efectos d la proteina bcl2
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PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
EFECTOS DE LA PROTEÍNA bcl-2 SOBRE LOS PARÁMETROS
DE ENVEJECIMIENTO CELULAR EN FIBROBLASTOS DE
PULMÓN DE RATONES VIEJOS.
ALUMNA: RIVERA MARTÍNEZ LIDIA PAOLA
ASESOR: MINA KONIGSBERG FAINSTEIN.
2003-I
2
INDICE1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………..3
1.1 ENVEJECIMIENTO CELULAR………………………………………………..3
1.2 PROLIFERACION CELULAR Y SENESCENCIA REPLICATIVA…….…..4
1.3 LA PROTEÍNA Bcl-2…………………………………….……………………….6
1.4 CONTENIDO DE LA PROTEÍNA Bcl-2 EN LOS
ORGANISMOS ENVEJECIDOS……………………………………………….8
2. JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………………....9
3. HIPÓTESIS…………………………………………………………………………..9
4. OBJETIVO GENERAL……………………………………………………………..9
4.1OBJETIVOS PARTICULARES…………………………………………………..10
5. METODOLOGÍA………………………………………………..…………………..11
5.1 OBTENCION DEL CULTIVO PRIMARIO…………………..…………………11
5.2 SOBREEXPRESION DE LA PROTEÍNA Bcl-2………………………………12
5.3 OBTENCION DE LOS PLÁSMIDOS…………………………………………..13
5.4 CO-TRANSFECCIÓN…………………………………………………………….18
5.5 NFECCIÓN…………………………………………………………………………20
6. SEMBRADO DE CÉLULAS PARA LAS DETERMINACIONES
A LO LARGO DEL TIEMPO DE CULTIVO…………………………………….21
7. PARÁMETROS DE ENVEJECIMIENTO……………………………………….23
7.1 PROLIFERACIÓN CELULAR…………………………………………………..23
7.2 FUNCIONALIDAD CELULAR………………………………………………….23
7.3 CUANTIFICACIÓN DE LA SENESCENCIA EN LAS CÉLULAS
DE CULTIVO PRIMARIO………………………………………………………24
8. RESULTADOS………………………………………………………………………26
9. DISCUSION Y CONCLUSION……………………………………………………33
10. REFERENCIAS……………………………………………………………………36
11. AGRADECIMIENTOS…………………………………………………………….38
3
Efecto de la proteína Bcl2 sobre los parámetros de
envejecimiento celular en cultivos primarios de fibroblastos
de pulmón de ratones viejos.
1. INTRODUCCIÓN
1.1 ENVEJECIMIENTO CELULAR
El proceso de envejecimiento es un fenómeno biológico complejo e
inevitable, que se relaciona con la pérdida o el decaimiento de varias
funciones bioquímicas, estructurales y fisiológicas del organismo que
conducen a la morbilidad y a la mortalidad. (Kirkwood, 1989).
Existen varias hipótesis que tratan de explicar el envejecimiento, sin
embargo, ninguna de ellas explica todas las causas del fenómeno. Al
parecer el envejecimiento es un proceso multifactorial controlado por una
combinación de factores genéticos y ambientales. Por ejemplo, las
hipótesis moleculares proponen que la duración de la vida de cualquier
especie está gobernada por genes que interactúan con los factores
ambientales. Las hipótesis sistémicas atribuyen el envejecimiento de todo
un organismo, al decremento de la función de un sistema clave, como
puede ser el nervioso, el endócrino o el inmunológico. Las teorías celulares
del envejecimiento, relacionan los cambios en la estructura y en la función
de las células al paso del tiempo, bajo la influencia de factores
ambientales. (Timiras, 1997).
En 1956, Harman propuso la hipótesis del envejecimiento por radicales
libres, basada en el deterioro celular, la cual dice que el envejecimiento
resulta de los efectos nocivos generados por los radicales libres que se
producen en el curso del metabolismo celular normal y que son acumulados
a lo largo de toda la vida de un organismo .
Los radicales libres son moléculas que tienen uno o más electrones
desapareados y se producen continuamente en el metabolismo aeróbico de
4
manera normal, o de manera exógena por la radiación ionizante y
sustancias químicas. Los radicales libres pueden dañar las células a
diferentes niveles (ADN, proteínas, membranas, etc.). Sin embargo, existen
mecanismos de defensa en las células ante el daño que ellos producen.
Tales mecanismos constan de moléculas antioxidantes y/o atrapadores de
radicales libres.
De acuerdo con la hipótesis de Harman, las células que provienen de
animales viejos deben haber acumulado mayor daño al ADN en
comparación con las células provenientes de animales jóvenes. En la
actualidad esta hipótesis es aceptada y apoyada por una gran cantidad de
científicos, ya que explica muchos de los cambios degenerativos asociados
con el envejecimiento (Melov, 2000), y cuenta con evidencia experimental.
(Liu, et. al., 1999).
1.2 PROLIFERACION CELULAR Y SENESCENCIA REPLICATIVA
Hasta la mitad del siglo pasado se pensó que las células en cultivo se
dividían indefinidamente si las condiciones del medio permanecían
optimas (Carrel, 1912). Sin embargo, los experimentos realizados por
Hayfilck y Moorehead en 1961, trabajando con fibroblastos humanos,
demostraron que después de un número finito de divisiones celulares, las
células dejan de dividirse y entran en una fase que se conoce como
senescencia replicativa. En 1995 se tuvo la primera evidencia directa de
la existencia de células senescentes in vivo en dermis de humano,
utilizando un ensayo histoquímico para -galactosidasa (Dimri, et al.
1995). La característica primordial de este estado, es que cesa totalmente
la proliferación celular, aún ante estímulos mitogénicos. Sin embargo, las
células se mantienen metabolitamente activas y detenidas de manera
irreversible en la fase G0 o G1 del ciclo celular (Lunderberg, et al.2000;
Chen, et al. 2000). Las células senescentes muestran cambios selectivos
en la expresión génica. Este cambio les da un fenotipo alterado que es
5
dependiente del tipo celular (Campisi, 1997). Cabe aclarar que la
senescencia sólo se observa en organismos pluricelulares y en células que
tienen potencial para el recambio (Faragher et al. 2000). Por el aumento de
las células senescentes encontradas al final de la vida de los cultivos,
Hayflick propuso que la senescencia puede contribuir al envejecimiento en
el organismo. Para tratar de explicar la existencia de las células
senescentes, se ha sugerido un mecanismo de antagonismo pleiotrópico
(un efecto que proporciona un beneficio a corto plazo y un daño a más
largo plazo) (Campisi, 1997), que dice que la aparición lenta de estas
células desde el inicio de la vida, protege al organismo de desarrollar un
cáncer u otra alteración. Al incrementarse la edad del organismo, aumenta
la presencia de las células senescentes, esto modifica el microambiente
celular y por tanto la función de las células no senescentes. Este estado
alterado puede contribuir al envejecimiento y al desarrollo del cáncer.
Se ha propuesto que la senescencia replicativa pueda deberse, a que en
cada duplicación celular los telómeros se van acortando y ello da lugar a
que exista una señalización celular que indique el cese en la duplicación
(Hayflick, 1977). Se han estudiado muchos tipos celulares de diferentes
especies de animales y se ha determinado el límite replicativo en cada
caso. Así mismo, se ha reportado que in vivo, el fenómeno de senescencia
replicativa se lleva a cabo de una manera similar a la que se describió para
los cultivos primarios, por lo que se piensa que en un tejido in vivo pueden
convivir células senescentes y presenescentes al mismo tiempo (Campisi,
1997).
Se ha demostrado que algunas enzimas dependientes del ciclo celular,
como por ejemplo las proteínas p21, p16 y p53 entre otras, muestran
actividades disminuidas o sobre reguladas (Chen et al., 2000). Esto podría
estar relacionado con el hecho de que al entrar en senescencia, las células
se quedan detenidas en la fase G1 del ciclo celular (Lundberg et al., 2000).
Se ha sugerido que la senescencia de las células normales puede
contribuir al envejecimiento en el organismo in vivo (Hayflick, 1997),
6
debido a que el fenómeno de envejecimiento involucra una serie de
procesos que incluyen factores internos y externos que dañan a la célula, y
esta como respuesta a dichos daños puede entrar en senescencia. Esto
último, es un proceso inevitable en los seres vivos, ya que existe una
disminución en las funciones fisiológicas que conducen a la muerte
(Kirkwood, 1989). El hecho de que las células senescentes tengan sus
funciones alteradas conduce a un deterioro gradual que se relaciona con el
envejecimiento.
1.3 LA PROTEÍNA Bcl-2
La proteína Bcl-2, se identifica como una proteína reguladora de la
apoptosis (muerte celular programada). Se ha observado que cuando
forma homodímeros presenta función antiapoptótica, mientras que cuando
forma heterodímeros con la proteína proapoptótica Bax, promueve la
apoptosis (Reed, 1997).
La proteína Bcl-2 fue descubierta en linfomas de células B en folículo
humano, en la translocación intercromosomal t (14 y 18) que yuxtapone el
de gen bcl-2 con el locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina (Ig)
(Warner, et al. 1997), (McDonell, et al. 1989). Tiene un peso molecular de
26 KDa, 205 aminoácidos (Bcl-2b) o 239 aminoácidos (Bcl-2a), y su
extremo amino terminal es hidrofóbico por lo que se encuentra anclada en
la membrana mitocondrial, nuclear y del retículo endoplásmico (Bakhshi
et al. 1985), con orientación hacia el citosol (Hockenbery, 1993).
Además de su papel antiapóptico, se sabe que protege ante el estrés
oxidativo, aunque el mecanismo por el cual lo hace no es bien conocido. Se
ha propuesto que su efecto sea prooxidante, antioxidante y/o de
reparación.
Existen varios investigadores que se han encargado del estudio de esta
proteína, aunque aún hay controversias al respecto. Por mencionar a
7
algunos, tenemos que en el año de 1993, Hockenbery reporto un papel
regulador para Bcl-2 en la vía antioxidante en los sitios donde son
generadas las especies reactivas de oxígeno (ERO) (Hockenbery, 1993). En
ese mismo año, Kane, propuso que el producto del protooncogene bcl-2,
fuera una molécula antiapoptótica, ya que observó una reducción en la
producción de los intermediarios reactivos de oxígeno (Kane, et. al. 1993).
Sin embargo, Steinman en el mismo año, estudiando células B en una
línea murina de cultivos transfectados con bcl-2, encontró que existía
generación de especies reactivas de oxígeno que inducían una respuesta
antioxidante por lo que él propuso que la función de Bcl-2 fuera
prooxidante (Steinman, 1993).
La función antioxidante de Bcl-2 fue apoyada por Myers en 1995, ya que
observó que confería protección a cultivos de células neuronales en
cuanto a la lipoperoxidación membranas plasmáticas (Myers, et. al. 1995).
Un año después, Richter en 1996 propuso, que Bcl-2 podría ser un vínculo
entre el sistema de defensa antioxidante, el Ca2+ y el potencial de
membrana (Richter et. al; 1996). En 1997 Longo publicó datos que
apoyaban la actividad antioxidante de Bcl-2, ya que reportaban un
aumento en la enzima catalasa en Saccharomyces cerevisiae, cuando se
sobreexpresaba bcl-2 (Longo et. al., 1997). En 1998 Hochman, trabajando
con animales knockout de bcl-2 encontró que en el cerebro de este tipo de
ratones, había proteínas oxidadas en mayor proporción que en animales
que podían expresar esta proteína, por lo que sus resultados mostraron
una elevación en el estrés oxidativo y niveles alterados de antioxidantes,
sugiriendo que Bcl-2 incrementa la producción de ERO (Hochman et. al.,
1998). En 1999, se puso en auge la investigación de dicha proteína, por lo
que Degli reportó resultados que sugerían que Bcl-2 incrementa las
defensas antioxidantes y neutraliza la sobreproducción de moléculas que
estimulan la muerte celular como TNF-α o ceramida (Degli, 1999). Por su
parte, Esteve observó que Bcl-2 inhibía la apoptosis en ausencia de
productos reactivos de oxígeno lo que indica multifuncionalidad de esta
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molécula (Esteve, et. al; 1999). Por último, Deng reporto que Bcl-2 está
también involucrado en la regulación de la expresión o función de enzimas
de reparación, además que poder evitar rompimientos de las hebras del
ADN (Deng, et. al; 1999).
Todo lo anterior demuestra que aún no se tiene claro el mecanismo de
acción de Bcl-2, por lo que es importante entender la relación entre
envejecimiento y apoptosis. El conocer los mecanismos del daño oxidativo
al ADN y la participación antioxidativa de Bcl-2, son críticos para la
comprensión de los mecanismos involucrados en las enfermedades
asociadas con el envejecimiento celular, como son las enfermedades
neurodegenerativas de Parkinson, Huntintong, esclerosis lateral,
Alzheimer, enfermedades cardiovasculares como la ateroesclerosis,
disminución del sistema inmune (por la muerte de linfocitos T), cáncer,
etc. (Warner, et al, 1997). Por lo que es importante encontrar un
tratamiento para tales enfermedades, debido a que son poco conocidos los
mecanismos por los cuales la proteína Bcl-2 protege al ADN y su relación
con el envejecimiento celular.
1.4 CONTENIDO DE LA PROTEÍNA Bcl-2 EN LOS ORGANISMOS
ENVEJECIDOS
Se han realizado pocos estudios para determinar la presencia de la
proteína Bcl-2 en tejidos de mamíferos. En 1994 Migheli y colaboradores
reportaron un aumento en la expresión de la proteína Bcl-2 en cerebros
envejecidos de rata, y propusieron que el incremento puede ser el reflejo de
un mecanismo de protección contra las ERO. (Migheli, 1994)
En otros estudios, se compararon linfocitos humanos de individuos
jóvenes (menos de 35 años) y de individuos viejos (más de 60 años) y se
encontró una correlación entre el aumento en la expresión de Bcl-2 y la
edad avanzada del paciente (Schindowski et al. 2000).
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En trabajos previos del laboratorio se ha encontrado que Bcl-2 aumenta
con la edad en pulmón de ratón de la cepa CD1.
2. JUSTIFICACIÓN
El poder emplear el modelo in vitro de cultivo primario de fibroblastos de
ratón proporciona una herramienta útil que permite obtener información
valiosa permitiendo tener conocimiento sobre los mecanismos del
envejecimiento y la relación de este con la senescencia celular así como el
comportamiento de los mismos mediante la sobreexpresión de la proteína
Bcl-2. Estos conocimientos permitirán una mejor comprensión para
desarrollar tratamientos específicos en las enfermedades relacionadas al
envejecimiento e incluso el cáncer, debido a que el fenómeno de
senescencia es considerado como un mecanismo para la supresión de
tumores (Campisi, 1997).
3. HIPÓTESIS
Si la sobreexpresión de la proteína Bcl-2 retrasa la entrada a la
senescencia en las células de cultivo primario, se espera encontrar
un aumento en la funcionalidad y proliferación de dichas células en
comparación con las que no sobreexpresen Bcl-2.
4. Objetivo General.
v Determinar el efecto de la sobre-expresión de la proteína Bcl2 sobre
los parámetros de envejecimiento celular en fibroblastos de pulmón
de ratones viejos.
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4.1 Objetivos Particulares.
v Realizar cultivos primarios de pulmones de ratones viejos de la cepa
CD1.
v Preparar partículas que contengan la información para
sobreexpresar bcl2, mediante la técnica de cotransfección de fosfato
de Ca2+ de los plásmidos PCLNRX-GFPN, PCLNRX-GFPN-Bcl2 y pcl-
Eco a células empaquetadoras 293 T.
v Infectar los cultivos primarios con las partículas virales para que
sobre-expresen bcl2.
v Determinar microscópicamente la presencia del plásmido infectado,
gracias a la fluorescencia de la proteína reportera GFP.
v Cuantificar la presencia de la enzima -galacatosidasa como
parámetro de senescencia.
v Cuantificar la funcionalidad mitocondrial de las células infectadas y
control, mediante la técnica de MTT.
v Medir la proliferación de las células infectadas y control.
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5. METODOLOGÍA
5.1 OBTENCION DEL CULTIVO PRIMARIO
Para este estudio, se utilizó como modelo experimental el cultivo primario
de fibroblastos de pulmón de ratón, que se ha reportado como un modelo
adecuado para el estudio de dicho fenómeno (Campisi, 2000).
Primeramente se establecieron los cultivos primarios, para lo cual se
utilizaron ratones hembras de pie de cría provenientes de la cepa CD-1 de
12 meses de edad. Los animales mostraban un fenotipo envejecido como lo
es la falta de tono muscular, caída de pelo, acumulación de grasa y en
alguno de ellos, la aparición de tumores.
1. Todos los ratones fueron sacrificados mediante dislocación médulo-
encefálica.
2. Los pulmones se extrajeron mediante incisión toráxica.
3. El de pulmón se colocó en cajas Petri estériles que contenían 25ml
de PBS que es una solución amortiguadora libre de fosfatos
(Sigma), con 1% de antibiótico antimicótico (Gibco).
4. El tejido se lavó 2 veces con la solución anterior, aspirando el PBS
con una jeringa para evitar la perdida del tejido. Se disgregó el
tejido con un bisturí y unas pinzas, lo más finamente posible.
5. Se quito el PBS y se agregaron 5ml de tripsina-EDTA 0.25% (Sigma)
y se metió a la incubadora por 10min, a 37° C.
6. La tripsina fue aspirada con una jeringa. Se lavó 2 veces más el
tejido con la solución de PBS y aspirando el PBS con una jeringa,
para evitar la perdida de tejido.
7. Los fragmentos del tejido se transfirieron a tubos Falcon que
contenían 7ml de colagenasa 1.A (Sigma) al 0.03% en Medio
Esencial Mínimo modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma) sin
suero fetal bovino (SFB).
8. Los tubos se colocaron en la incubadora a 37° C durante 60 min.
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9. Pasado ese tiempo, se le agregó a cada tubo 30ml de DMEM
suplementado con 15% de suero fetal bovino inactivado (SFB)
(Hyclone).
10. La suspensión se homogenizó vigorosamente utilizando una pipeta
de vidrio.
11. La suspensión celular se distribuyó homogéneamente en cajas
Petri de 60mm de diámetro.
12. El establecimiento de las primeras células (cuando éstas
permanecieron viables y adheridas al sustrato), fue entre 4 y 6 días
después de la obtención del cultivo.
13. Los cultivos se mantuvieron en una atmósfera con 5% de CO2 y
90% de humedad a 37° C de temperatura.
14. El medio se cambió cada 3 o 4 días, durante el tiempo de vida del
cultivo.
5.2 SOBREEXPRESION DE LA PROTEÍNA Bcl-2
Para lograr la sobreexpresión de la proteína Bcl-2 en los cultivos primarios
de fibroblastos de pulmón de ratón, se utilizó un vector retroviral, se
introdujo un gen no viral (bcl-2) y el gen de una proteína fluorescente (gfp),
que permite observar la inserción del gen en nuestros cultivos.
Para ello, primero se amplificaron los plásmidos de interés, posteriormente
se realizó una cotransfección de dichos plásmidos en las células
empaquetadoras 293T. A partir de las cuales se obtuvieron las partículas
virales para infectar a los cultivos primarios.
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5.3 OBTENCION DE LOS PLÁSMIDOS
Se amplificaron 3 plásmidos: PCLNRX-GFPN, que contiene la información
para la proteína verde fluorescente (GFP); PCLNRX-GFPN-Bcl2, que
además de contener a la proteína GFP, también contenía el gen que
codifica para la proteína Bcl-2; y el plásmido pclEco que contiene la
información estructural para la cápside del virus.
1. Transformación:
Se transformaron bacterias E.coli de la cepa Mn522 y DH5 con los
plásmidos antes mencionados.
La inserción del plásmido en las bacterias se logró a través de choque
térmico.
1. Para ello se prendió el baño a 42° C.
2. Se prepararon 2 tubos falcon de 15ml estériles con 20 µl de agua
estéril, se agregó 1 l de plásmido.
3. Las bacterias fueron resuspendidas con cuidado y se agregó 100µl
de bacterias a cada tubo y se resuspendió todo, esta mezcla fue
incubada en hielo por 10 minutos.
4. Posteriormente se mantuvieron a 42° C de 30 a 60 segundos.
5. Pasado ese tiempo se adiciono 1ml de medio LB sin bactoagar (medio
LB: 1L de agua, 10g de triptona, 5g de NaCl, 5g de extracto de
levadura y 1ml de NaOH 1N), para hacer crecer las bacterias, en
agitación a 37° C durante 1 o 2 horas.
6. Se prepararon dos placas de medio LB con bactoagar, (medio LB con
bactoagar: 1L de agua, 15g de bactoagar, 10g de triptona, 5g de
NaCl, 5g de extracto de levadura y 1ml de NaOH 1N una que
contenía ampicilina (200-250 µg/ml) y otra con las mismas
características pero sin ampicilina que nos sirvió como control, ya
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que las bacterias que introducen el plásmido adquieren resistencia
a la ampicilina.
7. Una vez solidificado el bactoagar, en esterilidad con un mechero,
fueron sembradas las bacterias en una dilución 1:100, en LB sin
bactoagar de manera que se generaran colonias discretas. Para ello
se dejaron incubar por 12 horas a 37° C y posteriormente se
pasaron a refrigeración.
8. Ya obtenidas las colonias, se inoculo una colonia bacteriana
transformada en 3ml de medio LB suplementado con ampicilina
(100µl/ml).
9. Se dejó crecer el cultivo durante toda la noche a 37° C en agitación
constante.
A partir de aquí se prosiguió a realizar la técnica de lisis alcalina para
obtener el plásmido.
2. Purificación del ADN plasmídico por lisis alcalina con SDS:
Se utilizo la técnica de lisis alcalina en combinación con el detergente SDS,
para aislar el ADN plasmídico de E.coli (Sambrook, 2001). Se expuso la
suspensión bacteriana a un detergente aniónico con un pH alto que abre
la pared celular, desnaturalizando el ADN cromosomal y las proteínas,
permitiendo la salida del ADN plasmídico hacia el sobrenadante. La
solución alcalina rompe completamente la unión entre los pares de bases
del ADN genómico, sin embargo, las hebras del ADN plasmídico por ser
circular no se alteran ya que estas se encuentran topológicamente
entrelazadas.
Soluciones:
2ml de la solución GTE: 50mM glucosa, 25mM Tris-HCl, pH 8.0, 10mM
EDTA, pH 8.0
10ml de solución TE: 10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA, pH 8.0
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2ml de solución NaOH/SDS: 0.2N NaOH, 1% SDS
1. Se tomaron 1.5ml del cultivo bacteriano en un tubo Eppendorf
estéril de 1.5ml.
2. Se centrifugó a 14,000rpm por 20 seg. en una microcentrífuga
marca eppendorf a temperatura ambiente.
3. El sobrenadante se decanto y el pellet se resuspendió en 100µl de
la solución GTE.
4. Se agregaron 200µl de una solución recién preparada de
NaOH/SDS y se mezclo por inversión.
5. Se paso a hielo frape durante 5 minutos y se agregaron 200µl de
acetato de sodio 5M, pH 8.0, manteniéndolo en hielo 5 minutos,
formándose un precipitado denso.
6. Se agito en vortex 2 segundos y se regreso al hielo 5 minutos.
7. El tubo fue centrifugado a 14,000 rpm durante 3 minutos a TA.
8. El sobrenadante fue recuperado en un tubo nuevo y se agregaron
0.8ml de etanol absoluto, agitándolo por inversión.
9. Se mantuvo a -70° C por 10 minutos.
10. Se centrifugó a 14,000 rpm por 10 minutos a TA.
11. El sobrenadante se decanto y el pellet fue lavado con 1ml de etanol
al 70%.
12. Se centrifugó a 14,000 rpm por 5 minutos a TA.
13. El sobrenadante se decanto y se resuspendió el pellet en 30µl de
TE, pH 8.0
14. Se cuantificó la concentración de ADN obtenido por
espectrofotometría (absorbancia 260-280nm), utilizando 2µl del
plásmido y 298 µl de H2O.
15. El plásmido se guardó a -20° C.
Otra forma de cuantificar el plásmido fue corriendo una electroforesis en
un gel de agrosa al 0.8% y 2µl de bromuro de etidio, esto es también para
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asegurar que fuera el plásmido de nuestro interés. Para ello se digirió el
plásmido con las enzimas de restricción con que fue manipulado
anteriormente.
1. Se preparó una cámara de electroforesis con un gel de agarosa al
0.8%, en donde se pusieron 0.2gr de agarosa y se le adicionaron
25ml de TBE 0.5X (para un litro de TBE 5X: 0.5 M ácido bórico
30.9g/l, PM 61.8; 0.5M Tris base 60.5g/l, PM 121.1 y 10mM EDTA
3.73g/l, PM 372.2).
2. Se disolvió la agarosa calentando en un horno de microondas
aproximadamente 40 segundos, y se le agregaron 2µl de bromuro
de etidio, se dejo enfriar la agarosa hasta que se soporto la
temperatura al toque con la palma de la mano y se vació en el
contenedor del gel.
3. Se agregó la solución de TBE 0.5X a la cámara, en suficiente
cantidad hasta que se cubrió el gel.
4. En seguida se prepararon las muestras de los plásmidos de la
siguiente manera.
5. Para Bcl-2 en el tubo 1(plásmido digerido): se tomaron 2µl del
plásmido de Bcl-2, se agregó 1µl de la enzima EcoRI, 1µl de buffer
H y 6µl de agua, para llevarlo a 10 µl.
6. El tubo 2 (plásmido sin digerir): se agregó 2 µl del plásmido de Bcl-
2, se agregó 1µl de buffer H y 7µl de agua, para llevarlo a 10 µl.
7. EL tubo 3 (plásmido sin digerir): se agregó 2 µl del plásmido de Bcl-
2 y 8µl de agua, para llevarlo a 10µl.
8. Para GFP en el tubo 1(plásmido digerido I): se agregó 2µl del
plásmido de Gfp, con 1µl de la enzima Cla-I, 1µl de buffer 1 y 6µl de
agua.
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9. Para el tubo 2 (plásmido digerido II): se agregó 2µl del plásmido de
Gfp, con 1µl de la enzima Xho-I, 1µl de buffer 2 y 6µl de agua.
10. Para el tubo 3 (plásmido digerido): se agregó 2µl del plásmido de
Gfp, con 1µl de la enzima Cla-I, 1µl de buffer 1, 1µl de la enzima
Xho-I, y 5µl de agua.
11. Para el tubo 4 (plásmido sin digerir): se agregó 2µl del plásmido de
Gfp y 8µl de agua.
12. Para pclEco en el tubo 1 (plásmido digerido): se agregó 2µl del
plásmido de pclEco, con 1µl de la enzima XBa-I, 1µl de buffer H y
6µl de agua.
13. Para el tubo 2 (plásmido sin digerir): se agregó 2µl del plásmido de
pclEco, 1µl de buffer H y 7µl de agua.
14. Para el tubo 3 (plásmido sin digerir): se agregó 2µl del plásmido de
pclEco y 8µl de agua.
15. Se usó un marcador de peso molecular llamado λ Hind III
agregando 3µl de este más 3µl de agua y 1µl de LB-ADN que es la
solución de carga para ADN (para 10ml de 6X LB-ADN: 0.25% azul
de bromofenol, PM 691.9; 0.25% xilen cianol FF, PM 538.6 y
glicerol PM 92.09; densidad 92.09).
16. Ya preparado cada tubo de los plásmidos se incubaron a 37° C por
1 hora, esto es para activar la enzima, posteriormente para detener
la reacción se calentaron a 95° C por 5 minutos, en seguida se
metió a enfriar a 4° C por 5 minutos, para desactivar la enzima.
17. Posteriormente se tomaron 5µl de cada tubo y se le agregó 1µl de
LB-DNA, cada muestra se deposito en el gel y se corrió a 100V
aproximadamente 45 min.
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18. Hecha la cuantificación se purificó el plásmido a través de filtros
estériles de 0.22 m de la marca Milliport y entonces se obtuvo el
plásmido puro y estéril para continuar con la transfección del
mismo.
5.4 CO-TRANSFECCIÓN
Los plásmidos fueron introducidos en células empaquetadoras (293-T) a
través de la técnica de fosfato de calcio. Esta técnica permite que la
permeabilidad de la membrana cambie y así se introduzca el plásmido.
Cabe mencionar que fueron insertados dos plásmidos en las células 293 T,
gfp-bcl-2 y el plásmido pclEco. Como control se hizo otro tipo de
cotransfección en la que se usó el plásmido gfp sin bcl-2 y pclEco.
1. Un día antes se sembraron 10 pozos en placas de 6 con 400,000
células de 293T en cada uno.
2. 4 horas antes de la co-transfección se cambio el medio a las células
por medio nuevo sin antibac (DMEM más 15% de SFB).
3. Se preparo solución del kit Calcium phosphate transfection system
(GIBCO BRL) de la técnica de fosfato de calcio para 10 pozos, los
cuales se hicieron para 4 pozos de gfp, 4 pozos para bcl-2 y 2 pozos
control.
4. La solución se hizo con 880µl de agua, 100µl de HSB 10 X y se
vortexeo, más 15 µl de NaOH dando vortex, más 20µl de fosfatos,
volviendo a dar vortex.
5. Ya lista la solución se prepararon 3 tubos 1, de los cuales un tubo
fue para bcl-2 con 400µl de la solución, otro fue para gfp con 400µl
de la solución y el último tubo para el control con 200µl de la
solución.
6. En seguida se prepararon 3 tubos 2, de los cuales uno era para bcl-
2 al que se le agregó 343.2µl de agua, 0.4µl de ADN acarreador,
19
40µl de ADN plasmídico de bcl-2 y 57.12µl de pclEco. (que
corresponde a 5ng de ADN plasmídico para cada uno).
7. Para el tubo 2 de gfp, se agregó 343.2µl de agua, 0.4µl de ADN
acarreador, 57.12µl de ADN plasmídico de gfp y 57.12µl de pclEco.
(que corresponde a 5ng de ADN plasmídico para cada uno).
8. Para el tubo 2 del control, se agregó 2µl de Ca2+ resuspendiendo 5
veces, agregándole 10µl de Ca2+ resuspendiendo nuevamente.
9. Al tubo 2 de bcl-2 se le agregaron 4µl de Ca2+, resuspendiendo 5
veces, mas 20µl de Ca2+, resuspendiendo nuevamente.
10. Al tubo 2 de gfp se le agregaron 4µl de Ca2+, resuspendiendo 5
veces, mas 20µl de Ca2+, resuspendiendo nuevamente.
11. Después cada tubo 1 fue burbujeado con una pipeta pasteur y
goteando con su respectivo tubo 2 lentamente.
12. Para que precipitara se dejo 20 minutos a temperatura ambiente.
13. A 4 pozos se le agrego 185µl de bcl-2, a otros 4 pozos se le agregó
185µl de gfp y a un pozo 185µl de control.
14. Al día siguiente se cambio el medio de cada pozo.
15. A las 48 horas se recogieron las partículas, tomando el
sobrenadante el cual fue centrifugado a 3,000rpm por 5 min. A
temperatura ambiente, de ahí se congelo el sobrenadante a -70° C.
Con ello se obtuvieron en el medio de cultivo los retrovirus conteniendo
los genes de interés, el cual fue recolectado y almacenado a una
temperatura de –70° C para su uso posterior en el cultivo primario.
20
5.5 INFECCIÓN
Una vez establecido el cultivo primario de fibroblastos de pulmón de ratón,
se procedió a realizar la infección de estas células con las partículas virales
obtenidas. Para tener mejores resultados en cuanto a la inserción del
plásmido fue necesario cambiar el medio de cultivo de los pozos 24 hrs.,
antes de realizar la infección.
Se seleccionaron los pozos correspondientes para cada tratamiento, Bcl-2,
GFP y control. Se consideró un volumen total de 1ml para cada pozo, por
lo que se adicionaron 500µl de medio con Polibrent en una concentración
de 2µl/ml de medio y 500µl de partículas virales para las células que
sobreexpresarían la proteína Bcl-2, de igual forma para las células
específicas de GFP (500 µl de medio con polibrent y 500 µl de partículas
virales con el plásmido para la proteína verde fluorescente) y por último a
las células control se les adicionaron 500µl de medio con polibrent y 500µl
de medio. Cabe señalar que el medio utilizado no contenía antibiótico para
asegurar la infección y no estresar más a las células.
Una vez realizada la infección, las células fueron incubadas durante 24
hrs. Pasado este tiempo se retiró el tratamiento y se adicionó nuevamente
medio de cultivo con todos los requerimientos (DMEM más suero fetal
bovino 15%, aminoácidos no esenciales y antibac). Se dejaron incubar
durante 5 días en las mismas condiciones para poder asegurar la
expresión de los genes introducidos en las células. Una vez transcurrido
ese tiempo se prosiguió a realizar los ensayos para determinar los
parámetros de envejecimiento de los fibroblastos tales como: proliferación
celular, senescencia asociada a la enzima β-galactosidasa (SA-β-gal) y
funcionalidad celular.
Para corroborar que el plásmido que contenía los genes bcl-2 y gfp se
encontraban dentro de las células, fueron sembradas 40,000 células de
cada uno de los tratamientos (control, gfp y bcl-2) en laminillas que fueron
21
observadas al microscopio de fluorescencia debido a que las células
infectadas debían fluorescer por la presencia de la proteína GFP, en
comparación con las células control tratadas únicamente con polibrent.
6. SEMBRADO DE CÉLULAS PARA LAS DETERMINACIONES A LO
LARGO DEL TIEMPO DE CULTIVO.
Para los ensayos de proliferación celular, funcionalidad celular y SA- -
galactosidasa, se sembraron aproximadamente 5000 células/pozo en
placas de 48 pozos. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y
en al menos 3 experimentos independientes.
1. Después de 5 ó 6 días de realizados los cultivos primarios, las
células se lavaron cuidadosamente con PBS.
2. Se despegaron agregando 0.3ml de tripsina-EDTA 0.25% (Sigma)
para cada caja petri.
3. Las células se contaron utilizando un hemocitómetro.
4. Se repartieron aproximadamente 5000cels/pozo en placas de 48
pozos para todos los días del experimento.
5. Se realizaron las determinaciones correspondientes cada tercer día.
22
Células control 40 x
Células GFP 40 x EPIFLUORESCENCIA
Células BCL-2 40 x EIPIFLUORESCENCIA
23
7. PARÁMETROS DE ENVEJECIMIENTO.
7.1 PROLIFERACIÓN CELULAR
La proliferación celular se determinó contando células vivas a lo largo del
tiempo de vida de los cultivos, utilizando azul tripano que es un colorante
vital que es excluido activamente de las células vivas. En las células
muertas, el colorante difunde fácilmente hacia el citoplasma (Doyle, et al;
1994). Esta técnica evita contar falsos positivos.
Técnica para determinar la proliferación y la viabilidad celular
1. Las células se lavaron con PBS una vez y se despegaron con 200 l
de tripsina-EDTA 0.25% (Sigma).
2. Para inactivar la enzima se agregaron 200 l de DMEM + Suero de
ternera al 10%.
3. Se tomó una alícuota de 20 l de suspensión celular y 20 l de azul
tripano y se homogenizaron.
4. De esta suspensión se tomaron 10 l y se contaron las células
utilizando un hemocitómetro y un microscopio óptico.
5. El resultado de x de los campos contados se multiplico por 2
(dilución) y ese resultado se multiplico por 1 x 104 células/ml.
7.2 FUNCIONALIDAD CELULAR
Para evaluar la funcionalidad celular, se cuantificó la actividad de la
enzima succinato deshidrogenasa mitocondrial mediante la técnica del 3-
(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil bromuro de tetrazolio (MTT) (Sigma).
Esta enzima participa en la transferencia de electrones en la cadena
respiratoria mitocondrial, reduciendo a la ubiquinona (Konigsberg, 1992).
La enzima que se encuentra en las células funcionales reduce el sustrato
MTT y como resultado se produce formazán de color azul, que se mide
espectrofotométricamente a 570nm (Mosman, 1983).
24
Técnica de la funcionalidad celular (MTT)
1. A las células se les retiró el medio y se lavaron cuidadosamente con
PBS.
2. Se retiró el PBS y se agregó 1ml de solución MTT (Sigma) (0.5mg de
MTT/ml PBS) pH 7.5.
3. Las células se incubaron durante 3 horas a 37° C.
4. Se retiró el MTT y se lavaron las células cuidadosamente con PBS
una vez.
5. Se agregaron 800 l de solución de extracción (HCl 0.04 M en
isopropanol) a cada pozo.
6. Las placas de cultivo se colocaron sobre un plato de agitación
(Thermolyne AROS 160) durante 15 min. a temperatura ambiente
para disolver el formazán.
7. El contenido de cada pozo se depositó en celdas de vidrio para su
lectura a 570nm utilizando un espectrofotómetro (Beckman DU
640).
8. La funcionalidad se determinó normalizando los datos por célula (el
valor de MTT/número de células de la proliferación de ese día).
7.3 CUANTIFICACIÓN DE LA SENESCENCIA EN LAS CÉLULAS DE
CULTIVO PRIMARIO
Como marcador de senescencia se usó el ensayo de -galactosidasa
asociada a la senescencia (SA- -gal). La técnica consiste en la hidrólisis
del reactivo x-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactósido) por la
enzima -galactosidasa cuya presencia se encuentra considerablemente
aumentada en las células envejecidas o con senescencia replicativa. Tras
la reacción se produce un precipitado verde-azul (Dimri, 1995) que se
cuantifica contando las células teñidas con la ayuda de un microscopio
óptico.
25
Técnica de ensayo SA- -gal
1. Se agregaron 300 l de solución fijadora (paraformaldehído 2%,
MgCl2 2mM, EGTA 1.35mM y Buffer piperazina-N, N’-bis (2-etanol-
ácido sulfónico)(PIPES) 0.1M provenientes de soluciones stock a pH
6.9 y pH 8, respectivamente) a cada pozo.
2. Las células se incubaron 1 hora a temperatura ambiente.
3. Pasado ese tiempo se retiró la solución y se lavaron 3 veces con
PBS.
4. Se agregaron 300 l de solución X-gal que contenía 5mM de
K3Fe(CN)6, 5mM de K3Fe(CN)63H2O, 2mM MgCl2 y 1mg/ml de X-gal
(PROMEGA) el pH ajustado a 6.
5. Las células se mantuvieron en incubación a 37°C durante toda la
noche.
6. Al siguiente día se contaron las células teñidas con ayuda de un
microscopio óptico.
26
8. RESULTADOS
OBTENCION DEL CULTIVO PRIMARIO
La obtención de fibroblastos fue básica para la elaboración de la presente
investigación.
SOBREEXPRESION DE LA PROTEÍNA Bcl-2
En primer lugar, cabe aclarar que los plásmidos fueron donados por la
Dra. María del Carmen Aguayo del laboratorio del Dr. Luis Covarrubias.
Para aumentar la cantidad de los mismos fue necesario realizar su
amplificación, utilizando la técnica de lisis alcalina. Una vez aislados los
plásmidos se tomó una muestra de cada uno de ellos y se digirió con las
enzimas correspondientes para saber si el plásmido obtenido era el de
nuestro interés y así mismo cuantificarlo. Para ello se hizo una
electroforesis en gel de agrosa al 0.8 % como se muestra en la figura 1. En
el carril 1 se observa el marcador de peso molecular (λ Hind III); en el carril
3 se encuentra pclEco sin digerir, que es todo el plásmido, en el carril 4 se
muestra pclEco digerido con Xba, que es la enzima que ha cortado el
plásmido para poder identificar el peso molecular para el gen pclEco. El
carril 7 se muestra a gfp cortado con la enzima Xba I y Cla I para
identificar el peso molecular del gen gfp, por último en el carril 8 se
muestra el plásmido gfp sin digerir, por lo cual se puede observar todo el
ADN plasmídico.
27
1 2 3 4 5 6 7 8
Fig. 1
Electroforesis en agarosa al 0.8 % para evidenciar a los plásmidos digeridos con diferentes enzimas
de restricción como aparece en el texto.
PARAMETROS DE ENVEJECIMIENTO
PROLIFERACIÓN CELULAR
En cuanto a la proliferación, en la gráfica 1 podemos observar que la curva
del cultivo control, presenta un periodo de establecimiento a partir del día
7 al 15, después de este y hasta el día 18 comienza a tener un crecimiento
exponencial, después se observa en el día 21 que las células entran en
senescencia y muerte, la que puede apreciarse al presentarse una fase
estacionaria, indicando el cese de la proliferación.
En la misma gráfica se muestra la curva del cultivo infectado con bcl-2,
donde se observa que del día 15 al 21 de cultivo las células presentan un
comportamiento de retardo de crecimiento en comparación con el control,
28
para el día 21 entran en crecimiento exponencial hasta el día 23, para el
día 25 se ve una caída en la proliferación, en la cual las células han
entrado en senescencia.
Mientras para las células gfp que son el control de infección, se puede
observar que a partir del día 15 tienen una proliferación menor que las
infectadas con bcl-2 y a partir del día 21 entran en senescencia.
En cuanto a diferencias estadísticas para el día 15 no hubo diferencia en
cuanto a la proliferación entre el control, gfp y bcl-2. Para el día 18 se
muestra que si hubo diferencia del control con gfp, pero no se mostró
ninguna diferencia con bcl-2 esto indica que la diferencia que se observa
con el control está dada únicamente por la infección. Para el día 21, se
mostró una diferencia entre bcl-2 y gfp con el control, pero no hubo alguna
diferencia entre ellos.
En el día 24 el control muestra una diferencia de proliferación con el grupo
gfp, pero no así con el de bcl-2, aunque si hay diferencia estadística entre
las células infectadas.
En el día 28 tanto las infectadas con bcl-2 como con gfp presentan
diferencia estadística con el control y así mismo se muestra diferencia
entre ellos.
29
PROLIFERACIÓN CELULAR
control
bcl2
gfp
*Diferencia estadística con las células que sobreexpresan gfpp<0.05
Diferencia estadística con el control
0
1
2
3
4
5
6
0 20
40Días de cultivo
Núm.decélulasx10 5
**
**
** **
**
{
{
{
Gráfica 1.
30
FUNCIONALIDAD CELULAR
En la gráfica 2 se muestra la funcionalidad de las células. Estos datos
representan la absorbancia a 570nm por número de célula, además se
normalizaron con el control tomando al día 15 (inicio del experimento)
como el valor de 1.0.
No se observa una mejoría estadística en la funcionalidad de las células
que sobreexpresan bcl-2, pero tampoco un detrimento. Lo mismo ocurre
para las infectadas con gfp.
FUNCIONALIDAD CELULAR
00.5
11.5
22.5
33.5
4
0 5 10 15 20 25 30
Control
bcl2
gfp
Días de cultivo
NormalizadoDO/célula Gráfica 2. Funcionalidad celular por el ensayo
MTT.
31
SENESCENCIA CELULAR
En la gráfica 3 se puede observar que para las células control el número
de células positivas a β-galactosidasa aumenta e manera constante a lo
largo del cultivo. Mientras que para las células infectadas con bcl-2 y gfp
se observa que a los mismos tiempos hay un mayor número de células
positivas a -galactosidasa. Esto es: para el día 15 ambos cultivos
infectados tienen 20% mas de células senescentes que el control para el
mismo día y para el día 18 las células que sobreexpresan gfp tienen 12%
más de células senescentes que el control y las que sobreexpresan bcl-2
tienen 32% mas células senescentes que el control, esta diferencia se
mantiene más o menos estable a lo largo del cultivo, sin embargo, para el
día 28 no hay diferencia con las control.
Al hacer la comparación estadística, se observa que en el día 15 hay una
diferencia significativa de p=0.08 entre las células senescentes que
sobreexpresan bcl-2 y gfp con el control. Mientras que para el día 18 solo
hay diferencia significativa de las que sobreexpresan bcl-2 con el control,
pero no de las que sobreexpresan gfp con el control. Para los días
siguientes no se presenta alguna diferencia entre el control y las células
infectadas.
32
SENESCENCIA ASOCIADA A LA β-GALACTOSIDASA80
control
bcl2
gfp
*{ Diferencia estadística con las células que sobreexpresan gfp
p<0.05
Diferencia estadística con el control
010
203040
5060
70
0 10 20 30Días de cultivo
%decélulassenescente
**
*
*
Gráfica 3.
33
9. DISCUSION Y CONCLUSION
Para iniciarla discusión me gustaría aclarar que el trabajar con ratones
viejos es difícil, puesto que en primer lugar hay que esperar a que
envejezcan. En segundo lugar, los cultivos de fibroblastos de pulmón de
ratón que se obtienen cuentan con pocas células, ya que están muy
dañadas y se mueren, además de que son muy susceptibles a
contaminarse.
Con respecto al manejo de los plásmidos y su amplificación, se obtuvieron
con éxito los plásmidos aislados para poder formar las partículas virales y
sebreexpresar las proteínas en los cultivos primarios.
En la gráfica 4 podemos apreciar el comportamiento que tienen las células
controles de cultivos primarios de fibroblastos de ratones viejos como de
jóvenes. En ella se puede observar la diferencia de proliferación entre una
población y otra. Las células jóvenes presentan una mayor proliferación en
comparación con las células viejas. Además, en esta misma gráfica se
observa disminuida la proliferación en el cultivo de las células infectadas
en comparación con el control. Al comparar bcl-2 con su control de
infección gfp se puede apreciar una ligera protección que es mínima sí se
compara con las células sin infectar.
Los cultivos de fibroblastos de ratones viejos tienen un deterioro mayor,
además que al momento de realizar la infección las células se dañan aún
más, provocando que muchas células no resistan. Las que resistieron se
34
mantuvieron más o menos estables, por lo que se puede decir que bcl-2
trató de proteger a las células pero no revirtió el daño que ya tienen.
Analizando lo obtenido para las células control en proliferación,
funcionalidad y senescencia celular, se observa que efectivamente cuando
las células entran en senescencia son alteradas sus funciones fisiológicas
y su capacidad proliferativa cesa, como algunos investigadores han
propuesto (Campisi, 2000; Lundberg et al., 2000).
En cuanto al comportamiento de las células infectadas, podemos decir que
hay un impacto en las células, provocándoles un daño mayor. Pero a pesar
de eso, pudimos observar que en la proliferación al sobreexpresar la
proteína bcl-2 se tiene un pequeño efecto de protección, pero que después
decae. Por lo que se puede decir, que bcl-2 no retarda la entrada a la
senescencia, ya que esta proteína se presenta a lo largo del cultivo de una
manera constante, por lo cual no se encontró un aumento en la
funcionalidad.
Como se mostró en las gráficas anteriores, las células infectadas con bcl2
trataron de proliferar, pero debido a la infección las células sufrieron un
daño y estrés por lo que ya no crecieron lo necesario, así que bcl2
proporciono un pequeño efecto protector por un tiempo, pero después
decayó.
35
7 9 13 15
Días de cultivo
1711 19 21 2523 27
0
1
2
3No.decélulas x105
29 31
bcl2
gfp
Gráfica 4. Control de cultivo control de viejas y jóvenes se puede observar el comportamiento de lascélulas jóvenes y las células viejas sin infectar.
jóvenes
viejas
36
10. REFERENCIAS
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v A mi esposo.
v M. en C. Mina Konigsberg Faisntein.
v M. En B.E. Norma Edith Guerrero-Díaz López.
v Biol. Exp. Ma. Cristina Aguilar Calles.
v Dr. Pablo Damian Matsumura.
v M.V.Z. Rocio Vieria.
v CONACYT 400200-5-J34194-M