Projeto: Diretrizes de Políticas Públicas para a Agroindústria Canavieira de São Paulo.

Workshop Produção de etanol: Qualidade da matéria-

prima.

Efeito de fatores inibidores na fermentação alcoólica.

Prof. Dr. Pedro de Oliva NetoFaculdade de Ciências e Letras de Assis – UNESP

poliva@assis.unesp.br

INTRODUÇÃO

Para dimensionar os fatores bióticos e abióticos que inibem a fermentação alcoólica industrial é necessário reconhecê-los e avaliá-los de forma sinérgica.

Dentre os fatores destacam-se :

1. qualidade do substrato a ser fermentado2. pH e temperatura de processo3. teor alcoólico4. aditivos químicos (ácidos, biocidas, antibióticos, íons Ca, P )5. contaminações microbianas com produção de ácidos e outros6. floculação celular7. qualidade da centrifugação do fermento8. tipo de processo fermentativo.9. dimensionamento da planta10. limpeza e assepcia

Nesta apresentação será dada atenção a alguns destes fatores relacionados à qualidade da matéria-prima, parâmetros de processo e efeito de contaminações microbianas , sempre sobre o prisma do efeito sinérgicocom outros fatores.

Quando me refiro à matéria-prima para a fermentação alcoólica, me refiro, em especial, ao melaço e caldo de cana , pois atualmente, estes dois componentes compõe o mosto, sendo o primeiro mais problemático do que o segundo para a fermentação alcoólica.

Alguns parâmetros que podem ser inibidores da fermentação alcoólica são apresentados a seguir,os quais se pretende avaliá-los de forma detalhada:

Efeito de Ácidos orgânicos

O ácido lático (forma não dissociada ) pode entrar na célula diretamente por difusão simples, na presença de glicose no meio. Os ácidos acético e fórmico são mais solúveis nos lipídeos da membrana da levedura que o lático (que contém uma OH- extra, inibindo o crescimento da levedura numa concentração inferior ao ac. Lático.- interfere na energia de manutenção celular - reposição celular e crescimento, - gasto ATP com as permeases de membrana para

manutenção do pH I, - interferência na absorção de nutrientes ex.

Fósforo através da interferência no mecanismo de transporte Symport (glicose, H+ e fósforo).

- consumo de glicose endógena (trealose ou glicogênio) ou externa. Quando o pH externo está abaixo de 4 triplica a

atividade da ATPase, dobrando sua afinidade pelo ATP, sem contudo alterar seu pH ótimo (ERASO & GANCEDO , 1987).

Efeito do pH do meio no metabolismo da levedura

Gradiente gera a força extrusão consumo

de pH ⃗⃗⃗⃗ proton motiva ⃗⃗⃗⃗ de prótons ⃗⃗⃗⃗ glicose via ⃗⃗⃗⃗

ATPases

excesso aumento H+ maior velocidade no limite

acidez ⃗⃗⃗⃗ entrando célula ⃗⃗⃗⃗ das permeases ⃗⃗⃗⃗ ocorre acidificação

e consumo gli interna e ↓↓↓↓ pHi

inibição das enzimas inibição da viabilidade, morte ⃗⃗⃗⃗

e da prod. ATP ⃗⃗⃗⃗ e queda rendimento etanol

Efeito do sulfito• Sulfito em solução aquosa existe em 3 formas dependendo do valor

do pH. • SO2 ↔ HSO3

- ↔ SO3–2 pK entre SO2 ↔ HSO3

- = 1,77 e entre • HSO3

- ↔ SO3-2, pK = 6,9 .

• O dióxido de enxofre molecular é tóxico para bactérias láticas e em menor grau para leveduras. O HSO3- (bissulfito) inibe a zinco desidrogenase alcoólica , portanto a fermentação.

• O Sulfito é mais letal para bactérias no pH mais ácido (pH 4,0), predomínio da forma HSO3

- . • Na fermentação industrial o efeito do sulfito é claro na acidez total

do vinho (o normal é 1,8-2,5 g/L e aumenta para níveis de até 3-5 g/L)e como conseqüência temos:

• queda da viabilidade e número de células vivas.• queda do brotamento celular e queda na eficiência alcoólica via

reprodução de mais fermento para reposição das perdas.• aumento da atividade tamponante do meio, maior consumo de ácidos

e bases no processo.• em casos mais graves, aumento exagerado na acidez do álcool

produzido.

Efeito da TemperaturaA temperatura é outro fator importante que pode levar a inibição

da levedura e do processo. S. cerevisiae tolera até 33ºC em condições industriais para produção de etanol, apesar desta sp ter uma faixa de crescimento mínima de 10ºC e máxima de 40ºC, estando a temperatura ótima entre 28ºC e 35ºC (JONES et al, 1981).

O sinergismo entre ácidos orgânicos e temperatura ocorre levando a um efeito inibidor potencializado. A faixa de crescimento de S.cerevisiae é encurtada de 3-42OC para 19-26oC. na presença de 1% v/v de ácido acético (Tereza-Ramos e Madeira-Lopes , 1990).

A temperatura estimula o acúmulo de trealose . Segundo HOTTIGER (1987), um choque térmico, com mudança de 27ºC para 40ºC por uma hora resulta em um rápido e grande acúmulo de trealose . Tal choque induz a um aumento de seis vezes na atividade da trealose-P-sintetase.

0

10

20

30

40

50

60

70

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90

100

0 10 20 30 40

te m po em horas

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38ºC 40ºC 45ºC 50ºC 55ºC 65ºC

Viabilidade das células de levedura de panificação durante a autólise em

diferentes temperaturas

Efeito inibitório do Etanol

- alterações da composição da camada lipídica da membrana, - síntese de proteínas estressoras, na modulação dos processos de troca iônica, - redução de atividades metabólicas como causa da inibição do transporte de glicose, diminuindo a viabilidade, formação de produto e causando estresse hídrico(Hallsworth, 1998, Martini et al., 2004).- A toxidade do etanol em concentrações elevadas (acima de 10% p:v), limita o seu rendimento e produtividade durante a fermentação industrial (Walker-Capriolo et al., 1985) e diminui a tolerância à temperaturas mais altas .

Fatores de estresse fisiológico que levam ao aumento da energia de manutenção celular, queda viabilidade,

produção de etanol e reservas energéticas causando instabilidade do processo fermentativo.

Sinergismo entre ácidos fracos, pH, etanol, pressão osmótica do meio, temperatura afetando de forma

potencializada a Força Próton Motiva.

Quando por ex. o pH externo cai de 6 para 3 aumenta a sensibilidade da levedura ao etanol , dissipando a força protomotiva da membrana. Esse feito é aumentado na presença de ácidos orgânicos fr acos, principalmente quando o pHi da célula está abaixo do pKa dos ácidos, aumentando a forma indissociada do ácido e aumentando a toxidez pelo et anol, de modo sinergístico, c omo ocorre com o ácido acético. O etanol em concentrações de 6 e 8% (v/v) ativa (acelera) a ATPase da membrana pl asmática de Saccharomyces cerevisiae, industrialmente trabalha-se com 9-9,5% de etanol, portanto no limite do metabolismo da levedura. Efeito do pH baixoocasiona a perda de nutrientes como nitrogênio e potássio, bem como aumenta a sensibilidade ao etanol, aos ácidos orgânicos e a o SO2.

Elevada Pressão osmótica do meio pode aumentar a toxicidade do ácido lático que em baixa Pressão Osmótica (0,6) inibe o crescimento de S.cerevisiaea partir de 5 g/L , em alta pressão osmótica (1,6) inibe a partir de 2,5 g/L.(Ngang et al. 1989).

Sinergismo entre ácido lático, Sulfito, pH e etanol na fermentação de Saccharomyces cerevisiae Pe-2 e M-26.

Tese de Doutorado da aluna: Claudia DortaOrientação: Prof. Dr. Pedro de Oliva NetoUNESP –Campus de Rio Claro e Assis

Publicação: Dorta, C. Oliva-Neto, P. Synergism amon g lacticacid, sulfite, pH and ethanol in alcoholic fermentatio n of Saccharomyces cerevisiae (PE-2 and M-26). World Journa l of Microbiology and Biotechnoloy , vol. 22, p. 177-182, 2 006.

Objetivo

�Verificação dos efeitos sinérgicos de estresse durante a fermentação etanólica, podendo assim estabelecer parâmetros reais para um aprimoramento na produção de álcool carburante.

Tabela 1: Formulação de meios fermentativos com os fatores de estresse: etanol, ácido lático sulfito e pH.

______________________________________________________________________TºC sulfito (mg/L) ácido lático etanol pH toxicidade

M (meio) (NaHSO 3) (g/L) (% p:v) ______________________________________________________________________

1 32 200 6,0 9,5 3,6 máxima 2 32 50 6,0 9,5 3,6 - sulfito 3 32 200 2,0 9,5 3,6 - ác. lát. 4 32 200 6,0 7,5 3,6 - etanol 5 32 200 6,0 9,5 4,5 pH normal6 32 0 0 7,5 4,5 controle

_____________________________________________________________________

Figura 1: Efeito de diferentes estresses associados na viabilidade celular das linhagens de levedura Saccharomyces cerevisiae P-2 e M26 após a fermentação etanólica.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

M1 M2 M3 M4 M5 M6

Meios fermentativos

Via

bilid

ade

ce

lula

r (%

)

Figura 2: Efeito da fermentação em M5 sobre as células da linhagem Pe-2.

Figura 3: Efeito da fermentação em M1 sobre as células da linhagem PE-2.

Figura 4: Efeito de diferentes estresses associados na taxa de brotamento das linhagens de levedura Saccharomyces cerevisiae Pe2 e M26 após a fermentação etanólica.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

M1 M2 M3 M4 M5 M6

Meios fermentativos

Bro

tam

ent

o (%

)

Figura 5: Efeito de diferentes mostos com estresses associados na atividade da bomba de prótons, após o processo fermentativo por S cerevisiae P-2. M1, M2, M3, M4, M5, M6.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

To 5 o Ciclo 7o Ciclo

Ciclo fermentativo

Libe

raçã

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H+

(um

oles

de

H+/

h/ g

)

Tabela 2. Ácidos orgânicos totais produzidos durante a fermentação alcoólica por S. cerevisiae M-26 e PE-2.

______________________________________________________________________ Média ácidos orgânicos totais(g l-1)

______________________________________________________ M-26 PE-2

________________ _______________M * DP * M * DP *

______________________________________________________________________ M1 14.97 1.76 10.86 3.68M2 15.88 0.67 12.25 2.60M3 12.02 1.37 8.50 1.96M4 13.30 1.00 8.06 2.90M5 14.65 1.00 11.00 2.28M6 10.62 1.15 8.00 2.00______________________________________________________________________*M= média, *DP= desvio padrão. Obs. Somatória dos ácidos lático, acético, succínico, aconítico, tartárico.

Figura 6: Concentração de trealose em linhagens de Saccharomyces cerevisiae PE-2 e M-26 durante diferentes condições de fermentação. ( ) PE-2, To-1o ciclo ; ( ) PE-2, 7o ciclo -12h; ( ) M-26, 1o ciclo-To; ( ) M-26, 7 o ciclo-12h.

0

2

4

6

8

10

12

M1 M2 M3 M4 M5 M6

Meios de fermentação

Tre

alos

e (

g.10

0g-1

mas

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)

Figura 7: Efeito de diferentes estresses associados na formação de proteína residual no mosto fermentado pela linhagem S. cerevisiae M-26 PE-2

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

M1 M2 M3 M4 M5 M6

Meios fermentativos

Con

cent

raçã

o de

pro

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l (m

g/ m

L)

Figura 8: Efeito de diferentes estresses associados na formação de ARRT após a fermentação de S. cerevisiaeP-2 e M26 .

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

M1 M2 M3 M4 M5 M6

Meios fermentativos

AR

RT

(%

)

Figura 9: Efeito de diferentes estresses associados no rendimento etanólico obtido da fermentação de S. cerevisiae P-2 e M26 .

40

45

50

55

60

65

70

75

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M1 M2 M3 M4 M5 M6

Meios fermentativos

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0

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M1 M2 M3 M4 M5 M6

Meios fermentativos

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(g/L

.h)

Figura 10: Efeito de diferentes estresses associados na produtividade etanólica obtido da fermentação de S. cerevisiae Pe-2 e M26 .

Conclusões do trabalho

O pH baixo do meio demonstra ser o fator de maior estresse fisiológico para Saccharomyces cerevisiae obtida e utilizada em destilarias de produção de etanol carburante, quando comparado com outros fatores (sulfito, ácido lático e teor alcoólico elevado). O pH 4,5 no mosto permite uma proteção contra os fatores de estresse estudados, obtendo-se maior viabilidade celular, brotamento, rendimento alcoólico, morfologia regular das leveduras, diminuição no açúcar residual e menor liberação de aminoácidos no meio, propiciando melhor eficiência alcoólica e estabilidade do processo.O desenvolvimento da tecnologia de produção do bioetanol deve contemplar procedimentos que preservem a força próton-motiva da levedura tais como: mostos com pH mais adequados, e eliminação de métodos que envolvam aumento da concentração hidrogeniônica do meio.

Perspectivas para a melhoria da matéria prima usada na fabricação do bioetanol

Clarificação do melaço de cana • 1. considerando-se que o melaço provoca aumento da acidez e

sulfito, no mosto, o que é prejudicial à levedura e ao processo. • 2. Aumento de cálcio no mosto, estimulando a floculação celular• 3. A quantia de ART via mel na composição do mosto ser superior à

do caldo de cana. • 4. Aumento do poder tamponante do mosto o que impacta em maior

gasto com ácido sulfúrico no “pé-de-cuba”.• 5. A eficiência na eliminação de sais, incluindo o sulfito via clarificação

do melaço, a qual pode chegar a 90%Justifica-se a implementação deste procedimento em escala

indutrial, porém é necessário um decantador separado da linha de fabricação de açúcar, maior entrave hoje .

Controle na deterioração da cana

• É mais fácil evitar a entrada de moléculas e microrganismos

indesejáveis no processo industrial, do que retirá-los do sistema. Cana deteriorada no campo é rica em biopolímeros e microrganismos que causam distúrbios no processo industrial, tanto para a linha de açúcar, como para a de etanol. Por isso é necessário um eficiente planejamento entre a área agrícola e a industrial, para evitar a deterioração da cana no campo. Em meses quentes e chuvosos, a deterioração pode chegar a infecções microbianas da ordem de 10 bilhões de células por ml de caldo de cana.

• Com a lei obrigando a mecanização do corte , onde a cana é cortada em tamanhos menores, haverá mais área exposta a deterioração e maior controle neste planejamento deverá ser feito.

• Investimentos em pesquisa e desenvolvimento de métodos de controle biológico de insetos devem ser feitos para melhorar a tecnologia hojedisponível no Brasil.

Assepsia da moenda

A qualidade do mosto a ser fermentado depende muito do

grau de assepcia da moenda. Para a assepcia da moenda em condições de processo, apenas alguns biocidas são utilizados, e com baixa eficiência nas dosagens recomendadas. A limpeza física só é feita nas paradas. Métodos de CIP (clean in place) deveriam ser estudados, em especial nos locais considerados pontos críticos, onde biofilmes são formados. Pesquisas de novos produtos antimicrobianos são necessários, de preferência produtos naturais com comprovada inocuidade ao ser humano e meio ambiente.