efeitos metabÓlicos da combinaÇÃo de triglicerÍdeos de ... · de tcm e óleo de peixe em...
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE CLINICA MEDICA
BIANCA BELLIZZI DE ALMEIDA
EFEITOS METABÓLICOS DA COMBINAÇÃO DE
TRIGLICERÍDEOS DE CADEIA MÉDIA E ÓLEO DE PEIXE NA
ESTEATOSE HEPÁTICA E ESTRESSE OXIDATIVO INDUZIDOS
PELA DIETA HIPERLIPÍDICA TERMOLIZADA EM RATOS
Ribeirão Preto
2014
BIANCA BELLIZZI DE ALMEIDA
EFEITOS METABÓLICOS DA COMBINAÇÃO DE
TRIGLICERÍDEOS DE CADEIA MÉDIA E ÓLEO DE PEIXE NA
ESTEATOSE HEPÁTICA E ESTRESSE OXIDATIVO INDUZIDOS
PELA DIETA HIPERLIPÍDICA TERMOLIZADA EM RATOS
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título
de Doutor em Ciências Médicas.
Área de concentração: Investigação Biomédica
Orientador: Prof. Dr. Alceu Afonso Jordão Jr.
Versão Corrigida
(versão original encontra-se disponível na Secretaria de Pós-Graduação
da Clínica Médica)
Ribeirão Preto
2014
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho,
por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo
ou pesquisa, desde que citada a fonte.
FICHA CATALOGRÁFICA
Almeida, Bianca Bellizzi
Efeitos metabólicos da combinação de triglicerídeos de cadeia média e óleo de peixe na esteatose hepática e estresse oxidativo induzidos pela dieta hiperlipídica termolizada em ratos
142p.: il.; 30 cm
Tese de doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Clínica Médica.
Orientador: Prof. Dr. Alceu Afonso Jordão Jr.
1. Dieta hiperlipídica termolizada. 2. esteatose hepática não alcoólica. 3.estresse oxidativo.
4. óleo de peixe. 5. óleo de TCM. 6.ratos.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Nome: Bianca Bellizzi de Almeida.
Título: Efeitos metabólicos da combinação de triglicerídeos de cadeia média e óleo de
peixe na esteatose hepática e estresse oxidativo induzidos pela dieta hiperlipídica
termolizada em ratos.
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em
Ciências Médicas.
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof. Dr.___________________________________________Instituição:_______________
Julgamento:___________________________ Assinatura:___________________________
Prof. Dr.___________________________________________Instituição:_______________
Julgamento:___________________________ Assinatura:___________________________
Prof. Dr.___________________________________________Instituição:_______________
Julgamento:___________________________ Assinatura:___________________________
Prof. Dr.___________________________________________Instituição:_______________
Julgamento:___________________________ Assinatura:___________________________
Prof. Dr.___________________________________________Instituição:_______________
Julgamento:___________________________ Assinatura:___________________________
Dedicatória
Dedico este trabalho aos meus pais, Marco Antônio e Maria Teresa, meu irmão
Marco Aurélio, meus avós, Mário, Marilene, Benedito e Benedita (in memorian)
e à minha bisavó Julieta (in memorian).
Agradecimentos
Agradeço primeiramente a Deus por me dar força e inspiração para seguir em
busca dos meus sonhos.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Alceu Afonso Jordão Jr. pela confiança e por estes
10 anos de aprendizado e de amizade.
As queridas Laura Barreto, Paula P. Ovídio, Lívia Simões, Lilian Eslaine ,
Renata Lataro, Valdecir Blefari, pelo auxílio no experimento, nas análises e pela
amizade.
Aos amigos Gabriela Castro, Izabel Leme, Patricia Contri, Cecilia Helena
Mattos, Mirele Mialich, Monique Pichi , Helena Vassimon, Stela, Ronaldo,
pelo auxilio, pelos conselhos e pela amizade.
Aos técnicos do Biotério de Clínica Médica, Adalberto Verceze, Maurício
Arantes e Roni Charles pela dedicação.
Ao departamento de Clínica Médica pela oportunidade de realizar este estudo.
Ao Émerson, da Secretaria de Pós-Graduação da Clínica Médica pela atenção
disponibilizada.
Aos meus pais, irmão e familiares pelo amor e apoio incondicionais.
As minhas queridas amigas Ana Paula Sanches, Mariana Mathias, Thaís de
Oliveira, Paula Valéria Domingues, Paula Campos, Danielle Marques e Daphne
Leonardi Carvalho pelo carinho, apoio e todos estes anos de amizade.
Ao Carlos Eduardo por seu amor, apoio e incentivo durante todos estes anos.
A todos que direta ou indiretamente colaboraram para a realização deste
trabalho.
Epígrafe
“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de
água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”.
Madre Teresa de Calcutá
Resumo
ALMEIDA, B.B. Efeitos metabólicos da combinação de triglicerídeos de
cadeia média e óleo de peixe na esteatose hepática e estresse oxidativo
induzidos pela dieta hiperlipídica termolizada em ratos. 2014. 142f. Tese
(Doutorado) - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo,
São Paulo, 2014.
Introdução: Os efeitos metabólicos do uso combinado dos triglicerídeos de cadeia
média (TCM) e do óleo de peixe (OP) na esteatose hepática ainda não estão
totalmente esclarecidos. Objetivo: O presente estudo teve o objetivo de verificar os
efeitos da combinação dos TCMs e OP na esteatose hepática e estresse oxidativo
induzidos pela dieta hiperlipídica (HL+) termolizada em ratos. Material e Métodos:
Foram utilizados no total 50 ratos machos da linhagem Wistar. O grupo Controle
(n=10) recebeu a dieta controle. Os grupos HL+ receberam a dieta contendo 50% de
gordura animal (GA) termolizada e 50% de ração. A adaptação às dietas HL+ foi
realizada durante 5 dias. Os grupos HL+GA, HL+TCM, HL+OP e HL+TCM/OP (n=10)
receberam a dieta HL+ com 50% de lipídios (gordura animal termolizada) durante 30
dias. Após este período, os grupos HL+TCM, HL+OP e HL+OP/TCM receberam as
dietas HL+ adicionadas de óleo de TCM (OTCM), OP e OTCM + OP,
respectivamente, durante 20 dias. As análises realizadas foram a gordura hepática
total, frações lipídicas hepáticas e séricas, glicemia, vitamina E e retinol séricos,
glutationa reduzida (GSH) e malondialdeído (MDA) sérico e hepático e
aminotransferases séricas. Resultados: Os grupos HL+ apresentaram acúmulo
significativo de gordura total e triglicerídeos hepáticos, exceto o HL+OP. Apenas o
grupo HL+TCM não apresentou acúmulo significativo de colesterol total hepático
(CT). Este mesmo grupo apresentou valores maiores de CT e HDLcol séricos e
menor razão triglicerídeos/HDLcol. Os valores séricos de aminotransferases foram
significativamente maiores nos grupos que receberam os OTCM e/ou OP. A
peroxidação lipídica (LPO) hepática foi maior foi nos grupos HL+, exceto o HL+TCM.
Apenas o grupo HL+GA apresentou maior LPO sérica. Verificou-se que a GSH foi
maior nos grupos HL+GA, HL+TCM e HL+OP/TCM, a vitamina E sérica foi menor nos
grupos HL+GA, HL+OP e HL+OP/TCM e o retinol sérico foi maior nos grupos HL+GA
e HL+TCM. Conclusões: As alterações séricas não refletiram as alterações
hepáticas em relação aos lipídios, estresse oxidativo e antioxidantes. O uso do óleo
de TCM e óleo de peixe em associação na dieta HL+ resultou em efeito negativo
devido ao maior acúmulo de gordura hepática tanto na forma de triglicerídeos quanto
de colesterol, maior peroxidação lipídica hepática e menor vitamina E sérica.
Palavras-chave: dieta hiperlipídica termolizada, esteatose hepática não
alcoólica, estresse oxidativo, óleo de peixe, óleo de TCM, ratos.
Abstract
ALMEIDA, B.B. Metabolic effects of combined use of medium chain
triglycerides and fish oil on hepatic steatosis and oxidative stress induced by
high fat thermolyzed diet in rats. 2014. 142f. Tese (Doutorado) - Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2014.
Introduction: The metabolic effects of combined use of medium chain triglycerides
(MCT) and fish oil (FO) on non alcoholic hepatic steatosis are not fully understood.
Objective: The aim of this study was to investigate the effects of the combination of
MCT and FO on hepatic steatosis and oxidative stress induced by high fat (HF+)
thermolyzed diet in rats. Methodology: Fifty wistar male rats were studied. The
Control group (n = 10) received the standard diet. The HF+ groups received diet with
50% of thermolyzed animal fat (AF) and 50% of ration. Five days were dedicated for
adaptation to high-fat diets. The groups HF+AF, HF+MCT, HF+FO and HF+MCT/FO (n
= 10) received HF+ diet with 50% thermolyzed fat during 30 days. After this period,
the groups HF+MCT, HF+FO and HF+MCT/FO received HF+ diets with MCT oil
(MCTO), FO and MCTO + OP, respectively, during 20 days. Analysis of total liver fat,
liver and serum lipid fractions, serum glucose, vitamin E and retinol, serum and liver
reduced glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA), and serum
aminotransferases (AST and ALT) were performed. Results: The groups HF+
showed higher total fat and triglycerides, except HF+FO. Only HF+MCT group didn´t
have higher liver total colesterol (TC). This same group had higher serum TC and
HDLcol and lower triglycerides/HDLcol ratio. The groups fed with MCTO and/or FO
had higher serum aminotransferase. Liver lipid peroxidation (LPO) was higher in HF+
groups, except HF+MCT. Serum LPO was higher in HF+AF. The hepatic GSH was
higher in the groups HF+AF, HF+MCT and HF+MCT/FO, serum vitamin E was lower
in groups HF+AF, HF+FO and HF+MCT/FO, and serum retinol was higher in groups
HF+AF and HF+MCT. Conclusions: Lipids, oxidative stress and antioxidant serum
and liver alterations didn’t correspond. The association of MCTO with FO in HF+ diet
resulted in a negative effect when it concerns liver fat, triglyceride and cholesterol
accumulation, higher liver lipid peroxidation and lower serum vitamin E.
Key-words: high fat thermolyzed diet, non alcoholic hepatic steatosis, oxidative
stress, fish oil, MCT oil, rats.
Lista de Figuras
Figura 1: Prevalência de NAFLD no grupo de risco (%)...........................................24
Figura 2: Mecanismos de progressão da NAFLD à NASH ...................................... 30
Figura 3. Valores de vitamina E dos óleos de TCM e peixe e da gordura animal
(nmol/mL) ......................................................................................... ........................ 62
Figura 4. Evolução semanal do peso dos animais (g) .............................................. 64
Figura 5. Ingestão alimentar semanal dos animais (g) ............................................. 67
Figura 6. Ingestão energética semanal dos animais (g) ........................................... 68
Figura 7. Percentual de gordura hepática (%) .......................................................... 75
Lista de Quadros Quadro 1. Composição das dietas experimentais (g/100g) ..................................... 45
Quadro 2. Composição em nutrientes das dietas experimentais (%) .............. 46
Quadro 3. Composição percentual em ácidos graxos dos óleos de peixe, TCM e
gordura animal .......................................................................................................... 58
Quadro 4. Índice de peroxibilidade (IP) dos óleos de TCM e peixe e gordura
animal utilizados na dieta.......................................................................................... 60
Lista de Tabelas
Tabela 1. Peso inicial, peso final e ganho de peso dos animais durante todo
experimento (g) ........................................................................................................ 65
Tabela 2. Ingestão alimentar diária (g/dia), ingestão energética diária (Kcal/dia),
ganho de peso diário (g/dia) e taxa de eficiência da dieta (TED) ............................ 70
Tabela 3. Peso hepático, peso do tecido adiposo epididimal e retroperitonial e razões
em relação ao peso corporal (g) ............................................................................... 72
Tabela 4. Caracterização de gordura hepática pelos valores de gordura total (g
gordura/g tecido), colesterol total e triglicerídeos hepáticos (g/g tecido)
........................................................................................................................... .........74
Tabela 5. Valores séricos de glicose, triglicerídeos, colesterol total, lipoproteína de
alta densidade (HDLcolesterol) (mg/dL), e razão triglicerídeos/HDLcolesterol
....................................................................................................................................77
Tabela 6. Concentrações médias sérica e hepática de proteína (g/mL) ................. 79
Tabela 7. Concentrações médias séricas de aspartato aminotransferase (AST) e
alanina aminotransferase (ALT) (U/L) e razão AST/ALT
................................................................................................................................... 81
Tabela 8. Valores séricos (nmol/g proteína) e hepáticos (mol/g proteína) de
malondialdeído (MDA) ........................................................................................... ... 83
Tabela 9. Componentes do sistema antioxidante, valores de glutationa reduzida
(GSH) sérica e hepática (mol/g proteína), vitamina E e retinol séricos (mol/L) e
razão vitaminaE/Colesterol (mol/mg)
................................................................................................................................... 85
Lista de Siglas
AA – Ácido araquidônico
AGs – Ácidos graxos
AGEs - Produtos finais de glicação avançada, advanced glycation end products.
ALEs - Produtos finais de lipoxidação avançada, advanced lipoxidation end products
AGLs - Ácidos graxos livres
AGMIs - Ácidos graxos monoinsaturados
AGPIs – Ácidos graxos poli-insaturados
AGPI-n-3 – Ácidos graxos poli-insaturados ômega -3
AGSs – Ácidos graxos saturados
AGSCMs – Ácidos graxos de cadeia média
ALT – Alanina aminotransferase
AST – Aspartato aminotransferase.
CT – Colesterol total
DHA – Ácido Docosahexaenóico.
DMT2 - Diabetes melittus tipo 2
EPA – Ácido Eicosapentaenóico.
EROs - Espécies reativas ao oxigênio
GA – Gordura animal
GSH - Glutationa reduzida
HDL - Lipoproteína de elevada densidade
HL+ - Hiperlipídica
IP - Índice de peroxibilidade
LDL – Lipoproteína de baixa densidade
MDA - malondialdeído
n-3 – Ômega 3
n-6 – Ômega -6
NAFL - Esteatose hepática não alcoólica, do inglês Nonalcoholic fatty liver
NAFLD - Doença hepática gordurosa não alcoólica, do inglês Nonalcoholic fatty liver
disease.
NASH - Esteato-hepatite não alcoólica, do inglês Nonalcoholic steatohepatitis.
OP – Óleo de peixe
PPAR-α – Receptores ativados por proliferadores de peroxissomo- alfa, do inglês
Peroxisome proliferator-activated receptor - α.
RAGE - Receptores para os produtos de glicação avançada, do inglês receptors for
advanced glycation end products)
RE - Retículo endoplasmático
RI – Resistência à insulina
SM - Síndrome metabólica
SRATBs – Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
SREBP-1c - Proteína 1c ligadora do elemento responsivo ao esterol, do inglês
Sterol regulatory element-binding protein-1c
TCLs – Triglicerídeos de cadeia longa
TCMs – Triglicerídeos de cadeia média
TED - Taxa de eficiência da dieta
TG – Triglicerídeos
TGF- - Fator de transformação do crescimento - , do inglês transforming growth
factor beta.
TNF-α – Fator de necrose tumoral, do inglês Tumor necrosis factor - .
VLDL - Lipoproteína de muito baixa densidade, do inglês Very-low-density lipoprotein
Lista de ácidos graxos
C8:0 Ácido Caprílico
C10:0 Ácido Cáprico
C14:0 Ácido Mirístico
C16:0 Ácido Palmítico
C18:0 Ácido Esteárico
C23:0 Ácido Tricosanóico
C16:1 Ácido Palmitoléico
C18:1n9c Ácido Oléico
C22:1n9 Ácido Erúcico
C18:2n6c Ácido Linoléico
C20:3n6 Ácido di-homo-linolênico
C20:4n6 Ácido Araquidônico
C18:3n3 Ácido α-linolênico
C20:3n3 Ácido Eicosatrienóico
C20:5n3 Ácido Eicosapentaenóico
C22:6n-3 Ácido Docosahexaenóico
Sumário
Resumo
Abstract
Lista de Figuras
Lista de Quadros
Lista de Tabelas
Lista de Siglas
Lista de ácidos graxos
1. Introdução ..................................................................................................... 22
1.1.Dieta Hiperlipídica e NAFLD .................................................................... 31
1.2.Dietoterapia na NAFLD ............................................................................ 34
1.3.Uso dos óleos de peixe e triglicerídeos de cadeia média na NAFLD ....... 36
2. Justificativa .................................................................................................... 39
3. Objetivos ....................................................................................................... 41
3.1.Objetivo geral .......................................................................................... 41
3.2.Objetivos específicos ............................................................................... 41
4. Materiais e métodos ...................................................................................... 43
4.1.Animais e dieta ........................................................................................ 43
Quadro 2. Composição em nutrientes das dietas experimentais (%) ....................... 46
4.2.Análises ................................................................................................... 47
4.2.1. Determinação da gordura hepática total ............................................... 47
4.2.2. Determinação de ácidos graxos dos óleos e gordura das dietas
experimentais .................................................................................................... 48
4.2.3. Determinação de colesterol total (CT) e triglicerídeos (TG) hepáticos e
Séricos . ............................................................................................................ 49
4.2.4. Determinação do colesterol total........................................................... 49
4.2.5. Determinação de triglicerídeos ............................................................. 49
4.2.6. Determinação da proteína sérica e hepática ......................................... 50
4.2.7. Determinação da glicemia .................................................................... 50
4.2.8. Determinação da HDL colesterol .......................................................... 51
4.2.9. Determinação da peroxidação lipídica sérica e hepática ...................... 51
4.2.10. Determinação de glutationa reduzida (GSH) hepática e sérica ............. 52
4.2.11. Determinação de retinol sérico e da vitamina E sérica e dos óleos e
gordura das dietas experimentais ...................................................................... 53
4.2.12. Determinação das concentrações séricas das aminotransferases
aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT)................ 53
4.3.Cálculos ................................................................................................... 54
4.3.1. Cálculo da taxa de eficiência da dieta (TED) ........................................ 54
4.3.2. Cálculo do índice de peroxibilidade da dieta ......................................... 54
4.3.3. Cálculo da razão entre triglicerídeos e HDLcolesterol séricos ................... 55
4.3.4. Cálculo da razão entre vitamina E e colesterol ..................................... 55
4.4.Análise estatística .................................................................................... 55
5. Resultados .................................................................................................... 57
5.1.Composição dos óleos de TCM e peixe e gordura animal ....................... 57
5.1.1. Perfil de ácidos graxos dos óleos de TCM e peixe e gordura animal .... 57
5.1.2. Índice de peroxibilidade dos óleos de TCM e peixe e gordura animal ... 59
5.1.3. Vitamina E dos óleos de TCM e peixe e gordura animal ...................... 61
5.2.Crescimento dos animais ......................................................................... 63
5.3.Ingestão alimentar dos animais ............................................................... 66
5.4.Ganho de peso, ingestão alimentar e energética diários e taxa de
eficiência da dieta .......................................................................................... 69
5.5.Peso hepático, peso do tecido adiposo epididimal e retroperitonial, e
razões em relação ao peso corporal .............................................................. 71
5.6.Gordura hepática total, gordura hepática percentual e concentração das
frações lipídicas hepáticas ............................................................................. 73
5.7.Concentração sérica de glicose, triglicerídeos, colesterol total, HDL
colesterol séricos e razão triglicerídeos/HDLcolesterol .................................. 76
5.8.Proteína total sérica e hepática ................................................................ 78
5.9.Concentração sérica das aminotransferases ........................................... 80
5.10. Peroxidação lipídica sérica e hepática ............................................... 82
5.11. Sistema antioxidante sérico e hepático ............................................. 84
6. Discussão ...................................................................................................... 87
7. Conclusões .................................................................................................... 99
Apêndice ................................................................................................................ 115
Apêndice A - Evolução do peso semanal dos animais (g). .......................... 115
Apêndice B - Ingestão alimentar semanal dos animais (g). ......................... 116
Apêndice C - Ingestão de energia semanal dos animais (g). ....................... 117
Anexo..................................................................................................................... 119
Anexo I - Certificado comissão de ética em experimentação animal. ........... 119
Artigo científico ...................................................................................................... 121
21
Introdução
22
1. Introdução
A esteatose hepática não alcoólica (NAFL, do inglês Nonalcoholic fatty liver) é
caracterizada pelo acúmulo de lipídios na forma de triglicerídeos (TG) no fígado de
indivíduos sem história significativa de ingestão de álcool e exclusão de outras
causas de doença hepática como drogas, toxinas e hepatite C (ZIVKOVIC;
GERMAN; SANYAL, 2007; CHALASANI et al, 2012). A doença hepática gordurosa
não alcoólica (NAFLD, do inglês Nonalcoholic fatty liver disease) representa um
amplo espectro desde a esteatose, esteatohepatite não alcoólica (NASH, do inglês
Nonalcoholic steatohepatitis) até cirrose. A NASH é caracterizada pela presença de
inflamação, fibrose e tem potencial de progredir para cirrose (FIERBINTEANU-
BRATICEVIC et al, 2011).
A NAFLD se tornou uma das causas mais comuns de doença hepática e a
prevalência da doença vem crescendo proporcionalmente ao aumento da ingestão
de gordura saturada, obesidade e síndrome metabólica (SM) (NSEIR; HELLOU;
ASSY, 2014).
A prevalência da NAFLD na população em geral varia de 6,3 a 33% e
apresenta uma média estimada de 20%, sendo que a prevalência da NASH é
estimada em 3 a 5%. A variabilidade dos percentuais de prevalência da NAFLD e
NASH encontrados nos estudos sofre influência da população estudada e do método
diagnóstico utilizado (ultrassonografia, ressonância magnética ou histologia
hepática). A prevalência de cirrose em indivíduos com NASH na população em
geral não é conhecida (CHALASANI et al, 2012).
No Brasil, um estudo realizado com pacientes atendidos em centros médicos
de referência para doenças hepáticas, utilizando o método diagnóstico histológico,
descreve a prevalência de 41,9% de esteatose isolada, 31,1% de NASH e 27% de
NASH e fibrose em um total de 1280 pacientes com NAFLD (COTRIM et al, 2011).
Na população caracterizada como grupo de risco para a NAFLD, devido a
presença de doenças crônicas como obesidade, diabetes e dislipidemia, a
prevalência é maior. Nos pacientes com NAFLD 90% possuem pelo menos uma
característica da SM e 33% possuem a SM (DUVNJAK et al, 2009). A prevalência da
23
NAFLD é maior que 90% em indivíduos com obesidade, varia de 69 a 87% em
indivíduos com diabetes melittus tipo 2 (DMT2), é estimada em 50% em indivíduos
com dislipidemia (CHALASANI et al, 2012). Assim, a NAFLD é descrita na literatura
como uma manifestação da SM (TACER; ROZMAN, 2011). A prevalência da NAFLD
no grupo de risco é ilustrada na Figura 1, a seguir:
24
90%
80%
50%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Obesidade DM tipo 2 DLP
Pre
valê
ncia
de N
AF
LD
no
gru
po
de
risco
(%
)
NAFLD
Figura 1. Prevalência de NAFLD no grupo de risco (%). Barras largas verticais representam a prevalência. Fonte: CHALASANI et al, 2012.
25
O acúmulo de gordura visceral na obesidade é associado a doenças
cardiovasculares, e também é considerado fator de risco para o desenvolvimento da
NAFLD e da NASH (TAKAKI; KAWAI; YAMAMOTO, 2013).
A progressão da fibrose pode ocorrer em 10% a 15% dos pacientes com
NASH e a cirrose em 15% a 25% (BRUNT; TINIAKOS, 2010). Os fatores de risco
associados à progressão para fibrose são idade maior que 45 anos, obesidade,
diabetes e índice AST/ALT > 1 (ANGULO et al, 1999).
A maioria dos pacientes com NAFLD é assintomática. As alterações
bioquímicas que podem ocorrer são elevação nos níveis séricos de
aminotransferases (AST, ALT) e de gamaglutamiltransferase (GGT). A forte
associação com a resistência à insulina (RI) faz com que comumente seja
observada hiperglicemia, elevação da insulina e intolerância à glicose. Alteração no
lipidograma também pode ser observada com hipertrigliceridemia e/ou
hipercolesterolemia (GRATTAGLIANO et al, 2007).
Apesar de níveis elevados das aminotransferases sugerirem a presença da
NASH, há baixa relação entre os níveis plasmáticos de enzimas hepáticas e os
achados na biópsia hepática (LOMONACO et al, 2013).
O método padrão ouro para o diagnóstico da NAFLD é a biópsia hepática.
Esse método permite identificar a presença de inflamação, degeneração baloniforme
e fibrose, permitindo diagnóstico diferencial entre esteatose pura e NASH. A biópsia
permite avaliar o grau de infiltração de lipídios no tecido hepático (GRATTAGLIANO
et al, 2007). No entanto, métodos menos invasivos como a ultrassonografia,
ressonância magnética ou tomografia computadorizada, permitem a identificação da
distribuição dos depósitos de lipídios no fígado todo, sendo que os dois últimos
permitem também a quantificação do total de gordura hepática (NARCISO-
SCHIAVON et al, 2010; MOORE, 2010).
A proposta para utilização de parâmetros bioquímicos não invasivos no
diagnóstico da NASH e fibrose na NAFLD ainda está em experimentação, mas os
estudos são bastante promissores para utilização destas ferramentas na prática
clínica. A NASH tem como forte preditor a presença da SM. O NAFLD fibrose score
utiliza os parâmetros como idade, IMC, hiperglicemia, contagem de plaquetas,
26
albumina e razão AST/ALT para identificar a fibrose avançada e/ou cirrose
(CHALASANI et al, 2012).
O primeiro estágio da doença é caracterizado pela esteatose hepática pura,
definida pelo acúmulo de gordura predominantemente macrovesicular e presença de
esteatose visível em mais de 5% dos hepatócitos (SANYAL et al, 2011). A presença
da inflamação associada à esteatose caracteriza o segundo estágio da doença. A
NASH é caracterizada pelos estágios mais graves 3 e 4. No terceiro estágio, a
esteatose é associada ao dano hepatocelular com degeneração em balonização do
hepatócito. A presença da esteatose associada à fibrose sinusoidal e corpúsculo de
Mallory caracteriza o quarto estágio da doença (ZIVKOVIC; GERMAN; SANYAL,
2007)
A patogênese da NAFLD e os mecanismos que levam à NASH, fibrose e
dano do hepatócito não estão completamente esclarecidos, mas pode-se afirmar
que há uma combinação de fatores ambientais, genéticos e metabólicos que
resultam na progressão da doença (TORRES et al, 2012; BASARANOGLU;
SENTÜRK, 2013).
O mecanismo de patogênese da NAFLD foi proposto em 1998 por Day e
James e consiste na teoria dos dois hits (DAY; JAMES, 1998). O primeiro hit ou
gatilho é dado pelo acúmulo hepático de lipídios que predispõe à ocorrência do
segundo hit (GENTILE; PAGLIASSOTTI, 2008). O segundo hit é caracterizado pelo
estresse oxidativo, peroxidação lipídica, disfunção mitocondrial e produção de
citocinas pró-inflamatórias e é responsável pela progressão à NASH, pois contribui
para a inflamação, fibrose e morte celular (TESSARI et al, 2009).
Atualmente, tem sido reconhecida a hepatotoxicidade dos AGs livres (AGLs)
que atuam na progressão da esteatose à NASH, pois estão diretamente associados
ao aumento do estresse oxidativo, ativação das vias inflamatórias e dano ao
hepatócito (DOWMAN; TOMLINSON; NEWSOME, 2010).
A progressão da NASH à cirrose é representada pelo terceiro hit que envolve
a morte celular e inadequada proliferação dos hepatócitos que resultam no
desenvolvimento da fibrose e recrutamento de células do sistema imune (JOU;
CHOI; DIEHL, 2008).
Os efeitos da dieta, regulação das vias metabólicas por hormônios e fatores
de transcrição desempenham um importante papel na NAFLD, sendo que a RI é
27
considerada um fator chave no desenvolvimento da NAFLD e da NASH (ZIVKOVIC;
GERMAN; SANYAL, 2007).
As vias metabólicas que influenciam o conteúdo hepático de gordura
englobam a síntese e eliminação de lipídios. Na síntese de lipídios estão envolvidos
os processos da lipogênese de novo e de esterificação de TG. A eliminação de
lipídios envolve a lipólise no tecido adiposo, oxidação de ácidos graxos (AGs) e
secreção de TG no fígado pela lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL, do
inglês Very-low-density lipoprotein) (FERRAMOSCA; ZARA, 2014). Segundo
Donnely et al (2005), o aumento do fluxo hepático de AGLs provenientes do tecido
adiposo tem uma contribuição de 60% para o acúmulo hepático de lipídios, sendo
26% atribuída à lipogênese de novo hepática e 15% à dieta.
O aumento da ingestão de gordura e frutose na dieta contribui para o acúmulo
hepático de lipídios (BASARANOGLU; BASARANOGLU; SENTÜRK, 2013). A
ingestão alimentar excessiva em energia provenientes tanto de carboidratos como
de gordura pode levar ao aumento crônico da glicemia, AGLs e na concentração de
insulina e contribui para a resistência na ação da insulina na captação de glicose
pelo tecido adiposo e muscular e na supressão da hidrólise de TG no tecido adiposo
(ZIVKOVIC; GERMAN; SANYAL, 2007).
A relação da esteatose hepática como causa ou consequência das alterações
metabólicas que resultam na redução da sensibilidade à insulina ainda não está
estabelecida (LOMONACO et al, 2013). Estudos sugerem que o mecanismo de
patogênese da NAFLD é associado a RI e DMT2 em um ciclo em que uma pode
promover ou exacerbar a outra (CUSI, 2009; LOMONACO et al, 2011).
A resistência periférica à insulina resulta em menor supressão da lipólise no
tecido adiposo promovendo aumento do fluxo hepático de AGLs (ZIVKOVIC;
GERMAN; SANYAL, 2007). A hiperglicemia pode resultar em aumento da captação
hepática de glicose, pois não depende da insulina (ZIVKOVIC; GERMAN; SANYAL,
2007). No fígado, a insulina estimula a lipogênese de novo resultando no aumento
da síntese hepática de AGs por ativação do fator de transcrição da
Proteína 1c ligadora do elemento responsivo ao esterol (SREBP-1c, do inglês sterol
regulatory element-binding protein-1c) (TESSARI, et al, 2009; GEELEN et al, 1995).
O acúmulo hepático de AGLs promove aumento na lipogênese hepática também por
estímulo à SREBP1-c, resultando no aumento da síntese de TG (TESSARI, et al,
28
2009). Portanto, o aumento da glicemia e do fluxo de AGLs contribuem para o
acúmulo de gordura hepática (ZIVKOVIC; GERMAN; SANYAL, 2007).
Nos indivíduos com NAFLD e NASH o aumento da secreção hepática de
lipídios via VLDL pode estar prejudicado ou é insuficiente para evitar o acúmulo de
gordura no fígado (CHARLTON et al, 2002). Portanto, o acúmulo de gordura
hepática ocorre quando a taxa de síntese de TG excede a capacidade da
síntese/secreção da VLDL, resultando na esteatose (JOU; CHOI; DIEHL, 2008).
A progressão à NASH tem como fatores atuantes o estresse oxidativo,
disfunção mitocondrial, peroxidação lipídica e atividade das citocinas pró-
inflamatórias (RAHIMI; LANDAVERDE, 2013).
Em condições fisiológicas, a oxidação mitocondrial de AGs resulta na
produção das espécies reativas ao oxigênio (EROs), como o superóxido, peróxido
de hidrogênio e radical hidroxila (BASARANOGLU; BASARANOGLU; SENTÜRK,
2013). O aumento dos AGLs resulta em aumento da-oxidação mitocondrial e
sobrecarga na cadeia transportadora de elétrons, provocando aumento da produção
das EROs (LOMONACO et al, 2013).
O estresse oxidativo é caracterizado pelo desequilíbrio provocado pelo
aumento da produção das EROs e redução dos antioxidantes que resulta na
peroxidação lipídica de ácidos graxos poli-insaturados (AGPIs), membranas
celulares, membranas mitocondriais e DNA (BASARANOGLU; BASARANOGLU;
SENTÜRK, 2013).
A disfunção mitocondrial está associada à NASH (SANYAL et al, 2001). A
peroxidação lipídica da membrana mitocondrial hepática é responsável por alterar a
função da organela, bem como a cadeia respiratória e a produção de genes
mitocondriais, produzindo assim um ciclo de geração de EROS (TESSARI, et al,
2009). Em contrapartida, verifica-se aumento da oxidação extramitocondrial de AGLs
nos microssomos e peroxissomos, resultando em aumento da produção das EROS
e predispondo ao estresse oxidativo (MOORE, 2010; JOU; CHOI; DIEHL, 2008).
Os produtos da peroxidação lipídica, como o malondialdeído (MDA), levam ao
aumento da produção de citocinas e recrutamento de células inflamatórias para o
fígado (MOORE, 2010). A inflamação e ativação das células estreladas hepáticas
levam à produção de colágeno e fibrose (MOORE, 2010).
29
Outros fatores como o estresse do retículo endoplasmático (RE) e a razão
adiponectina/leptina estão associados à progressão à NASH, pois resultam em
estímulo pró-inflamatório e indução da RI (DARA; JI; KAPLOWITZ, 2011; TAKAKI;
KAWAI; YAMAMOTO, 2013). Os mecanismos de progressão à NASH estão
apresentados na Figura 2.
30
Figura 2: Mecanismos de progressão da NAFLD à NASH. (1) Resistência à insulina no tecido adiposo: No contexto da síndrome metabólica e/ou diabetes melittus tipo 2 a
resistência à ação da insulina resulta em aumento da lipólise no tecido adiposo e aumento do fluxo hepático de AGL que associada à hiperinsulinemia e hiperglicemia, estimula a excessiva síntese hepática de ácidos graxos saturados e de triglicerídeos. (2) Esteatose: A
exacerbada resistência à insulina estimula a secreção de VLDL e a -oxidação mitocondrial. A esteatose pode estar associada à dislipidemia (aumento de triglicerídeos e redução do HDLcolesterol). (3) Esteatohepatite: o aumento do fluxo de AGLs sobrecarrega a mitocôndria e a cadeia respiratória entra em colapso, resultando na produção de metabólitos tóxicos, ativação das vias inflamatórias e lipotoxicidade do hepatócito que favorecem a inflamação e necrose crônicas (4) Fibrose: a ativação dos macrófagos e das células estreladas hepáticas determinam a resposta fibrogênica e a potencial progressão à cirrose. Neste contexto, a redução da adiponectina plasmática favorece a promoção da esteatose e fibrose, pela síntese de triglicerídeos e ativação das células estreladas hepáticas, respectivamente. AGL, AGs livres; HDL-C, lipoproteína de elevada densidade; CEH, células estreladas hepáticas; NAFLD: doença hepática gordurosa não alcoólica; NAFL, esteatose hepática não alcoólica; NASH, esteatohepatite não alcoólica; IG: Intolerância à glicose; DMT2, diabetes melittus tipo 2. Adaptado de CUSI, 2009.
31
1.1. Dieta Hiperlipídica e NAFLD
A dieta hiperlipídica (HL+) é amplamente utilizada para indução da NAFLD em
modelos experimentais, pois reflete a histopatologia e patofisiologia observada em
humanos (NAKAMURA; TERAUCHI, 2013). Os resultados podem variar no grau de
esteatose, inflamação e fibrose de acordo com a linhagem de roedor utilizada, o
percentual de lipídios e composição da dieta, e a duração do experimento (KANURI;
BERGHEIM, 2013).
O mecanismo de indução da NAFL e progressão à NASH pela dieta HL+
consiste em favorecer o acúmulo hepático de lipídios, estresse oxidativo, ativação
das vias inflamatórias e dano ao hepatócito (AHMED, REDGRAVE; OATES, 2009;
FAN; QIAO, 2009).
O excesso de gordura na dieta promove o aumento do fluxo hepático de
lipídios e resulta em estímulo à síntese de novo de AGs e à síntese de TG por
ativação da SREBP-1c (JUMP, 2011). O aumento do diacilglicerol, intermediário na
síntese de TG, promove dano lipotóxico dos hepatócitos (SCHUPPAN;
SCHATTENBERG, 2013). O excesso de lipídios sobrecarrega a mitocôndria e
resulta na redução da oxidação de AGs e da eficiência da cadeia respiratória
mitocondrial e consequente aumento da produção de EROS (VIAL et al, 2011).
O perfil de AGs da dieta influencia a indução da esteatose hepática. As dietas
HL+ deficientes em ácidos graxos poli-insaturados ômega-3 (AGPIs n-3) favorecem
o desenvolvimento da esteatose hepática devido à ação destes AGs na inibição da
síntese de lipídios (FERRAMOSCA; ZARA, 2014).
A dieta rica em ácidos graxos saturados (AGSs) é associada ao aumento de
lipídios no fígado, elevação da insulina no plasma, indução da RI, alteração na
função mitocondrial e estímulo inflamatório e, portanto, são associados à progressão
à NASH (TESSARI et al, 2009). O aumento dos AGLs favorece o acúmulo hepático
de lipídios, em especial os AGSs, que são associados à disfunção hepática
resultantes da disfunção mitocondrial, estresse do RE, estresse oxidativo e apoptose
(CUSI, 2009; FERRAMOSCA; ZARA, 2014). O uso da gordura animal (GA) na dieta
HL+ foi associado ao estresse do RE e à resposta inflamatória, resultando em um
maior efeito deletério na RI e esteatose hepática em relação aos animais
32
alimentados com óleo de soja (ZHAO et al, 2013). A indução do dano hepático e
redução da capacidade de proliferação dos hepatócitos foram associadas ao
aumento da razão hepática de AGSs em relação aos insaturados no fígado
esteatótico de modelos animais (GENTILE; PAGLIASSOTTI, 2008).
Recentemente, foram descritos os efeitos da ingestão dietética de colesterol
na NAFLD e NASH (CARVALHANA; MACHADO; CORTEZ-PINTO, 2012). O
aumento da ingestão dietética de colesterol resulta em desequilíbrio entre a síntese
e oxidação dos AGs (SCHUPPAN; SCHATTENBERG, 2013). O estudo de Ichimura
et al (2014) descreve a indução da NASH caracterizada pela esteatose com maior
acúmulo de TG, inflamação, balonização do hepatócito, fibrose e progressão à
cirrose com a adição de colesterol à dieta HL+. Neste mesmo estudo, a adição do
colesterol na dieta foi associada à supressão da atividade da carnitina palmitoil
transferase (ICHIMURA, et al, 2014). O acúmulo do colesterol livre é associado ao
estresse do RE por alterar a razão colesterol livre/fosfolipídios na membrana,
alterando a fluidez e, consequentemente, a função da organela (TAKAKI; KAWAI;
YAMAMOTO, 2013). Os AGLs e colesterol livre provenientes da dieta induzem o
estresse do RE e estresse oxidativo resultando na inflamação e fibrogênese
hepática (TAKAKI; KAWAI; YAMAMOTO, 2013)
Em modelos animais, a progressão da esteatose para NASH é marcada pelo
aumento da peroxidação lipídica (TESSARI et al, 2009). Em pacientes com NASH a
elevada ingestão de AGSs foi associada à redução da razão glutationa
reduzida/oxidada, evidenciando um efeito pró-oxidante (MACHADO et al, 2008). A
redução das vitaminas antioxidantes é associada ao aumento da peroxidação
lipídica, estresse oxidativo e pode contribuir para o dano hepatocelular, inflamação e
fibrose (LOGUERCIO et al, 2001).
O processamento térmico das gorduras resulta na produção de compostos
como os produtos da peroxidação lipídica, produtos finais de glicação e de
lipoxidação avançada (AGEs/ALEs, do inglês advanced glycation/lipoxidation end
products) que apresentam propriedades pró-oxidantes e pró-inflamatórias e atuam
como fonte de estresse oxidativo exógeno (LUCI et al, 2007; VISTOLI et al, 2013).
A ingestão de elevado conteúdo de AGEs/ALEs, provenientes da dieta HL+
submetida ao aquecimento, está associada ao desenvolvimento da RI e DMT2 com
33
sintomas de maior proporção que o observado após a ingestão de dieta HL+ sem
aquecimento (ASSIS et al, 2009).
A interação dos AGEs com os receptores para os produtos de glicação
avançada (RAGE, do inglês receptors for advanced glycation end products) das
células hepáticas resulta em aumento da produção das EROs, citocinas pró-
inflamatórias e proliferação e ativação das células estreladas hepáticas, e desta
forma contribui para a progressão da NAFLD e piora da fibrose hepática (SANTOS
et al, 2013).
O estudo de Patel et al (2012) demonstrou que os AGES dietéticos são
capazes de promover a inflamação hepática, independentemente da esteatose,
contribuindo assim para a progressão da NAFL à NASH.
34
1.2. Dietoterapia na NAFLD
O estudo de Musso et al (2003) descreve que os pacientes com NASH
apresentam aumento da ingestão de AGSs, colesterol e redução da ingestão de
AGPIs, fibras e antioxidantes como as vitaminas C e E. Os hábitos alimentares
caracterizados neste mesmo estudo podem promover o desenvolvimento da NASH
por alterações no metabolismo pós-prandial de TG, na sensibilidade à insulina, na
modulação do acúmulo hepático de lipídios e da atividade antioxidante (MUSSO et
al, 2003).
O tratamento da NAFLD é baseado em modificações no estilo de vida.
Hábitos alimentares saudáveis e atividade física são consideradas as medidas mais
eficazes de tratamento de pacientes com NAFLD (CHALASANI et al, 2012). Os alvos
da terapia são basicamente a RI e o estresse oxidativo (PAREKH; ANANIA, 2007).
Além da melhora da doença hepática, o tratamento visa o controle de fatores
metabólicos e melhora das comorbidades associadas à NAFLD como obesidade,
hiperlipidemia, RI e DMT2 (CHALASANI et al, 2012).
A perda de peso promove melhora do acúmulo de lipídios e da NASH, no
entanto, deve ser lenta e gradual. A rápida perda de peso resulta em maior
mobilização de TG do tecido adiposo e aumento dos AGL, que pode promover maior
progressão da doença (ZIVKOVIC; GERMAN; SANYAL, 2007).
A restrição calórica é benéfica na perda de peso, redução da esteatose e
melhora da RI (RAHIMI; LANDAVERDE, 2013). Em um período de 6 meses à 1 ano,
a perda de peso de 3-5% promove melhora na esteatose, já a melhora da
esteatohepatite requer uma maior perda de peso de 7 a 10% (RAHIMI;
LANDAVERDE, 2013; CHALASANI et al, 2012). A perda de peso maior que 10% é
necessária para melhora da necroinflamação hepática (CHALASANI et al, 2012).
A composição da dieta em macronutrientes se mostra tão importante quanto a
perda de peso, mas ainda são necessários mais estudos para se determinar a exata
composição da dieta ideal para o tratamento na NAFLD (ASRIH; JORNAYVAZ,
2014).
No entanto, a recomendação de redução da ingestão de gordura,
principalmente em AGSs e carboidratos simples, é baseada em evidências da
35
influência do perfil lipídico e de carboidratos da dieta no desenvolvimento da NAFLD
e progressão à NASH (ASRIH; JORNAYVAZ, 2014).
A redução da ingestão de carboidratos associada à restrição calórica tem
efeito positivo na redução dos TG hepáticos e na melhora da sensibilidade à insulina
(KIRK et al, 2009). A ingestão de carboidratos simples, como a frutose, deve ser
limitada devido à sua associação com progressão à NASH (ZIVKOVIC; GERMAN;
SANYAL, 2007).
No estudo de Westerbacka et al (2005) a redução do percentual de lipídios na
dieta promoveu a redução do conteúdo hepático de gordura em indivíduos obesos e
não diabéticos, independente da perda de peso. Neste mesmo estudo, a redução da
esteatose hepática foi associada às alterações na concentração da insulina em
jejum (WESTERBACKA et al, 2005).
A ingestão da gordura saturada em pacientes com NAFLD deve ser mantida
em torno de 7% a 10% do valor calórico total da dieta para melhora da RI
(ZIVKOVIC; GERMAN; SANYAL, 2007). Em dietas com baixo teor de AGSs (6%) foi
observado efeito prejudicial nos lipídios sanguíneos devido à redução tanto da
lipoproteína de baixa densidade (LDL) como da lipoproteína de elevada densidade
(HDL) e aumento dos TG (OLIVEIRA et al, 2005).
Os ácidos graxos monoinsaturados (AGMIs) são associados à melhora do
perfil lipídico sérico, redução da glicemia e aumento da HDL em pacientes com
diabetes melittus, quando o aumento da ingestão é realizado por substituição dos
AGSs e carboidratos e portanto pode ser benéfico para pacientes com NAFLD
(JULIUS, 2003; FAN; CAO, 2013).
Estudos mostram que a suplementação dos AGPI-n3 é favorável na redução
da esteatose hepática e melhora do perfil metabólico na NAFLD (BOUZIANAS;
BOUZIANA; HATZITOLIOS, 2013; BARGUT et al, 2014). No entanto, mais
pesquisas são necessárias para estabelecer a dose, duração do tratamento e os
efeitos na gordura hepática, inflamação e fibrose, e ainda é prematura a
recomendação da suplementação dos AGPI n-3 para o tratamento da NAFLD/NASH
(CHALASANI et al, 2012). O aumento da ingestão de n-3 deve ser obtido com o
aumento do consumo de peixes como salmão, sardinha e atum (SCORLETTI;
BYRNE, 2013).
36
1.3. Uso dos óleos de peixe e triglicerídeos de cadeia média na NAFLD
Os efeitos do uso dos óleos de peixe (OP) e triglicerídeos de cadeia média
(TCMs) no tratamento da NAFLD ainda não estão totalmente esclarecidos.
A utilização dos TCMs no tratamento da NAFLD foi inicialmente baseada na
premissa de que os ácidos graxos saturados de cadeia média (AGSCMs) são
preferencialmente oxidados, pois não requerem a carnitina palmitoil transferase para
o transporte intramitocondrial (SHINOHARA et al, 2005). Portanto, os AGSCMs
seriam utilizados em substituição aos AGCL na tentativa de prevenir o bloqueio da -
oxidação de AGs na NAFLD (LIEBER et al, 2007, 2008).
No entanto, os estudos que utilizam os TCMs na dieta HL+ apresentam
resultados controversos. A dieta HL+ adicionada de TCM resultou no favorecimento
à esteatose hepática nos estudos de Geelen et al, (1995) e Wein, et al (2009). O
estudo de Lieber et al (2008) demonstra a redução da esteatose hepática e da
peroxidação lipídica somente com o uso dos TCMs como única fonte lipídica na
dieta, sendo que, quando associado aos triglicerídeos de cadeia longa (TCLs) na
dieta HL+ parece promover a hepatotoxicidade devido ao maior acúmulo hepático de
lipídios, aumento da peroxidação lipídica e da produção de TNF-.
Em estudos com animais, a deficiência de AGs essenciais está associada à
esteatose (ZIVKOVIC; GERMAN; SANYAL, 2007). Os AGPI n-3 (ácido
docosahexaenóico (DHA) e ácido eicosapentaenóico (EPA)) regulam a expressão
de genes que são favoráveis à prevenção do acúmulo de lipídios no fígado, pois
promovem estímulo à oxidação dos AGs por ligação e ativação dos Receptores
ativados por proliferadores de peroxissomo - α (PPAR-, do inglês Peroxisome
proliferator-activated receptor – alfa) e redução da síntese de AGs e TG por inibição
do SREBP1-c (CLARKE, 2001; JUMP, 2011; PETTINELLI et al, 2011).
Há evidências de que a suplementação do ômega-3 (n-3) promove melhora
no perfil lipídico sérico, melhora da sensibilidade à insulina, redução da esteatose,
inflamação e dano hepático em modelos animais e humanos com NAFLD
(BOUZIANAS; BOUZIANA; HATZITOLIOS, 2013; BARGUT et al, 2014). O uso do
óleo de peixe em elevado percentual na dieta HL+ foi associado à melhora da
sensibilidade à insulina, melhora da atividade mitocondrial, estímulo da -oxidação,
inibição da lipogênese hepática, redução da esteatose e estresse oxidativo
37
(LIONETTI et al, 2014). No estudo de Popescu (2013), o uso do EPA e DHA na dieta
HL+ resultou em redução da peroxidação lipídica, mas não houve melhora da lesão
hepática, caracterizada pela degeneração granular e vacuolar do hepatócito. Neste
mesmo estudo, histologia hepática normal somente foi observada com a redução do
percentual de lipídios da dieta (POPESCU, 2013).
No entanto, estudos demonstraram que a suplementação da dieta HL+ com os
AGPI-n3 está associada ao aumento da peroxidação lipídica e redução de
antioxidantes (KRAVCHENKO et al, 2013; SAITO; NAKATSUGAWA, 1994; SEALLS
et al, 2008). O estudo de Castro et al (2012) demonstra que o uso do óleo de peixe
promoveu o aumento da tolerância à glicose, mas a longo prazo foi associado a um
efeito negativo devido ao aumento da peroxidação lipídica e dano ao DNA dos
hepatócitos.
Os efeitos do uso do óleo de TCM ou óleo de peixe na dieta HL+ no
desenvolvimento da esteatose hepática e estresse oxidativo foram verificados em
um estudo anterior (ALMEIDA, 2011). Neste mesmo estudo, os TCMs foram
associados a um efeito negativo no desenvolvimento da esteatose hepática devido
ao exacerbado acúmulo de TG no fígado, no entanto, verificou-se o aumento da
defesa antioxidante hepática. Em contrapartida, o uso do óleo de peixe na dieta HL+
foi associado ao aumento significativo da peroxidação lipídica hepática e os
benefícios dos AGPI n-3 na redução da gordura hepática foram limitados (ALMEIDA,
2011).
Neste sentido, a combinação do óleo de TCM e óleo de peixe parece uma
alternativa promissora para contrabalancear os efeitos negativos e positivos da
administração isolada dos TCMs e dos AGPI-n3.
A NAFLD é uma doença de alta prevalência cujo tratamento ainda não está
estabelecido. O presente estudo visa verificar os efeitos metabólicos da combinação
de TCM e óleo de peixe na busca de uma possível alternativa para o tratamento da
esteatose hepática.
38
Justificativa
39
2. Justificativa
Os efeitos metabólicos do uso combinado dos triglicerídeos de cadeia média
e do óleo de peixe no tratamento da esteatose hepática ainda não estão totalmente
esclarecidos.
40
Objetivos
41
3. Objetivos
3.1. Objetivo Geral
Verificar os efeitos da combinação de triglicerídeos de cadeia média e óleo de
peixe na esteatose hepática e estresse oxidativo induzidos pela dieta hiperlipídica
termolizada em ratos.
3.2. Objetivos Específicos
Avaliar o efeito da dieta hiperlipídica com triglicerídeos de cadeia média
e óleo de peixe nos lipídios hepáticos e séricos, através da gordura
total hepática e frações lipídicas hepáticas e séricas
Avaliar o efeito da dieta hiperlipídica com triglicerídeos de cadeia média
e óleo de peixe na glicemia.
Avaliar o efeito da dieta hiperlipídica com triglicerídeos de cadeia média
e óleo de peixe no sistema antioxidante através da determinação de
vitamina E, glutationa reduzida e no estresse oxidativo através da
peroxidação lipídica
Avaliar o efeito da dieta hiperlipídica com triglicerídeos de cadeia média
e óleo de peixe na lesão hepática através das aminotransferases
séricas (AST e ALT).
42
Materiais
e
Métodos
43
4. Materiais e Métodos
4.1. Animais e dieta
No total, foram utilizados 50 ratos machos da linhagem Wistar com peso médio
de 60 gramas provenientes do Biotério da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
– Universidade de São Paulo. Os ratos foram alojados em gaiolas individuais e
mantidos à temperatura de 25C num ciclo claro-escuro de 12 horas. A limpeza das
gaiolas e a pesagem dos animais foram realizadas semanalmente. As dietas foram
pesadas e repostas três vezes na semana. A distribuição dos animais foi realizada
aleatoriamente em cinco grupos. Os animais receberam água e dieta à vontade
durante 60 dias.
A dieta controle utilizada no estudo consistiu de ração comercial para ratos
(Nuvilab), contendo por peso 22% de proteína, 57% de carboidratos, 4% de lipídios,
9% de cinzas, com 3,5 Kcal/g (FREITAS, 2011). A dieta HL+ foi obtida de uma
mistura na proporção de 50% de ração moída e 50% de gordura animal (banha)
(Sadia) termolizada, adaptada de Almeida et al (2011) e Leonardi et al (2010). O
aquecimento da gordura animal foi realizado durante 30 minutos à 180ºC, adaptado
de Assis et al (2009).
A dieta do grupo Controle (C) consistiu da ração moída. A dieta HL+ utilizada
para a indução da esteatose nos animais foi composta por 50% de lipídios
provenientes da gordura animal termolizada e 50% da ração moída. As dietas dos
grupos HL+OP e HL+TCM continham 25% de gordura animal termolizada e 25% dos
respectivos óleos (óleo de peixe (Campestre) e óleo de TCM (Support) e do grupo
HL+OP/TCM continha 25% de gordura animal termolizada, 15% de óleo de TCM e
10% de óleo de peixe.
A composição das dietas experimentais consumidas pelos animais é
apresentada nos Quadros 1 e 2.
O grupo Controle (n=10) recebeu a dieta controle durante todo experimento. A
adaptação à dieta controle foi realizada durante os primeiros 3 dias. Os grupos
HL+GA (n=10), HL+TCM (n=10), HL+OP (n=10) e HL+TCM/OP (n=10) receberam as
44
dietas HL+. A adaptação dos animais à dieta HL+ foi realizada durante 5 dias com o
aumento gradual do conteúdo de lipídios. Inicialmente os animais receberam as
dietas experimentais adicionadas à dieta controle na proporção de 1:1
(Experimental:Controle), e posteriormente, na proporção 2:1. Após o período de
adaptação foi ofertada a dieta HL+ com 50% de lipídios contendo somente a GA
termolizada para todos os grupos HL+ durante 30 dias. Em seguida, animais
receberam as dietas HL+ de diferentes composições (GA termolizada somente,
adicionada de óleo de TCM e/ou óleo de peixe) durante 20 dias. A adição dos óleos
à dieta foi realizada progressivamente durante 5 dias, para adaptação dos animais.
Inicialmente os animais receberam as dietas experimentais HL+ contendo GA
termolizada e as dietas HL+ adicionadas dos diferentes tipos de óleos na proporção
de 1:1 (HL+Óleos:HL+GA), e posteriormente, na proporção 2:1. Após este período de
adaptação os animais receberam as dietas com a GA termolizada adicionada dos
respectivos óleos na proporção total das dietas experimentais.
Ao fim do experimento os animais foram eutanasiados por decaptação. O
sangue, o fígado e o tecido adiposo foram coletados para as análises histológicas e
bioquímicas. O sangue foi prontamente centrifugado a 3500 rpm, à 4°C durante 15
minutos para obtenção do soro. O fígado, o tecido adiposo epididimal e
retroperitoneal foram removidos, pesados e prontamente congelados em nitrogênio
líquido. As amostras foram armazenadas a -40ºC para posteriores análises
bioquímicas.
45
Quadro 1. Composição das dietas experimentais (g/100g).
Ingredientes
(g/100g)
Dieta
controle
Dieta
gordura
animal
termolizada
50%
Dietas gordura animal
termolizada + óleos
Óleo de
TCM
Óleo
de
peixe
Óleo de
TCM +
peixe
Ração 100 50 50 50 50
Óleo de TCM 0 0 25 0 15
Óleo de peixe 0 0 0 25 10
Gordura animal 0 50 25 25 25
BHT 0 0,01 0,01 0,01 0,01
BHT – di-terc-butil metil fenol.
46
Quadro 2. Composição em nutrientes das dietas experimentais (%)
Nutriente (%) Controle HL+GA HL+TCM HL+OP HL+OP/TCM
Proteína (%) 22 11 11 11 11
Carboidrato (%) 57 28,5 28,5 28,5 28,5
Lipídio (%) 4 52 52 52 52
Valor calórico (Kcal)* 350 625 625 625 625
Energia lipídios (%)* 10,3 74,9 74,9 74,9 74,9
FREITAS, 2011. *O Fator de Atwater de 9Kcal/g foi utilizado para o cálculo de energia dos óleos e gordura animal utilizados na dieta (ZOU et al, 2007).
47
4.2. Análises
4.2.1. Determinação da gordura hepática total
A determinação da gordura hepática total foi realizada de acordo com o método
proposto por Bligh e Dyer (1959).
O tecido hepático (500mg) foi homogeneizado com 0,8mL de água destilada, em
tubos de 10mL e em seguida foi adicionado 2mL de metanol e 1 mL de clorofórmio.
As amostras foram submetidas à agitação em vórtex por 1 minuto. Posteriormente
foram adicionados 1mL de água e 1 mL de clorofórmio e submetidos a nova
agitação por 2 minutos e então as amostras foram centrifugadas à 1000rpm por 5
minutos, para separação do clorofórmio da fase aquosa. A fase inferior (clorofórmio),
aproximadamente 1,3mL, foi transferida para um tubo de ensaio contendo 1g de
sulfato de sódio anidro para remoção dos traços de água. A alíquota de 0,5mL da
fase de clorofórmio livre de água foi transferida para um béquer, previamente
pesado, e levado a estufa, com circulação forçada de ar, na temperatura de 50ºC
para evaporação de todo o clorofórmio e nova pesagem do béquer.
O cálculo foi obtido através da diferença das pesagens do béquer, em relação à
massa inicial do tecido utilizado.
48
4.2.2. Determinação de ácidos graxos dos óleos e gordura das dietas
experimentais
Os AGs dos óleos e gordura da dieta experimental foram determinados por
cromatografia gasosa (SHIMADZU, GC-2014), equipado com auto-injetor AOC-20i,
com coluna capilar Supelcowax de 30m de comprimento, 0,25mm de diâmetro
interno e 0,25µm de espessura de filme. O gás Hélio foi utilizado como carreador,
com fluxo de 1,6ml/min. O ar sintético foi utilizado para a ionização em chama com
detecção a 250ºC. As injeções foram realizadas em modo splitless.
A determinação dos AGs dos óleos e gordura das dietas utilizadas foi adaptada
de Andreoli et al (2007) através da extração com hexano.
Inicialmente, 50L de amostra foram hidrolisados, em um tubo fechado, com
1,0mL da solução de KOH e metanol 0,5M a 100ºC durante 5 minutos.
Posteriormente foram esterificados com a adição de 400L da solução de HCl e
metanol (4:1 v/v) e novamente aquecidos a 100ºC durante 15 minutos. As amostras
foram resfriadas e então, adicionado 2 mL de água para a extração dos AGs
estereificados com o uso do hexano na proporção 2x3mL. A fase orgânica
(sobrenadante) obtida foi passada em um funil contendo Na2SO4, anidro, para sofrer
evaporação, e posteriormente foi redissolvida em 500L de CHCl3, para a análise
no GC.
A determinação dos AGs foi realizada através de um padrão externo (Supelco 37
Component FAME Mix).
49
4.2.3. Determinação de colesterol total (CT) e triglicerídeos (TG)
hepáticos e séricos
As frações lipídicas foram dosadas no fígado após a extração da gordura total
pelo método de Bligh e Dyer (1959) e posteriormente foram determinados por kits
comerciais utilizados para análise em soro, conforme descrito a seguir.
4.2.4. Determinação do colesterol total
O CT foi determinado pelo método colorimétrico enzimático através de kits
comerciais da Labtest (Labtest Diagnóstica S.A., Brasil). Os ésteres de colesterol
foram hidrolisados pela colesterol esterase a AGs e a colesterol livre, que foi então
oxidado pela colesterol oxidase a colest-4-en-ona e a peróxido de hidrogênio. O
fenol e a 4-aminoantipirina foram oxidados, na presença da peroxidase e peróxido
de hidrogênio, formando a antipirilquinonimina com absortividade máxima à 500nm,
com intensidade da cor vermelha formada na reação final diretamente proporcional à
concentração do colesterol na amostra. No procedimento foi adicionado 1mL de
reagente de cor a 10µL de amostra, em seguida essa solução foi incubada em
banho Maria a 37ºC por 10 minutos, e então foi realizada a leitura a 500nm. A
concentração de colesterol total das amostras foi dada a partir de um padrão
conhecido de colesterol.
4.2.5. Determinação de triglicerídeos
A determinação dos TG hepáticos foi realizada pela metodologia colorimétrica
enzimática através de kits comerciais da Labtest (Labtest Diagnóstica S.A., Brasil). A
hidrólise dos triglicerídeos foi realizada pela lipase da lipoproteína, liberando o
glicerol, que foi convertido em glicerol-3-fosfato, pela gliceroquinase. O glicerol-3-
fosfato foi então oxidado à dihidroxiacetona e peróxido de hidrogênio na presença da
50
glicerolfosfato oxidase. Posteriormente foi realizada uma reação de acoplamento
entre peróxido de hidrogênio, 4-aminoantipirina e 4-clorofenol, catalizada pela
peroxidase, produzindo uma quinoneimina com absorbância máxima em 505nm,
sendo que a intensidade da cor vermelha formada é diretamente proporcional à
concentração dos triglicerídeos da amostra. No procedimento, foi adicionado 1mL de
reagente de cor a 10µL de amostra, em seguida essa solução foi incubada em
banho Maria a 37ºC por 10 minutos, e então foi realizada a leitura a 505nm. A
concentração de triglicerídeos das amostras foi dada a partir de um padrão
conhecido de triglicerídeos.
4.2.6. Determinação da proteína sérica e hepática
A determinação da proteína sérica e hepática foi realizada através kits
comerciais, pelo método de Biureto (Labtest Diagnóstica, Lagoa Santa, MG, Brasil).
A determinação da proteína hepática foi realizada no homogenato de fígado, cerca
de 50mg de tecido, diluídos em 0,5mL de água, para posterior análise. Os íons
Cobre em meio alcalino (Reagente de Biureto) reagiram com as ligações peptídicas
das proteínas séricas formando cor púrpura, com absorbância máxima em 545nm,
sendo proporcional à concentração de proteína da amostra. No procedimento, foram
adicionados 500µL de reagente de cor a 10µL de amostra, em seguida essa solução
foi incubada em banho Maria a 37ºC por 10 minutos, e então foi realizada a leitura a
545nm. A concentração de proteínas totais das amostras foi dada a partir de um
padrão conhecido de proteínas totais.
4.2.7. Determinação da glicemia
A glicemia dos animais foi determinada em até 8 horas após a eutanásia dos
animais a partir do soro utilizando-se o kit para dosagem de Glicose PAP Liquiform
Labtest ®, no qual a glicose oxidase catalisa uma reação, formando peróxido de
hidrogênio que reage com 4-aminoantipirina e fenol em reação oxidativa, tendo
51
como produto uma antipirilquinonimina vermelha, cuja intensidade da cor é
proporcional a concentração de glicose na amostra de soro. No procedimento foi
adicionado 1mL de reagente de cor a 10µL de amostra, em seguida essa solução foi
incubada em banho Maria a 37ºC por 10 minutos, e então foi realizada a leitura a
505nm. A concentração de glicemia das amostras foi dada a partir de um padrão
conhecido de glicose.
4.2.8. Determinação da HDL colesterol
Para a determinação do HDL colesterol sanguíneo através da precipitação
seletiva de lipoproteinas de baixa e muito baixa densidade (LDL e VLDL), foi
utilizado a combinação de dois kits, o Colesterol HDL Labtest ® e Colesterol
Liquiform Labtest ®. Em 100µL de amostra foram adicionados 100µL de precipitante
de lipoproteínas de baixa e muito baixa densidade (LDL e VLDL). Essas amostras
foram agitadas em vórtex por 30 segundos e então centrifugadas a 4000rpm por 15
minutos. Foram retirados 50µL do sobrenadante e adicionados a 500µL de reagente
de cor de colesterol. Em seguida essa solução foi incubada em banho Maria a 37ºC
por 10 minutos, e então foi realizada a leitura a 500nm. A concentração de HDL das
amostras foi dada a partir de um padrão conhecido de HDL.
4.2.9. Determinação da peroxidação lipídica sérica e hepática
Esta análise foi feita de acordo com o método proposto por Gerard-Monnier et
al (1998), com algumas adaptações. Para a dosagem de MDA no soro foram
utilizados 200μl de amostra. A determinação do MDA no fígado foi realizada com a
alíquota de 200l retirada do homogenato de fígado (200mg de tecido em 1L de
tampão fosfato). A este foi adicionado 650μl de solução de 10mM de 1-metil-
fenilindol em acetonitrila e metanol (2:1, v/v) e 150μl de HCL puro (37%). Logo após,
as amostras foram agitados em vórtex e incubados em banho-maria a 45ºC por 40
minutos. Após o banho, houve resfriamento das amostras em gelo e em seguida os
52
eppendorfs foram centrifugados a 4000rpm por 10 minutos. Do sobrenadante foi
feita a leitura de absorbância com comprimento de onda de 586nm. A concentração
de MDA foi calculada comparando-a a uma curva de 1,1,3,3- tetrametoxipropano
(TMP) hidrolisado.
4.2.10. Determinação de glutationa reduzida (GSH) hepática e sérica
A dosagem de Glutationa Reduzida (GSH) foi realizada no tecido hepático de
acordo com o método descrito por Sedlak e Lindsay (1968). Cerca de 100mg da
amostra do tecido foi homogeneizada em um Potter com 4,0 mL de tampão EDTA
(0,02M), sob gelo. Uma alíquota de 2,5 mL deste homogenato foi retirada, para a
mistura a 2,0 mL de água deionizada e 0,5 mL de ácido tricloroacético (TCA) 50%. A
reação dura cerca de 15minutos, posteriormente a amostra foi centrifugada por 15
minutos (4000 rpm a temperatura ambiente). Após a centrifugação foi retirado 1,0
mL do sobrenadante e adicionado 2,0 mL de tampão TRIS (0,4M, pH 8,9) e 0,05 mL
de DTNB (ácido ditionitrobenzóico) (0,01M em metanol). A leitura foi feita no
comprimento de onda de 412 nm, 5 minutos após a adição do DTNB, contra um
branco com EDTA (0,02M) em lugar do sobrenadante. A concentração foi calculada
utilizando-se uma curva padrão de GSH em EDTA (0,02M).
A GSH foi dosada por meio de uma alíquota de 25L de soro com a adição de
1mL do tampão Tris-EDTA para a realização da primeira leitura no comprimento de
onda de 412nm, obtendo-se A1. Posteriormente, 25L do DTNB foi adicionado à
esta solução e após 15 minutos de reação a temperatura ambiente, foi realizada a
segunda leitura, obtendo-se A2, contra um branco de DTNB. Após a subtração dos
valores obtidos A2-A1, a concentração na amostra foi calculada utilizando-se, uma
curva padrão de GSH, expressa em mmol/L, conforme método descrito por Costa;
Dos Santos; Lima (2006).
53
4.2.11. Determinação de retinol sérico e da vitamina E sérica e dos
óleos e gordura das dietas experimentais
As análises hepáticas de vitamina E (-tocoferol) e de retinol foram realizadas
por HPLC, segundo método adaptado de Arnaud et al (1991). Para as análises foi
utilizado um cromatógrafo Shimadzu modelo LC-20AT; coluna tipo C-18 (150 x
4,6mm - 5µm); detector UV-visível modelo SPD-20A; fase móvel composta por
acetonitrila:diclorometano:metanol 7:2:1; velocidade de fluxo de 1,0 mL/min e
detecção em 292 nm e 352 nm para α-tocoferol e retinol, respectivamente. As
concentrações foram determinadas por meio do uso de padrão externo e os
resultados foram expressos em µmol/L de soro/plasma.
Cerca de 200mg de óleo/gordura ou 200L de soro foram homogeneizados
com 400L de etanol absoluto. Posteriormente foi adicionado 400L de n-hexano
para extração. As amostras sofreram agitação em vórtex por 1 minuto, para posterior
centrifugação (3000rpm durante 10 min). O sobrenadante foi retirado, cerca de
200L, e seco ao fluxo de nitrogênio. A ressuspensão do resíduo seco foi realizada
com 200L da fase móvel e 20mL foram injetados no cromatógrafo.
4.2.12. Determinação das concentrações séricas das aminotransferases
aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase
(ALT)
As concentrações das aminotransferases séricas foram avaliadas com o uso
de kits comerciais Labtest. O método foi descrito por uma transferência de
agrupamentos amina de α-aminoácidos para α-cetoácidos, formando, glutamato e
oxaloacetato ou o piruvato, que são medidos pela formação de hidrazona, com a
característica de cor intensa em meio alcalino. No procedimento 250L de substrato
foi incubado em Banho Maria à 37°C durante 2 minutos. Em seguida, foi adicionado
50µL de amostra e a solução foi incubada em Banho Maria à 37ºC por exatamente
30 minutos (ALT) e por exatamente 1 hora (AST). Foi adicionado 250L do reagente
e a solução foi mantida à temperatura ambiente durante 20 minutos, posteriormente,
54
foi adicionado 2,5mL de NaOH e após 5 minutos à temperatura ambiente foi
realizada a leitura a 505nm. A concentração de AST ou ALT das amostras foi obtida
a partir da curva de calibração nas concentrações de zero, 28, 57, 97 e 150
Unidades/mL de um padrão conhecido de ALT, ou nas concentrações de zero, 24,
61,114 e 190 Unidades/mL de um padrão conhecido de AST.
4.3. Cálculos
4.3.1. Cálculo da taxa de eficiência da dieta (TED)
A TED expressa a eficiência da dieta em propiciar ganho de peso e é
calculada de acordo com a fórmula apresentada abaixo (KANG; AHN; LEE, 2005):
TED = [média ganho de peso diário (g)/média de consumo de dieta diário (g)]
4.3.2. Cálculo do índice de peroxibilidade da dieta
O índice de peroxibilidade (IP) da dieta foi calculado conforme descreve
Pamplona et al (1998) a partir dos dados obtidos na determinação do perfil de AGs
das dietas experimentais, com base no grau de insaturação dos AGs. A fórmula
utilizada para o cálculo é descrita a seguir:
IP = (% monoenóicos x 0,025) + (% dienóicos x 1) + (% trienóicos x 2) + (%
tetraenóicos x 4) + (pentaenóicos x 6) + (hexaenóico x 8).
55
4.3.3. Cálculo da razão entre triglicerídeos e HDLcolesterol séricos
A razão triglicerídeos/HDLcolesterol foi calculada como preditor da resistência
a insulina, conforme proposto por Fan et al (2011).
4.3.4. Cálculo da razão entre vitamina E e colesterol
A razão vitamina E/colesterol foi calculada conforme descrito por Ford et al
(2006).
4.4. Análise Estatística
A comparação entre os grupos experimentais foi realizada pela análise de
variância one-way (ANOVA) com pós-teste de Tukey, considerando p <0,05 como
nível de significância. As variáveis são apresentadas como média ± desvio padrão.
56
Resultados
57
5. Resultados
5.1. Composição dos óleos de TCM e peixe e gordura animal
5.1.1. Perfil de ácidos graxos dos óleos de TCM e peixe e gordura animal
O perfil de AGs dos óleos de TCM e peixe e da GA são apresentados no
Quadro 3.
A GA é rica em ácido oléico, principal representante dos AGMIs. Os AGSs,
principalmente os ácidos palmítico e esteárico, também estão presentes em elevado
percentual. A GA é rica em ômega 6 (n-6), sendo que o ácido linoléico é o principal
representante dos AGPIs.
O óleo de peixe é rico em AGPI n-3, sendo o EPA e DHA os principais
representantes, que contribuem para a baixa razão n-6/n-3. O perfil de AGs do óleo
de peixe revelou um elevado percentual de ácido palmítico, o que contribuiu para o
elevado percentual de AGSs.
O óleo de TCM é composto principalmente pelos AGSCMs (caprílico e
cáprico), com cadeia de 8 e 10 carbonos, respectivamente. A análise dos AGs do
óleo de TCM apresentou valores mínimos de AGs com insaturações.
A maior razão entre AGSs e AGPIs foi encontrada na GA, seguida do óleo de
peixe. Estima-se que esta razão seja elevada no óleo de TCM devido ao mínimo
conteúdo de AGPIs.
58
Quadro 3. Composição percentual em ácidos graxos dos óleos de peixe, TCM e gordura animal (%).
Ácido Graxo Estrutura
Óleos Gordura* animal Peixe TCM
Ácidos graxos saturados
Ácido caprílico C8:0 <0,05 52,02 <0,05
Ácido cáprico C10:0 <0,05 35 <0,05
Ácido mirístico C14:0 7,31 12,78 1,4
Ácido palmítico C16:0 22,28 <0,05 24,53
Ácido esteárico C18:0 4,81 <0,05 10,07
Ácido tricosanóico C23:0 0,75 <0,05 <0,05
∑AGS
35,15 99,8 36
Ácidos graxos monoinsaturados
Ácido palmitoléico C16:1 7,54 <0,05 2,39
Ácido oléico C18:1n9 10,36 <0,05 43,23
Ácido erúcico C22:1n9 1,42 <0,05 <0,05
∑AGMI
19,32 - 45,61
Ácidos graxos poli-insaturados
Ácidos graxos n-6
Ácido linoléico C18:2n6 11,31 <0,05 16,54
Ácido Di-homo-linolênico C20:3n6
<0,05 0,53
Ácido araquidônico C20:4n6 0,46 <0,05 <0,05
∑n-6
11,77 - 17,07
Ácidos graxos n-3
Ácido α-linolênico C18:3n3 1,91 <0,05 <0,05
Ácido eicosatrienóico C20:3n3 0,22 <0,05 <0,05
Ácido eicosapentaenóico C20:5n3 15,05 <0,05 <0,05
Ácido docosahexaenóico C22:6n-3 12,6 <0,05 <0,05
∑n-3
29,78 - <0,05
∑AGPI
41,55 - 17,07
Razão n-6/n-3
0,4 - -
Razão ∑AGS/∑AGPI
0,85 - 2,03
Outros ácidos graxos 4,2 0,2 1,32
*Perfil de ácidos graxos da gordura animal sem tratamento térmico. ∑: somatória; AGS: ácidos graxos saturados; AGMI: ácidos graxos monoinsaturados; AGPI: ácidos graxos poli-insaturados; n-3: ácidos graxos ômega-3; n-6: ácidos graxos ômega-6.
59
5.1.2. Índice de peroxibilidade dos óleos de TCM e peixe e gordura
animal
O IP dos óleos de TCM e de peixe e da GA são apresentados no Quadro 4.
O cálculo do IP é realizado de acordo com o grau de insaturações dos AGs. O
óleo de peixe é composto por elevado percentual dos AGPIs EPA e DHA, o que
contribuiu para elevado IP encontrado. A GA apresentou baixo IP provavelmente por
apresentar elevado percentual de AGS e AGMI. Em relação ao óleo de TCM,
estima-se que o IP seja mínimo, já que é composto por AGSs e apresenta um
percentual mínimo de insaturações.
60
Quadro 4. Índice de peroxibilidade (IP) dos óleos de TCM e peixe e da gordura animal utilizados na dieta.
Óleo de Peixe
Óleo de
TCM*
Gordura**
Animal
Índice de peroxibilidade 208,99 ─ 18,74
*Devido à presença de quantidades mínimas de AGs com insaturações não foi possível realizar o cálculo do índice de peroxibilidade do óleo de TCM. **Índice de peroxibilidade da gordura animal sem tratamento térmico. IP = (% monoenóicos x 0,025) + (% dienóicos x 1) + (% trienóicos x 2) + (% tetraenóicos x 4) + (pentaenóicos x 6) + (hexaenóico x 8).
61
5.1.3. Vitamina E dos óleos de TCM e peixe e gordura animal
O teor de vitamina E dos óleos de TCM e de peixe e da GA são apresentados
na Figura 3.
O óleo de peixe apresenta elevado teor de vitamina E, seguido do óleo de
TCM e da GA, em ordem decrescente de concentração.
62
Figura 3. Valores de vitamina E dos óleos de TCM e peixe e da gordura animal (nmol/mL). *Valores de vitamina E da gordura animal sem tratamento térmico. Barras
largas verticais representam a média, barras finas representam os desvios-padrões. ap<0,001 vs Gordura Animal. bp<0,001 vs óleo de TCM.
63
5.2. Crescimento dos animais
O peso inicial dos animais não apresentou diferença estatística. A evolução
do peso semanal dos animais evidenciou um menor ganho de peso nos grupos que
foram alimentados com as dietas HL+ a partir da terceira semana, comparados ao
grupo Controle. Na sétima semana o grupo HL+OP apresentou peso reduzido em
relação ao HL+GA. Na oitava semana, somente os grupos que receberam os óleos
(HL+TCM, HL+OP e HL+OP/TCM) apresentaram peso menor que o Controle. Apenas
o grupo que recebeu o óleo de peixe (HL+OP) apresentou menor peso final,
comparado ao Controle. Os dados são apresentados na Figura 4 e na Tabela 1.
O calculo do ganho de peso (Δ) revelou um menor ganho de peso total no
grupo HL+OP, em relação ao grupo Controle. Os dados são apresentados na Tabela
1. As médias de peso observadas semanalmente durante o experimento são
apresentadas no Apêndice A.
64
Figura 4. Evolução semanal do peso dos animais (g). Os pontos representam valores médios de ganho de peso, as barras verticais em cada ponto expressam os desvios-padrões. ap<0,05 vs Controle. bp<0,01 vs HL+GA. (♦)Controle, (■)HL+GA, ( )HL+OP, (><)HL+TCM, (>|<)HL+OP/TCM. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA
50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.
65
Tabela 1. Peso inicial, peso final e ganho de peso dos animais durante todo experimento (g).
Controle HL+GA HL+TCM HL+OP HL+OP/TCM
Peso corporal inicial (g) 70,00±6,88 68,29±6,16 62±8,45 64,86±5,08 70,33±7,44
Peso corporal final (g) 402,57±74,47 371,14±45,72 335±34,11 310,29±34,49a 324,83±88,47
(Δ) Ganho de peso (g) 332,57±70,32 302,86±41,83 273±36,74 245,43±30,01a 254,5±84,22
Resultados expressos em média ± DP. ap<0,05 vs Controle. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.
66
5.3. Ingestão alimentar dos animais
Na Figura 5 são apresentados os dados sobre a ingestão alimentar semanal
dos animais durante o experimento. A ingestão de dieta semanal dos animais foi
calculada a partir da média obtida em 3 dias de consumo. A partir da primeira
semana do experimento verifica-se uma redução da ingestão alimentar nos animais
que receberam as dietas HL+. Na sétima semana, o grupo alimentado com óleo de
peixe somente, apresentou uma redução significativa da ingestão alimentar,
comparado tanto ao Controle, quanto ao grupo HL+GA. Na última semana, não
verificou-se diferença significativa na ingestão alimentar entre os grupos
experimentais. As médias de ingestão alimentar por semana são apresentadas no
Apêndice B.
A ingestão energética semanal dos animais é apresentada na Figura 6. Na
primeira semana, os animais alimentados com as dietas HL+ dos grupos HL+OP,
HL+TCM HL+OP/TCM apresentaram maior ingestão de energia em relação ao
Controle. Durante o experimento, a ingestão energética dos grupos HL+ foi
semelhante ao Controle. Somente na sétima semana, verificou-se redução da
ingestão enérgetica nos grupos alimentados com óleo de peixe (HL+OP e
HL+OP/TCM). Nas últimas semanas do experimento a ingestão energética foi
normalizada, sendo que não se verificou diferença estatística. As médias de
ingestão energética por semana são apresentadas no Apêndice C.
67
Figura 5. Ingestão alimentar semanal dos animais (g). Os pontos representam valores médios de ingestão alimentar, as barras verticais em cada ponto expressam os desvios-padrões. Os valores expressos para cada grupo por semana representam a média de três dias de consumo. ap<0,05 vs Controle. bp<0,001 vs Controle. cp<0,05 vs HL+GA. (♦ )Controle, (■)HL+GA, ( )HL+OP, (><)HL+TCM, (>|<)HL+OP/TCM. Inicio: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta
Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.
68
Figura 6. Ingestão energética semanal dos animais (g). Os pontos representam valores médios de ingestão energética, as barras verticais em cada ponto expressam os desvios-padrões. Os valores expressos para cada grupo por semana representam a média de três dias de consumo. ap<0,001 vs HL+OP. bp<0,01 vs HL+TCM. cp<0,05 vs HL+OP/TCM. (♦ )Controle, (■)HL+GA, ()HL+OP, (><)HL+TCM, (>|<)HL+OP/TCM. Inicio: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2:
Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.
69
5.4. Ganho de peso, ingestão alimentar e energética diários e taxa de
eficiência da dieta
A quantidade de dieta ingerida por dia foi significativamente menor nos grupos
alimentados com as dietas HL+. No entanto, não houve diferença estatística da
ingestão energética nestes grupos HL+, em relação ao grupo Controle. O ganho de
peso por dia dos grupos HL+ foi semelhante ao Controle, com exceção do grupo
HL+OP/TCM, que apresentou menor ganho de peso diário. A TED, que expressa a
eficiência da dieta em propiciar ganho de peso, foi maior nos grupos HL+. Os dados
são apresentados na Tabela 2.
70
Tabela 2. Ingestão alimentar diária (g/dia), ingestão energética diária (Kcal/dia), ganho de peso diário (g/dia) e taxa de eficiência da dieta.
Controle HL+GA HL+TCM HL+OP HL+OP/TCM
Ingestão de dieta (g/dia) 11,72±2,92 6,48±1,24a 6,23±1,25a 5,88±0,84a 5,67±1,58a
Ingestão energética (Kcal/dia) 41,01±10,21 40,51±7,77 38,93±7,79 36,73±5,28 35,46±9,90
Ganho de peso (g/dia) 5,54±1,17 5,18±0,68 4,61±0,67 4,13±0,76 3,91±2,04b
Taxa de eficiência da dieta 0,42±0,11 0,76±0,05a 0,71±0,05a 0,67±0,08a 0,69±0,14a
Resultados expressos em média ± DP. ap<0,001 vs Controle. bp<0,05 vs Controle. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.
71
5.5. Peso hepático, peso do tecido adiposo epididimal e retroperitonial,
e razões em relação ao peso corporal
Os dados sobre peso hepático e do tecido adiposo são apresentados na
Tabela 3. O peso hepático foi significativamente maior apenas no grupo HL+GA,
comparado aos grupos Controle, HL+TCM e HL+OP/TCM. A razão peso
hepático/corporal revela maior peso hepático em relação ao peso corporal tanto no
grupo HL+GA quanto no grupo HL+OP, comparados ao Controle. No grupo HL+GA
verificou-se maior peso de tecido adiposo epididimal, comparado ao Controle e
HL+TCM. O mesmo é observado quando o peso do tecido adiposo epididimal é
ajustado pelo peso corporal. Em relação ao peso do tecido adiposo retroperitoneal,
verifica-se maiores valores nos grupos HL+GA, HL+TCM e HL+OP/TCM. Os valores
do peso do tecido adiposo retroperitoneal ajustado pelo peso corporal revelam que
também há diferença estatística no grupo HL+OP em relação ao Controle.
72
Tabela 3. Peso hepático, peso tecido adiposo epididimal e retroperitonial, e razões em relação ao peso corporal (g).
Controle HL+GA HL+TCM HL+OP HL+OP/TCM
Peso hepático (g) 9,41±1,99 14,05±3,22a,b 10,25±1,93 11,05±2,54 10,25±2,26
Razão peso hepático/corporal (%) 2,33±0,11 3,76±0,50c 3,08±0,59 3,53±0,46c 3,29±0,94
Tecido adiposo epididimal (g) 4,47±1,63 7,90±2,46a,d 4,60±1,59 5,13±1,39 5,64±2,96
Tecido adiposo retroperitoneal (g) 3,82±1,88 9,91±2,69c 7,38±1,47c 6,75±1,93 8,07±4,08c
Razão peso tecido adiposo epididimal/corporal (%) 1,12±0,44 2,09±0,45c,d 1,35±0,35 1,64±0,30 1,67±0,47
Razão peso tecido retroperitoneal/corporal (%) 0,93±0,44 2,64±0,46c 2,20±0,31c 2,15±0,42c 2,38±0,54c
Resultados expressos em média ± DP. ap<0,05 vs Controle. bp<0,05 vs HL+TCM e HL+OP/TCM. cp<0,001 vs Controle. dp<0,05 vs HL+TCM. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.
73
5.6. Gordura hepática total, gordura hepática percentual e
concentração das frações lipídicas hepáticas
A gordura total hepática e gordura hepática percentual (Tabela 4 e Figura 7)
foram significativamente maiores nos grupos que receberam as dietas HL+, com
exceção do grupo HL+OP. O CT hepático apresentou maiores valores nos grupos
HL+GA, HL
+OP e HL
+OP/TCM. Os valores de TG hepático foram maiores nos grupos
HL+, no entanto o grupo HL+OP não apresentou diferença significativa.
74
Tabela 4. Caracterização de gordura hepática pelos valores de gordura total (g gordura/g tecido), colesterol total e
triglicerídeos hepáticos (g/g tecido).
Controle HL+GA HL+TCM HL+OP HL+OP/TCM
Gordura total hepática (g gordura/g tecido) 0,05±0,01 0,21±0,06a,b 0,16±0,04a 0,11±0,04 0,17±0,06a
Colesterol total hepático (g/g tecido) 2,72±0,17 5,36±1,96c 3,49±0,66 5,38±2,47c 5,28±1,52c
Triglicerídeos hepático (g/g tecido) 3,36±1,65 74,42±29,93a,d 64,85±39,67a 36,91±15,93e 68,52±29,13a
Resultados expressos em média ± DP. ap<0,001 vs Controle. bp<0,001 vs HL+OP. cp<0,05 vs Controle. dp<0,05 vs HL+TCM e HL+OP/TCM. ep<0,05 vs HL+GA. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.
75
Figura 7. Percentual de gordura hepática (%). Barras largas verticais representam a média, barras finas representam os desvios-padrões. ap<0,001 vs Controle. bp<0,001 vs HL+OP. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.
76
5.7. Concentração sérica de glicose, triglicerídeos, colesterol total, HDL
colesterol séricos e razão triglicerídeos/HDLcolesterol
Os valores séricos de glicose e TG não apresentaram diferença significativa.
Verificou-se que o CT sérico foi maior no grupo HL+TCM. Neste mesmo grupo,
verificou-se maior valor da HDL colesterol, em relação aos grupos Controle e
HL+OP/TCM. A razão triglicerídeos/HDL colesterol foi menor no grupo HL+TCM,
comparado ao grupo HL+OP/TCM. Os dados são apresentados na Tabela 5.
77
Tabela 5. Valores séricos de glicose, triglicerídeos, colesterol total, lipoproteína de alta densidade (HDLcolesterol) (mg/dL), e razão triglicerídeos/HDLcolesterol.
Controle HL+GA HL+TCM HL+OP HL+OP/TCM
Glicose (mg/dL) 75,78±8,25 89,31±17,97 70,66±17,30 87,62±21,67 81,37±7,48
Triglicerídeos (mg/dL) 61,03±11,00 80,26±19,31 69,94±8,87 82,85±21,09 92,6±54,89
Colesterol total (mg/dL) 67,35±18,81 81,26±11,20 114,80±22,50a 82,07±17,88 67,43±26,13
HDL colesterol (mg/dL) 45,44±8,77 51,46±9,06 64,90±11,62b 57,62±12,43 44,65±8,68
Razão triglicerídeos/HDLcolesterol 1,56±0,36 1,56±0,29 1,06±0,19c 1,53±0,51 2,10±1,05
Resultados expressos em média ± DP. ap<0,001 vs Controle, HL+GA, HL+OP e HL+OP/TCM. bp<0,001 vs Controle e HL+OP/TCM. cp<0,01 vs HL+OP/TCM. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.
78
5.8. Proteína total sérica e hepática
Os valores de proteína total sérica não apresentaram diferença significativa.
No entanto, ao observar os valores hepáticos, verifica-se menor proteína total nos
grupos HL+GA, HL+TCM e HL+OP/TCM, em relação ao Controle. Os dados são
apresentados na Tabela 6.
79
Tabela 6. Concentrações médias sérica e hepática de proteína (g/mL).
Controle HL+GA HL+TCM HL+OP HL+OP/TCM
Proteína total sérica (g/mL) 0,079±0,011 0,074±0,010 0,075±0,004 0,075±0,008 0,077±0,009
Proteína total hepática (g/mL) 0,023±0,005 0,019±0,002a 0,018±0,003a 0,021±0,004 0,017±0,002a
Resultados expressos em média ± DP. ap<0,05 vs Controle. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ -
5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5
dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura
animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe
ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de
peixe e 15% de óleo de TCM.
80
5.9. Concentração sérica das aminotransferases
As concentrações séricas de AST e ALT e a razão AST/ALT são
apresentadas na Tabela 7. Os grupos HL+TCM e HL+OP/TCM apresentaram valores
séricos maiores de AST (comparado ao grupo HL+GA) e o grupo HL+OP apresentou
valor sérico maior de ALT, quando comparado aos grupos HL+GA e HL+TCM. A
razão AST/ALT foi menor nos animais alimentados com a dieta HL+ adicionada
somente de óleo de peixe (HL+OP).
81
Tabela 7. Concentrações médias séricas de aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) (U/L) e razão AST/ALT.
Controle HL+GA HL+TCM HL+OP HL+OP/TCM
AST (U/L) 77,8±18,88 66,00±8,72 85,48±12,76a 83,18±9,49 88,06±14,22a
ALT (U/L) 30,57±18,17 24,50±6,09 30,21±5,69 43,53±9,16b 34,57±4,07
AST/ALT 2,42±1,18 2,84±0,99 2,91±0,71 1,90±0,65c 2,40±0,59
Resultados expressos em média ± DP. ap<0,05 vs HL+GA. bp<0,05 HL+GA e HL+TCM. cp<0,05 HL+TCM. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.
82
5.10. Peroxidação lipídica sérica e hepática
Os valores de MDA como marcador da peroxidação lipídica são apresentados
na Tabela 8. O grupo HL+GA apresentou valor significativamente maior de MDA
sérico em relação aos grupos HL+TCM e HL+OP/TCM. Os grupos que receberam as
dietas HL+ apresentaram valores significativamente maiores da peroxidação lipídica
hepática em relação ao Controle, com exceção do grupo HL+TCM.
83
Tabela 8. Valores séricos (nmol/g proteína) e hepáticos (mol/g proteína) de malondialdeído (MDA).
Controle HL+GA HL+TCM HL+OP HL+OP/TCM
MDA sérico (nmol/g proteína) 85,80±24,16 104,23±29,19a 65,29±6,28 86,70±23,01 59,36±14,95
MDA hepático (mol/g proteína) 11,46±1,83 50,92±20,12b 16,66±9,07c 64,05±20,11b 54,23±8,75b
Resultados expressos em média ± DP. ap<0,05 vs HL+TCM e HL+OP/TCM. bp<0,001 vs Controle. cp<0,001 vs HL+GA, HL+OP e HL+OP/TCM. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM. MDA: Malondialdeído.
84
5.11. Sistema antioxidante sérico e hepático
Os parâmetros do sistema antioxidante sérico e hepático são apresentados
na Tabela 9. Apesar das concentrações de GSH sérico não apresentarem diferenças
significativas entre os grupos, verificou-se maiores valores de GSH hepático nos
grupos HL+GA, HL+TCM e HL+OP/TCM. Valores significativamente menores de
vitamina E sérica foram observados nos grupos HL+GA, HL+OP em relação ao
Controle e ao grupo HL+TCM. No grupo HL+OP/TCM o menor valor de vitamina E
sérica apresentou diferença significativa somente em relação ao grupo HL+TCM. O
cálculo da vitamina E ajustado pelo colesterol foi significativamente menor nos
grupos HL+GA, HL+OP e HL+OP/TCM, em relação ao Controle. A concentração do
retinol sérico foi significativamente maior nos grupos HL+GA e HL+TCM.
85
Tabela 9. Componentes do sistema antioxidante, valores de glutationa reduzida (GSH) sérica e hepáticamol/g proteína),
vitamina E e retinol séricos (mol/L) e razão vitaminaE/colesterol (mol/mg).
Controle HL+GA HL+TCM HL+OP HL+OP/TCM
GSH sérico (mol/g proteína) 4,03±1,44 5,7±1,69 5,38±1,54 5,23±1,54 3,69±1,39
GSH hepático (µmol/g proteína) 395,32±90,42 553,59±81,42a 532,51±79,21a 448,91±94,52 524,82±73,08a
Vitamina E sérico (µmol/L) 5,24±2,04 1,77±0,70a,b 8,39±3,73 0,67±0,20a,b 2,09±1,84b
Razão vitamina E/colesterol (mol/mg) 0,79±0,16 0,17±0,13c 0,77±0,36 0,08±0,02c 0,24±0,15c
Retinol sérico (µmol/L) 0,36±0,08 0,96±0,41a 0,86±0,31a 0,79±0,32 0,80±0,42
Resultados expressos em média ± DP. ap<0,05 vs Controle. bp<0,001 vs HL+TCM. cp<0,001 vs Controle e HL+TCM. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal termolizada. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal termolizada, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.
86
Discussão
87
6. Discussão
A GA termolizada utilizada no presente estudo implica na ingestão de
compostos que favorecem o estresse oxidativo. O aquecimento da GA a elevadas
temperaturas resulta na produção de compostos tóxicos como os produtos da
peroxidação lipídica, produtos finais de glicação avançada e lipoxidação e, portanto,
a ingestão da dieta HL+ termolizada implica no fornecimento exógeno destes
compostos (ASSIS et al, 2009; SHANGARI et al, 2007).
A análise do perfil de AGs da GA utilizada na dieta dos animais apresentou
elevado percentual de AGSs (ácidos palmítico e esteárico), AGMIs (ácido oléico),
AGPI n-6 (ácido linoléico), com elevada razão ∑AGS/∑AGPI, mas foi realizada antes
do processamento térmico. O aquecimento da gordura promove oxidação da cadeia
lipídica e pode resultar em alterações na composição em AGs. Segundo Gabriel,
Alexander e Valli (1976), o processamento térmico da GA promove uma redução da
concentração de ácido linoléico (1,4%) e aumento das concentrações de ácido
palmítico (28,1%) e esteárico (18,6%). Este mesmo estudo relata que a ingestão da
GA termolizada pode resultar em alterações na composição hepática de AGs, como
a redução das concentrações de ácidos oléico, ácido araquidônico e linoléico, e
aumento dos níveis de ácido palmítico e palmitoléico (GABRIEL, ALEXANDER;
VALLI, 1976).
Os óleos de Peixe e de TCM utilizados nas dietas não foram submetidos ao
processamento térmico e a composição em AGs encontrada no presente estudo
apresenta-se de acordo com o esperado, conforme descrito a seguir.
O óleo de peixe é rico em EPA e DHA, o que contribui para o elevado
percentual de AGPIs, elevado IP e baixa razão n-6/n-3 (OTTO et al, 1991; LOPEZ et
al, 2008). A elevada concentração de ácido palmítico no óleo de peixe contribuiu
para elevado percentual de AGSs. O uso de peixes com elevado percentual de
gordura corporal para extração do óleo e o uso do óleo de peixe não refinado nos
estudos em geral são fatores que contribuem para o elevado percentual de AGSs
(VENTURA; WOOLLETT; SPADY, 1989, PICKOVA, 2009). O conteúdo de colesterol
no óleo de peixe não está descrito na literatura, no entanto, espera-se que o valor do
colesterol no óleo seja maior que o encontrado na matéria-prima, que varia de
88
68,2mg, 87mg e 142mg em 100g de peixes como atum, salmão e sardinha,
respectivamente, devido à extração da fração lipídica (TACO, 2011; USDA, 2009).
O óleo de TCM utilizado no presente estudo é composto em maiores
percentuais pelos AGs caprílico e cáprico com cadeia de 8 e 10 carbonos,
respectivamente, e está de acordo com o encontrado nos estudos de Wollin et al
(2004), Tholstrup et al (2004) e You et al (2008). No entanto, a análise de AGs do
óleo de TCM revelou percentual de ácido mirístico maior que o valor encontrado em
outros estudos (WOLLIN et al, 2004; CATER; HELLER; DENKE, 1997). Os
percentuais de AGs essenciais n-6 e n-3 no óleo de TCM são mínimos (FLOYD,
1999). Estima-se um mínimo IP no óleo de TCM, pois apresenta valores mínimos de
AGs com insaturações.
A introdução à dieta HL+ foi associada à redução da ingestão alimentar, que
também ocorreu nos períodos de adaptação com aumento gradual de lipídios na
dieta. As dietas HL+ apresentaram maior TED em propiciar o ganho de peso devido
à elevada densidade calórica. Nos cálculos dos valores diários, a redução da
ingestão alimentar resultou em manutenção da ingestão energética. Os valores
apresentados por semana também revelam que a redução da ingestão alimentar nos
grupos HL+ não foi associada à redução de energia durante o experimento.
Outros estudos também observaram a redução da ingestão alimentar em
animais alimentados com dietas HL+ (LEONARDI et al, 2010; CATON et al, 2009). A
redução da ingestão alimentar é associada à manutenção da ingestão energética e
manutenção do peso dos animais que consomem dieta HL+ (SINITSKAYA et al,
2007; LARTER; YEH, 2008). O estudo de Benani et al (2012), realizado com
animais, demonstra o efeito anorexígeno da dieta HL+ e controle da homeostase
energética corporal.
A sétima semana corresponde ao período de introdução das dietas contendo
os óleos utilizados no experimento. A introdução da dieta contendo óleo de peixe foi
realizada de forma gradual, no entanto, resultou em maior redução da ingestão
alimentar no grupo HL+OP. Neste mesmo período, verificou-se redução da ingestão
de energia nos grupos que receberam o óleo de peixe (HL+OP e HL+OP/TCM). O
estudo de Buettner et al (2006) também verificou a redução da ingestão alimentar
associada ao uso do óleo de peixe na dieta dos animais. Segundo Cintra et al (2012)
89
dietas ricas em AGPIs são associadas à redução da inflamação no hipotálamo e
contribuem para redução da ingestão alimentar e do peso corporal.
O peso inicial dos animais não apresentou diferença estatística. Durante o
experimento foi observado que os grupos HL+ apresentaram menor peso em relação
ao Controle a partir da terceira semana, no entanto, somente o grupo HL+OP
apresentou menor ganho de peso total e menor peso final e o grupo HL+OP/TCM
apresentou menor ganho de peso por dia. O uso óleo de peixe na dieta HL+
promoveu redução na ingestão alimentar e energética, o que provavelmente
contribuiu para as alterações no ganho de peso verificadas nos grupos HL+OP e
HL+OP/TCM.
O peso do tecido adiposo retroperitonial foi maior em todos os animais que
receberam as dietas HL+, mas somente o grupo HL+GA apresentou maior peso do
tecido adiposo epididimal. O uso dos óleos de peixe e óleo de TCM na dieta dos
animais não resultou em valores significativamente maiores do tecido adiposo
epididimal nos animais dos grupos HL+TCM, HL+OP, HL+OP/TCM.
No estudo de Assis et al (2009) a GA termolizada não resultou em diferença
significativa no acúmulo de tecido adiposo epididimal em relação aos animais
alimentados com a GA sem processamento térmico. O efeito positivo observado no
presente estudo devido ao menor peso do tecido adiposo epididimal dos grupos
alimentados com os óleos de TCM e/ou peixe pode ser resultante de seus efeitos
metabólicos.
Os TCMs são rapidamente absorvidos e são associados à supressão do
acúmulo de tecido adiposo (TAKEUCHI et al, 2008). O estudo de Han et al (2003)
observou que o menor conteúdo de gordura abdominal nos animais que consumiram
o óleo de TCM na dieta HL+ está associado a inibição da expressão de genes
adipogênicos no tecido adiposo. A oxidação dos TCMs resulta em menor liberação
de energia (8,3Kcal/g) que os TCLs (LAVAU; HASHIM, 1978) e pode influenciar o
acúmulo de gordura corporal. Takeuchi et al (2008) relata que a redução do tecido
adiposo pode estar associada à influência dos TCMs no aumento do gasto
energético.
90
No entanto, os estudos são controversos em associar o uso dos TCMs à
redução de gordura corporal e perda de peso (BEERMANN et al, 2003; ROYNETTE
et al, 2008). A ingestão excessiva dos TCMs pode resultar em aumento da
lipogênese de novo hepática e contrabalancear os efeitos no aumento do gasto
energético e redução da gordura corporal (SHINOHARA et al, 2005).
A suplementação do n-3 é associada à redução da hiperplasia e hipertrofia do
tecido adiposo (QUEIROZ et al, 2009). O estudo de Jelinek et al (2013) descreve a
redução do tecido adiposo epididimal em animais alimentados com óleo de peixe na
dieta HL+. Os mecanismos descritos são por modulação no metabolismo devido ao
estímulo à -oxidação por indução do PPAR- em resposta aos AGPI n-3 e controle
na diferenciação e proliferação das células adiposas (HENSLER et al, 2011).
No entanto, os resultados ainda são controversos, conforme demonstrado no
estudo de Taltavull et al (2014) em que foi verificado aumento da gordura abdominal
em animais alimentados com óleo de peixe na dieta HL+. Os resultados obtidos
utilizando-se o óleo de peixe podem variar conforme o modelo experimental e a dieta
resultando em aumento ou redução do tecido adiposo (SARASWATHI et al, 2007).
No presente estudo, os animais alimentados com dietas contendo óleo de peixe
apresentaram menor ganho de peso em decorrência de menor ingestão alimentar e,
portanto, o menor ganho de gordura corporal também pode ser resultante das
alterações na ingestão energética.
Estudos que descrevem a influência da associação dos óleos de peixe e TCM
no tecido adiposo são raros na literatura. O estudo de Dulloo et al (1995) realizado
com uma mistura de lipídios de diferentes fontes (entre outros, banha, óleo de coco
e óleo de peixe) descreve aumento da gordura corporal quando o óleo de peixe foi
utilizado isolado ou na mistura de lipídios, mas a dieta rica em TCMs resultou em
redução da gordura corporal. No presente estudo, o efeito positivo foi mantido, pois
não se verificou diferença significativa no peso do tecido adiposo quando os óleos
de TCM e peixe foram utilizados isolados ou em associação.
A dieta HL+ utilizada neste estudo contendo 50% de lipídios foi eficiente em
induzir esteatose hepática, pois os grupos HL+ apresentaram percentual de gordura
hepática acima de 20 à 40%. O acúmulo de gordura hepática que excede 5% a 10%
do peso tecidual, na ausência de consumo excessivo de álcool ou outra doença
91
hepática, é definido como NAFL (VARELA-REY et al, 2009; VANNI et al, 2010)
Segundo Hijona et al (2010), a quantificação bioquímica de gordura hepática
apresenta forte relação com a classificação histológica da esteatose hepática
proposta por Kleiner e Brunt (2005).
No presente estudo, a indução da esteatose é resultante da excessiva
ingestão de gordura termolizada pela dieta HL+. O aumento da gordura hepática em
animais alimentados com a dieta HL+ é esperado, conforme já descrito por Picchi et
al (2011) e Leonardi et al (2010). O estudo de Luci et al (2007) descreve a
associação da ingestão de gordura submetida ao processamento térmico e estímulo
da síntese de TG e colesterol no fígado via SREBP 1c no desenvolvimento da
esteatose hepática.
Entre os grupos que consumiram dietas HL+ com diferentes composições em
AGs, verificou-se diferenças no acúmulo de gordura e frações lipídicas hepáticas. Os
grupos HL+GA e HL+OP/TCM foram caracterizados pelo acúmulo de gordura total,
TG e CT hepáticos. O grupo HL+TCM apresentou acúmulo de gordura hepática na
forma de TG. A gordura total hepática no grupo HL+OP não foi significativamente
maior, mas este grupo apresentou maior valor de CT hepático.
No grupo HL+OP, o maior peso hepático não foi associado ao maior acúmulo
de gordura e apenas este grupo não apresentou valor significativamente menor de
proteína hepática. Outros estudos descrevem a hepatomegalia em animais
alimentados com óleo de peixe, que pode estar associada à indução da proliferação
e aumento do volume dos peroxissomos e também à indução da hiperplasia das
células hepáticas (OTTO et al, 1991; BUETTNER et al, 2006).
A adição de óleo de peixe na dieta dos animais resultou em efeito benéfico
devido aos menores valores de gordura total e TG hepáticos. Estudos descrevem
efeitos benéficos do óleo de peixe na redução da esteatose e TG hepáticos
(SARASWATHI et al, 2007; BARGUT et al, 2014). O EPA e DHA presentes no óleo
de peixe são associados à redução da esteatose hepática, pois promovem uma
modulação no metabolismo de lipídios. Os AGPI n-3 estão associados à redução da
síntese hepática de TG por inibição do SREBP-1c e aumento da _oxidação de
lipídios por ativação do PPAR- (POPESCU, 2013; SVEGLIATI-BARONI et al, 2006;
LEVY; CLORE; STEVENS, 2004).
92
Apesar do efeito benéfico devido aos menores valores de TG, o grupo que
recebeu o óleo de peixe apresentou elevado conteúdo hepático de colesterol. Os
peixes marinhos apresentam valores de colesterol de até 142mg/100g, como o
encontrado na sardinha e espera-se que no óleo de peixe este valor seja maior, já
que se trata da fração lipídica do alimento (TACO, 2011; USDA, 2009). Segundo
Saraswathi et al (2007), os AGPIs n-3 promovem aumento da captação hepática do
HDL colesterol, o que também pode contribuir para o aumento do CT hepático.
O óleo de TCM foi associado a maiores valores de gordura total e TG
hepáticos, mas verificou-se efeito benéfico devido ao menor acúmulo hepático de
CT. O teor de óleo de TCM utilizado na dieta do presente estudo (25%) foi maior que
o utilizado em estudo anterior (15%) (ALMEIDA, 2011) e verificou-se prevenção do
acúmulo excessivo de TG, mas não resultou em valor significativamente menor de
gordura hepática. Segundo o estudo de Ronis et al (2013), os benefícios dos TCMs
na redução da esteatose hepática são proporcionais à sua concentração na dieta. O
estudo de Lieber et al (2008) descreve que o uso dos TCMs é benéfico na redução
da esteatose quando utilizados como única fonte de gordura na dieta ou com a
restrição da ingestão de dieta.
O efeito benéfico dos TCMs na redução na esteatose hepática é resultante da
prevenção da inibição da -oxidação de AGs (LIEBER et al, 2007; LIEBER et al,
2008). Os TCMs são hidrolisados à AGSCMs e rapidamente absorvidos pelo trato
intestinal (AOYAMA; NOSAKA; KASAI, 2007). O transporte dos AGSCMs, ligados à
albumina, ocorre diretamente para o fígado pela veia porta (GEELEN et al, 1995;
AOYAMA; NOSAKA; KASAI, 2007). No fígado, os AGSCMs vão sofrer a _oxidação,
que não depende do transporte mitocondrial pela carnitina palmitoil transferase-1 e,
portanto, são oxidados preferencialmente (SHINOHARA et al, 2005).
No entanto, quando os TCMs são ofertados em excesso, a _oxidação
mitocondrial ocorre extensivamente levando à elevada produção de Acetil CoA. Uma
parte da Acetil CoA produzida em excesso é substrato para a produção de AGs
através da síntese de novo (BACH; BABAYAN, 1982; GEELEN et al, 1995). Os
TCMs também podem favorecer o acúmulo hepático de lipídios devido à menor
inibição de enzimas lipogênicas, resultando em aumento da síntese e esterificação
de AGs (CHANEZ et al, 1991; FOUFELLE et al, 1992). Além dos fatores já citados,
93
a deficiência de AGs n-3 das dietas contendo os TCMs também pode favorecer o
acúmulo hepático de lipídios (TANAKA et al, 2010).
Os estudos, em geral, não avaliam alterações no colesterol hepático
associado ao uso dos TCMs nas dietas HL+ (RONIS et al, 2013; LIEBER et al, 2008;
SHINOHARA et al, 2005). O estudo de Geelen et al (1995) descreve a redução do
CT hepático associado ao uso dos TCMs na dieta HL+ contendo 1% de óleo de
milho e 15% de óleo de TCM. Em estudo anterior, realizado com menor quantidade
de TCM (15%) na dieta HL+ rica em colesterol verificou-se acúmulo de colesterol
hepático (ALMEIDA, 2011). A utilização dos TCMs em maior percentual na dieta
(25%) no presente estudo, provavelmente resultou em efeito benéfico devido ao
menor acúmulo do colesterol hepático.
O uso do óleo de TCM e óleo de peixe associados resultou em um efeito
negativo, pois verificou-se maior acúmulo de gordura hepática tanto na forma de
colesterol quanto de TG. Há escassez de dados que descrevem o tratamento da
esteatose com o óleo de peixe e TCM em associação na dieta. O estudo de
Carpentier et al (2008) descreve a redução da esteatose hepática após a injeção de
uma mistura de lipídios (TCM e óleo de peixe na proporção 4:1, respectivamente)
em animais com deficiência de n- 3.
No presente estudo, a proporção dos óleos de peixe e TCM utilizados em
associação na dieta HL+ (15% de óleo de TCM e 10% de óleo de peixe) não resultou
em efeitos benéficos, pois prevaleceram os efeitos negativos observados com o uso
dos óleos de forma isolada.
As alterações séricas não refletiram as alterações hepáticas encontradas. Os
grupos HL+GA, HL+OP e HL+OP/TCM não apresentaram alterações significativas
nos valores séricos de glicemia, CT, TG, HDL colesterol e razão TG/HDL. Somente o
grupo HL+TCM apresentou maiores valores séricos de CT, HDL colesterol e menor
razão TG/HDL colesterol.
A dieta HL+ contendo somente GA termolizada não resultou em alterações
significativas nos parâmetros séricos de glicemia e frações lipídicas. O estudo de
Assis et al (2009), que utilizou GA termolizada, também não observou alteração
significativa na glicemia e lipídios séricos (CT e HDL), no entanto, outros parâmetros
como teste de tolerância à glicose e à insulina, e os níveis séricos de ácidos graxos
94
livres apresentaram-se alterados. No presente estudo, não foram realizadas as
análises para constatar estas alterações.
Os grupos alimentados com óleo de peixe não apresentaram alterações
séricas significativas de colesterol. Segundo Saraswathi et al (2007), a redução do
colesterol sérico e hepático resultante do uso do óleo de peixe na dieta está
associada ao acúmulo no tecido adiposo. No presente estudo, os valores séricos de
CT não apresentaram valores significativamente maiores, mas verificou-se acúmulo
hepático de colesterol nos grupos HL+OP e HL+OP/TCM. O conteúdo de colesterol
não foi dosado no tecido adiposo dos animais.
No grupo HL+TCM, verificou-se efeito benéfico devido ao maior valor de HDL
colesterol e menor razão TG/HDL com a adição de óleo de TCM, somente, na dieta
HL+. Segundo o estudo de Fan et al (2011) a razão TG/HDL colesterol pode ser
utilizada como preditor da RI, em que baixos níveis de HDL colesterol e TG elevados
são fatores de risco para a RI.
Os TCMs apresentam efeitos favoráveis na redução dos TG séricos e,
segundo Hayes (2000), o aumento do CT provavelmente está associado à
hiperlipidemias. No entanto, o estudo de Tholstrup et al (2004), verificou o efeito
hiperlipemiante dos TCMs resultando em aumento sérico dos TG, CT e LDL
colesterol em homens normolipidêmicos. Os resultados encontrados nos estudos
são controversos devido às diferentes fontes lipídicas que compõem as dietas HL+
para avaliar os efeitos do uso dos TCMs (THOLSTRUP et al, 2004). No presente
estudo, o valor significativamente maior do HDL colesterol provavelmente contribuiu
para maiores valores de CT sérico nos animais que consumiram o óleo de TCM.
Embora os valores séricos de TG nos grupos que receberam a dieta contendo TCM
não se modificaram, observou-se acúmulo de TG no fígado.
Os maiores valores séricos de aminotransferases, como marcadores de lesão
hepática, foram verificados nos animais que receberam as dietas HL+ que continham
o óleo de TCM e/ou óleo de peixe (grupos HL+TCM, HL+OP e HL+OP/TCM). A
indução da lesão hepática foi descrita por Carmiel-Haggai, Cederbaum e Nieto
(2004) em ratos obesos alimentados com a dieta HL+ que desenvolveram
esteatohepatite e fibrose associada ao aumento da ALT, TGF, TNF- e marcadores
de estresse oxidativo. Estudos mostram que os AGEs, presentes na dieta HL+
95
termolizada, estão associados à inflamação e fibrose, contribuindo para a
progressão da NAFLD (SANTOS et al, 2013; PATEL et al (2012).
A menor razão AST/ALT poderia indicar menor progressão da doença
hepática no grupo HL+OP, mas este mesmo grupo apresentou maior valor de ALT.
Indivíduos com esteatose hepática podem apresentar aumento discreto ou
moderado das enzimas hepáticas AST e/ou ALT e a razão AST/ALT tende a
aumentar com o desenvolvimento de fibrose (ANGULO, 2002).
Por outro lado, não há marcadores bioquímicos específicos para a NASH e
indivíduos podem apresentar a doença hepática avançada sem alteração das
aminotransferases (GRATTAGLIANO et al, 2007). Os dados histológicos são de
suma importância para confirmação dos resultados encontrados já que o método
padrão ouro para a avaliação da progressão da doença é a biópsia hepática (CAVE
et al, 2007).
O uso da dieta HL+ termolizada resultou em maior peroxidação lipídica sérica
e hepática no grupo HL+GA. O estudo de Assis et al (2009) verificou aumento de
AGLs associado ao aumento da peroxidação lipídica no fígado dos animais que
receberam GA termolizada.
Nos grupos HL+OP e HL+OP/TCM os valores séricos não seguiram a mesma
tendência que os valores hepáticos. Verificou-se maiores valores de MDA hepático,
enquanto os valores séricos não apresentaram diferença significativa nestes grupos.
Somente o uso do óleo de TCM na dieta do grupo HL+TCM resultou em menor
peroxidação lipídica hepática, sendo que os valores séricos também não
apresentaram alteração significativa.
Os óleos utilizados neste estudo apresentam diferentes composições em AGs
que contribuem de modos distintos para a peroxidação lipídica. O aumento da
peroxidação lipídica hepática, evidenciada pelos níveis de MDA foi observado pelo
estudo de Garrel et al (2012), em animais que receberam dietas suplementadas com
EPA e DHA, sem alterações significativas nas enzimas antioxidantes. O óleo de
peixe é composto por AGPIs (EPA e DHA) e apresenta elevado IP (Tabela 1 e 2). O
estudo de Sugihara et al (1994), verificou a suscetibilidade dos AGPIs à peroxidação
lipídica em cultura de hepátocitos de ratos e revelou que a taxa de produção de
96
MDA é proporcional ao grau de insaturação: DHA> EPA> AA>-linolênico>
linoléico> oléico.
O uso dos TCMs resultou em efeito protetor no fígado de ratos com a
redução da peroxidação lipídica e aumento de antioxidantes, como a GSH, quando
utilizado na dieta do estudo de Sengupta e Ghosh (2011). A composição em AGs do
óleo de TCM apresenta grau mínimo de insaturações, pois é composto
principalmente por AGSCMs (ácidos cáprico e caprílico) (Tabelas 1 e 2).
Os relatos da literatura sobre o estresse oxidativo e sistema antioxidante em
estudos que utilizam o óleo de peixe e TCM em associação na dieta são escassos.
O estudo de Goulet et al (2010) demonstrou que em pacientes que receberam dieta
parenteral, contendo emulsão lipídica à base de óleo de oliva, óleo de peixe e TCM
não apresentaram alterações significativas nos valores séricos de substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico (SRATBs), marcadores da peroxidação lipídica.
No entanto, no presente estudo, quando o óleo de peixe e o óleo de TCM
foram utilizados em associação verificou-se efeito predominante do óleo de peixe em
promover maior peroxidação lipídica hepática.
A GSH sérica não apresentou alteração significativa. No entanto, foi
observado maior GSH hepática nos grupos HL+GA, HL+TCM e HL+OP/TCM. Nos
grupos HL+GA e HL+OP verificou-se menores valores de vitamina E sérica. Quando
o óleo de TCM e o óleo de peixe foram administrados em associação a vitamina E
sérica somente apresentou diferença significativa no calculo da razão vitE/colesterol,
que revelou valores significativamente menores nos grupos HL+OP/TCM, HL+GA e
HL+OP.
Nos grupos HL+GA e HL+OP/TCM, os maiores valores hepáticos de GSH
possivelmente refletem aumento da síntese do antioxidante no fígado em resposta à
maior peroxidação lipídica. O estudo de Andreoli et al (2010), descreve que o
aumento da GSH hepática não foi suficiente para neutralizar a progressão da
peroxidação lipídica induzida pela esteatose hepática. Neste mesmo estudo
verificou-se que o estresse oxidativo resultou em redução de outros antioxidantes.
A utilização preferencial da vitamina E como antioxidante foi verificada nos
grupos HL+GA, HL+OP e HL+OP/TCM. Apesar de rico em vitamina E, a adição do
óleo de peixe na dieta resultou em menores valores séricos da vitamina
97
provavelmente devido ao elevado IP do óleo e à sua suscetibilidade à peroxidação
lipídica. As dietas ricas em AGPIs promovem redução da biodisponibilidade do -
tocoferol que é utilizado como antioxidante em decorrência da peroxidação lipídica
no trato gastrointestinal (VILLAVERDE et al, 2008). No presente estudo, as dietas
HL+ com óleo de peixe foram associadas à depleção de antioxidantes.
No grupo HL+TCM o valor elevado de GSH é provavelmente devido à
preservação do antioxidante em decorrência da menor peroxidação lipídica hepática.
Neste mesmo grupo, a vitamina E sérica provavelmente também foi preservada
como antioxidante. Além disso, valores maiores de vitamina E sérica podem estar
associados ao uso dos TCMs na dieta dos animais do grupo HL+TCM. O estudo de
Gallo-Torres, Ludorf e Brin (1978) demonstrou que a absorção intestinal de vitamina
E é maior quando solubilizada em TCMs. A preservação da vitamina E sérica
provavelmente contribuiu para a preservação da GSH. A GSH é utilizada na
regeneração da vitamina E por meio da redução do radical tocoferol (VALKO et al,
2007) e desta forma pode influenciar a sua concentração.
A dieta HL+ pode ter contribuído para os valores significativamente maiores de
retinol sérico encontrado nos animais dos grupos HL+GA e HL+TCM. O aumento da
absorção e transporte do retinol no enterócito associada à dieta HL+ foi observada
por Suruga et al (2005) e Goda; Yasutake; Takase (1994). A vitamina E é utilizada
preferencialmente como proteção da ação oxidativa às cadeias lipídicas e desta
forma a absorção da vitamina A é favorecida (MOURÃO et al, 2005). O retinol
esterificado é estocado no fígado e conforme a necessidade são hidrolisados e
transportados para a circulação por meio da proteína ligadora do retinol (EROGLU;
HARRISON, 2013).
Por outro lado, a redução dos valores séricos e hepáticos de retinol está
associada à progressão da NAFLD, pois resulta da ativação das células estreladas
hepáticas e progressão à fibrose (CHAVES et al, 2014). No presente estudo, os
grupos alimentados com óleo de peixe (HL+OP e HL+OP/TCM) não apresentaram
maiores valores de retinol sérico e neste sentido, poderia indicar maior progressão
da doença hepática. No entanto, a análise histológica seria necessária para
confirmar esta hipótese.
98
Conclusões
99
7. Conclusões
A dieta HL+ termolizada com 50% de lipídios administrada por um período de
60 dias foi eficiente na indução da esteatose hepática nos animais.
O uso das fontes lipídicas óleo de peixe e óleo de TCM nas proporções
utilizadas nas dietas influenciou de diferentes modos o acúmulo hepático de lipídios
e o estresse oxidativo. A adição de 25% de óleo de peixe na dieta dos animais
resultou em efeito benéfico devido aos menores valores de gordura total e TG
hepáticos, mas verificou-se acúmulo de colesterol, maior peroxidação lipídica
hepática e depleção de Vitamina E sérica. Apesar do acúmulo significativo de
gordura hepática, o óleo de TCM (25%) foi associado à prevenção do acúmulo
excessivo de TG, menor acúmulo de colesterol, à menor peroxidação lipídica
hepática e maiores valores de antioxidantes.
No entanto, quando o óleo de TCM e óleo de peixe foram utilizados em
associação na proporção de 15% e 10%, respectivamente, verificou-se efeito
negativo devido ao acúmulo de gordura hepática tanto na forma de TG quanto de
colesterol, maior peroxidação lipídica hepática e, consequentemente, maior valor de
GSH e menor de vitamina E.
As alterações séricas em relação às frações lipídicas, peroxidação lipídica e
antioxidantes não refletiram as alterações hepáticas encontradas. Portanto, as
dosagens apenas no soro podem não refletir as alterações metabólicas que ocorrem
no fígado. Os resultados encontrados no presente estudo servem de alerta para os
riscos da suplementação de fontes lipídicas associadas (óleo de peixe + óleo de
TCM), uma vez que os estudos realizados em humanos ainda são escassos.
As perspectivas de estudos futuros são avaliar as alterações metabólicas da
dieta HL+ contendo o óleo de peixe e óleo de TCM em associação com diferentes
proporções para verificar se a alteração dos percentuais na dieta poderia ter
influência no acúmulo de lipídios e estresse oxidativo hepáticos.
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Referências
Bibliográficas
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114
Apêndice
115
Apêndice
Apêndice A - Evolução do peso semanal dos animais (g).
Apêndice A. Evolução do peso semanal dos animais (g).
Controle HL+GA HL+TCM HL+OP HL+OP/TCM
Início 69±6,83 67,5±5,32 63,5±8,18 65,8±4,59 68,1±6,49
Semana 1 125,7±20,00 126,7±10,77 124,8±12,34 129,1±6,19 126,8±20,57
Semana 2 192,6±19,13 166,7±24,32 165,8±10,29 169,8±23,86 166,6±32,58
Semana 3 251,1±15,77 201,2±39,35a 211±15,33a 211,7±27,17a 202,1±40,80a
Semana 4 312,6±21,77 240,1±34,96a 252,1±30,54a 245,2±43,95a 250,5±55,10a
Semana 5 363,5±40,50 281,11±42,61a 282,56±53,87a 282,33±38,44a 285±70,32a
Semana 6 386,88±62,44 314,89±41,24 304,11±32,27a 301,22±41,25a 303,56±83,45a
Semana 7 416,29±62,32 346,33±42,12a 291,44±31,36a 266,11±34,20a,b 301,86±62,06a
Semana 8 439±83,01 379,22±48,10 325,33±37,71a 304,89±37,49a 342,43±75,37a
Semana 9 402,57±74,47 378,56±43,46 340±37,16 314,22±47,42a 336,71±86,66
Resultados expressos em média ± DP. ap<0,05 vs Controle. bp<0,01 vs HL+GA. Análise estatística. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal. HL+OP e HL+TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.
116
Apêndice B - Ingestão alimentar semanal dos animais (g).
Apêndice B: Ingestão alimentar semanal dos animais (g).
Controle HL+GA HL+TCM HL+OP HL+OP/TCM
Início 14,77±4,78 18,2± 3,05 14,73±1,45 16,17±3,92 16,03±2,76
Semana 1 24,35±6,91 17,3 ± 3,29a 19,25±1,82a 18,93±0,91a 17,95±3,79a
Semana 2 25,55±3,22 15,83±2,62b 15,40±1,89b 15,1±3,03b 14,73±4,32b
Semana 3 25,85±3,67 15,10±3,19b 16,48±2,57b 14,78±2,74b 15,55±4,34b
Semana 4 31,78±5,53 15,25±4,70b 15,63±2,36b 14,3±2,91b 15,85±4,97b
Semana 5 35,35±9,84 15,63±3,51b 16,35±3,58
b 15,08±3,91
b 17,05±4,98
b
Semana 6 41,5±6,85 15,22±2,53b 11,58±2,29b 12,50±3,46b 13,03±6,40b
Semana 7 38,31±6,85 14,67±3,21b 10,81±5,75b 6,22±4,27b,c 9,03±6,72b
Semana 8 29,53±17,10 15,42±3,75a 16,71±7,40 14,1± 6,66a 13,22±8,81a
Semana 9 24,42±13,97 16,12±2,11 17,91±4,52 16,34±7,03 13,76±7,05
Resultados expressos em média ± DP. Os valores expressos para cada grupo por semana representam a média de três dias de consumo. ap<0,05 vs Controle. bp<0,001 vs Controle. cp<0,05 vs HL+GA. Inicio: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.
117
Apêndice C - Ingestão de energia semanal dos animais (g).
Apêndice C: Ingestão de energia semanal dos animais (g).
Controle HL+GA HL+TCM HL+OP HL+OP/TCM
Semana 1 85,23±24,18 108,13±20,57 120,31±11,39a 118,28±5,66a 112,19±23,71b
Semana 2 89,42±11,28 98,91±16,36 96,25±11,84 94,38±18,95 92,03±27,00
Semana 3 90,48±12,84 94,38±19,93 102,97±16,06 92,34±17,14 97,19±27,14
Semana 4 111,21±19,37 95,31±29,37 97,66±14,77 89,38±18,22 99,06±31,06
Semana 5 123,73±34,43 97,66±21,94 102,19±22,37 94,22±24,41 106,56±31,10
Semana 6 116,20±64,79 85,63±33,57 65,16±26,59 70,31±32,04 73,28±45,65
Semana 7 107,28±60,37 82,50±34,63 60,78±40,05 35,00±28,02a 45,16±44,05b
Semana 8 93,01±65,20 86,72±37,65 73,13±63,03 88,13±41,65 57,81±60,09
Semana 9 76,91±53,44 90,68±34,21 100,73±44,30 102,14±43,94 60,21±54,96
Resultados expressos em média ± DP. Os valores expressos para cada grupo por semana representam a média de três dias de consumo. ap<0,01 vs Controle. bp<0,05 vs Controle. Inicio: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: Dieta hiperlipídica com 50% de gordura animal. HL+OP e HL+TCM : Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal e 25% de óleo de peixe ou óleo de TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: Dieta hiperlipídica com 25% de gordura animal, 10% de óleo de peixe e 15% de óleo de TCM.
118
Anexo
119
Anexo
Anexo I - Certificado Comissão de Ética em Experimentação Animal.
120
Artigo Científico
121
Artigo científico
EFEITOS METABÓLICOS DA COMBINAÇÃO DE TRIGLICERÍDEOS DE
CADEIA MÉDIA E ÓLEO DE PEIXE NA ESTEATOSE HEPÁTICA E
ESTRESSE OXIDATIVO INDUZIDOS PELA DIETA HIPERLIPÍDICA
TERMOLIZADA EM RATOS
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO, UNIVERSIDADE DE SÃO
PAULO, RIBEIRÃO PRETO, BRASIL.
BIANCA B. DE ALMEIDA*; LAURA P. BARRETO; PAULA P. OVÍDIO*; LIVIA
M. C. S. AMBROSIO*; ALCEU A. JORDÃO**
*Mestre; **Doutor
Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo
Autor para correspondência:
Alceu A. Jordão
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Av.
Bandeirantes, 3900, 14049-900 Ribeirão Preto, SP, Brasil. Telefone: 55 16 3602 45 64;
Fax: 55 16 3633 15 86.
Número de palavras: 6.700
Número de figuras: 2
Número de tabelas: 5
Submissão de material suplementar online: não
Running title: Effects of combined use of medium chain triglycerides and fish oil on
hepatic steatosis and oxidative stress
122
Resumo
Introdução: Os efeitos metabólicos do uso combinado dos triglicerídeos de cadeia
média (TCMs) e do óleo de peixe (OP) na esteatose hepática ainda não estão totalmente
esclarecidos. Objetivo: O presente estudo teve o objetivo de verificar os efeitos da
combinação dos TCMs e OP na esteatose hepática e estresse oxidativo induzidos pela
dieta hiperlipídica (HL+) termolizada em ratos. Material e Métodos: Foram utilizados
no total 50 ratos machos da linhagem Wistar. O grupo Controle (n=10) recebeu a dieta
controle. Os grupos HL+ receberam a dieta contendo 50% de gordura animal (GA)
termolizada e 50% de ração. A adaptação às dietas HL+ foi realizada durante 5 dias. Os
grupos HL+GA, HL
+TCM, HL
+OP e HL
+TCM/OP (n=10) receberam a dieta HL
+ com
50% de lipídios durante 30 dias. Após este período, os grupos HL+TCM, HL
+OP e
HL+OP/TCM receberam as dietas HL
+ adicionadas de óleo de TCM (OTCM), OP e
OTCM + OP, respectivamente, durante 20 dias. As análises realizadas foram a gordura
hepática total, frações lipídicas hepáticas e séricas, glicemia, vitamina E e retinol
séricos, glutationa reduzida (GSH) e malondialdeído (MDA) séricos e hepáticos, e
aminotransferases séricas. Resultados: Os grupos HL+ apresentaram acúmulo
significativo de gordura total e triglicerídeos hepáticos, exceto o HL+OP. Apenas o
grupo HL+TCM não apresentou acúmulo significativo de CT hepático (CT). Este
mesmo grupo apresentou valores maiores de CT e HDLcol séricos e menor razão
triglicerídeos/HDLcol. Os valores séricos de aminotransferases foram significativamente
maiores nos grupos que receberam os OTCM e/ou OP. A peroxidação lipídica (LPO)
hepática foi maior foi nos grupos HL+, exceto o HL
+TCM. Apenas o grupo HL
+GA
apresentou maior LPO sérica. Verificou-se que a GSH foi maior nos grupos HL+GA,
HL+TCM e HL
+OP/TCM, vitamina E sérica foi menor nos grupos HL
+GA, HL
+OP e
HL+OP/TCM e o retinol sérico foi maior nos grupos HL
+GA e HL
+TCM. Conclusões:
As alterações séricas não corresponderam às alterações hepáticas em relação aos
lipídios, estresse oxidativo e antioxidantes. O uso do óleo de TCM e óleo de peixe
associados na dieta HL+ resultou em efeito negativo devido ao maior acúmulo de
gordura hepática tanto na forma de triglicerídeos quanto de colesterol, maior
peroxidação lipídica hepática e menor valor de vitamina E sérica.
Palavras-chave: dieta hiperlipídica termolizada, esteatose hepática não
alcoólica, estresse oxidativo, óleo de peixe, óleo de TCM, ratos.
Introdução
A Doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) se tornou uma das causas
mais comuns de doença hepática e a prevalência da doença vem crescendo
proporcionalmente ao aumento da ingestão de gordura saturada, obesidade e síndrome
metabólica (SM) (1).
A prevalência da NAFLD na população em geral varia de 6,3 a 33% com média
estimada em 20% e da Esteatohepatite não alcoólica (NASH) é estimada em 3 a 5%. A
prevalência de cirrose em indivíduos com NASH na população em geral não é
conhecida (2).
123
Os efeitos da dieta, regulação das vias metabólicas por hormônios e fatores de
transcrição desempenham um importante papel na doença, sendo que a resistência à
insulina (RI) é considerada um fator chave no desenvolvimento da NAFLD e da NASH
(3).
O mecanismo de patogênese da NAFLD foi proposto em 1998 por Day e James
e consiste na teoria dos dois hits (4). O primeiro hit ou gatilho é dado pelo acúmulo
hepático de lipídios que predispõe à ocorrência do segundo hit (2). O segundo hit é
caracterizado pelo estresse oxidativo, peroxidação lipídica, disfunção mitocondrial e
produção de citocinas pró-inflamatórias e é responsável pela progressão à NASH, pois
contribui para a inflamação, fibrose e morte celular (5).
Atualmente, tem sido reconhecido a hepatotoxicidade dos ácidos graxos livres
(AGL) que atuam na progressão da esteatose à NASH, pois estão diretamente
associados ao aumento do estresse oxidativo, ativação das vias inflamatórias e dano ao
hepatócito (6).
A dieta rica em ácidos graxos saturados (AGSs) é associada ao aumento de
lipídios no fígado, elevação da insulina no plasma, indução da RI, alteração na função
mitocondrial e estímulo inflamatório por ativação de receptores nucleares e, portanto,
são associados à progressão á NASH (5).
O processamento térmico das gorduras resulta na produção de compostos como
os produtos da peroxidação lipídica, produtos finais de glicação e de lipoxidação
avançada (AGEs/ALEs, do inglês advanced glycation/lipoxidation end products) que
apresentam propriedades pró-oxidantes e pró-inflamatórias e atuam como fonte de
estresse oxidativo exógeno (7,8).
As dietas hiperlipídicas submetidas ao aquecimento que apresentam elevado
conteúdo de AGEs estão associados ao desenvolvimento da RI e DMT2 com sintomas
de maior proporção que as dietas hiperlipídicas sem aquecimento (9).
O tratamento da NAFLD não é descrito em um guia. As modificações do estilo
de vida baseada em hábitos alimentares saudáveis e atividade física são consideradas as
medidas mais eficazes de tratamento de pacientes com NAFLD (2).
Há evidências de que a suplementação do ômega-3 promove melhora no perfil
lipídico sérico, melhora da sensibilidade à insulina, redução da esteatose, inflamação e
dano hepático em modelos animais e humanos com NAFLD (10,11).
No entanto, estudos demonstraram que a suplementação com os AGPI-n3 está
associada ao aumento da peroxidação lipídica e redução de antioxidantes (12,13,14,15).
124
Os TCMs seriam utilizados no tratamento da NAFLD em substituição aos ácidos
graxos de cadeia longa (AGCL) na tentativa de prevenir o bloqueio da -oxidação de
AGs (16,17), pois não requerem a carnitina palmitoil transferase para o transporte
intramitocondrial (18).
No entanto, os estudos que utilizam os TCMs na dieta hiperlipídica apresentam
resultados controversos. O uso do TCM na dieta hiperlipídica resultou no favorecimento
à esteatose hepática e aumento da defesa antioxidante (19,20,21). A redução da
esteatose hepática somente foi observada com o uso dos TCMs como única fonte de
lipídios na dieta (17).
Neste sentido, a combinação dos óleos de TCM e peixe na dieta parece uma
alternativa promissora para contra balancear os efeitos negativos e positivos da
administração isolada dos TCMs e dos AGPI-n3.
A NAFLD é uma doença de alta prevalência cujo tratamento ainda não está
estabelecido. O presente estudo visa verificar os efeitos metabólicos da combinação
entre os triglicerídeos de cadeia média e óleo de peixe na busca de uma possível
alternativa para o tratamento da esteatose hepática.
Materiais e Métodos
O estudo teve aprovação da Comissão de Ética em Experimentação Animal da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. A dieta
hiperlipídica utilizada para a indução da esteatose nos animais foi composta por 50% de
lipídios provenientes da gordura animal termolizada (aquecimento durante 30 minutos à
180°C, adaptado de Assis et al (2009) (9) e 50% da ração padrão moída. As dietas dos
grupos HL+OP e HL
+TCM continham 25% de gordura animal termolizada e 25% dos
respectivos óleos (óleo de peixe e óleo de TCM) e do grupo HL+OP/TCM continha 25%
de gordura animal termolizada, 15% de óleo de TCM e 10% de óleo de peixe. A
composição centesimal das dietas é apresentada no quadro 1.
No total, foram utilizados 50 ratos machos da linhagem Wistar com peso médio
de 60 gramas distribuídos aleatoriamente em 5 grupos. Os animais receberam água e
dieta à vontade durante 60 dias. O grupo Controle (n=10) recebeu a dieta controle
durante todo experimento. A adaptação dos animais às dietas hiperlipídicas foi realizada
durante 5 dias com o aumento gradual do conteúdo de lipídios. Os grupos HL+GA
(n=10), HL+TCM (n=10), HL
+OP (n=10) e HL
+TCM/OP (n=10) receberam as dietas
hiperlipídicas com 50% de lipídios contendo somente a gordura animal durante 30 dias.
125
Após este período, os grupos HL+TCM, HL+OP e HL
+OP/TCM receberam as dietas
hiperlipídicas com adição de óleo de TCM, óleo de peixe ou óleo de TCM + peixe
durante 20 dias. Ao fim do experimento os animais foram eutanasiados e foram
coletados o sangue, fígado e tecido adiposo epididimal e retroperitonial.
A determinação dos AGs dos óleos e gordura das dietas utilizadas foi adaptada
de Andreoli et al (2007) através da extração com hexano (22). A determinação da
gordura hepática total foi realizada de acordo com o método proposto por Bligh e Dyer,
1959 (23). As frações lipídicas de Colesterol Total (CT) e triglicerídeos (TG) foram
dosadas no fígado após a extração da gordura total por kits comerciais como utilizado
na análise em soro (Labtest Diagnóstica S.A., Brasil). A determinação da proteína sérica
e hepática, glicemia, HDL colesterol e aminotransferases séricas também foram
realizadas por kits comerciais (Labtest Diagnóstica S.A., Brasil).
A medida da peroxidação lipídica sérica e hepática foi realizada de acordo com o
método proposto por Gerard-Monnier et al, 1998 (24), com algumas adaptações. A
dosagem de glutationa reduzida (GSH) foi realizada no tecido hepático de acordo com o
método descrito por Sedlak e Lindsay, 1968 (25). A glutationa reduzida sérica foi
dosada conforme método descrito por Costa; Dos Santos; Lima, 2006 (26). As análises
hepáticas de vitamina E (-tocoferol) e de retinol foram realizadas por HPLC, segundo
método adaptado de Arnaud et al, 1991 (27).
A taxa de eficiência da dieta (TED) foi calculada de acordo com Kang; Ahn;
Lee, 2005 (28), sendo obtido pela razão entre a média de ganho de peso e de consumo
de dieta diários. O índice de peroxibilidade (IP) da dieta foi calculado conforme
descreve Pamplona et al, 1998 (29) com base no grau de insaturação dos AGs. A razão
triglicerídeos/HDLcolesterol foi calculada como preditor da RI, conforme proposto por
Fan et al, 2011 (30). A razão vitamina E/colesterol foi calculada conforme descrito por
Ford et al, 2006 (31).
As variáveis são apresentadas como média ± desvio padrão. A comparação entre
os grupos experimentais foi realizada pela análise de variância one-way (ANOVA) com
pós-teste de Tukey, considerando p <0,05 como nível de significância.
Resultados
A composição percentual de AGs dos óleos e gordura utilizados na dieta é
apresentada no quadro 2. O óleo de peixe apresentou um elevado IP. O teor de Vitamina
126
E no óleo de peixe é elevado (107,63±1,35nmol/mL), seguido do óleo de TCM
(63,17±2,22 nmol/mL), e da gordura animal (27,07±1,72 nmol/mL).
O crescimento dos animais alimentados com as dietas hiperlipídicas foi menor a
partir da terceira semana do experimento, sendo que o grupo HL+OP apresentou menor
peso final e menor ganho de peso total. A redução da ingestão alimentar dos animais
alimentados com as dietas HL+ foi observada desde a primeira semana. A redução da
ingestão energética foi observada somente nos grupos HL+OP e HL
+OP/TCM na sétima
semana. A TED foi maior nos grupos HL+. Os dados são apresentados nas Figuras 1 e 2.
O maior peso hepático em relação ao peso corporal foi verificado somente nos
grupos HL+GA e HL
+OP. A gordura total e triglicerídeos hepáticos foi maior nos
grupos HL+, com exceção do grupo HL
+OP. Os grupos HL
+GA, HL
+OP e HL
+OP/TCM
apresentaram maior acúmulo de CT hepático. Verificou-se menores valores de proteína
total hepática nos grupos HL+GA, HL
+TCM e HL
+OP/TCM em relação ao Controle. Os
dados são apresentados na Tabela 1.
Os valores séricos de glicose, triglicerídeos e proteína não apresentaram
diferença significativa. O grupo HL+TCM apresentou maior valor de CT sérico, HDL
colesterol e menor razão triglicerídeos/HDL colesterol. A AST sérica foi maior nos
grupos HL+TCM e HL
+OP/TCM. No grupo HL
+OP verificou-se o maior valor de ALT
e menor razão AST/ALT (Tabela 2).
O grupo HL+GA apresentou maior MDA sérico em relação aos grupos HL
+TCM
e HL+OP/TCM. Os grupos que receberam as dietas hiperlipídicas apresentaram maior
peroxidação lipídica hepática em relação ao Controle, com exceção do grupo HL+TCM.
Apesar das concentrações de GSH sérico não apresentarem alterações significativas,
verificou-se maiores valores de GSH hepático nos grupos HL+GA, HL
+TCM e
HL+OP/TCM. A vitamina E sérica foi significativamente menor nos grupos HL
+GA,
HL+OP em relação ao Controle e HL
+TCM. O grupo HL
+OP/TCM somente apresentou
diferença significativa de vitamina E em relação ao grupo HL+TCM. O cálculo da
vitamina E ajustado pelo colesterol também foi significativamente menor nestes grupos,
em relação ao Controle. A concentração do retinol sérico foi significativamente maior
nos grupos HL+GA e HL
+TCM. Os dados são apresentados na Tabela 3.
Discussão
A redução da ingestão alimentar também foi observada por outros estudos em
animais que consomem dietas hiperlipídicas (32,33). As dietas HL+ apresentam elevada
127
densidade calórica e por esse motivo a redução da ingestão de dieta resultou na
manutenção da ingestão energética durante o experimento e não se verificou diferença
significativa no ganho de peso total e peso final dos animais dos grupos HL+, exceto o
grupo HL+OP. Conforme também observado por Buettner et al, 2006 (34), a redução da
ingestão alimentar no grupo HL+OP foi associada à introdução do óleo de peixe na dieta
na sétima semana do experimento, resultando em menor peso no grupo HL+OP (VS C e
HL+GA).
O aumento da gordura hepática em animais alimentados com a dieta
hiperlipídica é descrito por Picchi et al, 2011 e Leonardi et al, 2010 (35, 32). O estudo
de Luci et al, 2007 descreve a associação da ingestão de gordura submetida ao
processamento térmico e estímulo da síntese de TG e colesterol no fígado via SREBP
1c no desenvolvimento da esteatose hepática (7). No presente estudo, a dieta
hiperlipídica contendo 50% de lipídios foi eficiente em induzir a esteatose hepática, pois
os grupos HL+ apresentaram percentual de gordura hepática acima de 20 a 40%. O
acúmulo de gordura hepática que excede 5 a 10% do peso tecidual, na ausência de
consumo excessivo de álcool ou outra doença hepática, é definida como esteatose
hepática não alcoólica (36, 37). Segundo Hijona et al, 2010, a quantificação bioquímica
de gordura hepática apresenta boa relação com a classificação histológica de esteatose
hepática proposta por Kleiner e Brunt, 2005 (38,39).
A adição dos óleos de TCM e/ou peixe na dieta HL+ promoveu diferentes
alterações no acúmulo hepático de lipídios. O maior peso hepático no grupo HL+OP não
foi associado ao acúmulo significativo de gordura hepática e apenas este grupo não
apresentou menores valores de proteína hepática. Outros estudos descrevem a
hepatomegalia em animais alimentados com óleo de peixe, que pode estar associada à
indução da proliferação e aumento do volume dos peroxissomos e também à indução da
hiperplasia das células hepáticas (40,34). A adição de óleo de peixe na dieta dos animais
resultou em efeito benéfico, pois resultou em menor gordura total e triglicerídeos,
apesar do acúmulo de CT hepático. Estudos descrevem efeitos benéficos do óleo de
peixe na redução da esteatose e triglicerídeos hepáticos (41,11). O EPA e DHA
presentes no óleo de peixe são associados à redução da esteatose hepática, pois
promovem uma modulação no metabolismo de lipídios. Os AGPI n-3 estão associados à
redução da síntese hepática de triglicerídeos por inibição da SREPB-1c e aumento da
_oxidação de lipídios por ativação do PPAR-(42,43,44). O elevado conteúdo
hepático de colesterol pode ser consequência da elevada concentração no óleo de peixe.
128
O conteúdo de colesterol no óleo de peixe não está descrito na literatura, no entanto,
espera-se que o valor do colesterol no óleo seja maior que o encontrado na matéria-
prima, que varia de 68,2mg, 87mg e 142mg em 100g de peixes como atum, salmão e
sardinha, respectivamente, devido à extração da fração lipídica (45,46).
O acúmulo da gordura hepática associada ao excessivo aumento de triglicerídeos
e acúmulo do colesterol hepáticos com o uso dos TCMs foi observado em um estudo
anterior (21). No presente estudo, o maior percentual do óleo de TCM utilizado na dieta
resultou na prevenção do acúmulo excessivo de triglicerídeos e menor acúmulo de CT,
no entanto, ainda verificou-se o significativo acúmulo de gordura hepática. Segundo o
estudo de Ronis et al, 2013, os benefícios dos TCMs na redução da esteatose hepática
são proporcionais à sua concentração na dieta (47). O estudo de Lieber et al, 2008
descreve que o uso dos TCMs são benéficos na redução da esteatose quando utilizados
como única fonte de gordura na dieta ou quando a ingestão de dieta é restringida (17).
No entanto, quando os TCMs são ofertados em excesso, a _oxidação mitocondrial
ocorre extensivamente levando à elevada produção de Acetil CoA. Uma parte da Acetil
CoA produzida em excesso é substrato para a produção de AGs através da síntese de
novo (48,19). Os TCMs também podem favorecer o acúmulo hepático de lipídios
devido à menor inibição de enzimas lipogênicas, resultando em aumento da síntese e
esterificação de AGs (49,50). Além dos fatores já citados, a deficiência de AGs n-3 das
dietas contendo os TCMs também pode favorecer o acúmulo hepático de lipídios (51).
A redução do CT hepático também é descrita pelo estudo de Geelen et al, 1995, que
utiliza a dieta hiperlipídica com maior proporção de TCMs, sendo 1% de óleo de milho
e 15% de óleo de TCM (19).
Há escassez de dados que descrevem o tratamento da esteatose com o óleo de
peixe e TCM associados na dieta. O estudo de Carpentier et al, 2008 descreve a redução
da esteatose hepática após a injeção de uma mistura de lipídios (TCM e óleo de peixe na
proporção 4:1, respectivamente) em animais com deficiência de n- 3 (52). No presente
estudo, a proporção dos óleos de peixe e TCM utilizados em associação na dieta HL+
(15% de óleo de TCM e 10% de óleo de peixe) não resultou em efeitos benéficos, pois
prevaleceram os efeitos negativos observados com o uso dos óleos de forma isolada.
As alterações séricas não refletiram as alterações hepáticas encontradas. Os
valores séricos de lipídios não apresentaram alteração significativa, mas verificou-se
acúmulo hepático. Somente verificou-se efeito benéfico devido ao maior valor de HDL
colesterol e menor razão triglicerídeos/HDL com adição de óleo de TCM, somente, na
129
dieta hiperlipídica. Segundo o estudo de Fan et al, 2011 a razão triglicerídeos/HDL
colesterol pode ser utilizada como um preditor da RI, em que baixos níveis de HDL
colesterol e triglicerídeos elevados são fatores de risco para a RI (30).
Indivíduos com esteatose hepática podem apresentar um aumento discreto ou
moderado das enzimas hepáticas AST e/ou ALT e a razão AST/ALT tende a aumentar
com o desenvolvimento de fibrose (53). Estudos mostram que os AGEs, presentes na
dieta HL+ termolizada, estão associados à inflamação e fibrose, contribuindo para a
progressão da NAFLD (54,55). No presente estudo, os valores significativamente
maiores de aminotransferases, como marcadores de dano hepático, foram verificados
nos animais que receberam as dietas hiperlipídicas que continham os óleos. A menor
razão AST/ALT, poderia indicar uma menor progressão da doença hepática no grupo
HL+OP, mas o uso isolado do óleo de peixe resultou em maior ALT.
No entanto, no presente estudo, faltam dados histológicos para confirmação
destes resultados já que o método padrão ouro para a avaliação da progressão da doença
é a histologia hepática (56).
Assim como a gordura hepática, verificou-se diferentes alterações no estresse
oxidativo com o uso dos óleos de TCM e de peixe na dieta HL+. A peroxidação lipídica
sérica não refletiu a maior peroxidação lipídica hepática. Verificou-se maior MDA
hepático nos grupos HL+OP e HL
+OP/TCM enquanto os valores séricos não foram
significativamente maiores. O aumento da peroxidação lipídica hepática, evidenciada
pelos níveis de MDA foi observado pelo estudo de Garrel et al, 2012, em animais que
receberam dietas suplementadas com EPA e DHA, sem alterações significativas nas
enzimas antioxidantes (57). O uso do óleo de TCM na dieta do grupo HL+TCM resultou
em uma proteção à peroxidação lipídica hepática. O uso dos triglicerídeos de cadeia
média resultou em um efeito protetor no fígado de ratos com a redução da peroxidação
lipídica e aumento de enzimas antioxidantes, como a GSH, quando utilizado na dieta do
estudo de Sengupta e Ghosh, 2011 (58).
Os óleos utilizados neste estudo apresentam diferentes composições em AGs que
contribuem de modos distintos para a peroxidação lipídica. O óleo de peixe é composto
por ácidos graxos poli-insaturados (EPA e DHA) e apresenta elevado IP. O estudo de
Sugihara et al, 1994, verificou a suceptibilidade dos AGPIs à peroxidação lipídica em
cultura de hepátocitos de ratos e revelou que a taxa de produção de MDA é proporcional
ao grau de insaturação: DHA> EPA> AA>-linolênico> linoléico> oléico (59). A
130
composição em AGs do óleo de TCM apresentou grau mínimo de insaturações, pois é
composto principalmente por ácidos graxos saturados de cadeia média com 8 e 10
carbonos (ácidos cáprico e caprílico). Os percentuais de AGs essenciais n-6 e n-3 no
óleo de TCM são mínimos (60) e estima-se um mínimo IP, pois apresenta valores
mínimos de AGs com insaturações.
Os relatos da literatura sobre o estresse oxidativo e sistema antioxidante em
estudos que utilizam o óleo de peixe e TCM associados na dieta são escassos. No
entanto, no presente estudo, quando o óleo de peixe e o óleo de TCM foram utilizados
em associação verificou-se o efeito predominante do óleo de peixe em promover maior
peroxidação lipídica hepática.
O uso dos TCMs na dieta do grupo HL+TCM foi associado à proteção à
peroxidação lipídica, e consequente preservação do sistema antioxidante. A GSH
hepática e a vitamina E sérica apresentaram valores significativamente maiores e
provavelmente foram preservados como antioxidantes. Além disso, valores maiores de
Vitamina E sérica podem estar associados ao uso dos TCMs na dieta dos animais do
grupo HL+TCM. O estudo de Gallo-Torres, Ludorf e Brin, 1978, demonstrou que a
absorção intestinal de vitamina E é maior quando solubilizada em TCMs (61). A GSH é
utilizada na regeneração da vitamina E por meio da redução do radical tocoferol (62) e,
portanto, a preservação da vitamina E pode ter contribuído para a preservação da GSH.
Apesar de rico em vitamina E, a adição do óleo de peixe na dieta resultou em
menores valores séricos da vitamina provavelmente devido ao elevado IP do óleo e à
sua influência na peroxidação lipídica. Dietas ricas em AGPI promovem uma redução
da biodisponibilidade do -tocoferol que é utilizado como antioxidante em decorrência
da peroxidação lipídica no trato gastrointestinal (63).
A dieta hiperlipídica pode ter contribuído para valores significativamente
maiores do retinol sérico nos grupos HL+GA e HL
+TCM. O aumento da absorção e
transporte do retinol no enterócito associada à dieta hiperlipídica foi observada por
Suruga et al, 2005 e Goda; Yasutake; Takase, 1994 (64,65). A vitamina E é utilizada
preferencialmente como proteção da ação oxidativa às cadeias lipídicas e desta forma a
absorção da vitamina A é favorecida (66). Por outro lado, a redução dos níveis séricos e
hepáticos de retinol está associada à progressão da NAFLD, pois resulta da ativação das
células estreladas hepáticas e progressão à fibrose (67). No presente estudo, os grupos
alimentados com óleo de peixe (HL+OP e HL
+OP/TCM) não apresentaram maiores
valores de retinol sérico e neste sentido, poderia indicar uma maior progressão da
131
doença hepática. No entanto, a análise histológica seria necessária para confirmar esta
hipótese.
Como conclusão, o uso de diversas fontes lipídicas na dieta influenciou de
diferentes modos o acúmulo hepático de lipídios e o estresse oxidativo. A adição de
óleo de peixe na dieta dos animais resultou em efeito benéfico devido ao menor
acúmulo de gordura total e triglicerídeos hepáticos, mas verificou-se maior acúmulo de
CT e maior peroxidação lipídica hepática. Apesar do acúmulo significativo de gordura
hepática, o óleo de TCM foi associado à prevenção do acúmulo excessivo de
triglicerídeos, ao menor acúmulo de colesterol e à menor peroxidação lipídica hepática.
O uso do óleo de TCM e óleo de peixe em associação resultou em efeito negativo
devido ao acúmulo de gordura hepática tanto na forma de triglicerídeos quanto de
colesterol e à maior peroxidação lipídica hepática. As alterações séricas em relação às
frações lipídicas, peroxidação lipídica e antioxidantes não refletiram as alterações
hepáticas encontradas e, portanto, as dosagens apenas no soro podem não representar as
alterações metabólicas que ocorrem no fígado. Os resultados encontrados no presente
estudo servem de alerta para os riscos da suplementação destas fontes lipídicas
associadas (óleo de peixe + óleo de TCM), já que os estudos realizados em humanos
ainda são escassos.
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137
Quadro 1. Composição em nutrientes das dietas experimentais (%)
Nutriente (%) Controle HL+GA HL
+TCM HL
+OP HL
+OP/TCM
Proteína (%) 22 11 11 11 11
Carboidrato (%) 57 28,5 28,5 28,5 28,5
Lipídeo (%) 4 52 52 52 52
Valor calórico (Kcal)* 350 625 625 625 625
Energia lipídios (%)* 10,3 74,9 74,9 74,9 74,9
FREITAS, 2011 (68). *O Fator de Atwater de 9Kcal/g foi utilizado para o cálculo de energia dos óleos e gordura animal utilizados na dieta (ZOU et al, 2007) (69).
138
Quadro 2. Composição percentual em ácidos graxos dos óleos de peixe,
TCM e gordura animal (%) e índice de peroxibilidade (IP).
Ácido Graxo Estrutura
Óleos Gordura*
Animal Peixe TCM
Ácidos graxos saturados
Ácido caprílico C8:0 <0,05 52,02 <0,05
Ácido cáprico C10:0 <0,05 35 <0,05
Ácido mirístico C14:0 7,31 12,78 1,4
Ácido palmítico C16:0 22,28 <0,05 24,53
Ácido esteárico C18:0 4,81 <0,05 10,07
Ácido tricosanóico C23:0 0,75 <0,05 <0,05
∑AGS
35,15 99,8 36
Ácidos graxos monoinsaturados
Ácido palmitoléico C16:1 7,54 <0,05 2,39
Ácido oléico C18:1n9c 10,36 <0,05 43,23
Ácido erúcico C22:1n9 1,42 <0,05 <0,05
∑AGMI
19,32 - 45,61
Ácidos graxos poli-insaturados
Ácidos graxos n-6
Ácido linoléico C18:2n6c 11,31 <0,05 16,54
Ácido Di-homo-linolênico C20:3n6
<0,05 0,53
Ácido araquidônico C20:4n6 0,46 <0,05 <0,05
∑n-6
11,77 - 17,07
Ácidos graxos n-3
Ácido α-linolênico C18:3n3 1,91 <0,05 <0,05
Ácido eicosatrienóico C20:3n3 0,22 <0,05 <0,05
Ácido eicosapentaenóico C20:5n3 15,05 <0,05 <0,05
Ácido docosahexaenóico C22:6n-3 12,6 <0,05 <0,05
∑n-3
29,78 - <0,05
∑AGPI
41,55 - 17,07
Razão n-6/n-3
0,4 - -
Razão ∑AGS/∑AGPI
0,85 - 2,03
Outros ácidos graxos 4,2 0,2 1,32
IP
208,99 - 18,74**
*Perfil de AGs da gordura animal sem tratamento térmico. **Índice de
peroxibilidade da gordura animal sem tratamento térmico. IP = (%
monoenóicos x 0,025) + (% dienóicos x 1) + (% trienóicos x 2) + (%
tetraenóicos x 4) + (pentaenóicos x 6) + (hexaenóico x 8). Devido à presença
de quantidades mínimas de AGs com insaturações não foi possível realizar o
cálculo do índice de peroxibilidade do óleo de TCM. ∑: somatória; AGS:
AGs saturados; AGMI: AGs monoinsaturados; AGPI: AGs poli-insaturados;
n-3: AGs ômega-3; n-6: AGs ômega-6.
Figura 1. A: Evolução semanal do peso dos animais (g): ap<0,05 vs Controle. bp<0,01 vs HL+GA. B: Ingestão alimentar
semanal dos animais (g): ap<0,05 vs Controle. bp<0,001 vs Controle. cp<0,05 vs HL+GA. C:Ingestão energética semanal dos
animais (Kcal):ap<0,001 vs HL
+OP.
bp<0,01 vs HL
+TCM.
cp<0,05 vs HL
+OP/TCM.
Controle: Dieta Controle. HL+GA:
50% GA. HL+OP e HL+TCM: 25% GA e 25% OP ou TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: 25% GA, 10% OP e 15% TCM.
Figura 2. Taxa de eficiência da dieta (TED) em propiciar o ganho de peso. Barras largas verticais representam a média, barras finas representam os desvios-padrões. ap<0,001 vs Controle. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta
HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL
+GA 50% - 30 dias. Semana 6:
Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos -
20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: 50% GA. HL
+OP e HL
+TCM: 25% GA e
25% OP ou TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: 25% GA, 10% OP e 15% TCM.
141
Tabela 1. Peso hepático, razão peso hepático/corporal, caracterização de gordura hepática pelos valores de gordura total e valor percentual de gordura hepática, valores de colesterol total e triglicerídeos hepáticos.
Controle HL+GA HL
+TCM HL
+OP HL
+OP/TCM
Peso hepático (g) 9,41±1,99 14,05±3,22a,b
10,25±1,93 11,05±2,54 10,25±2,26
Razão peso hepático/corporal (%) 2,33±0,11 3,76±0,50c 3,08±0,59 3,53±0,46
c 3,29±0,94
Gordura total hepática (g gordura/g tecido) 0,05±0,01 0,21±0,06c,d
0,16±0,04c 0,11±0,04 1,17±0,06
c
Percentual de gordura hepática (%) 9,90±1,71 40,85±14,19c,d
31,38±8,46c 21,63±6,54 32,70±14,08
c
Colesterol total hepático (g/g tecido) 2,72±0,17 5,36±1,96a 3,49±0,66 5,38±2,47
a 5,28±1,52
a
Triglicerídeos hepático (g/g tecido) 3,36±1,65 74,42±29,93c,b
64,85±39,67c 36,91±15,93 68,52±29,13
c
Proteína total hepática (g/mL) 0,023±0,005 0,019±0,002a 0,018±0,003
a 0,021±0,004 0,017±0,002
a
Resultados expressos em média ± DP. ap<0,05 vs Controle.
bp<0,05 vs HL
+TCM e HL
+OP/TCM.
cp<0,001 vs Controle.
dp<0,001 vs HL
+OP. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL
+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta
Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento
óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: 50% GA. HL
+OP e HL
+TCM: 25% GA e 25% OP ou TCM, respectivamente.
HL+OP/TCM: 25% GA, 10% OP e 15% TCM.
142
Tabela 2. Valores séricos de glicose, triglicerídeos, colesterol total, lipoproteína de alta densidade, razão
triglicerídeos/HDLcolesterol, concentrações médias séricas de aspartato aminotransferase e alanina
aminotransferase apresentadas pelos grupos e razão AST/ALT e concentrações médias séricas de proteína.
Controle HL+GA HL
+TCM HL
+OP HL
+OP/TCM
Glicose (mg/dL) 75,78±8,25 89,31±17,97 70,66±17,30 87,62±21,67 81,37±7,48
Triglicerídeos (mg/dL) 61,03±11,00 80,26±19,31 69,94±8,87 82,85±21,09 92,6±54,89
Colesterol total (mg/dL) 67,35±18,81 81,26±11,20 114,80±22,50a 82,07±17,88 67,43±26,13
HDL colesterol (mg/dL) 45,44±8,77 51,46±9,06 64,90±11,62b 57,62±12,43 44,65±8,68
Razão triglicerídeos/HDLcolesterol 1,56±0,36 1,56±0,29 1,06±0,19c 1,53±0,51 2,10±1,05
Proteína total sérica (g/mL) 0,079±0,011 0,074±0,010 0,075±0,004 0,075±0,008 0,077±0,009
AST (U/L) 77,8±18,88 66,00±8,72 85,48±12,76d 83,18±9,49 88,06±14,22
d
ALT (U/L) 30,57±18,17 24,50±6,09 30,21±5,69 43,53±9,16e 34,57±4,07
AST/ALT 2,42±1,18 2,84±0,99 2,91±0,71 1,90±0,65f 2,40±0,59
Resultados expressos em média ± DP. ap<0,001 vs Controle, HL
+GA, HL
+OP e HL
+OP/TCM.
bp<0,001 vs
Controle e HL+OP/TCM.
cp<0,01 vs HL
+OP/TCM.
dp<0,05 vs HL
+GA.
ep<0,05 HL
+GA e HL
+TCM.
fp<0,05
HL+TCM. Início: Dieta Controle - 3 dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL
+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta
Hiperlipídica HL+GA 50% - 30 dias. Semana 6: Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7:
Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle. HL+GA: 50% GA. HL
+OP e HL
+TCM: 25% GA e
25% OP ou TCM, respectivamente. HL+OP/TCM: 25% GA, 10% OP e 15% TCM.
143
Tabela 3. Componentes do sistema antioxidante, valores de glutationa reduzida e malondialdeído (MDA) séricos e hepáticos, vitamina E e retinol séricos e razão vitamina E/colesterol.
Controle HL+GA HL
+TCM HL
+OP HL
+OP/TCM
GSH sérico (mol/g proteína) 4,03±1,44 5,7±1,69 5,38±1,54 5,23±1,54 3,69±1,39
GSH hepático (µmol/g proteína) 395,32±90,42 553,59±81,42a 532,51±79,21
a 448,91±94,52 524,82±73,08
a
Vitamina E sérico (µmol/L) 5,24±2,04 1,77±0,70a,b
8,39±3,73 0,67±0,20a,b
2,09±1,84b
Razão vitamina E/colesterol (mol/mg) 0,79±0,16 0,17±0,13c 0,77±0,36 0,08±0,02
c 0,24±0,15
c
Retinol sérico (µmol/L) 0,36±0,08 0,96±0,41a 0,86±0,31
a 0,79±0,32 0,80±0,42
MDA sérico (nmol/g proteína) 85,80±24,16 104,23±29,19d 65,29±6,28 86,70±23,01 59,36±14,95
MDA hepático (mol/g proteína) 11,46±1,83 50,92±20,12e 16,66±9,07
f 64,05±20,11
e 54,23±8,75
e
Resultados expressos em média ± DP. ap<0,05 vs Controle.
bp<0,001 vs HL
+TCM.
cp<0,001 vs Controle e HL
+TCM.
dp<0,05
vs HL+TCM e HL
+OP/TCM.
ep<0,001 vs Controle.
fp<0,001 vs HL
+GA, HL
+OP e HL
+OP/TCM. Início: Dieta Controle - 3
dias. Semana 1: Adaptação à dieta HL+ - 5 dias. Semana 2: Inicio Dieta Hiperlipídica HL
+GA 50% - 30 dias. Semana 6:
Adaptação à dieta com diferentes óleos - 5 dias. Semana 7: Início Tratamento óleos - 20 dias. Controle: Dieta Controle.
HL+GA: 50% GA. HL
+OP e HL
+TCM: 25% GA e 25% OP ou TCM, respectivamente. HL
+OP/TCM: 25% GA, 10% OP e
15% TCM. MDA: Malondialdeído.