efeitos da oxigenoterapia hiperbÁrica em lesÕes … · segmento de veia cava e aorta pinçados...
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RUBENS PALMA FILHO
EFEITOS DA OXIGENOTERAPIA HIPERBÁRICA EM LESÕES
ACTÍNICAS DA VEIA CAVA E AORTA INFRA-RENAL. ESTUDO
EXPERIMENTAL EM RATOS
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
SÃO PAULO 2007
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RUBENS PALMA FILHO
EFEITOS DA OXIGENOTERAPIA HIPERBÁRICA EM LESÕES
ACTÍNICAS DA VEIA CAVA E AORTA INFRA-RENAL. ESTUDO
EXPERIMENTAL EM RATOS
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Paulo de Oliveira Gomes CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Maria Ligia Lyra Pereira
SÃO PAULO 2007
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Palma Filho, Rubens Efeitos da oxigenoterapia hiperbárica em lesões actínicas da veia cava e
aorta infra-renal. Estudo experimental em ratos/Rubens Palma Filho – São Paulo, 2007
xviii, 63f Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação. Hyperbaric oxygen on radiation injuries in the vena cava and aorta of rats. 1. Oxigenação hiperbárica. 2 Radioterapia. 3. Veia Cava. 4. Aorta.
5.Apoptose.
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, UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA UNIFESP-EPM
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIRURGIA E EXPERIMENTAÇÃO COORDENADOR: Prof. Dr. José Luiz Martins
TESE DE DOUTORADO
AUTOR: Rubens Palma Filho ORIENTADOR: Prof. Dr. Paulo de Oliveira Gomes CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Maria Ligia Lyra Pereira TÍTULO: Efeitos da oxigenoterapia hiperbárica em lesões actínicas da veia cava e aorta infra-renal. Estudo experimental em ratos. BANCA EXAMINADORA: 1- Presidente: Prof. Dr. Paulo de Oliveira Gomes Professor Adjunto do Departamento de Cirurgia da Universidade Federal de São Paulo UNIFESP-EPM. MEMBROS EFETIVOS: 2 – Prof. Dr. Newton de Barros Junior
Professor Adjunto da Disciplina de Cirurgia Vascular da Universidade Federal de São Paulo. UNIFESP-EPM. 3 – Prof. Dr. Carlos Henrique de Alvarenga Bernardes
Professor Titular da Disciplina de Cirurgia Vascular da Faculdade de Medicina da Universidade Metropolitana de Santos / UNIMES. 4 – Prof. Dr. Paulo Eduardo Soares Novaes
Professor Assistente da Disciplina de Oncologia da Faculdade de Medicina da Universidade Metropolitana de Santos / UNIMES..
5 – Profa. Dra. Regina de Faria Bittencourt da Costa
Professora Doutora em Medicina pela UNIFESP / Chefe do Serviço de Cirurgia Vascular do Hospital Heliópolis. MEMBROS SUPLENTES 1- Profa. Dra. Edna Frasson de Souza Montero
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Professor Adjunto da Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da Universidade Federal de São Paulo-Escola Paulista de Medicina. 2 - Prof. Dr. Ângelo Sementilli Professor Adjunto da Disciplina de Patologia da Faculdade de Ciências Médicas de Santos / UNILUS.
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“O valor do homem está nas poucas coisas que cria e não nas muitas que acumula”.
Gibran Khalil Gibran
1883-1931
DEDICATÓRIA
Aos meus pais Rubens e Marly, pelo exemplo de vida, perseverança, honestidade e
respeito ao próximo. Agradeço a vocês por minha formação e por todo amor dedicado.
À minha Mônica; por seu apoio em todas as horas, por seu amor incondicional.
Agradeço seu esforço em conciliar suas atividades de mãe, esposa e médica.
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Ao meu pequeno Gabriel, filho amado; você é minha inspiração e esperança em dias
melhores para o nosso mundo.
As minhas irmãs; Rogéria, Eugênia e Ana. Agradeço a vocês pelo amor, carinho e
paciência dedicados em todos os momentos.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao meu orientador Prof. Dr. Paulo de Oliveira Gomes, Professor Adjunto do
Departamento de Cirurgia e Orientador do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e
Experimentação da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina,
orientador deste trabalho, por todo incentivo e ensinamentos. Muito obrigado por ter me
acolhido como seu aluno e pela confiança em mim depositada
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À minha co-orientadora Profa. Dra. Maria Ligia Lyra Pereira. Não tenho como
expressar minha gratidão pela oportunidade de participar desta linha de pesquisa que foi
criada graças a seu brilhantismo como médica e pesquisadora.
AGRADECIMENTOS
À UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO – ESCOLA PAULISTA DE
MEDICINA – UNIFESP-EPM, por ter me recebido como aluno do Programa de Pós-
Graduação em Cirurgia e Experimentação, possibilitando minha titulação.
Ao Prof. Dr. José Luiz Martins, Professor Adjunto, Livre-Docente da Disciplina de
Cirurgia Pediátrica e Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e
Experimentação da UNIFESP-EPM, agradeço a confiança em meu trabalho, valiosos
ensinamentos e orientação.
Ao Prof. Dr. Djalma José Fagundes, Professor Adjunto da Disciplina de Técnica
Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM, pelas informações e conhecimentos
de grande valia.
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Ao Prof. Dr. João Luiz Moreira Coutinho de Azevedo, Professor Adjunto da
Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM, pelos
ensinamentos dirigidos principalmente à língua portuguesa e à metodologia científica.
Ao Prof. Dr. Murched Omar Taha, Professor Afiliado ao Departamento de Cirurgia
da UNIFESP-EPM, pelos ensinamentos transmitidos.
Ao Prof. Dr. Manuel de Jesus Simões, Professor Livre Docente Chefe da Disciplina
de Histologia e Biologia Estrutural do Departamento de Morfologia da UNIFESP-EPM, por
sua valiosa contribuição na elaboração do estudo histológico desta pesquisa.
Ao Prof. Dr. João Francisco Junior, Professor Adjunto da Disciplina de Técnica
Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM, por seus ensinamentos durante o
curso de pós-graduação.
Ao Prof. Dr. Hélio Plapler, Professor Adjunto da Disciplina de Técnica Operatória e
Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM, por seus ensinamentos em informática e análise de
projetos.
Ao meu amigo cirurgião vascular Dr. Kleber Fabbri das Neves Louro, por sua
amizade e colaboração. Muito obrigado.
À amiga e funcionária da UNIFESP-EPM Elaine Maria Alves Bazzi Dantas, pela
amizade, apoio e paciência nestes anos de muito trabalho. Muito obrigado pela colaboração
nesta pesquisa.
À estatística Sandra Malagutti, pelo talentoso desempenho estatístico na realização
deste trabalho.
Ao Prof. Osimar de Carvalho Sanches, Professor assistente da Universidade do Oeste
Paulista, por sua valiosa contribuição na realização desta pesquisa.
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A Prof. Dra. Celina Tizuko Fugiyama Oshima, Professora do Departamento de
Patologia Estrutural da UNIFESP-EPM, por sua inestimável contribuição no estudo imuno-
histoquímico deste trabalho.
À Valdelice Justiniano Soares, secretária do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia
e Experimentação da UNIFESP, pela sua amizade, apoio e disponibilidade na execução deste
trabalho.
À Benedita Salete Costa Lima Valverde e Rita de Cássia Almeida Bonfim
funcionárias da Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP, pela
colaboração durante a realização do presente trabalho.
Aos colegas do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação da
UNIFESP, pela convivência, amizade e ajuda na formação do espírito crítico.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fluxograma dos diferentes procedimentos realizados nos animais
dos quatro grupos.............................................................................
6
Figura 2 - Foto de um animal do grupo simulado (GS) onde se observa o
segmento de veia cava e aorta infra-renal a ser ressecado..............
8
Figura 3 - Foto de um animal do grupo irradiado (RT) onde se observa o
segmento de veia cava e aorta pinçados para serem
ressecados........................................................................................
9
Figura 4 - Foto onde se observa o grupo de três animais com placa de
chumbo protetora focalizando a área efetiva de exposição à
radiação............................................................................................
10
Figura 5 - Foto de três animais em posição sob o aparelho de ortovoltagem
e prontos para iniciar a exposição à Radiação..............................
11
Figura 6 - Foto dos animais em câmara hiperbárica de acrílico para animais
de pequeno porte, sob três atmosferas absolutas de pressão (3
ATA)................................................................................................
12
Figura 7 - Fotomicrografia em HE aumento de 4x onde podemos observar
segmento de veia cava e aorta infra-renal no GS............................
34
Figura 8 - Fotomicrografia em HE do segmento de veia cava aumento de
40x, onde podemos observar a ausência de alterações no GOHB...
34
Figura 9 - Fotomicrografia em HE do segmento de veia cava aumento de
40x, onde podemos observar lesões nas camadas íntima, média e
adventícia no GRT...........................................................................
35
Figura 10 - Fotomicrografia em HE do segmento de veia cava aumento de
40x, onde podemos observar áreas de ausência de endotélio no
GRT.................................................................................................
35
Figura 11 - Fotomicrografia em HE do segmento de aorta, aumento de 40x
onde podemos observar as 3 camadas sem alterações no GOHB..
36
Figura 12 - Fotomicrografia em HE do segmento de aorta aumento de 40x,
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onde podemos observar a tumefação da vaso-vasorum na camada
adventícia do GRT...........................................................................
36
Figura 13 - Fotomicrografia em HE do segmento de aorta, aumento de 40x,
onde podemos observar a normalidade da vasa-vasorum na
camada adventícia do GRT/OHB....................................................
37
Figura 14 - Fotomicrografia em AgNOR do segmento de veia cava, aumento
de 100x, no GRT, onde podemos observar a escassez de NORs....
37
Figura 15 - Fotomicrografia em AgNOR do segmento de veia cava, aumento
de 100x, no GRT/OHB, onde podemos observar o aumento do
número de NORs nas camadas íntima e média...............................
38
Figura 16 - Fotomicrografia em AgNOR do segmento de aorta, aumento de
100x, no GRT, onde podemos observar a escassez do número de
NORs...............................................................................................
38
Figura 17 - Fotomicrografia em AgNOR do segmento de aorta, aumento de
100x, no GRT/OHB, onde podemos observar o aumento do
número de NORs na camada média................................................
39
Figura 18 - Fotomicrografia do segmento de veia cava do GS, onde podemos
observar a escassez de células coradas em castanho expressando a
positividade à caspase-3. (Imuno-histoquímica - 40x)....................
39
Figura 19 - Fotomicrografia do segmento de veia cava do GOHB, onde
podemos observar a escassez de células coradas em castanho
expressando a positividade a caspase-3. (Imuno-histoquímica -
40x)..................................................................................................
40
Figura 20 - Fotomicrografia do segmento de veia cava do GRT, onde
podemos observar a presença de células caspase positivas coradas
em castanho nas camadas íntima, média e adventícia. (Imuno-
histoquímica – 40x).........................................................................
40
Figura 21 - Fotomicrografia do segmento de veia cava do GRT/OHB, onde
podemos observar a escassez de células coradas em castanho
expressando a positividade a caspase-3. (Imuno-histoquímica –
40x)..................................................................................................
41
Figura 22 - Fotomicrografia do segmento de Aorta do GS, onde não se
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observa células coradas em castanho expressando a positividade a
caspase-3 nas camadas íntima, média e adventícias. (Imuno-
histoquímica – 40x).........................................................................
41
Figura 23 - Fotomicrografia do segmento de Aorta do GOHB, onde podemos
observar a escassez de células em castanho caspase positivas.
(Imuno-histoquímica – 40x)............................................................
42
Figura 24 - Fotomicrografia do segmento de Aorta do GRT, onde podemos
observar a presença de células coradas em castanho caspase
positivas nas camadas, íntima e média. (Imuno-histoquímica –
40x)..................................................................................................
42
Figura 25 - Fotomicrografia do segmento de Aorta do GRT, onde podemos
observar a presença de células castanhas caspase positivas.
(Imuno-histoquímica – 40x)............................................................
43
Figura 26 - Fotomicrografia do segmento de Aorta do GRT, onde podemos
observar a presença de células castanhas caspase positivas na
camada adventícia, inclusive na vasa-vasorum. (Imuno-
histoquímica - 40x)..........................................................................
43
Figura 27 - Fotomicrografia do segmento de Aorta do GRT/OHB, onde se
pode observar intensa vacuolização e escassas células castanhas
caspase positivas. (Imuno-histoquímica - 40x)...............................
44
Figura 28 - Fotomicrografia do segmento de Aorta do GRT/OHB, onde
podemos observar escassas células castanhas caspase
positivas nas distintas camadas da artéria. (Imuno-
histoquímica – 40x).......
44
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Medidas resumo das variáveis de peso em gramas nos instantes pré
e pós, segundo o grupo.........................................................................
17
Tabela 2 - Medidas resumo da diferença dos pesos em gramas (pós-pré),
segundo o grupo...................................................................................
18
Tabela 3 - Medidas resumo da porcentagem de ausência de endotélio na
camada íntima da veia observados em toda sua circunferência em
aumento de 40 vezes.............................................................................
19
Tabela 4 - Medidas resumo da porcentagem de lesão da vasa-vasorum na
camada adventícia da artéria observadas em toda sua circunferência
em aumento de 40 vezes.......................................................................
20
Tabela 5 - Medidas resumo dos três segmentos da parede arterial ( íntima,
camada média e adventícia) para a contagem de NORs observados
em 100 células pelo método de AgNor................................................
22
Tabela 6 - Medidas resumo dos três segmentos da parede venosa (íntima,
camada média e adventícia) para a contagem de NORs observados
em 100 células pelo método de AgNor................................................
25
Tabela 7 - Medidas resumo dos três segmentos da parede arterial (íntima,
camada média e adventícia), dos percentuais de células caspase
positivas em relação ao total de células encontradas em 20 campos
aleatórios com aumento de 40 vezes em Imuno-histoquímica
(Caspase 3 Clivada)..............................................................................
28
Tabela 8 - Medidas resumo dos três segmentos da parede venosa (íntima,
camada média e adventícia), dos percentuais de células caspase
positivas em relação ao total de células encontradas em 20 campos
aleatórios com aumento de 40 vezes em imuno-histoquímica
(caspase 3 clivada)................................................................................
31
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LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - Valores em gramas de peso dos ratos dos diferentes grupos ao
início dos procedimentos...............................................................
17
Gráfico 2 - Variação do peso dos ratos em gramas, dos diferentes grupos ao
final dos procedimentos..................................................................
18
Gráfico 3 - Valores percentuais da ausência de endotélio na camada íntima
das veias nos diferentes grupos......................................................
19
Gráfico 4 - Valores percentuais do número de vasa-vasorum lesadas na
camada adventícia das artérias dos diferentes
grupos..............................................................................
20
Gráfico 5 - Contagem do número de NORs por células da camada íntima das
artérias nos diferentes grupos.........................................................
23
Gráfico 6 - Contagem do número de NORs por células da camada média das
artérias nos diferentes grupos.........................................................
23
Gráfico 7 - Contagem do número de NORs por células da camada adventícia
das artérias nos diferentes grupos...................................................
24
Gráfico 8 - Contagem do número total de NORs por células das três
camadas das artérias nos diferentes grupos..................................
26
Gráfico 9 - Contagem do número de NORs por células da camada íntima das
veias nos diferentes grupos.............................................................
26
Gráfico 10 - Contagem do número de NORs por células da camada média
das veias nos diferentes grupos......................................................
26
Gráfico 11 - Contagem do número de NORs por células da camada adventícia
das veias nos diferentes grupos......................................................
27
Gráfico 12 - Contagem do número total de NORs por células das três
camadas das veias nos diferentes grupos.......................................
27
Gráfico 13 - Valores percentuais de células caspase positivas nos diferentes
grupos na camada íntima das artérias.............................................
29
Gráfico 14 - Valores percentuais de células caspase positivas nos diferentes
grupos na camada média das artérias............................................
29
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Gráfico 15 - Valores percentuais de células caspase positivas nos diferentes
grupos na camada adventícia das artérias.......................................
30
Gráfico 16 - Valores percentuais de células caspase positivas nos diferentes
grupos na camada íntima das veias................................................
32
Gráfico 17 - Valores percentuais de células caspase positivas nos diferentes
grupos na camada média das veias.................................................
32
Gráfico 18 - Valores percentuais de células caspase positivas nos diferentes
grupos na camada adventícia das veias..........................................
33
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LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
- micrômetro
C - graus Celsius
ATA - atmosfera absoluta cm - centímetro
D.P. – desvio padrão F- análise da variância paramétrica
g - grama GL - Gal Lussac
GOHB – grupo oxigenoterapia hiperbárica GRT – grupo radioterapia
GRT/OHB – grupo radioterapia e oxigenoterapia hiperbárica GS – grupo simulado
Gy – gray mg - miligrama
mg.Kg -1 - miligrama por kilograma min - minuto
ml - mililitro NS - não significante
OHB – oxigenoterapia hiperbárica RT - radioterapia
RT/OHB - radioterapia e oxigenoterapia hiperbárica AgNOR – região organizadora de nucléolos argintofílicos
NORs – região organizadora de nucléolos
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RESUMO Objetivos: Estudar o efeito da Oxigenoterapia Hiperbárica sobre as lesões causadas pela
radiação ionizante na veia cava e aorta. Método: Foram utilizados 32 ratos adultos
distribuídos aleatoriamente em 4 grupos: 3 no grupo controle; 10 no grupo oxigenoterapia
hiperbárica (5 sessões e 3 ATA e após 3 dias, operados), 9 no grupo radioterapia (8 sessões de
5Gy, atingindo 54Gy, sendo operados após 7 dias), 10 no grupo radioterapia e oxigenoterapia
hiperbárica (procedimento radioterapia, observação por 7 dias, submetidos a 5 sessões de
oxigenoterapia hiperbárica e após 3 dias, são operados. Ressecamos a veia cava e aorta infra-
renal para estudo morfológico (integridade endotelial, infiltrado inflamatório e integridade da
vasa-vasorum), avaliação do ciclo celular pelo método do AgNOR e índice de apoptose nas
distintas camadas dos vasos, através da Caspase-3 (imuno-histoquímica). Resultados: O
grupo radioterapia – oxigenoterapia hiperbárica apresentou diminuição estatisticamente
significativa das alterações morfológicas em vasa-vasorum, aumento da atividade celular na
camada média e também diminuição do índice de apoptose nas camadas íntima e média da
aorta infra-renal quando comparados ao grupo apenas submetidos à radiação ionizante. A
lesões rádio induzidas na veia cava não apresentaram melhora significativa com a
oxigenoterapia hiperbárica Conclusão: A oxigenoterapia hiperbárica é capaz de minimizar as
lesões radio-induzidas em fase aguda em aorta.
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ABSTRACT Objectives: The role of hyperbaric oxygen treatment on radiation injuries in vena cava and
aorta. Methods: It was chosen 32 rats distributed in 4 groups: 3 surgery; 10 hyperbaric
oxygenation (5 exposures to 3 ATA for 90 minutes and after 3 days surgery); 9 radiotherapy
(8 exposures of 5 Gy each reaching a total dose of 54 Gy in the vena cava and aorta, after
7days, surgery procedures), and 10 radiotherapy/ hyperbaric oxygenation (8 exposures of 5
Gy each reaching a total dose of 54 Gy, after 7 days, 5 exposures to 3 ATA for 90 minutes
and after 3 days surgery). The vena cava and aorta species were studied by histological
morphology, histochemical (AgNOR), and immunocytochemical aspects (caspase-3).
Results: There have been statistically significant differences among the group radiotherapy
and radiotherapy/hyperbaric oxygenation in morphological aspects of aorta vasa-vasorum,
cellular cycle of the media aorta wall and decrease at apoptosis index in the endothelium and
media. There have been no statistically significant differences among the group radiotherapy
and radiotherapy/hyperbaric oxygenation in vena cava. Conclusion: The hyperbaric
oxygenation reduced the radiation injures in the aorta wall.
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................. 1
2. OBJETIVOS....................................................................................................... 4
3. MÉTODOS......................................................................................................... 5
4. RESULTADOS.................................................................................................. 17
5. DISCUSSÃO...................................................................................................... 45
6. CONCLUSÕES.................................................................................................. 54
7. REFERÊNCIAS................................................................................................. 55
8. NORMAS ADOTADAS.................................................................................... 59
APÊNDICE......................................................................................................... 60
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1. INTRODUÇÃO
A radioterapia demonstrou ser eficaz no tratamento curativo e paliativo dos tumores
pélvicos1.
Apesar da melhora nos resultados com aumento da longevidade e diminuição no
índice de recidiva local, os efeitos precoces e tardios da radiação sobre os órgãos pélvicos
também aumentaram na proporção direta da difusão de método, portanto os cuidados para
minimizar estes efeitos são tão importantes quanto a sua indicação e utilizações precisas2-5.
A resposta dos tecidos normais à radiação representa a soma e a interação dos danos
em todos os diferentes tipos de células componentes desse tecido6.
Existe diferença na resposta radiobiológica entre o tecido normal e o tecido tumoral,
bem como entre os diferentes tecidos normais e estão relacionadas com a capacidade da célula
em reparar ou não as lesões radioinduzidas7.
As lesões vasculares induzidas pela radioterapia foram reconhecidas e estudadas desde
a década de 60, e hoje já são conhecidos seus efeitos, como a precocidade e aceleração do
processo aterosclerótico, fibroses, tromboses e conseqüente diminuição do fluxo em inúmeros
órgãos e sistemas8,9.
A morte celular aguda, particularmente a das células endoteliais vasculares, pode
causar disfunção orgânica tardia dentro de vários meses ou anos após a exposição a
radiação10,11.
Estas lesões podem ser precoces (até seis meses após a exposição à radiação
ionizante), ou tardias (após seis meses), acometem tanto artérias quanto veias, em todos os
calibres, sendo que a camada endotelial é a mais acometida na fase precoce, podendo levar a
estenoses e/ou tromboses.
As camadas médias e adventícias quando muito comprometidas nas artérias podem
evoluir com dilatação aneurismática e ruptura, levando às situações dramáticas10.
A abordagem operatória dos vasos severamente acometidos pela doença
aterosclerótica em territórios previamente irradiados (segmento Aorto-ilíaco ou Carotídeo),
bem como o tratamento das tromboses e/ou estenoses em veias comprometidas pelos efeitos
da radiação ionizante demonstrou ser um verdadeiro desafio e os resultados obtidos nesses
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2
procedimentos, muitas vezes inadequados, mesmo quando realizados por cirurgiões
experientes, tornou-se tema de intensa investigação científica12-15.
O aparecimento de lesão actínica está associado ao aumento de fenômenos
apoptóticos, ou à morte celular programada 6,7. Estas alterações podem ser detectadas através
da observação das alterações morfológicas e por estudos imuno-histoquímicos6,7,16.
O ciclo celular em condições de morte celular seja por apoptose ou por necrose,
também são comprometidos nessas situações e podem ser avaliados por método histoquímico
onde se observa a diminuição do número de Regiões Controladoras de Nucléolos (NORs)17
O processo de apoptose é desencadeado por uma cascata de reações bioquímicas de
enzimas proteolíticas, sendo que dentro das principais proteases responsáveis estão as do
grupo das caspases, em especial as denominadas caspase-3. A sua presença é indicativa do
aparecimento de fenômenos apoptóticos antes mesmo da expressão morfológica celular
ocorrer. Funciona com um excelente marcador prognóstico e diagnóstico de apoptose 18.
A Oxigenoterapia hiperbárica (OHB) seria uma das opções para diminuir os efeitos
adversos da radioterapia, diminuindo seus efeitos sobre as estruturas vasculares16.
A ação da OHB potencializa o efeito radiobiológico, quando realizada concomitante às
sessões de radioterapia. O aumento na oferta de oxigênio amplia a produção de radicais livres,
com aumento da lesão oxidativa do ácido desoxirribonucléico (DNA) e agravamento no
índice de morte celular18,19.
Por outro lado a OHB promove também aumento na produção de óxido nítrico, com
conseqüente vaso dilatação local, o que diminuiria a isquemia na fase aguda da aplicação
ionizante e seria um dos mecanismos de diminuição de fenômenos apoptóticos, sendo assim
um fator de proteção às lesões radio induzidas20-24.
As lesões radio induzidas que ocorrem sobre as distintas camadas da veia cava e aorta
são potencialmente graves e de difícil tratamento e a revisão da literatura biomédica não
proporcionou o encontro de trabalhos em animais de experimentação que analisassem os
efeitos da OHB sobre o sistema vascular irradiado25.
Desse modo, pareceu pertinente realizar em um modelo experimental de doença onde
pudéssemos avaliar os eventuais efeitos das oxigenoterapia hiperbárica sobre a veia cava e
aorta infra-renal de ratos submetidos à radiação ionizante.
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3
As possíveis alterações morfológicas e morfométricas, uma avaliação histoquímica e
imuno-histoquímica pela caspase-3 foram utilizadas como parâmetros que poderiam
estabelecer a relação entre a radiação ionizante e a aplicação da OHB.
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4
2. OBJETIVOS
Geral:
Estudar o efeito da oxigenoterapia hiperbárica sobre as lesões radio induzidas na veia cava e
aorta infra-renal.
Especifico:
Estudar o efeito da oxigenoterapia hiperbárica através de métodos morfológicos,
histoquímicos e imuno-histoquímicos sobre as lesões actínicas da veia cava e aorta infra-
renal.
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3. MÉTODOS
Amostra
Foram utilizados 32 ratos adultos (Rattus norvegicus albinus), da linhagem Wistar-
OUT EPM-l, originários do Laboratório Charles Rivers com peso médio de 265 gramas
(variação de 250 a 280g), com idade entre dois e três meses, provenientes do Biotério da
Faculdade de Ciências Médicas de Santos, Universidade Lusíadas (FCMS-UNILUS).
Os animais foram alojados no referido Biotério em gaiolas de 40x30x25cm, com água
e ração balanceada ad libitum, iluminação controlada por ciclo de doze horas claro e doze
horas escuro, limpeza diária das gaiolas, temperatura e umidade mantidas por ar
condicionado.
A distribuição aleatória dos animais em 4 grupos foi a seguinte:
Grupo Simulado (GS): 3 animais anestesiados e submetidos à ressecção do segmento de veia
cava e aorta infra-renal.
Grupo Radioterapia (GRT): 9 animais submetidos a oito sessões de radioterapia (60Gy),
que após sete dias foram anestesiados e submetidos a ressecção do segmento de veia cava e
aorta infra-renal.
Grupo Oxigenoterapia Hiperbárica (GOHB): 10 animais submetidos a sessões diárias de
oxigenação hiperbárica por cinco dias e que após três dias foram anestesiados e submetidos à
ressecção do segmento de veia cava e aorta infra-renal.
Grupo Radioterapia e Oxigenoterapia Hiperbárica (GRT/OHB): 10 animais submetidos a
oito sessões de radioterapia (60Gy) e que após sete dias da última aplicação foram expostos a
sessões diárias de OHB por cinco dias ; após três dias foram anestesiados e submetidos à
ressecção de veia cava e aorta infra-renal.
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6
.
Figura 1 – Fluxograma dos diferentes procedimentos realizados nos animais dos quatro grupos.
RESSECÇÃO DE SEGMENTO DE
GOHB
GRUPOS
RTA 8 SESSÕES
OHB 5 SESSÕES
GRT/OHB
GS
8º DIA:
RESSECÇÃO +
RTA 8 SESSÕES
7 DIAS OBSERVAÇÃO 3 DIAS
OBSERVAÇÃO 7 DIAS OBSERVAÇÃO
9º DIA:
RESSECÇÃO +
5 DIAS OHB
3 DIAS OBSERVAÇÃO
16º DIA:
RESSECÇÃO +
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7
PROCEDIMENTOS
Os procedimentos foram realizados no Laboratório de Técnica Cirúrgica da FCMS-
UNILUS, após aprovação do Projeto de Pesquisa pelo Comitê de Ética em pesquisa (CEP) do
Hospital São Paulo – UNIFESP-EPM, protocolados sob o número 1353/05 e ratificado pela
FCMS-UNILUS.
Procedimento anestésico
Os animais foram pesados e submetidos à anestesia com zolazepam em combinação
com tiletamina* na dose de 50mg/kg, associada à analgesia com cloreto de petidina** a
0,2mg/kg em uma única aplicação por via intramuscular, no músculo gastrocnêmico medial.
A eficácia da anestesia e analgesia foram comprovadas pela perda do reflexo palpebral e da
retirada do membro pélvico ao estímulo doloroso provocados por preensão após dois minutos
da administração. Os animais foram mantidos em respiração espontânea.
___________ *Zoletil®
**Dolossal®
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8
Procedimento de radioterapia
Os animais do Grupo Radioterapia, em grupo de três animais em cada sessão, foram
pesados e após o procedimento anestésico, transportados em gaiolas de 40x30x25cm para o
Serviço de Radioterapia da Sociedade Portuguesa de Beneficência de Santos.
Foram posicionados em decúbito dorsal horizontal sobre placa de acrílico. Para
exposição à radiação apenas do abdome inferior, foi posicionada uma placa de chumbo
protetora de 0,2cm de espessura, com três aberturas centrais de 4,5x4,5cm sobre o animal,
tendo como limite cranial a cicatriz umbilical e limite caudal a projeção óssea das espinhas
ilíacas ântero-superiores.
Cada animal foi submetido a oito sessões de radiação de 5Gy. A exposição foi obtida
através de um aparelho de ortovoltagem RT Muller 200, com filtro externo de meio milímetro
de cobre, para cento e sessenta quilovolts e quinze miliampéres, camada semi-redutora de
0,9mm de cobre acoplada a cone localizador de 20x24 centímetros e cinqüenta centímetros de
distância fonte-animal, durante treze minutos, três vezes por semana.
Foi obtida, de acordo com a tabela de efeito somatório de radiação, uma dose total de
60Gy na superfície do animal e de 54Gy no segmento aorto-ilíaco a ser estudado. Entre as
sessões os animais foram observados no biotério.
Após a última sessão os animais permaneceram sob observação por sete dias, quando
foram pesados, submetidos a procedimentos anestésico e operatório semelhantes aos dos
animais do Grupo Simulado.
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9
Figura 4 – Foto onde se observa o grupo de três animais com placa de chumbo
protetora focalizando a área efetiva de ex-posição à radiação.
Figura 5 – Foto de três animais em posição sob o aparelho de ortovoltagem e
prontos para iniciar a exposição à Radiação.
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10
Procedimento de Oxigenoterapia Hiperbárica
Os animais do Grupo Oxigenoterapia Hiperbárica foram pesados e levados ao
Laboratório de Técnica Cirúrgica da FCMS-UNILUS, onde foram colocados em grupos de
três animais, sem anestesia, em câmara hiperbárica de acrílico para animais de pequeno porte,
foram expostos a oxigenação hiperbárica a 3 atmosferas absolutas (ATA), por noventa
minutos por dia, durante cinco dias. Após três dias de observação foram submetidos aos
mesmos procedimentos anestésicos e operatórios descritos para os animais do Grupo
Simulado.
Figura 6 – Foto dos animais em câmara hiperbárica de acrílico para animais de pequeno
porte, sob três atmosferas absolutas de pressão (3 ATA).
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11
Procedimento de radioterapia e OHB
Os animais do Grupo Radioterapia e Oxigenoterapia Hiperbárica foram submetidos
numa primeira etapa ao processo de exposição à radioterapia, semelhante ao descrito para os
animais do grupo RT, e em seguida observados por sete dias. No oitavo dia foram expostos a
oxigenoterapia hiperbárica por cinco dias e após três dias submetidos aos procedimentos
anestésico e operatório, semelhantes ao descritos para os animais do grupo OHB.
Procedimento operatório
Os animais foram colocados sobre uma prancha, em decúbito dorsal horizontal, com
as extremidades dos membros torácicos e pélvicos imobilizados com fita adesiva.
Os pelos da parede ventral do abdome foram submetidos à epilação. Realizou-se a
anti-sepsia com tintura de iodo polivilpirrolidona com posterior delimitação da região
operatória com panos esterilizados.
Uma laparotomia, através de incisão longitudinal mediana, foi feita com bisturi de
lâmina 15, com 5 cm de extensão, interessando pele, tela subcutânea, linha Alba e o peritônio
parietal. O afastamento da parede abdominal e conseqüente exposição da cavidade abdominal
foi realizado com auxílio de um afastador auto-estático metálico.
Em cada animal foi realizada a exposição transperitonial do segmento de aorta infra-
renal e das artérias ilíacas, posteriormente os mesmos foram ligados e ressecados. A peça
operatória retirada foi colocada em solução salina de cloreto de sódio a 0,9% e posteriormente
em frasco contendo formalina a 10%
Foi realizado o fechamento da cavidade abdominal em plano único com fio de algodão
3.0
O procedimento de eutanásia foi realizado por aprofundamento da anestesia e
conseqüente depressão respiratória.
Os procedimentos foram semelhantes nos animais dos grupos OHB, RT e RT/OHB.
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12
Figura 2 – Foto de um animal do grupo simulado (GS) onde se observa o segmento de
veia cava e aorta infra-renal a ser ressecado.
Figura 3 – Foto de um animal do grupo irradiado (RT) onde se observa o segmento
de veia cava e aorta pinçados para serem ressecados.
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13
Coletas de amostras para o estudo histológico
As peças operatórias foram lavadas com solução salina e colocadas em solução de formalina a 10% por no mínimo vinte e quatro horas.
A preparação do tecido para confecção de lâminas26 incluiu a desidratação em álcoois
etílicos (70GL, 90GL e 100GL, consecutivamente), diafanização em xilol P.A (pró-análise) e
impregnação em parafina histológica (ponto de fusão 56 – 58 graus Centígrados), “a
temperatura de 59 graus Centígrados. Os blocos foram seccionados com micrótomo
rotativo*, ajustado para 3 milimícras de espessura, sempre no sentido transversal dos vasos,
de modo que pudessem ser observadas em toda espessura de sua parede. As lâminas obtidas
foram coradas com Hematoxilina e Eosina (HE), coloração de AgNOR e estudo imuno-
histoquímico, pela Caspase 3 clivada.
A análise dos dados microscópicos foi realizada no Laboratório de Histologia da
UNIFESP-EPM.
As imagens foram capturadas através de câmara de captura de imagem de alta
resolução, software AXIOcam MRC da ZEISS** e a leitura realizada em microscópio óptico
CARL ZEISS Axilab. O programa utilizado foi a Axiovision Rel 4.2 da ZEISS.
Os critérios de avaliação incluíram a descrição morfológica qualitativa e quantitativa
dos três segmentos da parede arterial e venosa (íntima, camada média e adventícia). Foi
avaliada em HE, a presença de necrose, descolamento endotelial, edema e células
inflamatórias na camada íntima. Na camada média foi verificada a presença de células
inflamatórias, edema e hemorragia e na camada adventícia, avaliamos a presença de
hemorragia, infiltrados inflamatórios e aspectos da vasa-vasorum (Aorta).
Esta avaliação foi realizada através da análise de toda a circunferência dos vasos, em
aumento de 40 vezes, nas lâminas obtidas de cada animal de cada grupo.
_____________________________ *Tipo MINOT®, marca REICHERT®, modelo 820. **marca ZEISS®. Modelo Standart 25 acoplado a um conjunto para fotomicrografia, marca ZEISS®, modelo MC 80.
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14
Estudo Histoquímico – Técnica do AgNOR
As amostras de aorta e veia cava dos diferentes grupos foram fixadas em solução de
formol a 10% tamponado, pH 7,0 por 24 a 48 horas e depois lavadas em água corrente por
uma hora. Após isso o material foi transferido para uma solução de álcool a 70% e
processadas de acordo com a técnica de rotina para microscopia óptica. Com o auxílio do
micrótomo rotativo secções de 5 µm de espessura foram obtidas. Os cortes foram
desparafinizados, hidratados em série alcoólica decrescente e lavados em água destilada
deionizada. Foram então incubadas em câmara úmida ao abrigo da luz por 30 minutos, a 60ºC
em solução contendo nitrato de prata. A solução a base de nitrato de prata para uso é
constituída de uma parte da solução A (1 grama de gelatina incolor, 0,5 ml de ácido fórmico e
50ml de água deionizada), para duas partes da solução B (12,5gramas de nitrato de prata e 25
ml de água deionizada). Quando as amostras apresentaram coloração marrom escura, as
lâminas foram retiradas da solução corante e lavadas em água deionizada morna (45ºC), para
retirar o precipitado formado pela gelatina. A seguir as mesmas foram passadas em solução de
tiossulfato de sódio a 5% por 5 minutos, com a finalidade de retirar a prata reduzida
depositada sobre as células27-29. Em seguida as lâminas foram desidratadas para o
procedimento de montagem. Foi contado o número de NOR por núcleo em cada uma das
camadas da veia cava e aorta em 100 células, em aumento de 100x.
Estudo Imuno-histoquímico – Caspase 3 clivada
O procedimento de coloração imuno-histoquímica para a marcação da caspase-3 foi
realizado no laboratório de patologia estrutural da UNIFESP-EPM.
Foram realizados cortes histológicos de 3 µm de espessura do material incluído em
parafina, foram colados em lâminas de vidro previamente tratadas com adesivo as bases de 3-
aminopropyl-triethoxy-silane۠* e deixadas por 24 horas em estufa regulada a 60ºC. Os cortes
foram desparafinizados em xilol por 5 minutos (3 banhos), hidratados em álcol etílico
absoluto (4 banhos) e lavados com solução salina tamponada (SST) em pH 7,4 por 5 minutos;
posteriormente os cortes foram tratados com perióxido de hidrogênio (H2O2) a 3% diluído em
SST por 5 minutos para bloqueio de peroxidase endógena. Utilizou-se o método de
recuperação de epítopos pelo calor (SST de citrato com pH 6,4 por 15 minutos em forno de
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15
microondas) para a pesquisa de caspase 3. Em seguida, os tecidos foram incubados com
anticorpo primário anti-caspase 3 em média por 16 horas, incluindo o período noturno. No dia
seguinte, após lavagem em SST, os cortes foram incubados com anticorpo secundário
biotinilado no diluição de 1: 300 (Vector Corporation, Burlingame, Califórnia, EUA). A
seguir realizou-se incubação 45 minutos com complexo ABC na proporção de 1 gota do
reagente A (avidina) e uma do reagente B (biotina ligada à peroxidase) na diluição de 5 ml de
solução tampão de TRIS e solução de peróxido de hidrogênio (H2O2) por 5 minutos. Os cortes
foram contra-corados com hematoxilina de Harris por 20 segundos ou verde de metila por 5
minutos com posterior desidratação em banhos de álcool etílico absoluto (5 banhos) e xilol (3
banhos). Todos os passos da reação imuno-histoquímica foram realizados à temperatura
ambiente, com exceção da incubação no forno de microondas. Entre cada passo da reação as
lâminas foram lavadas várias vezes com SST (pH = 7,4).
O programa de computador Axiovision Rel 4,2 – Zeiss® permitiu a marcação das
células coradas em marrom acastanhado (expressão imunohistoquímica da caspase 3), sua
contagem em 20 campos aleatórios, cálculo de sua porcentagem em relação às células não
coradas em marrom-castanho (células sem expressão imunohistoquímica da caspase 3) e
apresentação dessas medidas em média e desvio padrão. O índice de apoptose foi calculado
considerando a porcentagem de células apoptóticas marcadas em cada 1000 células contadas.
_________________ *Sigma, A-3648, USA.
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16
Estudo Estatístico
As variáveis foram representadas por média, desvio padrão (d.p.), mediana, valores
mínimo e máximo.
Foram utilizados testes não paramétricos devido à natureza das variáveis e à grande
variabilidade dentro dos grupos.
Os grupos foram comparados quanto à distribuição das variáveis pela Prova de
Kruskal-Wallis e foi aplicado o teste de comparações múltiplas de Dunn para localizar as
diferenças. Foi adotado o nível de significância de 0,05 (α = 5%) e níveis descritivos (p)
inferiores a esse valor foram considerados insignificantes e representados por *. Todas as
análises foram realizadas pelo programa estatístico SPSS versão 12.0 for Windows®.
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4. RESULTADOS Resultados da Análise Estatística
Tabela 1 - Medida resumo das variáveis de peso em gramas nos instantes pré e pós, segundo o grupo. Tempo Grupo N Média D.P. Mínimo Mediana Máximo Pré GS 3 253,3 5,8 250 250 260 GRT 9 258,9 12,7 250 250 280 GOHB) 10 264,0 19,0 230 265 290 GRT/OHB 10 253,0 4,8 250 250 260 p = 0,408 Pós GS 3 253,3 5,8 250 250 260 GRT 9 202,2 19,2 180 200 250 GOHB) 10 256,0 19,0 220 255 290 GRT/OHB 10 199,0 31,1 150 200 240
O resultado da Tabela 1 apresenta uma análise exploratória do peso e o resultado
obtido do teste comparativo (p = 0,408). O resultado mostra evidência de que não há
diferença dos pesos entre os grupos estudados.
GS GRT GOHB GRT/OHB
Grupo
240
260
280
Peso
(g) n
o pr
é-pr
oced
imen
to
p = 0,408
Gráfico 1 – Valores em gramas de peso dos ratos ao início dos
procedimentos nos diferentes grupos.
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18
Tabela 2 - Medidas resumo da diferença dos pesos em gramas (pós-pré), segundo o grupo.
Grupo N Média D.P. Mínimo Mediana Máximo p
GS 3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 <0,001 GRT 9 -56,7 19,4 -100,0 -50,0 -30,0 GOHB 10 -8,0 7,9 -20,0 -10,0 0,0 GTR/OHB 10 -54,0 30,3 -100,0 -55,0 -10,0 Teste de comparação múltipla: Simulado ≠ RT, RT/OHB; OHB ≠ RT, RT/OHB.
Os resultados da Tabela 2 apresentam uma análise exploratória da diferença entre os
pesos e o resultado obtido do teste comparativo (p < 0,001). O resultado mostra evidência de
diferença de peso entre os grupos estudados. Após realizar um teste de comparação múltipla a
fim de verificar quais grupos diferiram, constatou-se que houve diferença do grupo Simulado
com os grupos Radioterapia e Radioterapia/Oxigenoterapia; também houve diferença do
grupo Oxigenoterapia Hiperbárica com o grupo Radioterapia e Radioterapia/Oxigenoterapia
hiperbárica.
p < 0,001GSGRTGSGRT/OHBGOHB GRTGOHB GRT/OHB
GS GRT GOHB GRT/OHB
Grupo
-100
-75
-50
-25
0
Red
ução
de
Peso
(g) a
o fin
al d
o pr
oced
imen
to
Gráfico 2 – Variação do peso dos ratos em gramas, ao final dos procedimentos nos diferentes
grupos.
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19
Tabela 3 - Medidas resumo da porcentagem de ausência de endotélio na camada íntima da veia observadas em toda sua circunferência em aumento de 40 vezes.
Veia Grupo Média D.P. Mínimo Mediana Máximo p %Ausência de Endotélio
GS 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 <0,001 GRT 23,89 15,77 0,00 20,00 50,00 GOHB 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 GRT/OHB 11,50 7,09 0,00 10,00 20,00
__________________________________________________________________________________
Teste de comparação múltipla: Ausência de Endotélio: GRT ≠GS, GRT ≠ OHB, GRT/OHB GS, GRT/OHB GOHB
GS GRT GOHB GRT/OHB
Grupo
0
10
20
30
40
50
Veia
s - A
usên
cia
de E
ndot
élio
(%) -
Cam
ada
Íntim
a
p < 0,001GSGRTGSGRT/OHBGOHB GRTGOHB GRT/OHB
Gráfico 3 – Valores percentuais da ausência de endotélio na camada íntima das
veias nos diferentes grupos.
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20
Tabela 4 - Medidas resumo da porcentagem de lesão da vasa-vasorum na camada adventícia da artéria observados em toda sua circunferência em aumento de 40 vezes.
Artéria %Lesão de Vasa-vasorum
GS 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,001 GRT 50,00 41,53 0,00 50,00 100,00 GOHB 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 GRT/OHB. 7,00 16,36 0,00 0,00 50,00
Teste de comparação múltipla: Lesão de Vasa-vasorum: GRT ≠GS, GRT ≠ GOHB, GRT GRT/OHB
p = 0,001GSGRTGOHB GRTGRT/OHB GRT
GS GRT GOHB GRT/OHB
Grupo
0
25
50
75
100
Art
éria
s - L
esão
de
Vasa
Vas
orum
- C
amad
a A
dven
tícia
Gráfico 4 – Valores percentuais do número de vasa-vasorum lesadas na camada adventícia das artérias dos diferentes grupos.
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21
Na Tabela 3 observa-se evidência de uma diferença significante entre os grupos
quanto a porcentagem de ausência de endotélio na camada íntima das veias (p < 0,001).
Verifica-se também que existe diferença entre os grupos quanto à porcentagem de lesão da
vasa vasorum na camada adventícia das artérias (p = 0,001).
Para a porcentagem de ausência do endotélio, o grupo Simulado diferiu dos outros
dois grupos: Radioterapia e Radioterapia/Oxigenoterapia, o grupo Oxigenoterapia Hiperbárica
diferiu dos outros dois grupos: Radioterapia e Radioterapia/Oxigenoterapia.
Para a porcentagem de lesão da vasa vasorum, o grupo Radioterapia diferiu dos outros
três grupos: Simulado, Oxigenoterapia Hiperbárica e Radioterapia/Oxigenoterapia.
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22
Tabela 5 - Medidas resumo dos três segmentos da parede arterial (íntima, camada média e adventícia) para a contagem de NORs observados em 100 células pelo método de AgNor.
Artéria Grupo Média D.P. Mínimo Mediana Máximo p %Íntima
GS 104,00 6,00 98,00 104,00 110,00 0,005 GRT 89,67 12,96 71,00 87,00 113,00 GOHB 106,40 5,68 99,00 107,50 115,00 GRT/OHB 94,60 9,52 84,00 97,00 108,00
%Média GS 106,67 2,08 105,00 106,00 109,00 <0,001 GRT 81,89 14,02 51,00 85,00 96,00 GOHB 106,50 4,88 101,00 105,50 117,00 .GRT/OHB 98,40 15,11 72,00 100,50 131,00
%Adventícia GS 101,67 5,03 97,00 101,00 107,00 <0,001 GRT 74,44 14,57 42,00 74,00 97,00 GOHB 103,30 4,94 94,00 102,50 109,00 GRT/OHB 86,30 8,47 70,00 85,50 100,00
Total GS 312,33 11,93 304,00 307,00 326,00 <0,001 GRT 246,00 31,15 203,00 243,00 295,00 GOHB 316,20 7,48 305,00 315,00 328,00
GRT/OHB. 279,30 17,84 256,00 285,00 299,00
Teste de comparação múltipla: - Íntima: GOHB ≠ GRT, GRT/OHB
- Média: GRT ≠GS, GOHB, GRT/OHB; GOHB ≠ GRT/OHB - Adventícia: GOHB ≠ GRT, GRT/OHB; GS≠ GRT
- Total: GOHB ≠ GRT, GRT/OHB; GS ≠ GRT
Os resultados da Tabela 5 mostram diferenças significantes dos segmentos da parede
arterial: íntima (p = 0,005), camada média (p < 0,001) e adventícia
(p < 0,001), entre os grupos, quando utilizado o método do AgNor. Também se observa que
há diferença no total dos três segmentos (p < 0,001). No segmento da parede arterial íntima
houve diferença entre o grupo Oxigenoterapia Hiperbárica com os grupos Radioterapia e
Radioterapia/Oxigenoterapia. Em relação ao segmento da camada média o grupo Radioterapia
diferiu dos demais e o Oxigenoterapia Hiperbárica diferiu do grupo
Radioterapia/Oxigenoterapia. Já para o segmento da adventícia houve diferença entre o grupo
Oxigenoterapia Hiperbárica com os Radioterapia e Radioterapia/Oxigenoterapia e entre o
grupo Simulado com o Radioterapia. A mesma diferença detectada entre os grupos para o
segmento da adventícia ocorreu para o total dos segmentos.
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23
GS GRT GOHB GRT/OHB
Grupo
70
80
90
100
110
Art
éria
s - N
ors
- Cam
ada
Íntim
a
p = 0,005GOHB GRTGOHB GRT/OHB
Gráfico 5 – Contagem do número de NORs por células na camada íntima das artérias
nos diferentes grupos.
p < 0,001GSGRTGOHBGRTGRT/OHB GRTGOHBGRT/OHB
GS GRT GOHB GRT/OHB
Grupo
50
75
100
125
Art
éria
s - N
ors
- Cam
ada
Méd
ia
Gráfico 6 – Contagem do número de NORs por células na camada média das artérias
nos diferentes grupos.
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24
p < 0,001GSGRTGOHB GRTGOHB GRT/OHB
GS GRT GOHB GRT/OHB
Grupo
40
60
80
100
Art
éria
s - N
ors
- Cam
ada
Adv
entíc
ia
Gráfico 7 – Contagem do número de NORs por células na camada adventícia das
artérias nos diferentes grupos.
p < 0,001GSGRTGOHBGRTGOHBGRT/OHB
GS GRT GOHB GRT/OHB
Grupo
50
75
100
125
Art
éria
s - N
ors
- Tot
al
Gráfico 8 – Contagem do número total de NORs por células nas três camadas das
artérias nos diferentes grupos.
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25
Tabela 6 - Medidas resumo dos três segmentos da parede venosa (íntima, camada média e adventícia) para a contagem de NORs observados em 100 células pelo método de AgNor.
Veia Grupo Média D.P. Mínimo Mediana Máximo p %Íntima GS 132,00 27,05 104,00 134,00 158,00 <0,001 GRT 84,33 1,71 68,00 87,00 99,00 GOHB 132,10 11,99 109,00 135,00 148,00 GRT/OHB 92,40 9,67 73,00 95,50 104,00 %Média GS 111,33 4,51 107,00 111,00 116,00 <0,001 GRT 78,78 13,75 48,00 79,00 94,00 GOHB 11,50 4,12 104,00 109,00 117,00 .GRT/OHB 95,70 7,45 84,00 96,00 110,00 %Adventícia GS 104,00 2,00 102,00 104,00 106,00 <0,001 GRT 73,89 11,68 44,00 78,00 82,00 GOHB 103,50 3,78 98,00 104,00 108,00 GRT/OHB 88,20 1,62 72,00 87,50 105,00 Total GS 347,33 25,15 319,00 356,00 367,00 <0,001 GRT 237,00 23,18 193,00 245,00 262,00 GOHB 346,10 12,11 326,00 347,50 362,00 .GRT/OHB 276,30 19,24 241,00 280,50 301,00
Teste de comparação múltipla: Íntima: GS≠ GRT, GRT/OHB; GOHB ≠ GRT, GRT/OHB
Média: GS≠ GRT; GOHB ≠ GRT, GRT/OHB Adventícia: GS≠ GRT; GOHB ≠G RT, GRT/OHB
Total:GS ≠ GRT, GRT/OHB; GOHB ≠ GRT, GRT/OHB
Os resultados da Tabela 6 mostram diferenças significantes dos segmentos da parede
venosa: íntima (p < 0,001), camada média (p < 0,001) e adventícia (p < 0,001), entre os
grupos. Também se observa diferença significante no total dos três segmentos (p < 0,001).
Para o segmento da parede venosa íntima houve diferença entre o grupo Simulado com
os Radioterapia e Radioterapia/Oxigenoterapia e entre o grupo Oxigenoterapia Hiperbárica
com os Radioterapia e Radioterapia/Oxigenoterapia. Em relação ao segmento da camada
média o grupo Simulado diferiu do grupo Radioterapia e o grupo Oxigenoterapia Hiperbárica
diferiu dos grupos Radioterapia e da Radioterapia/Oxigenoterapia. A mesma diferença
detectada entre os grupos para o segmento da camada média ocorreu para a adventícia e a
mesma diferença detectada entre os grupos para o segmento da parede venosa íntima ocorreu
para o total dos segmentos.
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26
GS GRT GOHB GRT/OHB
Grupo
75
100
125
150
Veia
s - N
ors
- Cam
ada
Íntim
a
p < 0,001GSGRTGSGRT/OHBGOHBGRTGOHBGRT/OHB
Gráfico 9 – Contagem do número de NORs por células na camada íntima das veias nos
diferentes grupos.
p < 0,001GSGRTGOHB GRTGOHB GRT/OHB
GS GRT GOHB GRT/OHB
Grupo
50
75
100
Veia
s - N
ors
- Cam
ada
Méd
ia
Gráfico 10 - Contagem do número de NORs por células na camada média das veias
nos diferentes grupos.
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27
p < 0,001GSGRTGOHBGRTGOHBGRT/OHB
GS GRT GOHB GRT/OHB
Grupo
50
75
100Ve
ias
- Nor
s - C
amad
a Ad
vent
ícia
Gráfico 11 - Contagem do número de NORs por células na camada adventícia das veias
nos diferentes grupos.
p < 0,001GSGRTGSGRT/OHBGOHB GRTGOHB GRT/OHB
GS GRT GOHB GRT/OHB
Grupo
200
250
300
350
Veia
s - N
ors
- Tot
al
Gráfico 12 – Contagem do número total de NORs por células nas três camadas das
veias nos diferentes grupos.
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28
Tabela 7 - Medidas resumo dos três segmentos da parede arterial (íntima, camada média e adventícia), dos percentuais de células caspase positivas em relação ao total de células encontradas em 20 campos aleatórios com aumento de 40 vezes em Imuno-histoquímica (Caspase 3 Clivada).
Artéria Grupo Média D.P. Mínimo Mediana Máximo p %Íntima
GS 6,32 4,43 3,22 4,35 11,40 <0,001 GRT 47,83 14,97 23,50 49,00 69,10 GOHB 5,33 2,20 2,33 4,84 8,70 .GRT/OHB 18,43 16,61 0,00 15,85 41,10
%Média GS 9,36 7,19 3,29 7,50 17,30 <0,001 GRT 43,47 14,62 16,40 47,60 63,80 GOHB 4,81 3,11 1,75 3,77 12,40 GRT/OHB 15,72 12,97 0,00 14,75 34,65
%Adventícia GS 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,003 GRT 14,57 15,70 0,00 13,70 45,40 GOHB 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 GRT/OHB 4,25 8,08 0,00 0,00 22,75
Teste de comparação múltipla:
Íntima: GRT ≠GS, GOHB, GRT/OHB Média: GRT ≠GS, GOHB, GRT/OHB
Adventícia: GRT ≠ GOHB, GS
O resultado da Tabela 7 mostra evidência de uma diferença significante do segmento
da parede arterial íntima entre os grupos (p < 0,001) quando utilizado Imuno-histoquímica
(Caspase 3 Clivada). Verifica-se também que existe diferença entre os segmentos da camada
média (p < 0,001) e adventícia (p = 0,003).
Para o segmento da parede arterial íntima o grupo da Radioterapia diferiu dos três
grupos: Simulado, Oxigenoterapia Hiperbárica e Radioterapia/Oxigenoterapia. A mesma
diferença entre os grupos tem ocorrido em relação ao segmento da parede arterial da camada
média. Para o segmento da parede arterial adventícia constatou-se diferença entre o grupo
Radioterapia e os grupos Simulado e Oxigenoterapia Hiperbárica.
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29
GS GRT GOHB GRT/OHB
Grupo
0
20
40
60A
rtér
ias
- Cas
pase
(%) -
Cam
ada
Íntim
a p < 0,001GSGRTGOHBGRTGRT/OHB GRT
Gráfico 13 – Valores percentuais de células caspase positivas na camada íntima das
artérias nos diferentes grupos.
p < 0,001GSGRTGOHB GRTGRT/OHB GRT
GS GRT GOHB GRT/OHB
Grupo
0
20
40
60
Art
éria
s - C
aspa
se (%
) - C
amad
a M
édia
Gráfico 14 – Valores percentuais de células caspase positivas na camada média das artérias nos diferentes grupos.
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30
p = 0,003GSGRTGOHBGRT
GS GRT GOHB GRT/OHB
Grupo
0
10
20
30
40A
rtér
ias
- Cas
pase
(%) -
Cam
ada
Adv
entíc
ia
Gráfico 15 – Valores percentuais de células caspase positivas na camada adventícia das artérias nos diferentes grupos.
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31
Tabela 8 - Medidas resumo dos três segmentos da parede venosa (íntima, camada média e adventícia), dos percentuais de células caspase positivas em relação ao total de células encontradas em 20 campos aleatórios com aumento de 40 vezes em Imuno-histoquímica (Caspase 3 Clivada).
Veia Grupo Média D.P. Mínimo Mediana Máximo p %Íntima
GS 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,003 GRT 40,38 32,90 0,00 48,10 77,80 GOHB 0,30 0,67 0,00 0,00 2,00 GRT/OHB 8,65 10,47 0,00 5,22 28,60
%Média GS 2,33 4,04 0,00 0,00 7,00 <0,001 GRT 46,50 26,41 10,30 38,80 88,90 GOHB 0,60 1,35 0,00 0,00 4,00 GRT/OHB 19,93 19,89 0,00 13,12 64,45
%Adventícia GS 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,017 GRT 24,46 25,67 0,00 28,50 65,80 GOHB 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 GRT/OHB 4,68 6,35 0,00 2,02 16,07
Teste de comparação múltipla:
Íntima: GS ≠ GRT; GOHB ≠ GRT, GRT/OHB Média: GS≠ GRT; GOHB ≠ GRT, GRT/OHB
Adventícia: GRT ≠ GS, GOHB
Os resultados da Tabela 8 mostram diferenças significantes dos segmentos da parede
venosa: íntima (p = 0,003), camada média (p < 0,001) e adventícia (p = 0,017), entre os
grupos.
Para o segmento da parede venosa íntima houve diferença entre o grupo Radioterapia
e o Simulado, e entre o grupo Oxigenoterapia Hiperbárica com os grupos Radioterapia e
Radioterapia/Oxigenoterapia. A mesma diferença dos grupos em relação à parede venosa
íntima tem ocorrido no segmento da parede venosa da camada média. Já para o segmento
adventícia, houve diferença do grupo Radioterapia com os Simulado e Oxigenoterapia
Hiperbárica.
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32
p = 0,003GSGRTGOHBGRTGOHBGRT/OHB
GS GRT GOHB GRT/OHB
Grupo
0
25
50
75
Veia
s - C
aspa
se (%
) - C
amad
a Ín
tima
Gráfico 16 – Valores percentuais de células caspase positivas na camada íntima das
veias nos diferentes grupos.
GS GRT GOHB GRT/OHB
Grupo
0
25
50
75
Veia
s - C
aspa
se (%
) - C
amad
a M
édia p < 0,001
GSGRTGOHBGRTGOHBGRT/OHB
Gráfico 17 – Valores percentuais de células caspase positivas na camada média das
veias nos diferentes grupos.
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33
p = 0,017GSGRTGOHBGRT
GS GRT GOHB GRT/OHB
Grupo
0
20
40
60
Veia
s - C
aspa
se (%
) - C
amad
a Ad
vent
ícia
Gráfico 18 - Valores percentuais de células caspase positiva na camada adventícia das
veias nos diferentes grupos.
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34
Figura 7 – Fotomicrografia em HE, aumento de 4x onde podemos observar segmento de veia cava e aorta
infra-renal no GS.
Figura 8 – Fotomicrografia em HE de segmento de veia cava, aumento de 40x, onde podemos observar a
ausência alterações no GOHB.
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35
Figura 9 – Fotomicrografia em HE de segmento de veia cava, aumento de 40x, onde podemos observar
lesão nas camadas íntima, média e adventícia no GRT.
Figura 10 - Fotomicrografia em HE de segmento de veia cava, aumento de 40x, onde podemos observar
áreas de ausência de endotélio no GRT.
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36
Figura 11 - Fotomicrografia em HE do segmento de aorta, aumento de 40x onde podemos observar as 3
camadas sem alterações no GOHB.
Figura 12 – Fotomicrografia em HE do segmento de aorta, aumento de 40x, onde podemos observar a
tumefação da vaso-vasorum na camada adventícia do GRT.
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37
Figura 13 – Fotomicrografia em HE do segmento de aorta, aumento de 40x, onde podemos observar a
normalidade da vasa-vasorum na camada adventícia do GRT/OHB.
Figura 14 – Fotomicrografia em AgNOR do segmento de veia cava, aumento de 100x, no GRT, onde
podemos observar a escassez de NORs nas suas distintas camadas.
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38
Figura 15 – Fotomicrografia em AgNOR do segmento de veia cava, aumento de 100x, no GRT/OHB,
onde podemos observar o aumento do número de NORs nas camadas íntima e média.
Figura 16 - Fotomicrografia em AgNOR do segmento de aorta, aumento de 100x, no GRT, onde
podemos observar a escassez do número de NORs nas suas distintas camadas.
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39
Figura 17 – Fotomicrografia em AgNOR do segmento de aorta, aumento de 100x, no GRT/OHB, onde
podemos observar o aumento do número de NORs na camada média.
Figura 18 – Fotomicrografia do segmento de veia cava do GS, onde podemos observar a escassez de
células coradas em castanho expressando a positividade à caspase-3. (Imuno-histoquímica - 40x).
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40
Figura 19 – Fotomicrografia do segmento de veia cava do GOHB, onde podemos observar a escassez de
células coradas em castanho expressando a positividade a caspase-3.(Imuno-histoquímica - 40x).
Figura 20 – Fotomicrografia do segmento de veia cava do GRT, onde podemos observar a presença de
células caspase positivas coradas em castanho nas camadas íntima, média e adventícia. (Imuno-histoquímica – 40x).
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41
Figura 21 – Fotomicrografia do segmento de veia cava do GRT/OHB, onde podemos observar a escassez
de células coradas em castanho expressando a positividade a caspase-3. (Imuno-histoquímica – 40x).
Figura 22 – Fotomicrografia do segmento de Aorta do GS, onde não se observa células coradas em
castanho expressando a positividade a caspase-3 nas camadas íntima média e adventícia. (Imuno-histoquímica – 40x).
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42
Figura 23 – Fotomicrografia do segmento de Aorta do GOHB, onde podemos observar a escassez de
células em castanho caspase positivas. (Imuno-histoquímca – 40x).
Figura 24 – Fotomicrografia do segmento de Aorta do GRT, onde podemos observar a presença de
células coradas em castanho caspase positivas nas camadas íntima e média. (Imuno-histoquímica – 40x).
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43
Figura 25 - Fotomicrografia do segmento de Aorta do GRT, onde podemos observar a presença de
células castanhas caspase positivas. (Imuno-histoquímica – 40x).
Figura 26- Fotomicrografia do segmento de Aorta do GRT, onde podemos observar a presença de células
castanhas caspase positivas na camada adventícia, inclusive na vasa-vasorum. (Imuno-histoquímica - 40x).
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44
Figura 27 – Fotomicrografia do segmento de Aorta do GRT/OHB, onde se pode observar intensa
vacuolização e escassas células castanhas caspase positivas. (Imuno-histoquímica - 40x).
Figura 28 – Fotomicrografia do segmento de Aorta do GRT/OHB, onde podemos observar escassas
células castanhas caspase positivas nas distintas camadas da artéria. (Imuno-histoquímica – 40x).
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5. DISCUSSÃO
A utilização da radioterapia em doenças oncológicas é baseada no princípio de que as
altas taxas de mitoses das células tumorais as tornam mais susceptíveis às mudanças
estruturais moleculares induzidas pela radiação ionizante, levando estas à morte por necrose30.
O grande desafio da radioterapia é encontrar o ponto de equilíbrio entre a destruição
das células tumorais e preservação das normais3.
As células neoplásicas devido à maior atividade mitótica ficam mais sensíveis às
variações energéticas que as células maduras e quiescentes. No entanto as células não
neoplásicas, também são afetadas e acabam por sofrer igualmente os efeitos da radiação e
podem evoluir com necrose30,31.
Tanto artérias como as veias, nos diferentes diâmetros e localizações, são passíveis de
serem acometidos pelos efeitos da radiação ionizante, sendo que o dano vascular será
diretamente proporcional ao tempo e a dose de radioterapia instituídos10.
As lesões radio induzidas nas artérias e veias de grande calibre, podem ser
classificadas em precoces (até seis meses após a radioterapia) ou tardias (após seis meses da
radioterapia). Em artérias acometidas na fase precoce, as células endoteliais são as mais
acometidas, no entanto, as repercussões hemodinâmicas são mínimas, uma vez que sua parede
apresenta uma estrutura muito forte, mas em fase tardia, essa exposição do espaço
subendotelial irá induzir um processo de aterosclerose extremamente intenso e agressivo10. As
camadas médias e adventícias apresentam menos lesões em fase precoce, porém quando
ocorrem, poderão ser seguidas de ruptura ou trombose10.
Já as veias de médio e grande calibre, apesar de apresentarem maior resistência que as
de pequeno calibre, também podem ser acometidas pela radiação ionizante tanto em fase
precoce, através de descolamento endotelial e posterior trombose (menos freqüente), quanto
em fase tardia, quando podem vir a apresentar fibrose intimal, estenoses ou oclusão10,32.
O tratamento das lesões actínicas em vasos ainda hoje é controverso. Apesar dos
avanços tecnológicos da última década e o advento das técnicas endovasculares que em muito
tem contribuído para o tratamento dessas afecções, muitos casos continuam a desafiar a
perícia do mais experiente cirurgião vascular, sendo os resultados em algumas situações
desastrosos para o paciente33,34.
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46
Uma maneira de se avaliar o comprometimento celular causado pela radiação
ionizante seria através da análise do ciclo celular pela quantificação das regiões organizadoras
de nucléolos (NORs)17,35. Os NORs são regiões do DNA localizados nos nucléolos que
possuem genes para transcrição do DNA ribossômico (rDNA). Esses genes são responsáveis
pela transcrição do acido ribonucléico (rRNA) e são desta maneira envolvidos na síntese de
ribossomas. Nas células normais (na fase de interfase), os NORs estão exclusivamente
agregados aos nucléolos. A prata reage seletivamente com proteínas ácidas não histônicas,
ricas em grupos sulfídricos e dissulfetos, que por sua vez reduzem os íons de prata, sendo
possível observar na óptica como agregados negros no interior dos núcleos e nucléolos. Seu
tamanho e número podem refletir a proliferação e a transformação celular36,37.
Cada ponto manchado pela prata corresponde, no nível ultra estrutural, em um centro
fibrilar com a associação de componentes fibrilares densos. Esses centros fibrilares e no
componente fibrilar denso do nucléolo, encontram-se as mesmas proteínas que são
encontradas exclusivamente nos NORs. Assim, durante a interfase, os NORs correspondem
aos centros fibrilares e estão associados aos componentes fibrilares densos36. A região
controladora de nucléolos (AgNOR) é um marcador desta duplicação celular, dependente de
várias proteínas que formam os ribossomas38-41.
Dois métodos têm sido utilizados para realizar a análise quantitativa de proteínas
AgNORs: o método de contagem e o método morfométrico. O método de contagem consiste
na enumeração de cada ponto impregnado por célula, diretamente em um microscópio com
magnificação de cem vezes; a vantagem deste método é que o mesmo é de fácil execução e
baixo custo. O método morfométrico consiste na mensuração automática ou semi-automática
da área ocupada por estruturas impregnadas pela prata dentro do contorno nuclear, através de
uma análise de imagem acoplada ao computador. Apesar de ser necessária tecnologia
apurada, optou-se por esse método a fim de se avaliar as eventuais alterações no ciclo celular,
individualmente em cada distinta camada do segmento de veia cava e aorta abdominal
acometidos pela radiação ionizante e também após receberem oxigenação hiperbárica, por ser
mais rápido, preciso e objetivo35.
A morte celular por necrose é caracterizada por uma resposta a um agente lesivo que
compromete a membrana plasmática. A resposta do organismo à agressão é traduzida por
uma reação inflamatória, que levará no estágio final à reparação ou à cicatrização tecidual7.
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47
O tecido necrótico será reposto por células de mesma natureza (reparação) ou por
células fibróticas (cicatrização), na dependência da intensidade, tempo de ação, virulência do
agente agressor ou da natureza da célula atingida6.
O processo natural de homeostase, associado à renovação celular, está relacionado ao
mecanismo conhecido por morte celular programada ou apoptose6,7.
O fenômeno de apoptose é um processo de morte celular que foi reconhecido em
1972, devido a sua morfologia distinta e foi assim denominada seguindo o temo grego “cair
fora”. È uma forma de morte celular destinada a eliminar células indesejáveis do hospedeiro
através da ativação de uma série coordenada e programada de eventos executados por um
conjunto de produtos gênicos. A sua ocorrência pode se dar nos seguintes contextos gerais: 1-
durante o desenvolvimento embriológico, 2- como um mecanismo homeostático para manter
as populações celulares nos tecidos, 3- como um mecanismo de defesa (reações imunes), 4-
quando as células são lesadas por uma doença ou agentes nocivos e 5- no envelhecimento13,14.
O processo de apoptose está associado a inúmeros processos fisiológicos, adaptativos
e patológicos. Está especialmente ligada aos fenômenos de morte celular em tumores, mais
frequentemente na fase de regressão e excepcionalmente na fase de proliferação e deleção
celular em populações de células em proliferação42,43.
Estímulos nocivos como calor, quimioterápicos e radiação ionizante podem induzir
apoptose se forem de grau leve, mas em altas doses os mesmos estímulos resultam em morte
celular necrótica43.
As seguintes características morfológicas, algumas bem estabelecidas à microscopia
eletrônica, caracterizam as células que sofrem apoptose: retração celular, condensação da
cromatina sob a membrana nuclear, formação de bolhas citoplasmáticas e corpúsculos
apoptóticos e fagocitose das células ou dos corpúsculos apoptóticos42.
O processo de apoptose é o ponto final de uma cascata dependente de energia de
eventos moleculares, desencadeadas por certos estímulos. Consiste em quatro componentes
distinguíveis: vias sinalizadoras (desencadeiam a apoptose), controle e integração (moléculas
reguladoras que inibem, estimulam ou antecipam a apoptose e assim, determinam o
prognóstico), fase de execução comum (onde estão envolvidas as proteases do grupo das
caspases) e remoção das células mortas7,18,42.
Dentre as vias sinalizadoras é conhecida a chamada sinalização intracelular, que exclui
a ação de agentes físico-químicos como o calor e a radiação ionizante18.
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48
O estágio de controle e integração é mediado por proteínas especificas que conectam
os sinais de morte ao programa de execução. A identificação destas proteínas é importante,
pois, sua existência implica em uma determinação de que a morte celular é inevitável. As
oncoproteinas da família Bel-2 são monitores importantes no acompanhamento e
monitorização de doenças neoplásicas ou a estímulos sabidamente lesivos7,18,42.
A fase de execução é a parte final do processo. Uma cascata de proteólise, que está
ligada a todas as formas de apoptose, é mediada pela família das caspases, que abrange mais
de dez membros. Elas existem como zimogênios e ao sofrerem clivagem coloca em
movimento um processo de ativação rápida e seqüencial. O alvo da ativação das caspases no
núcleo inclui proteínas envolvidas na transcrição, replicação do DNA, e no reparo do DNA. A
caspase-3 em particular converte uma DNase citoplasmática em uma forma ativa por
clivagem de um inibidor de enzima, resultando na clivagem internucleossômica típica do
DNA7,18,42.
A remoção das células mortas se faz por fagocitose de modo eficiente, sem deixar
vestígios e praticamente não há atividade inflamatória21.
A exposição das células à radiação ou quimioterápicos induz apoptose por um
mecanismo que é desencadeado por lesão do DNA (estresse genotóxico), envolvendo um
gene supressor tumoral p53. O gene acumula-se quando o DNA é lesado e interrompe o ciclo
celular (na fase G1), para conceder tempo adicional ao reparo. Contudo, se o processo de
reparação falha, o p53 desencadeia apoptose. Desse modo, o gene p53 normalmente estimula
o processo de apoptose; quando sofre mutação ou está ausente, favorece a sobrevida celular.
O mecanismo pelo qual a lesão do DNA recruta os efetores da morte distal aos das caspases é
complexo, mas sua função está bem caracterizada na regulação da transcrição do DNA7,18,42.
Considerando o exposto, realizou-se a correlação da ocorrência de apoptose, sua
monitorização para fins prognósticos ou terapêuticos, com as lesões actínicas que atingem
órgãos vizinhos a áreas tumorais irradiadas, comprometendo a qualidade de vida do paciente,
e agravamento do quadro geral da doença.
Partindo-se do referencial teórico da potencial avaliação da atividade celular pelo
AgNOR, da apoptose em estruturas vasculares e do referencial empírico da lesão actínica em
vasos, o modelo experimental proposto verificou a correlação entre o ciclo celular e o índice
de apoptose nas distintas camadas da veia cava e aorta infra-renal submetidas a radiação
ionizante, bem como suas alterações morfológicas.
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49
Concomitantemente agregou-se ao projeto uma opção terapêutica: a oxigenoterapia
hiperbárica (OHB), que por suas características teóricas de modo de ação poderia proteger
estas células das camadas vasculares dos efeitos nocivos da radiação16,21,35.
A OHB provoca aumento nas taxas de oxigenação tecidual e já foi utilizada
concomitante às aplicações de radioterapia, pois amplifica em duas ou três vezes seu efeito
nos tecidos tumorais, induzindo a um aumento da lesão celular produzida pelos radicais livres
e maior efetividade do tratamento, no entanto, também aumenta as lesões nas estruturas
adjacentes, sendo este o motivo de sua utilização apenas no período pós-exposição à radiação
ionizante6, 7,31.
Para o modelo animal de doença foi escolhido o rato. Um levantamento nas bases de
dados da Biblioteca de Medicina incluindo a Medline (National Library of Medicine – USA),
Lilacs (Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciências da Saúde), SciELO (Scientific
Eletronic Library Online) e Biblioteca Cochrane (The Cochrane Database of Systematic
Reviews) sobre as seis espécies animais mais comumente citadas, num período de quatro
anos, mostraram que nas quatro bases de dados, o rato é o animal mais usado em pesquisa,
seguidos pelo camundongo, coelho, cão, suínos e primatas. Cerca de 85% dos artigos da
Medline e 70,5%% dos artigos da Lilacs são referentes a ratos e camundongos44.
A escolha do rato como animal de experimentação deveu-se também ao fato de que
seu pequeno porte permite fácil manipulação e baixo custo de manutenção. É resistente a
infecções, agressões externas e oferece facilidade no controle de parâmetros biológicos 19,45.
Os dados da tabela 1 mostram que a amostra foi homogênea quanto aos pesos iniciais
dos animais. A tabela 2 mostra que ao final dos procedimentos, no momento da eutanásia, o
grupo Simulado e OHB, mantiveram seus pesos, enquanto os dos grupos RT e RT/OHB
diminuíram significativamente seus pesos iniciais. Este fato deve-se as alterações do trato
gastrintestinais e conseqüente desidratação a que esses grupos previamente irradiados
apresentaram.
Os animais dos grupos RT e RT/HBO foram submetidos à anestesia para cada sessão
de radioterapia. O procedimento anestésico com o uso de zolazepam associada à tiletamina e
analgesia com cloridrato de petidina promoveu anestesia e analgesia, que se iniciou após 2 a 4
minutos e manteve-se por aproximadamente 2 horas após a administração. Não há na
literatura consultada referência sobre a eventual interferência da anestesia em procedimentos
de radioterapia ou oxigenação hiperbárica. Não houve nenhuma alteração significativa em
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50
parâmetros vitais dos animais com hipotermia, hipotensão ou depressão respiratória. O
mesmo procedimento foi utilizado em todos os grupos e, portanto uniforme nas suas eventuais
influências nos parâmetros avaliados.
O modelo de indução de lesão actínica vascular procurou simular uma situação que
ocorre em seres humanos que necessitam ser submetido à radioterapia para tratamento de
tumores pélvicos. Foi estabelecido um paralelo entre a dose empregada de radiação e a
distância do órgão alvo. O modelo foi reforçado por relatos que estimam em 5% o risco de
desenvolvimento de complicações em 5 anos com dose total entre 60 a 65 Gy , embora outros
já refiram aparecimento de lesão com o uso de 10 Gy. A escolha da dose usada foi semelhante
a trabalho em ratos que realizaram OHB para tratamento de lesões actínicas em outros órgãos,
simulando situações de tratamento de tumores pélvicos40,45,47.
A radioterapia em máquina de ortovoltagem produziu um feixe direcional de baixa
energia e penetração tecidual. A baixa energia linear transferida tem indicação para uso em
alvos superficiais30,31.
A intensidade do feixe de radiação respeitou a lei do quadrado da distância onde: “a
intensidade do feixe decresce proporcionalmente ao quadrado da distância da fonte”. Através
da utilização das tabelas de dose de padrão nominal48 e da porcentagem de dose profunda 49
foi realizado cálculo para atingir uma dose total de 60 Gy na superfície do animal e de 54 Gy
no segmento de aorta e veia cava infra-renal. A tabela de dose padrão nominal relacionou a
dose, o tempo de exposição e o fracionamento da dose com o número de exposições por
semana.
Definiu-se, desse modo o fracionamento das aplicações em 8 sessões de 5 Gy, três por
semana, para atingir dose total de 60 Gy.
A tabela de porcentagem de dose profunda determinou, de acordo com a camada
semicondutora utilizada, qual a quantidade atingiria o órgão alvo que se encontrava a
aproximadamente 1cm da superfície abdominal do animal. A taxa de dose foi de 90,6% da
dose total de 60 Gy aplicada, ou seja, 54 Gy.
O procedimento de radioterapia foi realmente efetivo uma vez que em alguns, talvez
com maior radiossensibilidade, desenvolveram uma radiodermite traduzida por lesões
erosivas na pele da parede abdominal, dentro da área compreendida pela “janela” de
irradiação (Figura 4 – Protocolo IV – Apêndice).
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51
Um dos animais do grupo radioterapia (RT) apresentou durante o período de
observação sinais de comprometimento pulmonar (pneumonia), evoluindo a óbito, sendo que
a necropsia não revelou outros sinais de lesão orgânica.
Para a OHB foi utilizada câmara hiperbárica de acrílico para animais de pequeno
porte50, que mantinha os animais sem necessidade de anestesia ou analgesia em condições
adequadas para receber oxigênio a 100% em 3 ATA, sem intercorrências na fase de
compressão ou descompressão47. Sua utilização foi observada em ratos submetidos à lesão de
isquemia e reperfusão, demonstrando a prevenção da ocorrência de lesão de mucosa
intestinal, quando aplicada durante a isquemia51e também um efeito protetor nas lesões radio
induzidas no colon e vesícula urinária35,47.
A avaliação da lesão actínica vascular em aorta e veia cava foi basicamente realizada
pelo estudo morfológico e morfométrico, uma que vez que no momento do ato operatório para
retirada das peças não foi possível notar alterações macroscópicas nos animais irradiados
(grupos RT e RT/OHB).
O procedimento convencional de coloração das lâminas histológicas pela hemotoxilina
e eosina permitiu avaliar de forma qualitativa as estruturas das camadas dos vasos: intima
média e adventícia52.
Os animais do grupo simulado (GS) estabeleceram o padrão de normalidade dentro da
amostra escolhida (figura 7). Por orientação estatística e seguindo os preceitos da Comissão
de Ética, que sugere a utilização do menor número de animais possível, foram alocados três
animais no grupo.
Os animais do grupo oxigenoterapia hiperbárica (GOHB), tiveram descrição
histológica semelhante ao grupo de animais normais (GS). A OHB não provocou alterações
estruturais apreciáveis à microscopia de luz (figuras 8 e 11).
Nos animais do grupo radioterapia (GRT), observamos em veia cava: na camada
íntima ausência de endotélio ocorreu significativamente (figura 9 e 10); nas camadas médias e
adventícias, não se observou outras alterações morfológicas. Já em Aorta, no GRT, não
observamos alterações morfológicas significativas em camada íntima e media, no entanto em
adventícia, notamos o comprometimento significativo da vasa-vasorum (figura 12).
A avaliação dos animais submetidos à radioterapia e oxigenoterapia hiperbárica
(RT/OHB) quanto aos aspectos histológicos mostrou que na veia cava, apesar de uma
tendência a melhora no descolamento endotelial, este não foi evidenciado de maneira
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significativa (tabela 3), provavelmente devido ao tamanho da amostra. Já em Aorta, houve
uma recuperação estatisticamente muito significativa da vasa-vasorum, na camada adventícia
(figura 13), (tabela 4).
A interpretação provável é que a OHB promoveu de algum modo uma melhora na
evolução das lesões actínicas dos vasos submetidos à radiação ionizante. O mecanismo de
ação deste efeito protetor da OHB neste caso pode ser devido a vaso dilatação causada pela
liberação de oxido nítrico endógeno. A hiperóxia em condições hiperbáricas ativa a óxido
nítrico sintetase (NOS) e também favorecem a recuperação mais rápida dos estágios
inflamatórios nas distintas camadas dos vasos, uma vez que a oxigenação hiperbárica modula
a atividade dos neutrófilos53,54.
A ampliação da pesquisa para períodos de observação maiores e dos parâmetros de
avaliação quantitativas destas alterações morfológicas permitirá estabelecer uma relação mais
clara de causa e efeito entre a OHB e a lesão actínica em vasos de grande calibre.
Quando avaliamos o ciclo celular, utilizando o método do AgNOR, tivemos no grupo
simulado o padrão de normalidade em contagem de NORs, tanto em artérias quanto em veia,
situação semelhante que ocorreu no grupo OHB. O grupo apenas irradiado teve diminuição
significativa do ciclo celular nas camadas íntima, média e adventícia, tanto em artérias quanto
em veias (figuras 14 e 16), sendo que no grupo RT/OHB houve sempre uma tendência a um
aumento de ciclo celular, apesar de ter sido significativo do ponto de vista estatístico apenas
na camada média das artérias (figuras 15 e 17), (tabelas 5 e 6).
A avaliação da caspase -3 para estabelecer um índice apoptótico baseou-se nas
evidências de que a radiação, além de promover a morte celular por necrose, também está
associada à morte celular programada pela clivagem do DNA. O processo de apoptose foi
determinado por ensaio imuno-histoquímico que é procedimento padronizado e
industrializado com alto grau de confiabilidade e especificidade55,56.
O endotélio vascular tem índices de apoptose muito baixo, tanto em artérias quanto em
veias, quando comparado a outros órgãos. Isso pode ser explicado devido aos riscos que a
morte celular endotelial em grande escala, com conseqüente exposição do espaço
subendotelial, implicar em aumento da ocorrência de aterosclerose e de trombose venosa por
alteração da “Tríade de Virchow”57.
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53
A radioterapia seria um dos fatores de aumento dos índices de apoptose, não somente
no endotélio, mas também na camada média e adventícia de artérias e veias, sendo este o
provável motivo das lesões agudas e crônicas que podem se instalar nesses vasos58.
Os animais o grupo simulado e, portanto animais normais, bem como os animais do
grupo oxigenoterapia hiperbárica, apresentaram índices muito baixos de apoptose em todas as
camadas dos vasos (veia cava e aorta), o que era esperado, pois em condições normais esta
não ocorre em grande escala (figuras 18, 19, 22 e 23).
Os animais submetidos à radiação houve sempre um aumento significativo dos índices
de apoptose tanto nas veias quanto nas artérias (coloração castanha típica do método), nas
camadas íntima, média e adventícia (figuras 20, 24, 25 e 26).
Já no grupo radioterapia e oxigenoterapia hiperbárica (GRT/OHB), houve diminuição
significativa dos índices de apoptose nas camadas íntimas e médias das artérias (aorta),
mostrando uma recuperação próxima aos padrões fisiológicos (figuras 27 e 28), (tabela 7).
Considerando a análise dos resultados obtidos, podemos perceber que o modelo de
lesão actínica em veia cava e aorta proposto foi adequada para o estudo e pode ser utilizado
em outros protocolos de pesquisa.
Apesar de apresentar uma tendência a melhora em todos os parâmetros analisados
nesse estudo, a veia cava não apresentou de maneira significativa os benefícios esperados
após a OHB. O motivo dessa pouca resposta observada, provavelmente deve-se a maior
fragilidade da estrutura da veia e conseqüente maior intensidade das lesões, bem como o curto
período de observação (figuras 20 e 21), (tabela 8).
Contrapondo-se aos achados em veias cava, as aortas apresentaram significativa
melhora dos aspectos morfológicos em sua vasa-vasorum, ciclo celular na camada média e
diminuição dos índices de apoptose nas camadas endotelial e média.
A oxigenoterapia hiperbárica mostrou uma participação benéfica, que deve ser melhor
explorada em estudos futuros das lesões radio induzidas em vasos, sobretudo em artérias,
onde estes efeitos parecem ser mais significativos.
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6. CONCLUSÕES 1. A oxigenoterapia hiperbárica preserva a vasa vasorum da camada adventícia,
restabelece o ciclo celular avaliado através do número de NORs na camada média e
diminui o processo de apoptose nas camadas íntima e média das artérias submetidas a
radiação ionizante.
2. O índice de apoptose, o ciclo celular e as alterações morfológicas das distintas
camadas das veias lesadas pela radiação ionizante não é alterado pela oxigenoterapia
hiperbárica.
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APÊNDICE PROTOCOLO I OPERAÇÃO Data do procedimento: Identificação do animal: Número: Grupo: Peso: Anestesia: Droga: zoletil (zolazepam + tiletamina) Dose: 50 mg/kg Via: intramuscular Início: Analgesia: Droga: dolossal (cloreto de petidina) Dose: 0,2mg/kg Descrição do ato operatório: Início: Término: Intercorrências:
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Recuperação anestésica: PROTOCOLO II OXIGENOTERAPIA HIPERBÁRICA Data do procedimento: Identificação do animal: Número: Grupo: Peso: Dia de exposição: Tempo de compressão: Valores pressóricos: Tempo de exposição: Tempo de descompressão: Intercorrências:
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PROTOCOLO III RADIOTERAPIA Data do procedimento: Identificação do animal: Número: Grupo: Peso: Anestesia: Droga: zoletil (zolazepam + tiletamina) Dose: 50 mg/kg-¹ Via: intramuscular Início: Analgesia: Droga: dolossal (cloreto de petidina) Dose: 0,2mg/kg-¹ Transporte: Tempo: Intercorrências: Exposição:
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Dia: Tempo: Dose: Intercorrências: PROTOCOLO IV OBSRVAÇÃO PÓS-RADIAÇÃO Data do procedimento: Identificação do animal: Número: Grupo: Dia de observação: Diarréia: Presente ( ) Ausente ( ) Sangue ( ) Muco ( ) Intercorrências:
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