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広国
博 士 論 文
（ 2017 年 2月 3日 提出）
論文題目
急性腎障害ラットにおける組織および赤血球 MRP familyの機能解析
Functional analysis of MRP family in tissue and erythrocyte in acute renal failure rats
指 導 教 員 村上 照夫 ㊞㊞㊞
補 助 教 員 森 信博 ㊞㊞㊞
大学院
薬学研究科 医療薬学専攻
申請者氏名 松島 葵 ㊞㊞㊞
広島国際大学大学院
記 入 例
急性腎障害ラットにおける組織および赤血球 MRP familyの機能解析
2016年度
松島 葵
急性腎障害ラットにおける組織および赤血球 MRP familyの機能解析
Functional analysis of MRP family in tissue and erythrocyte
in acute renal failure rats
2016
松島 葵
Aoi Matsushima
略語一覧
I. Compounds
AMP : Adenosine-5’-monophosphate
ATP : Adenosine-5’-triphosphate
BSA : Bovine serum albumin
BUN : Blood urea nitrogen
Calcein-AM : Calcein-acetoxymethyl ester
cAMP : Cyclic adenosine monophosphate
CDNB : 1-Chloro-2,4-dinitrobenzene
cGMP : Cyclic guanosine monophosphate
CMPF : 3-Carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furanpropanoic acid
DNP-CG : 2,4-Dinitrophenyl-S-cysteinylglycine
DNP-SG : 2,4-Dinitrophenyl-S-glutathione
DMSO : Dimethylsulfoxide
DTNB : 5,5’-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)
EDTA : Ethylenediamine tetraacetic acid
EGTA : Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid
FDNB : 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene
GSH : Reduced glutathione
GSSH : Oxidized glutathione
HEPES : 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
IS : Indoxyl sulfate
KYA : Kynurenic acid
KYN : Kynurenine
MTX : Methotrexate
MTXGlux : Methotrexate polyglutamate
PCA : Perchloric acid
PMSF : Phenylmethylsulfonyl fluoride
Rho 123 : Rhodamine 123
SDS : Sodium dodecyl sulfate
II. Pharmacokinetics parameters
CLbile : Biliary clearance
*CLbile : Intrinsic biliary clearance
CLtot : Total plasma clearance
Cpss : Steady state plasma concentration
GFR : Glomerular filtration rate
ke : Elimination rate constant
Km : Michaelis constant
t1/2 : Half life
Vmax : Maximum uptake rate
III. Transporters
ABC transporter : ATP-binding cassette transporter
BCRP : Breast cancer resistance protein
BSEP : Bile salt export pump
cMOAT : Canalicular multispecific organic anion transporter
LAT : L-amino acid transporter
MATE : Multidrug and toxin extrusion protein
MRP : Multidrug resistance-associated protein
OAT : Organic anion transporter
OATP : Organic anion transporter polypeptide
OCT : Organic cation transporter
PCFT : Proton-coupled folate transporter
P-gp : P-glycoprotein
RFC : Reduced folate carrier
SLC transporter : Solute carrier transporter
IV. Enzymes
ACh-E : Acetylcholinesterase
Ch-E : Cholinesterase
CYP : Cytochrome P450
FPGS : Folylpolyglutamate synthase
-GT : gamma-Glutamyltranspeptidase
AST : Aspartate aminotransferase
ALT : Alanine aminotransferase
GST : Glutathione S-transferase
KAT : Kynurenine amino transferase
V. Others
ARF : Acute renal failure
CM : Crude membrane
CRF : Chronic renal failure
EHBR : Eisai hyperbilirubinemic rat
HPLC : High performance liquid chromatography
HRP : Horseradish peroxidase
IOV : Inside-out erythrocyte membrane vesicles
Kp : Tissue-to-plasma partition coefficient
MW : Molecular weight
NBD : Nucleotide binding domain
PAGE : Polyacrylamide gel electrophoresis
PBS : Phosphate-buffered saline
PVDF : Polyvinylidene fluoride
PE : Polyethylene
PBPK model : Physiologically based pharmacokinetic model
S.E. : Standard error
TDM : Therapeutic drug monitoring
TR- : Transport deficient rat
目次
略語一覧
序論 1
第 I章 Glycerol 誘発急性腎障害ラットにおける組織および赤血球 MRP機能の評価 6
第 1節 Glycerol 誘発急性腎障害ラットにおける腎機能の評価 7
第 2節 Glycerol 誘発急性腎障害ラットにおける組織 MRP機能の解析 8
2.1. Glycerol 誘発急性腎障害ラットにおける組織 MRP機能の評価 8
2.2. CDNB静注後の DNP-SGの胆汁排泄 9
2.3. CDNB静注後の DNP-SGの血漿および全血中濃度 9
2.4. CDNB静注後の DNP-SGの赤血球内濃度および赤血球分布 11
2.5. CDNB定速静注時の DNP-SGの血漿中および赤血球内濃度 11
2.6. CDNB定速静注時の血漿および赤血球内 DNP-SG濃度と indoxyl sulfate との相関 12
第 3節 Glycerol 誘発急性腎障害ラットにおける GSH/GSSG濃度および代謝活性の解析 14
3.1. Glycerol 誘発急性腎障害ラットにおける GSH/GSSG濃度の評価 14
3.2. Glycerol 誘発急性腎障害ラットにおける GST 活性の評価 15
3.3. Glycerol 誘発急性腎障害ラットにおける-GT 活性の評価 15
第 4節 Glycerol 誘発急性腎障害ラットにおける MTX の赤血球内蓄積の解析 16
第 5節 小括 18
第 II章 赤血球MRP機能に及ぼす uremic toxinsおよび腎障害ラット血漿成分の影響解析 19
第 1節 調製した IOV の有用性評価 19
1.1. アセチルコリンエステラーゼ活性測定による反転率の算出 19
1.2. DNP-SGの小胞内取り込み時間および ATP依存性 21
1.3. DNP-SGの小胞内取り込みの濃度依存性とパラメーターの算出 21
第 2節 DNP-SGの IOV 取り込みに及ぼす各種阻害剤および uremic toxinsの影響 24
2.1. DNP-SGの IOV 取り込みに及ぼす阻害剤および血漿成分の影響 24
2.2. DNP-SGの IOV 取り込みに及ぼす uremic toxinsの影響 25
第 3節 洗浄赤血球における CDNB添加後の赤血球内 DNP-SG蓄積に及ぼす各種阻害剤
の影響 27
3.1. 洗浄赤血球における CDNB添加後の赤血球内 DNP-SG蓄積の時間依存性 27
3.2. 洗浄赤血球における CDNB添加後の赤血球内 DNP-SG蓄積に及ぼす bilirubin の影響 28
3.3. 洗浄赤血球における CDNB添加後の赤血球内 DNP-SG蓄積に及ぼす血漿成分の影響 29
3.4. 洗浄赤血球における CDNB添加後の赤血球内 DNP-SG蓄積に及ぼす uremic toxins
の影響 30
第 4節 IOV と洗浄赤血球を用いた kynurenic acid と kynurenineのMRP阻害作用の解析 31
4.1. DNP-SGの IOV 取り込みに及ぼす kyunurenic acidおよび kynurenineの影響 31
4.2. 浄赤血球における赤血球内 DNP-SG蓄積に及ぼす kyunurenic acid および kynurenine
の影響 32
第 5節 小括 33
第 III章 Cisplatin 誘発急性腎障害ラットにおける MRPの発現と機能解析 34
第 1節 Cisplatin投与後の血漿中 indoxyl sulfate濃度と腎障害および肝障害の評価 35
第 2節 Cisplatin誘発急性腎障害ラットにおける組織 MRP機能の解析 36
2.1. Cisplatin 誘発急性腎障害ラットにおける組織 MRP機能の評価 36
2.2. CDNB静注後の DNP-SGの血漿中濃度および胆汁排泄 37
2.3. DNP-SG定速静注時の DNP-SGの組織移行性およびクリアランスの解析 37
2.4. MRP機能に及ぼす cisplatinの影響解析 40
第 3節 HepG2 細胞における急性腎障害ラット血漿成分のMRP阻害効果の解析 42
3.1. 阻害剤および血漿成分のMRP阻害作用の評価 43
3.2. 血漿成分による calcein-AM 代謝活性および calcein の HepG2細胞への取り込み評価 44
3.3. 血漿成分および cisplatinの MRP阻害作用の評価 46
第 4節 急性腎障害ラットにおける組織MRPタンパク発現量の解析 47
第 5節 小括 49
考察 50
結論 55
実験の部 57
参考文献 68
論文目録 81
謝辞 82
1
序論
ATP-binding cassette (ABC)トランスポーターは、ATP の加水分解エネルギーを駆動力とし、基
質化合物を細胞外に輸送する膜輸送担体である。ABCトランスポーターには、P-糖タンパク質 (P-
gp)、multidrug resistance-associated proteins (MRPs) および breast cancer resistance protein (BCRP) など
が存在し、各組織に発現している (Takano et al., 2006; Staud et al., 2010; Nakanishi and Ross, 2012)。P-
gp は 170 kDa の高分子膜タンパク質であり 12回膜貫通型で、2つの nucleotide binding domain (NBD)
を有する (Cole and Deeley, 1998; Ambudkar et al., 1999)。当初は、抗がん剤に耐性を示すがん細胞か
ら単離されたが、生体においても脳、消化管、肝臓および腎臓などに発現していることがわかり、
薬物の透過を制限することから、異物排出ポンプとして生体防御機構に携わることがわかった
(Juliano and Ling, 1976; Inaba et al., 1979; Ambudkar et al., 1999)。また、P-gpの基質は代謝酵素である
CYP3A の基質とかなりの割合で重複しており、中性あるいは塩基性化合物である免疫抑制剤や、
カルシウム拮抗薬、ステロイドなど比較的脂溶性の化合物を基質としている (Hunter et al., 1993;
Wacher et al., 1995 & 1998; Schuetz et
al., 1996; Terao et al., 1996; Takano et
al., 1998 & 2006)。MRPはドキソルビ
シンに耐性を示す肺小胞癌細胞株か
ら MRP1 として単離された (Cole et
al., 1992) (Fig 1)。MRPは P-gp同様、
2 つの NBDを有するが、MRPファミ
リーの NBD 領域は 60-70%の高い相
同性を有する (Cole et al., 1998;
Hipfner et al., 1999; Borst et al., 2000)。
また、MRPの基質は P-gpの基質とは
異なり、主に代謝物などの水溶性化
合物である (Suzuki and Sugiyama,
2002; Takano et al., 2006; Klaassen and
Aleksunes, 2010) (Table 1)。また、多くの抗がん剤の基質認識性は P-gpと重複するが、代謝などによ
ってその化合物の水溶性が高まると、MRPに認識されやすくなる (Matsson et al., 2009)。BCRPは
Doyle らによって多剤耐性を示すヒト乳癌細胞から単離された 72 kDa の膜タンパク質であり、6回
膜貫通型で、1つの NBDを有する (Doyle et al., 1998; Mailiepaard et al., 2001)。BCRPは脳、消化管、
肝臓の上皮細胞に発現し、抗がん剤や抱合代謝物など比較的水溶性化合物を基質としている (Doyle
and Ross, 2003; Adachi et al., 2005; Takano et al., 2006; Nakanishi and Ross, 2012)。
Fig. 1. Membrane topology models for MRP 1, 2, 3, 6, 7 (A)
and MRP 4, 5, 8, 9 (B). NBD; nucleotide binding domain.
NBD1
NBD2
HOOC
NH2
NBD2
HOOCNBD1
NH2
A
B
2
現在、MRP ファミリーとしては 13種類が同定されており、その中でも MRP1-9 はがん細胞に
おいて多剤耐性を示す主なトランスポーターであることが知られている (Sodani et al., 2012)。MRP2
は肝臓において canalicular multispecific organic anion transporter (cMOAT) としてクローニングされ、
MRP1 とアミノ酸レベルで 49%の相同性を示し、MRP1 同様、17 回膜貫通型、2 つの NBD を有す
る (Büchler et al., 1996; Feneyte et al., 2004)。また、MRP1, 2, 3, 6, 7 が 17回膜貫通型であるのに対し
(Fig. 1A)、MRP4, 5, 8, 9は P-gp同様、12回膜貫通型である (Sodani et al., 2012) (Fig. 1B)。MRP1は
脳、腎臓、消化管、肺、睾丸および筋肉など、広範に発現しているのに対し、MRP2は肝臓、腎臓、
消化管などの刷子縁膜に局在的に高発現している (Table 2)。肝臓の胆管側膜に発現している MRP2
は、肝臓で抱合代謝を受けた異物の胆汁排泄に関わる。例えば、Dubin-Johnson 症候群は、遺伝的に
MRP2 が欠損しており、肝細胞に蓄積する bilirubin および bilirubin glucuronideを胆汁中へと分泌で
きず、高 bilirubin 血症を呈する (Kartenbeck et al., 1996; Paulusma et al., 1997)。Dubin-Johnson 症候群
と同様、MRP2が欠損した Eisai hyperbilirubinemic rat (EHBR) や transport deficient rat (TR-) において
も高 bilirubin 血症が認められる (Hirohashi et al., 1998; Wada et al., 1998)。しかしながら、MRP2欠損
の代償として、EHBR および TR-においては肝臓の基底膜側 (血管側) に存在する MRP3 の発現が
亢進することが知られている (Kool et al., 1999; Ogawa et al., 2000)。従って、MRP2が欠損すること
によって胆汁中に分泌されない抱合体などは、MRP3 によって全身循環血に輸送され、腎排泄の寄
与が大きくなる。このように、MRP ファミリーはその多様性から柔軟に機能することで生体防御
機構の役割を担っている。
Conjugates Drugs Endogenous compounds
2,4-dinitrophenyl S-glutathione pravastatin folate
arsenic-glutathione methotrexate urate
glutathione-conjugated aflatoxin B1 leucovorin bilirubin
glutathione-conjugated chlorambucil doxorubicin taurocholate
bilirubin-glucuronide vincristine cholic acid
etoposide-glucuronide etoposide cAMP, cGMP
estradiol-17β-D-glucuronide paclitaxel leukotrienes C4, D4, E4
morphine-6-glucuronide irinotecan prostaglandins E1, E2, F2α
estrone-3-sulfate grepafloxacin ruduced glutathione (GSH)
acetaminophen-sulfate ritonavir oxidized glutathione (GSSH)
taurolithocholate-sulfate zidovudine
Table 1. List of MRP substrates
References: Suzuki and Sugiyama (2002), Takano et al. (2006), Klaassen and Aleksunes (2010).
3
トランスポーターを介した薬物間相互作用は、吸収、分布、排泄の過程に大きく影響し、薬物
の動態を変動させることから、同じトランスポーターを阻害する薬物などは、相互作用を回避する
目的で添付文書の禁忌あるいは慎重投与の項目に記載されている。従って、トランスポーターの変
動を理解することは、その基質薬物の投与設計や相互作用の回避法を考察する上で重要な情報であ
るといえる。同様に、病態時のトランスポーターの発現や機能の変動も数多く報告されているが
(Yumoto et al., 2003; Naud et al., 2012; Jin et al., 2013; Li et al., 2016)、薬物間相互作用とは異なり、病
態に伴う動態変動は一部を除き注目度は少ないようにみえる。中でも腎障害は、トランスポーター
だけでなく代謝活性やタンパク結合といった薬物動態に関わる因子を変動させることが知られて
いる (Holzer et al., 2005; Klammt et al., 2012; Kusuba et al., 2012; Feere et al., 2015)。Table 3 は報告され
ている腎障害時に変動するトランスポーターの発現および機能についてまとめたものである。急性
および慢性腎障害時に肝臓や腎臓の organic anion transporter (OAT)、organic cation transporter (OCT)
などの solute carrier (SLC)トランスポーターの発現と機能は低下する (Ji et al., 2002; Aoyama et al.,
2003; Deguchi et al., 2004; Matsuzaki et al., 2007 & 2008)。つまり、腎障害時には、これらのトランス
ポーターに認識される基質薬物の細胞内分布が減少することが考えられる。一方で、ABCトランス
ポーターの発現は、腎障害時に増加する傾向にある。例えば glycerol 誘発急性腎障害ラットにおい
て腎臓の P-gp発現は約 2.5 倍増加し、5/6腎摘慢性腎障害ラットにおいて肝臓のMrp2発現も約 1.6
倍増加した (Huang et al., 2000; Laouari et al., 2001)。しかし、機能について着目すると、腎臓の MRPs
や腎および肝臓の P-gpの機能は低下しているため、腎臓や肝臓に発現する ABCトランスポーター
は、その発現増加に関わらず機能低下の影響が大きいことが考えられる。また、腎臓のMRP2/4の
機能低下は、体内に蓄積する uremic toxins により MRP 機能が阻害されるためと考えられている
(Masereeuw et al., 2000; Mutsaers et al., 2011)。急性腎障害時も慢性腎障害時同様、血中に増加する
Member Tissues
MRP1 Ubiquitous (low in liver)
MRP2 Brain, liver, kidney, gut
MRP3 Brain, liver, kidney, gut, adrenals, pancreas
MRP4 Brain, liver, kidney, lung, skeletal muscle, pancreas, testis, bladder, erythrocyte
MRP5 Ubiquitous
MRP6 Brain, liver, kidney, lung, spleen, testis
MRP7 Brain, liver, kidney, spleen, colon, skin, pancreas, testis
MRP8 Brain, liver, kidney, lung, colon, breast, testis, ovary, trachea
MRP9 Brain, breast, skeletal muscle, testis, ovary
Table 2. MRP expression in the body
References: Borst et al. (2000), Ballatori et al. (2009), Sodani et al. (2012).
4
uremic toxinsにより、全身の MRP機能に影響するものと考えられるが、腎臓以外の MRP機能につ
いてはほとんど検討されていないのが現状である。本研究では、急性腎障害に血液中に蓄積する
uremic toxins が、組織のMRP機能にどのように影響するかについて解析することを目的とした。
MRP機能の評価はMRP基質である 2,4-dinitrophenyl-S-glutathione (DNP-SG) とその前駆体の 1-
chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) を用いて行った (Fig. 2)。MRP の基質には抱合代謝物が多いが、
その中でもグルタチオン抱合体である DNP-SG は典型的な MRP の基質であり、細胞実験や消化管
実験など in vitroにおいて、頻繁に用い
られている (Jedlitschky et al., 1997;
Gotoh et al., 2000; Hirohashi et al., 2000)。
しかしながら、MRPの基質認識部位は
細胞の内側に存在するため、MRP機能
を評価するためには基質が細胞内に
取り込まれる必要がある。本研究では
MRP 基質の前駆体である CDNB を用
いて検討した。CDNBは脂溶性化合物
Transporter Change in expression Change in function
Kidney
OAT1 in ARF rats2), in CRF rats3), 4) in ARF rats2), by uremic toxins5)
OCT2 in ARF rats6), in CRF rats3) in CRF rats3)
P-gp in ARF rats7), in CRF rats8) in ARF rats7), by endothelin-19)
MRP2 in ARF rats10), in CRF rats8) by endothelin-19)
MRP4 in ARF rats11) by uremic toxins12)
Liver
Oatps in CRF rats13) by uremic toxins14)
P-gp in ARF rats7), in CRF rats8) in ARF rats7)
MRP2 in CRF rats8), 13)
MRP3 in CRF rats15)
Table 3. Expression and function of transporters under renal failure state1)
ARF, acute renal failure; CRF, chronic renal failure; increase; decrease; no change.
References: 1) Sun et al. (2006), 2) Matsuzaki et al. (2007), 3) Ji et al. (2002), 4) Aoyama et al.
(2003), 5) Deguchi et al. (2004), 6) Matsuzaki et al. (2008), 7) Haung et al. (2000), 8) Laouari et al.
(2001), 9) Masereeuw et al. (2000), 10) Liu et al. (2012), 11) Erman et al. (2014), 12) Mutsaers et al.
(2011), 13) Holzer et al. (2005), 14) Sun et al. (2005), 15) Gai et al. (2014).
Fig. 2. Chemical structures of CDNB (A) and DNP-SG (B)
NO2
NO2
Cl
A BNO2
O
O
S
NH
OH
NO2
NH
OO
OH
NH2
5
であるため、単純拡散によって細胞膜を透過し、細胞内の glutathione S-transferase (GST) によって
速やかにグルタチオン抱合代謝を受け、DNP-SG に変換される化合物である (Fig. 3)。つまり、MRP
機能が低下すると細胞内に DNP-SG が蓄積する。以前の研究で、MRP 阻害剤である probenecid を
処置したラットに CDNB を投与することで、全身の MRP 機能を評価し、脳、心臓、肝臓、腎臓、
空腸、脾臓および骨格筋の DNP-SG 濃度が増加したことから、これらの組織では MRP が機能して
いることが示された (Yokooji et al., 2010)。本研究でも同様に CDNBを投与し、その後細胞内の DNP-
SG濃度を測定することで組織のMRP機能に及ぼす急性腎障害の影響について解析した。
Fig. 3. Schematic representation of MRPs-mediated transport of DNP-SG after
administration of CDNB in cells. CDNB, 1-chloro-2,4-dinitrobenzene; DNP-SG,
2,4-dinitrophenyl-S-glutathione; GSH, reduced glutathione; GST, glutathione S-
transferase; MRPs, multidrug resistance-associated proteins.
CDNB CDNB DNP-SG MRPsGST
DNP-SG
Passive diffusion
Cell
GSH
ATP
AMP
6
第 I章 Glycerol誘発急性腎障害ラットにおける組織および赤血球MRP機能の評価
急性腎障害とは、急激な腎機能の低下によって体液の恒常性が維持できなくなった状態のこと
である。具体的には、血清クレアチニン値が基礎値の 3倍以上に増加、または糸球体ろ過速度 (GFR)
が 75%以下に低下、または血清クレアチニン値が 4 mg/dL 以上で血清クレアチニン値が 0.5
mg/dL/day 以上増加することを急性腎障害 (Acute renal failure) として定義されている (Risk Injury
Failure Loss End-stage (RIFLE) 分類)。急性腎障害の原因は、腎血流量の減少が原因となる腎前性急
性腎不全、腎実質に障害がある腎性急性腎不全、腎以降の尿流障害による腎後性急性腎不全の 3つ
に分類され、その中でも腎性急性腎不全は糸球体性疾患、間質性腎炎、尿細管壊死と原因がわかれ、
ショック等によりおこる虚血による尿細管壊死は、腎性急性腎不全の 50%を占めている (Thadhani
et al., 1996)。Glycerol 誘発急性腎障害は虚血性腎障害を含んだ腎障害であり、glycerol が誘発する横
紋筋融解症によって増加するミオグロビンやサイトカインなどが尿細管腎障害を惹起することが
知られている (Curry et al., 1989; Wolfert and Oken, 1989)。一般的に、横紋筋融解症の 10-40%は急性
腎障害を併発し、急性腎障害の原因に横紋筋融解症が占める割合は 2-15%である (Singh et al., 2012)。
Glycerol 誘発急性腎障害ラットはこのような横紋筋融解症が誘発する急性腎障害のモデルとして使
用され、glycerol をラット両下肢部に筋注することで誘発される (Vlahović et al., 2007)。これまでの
研究で、glycerol 誘発急性腎障害ラットにおいて、P-gp の機能および発現が変動することが報告さ
れている。例えば、glycerol誘発急性腎障害ラットにおいて、腎尿細管上皮細胞の P-gpのタンパク
発現量は増加するが、P-gp の基質である rhodamine 123 (Rho 123) の尿細管分泌機能は低下し、Rho
123 の胆汁分泌機能も低下する (Kunihara et al., 1998; Huang et al., 2000)。Murakami らは、glycerol誘
発急性腎障害ラットにおいて、P-gp基質/阻害剤である corticosteroneが血漿中に増加したことから、
腎障害時に体内で蓄積する内因性物質が肝の P-gp 機能を阻害することを報告している (Murakami
et al., 2002)。しかしながら、誘発急性腎障害時、体内で蓄積する uremic toxinsや内因性物質が MRP
機能に及ぼす影響については検討されていない。本章では CDNB 投与後の細胞内 DNP-SG の蓄積
から、glycerol 誘発急性腎障害ラットにおける組織と赤血球のMRP機能について解析した。
7
第 1節 Glycerol 誘発急性腎障害ラットにおける腎機能の評価
Glycerol投与 24時間前から、ラットを絶水させることで腎障害が誘発しやすくなることが報告
されている (Sauriyal et al., 2012)。そこで本章における glycerol 誘発急性腎障害ラットは 24 時間絶
水処置したラットに 50% glycerol を両下肢部に筋注 (10 mL/kg) することで作製した。また、glycerol
処置 24 時間後のラット血漿中 BUN および代表的な uremic toxin のひとつである indoxyl sulfate 濃
度を測定することで腎機能を評価した。Glycerol処置 24時間後のラット血漿中 BUNおよび indoxyl
sulfate 濃度は有意に増加したことから、glycerol により急性腎障害が誘発されたことが確認された
(Table 4)。また、glycerol 誘発急性腎障害ラットにおいて total bilirubin および direct bilirubin 濃度が
有意に増加した (Table 4)。Glycerol 誘発急性腎障害は、glycerol が横紋筋融解症を惹起することで
二次的に腎障害が誘発されるが、溶血も同時に惹起されることが報告されている (Lochhead et al.,
1998)。従って、glycerol誘発急性腎障害ラットにおける bilirubin濃度の増加は主に溶血によるもの
と考えられた。
Control ARF
BUN (mg/dL) 13.7 ± 0.70 124 ± 6.94**
Indoxyl sulfate (µM) 3.63 ± 0.61 103 ± 10.6**
Total bilirubin (µM) 1.76 ± 0.09 29.1 ± 7.96*
Direct bilirubin (µM) 1.01 ± 0.12 3.01 ± 0.62*
Table 4. Biochemical data for kidney function in glycerol-induced ARF rats
ARF, acute renal failure; BUN, blood urea nitrogen. ARF rats were induced by an
intramuscular injection of 50% glycerol (10 mL/kg). Control rats were treated by the
same volume of saline. The concentrations of BUN, indoxyl sulfate, total bilirubin, and
direct bilirubin were measured at 24 h after injection. Each value represents the mean ±
S.E. of three to four rats. *P<0.05, **P<0.01: significantly different from the value for
control rats.
8
第 2節 Glycerol 誘発急性腎障害ラットにおける組織 MRP 機能の解析
第 1 節では glycerol 投与 24 時間後に急性腎障害の誘発が確認された。この急性腎障害ラット
を用いて組織および赤血球の MRP機能について解析した。
2.1. Glycerol 誘発急性腎障害ラットにおける組織 MRP機能の評価
Glycerol誘発急性腎障害ラットに CDNBを静注し、脳、肝臓、腎臓および脾臓の DNP-SG濃度
を測定することで、各組織の MRP機能を評価した (Fig. 3)。肝臓および脾臓で DNP-SG濃度の有意
な増加を示したことから (Fig. 4)、これらの組織において MRP 機能が低下したことが示唆された。
0
6
12
18
24
Brain Liver Kidney Spleen
**
**
Tis
sue
con
cn. o
f D
NP
-SG
(μ
M)
Fig. 4: Concentrations of DNP-SG in the brain, liver, kidney, and spleen 30 min
after intravenous administration of CDNB in control ( ) and ARF ( ) rats. The
dose of CDNB was 30 µmol/kg. Each value represents the mean ± S.E. of results
from four rats. **P < 0.01: significantly different from the value for control.
9
2.2. CDNB静注後の DNP-SGの胆汁排泄
肝臓には MRP2 を初め、多くの ABC トランスポーターが発現しており、DNP-SG は MRP2 に
よって胆汁中へと排出される。CDNB静注後の DNP-SGの胆汁排泄について検討するため、胆汁中
の DNP-SG濃度を経時的に測定した。急性腎障害ラットにおいて、DNP-SGの胆汁排泄は有意に減
少した (Fig. 5)。従って、急性腎障害時、肝MRP2の機能が低下することが示された。
2.3. CDNB静注後の DNP-SGの血漿および全血中濃度
CDNB 静注後の血漿および全血中 DNP-SG 濃度を測定した (Fig. 6)。急性腎障害ラットにおい
て、DNP-SG の血漿中濃度はわずかに増加し、全血中濃度は有意に増加した。また、DNP-SG の血
漿中濃度における消失相 (15-30 分) から消失速度定数 (ke) および半減期 (t1/2) を算出したところ、
keは減少し、t1/2が増加した (Table 5)。従って、腎障害時に DNP-SG の血中滞留性が僅かに高まる
ことが示された。
0
10
20
30
40
0 20 40 60
Cu
mu
lati
ve
bil
iary
ex
cret
ion
of
DN
P-S
G (
% o
f d
ose
)
Time (min)
* * *
Fig. 5. Cumulative biliary excretion of DNP-SG after intravenous administration of CDNB
in control (○) and ARF (●) rats. The dose of CDNB was 30 µmol/kg. Each value represents
the mean ± S.E. of results from three to five rats. *P < 0.05: significantly different from the
value for control.
10
Control ARF
ke (min-1) 0.120 ± 0.001 0.108 ± 0.004*
t1/2 (min) 5.74 ± 0.004 6.48 ± 0.226*
0
80
160
240
0 10 20 30
1
10
100
1000
0 10 20 30
Pla
sma
con
cn. o
f D
NP
-SG
(μ
M)
Time (min)
**
*
0
50
100
150
0 10 20 30
Wh
ole
blo
od c
on
cn. o
f D
NP
-SG
(μ
M)
1
10
100
1000
0 10 20 30
***
****
**
**
**
**
**
**
Time (min)
A B
Fig. 6. Concentrations of DNP-SG in plasma (A) and whole blood (B) after intravenous
administration of CDNB in control (○) and ARF (●) rats. The dose of CDNB was 30
µmol/kg. Each value represents the mean ± S.E. of results from four rats. *P < 0.05, **P <
0.01: significantly different from the value for control.
Table. 5. Pharmacokinetic parameters of DNP-SG after intravenous
administration of CDNB in control and ARF rats
Each value represents the mean ± S.E. of results from four rats. *P <
0.05: significantly different from the value for control.
11
2.4. CDNB静注後の DNP-SGの赤血球内濃度および赤血球分布
脾臓は古くなった赤血球を破壊する役割を担っており、脾臓と赤血球は密接に関係している。
急性腎障害ラットにおいて CDNB 静注後の脾臓および全血中 DNP-SG 濃度が増加したことから、
赤血球内 DNP-SG 濃度が増加したことが考えられた。そこで赤血球 MRP 機能について検討するた
め、CDNB静注後の赤血球内 DNP-SG濃度と赤血球分布 (Erythrocyte/plasma ratio) を測定した。腎
障害ラットにおいて、赤血球内濃度および赤血球分布は有意な増加を示した (Fig. 7)。
2.5. CDNB定速静注時の DNP-SGの血漿中および赤血球内濃度
CDNB定速静注時における DNP-SGの血漿と赤血球内濃度についても同様に検討した。CDNB
定速静注時の血漿中濃度に変化は認められず、一方で急性腎障害ラットにおける赤血球内濃度は有
意に増加した (Fig. 8)。
0
0.5
1
1.5
2
0 10 20 30
**
**
*
0
15
30
45
0 10 20 30
Ery
thro
cyte
co
ncn
. o
f D
NP
-SG
(μ
M)
Time (min)
Ery
thro
cyte
/pla
sma
rati
o
Time (min)
***
**
**
A B
Fig. 7. Concentrations of DNP-SG in erythrocyte (A) and erythrocyte/plasma concentration
ratio (B) after intravenous administration of CDNB in control (○) and ARF (●) rats. The
dose of CDNB was 30 µmol/kg. Each value represents the mean ± S.E. of results from four
rats. *P < 0.05, **P < 0.01: significantly different from the value for control.
12
2.6. CDNB定速静注時の血漿および赤血球内 DNP-SG濃度と indoxyl sulfate との相関
Indoxyl sulfate (Fig. 9) は uremic toxins のひとつであり、BUNや creatinine などの腎障害の指標
マーカーと相関することが報告されている (Matsuzaki et al., 2007)。また、indoxyl sulfate は蛍光物質
であり、HPLC による好感度な測定が可能である。そこで、腎障害誘発の程度と赤血球 MRP 機能
の関係について解析するため、CDNB 定速静注 30 分後の赤血球内 DNP-SG 濃度と血漿中 indoxyl
sulfate 濃度の相関性について検討した。CDNB定速
静注後の DNP-SG の血漿中濃度と indoxyl sulfate 濃
度には相関性は認められなかった (Fig. 10A)。一方、
赤血球内 DNP-SG 濃度と血漿中 indoxyl sulfate の濃
度には有意な正の相関関係が認められた (Fig.
10B)。以上の結果より、血漿中 indoxyl sulfate濃度の
増加に伴い赤血球内 DNP-SG濃度が増加すること、
およびラット間における赤血球内DNP-SG濃度のば
らつきは腎障害誘発の程度のばらつきによるもの
であることが示された。
Fig. 8. Concentrations of DNP-SG in plasma (A) and erythrocyte (B) during a constant-rate
infusion of CDNB in control (○) and ARF (●) rats. The dose of CDNB was 3 µmol/h. Each
value represents the mean ± S.E. of results from four rats. *P < 0.05: significantly different
from the value for control.
Fig. 9. Chemical structure of indoxyl sulfate
N
H
O S
O
O
O-
K+
0
5
10
15
20
0 10 20 30
*
*
0
5
10
15
20
0 10 20 30Pla
sma
con
cn. o
f D
NP
-SG
(μ
M)
Time (min)
*
Ery
rth
rocy
teco
ncn
. o
f D
NP
-SG
(µ
M)
Time (min)
A B
13
Pla
sma
con
cn. o
f D
NP
-SG
(µ
M)
Plasma concn. of IS (µM)
p=0.271
Ery
thro
cyte
co
ncn
. o
f D
NP
-SG
(µ
M)
Plasma concn. of IS (µM)
p<0.01
A B
0
8
16
24
0 50 100 150
0
8
16
24
0 50 100 150
Fig. 10. The relationship of DNP-SG concentrations in plasma (A) and erythrocyte (B) at 30
min after constant-rate infusion of CDNB with plasma concentrations of indoxyl sulfate (IS)
in control (○) and ARF (●) rats. The dose of CDNB was 3 µmol/h.
14
0
4
8
12
Erythrocyte Liver Kidney Spleen
Tis
sue
con
cn. o
f G
SH
(m
M)
*
0
0.1
0.2
0.3
Erythrocyte Liver Kidney Spleen
Tis
sue
con
cn. o
f G
SS
G (
mM
)
A
B
第 3節 Glycerol 誘発急性腎障害ラットにおける GSH/GSSG濃度および代謝活性の解析
第 2 節において、glycerol 誘発急性腎障害ラットに CDNB を投与すると、肝臓および赤血球内
の DNP-SG 濃度が増加したことから、急性腎障害ラットの肝臓および赤血球の MRP 機能が低下す
ることが示された。CDNBは細胞内に存在する GST により GSHと抱合反応し、DNP-SGへと代謝
される。また、生成した DNP-SG は gamma-glutamyl transferase (-GT) によって DNP-CG へと代謝
分解される (Gotoh et al., 2000)。本節では、CDNBおよび DNP-SGの代謝に関わる因子に及ぼす急
性腎障害の影響について解析した。
3.1. Glycerol 誘発急性腎障害ラットにおける GSH/GSSG濃度の評価
Glycerol 誘発急性腎障害ラットにおいて、CDNB の代謝に関わる GSH およびその酸化型であ
る GSSG濃度が変動しているかどうか確認するため、赤血球、肝臓、腎臓および脾臓の細胞内 GSH
および GSSG 濃度を測定した。その結果、急性腎障害ラットの肝臓において細胞内 GSH 濃度が有
意に増加することが認められた (Fig. 11A)。
Fig. 11. Concentrations of GSH (A) and GSSG (B) in erythrocyte, liver, kidney, and spleen
in control ( ) and ARF ( ) rats. Each value represents the mean ± S.E. of results from
three rats. *P < 0.05: significantly different from the value for control.
15
3.2. Glycerol 誘発急性腎障害ラットにおける GST 活性の評価
Glycerol誘発急性腎障害ラットにおける赤血球、肝臓および腎臓の GST 活性を測定した。GST
活性は CDNB、GSH および赤血球と組織 S9 画分をインキュベーションし、DNP-SG の生成速度を
測定することで算出した。急性腎障害ラットにおいて、腎臓の GST活性は有意に低下した (Fig. 12)。
3.3. Glycerol 誘発急性腎障害ラットにおける-GT 活性の評価
Glycerol誘発急性腎障害ラットにおける赤血球、肝臓および腎臓の-GT 活性を測定した。-GT
活性は DNP-SG と赤血球および組織の S9 画分をインキュベーションし、DNP-SG の分解速度を測
定することで算出した。急性腎障害ラットにおいて、赤血球、肝臓および腎臓の-GT 活性に変化は
認められなかった (Fig. 13)。
0
0.5
1
1.5
2
Erythrocyte Liver Kidney
DN
P-S
G m
etab
oli
sm
(nm
ol/
min
/mg
pro
tein
)
Fig. 13. Activities of -glutamyl transferase
(-GT) in erythrocyte, liver, and kidney in
control ( ) and ARF ( ) rats. Each value
represents the mean ± S.E. of results from
three rats.
GS
T a
ctiv
ity
(µm
ol/
min
/mg
pro
tein
)
**
0
1
2
3
Erythrocyte Liver Kidney
Fig. 12. Activities of glutathione S-transferase
(GST) in erythrocyte, liver, and kidney in
control ( ) and ARF ( ) rats. Each value
represents the mean ± S.E. of results from three
rats. **P < 0.01: significantly different from the
value for control.
16
第 4節 Glycerol 誘発急性腎障害ラットにおける MTXの赤血球内蓄積の解析
Methotrexate (MTX) は葉酸代謝拮抗薬であり、ジヒドロ葉酸還元酵素を阻害することで、抗リ
ウマチ剤や抗がん剤として臨床で用いられる (Fig. 14A)。MTX は reduced folate carrier (RFC) の基
質であり (Schilsky et al., 1981; Dixon et al., 1994; Sierra and Goldman, 1999)、RFCによって細胞内に
取り込まれるため、血漿中からMTXが消失した後も、細胞内に長時間滞留する (Tishler et al., 1989;
Dalrymple et al., 2008)。細胞内に取り込まれたMTX の一部は folylpolyglutamate synthase (FPGS) に
よってMTX polyglutamate (MTXGlux) (Fig. 14B) へと代謝され、細胞内に蓄積するため、赤血球内の
MTXGlux 濃度を測定することで、リンパ球など他の細胞内濃度を予測することが期待されている
(Kremer 2004; Dalrymple et al., 2008)。しかしながら、MTXGluxは-glutamyl hydrolase によって側鎖
の glutamate moleculeがはずれ、MTX やMTX mono glutamate (MTXGlu1) となると、MRPによって
速やかに細胞外へと排出される (Dalrymple et al., 2008)。また、MRP阻害剤であるMK-571 を同時
投与することによって、MTX の赤血球内分布が増加することが報告されている (Takeuchi et al.,
2012)。従って、MTX は赤血球内へ分布し、MRP機能の変動によって赤血球内分布の影響を受けや
すいことが考えられる。第 2 節で、腎障害時、赤血球膜 MRP 機能が低下することが示された。本
節では、臨床基質であるMTXの赤血球内蓄積が腎障害により増加するか検討するため、glycerol誘
発急性腎障害ラットに MTX を定速静注し、MTX の赤血球分布に及ぼす腎障害の影響について解
析した。
Fig. 14. Chemical structures of methotrexate (MTX) (A) and MTX polyglutamate (MTXGlux) (B)
O
NH2
NH2
N
NN
NCH3
N
NH COOH
H COOH
O
NH2
NH2
N
NN
NCH3
N
NH COOH
H COOH
n
A
B
17
急性腎障害ラットにおける MTX 定速静注時の赤血球内MTX濃度を測定した。なお、MTXの
負荷量および維持量はそれぞれ 3.16 µmol/kg、4.68 µmol/h で投与した。MTX を定速静注時、急性腎
障害ラット血漿中および赤血球内MTX 濃度は有意に増加した (Fig. 15A, B)。また、急性腎障害ラ
ットにおいて Kp 値 (赤血球内濃度/血漿中濃度比) は僅かに増加したが、CDNB 投与後の赤血球内
DNP-SG蓄積のような劇的な変化は認められなかった (Fig. 15C)。この蓄積にはMTXGluxも関わる
と考えられることから、MTXGluxも測定し、さらに検討する必要があると考えている。
0
20
40
60
0 40 80 120
0
2
4
6
8
0 40 80 120
0
0.06
0.12
0.18
0 40 80 120
Pla
sma
con
cn. o
f M
TX
(μ
M)
Ery
thro
cyte
co
ncn
. o
f M
TX
(μ
M)
Kp
val
ue
of
MT
X
Time (min) Time (min) Time (min)
*
*
*
*
*
*
**A B C
Fig. 15. Concentrations of MTX in plasma (A) and erythrocyte (B), and Kp value
(erythrocyte/plasma concentration ratio) during a constant-rate infusion of MTX in control (○) and
ARF (●) rats. The doses of MTX for loading and maintenance were 3.16 µmol/kg and 4.68 µmol/h,
respectively. Each value represents the mean ± S.E. of results from four rats. *P < 0.05, **P < 0.01:
significantly different from the value for control.
18
第 5節 小括
本章では、glycerol によって誘発される急性腎障害が組織および赤血球MRP 機能に及ぼす影響
について解析した。
第 1 節では、glycerol によって腎障害が誘発されたことが確認された。第 2 節では、急性腎障
害ラットに CDNB を投与することで、肝臓、脾臓および赤血球内の DNP-SG 濃度が増加した。ま
た、胆汁分泌が低下したこと、および血漿中 indoxyl sulfate 濃度と赤血球内 DNP-SG 濃度に有意な
相関性が認められたことから、肝および赤血球の MRP 機能が低下したことが示された。第 3 節で
は、細胞内 GSH/GSSG濃度および CDNB と DNP-SG の代謝に関わる酵素活性について検討した。
急性腎障害ラットにおいて肝臓および赤血球の代謝活性の変動が認められなかったことから、赤血
球および肝臓における DNP-SGの蓄積は代謝活性の変動によるものではないことが示された。第 4
節では、MRP基質である MTX の赤血球内分布に及ぼす急性腎障害の影響について検討した。腎障
害ラットにおいて、僅かではあるが有意に MTXの赤血球分布は増加したことから、その他の MRP
基質においても、赤血球内濃度が増加する可能性が示された。
以上の結果より、glycerol 誘発急性腎障害ラットにおいて、肝臓および赤血球のMRP機能が低
下することが示された。
19
第 II 章
赤血球膜 MRP 機能に及ぼす uremic toxins および腎障害ラット血漿成分の影響解析
赤血球は、直径約 7~8 µm、厚さ 2 µm程度の中央が凹んだ円盤状の形状をしており、肺から
得た酸素を全身へと運ぶ役割を担っている。また、核やミトコンドリアなどの細胞内小器官を有
せず、膜系は細胞膜のみである。そのため、白血球や血小板などの他の細胞を除去して得られる
洗浄赤血球は膜系として純粋な細胞膜を調製することが可能である。例えば、洗浄赤血球は、血
漿タンパク結合の影響を無視でき、in vivo における阻害剤の膜透過性を含めた赤血球内分布につ
いて、より詳細な解析が可能である。さらに、洗浄赤血球を溶血させ、細胞内容物を除去して得
られる反転小胞体 (inside-out erythrocyte membrane vesicles; IOV) は、代謝の影響や細胞内成分との
相互作用を無視できるため、膜輸送のみの評価が可能である。赤血球膜には MRPや BCRPなどの
ABCトランスポーターが発現しているため (Rychlik et al., 2000; Klokouzas et al., 2003; Kasza et al.,
2012)、反転することにより、MRP機能は取り込み方向に作用し、膜輸送を解析するための細胞内
条件を任意に設定できる。また、輸送の駆動力 adenosine-5’-triphosphate disodium salt (ATP) などを
容易に添加することができるため、MRP基質の探索や、MRP阻害剤のスクリーニングなどの解析
に有用な実験系である (Ogawa et al., 2006; Taogoshi et al., 2008)。
本章では、赤血球膜に発現している MRP機能に及ぼす各種 uremic toxinsおよび血漿成分の影
響を検討するため、ラットから得た赤血球を用い IOV および洗浄赤血球を作製し、各成分のMRP
阻害作用について解析した。
第 1節 調製した IOVの有用性評価
本章では、赤血球のMRP機能評価系として、以前報告されている方法に準じて IOV を調製
した (Ogawa et al., 2006)。この節ではまず、調製した IOV における膜小胞系としての有用性につ
いて評価した。
1.1. アセチルコリンエステラーゼ活性測定による反転率の算出
コリンエステラーゼ (Ch-E) とは、コリンエステルをコリンと有機酸に加水分解する酵素のこ
とで、アセチルコリンのほか種々のコリンエステルを加水分解する非特異性酵素とアセチルコリ
ンを基質とするアセチルコリンエステラーゼ (ACh-E) の 2種類に分類される。ここでは、調製し
た膜画分のうち IOV の占める割合を算出するため、赤血球膜の外酵素である ACh-Eの活性を 5,5’-
dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) 法 (DTNB法) により測定した (Ellman et al., 1961)。基質であるアセ
20
チルチオコリンに ACh-Eが働き、遊離してくるチオコリンのチオール基とジチオビスニトロ安息
香酸 (DTNB) を反応させ、生成するチオニトロ安息香酸 (黄色色素) の増加速度を O.D. 412 nmで
吸光度測定することにより、活性を求めた (Fig. 16)。
可溶化剤である Triton-X 100 存在下では、アセチルコリンはすべての酵素活性ドメインに結合
することができるが、Triton-X 100非存在下では、基質は IOV の酵素活性ドメインに結合するこ
とができない (Fig. 17)。Triton-X 100 存在下、非存在下の活性をそれぞれ求め、Triton-X 100 存在
下での活性から非存在下での活性を差し引いた値の Triton-X 100存在下での活性に占める割合を、
反転率として算出した (Table 6)。本章で作製した IOV の反転率は 37.5%であった。
Fig. 17. Accessibility of acetylthiocholine to acetylcholinesterase
(ACh-E) in the presence or absence of Triton-X 100
Fig. 16. Mechanism of DTNB method (5-thio-2-nitrobenzoic acid production)
O
N+
CH3
CH3CH3
S CH3
SHN
+
CH3
CH3CH3
O-
O
NO2
S-O
-
O
CH3
N+
SS
NO2
CH3
CH3
H2O
CH3COOH
ACh-E
Acetylthiocholine
Thiocholine5,5’-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)
5-Thio-2-nitrobenzoic acid
O2N
O
O-
O
SS
NO2
OH
ACh-E
IOV
+Triton-X 100
21
1.2. DNP-SGの小胞内取り込み時間および ATP依存性
調製した IOV を用い、DNP-SG (300 µM) の小胞内取り込みの経時的変化と ATP依存性につい
て検討した。DNP-SGは経時的に小胞内へと取り込まれ、60分までほぼ直線性を示した。また、
その取り込みは AMP 存在下に比べ ATP存在下で有意に高い値を示した (Fig. 18)。この結果に基
づき、取り込みに直線性が認められる 30分で評価した。
1.3. DNP-SGの小胞内取り込みの濃度依存性とパラメーターの算出
DNP-SGの小胞内取り込みの濃度依存性について、種々の濃度 (1~1000 µM) の DNP-SGを用
いて検討した。各濃度の ATP依存的な取り込み量は AMP存在下における取り込み量を差し引い
た値とした。この結果より、DNP-SGの ATP依存的な小胞内取り込みは非線形性を示し、飽和を
有する輸送系により取り込まれていることが示された (Fig. 19A)。さらに、Eadie-Hofstee plot によ
る解析から二相性が確認され、DNP-SGの取り込みには高親和性と低親和性の 2つの輸送系が関
与することが示された (Fig. 19B)。DNP-SGの小胞内取り込みの飽和性について非線形最小二乗法
を用いて解析し、以下に示す Michaelis-Menten 式に基づいて速度論的パラメーターを算出した
(Table 7)。
ACh-E activity (mU/mg protein/min)
- 0.2% Triton-X 100 115.02 ± 1.92
+ 0.2% Triton-X 100 184.16 ± 4.32
Fig. 18. Time- and ATP-dependence of DNP-
SG uptake by IOV. Uptake of DNP-SG (300
µM) was measured at 37°C with 1 mM ATP
(○) or 1 mM AMP (●). Each value represents
the mean ± S.E. of three trials. **P < 0.01:
significantly different from the value for AMP
application. 0
10
20
0 30 60DN
P-S
G u
pta
ke
(nm
ol/
mg
pro
tein
)
Time (min)
**
Table 6. ACh-E activity in the presence or absence of Triton-X 100
Each value represents the mean ± S.E. of results from three trials.
22
V = Vmax1 ∙ [S]
Km1 + [S] +
Vmax2 ∙ [S]
Km2 + [S]
得られた速度論的パラメーターを用いて、各濃度での輸送速度に占める高親和性輸送と低親
和性輸送の寄与率を算出した (Table 8)。In vivo において有意な赤血球内蓄積が認められた DNP-
SGの濃度は約 5~40 µMであり、その時の高親和性輸送の寄与率は 58~88%と算出された。以降
は、in vivo における赤血球内濃度を考慮し、20 µM の濃度で検討した。
Km (µM) Vmax (nmol/mg protein/min)
High-affinity system 1.14 1.03
Low-affinity system 139.4 3.25
Up
tak
e (n
mo
l/m
g p
rote
in/3
0 m
in)
V/S (mL/mg protein/30 min)
0
1.5
3
4.5
0 0.2 0.4 0.6
B
0
1.5
3
4.5
0 500 1000
Up
tak
e (n
mo
l/m
g p
rote
in/3
0 m
in)
DNP-SG concentration (µM)
A
V: uptake rate (nmol/mg protein/30 min), Vmax: maximum uptake rate (nmol/mg protein/30 min)
[S]: concentration of DNP-SG (µM), Km: Michaelis constant (µM)
Fig. 19. Concentration-dependence of DNP-SG uptake by IOV. Uptake rate of DNP-SG
for 30 min at a concentration in a range from 1 to 1000 µM was measured at 37°C. ATP-
dependent uptake was calculated by subtracting the uptake in the presence of AMP from
that in the presence of ATP at each DNP-SG concentration (A), and Eadie-Hofstee plots
of the data (B). Each value represents the mean ± S.E. of three trials.
Table 7. Kinetic parameters of DNP-SG uptake by IOV
23
Concentration High-affinity system Low-affinity system
5 µM 88% 12%
20 µM 70% 30%
40 µM 58% 42%
100 µM 43% 57%
500 µM 29% 71%
Table 8. Contribution of high- and low-affinity transport system at various
concentrations of DNP-SG in the uptake by IOV
Vh = [S] × 1.03
1.14 + [S] Vl =
[S] × 3.25
139.4 + [S]
Contribution of low/high affinity transport system (%) = Vh or Vl
Vh+ Vl
×100
Vh: uptake rate of high affinity at various concentrations
Vl: uptake rate of low affinity at various concentrations
24
第 2節 DNP-SGの IOV 取り込みに及ぼす各種阻害剤および uremic toxins の影響
第 1節で調製した IOV を用いて、DNP-SGの取り込みに及ぼす各種阻害剤、血漿成分、内因
性物質および uremic toxins の影響について解析した。なお、血漿成分はアセトニトリルで除タン
パクしたものを用いた。
2.1. DNP-SGの IOV 取り込みに及ぼす阻害剤および血漿成分の影響
内因性物質である bilirubin の血漿中濃度は glycerol 誘発急性腎障害ラットで増加したことか
ら、bilirubin が赤血球MRP 機能に及ぼす影響について検討した。MRP阻害剤のポジティブコント
ロールとして、MK-571および probenecid を用いた。MK-571 や probenecid 同様、bilirubin によ
り、DNP-SGの取り込みは有意に阻害された (Fig. 20)。
次に、血漿成分について検討した。コントロールおよび急性腎障害ラット血漿成分により
DNP-SGの取り込みは有意に阻害されたが、急性腎障害ラット血漿成分の方がより強い阻害作用
をもつことが示された (Fig. 21)。従って、健常時の血漿中にもMRP阻害剤は存在するが、急性腎
障害時の血漿中には、より多くのMRP阻害剤が存在することが認められた。
0
40
80
120
**
** **
**
DN
P-S
G u
pta
ke
(% o
f co
ntr
ol)
Fig. 20. Effects of MK-571, probenecid, and bilirubin on DNP-SG uptake by IOV. Control
represents the results in the absence of any MRP substrate/inhibitor in the medium at 37°C.
IOV was incubated with DNP-SG (20 µM) for 30 min at 37 °C. Each value represents the
mean ± S.E. of three trials. **P < 0.01: significantly different from the value for control.
25
2.2. DNP-SGの IOV 取り込みに及ぼす uremic toxinsの影響
赤血球MRP機能に及ぼす各種 uremic toxins の影響について解析した。Uremic toxins は 100 種
類以上存在し、small water-soluble solutes (molecular weight (MW) < 500 Da)、protein-bond solutes、
middle molecules (MW > 500 Da) の 3つに大別される (Vanholder et al., 2008)。本項では、small
water-soluble solutesと protein-bond solutesの一部の標準品について検討した。Small water-soluble
solutesにはMRP阻害作用が認められなかったが (Fig. 22A)、protein-bond 型である p-cresol、
hippuric acid、indoxyl sulfate、indole 3-acetic acid、kynurenic acid および 3-carboxy-4-methyl-5-propyl-
2-furanpropanoic acid (CMPF) においてMRP阻害作用が認められた (Fig. 22B)。
0
40
80
120
**
**
**
**
DN
P-S
G u
pta
ke
(% o
f co
ntr
ol)
††
††
Fig. 21. Effects of plasma components obtained from control and ARF rats on DNP-SG
uptake by IOV. Control represents the results in the absence of MRP substrate/inhibitor in
the medium at 37°C. Plasma components were obtained from deproteinized plasma of
control and ARF rats after 24 h glycerol treatment. IOV was incubated with DNP-SG (20
µM) for 30 min at 37 °C. Each value represents the mean ± S.E. of three trials. **P < 0.01:
significantly different from the value for control. †† P < 0.01: significantly different from
the value for control plasma.
26
Fig. 22. Effects of small water-soluble solutes (A) and protein-bond solutes (B) of uremic
toxins on DNP-SG uptake by IOV. Control represents the results in the absence of MRP
substrate/inhibitor in the medium at 37°C. IOV was incubated with DNP-SG (20 µM) for
30 min at 37°C. Each value represents the mean ± S.E. of three trials. *P < 0.05, **P <
0.01: significantly different from the value for control.
DN
P-S
G u
pta
ke
(% o
f co
ntr
ol)
0
40
80
120
0
40
80
120
*** * *
**
*
DN
P-S
G u
pta
ke
(% o
f co
ntr
ol)
A
B
27
第 3節 洗浄赤血球における CDNB添加後の赤血球内 DNP-SG蓄積に及ぼす各種阻害剤
の影響
IOV の評価系では代謝の影響や細胞内成分との相互作用を無視できる利点があるため、MRP
阻害剤のスクリーニング目的としては非常に有用であるが、阻害剤の膜透過性については評価で
きない。一方で他の細胞を除去して得られた洗浄赤血球は、血漿タンパク質の影響のみを除外し
た in vitro 実験系であり、MRP阻害剤の膜透過性を含めた評価系である。そこで、洗浄赤血球を用
いて、阻害剤存在下における CDNB添加後の DNP-SGの蓄積を評価することで、阻害剤の膜透過
性を含めた MRP機能に及ぼす血漿成分と各種 uremic toxins の影響について解析した。
3.1. 洗浄赤血球における CDNB添加後の赤血球内 DNP-SG蓄積の時間依存性
MRP阻害剤であるMK-571 を用いて、CDNB (10 µM) 添加後の赤血球内 DNP-SG蓄積につい
て解析したところ、MK-571 により DNP-SGの蓄積は有意に増加した (Fig. 23)。また、MK-571存
在下では時間依存的な DNP-SGの蓄積変化は認められなかったが、MK-571 非存在化では、時間
依存的な減少を示した (Fig. 23)。この結果より、本実験系では、赤血球内に取り込まれた CDNB
は、細胞内で DNP-SGに代謝された後、MRPによって細胞外へと排出されるが、MRP阻害剤存
在下では赤血球内に DNP-SGが蓄積することが示された。以降、CDNB添加 15分後の赤血球内
DNP-SG蓄積を評価することでMRP機能に及ぼす各種阻害剤の影響を評価した。
0
1
2
3
0 15 30
****
DN
P-S
G a
ccu
mu
lati
on
(n
mo
l/m
g p
rote
in)
Time (min)
N.S.
††
Fig. 23. Effect of 10 µM MK-571 (●) on DNP-SG
accumulation after application of CDNB in washed
erythrocyte. Control (○) represents the results in the
absence of MRP substrate/inhibitor in the medium
at 37°C. Concentration of DNP-SG in erythrocyte
was determined 15 and 30 min after application of
CDNB (10 µM) at 37°C. Each value represents the
mean ± S.E. of three trials. **P < 0.01: significantly
different from the value for control. †† P < 0.01:
significantly different from the value for 15 min.
N.S.: Not significant.
28
3.2. 洗浄赤血球における CDNB添加後の赤血球内 DNP-SG蓄積に及ぼす bilirubin の影響
IOV において強いMRP阻害作用を示した bilirubin の影響について洗浄赤血球を用いて検討し
た。Bilirubin により赤血球内 DNP-SG蓄積が有意に増加したことから、bilirubin は赤血球膜透過性
の高いMRP阻害剤であることが示された (Fig. 24)。
Fig. 24. Effects of MK-571 and bilirubin on DNP-SG accumulation after application of
CDNB in washed erythrocyte. Control represents the results in the absence of any MRP
substrate/inhibitor in the medium at 37°C. Concentrations of DNP-SG in erythrocyte was
determined 15 min after application of CDNB (10 µM) at 37°C. Each value represents the
mean ± S.E. of three trials. **P < 0.01: significantly different from the value for control.
DN
P-S
G a
ccu
mu
lati
on
(%
of
con
tro
l)
0
300
600
900
**
**
29
3.3. 洗浄赤血球における CDNB添加後の赤血球内 DNP-SG蓄積に及ぼす血漿成分の影響
赤血球MRP機能に及ぼす血漿成分の影響について検討した。なお、血漿成分はアセトニトリ
ルで除タンパクしたものを用いた。洗浄赤血球において急性腎障害ラットの血漿成分により
CDNB添加後の赤血球内 DNP-SGが有意に増加した (Fig. 25)。この結果より、急性腎障害ラット
血漿成分中にはMRP阻害剤が存在し、その一部には膜透過型のものが含まれていることが示され
た。
0
100
200
300
400
500
DN
P-S
G a
ccu
mu
lati
on
(%
of
con
tro
l)
*
†
Fig. 25. Effect of plasma components obtained from control and ARF rats on DNP-SG
accumulation after application of CDNB in washed erythrocyte. Control represents the
results in the absence of any MRP substrate/inhibitor in the medium at 37°C. Plasma
components were obtained from deproteinized plasma of control and ARF rats after 24 h
glycerol treatment. Concentrations of DNP-SG in erythrocyte was determined 15 min after
application of CDNB (10 µM) at 37°C. Each value represents the mean ± S.E. of four trials.
*P < 0.05: significantly different from the value for control. † P < 0.05: significantly different
from the value for 10% control plasma.
30
3.4. 洗浄赤血球における CDNB添加後の赤血球内 DNP-SG蓄積に及ぼす uremic toxins の影響
IOV において MRP阻害作用を示した protein-bond 型 uremic toxinsのMRP 阻害作用について
洗浄赤血球を用いて同様に検討した。CMPFと kynurenine により CDNB添加後の赤血球内 DNP-
SGの蓄積傾向が認められた (Fig. 26)。
Fig. 26. Effects of protein-bond solutes of uremic toxins on DNP-SG accumulation after
application of CDNB in washed erythrocyte. Control represents the results in the absence
of any MRP substrate/inhibitor in the medium at 37°C. Concentrations of DNP-SG in
erythrocyte was determined 15 min after application of CDNB (10 µM) at 37°C. Each
value represents the mean ± S.E. of three trials.
0
100
200
300
DN
P-S
G a
ccu
mu
lati
on
(%
of
con
tro
l)
31
第 4節 IOVと洗浄赤血球を用いた kynurenic acid と kynurenineの MRP 阻害作用の解析
Kynurenineは kynurenic acid の前駆体であり、細胞内で kynurenic acid に代謝されることが知ら
れている。IOV と洗浄赤血球を用いて、種々の濃度における kynurenineと kynurenic acidが赤血球
MRP機能に及ぼす影響について検討した。
4.1. DNP-SGの IOV 取り込みに及ぼす kynurenic acid および kynurenineの影響
IOV を用いて DNP-SGの取り込みに及ぼす kynurenic acidと kynurenine の影響について検討し
た。Kynurenic acidは濃度依存的に DNP-SGの取り込みを阻害したが、kynurenineは 100 µM にお
いてもMRP阻害作用を示さなかった (Fig. 27)。
0
40
80
120
Control 10 50 100 10 50 100
DN
P-S
G u
pta
ke
(% o
f co
ntr
ol)
**
*
**
Kynurenic acid (µM) Kynurenine (µM)
Fig. 27. Effects of kynurenic acid and kynurenine on DNP-SG uptake by IOV. IOV was
incubated with DNP-SG (20 µM) for 30 min at 37°C. Each value represents the mean ±
S.E. of three trials. *P < 0.05, **P < 0.01: significantly different from the value for control.
32
4.2. 洗浄赤血球における赤血球内 DNP-SG蓄積に及ぼす kynurenic acidおよび kynurenine の影響
洗浄赤血球における CDNB添加後の DNP-SGの蓄積に及ぼす kynurenic acid と kynurenineの影
響について検討した。CDNB添加後の赤血球内 DNP-SGの蓄積は kynurenineにより有意に増加し
たが、kynurenic acid による蓄積は 100 µM においても認められなかった (Fig. 28)。IOV において
認められた MRP阻害作用が洗浄赤血球において認められなかったのは、kynurenic acid が赤血球膜
を透過しないためと考えられた。
0
200
400
600
Control 10 50 100 10 50 100
Kynurenic acid (µM) Kynurenine (µM)
DN
P-S
G a
ccu
mu
lati
on
(%
of
con
tro
l)
*
Fig. 28. Effects of kynurenic acid and kynurenine on DNP-SG accumulation after
application of CDNB in washed erythrocyte. Control represents the results in the absence
of any MRP substrate/inhibitor in the medium at 37°C. Concentrations of DNP-SG in
erythrocyte was determined 15 min after application of CDNB (10 µM) at 37°C. Each
value represents the mean ± S.E. of three trials. *P < 0.05: significantly different from the
value for control.
33
第 5節 小括
本章では、赤血球MRP機能に及ぼす uremic toxins や glycerol 誘発急性腎障害ラットの血漿成
分の影響について in vitro実験系で検討した。
第 1節において、調製した小胞体が反転していることや DNP-SGの ATP 依存的な取り込みを
示したことから、調製した IOV が MRP機能の評価系として有用であることが確認された。第 2
節ではコントロールおよび急性腎障害ラットの血漿成分、bilirubin および大部分の protein-bond型
uremic toxins が MRP機能を阻害することが示された。第 3 節では、洗浄赤血球において、急性腎
障害ラット血漿成分および bilirubin により CDNB添加後の赤血球内 DNP-SGは有意な蓄積を示
し、CMPFと kynurenineにより DNP-SGの蓄積傾向が認められた。これらの阻害剤は赤血球膜を
透過し、MRP機能を阻害する可能性が示された。第 4節では、IOV において、kynurenic acid によ
り DNP-SGの取り込みが有意に阻害されたが、洗浄赤血球においては kynurenic acidの前駆体であ
る kynurenine により CDNB添加後の DNP-SGが有意に蓄積したことから、赤血球内へと取り込ま
れた kynurenineが細胞内で kynurenic acidに代謝された後、赤血球膜MRP機能を阻害した可能性
が示された。
以上の結果より、glycerol 誘発急性腎障害ラット血漿中にはいくつかのMRP 阻害剤が含まれ
ており、その中でも膜透過型のもの、および膜透過後、赤血球内で代謝された代謝物が in vivoに
おいて赤血球MRP機能を阻害することが示された (Fig. 29)。
Fig. 29. Schematic representation of MRP inhibition by uremic/endogenous inhibitors in erythrocyte.
CDNB, 1-chloro-2,4-dinitrobenzene; CMPF, 3-carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furanpropanoic acid;
DNP-SG, 2,4-dinitrophenyl-S-glutathione; GST, glutathione S-transferase; KYN, kynurenine; KYA,
kynurenic acid; KAT, kynurenine amino transferase; LAT, L-amino acid transferase. MRPs, multidrug
resistance-associated proteins.
CDNB CDNB DNP-SG
KYAKYN
CMPF, Bilirubin
MRPs
KYNLAT
CMPF, Bilirubin
GST
KAT
DNP-SG
Erythrocyte membrane
Passive diffusion
Passive diffusion
34
第 III 章 Cisplatin 誘発急性腎障害ラットにおける MRP の発現と機能解析
Cisplatin は非小細胞性肺癌、リンパ腫、黒色種、非上皮性悪性腫瘍、神経芽細胞腫など多く
の腫瘍に対して用いられる白金製剤である (Florea and Büsselberg, 2011; Apps et al. 2015) (Fig.
30A)。しかしながら、臨床上、腎尿細管上皮細胞に cisplatin が蓄積することで誘発する腎機能障
害が問題となっており、cisplatinの投与量は制限されている (Arany and Safirstein, 2003; Peres and
da Cunha, 2013)。特に cisplatinは他の白金製剤と比較しても腎への蓄積性が高く、腎毒性を示す。
例えばオキサリプラチン (Fig. 30B) は、腎尿細管基底膜に存在する organic cation transporter 2
(OCT2) の基質であり、OCT2 によって上皮細胞内へと取り込まれるが、腎尿細管刷子縁膜に発現
する multidrug and toxin extrusion protein 2-K (MATE2-K) の基質でもあるため、効率良くMATE2-K
によって細胞外 (尿細管側) へと排出され、腎毒性を示さない。またカルボプラチンやネダラプラ
チンは OCT2 の基質ではないため、上皮細胞内に取り込まれず腎毒性を示さない (Yonezawa,
2012)。一方、cisplatinは OCT2の基質ではあるが、MATE2-K の基質ではないため排出効率が悪
く、腎細胞内に蓄積し、腎障害を誘発しやすいと考えられている (Yokoo et al., 2007)。Cisplatin は
腎障害を誘発しやすく、動物実験においてもしばしば薬剤性急性腎障害モデルとして使用され
る。これまでの研究で、cisplatin誘発急性腎障害ラットにおいて、いくつかのトランスポーターの
発現が変動することが報告されている。例えば、cisplatin誘発急性腎障害ラットにおいて腎尿細管
細胞の基底膜側に発現する organic anion transporter 1 (OAT1), OAT2, OCT1および OCT2 の発現は低
下し、刷子縁膜側に発現する MRP2と MRP4の発現は増加することが報告されている (Erman et
al. 2014)。しかしながら、腎臓以外の組織における MRP発現や機能の変動についてはほとんど検
討されていない。本章では、cisplatin 誘発急性腎障害ラットにおける各組織 MRPの発現と機能に
ついて解析すると共に、第 1章の glycerol 誘発急性腎障害モデルと比較し検討した。
Fig. 30. Chemical structures of cisplatin (A) and oxaliplatin (B)
NH2
NH2
Pt
O
O
O
O
Pt
Cl NH2
Cl NH2
A B
35
第 1節 Cisplatin 投与後の血漿中 indoxyl sulfate 濃度と腎障害および肝障害の評価
Cisplatin 投与後の腎障害誘発を確認するため、血漿中の indoxyl sulfate (IS) の濃度を経時的に
測定することで腎障害を評価した。本実験に用いた cisplatin の投与量は 9 mg/kgであり、ラットに
とって致死的ではなく、急性腎障害を誘発する最大投与量である (Liu et al., 2012)。血漿中 IS濃度
は cisplatin投与 48時間まで変化しなかったが、72時間後に 152 µMまで増加した (Fig. 31, Table 9)。
さらに creatinine 値も約 6.8 倍増加したことから、急性腎障害の誘発が確認された (Table 9)。また、
cisplatin投与 72時間後に、肝障害の指標である AST および ALT活性、さらには total bilirubinおよ
び direct bilirubin 濃度を測定したところ、変化は認められなかったことから、本病態モデルにおい
て cisplatin 投与による肝障害は併発していないことが確認された (Table 9)。
Control ARF
Indoxyl sulfate (µM) 4.02 ± 0.94 151.9 ± 29.6**
Creatinine (mg/dL) 0.33 ± 0.08 2.23 ± 0.41**
AST (IU) 63.0 ± 5.19 70.1 ± 15.3
ALT (IU) 18.6 ± 0.62 17.6 ± 5.48
Total bilirubin (mg/dL) 0.11 ± 0.005 0.10 ± 0.014
Direct bilirubin (mg/dL) 0.04 ± 0.003 0.04 ± 0.004
Table 9. Biochemical data for kidney and liver functions in cisplatin-induced ARF rats
Fig. 31. Plasma concentration of indoxyl sulfate after
administration of cisplatin (●). Cisplatin was administrated
by intraperitoneal injection (9 mg/kg). Control rats (○)
were treated by same volume of saline. Plasma
concentrations of indoxyl sulfate were measured at 24, 48,
and 72 h after administration. Each value represents the
mean ± S.E. of seven rats. **P<0.01: significantly different
from the value for control rats.
AST, aspartate aminotransferase; ALT, alanine aminotransferase. ARF rats were induced by
an intraperitoneal injection of cisplatin (9 mg/kg). Control rats were treated by same volume
of saline. The concentrations of indoxyl sulfate, creatinine, toral bilirubin, and direct bilirubin
and activities of AST and ALT were measured at 72 h after injection. Each value represents
the mean ± S.E. of three to seven rats. **P<0.01: significantly different from the value for
control rats.
0
50
100
150
200
0 24 48 72
Time (h)
Pla
sma
con
cn. o
f IS
(µ
M)
**
36
第 2節 Cisplatin 誘発急性腎障害ラットにおける組織MRP 機能の解析
第 1 節では cisplatin 投与 72 時間後に急性腎障害の誘発が確認された。この急性腎障害ラット
を用いて、組織の MRP機能について解析した。
2.1. Cisplatin 誘発急性腎障害ラットにおける組織 MRP機能の評価
組織MRP機能は、CDNB静注後の細胞内 DNP-SG濃度で評価した (Fig. 3)。CDNB静注後の組
織 DNP-SG濃度は、脳、肝臓および腎臓で有意に増加したことから、腎障害時、これらの組織にお
いて MRP機能が低下したことが示された (Fig. 32)。
A B
0
2
4
6
8
Brain Liver Kidney Spleen
Tis
sue
con
cen
trat
ion
of
DN
P-S
G
(nm
ol/
g t
issu
e)
**
0
8
16
24
Lung
****
Fig. 32. The concentrations of DNP-SG in the brain, liver, kidney, and spleen (A), and lung (B)
30 min after intravenous administration of CDNB in control ( ) and ARF ( ) rats. The dose of
CDNB was 30 µmol/kg. Each value represents the mean ± S.E. of results from five rats. **P <
0.01: significantly different from the value for control.
37
2.2. CDNB静注後の DNP-SGの血漿中濃度および胆汁排泄
CDNB静注後の DNP-SG の血漿中濃度と胆汁排泄を経時的に測定した。急性腎障害ラットにお
いて CDNB静注後の血漿中 DNP-SG濃度は有意に増加し (Fig. 33A)、胆汁排泄は低下したことから
(Fig. 33B)、DNP-SGの血中滞留性が増加していること、また肝 MRP2の機能が低下していることが
示された。
2.3. DNP-SG定速静注時の DNP-SGの組織移行性およびクリアランスの解析
DNP-SG定速静注後の組織および血漿中濃度から各種クリアランスを算出し、腎障害時のDNP-
SG の薬物動態について解析した。DNP-SG の組織移行性は、組織内濃度を血漿中濃度で除した値
(Kp 値) で評価した。急性腎障害ラットにおいて、DNP-SG定速静注後の Kp 値は、肝臓で減少傾向
を示し、腎臓で有意に減少した (Fig. 34)。また、血漿中濃度 (Cpss) は約 3.3倍増加した (Fig. 35, Table
10)。この結果より、急性腎障害時、DNP-SGの肝臓および腎臓への取り込みが減少することが示さ
れた。また、血漿中濃度と胆汁排泄から、DNP-SGの各種クリアランスを算出すると、全身クリア
ランス (CLtot) は 1/3 に減少し、胆汁クリアランス (CLbile) は約 1/7まで減少し、肝内濃度で補正し
た胆汁固有クリアランス (*CLbile) も約 1/5 減少したことから、急性腎障害時は肝取り込みトランス
ポーターおよび排出トランスポーター (MRP2) の両方の機能が低下することが示された (Table
10)。
Fig. 33. Concentrations of DNP-SG in plasma (A) and cumulative biliary excretion of DNP-SG
(B) after intravenous administration of CDNB in control (○) and ARF (●) rats. The dose of
CDNB was 30 µmol/kg. Each value represents the mean ± S.E. of results from five rats. *P <
0.05: significantly different from the value for control.
0
40
80
120
0 10 20 30
*
Cum
ula
tiv
e b
ilia
ry e
xcr
etio
n
of
DN
P-S
G (
% o
f d
ose
)
A
*
* *
* * * *
B
Pla
sma
con
cn. o
f D
NP
-SG
(μ
M)
Time (min)
0
10
20
30
40
0 20 40 60
Time (min)
1
10
100
1000
0 10 20 30
**
*
38
Fig. 34. Kp values of DNP-SG in the brain, liver, kidney, spleen, and lung under a steady-state
plasma concentration of DNP-SG in control ( ) and ARF ( ) rats. DNP-SG was administrated
by a constant-rate infusion at a dose of 30 µmol/h. Each value represents the mean ± S.E. of
results from three rats. *P < 0.05: significantly different from the value for control.
*
Kp
val
ue
of
DN
P-S
G
0
0.05
0.1
0.15
0.2
Brain Liver Kidney Spleen Lung
0
25
50
75
100
0 50 100
**
**
****
** **
Pla
sma
con
cn. o
f D
NP
-SG
(μ
M)
Time (min)
Fig. 35. The plasma concentrations of DNP-SG during a constant-rate infusion of DNP-SG in
control (○) and ARF (●) rats. DNP-SG was administrated at a dose of 30 µmol/h. Each value
represents the mean ± S.E. of results from three rats. **P < 0.01: significantly different from the
value for control.
39
Control ARF
Cpss (µM) 27.1 ± 1.56 89.8 ± 4.82**
CLtot (mL/min/kg) 55.3 ± 2.55 18.4 ± 1.19**
CLbile (mL/min/kg) 8.89 ± 0.44 1.34 ± 0.46**
Concn. in liver (nmol/g tissue) 1.79 ± 0.51 3.28 ± 0.62
*CLbile (mL/min/kg) 51.9 ± 10.1 10.2 ± 1.91*
Table 10. Total and biliary clearances of DNP-SG under a steady-state plasma
concentration of DNP-SG in control and ARF rats
DNP-SG was administrated by a constant-rate infusion at a dose of 30 µmol/h. CLbile
was estimated by dividing the biliary excretion rate with plasma concentration (Cpss) of
DNP-SG. *CLbile was estimated by dividing the biliary excretion rate with liver
concentration of DNP-SG. Each value represents the mean ± S.E. of results from three
rats. *P < 0.05, **P < 0.01: significantly different from the value for control.
40
2.4. MRP機能に及ぼす cisplatin の影響解析
Cisplatin誘発急性腎障害ラットにおいて脳、肝臓および腎臓のMRP機能は低下した (Fig. 32)。
この MRP機能の低下が cisplatinによる MRP機能の阻害を伴うかどうか確認するため、IOV を用い
て cisplatin 自身の MRP 阻害作用を確認した。また、cisplatin 投与 48 時間以内は腎障害を伴わない
ため (Fig. 31)、cisplatin投与 1時間後の組織MRP機能を評価した。
2.4.1. IOV による cisplatin の MRP阻害作用の評価
IOV を用いて、各濃度における cisplatin の MRP 阻害作用を評価した。1000 µM の cisplatin 存
在下で IOV への DNP-SGの取り込みが有意に阻害されたことから、高濃度の cisplatinはMRP機能
を阻害することが示された (Fig. 36)。ただし、臨床における cisplatinの血漿中濃度は 2-40 µM 程度
であり、臨床時の cisplatin 単独による MRP阻害の可能性は無視しうるものと考えられた。
Fig. 36. Effect of cisplatin on DNP-SG uptake by IOV. The concentrations of cisplatin were
10, 100, and 1000 µM, respectively. Control represents the result in the absence of cisplatin in
the medium (37°C). IOV was incubated with DNP-SG (20 µM) for 30 min at 37°C. Each value
represents the mean ± S.E. of results from three trials. *P < 0.05: significantly different from
the value for control.
0
40
80
120
Control 10 100 1000
DN
P-S
G u
pta
ke
(% o
f co
ntr
ol)
Cisplatin (µM)
*
41
2.4.2. Cisplatin 投与 1時間後の組織 MRP機能の評価
ラットにおいて、cisplatin の血漿中濃度は腹腔内投与 1 時間後に最も高くなると報告されてい
る (Los et al., 1989)。MRP 阻害作用をもつ cisplatin の影響を検討するため、cisplatin 投与 1 時間後
に CDNB を静注し、組織内 DNP-SG 濃度を測定した。CDNB 静注後の組織内 DNP-SG 濃度に変化
は認められなかったことから、cisplatin 誘発急性腎障害ラットにおける組織 MRP 機能の低下は、
cisplatinによるものではなく、腎障害によって惹起されていることが示された (Fig. 37)。
Fig. 37. The concentrations of DNP-SG in the brain, liver, kidney, spleen, and lung 30 min after
intravenous administration of CDNB in control ( ) and cisplatin-treated ( ) rats. Cisplatin
was administrated by an intraperitoneal injection (9 mg/kg) 1 h before CDNB injection. The
dose of CDNB was 30 µmol/kg. Each value represents the mean ± S.E. of results from three
rats.
0
2
4
6
Brain Liver Kidney Spleen
0
8
16
24
Lung
Tis
sue
con
cen
trat
ion
of
DN
P-S
G
(nm
ol/
g t
issu
e)
A B
42
Fig. 38. The mechanism of calcein accumulation after application of calcein-AM in HepG2 cells.
Calcein-AM, calcein-acetoxymethyl ester; P-gp, P-glycoprotein; MRPs, multidrug resistance-
associated proteins. Elacridar: P-gp inhibitor.
第 3節 HepG2細胞における急性腎障害ラット血漿成分のMRP 阻害効果の解析
HepG2 細胞はヒト肝癌由来細胞株であり、in vitro 実験系において肝臓の代替モデルとして広
く用いられている。また、以前の研究で、Caco-2 細胞 (ヒト大腸癌由来細胞株) に MRP 基質であ
る calcein の前駆体である calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) を添加した後、細胞内の calcein濃
度を測定することで、尿中の MRP阻害剤について解析した (Yokooji et al., 2014)。本節では、HepG2
細胞に calcein-AM を添加した後の細胞内 calcein 濃度を測定することで、コントロールおよび急性
腎障害ラット血漿成分中の MRP阻害作用について評価した。なお、calcein-AM 自身は P-gpの基質
であるため、MRP 機能のみを評価する目的で、P-gp 選択的阻害剤である elacridar 存在下で実験を
行った (Fig. 38)。
Calcein-AM P-gpCalcein-AM
HepG2 cell
MRPsCalcein
Calcein-AM
Calcein
Esterase
Passive diffusionElacridar
43
3.1. 阻害剤および血漿成分の MRP阻害作用の評価
コントロールラット血漿成分によって calcein-AM 添加後の細胞内 calcein 濃度は有意に増加し
たが、急性腎障害ラット血漿成分によって有意に減少した (Fig. 39)。急性腎障害ラット血漿成分に
よる細胞内 calcein濃度の減少は、①細胞外における calcein-AM から calcein への代謝増大、②血漿
成分による calcein の細胞内取り込み阻害、③細胞内における calcein-AM から calcein への代謝阻
害、などが考えられた。実験においてこれらの影響を除外するために、まず①〜③について検討し
た。
Fig. 39. Accumulation of calcein in HepG2 cells after application of calcein-AM (2 µM).
HepG2 cells were pre-incubated with PBS containing 2 µM elacridar with or without plasma
components or 50 µM MK-571 at 37°C for 15 min before the accumulation study of calcein.
The concentration of intracellular calcein was measured 60 min after calcein-AM
application with or without plasma components or MK-571. Each value represents the mean
± S.E. of results from three trials. **P < 0.01, *P < 0.05: significantly different from the value
for control.
*
**Cal
cein
accu
mu
lati
on
(% o
f co
ntr
ol)
0
100
200
300
400
**
44
3.2. 血漿成分による calcein-AM 代謝活性および calceinの HepG2細胞への取り込み評価
血漿成分に calcein-AM を添加後、37°Cでインキュベーションし、代謝物である calcein の濃度
を経時的に測定した。コントロール血漿成分と比較し、急性腎障害ラット血漿成分による calcein-
AMの代謝は有意に増大した (Fig. 40)。血漿成分はアセトニトリルで除タンパクしたものであるが、
コントロールおよび急性腎障害ラット血漿成分には calcein-AM の代謝活性が認められた。また、そ
の活性は急性腎障害ラット血漿成分の方がコントロールラット血漿成分よりも強いことから、①細
胞外における calcein-AM から calcein への代謝増大の可能性が考えられた。
MK-571存在下で calcein-AMあるいは calcein添加後の細胞内 calcein濃度を測定すると、calcein
添加時では変化は認められず、calcein-AM 添加時のみ calcein の蓄積が増加した (Fig. 41)。また、
calcein-AM と比べ calcein 添加時は細胞内 calcein濃度が著しく低いことから、calcein は HepG2細胞
にほとんど取り込まれないことが確認された。従って、②血漿成分による calcein の細胞内取り込
み阻害の可能性は除外された。
Fig. 40. Effect of plasma components on the calcein-AM metabolism to calcein.
Calcein-AM was incubated with 10% plasma components obtained from control (○)
and ARF (●) rats at 37°C. Each value represents the mean ± S.E. of results from three
trials. **P < 0.01, *P < 0.05: significantly different from the value for control.
Cal
cein
pro
du
ctio
n (
pm
ol/
mL
pla
sma)
0
300
600
900
0 25 50 75 100
Time (min)
**
**
**
***
45
Fig. 41. Accumulation of calcein in HepG2 cells after application of calcein-AM (A) or
calcein (B). HepG2 cells were pre-incubated with PBS containing 2 µM elacridar with or
without 50 µM MK-571 at 37°C for 15 min before the accumulation study of calcein. The
concentration of intracellular calcein was measured 60 min after calcein-AM application (2
µM) or calcein (2 µM). Each value represents the mean ± S.E. of results from three trials.
**P < 0.01: significantly different from the value for control.
0
10
20
30
40
Cal
cein
accu
mu
lati
on
(p
mo
l/m
g p
rote
in)
0
200
400
600
800
A B
**
46
3.3. 血漿成分および cisplatin のMRP阻害作用の評価
3.2. の結果より、血漿成分による細胞外での calcein-AM の代謝を考慮し、血漿成分および阻害
剤はプレインキュベーションのみに使用した。コントロールラット血漿成分および cisplatin による
calcein-AM 添加後の細胞内 calcein の蓄積は認められず、急性腎障害ラット血漿成分において MK-
571 と同程度の細胞内 calcein 蓄積が認められた (Fig. 42)。この結果より、cisplatin 誘発急性腎障害
ラット血漿成分中にMRP阻害剤が含まれていることが示された。
0
40
80
120
160
* *
Cal
cein
accu
mu
lati
on
(% o
f co
ntr
ol)
Fig. 42. Accumulation of calcein in HepG2 cells after application of calcein-AM (500 nM). HepG2
cells were pre-incubated with PBS containing 2 µM elacridar with or without plasma components,
cisplatin, or MK-571 at 37°C for 30 min before the accumulation study of calcein. The concentration
of intracellular calcein was measured 15 min after calcein-AM application with or without plasma
components, cisplatin or MK-571. Each value represents the mean ± S.E. of results from three trials.
*P < 0.05: significantly different from the value for control.
47
第 4節 急性腎障害ラットにおける組織 MRP タンパク発現量の解析
第 2節により、cisplatin誘発急性腎障害時、脳、肝臓および腎臓の MRP機能が低下することが
示された。この MRP機能の低下は発現の変動を伴うか否かについて、Western blot解析により急性
腎障害ラットにおける MRP1-4 のタンパク発現量の変動を測定した。脳において、MRP 発現に変
化は認められなかったが (Fig. 43A)、腎障害ラットの肝臓において MRP2の発現は増加傾向を示し、
腎臓において、MRP2/4の発現が有意に増加した (Fig. 43B, 44)。
Fig. 43. The relative protein levels of MRP1-4 by Western blot analysis in the brain (A) and
liver (B) of control ( ) and ARF ( ) rats. ARF rats were induced by an intraperitoneal
injection of cisplatin (9 mg/kg), and control rats were treated with the same volume of saline.
Rats were examined at 72 h after injection. Each value represents the mean ± S.E. of results
from three trials.
0
1
2
Mrp1 Mrp2 Mrp3 Mrp4
Rel
ativ
e p
rote
in e
xp
ress
ion
of
MR
Ps
in b
rain
A
MRP1 MRP2 MRP3 MRP4
0
1
2
3
Mrp1 Mrp2 Mrp3 Mrp4
Rel
ativ
e p
rote
in e
xp
ress
ion
of
MR
Ps
in l
iver
B
MRP1 MRP2 MRP3 MRP4
48
Fig. 44. The relative protein levels of MRP1-4 by Western blot analysis in the kidney of
control ( ) and ARF ( ) rats. ARF rats were induced by an intraperitoneal injection of
cisplatin (9 mg/kg), and control rats were treated with the same volume of saline. Rats were
examined at 72 h after injection. Each value represents the mean ± S.E. of results from three
trials. *P < 0.05: significantly different from the value for control.
Rel
ativ
e p
rote
in e
xp
ress
ion
of
MR
Ps
in k
idn
ey
0
2
4
6
Mrp1 Mrp2 Mrp3 Mrp4
*
*
MRP1 MRP2 MRP3 MRP4
49
第 5節 小括
本章では、cisplatin によって誘発される薬剤性急性腎障害が組織MRPの発現と機能に及ぼす影
響について解析を行った。
第 1 節では、cisplatin によって急性腎障害が誘発されたことが確認された。第 2 節では、急性
腎障害ラットに CDNBを投与した結果、脳、肝臓および腎臓内 DNP-SG 濃度が増加したことから、
これらの組織において、MRP機能が低下していることが示された。第 3節により、cisplatin 誘発急
性腎障害ラットの血漿成分中に MRP 阻害剤が含まれており、それらが肝臓の MRP 機能を阻害す
ることが示された。第 4節では、腎臓の MRP2/4の発現が有意に増加したことから、MRP機能の低
下に伴い、代償作用としてその発現が増加することが示唆された。
以上の結果より、cisplatin 誘発急性腎障害時のMRP 機能は、発現の増加に関わらず、腎障害時
に血漿中に蓄積する uremic toxins もしくは内因性物質によって阻害されることが示された。
50
考察
第 I章 Glycerol 誘発急性腎障害ラットにおける組織および赤血球 MRP機能の評価
【Glycerol 誘発急性腎障害ラットにおける肝内 GSH濃度の変動】
第 I章、第 2 節および第 3 節により、腎障害時、肝臓の MRP 機能が低下し、GSH の肝内濃度
が増加した (Fig. 4, 5, 11A)。GSHは MRPの基質であることから (Klaassen and Aleksunes, 2010)、肝
MRP機能の低下により GSHの肝内濃度が増加したことが考えられる。従って、肝臓内に存在する
内因性 MRP 基質の濃度は腎障害時に変動する可能性が考えられる。今後は、腎障害による代償的
な GSH の合成促進かどうか確認するため、GSH の合成に関わる-グルタミルシステイン合成酵素
やグルタチオン合成酵素の活性の変動についても解析するなど、より詳細な検討が必要である。
【MTX の赤血球内蓄積】
赤血球MRP機能の低下については第 II章で考察する。ここではまず、MTXの赤血球内分布に
ついて考察する。第 4節では、DNP-SG以外のMRP基質である MTX の赤血球内濃度に及ぼす急性
腎障害の影響について検討した。急性腎障害ラットにおいて、MTX の血漿中濃度は有意に増加し、
赤血球内濃度も増加した (Fig. 15)。MTX の消失過程は主に腎排泄であるため、腎機能の低下によ
り血漿中濃度が増加し、赤血球内濃度も増加したことが考えられた。また、急性腎障害ラットにお
いて赤血球内分布 (Kp 値) は増加する傾向を示したが、CDNB 投与後の DNP-SG 蓄積と比較する
と、その増加はあまり顕著なものではなかった (Fig. 7, 8, 15)。MTX のオクタノール/水分配係数 (log
D) は-1.4 であり (Moura et al., 2011)、比較的水溶性の高い化合物のため、細胞内への取り込みは
RFCや proton-coupled folate transporter (PCFT) などのトランスポーターが関与する (Murakami et al,
2010; Urquhart et al, 2010)。Ogungbenro らは生理学的薬物速度論 (PBPKモデル) から、MTX の赤血
球内への取り込み過程において、Km と Vmax は 1.1 nM、7.48 nM/h と報告している (Ogungbenro
and Aarons, 2014)。本実験におけるMTX の血漿中濃度は 16.7-18.2 µM (コントロール)、27.5-53.3 µM
(急性腎障害) であることから (Fig. 15)、赤血球への取り込み過程にすでに飽和が生じていることが
考えられる。従って、血漿中濃度の増加に伴った赤血球内濃度の増加は認められず、見かけ上 Kp
値が増加しなかったものと考えられた。今後、MTX の投与量を幅広く変えて、検討する必要があ
る。
【その他のMRP基質の赤血球内蓄積】
MRP 基質の多くは水溶性化合物であり、中には脂溶性の高い MRP 基質も存在する。例えば、
抗マラリア薬であるメフロキンは赤血球内に寄生しているマラリアに対して薬効を示す。メフロキ
51
ン (50 mg/kg) を経口投与したマウスの Kp値 (赤血球内濃度/血漿中濃度比) は 5.8-11.2 (2-72時間)
であることが報告されており (Tao et al., 2015)、メフロキンの赤血球移行性は非常に高いことが示
されている。さらに、メフロキンは MRP基質であるため (Wu et al., 2005; Wurtz et al 2014)、赤血球
の MRP 機能が変動することによってメフロキンの赤血球内濃度およびマラリアに対する治療効果
は変わる可能性が考えられる。また、その他の臨床基質として、シクロスポリンが高い赤血球移行
性を示すことが知られている。そのためシクロスポリンは therapeutic drug monitoring (TDM) におい
て血漿中濃度を測定する際に誤差が生じやすいことから、全血中濃度の測定が推奨されている。シ
クロスポリンは P-gp の基質であるが、MRP2の基質でもある (Kato et al., 2010)。また、胆汁排泄に
より消失するが、腎移植患者においてシクロスポリンの血中滞留性が亢進することが報告されてお
り (Etienne et al., 2010)、これには赤血球や肝臓の MRP機能の低下が関与している可能性が考えら
れる。今後、臨床で使用される MRP 基質の赤血球内蓄積に及ぼす急性腎障害の影響を解析するた
め、メフロキンやシクロスポリンなどの血球移行性の高い MRP 基質についても検討する必要があ
る。
第 II章 赤血球膜 MRP機能に及ぼす uremic toxins および腎障害ラット血漿成分の影響解析
【赤血球膜MRPsによる DNP-SGの輸送】
血漿成分中のMRP阻害剤を探索するため、赤血球でのMRP機能評価系として IOV を調製し
た。調製した IOV の反転率は、37.5%であり、文献値の 30~57.5% (残りは unsealed vesicles) と同
程度であった (Table 6) (Heijn et al., 1992; Klokouzas et al., 2003; Rychlik et al., 2003)。また、IOV は
ATP 依存的な DNP-SGの取り込みを示し、MRP阻害剤であるMK-571 と probenecidによりその取
り込みが阻害されたことから、DNP-SGはMRPによって IOV に取り込まれていることが示された
(Fig. 18, 20)。IOV は凍結保存により、1年間、輸送機能を維持することが報告されているため
(Heijn et al., 1992)、調整後 3ヶ月以内のものを取り込み実験に使用した。調製した IOV を用いて
DNP-SGの濃度依存的な IOV 取り込みを測定した結果、DNP-SGの輸送は高親和性と低親和性輸
送の二相性を示した (Fig. 19B)。赤血球膜にはMRP1, 4, 5 が発現しており、DNP-SGの高親和性輸
送にはMRP1が、低親和性輸送には MRP4, 5がそれぞれ関与することが報告されている (Bartosz
et al., 1993; Ogawa et al., 2006)。また、得られた速度論的パラメーターを用いて、各濃度での輸送
速度に占める高親和性輸送と低親和性輸送の寄与率を算出した結果、in vivo において有意な赤血
球内蓄積が認められた DNP-SG濃度 (5~40 µM) における高親和性の寄与率は 58~88%であったこ
とから、glycerol 誘発急性腎障害ラットにおける赤血球膜MRP機能の低下は、主に MRP1の機能
が阻害されたためと考えられた (Fig. 19. Table 7, 8)。
52
【赤血球膜MRP機能に及ぼす uremic toxins の影響】
急性腎障害ラット血漿成分により、DNP-SGの IOV 取り込みが阻害され、洗浄赤血球におい
て、CDNB添加後の赤血球内 DNP-SG濃度は増加した (Fig. 21, 25)。従って、腎障害時、血漿中に
蓄積するMRP阻害剤の一部には赤血球膜透過型のものが存在し、それらが in vivo において赤血
球の MRP機能を阻害したと考えられた。また、本章において、腎障害患者の血漿中 uremic toxins
濃度を参考に (Uremic toxin-Data base from European Uremic Toxin Work Group. http://www.uremic-
toxins.org/DataBase. html (February 13, 2016))、腎障害ラット血漿中に蓄積する uremic toxins および
内因性物質のMRP阻害剤を探索したところ、IOV において bilirubin、p-cresol、hippuric acid、
indoxyl sulfate、indole 3-acetic acid、kynurenic acidおよび CMPFが直接 MRPを阻害することが示さ
れた (Fig. 22)。しかしながら、p-cresol、hippuric acid、indoxyl sulfate、indole 3-acetic acid および
kynurenic acid は洗浄赤血球においてはMRP阻害作用を示さなかったことから、これらの uremic
toxins は赤血球内への膜透過性が低いことが考えられた (Fig. 26)。一方で、洗浄赤血球において、
bilirubinによりMRP機能が有意に阻害され、CMPF によって阻害傾向が認められた (Fig. 24, 26)。
Glycerol誘発急性腎障害ラットにおいて、血漿中に増加した bilirubin は高い膜透過性を示し、容易
に脂質二重層を通過することが報告されている (Table 4) (Zucker et al., 1999; Levitt and Levitt,
2014)。従って、bilirubinは単純拡散によって赤血球に分布し、MRP機能を阻害したことが考えら
れた (Fig. 29)。また、CMPF のオクタノール/水分配係数 (log P) は 1.2であり、オクタノール/リ
ン酸バッファー (pH 7.4) 分配係数 (log D) は-0.59 であることから、比較的脂溶性の高い uremic
toxin といえる (Costigan et al., 1996; Vanholder and De Smet, 1999)。従って、bilirubin 同様、単純拡
散により赤血球に分布し、MRP機能を阻害したことが考えられた (Fig. 29)。さらに、kynurenic
acidは IOV でMRP阻害作用を示したが、洗浄赤血球ではその阻害作用が認められなかった (Fig.
27, 28)。一方で、kynurenine は洗浄赤血球でMRP阻害作用を示したが、IOV ではその阻害作用が
認められなかった (Fig. 27, 28)。Kynurenine は細胞内に存在する kynurenine amino transferase (KAT)
によって kynurenic acidに代謝されることが報告されている (Hartai et al., 2005)。また、kynurenine
は L-amino acid transporter (LAT) の基質であり、LAT は赤血球膜にも発現している (Yao et al.,
1993; Hara et al., 2008)。従って、前駆体である kynurenine が LAT によって細胞内へと取り込まれ
た後、KAT により kynurenic acid へと代謝された代謝物が赤血球膜 MRP機能を阻害することが考
えられた。即ち、kynurenineと kynurenic acid の IOV と洗浄赤血球における結果の相違は、化合物
の膜透過性の違いによるものと考えられた。
第 III章 Cisplatin 誘発急性腎障害ラットにおける MRPの発現と機能解析
【Cisplatin誘発急性腎障害ラットにおける組織トランスポーターの機能変動】
急性腎障害ラットに DNP-SG を定速静注したところ、肝の Kp 値は減少傾向を示し、腎の Kp
53
値は有意に減少した (Fig. 34)。肝内 DNP-SG濃度で補正した*CLbile (胆汁固有クリアランス) が減少
したことから、肝MRP2による胆汁排泄機能は減少していることが示された (Table 10)。同様に Kp
値も減少したことから、DNP-SG の肝への取り込み機能も減少するものと思われる (Fig. 34, Table
10)。DNP-SGは OATP2の基質でもあることが報告されている (Li et al., 2000)。OATP2は脳、肝臓、
腎臓の基底膜側に発現し、基質薬物の細胞内への取り込みに関わっている (Guo and Jiang, 2010)。
末期腎不全患者において OATP2 の基質である erythromycin の肝クリアランスが低下し、その理由
として CMPFによる OATP2の阻害が報告されている (Sun et al., 2004)。即ち、cisplatin誘発急性腎
障害ラットにおける DNP-SG の肝および腎への取り込み低下は、MRP2 機能の阻害に加え、CMPF
などの uremic toxins によって OATP2 の機能も阻害されたためと考えられた。
【腎障害時における組織 MRP発現】
第 4節で、ciplatin誘発急性腎障害ラットにおいて、肝臓のMRP2の発現は増加傾向を示し、腎
臓の MRP2/4 の発現は有意に増加した (Fig. 43B, 44)。この結果は今までの報告と類似しており、腎
障害時、肝臓と腎臓の P-gp、MRPs などの ABC トランスポーターの発現量が増加する傾向にある
ことが報告されている (Haung et al., 2000; Naud et al., 2008 & 2011; Liu et al., 2012; Erman et al., 2014)。
一方で、OATsや OCTs などの SLCトランスポーターの発現量は減少することが報告されている (Ji
et al., 2002; Aoyama et al., 2003; Deguchi et al., 2004; Matsuzaki et al., 2007 & 2008; Naud et al., 2011)。こ
れらの結果は、腎障害時、細胞内に異物を蓄積させないように、代償反応としてトランスポーター
の発現が変化した可能性が考えられる。しかしながら、腎障害時、消化管の MRP2の発現も減少す
ることが報告されており、一部の組織間において発現の増減には差異が認められる。(Naud et al.,
2007, Tsujimoto et al., 2012)。これらの違いは、トランスポーターの膜局在性の違いや、核内受容体
への結合性など、様々な要素が関わっている可能性が考えられ、今後 uremic toxinsが生体防御機構
における組織MRP発現に及ぼす影響についてさらに詳細な解析が必要である。
【Glycerol 誘発急性腎障害ラットおよび cisplatin誘発急性腎障害ラットの組織 MRP機能変動】
Cisplatin 誘発急性腎障害ラットでは、glycerol誘発急性腎障害ラットと比較し、脾臓での DNP-
AGの蓄積性は認められないものの、より全身的に MRP機能が低下した (Fig. 4, 32)。Cisplatin投与
72 時間後の血漿中 indoxyl sulfate 濃度は glycerol 誘発急性腎障害ラットと比べて約 1.5 倍高い値を
示した (Table 4, 9)。Indoxyl sulfateは代表的な uremic toxinsの一つであり、腎障害の指標である BUN
や creatinine と相関することが報告されていることから (Matsuzaki et al., 2007)、cisplatin誘発急性腎
障害モデルの方が glycerol 誘発急性腎障害モデルよりも腎障害の程度は強いことが考えられた
(Table 4, 9)。また、indoxyl sulfate は腎障害時においても組織 Kp 値が変化しないことが報告されて
おり、血漿中濃度の増加に伴い、組織濃度も増加する、いわゆる膜透過型の物質である (Deguchi et
al., 2003)。Cisplatin誘発急性腎障害ラットにおける uremic toxinsの濃度は脳、肝臓および腎臓のMRP
54
機能を有意に阻害することから、その他膜透過型でかつ MRP 阻害作用を有する uremic toxins の濃
度も増加したものと考えられる。また、cisplatin 誘発急性時腎障害ラットにおける血漿中 indoxyl
sulfate の濃度は 150 µM であったが、報告されている末期腎不全患者における最大血漿中濃度は約
1 mM である (Table 9) (Mutsaer et al., 2011)。従って、臨床において、全身の MRP機能は cisplatin誘
発急性腎障害ラットよりも強く阻害される可能性が考えられる。今後は indoxyl sulfate などの腎障
害の指標マーカーと組織 MRP機能との関係性についてより詳細な検討が必要である。
【組織MRP機能に及ぼす uremic toxins の影響】
第 III 章、第 3 節において、cisplatin 誘発急性腎障害ラット血漿成分中にも第 II 章で示した
glycerol 誘発急性腎障害時同様、MRP阻害剤が含まれていることが確認された (Fig. 42)。また、第
II章、2節において、uremic toxins中の p-cresol、hippuric acid、indoxyl sulfate、indole 3-acetic acidお
よび CMPF が MRP 阻害作用をもつことが示された (Fig. 22B)。赤血球と比較し、脳、肝臓および
腎臓には OATs、OCTs、OATPsなどの取り込みトランスポーターが存在することから (Sekine et al.,
2006; Roth et al., 2011)、uremic toxins は取り込みトランスポーターを介して細胞内に輸送されたこと
が考えられる。一方で、今回検討していない middle molecules型の uremic toxinsの一部には強い MRP
阻害作用をもつことが報告されている。例えば、endothelinや parathyroid hormone は 10 nMでMRP
の機能を阻害することが報告されている (Wever et al., 2006)。これらは高分子化合物であるため、
おそらくエンドサイトーシスによって細胞内へと取り込まれる (Vives, 2003)。従って、エンドサイ
トーシス機構が存在する肝臓や腎臓などの組織においては、middle molecules 型の uremic toxins も
protein bond型 uremic toxins 同様、MRP機能の阻害に関わっている可能性が考えられる。
【赤血球膜MRP機能に及ぼす bilirubinの影響】
第 II章において、赤血球膜 MRP機能に強い阻害作用を示した bilirubin の血漿中濃度は cisplatin
誘発急性腎障害ラットにおいては変化が認められなかった (Table 9)。Bilirubin は赤血球が溶血した
後に発生するヘモグロビンからなり、血中で 99.9%がアルブミンと結合することにより、肝臓のみ
へと運ばれる (Levitt and Levitt, 2014)。また、非結合型 bilirubin の濃度は血漿中に比べて肝臓内で
高いことから、何らかの取り込みトランスポーターが関与していることが報告されている (Levitt
and Levitt, 2014)。さらに、以前の研究において、bilirubin の血漿中濃度が 100 µM 以上のラットに
CDNBを投与したところ、肝臓内 DNP-SG濃度は有意に増加したが脾臓への蓄積は認められなかっ
た (Yokooji et al., 2010)。以上のことから、bilirubin は肝へ選択的に取り込まれることで肝臓のMRP
機能を阻害するが、glycerol誘発急性腎障害ラットにおける赤血球 MRP機能の阻害は bilirubin単独
では説明できず、uremic toxins共在下において阻害された可能性が考えられた。また、uremic toxins
は種々の薬物のタンパク結合を減少させることが報告されている。例えば CMPF などは bilirubin と
同じアルブミン結合部位に結合するため、uremic toxins 存在下における非結合型 bilirubinの濃度が
55
増加することで、赤血球膜 MRP機能を阻害した可能性が考えられる (Tsutsumi et al., 2000)。これら
の影響を確認するため、今後 cisplatin誘発急性腎障害ラットに bilirubinを投与してその影響を観察
するなどの検討が必要である。
56
結論
本研究では、急性腎障害時の組織および赤血球 MRP 機能の変動について検討し、以下の知見
が得られた。
1) Glycerol 誘発虚血性腎障害時、肝臓および赤血球のMRP機能は有意に低下した。
2) Glycerol 誘発腎障害時の赤血球 MRP 機能の低下には膜透過型の CMPF や kynurenine などの
uremic toxins、および溶血に伴う bilirubin の血漿中濃度上昇が主に関与していると考えられた。
3) Cisplatin 誘発腎障害ラットにおいて、肝臓や腎臓、脳の MRP機能は有意に低下した。ただし、
肝や脳のMRP発現量には有意な変動はなく、腎での発現量は増加した。
4) Cisplatin 誘発腎障害ラットにおいても、uremic toxins など内因性由来の MRP 阻害物質が血漿
内に蓄積し、そのため、ほぼ全身の MRP機能が低下することが考えられた。
本研究により得られた知見は、急性腎障害時には、全身の MRP 機能が変動する可能性がある
ことを示すものであり、MRP 基質を用いた薬物療法において、その投与設計や相互作用の回避な
どを考察する上で、有用な情報を与えるものと期待される。
57
実験の部
1. 試薬・抗体
試薬として、acetylthiocholine iodide、ATP、CDNB、cisplatin、creatine phosphokinase、DTNB、
glycerol、GSH、D(-)-mannitol、methotrexate、perchloric acid、quinolic acid、urea、uric acid、uridine (和
光純薬工業株式会社)、bilirubin、creatine、creatinine、cytidine、indole-3-acetic acid、indoxyl sulfate
potassium salt、inosine、kynurenic acid、l-kynurenine、p-cresol、probenecid、xantine (Sigma)、CMPF、
MK-571 (Cayman chemical)、calcein、calcein-AM (Dojindo)、EGTA (関東化学株式会社)、AMP (Oriental
yeast Co., Lyd.)、FDNB (東京化成工業株式会社)、hippuric acid sodium salt (東京化成工業株式会社)、
Blocking One、phosphocreatine disodium (ナカライテスク株式会社)、Solution 1・2 (Immunoreaction
enhancer solution) (Toyobo Co., Ltd.) を使用した。一次抗体として、Rabbit Anti-MRP1 Polyclonal
antibody、Rabbit Anti-MRP4 Polyclonal antibody (Bioss)、Mouse Anti-MRP2 Monoclonal antibody
(Chemicon international)、Goat Anti-MRP3 Polyclonal antibody (Santa cruz biotechnology) を使用した。
二次抗体として Affinity purified antibody peroxidase labeled goat anti-mouse IgG (H+L)、Affinity purified
antibody peroxidase labeled goat anti-rabbit IgG (H+L) (Kirkergaard & Perry labolatories)、Donkey anti-goat
IgG, HRP conjugated (Santa cruz biotechnology) を使用した。その他の試薬は市販特級品を使用した。
2. 使用機器・器具
紫外可視分光光度計: UV mini 1240 (Shimazu)
吸光マイクロプレートリーダー: Spectra MaxTM Plus384 (モレキュラーデバイスジャパン株式会社)
マルチラベルカウンター: ARVO-MX (パーキンエルマージャパン株式会社)
HPLC UV 検出器: UV-2075 Plus (ジャスコエンジニアリング株式会社)
HPLC蛍光検出器: FP-2025 Plus (ジャスコエンジニアリング株式会社)
HPLCポンプ: PU-2089 Plus (ジャスコエンジニアリング株式会社)
卓上遠心機: KUBOTA 1-13 (Kubota)
卓上冷却遠心機: Hitachi centrifuge (Hitachi)
ヘマトクリット遠心機: KUBOTA 3220 (Kubota)
冷却遠心機: CR 20G (Hitachi)
冷却遠心機: CR 70MX (Hitachi)
58
高速冷却遠心機: CS 150GXL (Hitachi)
エバポレーター: EYELA TVE-1000 (東京理化機械株式会社)
エバポレーター: CC-105 (Tomy)
ライトキャプチャー: AE-6971/2 (アトー株式会社)
インフュージョンポンプ: STC-525 (Terumo)
3. 実験方法
【実験動物】
7-11 週齢の雄性 SD 系ラット (日本チャールズ・リバー株式会社) を用いた。なお、動物実験
は広島国際大学動物実験に関する規定に基づき行った。承認番号: AE15-005
【細胞培養】
細胞はヒト肝癌由来細胞株である HepG2 細胞を用いた。HepG2 細胞は 10% Fetal bovine serum
(FBS)、100 IU/mL penicillinおよび 100 µg/mL streptomycin を含む Dulbecco’s modified eagle medium
(DMEM) を用いて 37°C、5% CO2インキュベーター内で培養した。培地交換は 2~3日毎に行い、継
代は 5~7日毎に行った。本実験には継代数 6~8の細胞を用いた。
【DNP-SGの合成】
DNP-SGは Yokooji らによって報告された方法に準じて合成した (Yokooji et al., 2006 & 2007)。
FDNB 2.5 mmol をメタノール 2.5 mLで溶解した後、GSH溶液 (1M KHCO3, 300 mM GSH) 12.5 mL
に添加し、スターラーで 1 時間撹拌した。室温でさらに 10分間インキュベーションし、filter paper
(Advantec) でろ過した後、ろ液を希塩酸で pH2 付近まで酸性化した。析出した沈殿物をさらに吸引
ろ過し、沸騰した蒸留水で数回洗浄することで過剰の GSH を取り除いた。沈殿物をシリカゲルで
数日間乾燥させた後、DNP-SGの標準品を得た。
【HPLC解析】
各化合物の HPLC解析は以下の条件で行った。
① DNP-SG
定量: HPLC (UV 365 nm)
使用カラム: J-Pak Wrapsil RP-18 (ジャスコエンジニアリング株式会社)
移動相: 1% acetic acid : acetonitrile (85 : 15)
59
流速: 1.0 mL/min
② Indoxyl sulfate
定量: HPLC (Ex. 280 nm/ Em. 375 nm)
使用カラム: J-Pak Wrapsil RP-18 (ジャスコエンジニアリング株式会社)
移動相: 0.2 M acetate buffer (pH 4.5) : acetonitrile (93 : 7)
流速: 1.0 mL/min
③ Methotrexate
定量: HPLC (UV 304 nm)
使用カラム: J-Pak Wrapsil RP-18 (ジャスコエンジニアリング株式会社)
移動相: 1% acetic acid : acetonitrile : methanol (85 : 10 : 5)
流速: 1.0 mL/min
4. 統計学的検定法
統計学的解析は student’s t-test もしくは tukey kramer method により行った。
60
第 I 章
【Glycerol 誘発急性腎障害ラットの作製】
Glycerol 誘発急性腎障害ラットは、24 時間絶水処置したラットに、エーテル麻酔下で 50%
glycerol (w/w 生理食塩水) を両下肢部に筋注 (10 mL/kg, i.m.) することで作製した (Huang et al.,
2000)。Glycerol 投与 24時間後の血漿中 indoxyl sulfate、BUN、total bilirubin および direct bilirubin濃
度はそれぞれ HPLC または市販キット (Blood Urea Nitrogen B-Test Wako, 和光純薬工業株式会社;
QuantiChromTM Bilirubin Assay kit, Bioassay systems) で測定した。
【CDNBの調製】
急速静注時: DMSOで 60 mM に溶解後、1.8% NaCl で 30 mM に調製した。
点滴静注時: DMSOで 100 mM に溶解後、生理食塩水で 3 mM に調製した。
【CDNB投与後の組織および赤血球 MRP機能の評価】
麻酔 (pentobarbital, 9 mg/kg, i.p.) 下のコントロー
ルおよび急性腎障害ラットに、CDNB を頸静脈から投
与 (30 µmol/kg, i.v.) し、経時的に血液 (0.4 mL) を採取
した。30分後、すばやく断頭し、氷冷した生理食塩水
50 mLを門脈から投与し脱血させた。各組織を摘出し、
3 倍量の 8% PCA を加え、ミンスした後、ポリトロン
(T 25 basic、IKA実験機器) で 2分間懸濁した。氷上で
30 分間インキュベーションし、遠心分離 (8,000 g, 4°C,
10 min) 後、上清の DNP-SG濃度を HPLCで測定した。
【CDNB定速静注時の赤血球 MRP機能の評価】
麻酔 (pentobarbital, 9 mg/kg, i.p.) 下のコントロールおよび急性腎障害ラットに大腿静脈カニュ
レーション (polyethylene tube (PE) 50, 夏目製作所株式会社) を施した。カニューレから CDNBを点
滴静注 (6 µmol/2 mL/h, d.i.v.) し、所定の時間に血液 (0.4 mL) を採取した (Fig. 45)。
【CDNB投与後の DNP-SGの胆汁排泄機能の評価】
麻酔 (pentobarbital, 9 mg/kg, i.p.) 下のコントロールおよび急性腎障害ラットに胆管カニュレー
ション (PE 30) を施した後、頸静脈から CDNBを投与 (30 µmol/kg, i.v.) した。投与後から 10分毎
に、あらかじめ 6% PCA (500 µL) を入れておいたチューブで胆汁を採取した。氷上で 30分間イン
キュベーションし、遠心分離 (8,000 g, 4°C, 10 min) 後、上清の DNP-SG 濃度を HPLCで測定した。
Fig. 45. Diagrammatic representation for
in vivo animal study under steady state
plasma concentration
Femoral-vein-cannula
(d.i.v. administration)
Injector
(Blood sampling/i.v. administration)Jugular vein
Bile-duct-cannula
(Bile sampling)
61
【血漿、全血サンプルの調製および赤血球内濃度の算出】
採取した血液 50 µL に蒸留水 250 µL を加え、ボルテックスミキサーで溶血し、全血サンプル
とした。また、残りの血液 50 µL をヘマトクリットチューブ (Hemato-clad hematocrit tubes, Drummond
Scientific company) に移し、遠心分離 (15,000 g, 10 min) 後、ヘマトクリット値を測定した。残った
血液を遠心分離 (8,000 g, 4°C, 10 min) し、血漿サンプルを得た。全血および血漿サンプルは、それ
ぞれ PCA (最終濃度: 4%以上) を加え除タンパクし、氷上で 30分間インキュベーションした。遠心
分離 (8,000 g, 4°C, 10 min) 後、上清の DNP-SG 濃度を HPLCで測定した。なお、赤血球内濃度は、
血漿、全血濃度およびヘマトクリット値から下記の式で算出した。
Ce = [Cw - Cp × (1 - Ht)] / Ht
Ce, 赤血球内濃度; Cw, 全血中濃度; Cp, 血漿中濃度; Ht, ヘマトクリット値.
【赤血球および組織 S9画分の調製】
麻酔 (pentobarbital, 9 mg/kg, i.p.) 下のコントロールおよび急性腎障害ラットから、ヘパリン処
理シリンジを用い下行大静脈より約 8 mL採血した。組織をすばやく摘出し、氷冷した buffer H (140
mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 5 mM glucose, 1 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 1 mM PMSF, pH
7.4) で洗浄後、9倍量の buffer H を加えた。氷上でミンスし、ホモジナイズ (1,000 rpm, 10 strokes)
した後、遠心分離 (9,000 g, 4°C, 20 min) し、組織 S9 画分を得た。また、採取した血液を、氷冷し
た PBS-P (137 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 5 mM glucose, 1 mM CaCl2, 0.5
mM MgCl2, 1 mM PMSF, pH 7.4) 40 mL を入れておいたプラスチックチューブに添加し、やさしく懸
濁した。遠心分離 (1,700 g, 室温, 5 min) 後、上清と buffy coat をアスピレーターで吸引除去し、こ
の操作を 3回行った。洗浄した赤血球に 5倍量の氷冷した 1 mM PMSF含有蒸留水を加え、スター
ラーで氷冷下 10分間撹拌し溶血させた。遠心分離 (9,000 g, 4°C, 20 min) 後、上清に等量の 2倍濃
縮した buffer Hを加え、赤血球 S9画分を得た。組織および赤血球 S9画分は使用するまで-80°C で
保存し、タンパク定量は bovine serum albumin (BSA) を標準物質として用い、Bradford 法により定
量した (Bradford et al., 1976)。
【組織および赤血球 GST 活性の測定】
組織および赤血球 S9画分を Buffer Hで 0.1 mg protein/mL に調製した。S9 画分 500 µLに、4.48
mM GSH 250 µL を加えて撹拌後、4 mM CDNB 250 µL を加え、37°Cでインキュベーションした。
5 秒後に 10% PCA 1 mL を添加し反応を止め、遠心分離 (8,000 g, 4°C, 10 min) 後、上清の DNP-SG
濃度を HPLCで測定した。
62
【組織および赤血球-GT 活性の測定】
組織および赤血球 S9 画分を Buffer H で 2 mg protein/mL に調製した。S9 画分 500 µL に、200
µM DNP-SG 500 µLを加えて撹拌し、37°Cでインキュベーションした。30分後に 10% PCA 1 mLを
添加し反応を止め、遠心分離 (8,000 g, 4°C, 10 min) 後、上清の DNP-SG 濃度を HPLCで測定した。
【組織および赤血球内 GSH/GSSG濃度の測定】
GSHおよび GSSG濃度は市販キット (GSSG/GSH Quantification Kit, Dojindo) で測定した。
【血漿成分の抽出】
コントロールおよび急性腎障害ラットから得た血漿に同量のアセトニトリルを加え除タンパ
クし、遠心分離 (1,500 g, 10 min) した。上清をエバポレーターで凍結乾燥させ、血漿成分として使
用するまで-20°Cで保存した。
【Methotrexate の赤血球内蓄積】
実験の部、第 I章 【CDNB 定速静注時の赤血球 MRP機能の評価】と同様の方法で行った (Fig.
45)。Methotrexateは、PBS (1.5 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM glucose)
で 3.16 mM と 2.34 mM になるようそれぞれ溶解した。負荷量および維持量はそれぞれ 3.16 µmol/kg
および 4.68 µmol/h/rat として投与した。
63
第 II 章
【IOV の調製】
IOV は Ogawaらの方法に準じて調製した (Ogawa et al., 2006)。麻酔 (pentobarbital, 9 mg/kg, i.p.)
下のラットより、ヘパリン処理シリンジを用い下行大静脈から約 8 mL 採血した。血液を、あらか
じめ等張緩衝液 (buffer K; 80 mM KCl, 70 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0.1 mM EGTA, pH 7.5) 40 mL を
入れておいたプラスチックチューブに添加し、やさしく懸濁した。遠心分離 (1,700 g, 室温, 5 min)
後、上清と buffy coat をアスピレーターで吸引除去し、この操作を 3 回行った。得られた洗浄赤血
球に 60 倍量の氷冷した低張緩衝液 (solution L; 2 mM HEPES, 0.1 mM EGTA, pH 7.5) を添加し、ス
ターラーで氷冷下 10分間懸濁し、溶血させた。遠心分離 (40,000 g, 4°C, 20 min) 後、上清をアスピ
レーターで吸引除去し、この操作を 2回繰り返した。得られたゴーストに、洗浄赤血球の 1/2 量の
氷冷 solution L を加えて懸濁し、37°C の湯浴で 30 分間インキュベーションした。その溶液を、注
射針 27G×3/4” (0.40×19 mm) 付きプラスチックシリンジで懸濁 (10 strokes) した。氷冷した buffer V
(100 mM D(-)- mannitol, 10 mM HEPES/Tris, pH 7.4) 10 mL を添加し、遠心分離 (40,000 g, 4°C, 20 min)
後、上清をアスピレーターで吸引除去した。この操作を 2 回繰り返した。得られた pellet に buffer
V を 300 µL添加して注射針 27G×3/4” (0.40×19 mm) 付きプラスチックシリンジで懸濁 (10 strokes)
し、IOV を含む膜画分を得た。タンパク定量後、タンパク濃度を 10 mg/mL に調製し、酵素活性測
定用に使用した。また、タンパク濃度を 5 mg/mL に調製し、取り込み実験用として使用するまで-
80°Cで保存した。なお、タンパク定量は bovine serum albumin (BSA) を標準物質として用い、Bradford
法により定量した (Bradford et al., 1976)。
【アセチルコリンエステラーゼ活性の測定 (5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid), DTNB法)】
基質である acetylthiocholine を含む反応液 3 mL (0.1 M Tris/HCl, pH 7.4 (±0.2% Triton-X) 2.88 mL,
75 mM acetylthiocholine iodide 20 µL, 10 mM DTNB溶液 100 µL) に、IOV (タンパク濃度; 10 mg/mL)
20 µL を添加した。ボルテックスミキサーですばやく撹拌後、キュベットに移し、セルホルダを温
度コントロールの下 (30°C)、O.D.412 nmにおける吸光度を 30秒おきに 5分間測定した。傾きより、
1 分間あたりの吸光度変化量 (O.D.412 (ΔE/min)) を求め、下記の式より、アセチルコリンエステラ
ーゼ活性を算出した。
ACh-E活性 (mU/mg protein/min) =O.D.412 (∆E/min)・106
13600×
3.02
0.1
【IOV による DNP-SGの輸送実験】
IOV (タンパク濃度; 5 mg/mL) および基質溶液は 37°Cで、あらかじめ 10 分間プレインキュベ
ーションした。IOV 20 µLに基質溶液 80 µLを加え、ボルテックスミキサーですばやく混合し、37°C
64
でインキュベーションした。所定の時間後、氷冷した stop solution (10 mM HEPES/Tris, 100 mM KCl,
100 mM D(-)-mannitol, pH 7.4) 1 mL で反応を停止し、あらかじめ中心部を stop solution 1 mL で湿ら
せたメンブレンフィルター (孔経 0.45 µm、セルロースアセテート/ニトロセルロース、Millipore) に
すばやく滴下し、吸引ろ過した。さらに、氷冷した stop solution 5 mLでフィルターを洗浄した。十
分吸引した後、フィルターをバイアル瓶へ入れた。阻害実験は、各阻害剤を含む基質溶液を用い、
同様の方法で行った。
バックグラウンド (非特異的なフィルターへの吸着) 用のフィルターは、次のように作製した。
IOV 20 µL に氷冷した stop solution 1 mL を加え、あらかじめ氷冷しておいた基質溶液 80 µLを加え
た。ボルテックスミキサーで撹拌し、あらかじめ中心部を stop solution 1 mLで湿らせたメンブレン
フィルターにすばやく滴下し、吸引ろ過した。さらに、氷冷した stop solution 5 mL でフィルターを
洗浄し、十分吸引した後、フィルターをバイアル瓶へ入れた。DNP-SGの抽出のため、フィルター
の入ったバイアル瓶に HPLC移動相 (1% acetic acid : acetonitrile = 85 : 15) 500 µL を加えて撹拌し、
1 時間後に抽出液を回収した。抽出液を遠心分離 (8,000 g, 10 min) し、上清の DNP-SG濃度を HPLC
で測定した。
【基質溶液の調製】
基質溶液として、DNP-SGを Buffer B (10 mM Tris/HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM creatine phosphate,
100 µg/mL creatine phosphokinase, 1 mM GSH, 1 mM ATP or AMP, pH 7.4) で溶解し、DMSOまたは
NaOHで溶解した各種阻害剤を加え調製した。IOV と基質溶液の混合液における各試薬濃度を最終
濃度とした。
【洗浄赤血球におけるMRP 機能の評価】
麻酔 (pentobarbital, 9 mg/kg, i.p.) 下のラット
より、ヘパリン処理シリンジを用い下行大静脈か
ら約 8 mL採血した。血液を、氷冷した等張緩衝液
(buffer G; 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM Tris/HCl,
2 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM glucose, pH 7.4)
40 mL をあらかじめ入れておいたプラスチックチ
ューブに添加し、やさしく懸濁した。遠心分離
(1,700 g, 室温, 5 min) 後、上清と buffy coatをアス
ピレーターで吸引除去し、この操作を 3回行った。
得られた洗浄赤血球に氷冷した buffer Gを加え、ヘマトクリット 0.45 に調製し、やさしく懸濁後、
100 µLずつマイクロチューブに分注した。氷上で 1 時間インキュベーションした後、阻害溶液 100
µLを添加し、37°Cで 15分間プレインキュベーションした。あらかじめ 37°Cで温めておいた基質
Washed erythrocyte (hematocrit: 15%)
Buffer
Inhibitors, Control/ARF
rat plasma components
CDNB (10 μM)
Fig. 46. In vitro washed erythrocyte method
65
溶液 100 µLを添加し、37°Cでインキュベーションした (Fig. 46)。所定の時間後、先を切ったチッ
プで慎重にピペッティングし、200 µLを氷冷した buffer G 600 µLに添加した。遠心分離 (8,000 g,
4°C, 10 min) 後、上清を捨て、さらに 600 µLの氷冷した buffer Gを加え、遠心分離 (8,000 g, 4°C, 10
min) した。上清を捨て、5倍量の蒸留水を加え、ボルテックスミキサーで溶血した。遠心分離 (8,000
g, 4°C, 10 min) した後、上清の DNP-SGおよびタンパク濃度を HPLCおよびタンパク定量で測定し
た。なお、タンパク定量は BSAを標準物質として用い、Bradford 法により定量した (Bradford et al.,
1976)。
【基質溶液と阻害溶液の調製】
基質溶液として、CDNBを DMSOで 10 mM に溶解後、buffer Gで 30 µMに調製した。阻害溶
液として、各種阻害剤を DMSOあるいは NaOHで溶解後、buffer Gで濃度を調製した。なお、洗浄
赤血球と各種溶液の混合時における各試薬濃度を最終濃度とした。
66
第 III 章
【Cisplatin誘発急性腎障害ラットの作製】
Cisplatin 誘発急性腎障害は、ラットに cisplatin (9 mg/kg) を腹腔内投与することで作製した (Liu
et al., 2012)。腎障害の経時的変化を確認するため、cispatinを投与して 24、48、および 72時間後の
indoxyl sulfateの血漿中濃度を HPLCで測定した。また、72時間後の血漿中 creatinine、total bilirubin、
direct bilirubin濃度および AST、ALT 活性は市販キット (LabAssayTM Creatinine, Transaminase CII-test
Wako, 和光純薬工業株式会社; Bilirubin Assay kit, Bioassay systems) で測定した。
【組織MRP機能の評価】
実験の部、第 I 章【CDNB 投与後の組織および赤血球 MRP 機能の評価】と同様の方法で行っ
た。
【DNP-SG定速静注時の組織内濃度および胆汁中排泄の評価】
実験の部、第 I章【CDNB定速静注時の赤血球 MRP 機能の評価】および【CDNB投与後の DNP-
SG の胆汁排泄機能の評価】と同様の方法で行った (Fig. 45)。DNP-SG は 0.1 M Tris buffer (0.1 M
Tris/HCl, 0.1 M NaCl, pH 7.4) で 15 mM に溶解し、30 µmol/2 mL/h の速度で点滴静注した (Fig. 45)。
【Western blot 用組織 crude membrane (CM) 画分の調製】
麻酔 (pentobarbital, 9 mg/kg, i.p.) 下のコントロールおよび急性腎障害ラットを断頭し、氷冷し
た生理食塩水 50 mLを門脈から投与し脱血させた。各組織を摘出し、氷冷した Preparation buffer A
(150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10 mM Tris/HCl, pH 7.4) で洗浄後、4 倍量の氷冷した
Preparation buffer A を加えた。各組織を氷上でミンスし、ポリトロンで 2分間懸濁した後、ホモジ
ナイズ (1,000 rpm, 10 strokes) した。遠心チューブに移し、遠心分離 (8,000 g, 4°C, 15 min) 後、上
清をさらに遠心分離 (15,000 g, 4°C, 15 min) した。上清をもう一度遠心分離 (100,000 g, 4°C, 1 h) し、
沈殿物に Preparation buffer B (1% Triton X-100, 0.1% SDSおよび 1% deoxycholic acidを含む Preparation
buffer A) 300 µLを加え、ボルテックスミキサーで撹拌後、23G×1-1/4” (0.60×32 mm) 付きプラスチ
ックシリンジで懸濁 (50 strokes) した。遠心分離 (10,000 g, 4°C, 1 h) 後、上清をWestern blot用 CM
画分として使用するまで-80°Cで保存した。タンパク定量は BSAを標準物質として用い、Lowry法
により行った (Lowry et al., 1951)。
【Western blot 解析】
泳動マーカー (Protein Ladder One Triple-color Broad range for SDS-PAGE, ナカライテスク株式会
社) 5 µLおよび Preparation buffer B で希釈した CM 画分 (2 mg/mL) 20 µLをアクリルアミドゲル (分
67
離ゲル: 7.5%、濃縮ゲル: 3.75%) にアプライし 20 mA、300 V で電気泳動を行った。電気泳動後、ゲ
ル板を外し、ウェル部分を切り捨てブロッティング用サンドイッチ板に blotting buffer (25 mM Tris,
192 mM glycine, 15% methanol, 0.02% SDS) で湿らせたスポンジ、ろ紙、ゲル、PVDF 膜 (Immun-
BlotTM PVDF membrane, BIO-RAD)、ろ紙、スポンジの順でセットし、ブロッティング用機器にスタ
ーラーと冷却用水を入れ、撹拌しながら氷冷下でブロッティング (500 mA, 100 V, 1 h) を行った。
ブロッティング終了後、PVDF 膜を TBS-T (20.5 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.5)
入りタッパーに浸し 4°C で 1 時間放置した。PVDF 膜を Blocking One 入りタッパーに浸し、30 分
間振盪した後、Blot Holders (SNAP i.d.TM Protein Detection System) に乗せ、Blocking One で洗浄し、
Solution 1で希釈した一次抗体 (Anti-MRP1; ×500, Anti-MRP2; ×1000, Anti-MRP3; ×1000, Anti-MRP4;
×200) を加え 10分間放置した。一次抗体を除去し TBS-T で 3回洗浄した後、Solution 2で希釈した
二次抗体 (Anti-mouse; ×50000, Anti-goat; ×5000, Anti-rabbit; ×5000) を加え 10分間放置した。二次抗
体を除去し TBS-Tで 3回洗浄後、蒸留水に浸した。水気を取り除いた PVDF膜に HRP基質 (Western
Blot Quant HRP substrate, Takara Bio Inc.) を加え、5分後にライトキャプチャー (AE-6971/2 型 C/FC)
で撮影した。
【HepG2細胞における calcein-AM の蓄積実験】
HepG2 細胞を 24-well plate に 5×104/well で播種し、6-7 日間培養したものを使用した。培地を
除去した後、それぞれの well を PBS-G (137 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, 5 mM glucose,
1 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, pH 7.4) 1 mL で 2 回洗浄し、阻害剤溶液を添加して、37℃で 30 分間プ
レインキュベーションした。阻害溶液を除去し、各阻害剤の存在下、非存在下で基質溶液 (2 µM
calcein acetoxymethyl ester (calcein-AM)) を加えて 37℃で所定時間インキュベートした。インキュベ
ーション後、基質溶液を除去し、氷冷した PBS-G でそれぞれの well を 2 回洗浄した。各 well に
0.1% (v/v) Triton X-100含有 1 mM HEPES/Tris (pH 7.4) を加えて、1時間放置し、サンプルを回収し
た。ボルテックスミキサーおよびホモジナイザーで細胞を壊した後、1 時間氷冷した後、遠心分離
(9,560 g, 4°C, 5 min) し、上清を蛍光測定 (励起波長 485 nm, 蛍光波長 535 nm) とタンパク定量に使
用した。なお、タンパク定量は BSA を標準物質として用い、Bradford 法により定量した (Bradford
et al., 1976)。
68
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論文目録
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proteins function in erythrocytes in glycerol-induced acute renal failure rats. J pharm pharmcol. 69: 172-
181.
2. Matsushima A, Oda K, Mori N, Murakami T. (2017) Modulated function of multidrug resistance-
associated proteins in cisplatin-induced acute renal failure rats. Pharmazie 72, in press.
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謝辞
終わりに臨み、本研究に終始御懇篤なる御指導、御鞭撻を賜りました恩師 村上 照夫 教授を
はじめ、森 信博 教授、小田 啓祐 助教に深甚なる謝意を表します。
また、アメリカ留学期間に、御助言、御指導を戴きましたフロリダ大学 Hartmut Derendorf 教
授に心より感謝致します。
さらに、本研究の遂行にあたり、お世話になりました薬物動態解析学研究室諸氏、同研究室卒
業生諸氏に厚く御礼申し上げます。
最後に、これまで自分の思う道を進むことに対し、温かく見守り、辛抱強く支援してくれた母
松島 恵子と家族に深い感謝の意を表して謝辞と致します。