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「文京区３大学 新技術説明会」 2011年10月27日

貴金属ナノ粒子を利用した光学的測定法の高感度化

～異方性金属微粒子による表面増強分析法～

Surface Analytical Techniques Based on Anisotropic Metal Nanoparticles

東洋大学 生命科学部 生命科学科 教授 竹井弘之

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紹介内容

目的： 光学的分析法の高感度化 原理： 固相化貴金属微粒子による励起効率の向上 手段： 量産に適した固相化貴金属微粒子の調製方法 の開発

“光学的分析、測定において

＊感度の向上

＊サンプル量の低減

＊測定装置の小型化

を望まれたことはありませんか？”

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研究背景

貴金属微粒子の光学特性を利用した分析方法が注目を集めている。様々な作製方法が試みられており、サイズ、形状、材質等の制御が可能になりつつある。 ＊表面増強ラマン分光法 ＊表面増強蛍光法 ＊表面増強比色法 への適用が期待されている。 現在入手可能な素材の形態は主に懸濁液であるが、実用化においては固相化微粒子が必要である。

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ご提案内容

近い将来（ニーズがあれば） ＊粒径：30-300 nm ＊元素:真空蒸着もしくは スパッタ可能なもの ＊表面積:100cm2 ＊調製可能数量：100枚/週

表面増強分析法に適した貴金属 微粒子の評価用サンプルを提供いたします。 現時点における仕様 ＊粒径：50-150 nm ＊元素：金、銀、白金、銅 およびそれらの合金 ＊表面積:数cm2 ＊調製可能数量：10枚/週

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背景：貴金属製のナノスケール凹凸構造を有する基板上に検体を滴下し、光学的に分析すると信号強度が増強する効果。 原理：基板を照射すると、凹凸構造近傍に「近接場光」と呼ばれる強い非伝播型電磁波が発生する。凹凸構造表面に吸着した分子は、数桁以上強い近接場光に励起されることになる。

基板

励起光

信号

基板

従来の測定 表面増強測定

表面増強法とは？

検体 近接場

vs.

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金コロイド 金属蒸着

加熱

基板

吸着

アニーリング法 吸着法 電子線描画法

従来技術とその問題点

従来技術における問題点

アニーリング法：均一な微粒子ができず、光学特性の最適化が困難。

吸着法：高濃度のコロイド懸濁液が必要であり、消耗品が高価。

電子線描画法：高額な製造設備が必要で、量産に不適。

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シリカ、ポリスチレン 粒子(30-300 nm)

異方形状 金属微粒子

金属蒸着 (5-160 nm)

基板

固相化された均一な微粒子の調製が可能

SEM像 2μ m

1 cm

面積が数 cm2 金微粒子

新規作製方法

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銀を真空蒸着

① ② ③ ④

銀微粒子

③

金属マスク

例：銀微粒子とシリカ粒子③

金薄膜（20 nm）

４種類の比較用サンプルを作製

本命

比較用サンプルの作製

表面 増強ラマン

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銀薄膜(80 nm)

基板

金薄膜(20 nm)

シリカ粒子(100 nm)

銀(80 nm)

金薄膜(20 nm)

２ヵ所で測定

金属微粒子が非常に有効

ラマンシフト (cm-1)

信号強度

コントロール実験

表面 増強ラマン

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同じサンプルにおける異なる領域（４ヶ所）

信号の均一性は、銀微粒子特性および測定対象分子の 吸着量の均一性に依存すると考えられる

信号強度はほぼ同等

信号強度

均一性の確認

表面 増強ラマン

ラマンシフト (cm-1)

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Ag 160 nm 10 mM

1 mM

100 μM

10 μM

信号強度

測定条件： 励起波長 514. 5 nm 励起光強度 500 μ W 対物レンズ倍率 100倍露光時間 3 x 5 秒

本条件における検出限界は100μ M弱

Ag 80 nm Ag 40 nm Ag 20 nm

その他の蒸着厚

R 6 G濃度への依存性

表面 増強ラマン

R 6 G: rhodamine 6 G （モデル分子）

ラマンシフト (cm-1)

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Ag 160 nm

60

,000

150 nm

100 nm

50 nm

粒径50 nmよりも、100 nmもしくは150 nmが望ましい

粒径への依存性

表面 増強ラマン

ラマンシフト (cm-1)

Ag 80 nm

60

,000

ラマンシフト (cm-1)

Ag 40 nm

60

,000

ラマンシフト (cm-1)

50 nm

100 nm Ag 20 nm

60

,000

ラマンシフト (cm-1)

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100522 No02Ag40nmOnSiO2

100nm(80K) 100522 No04Ag80nmOnSiO2

100nm(80K)

100522 No11Ag160nmOnSiO2

100nm(80K)

40 nm Ag/100 nm 粒子 80 nm Ag/100 nm 粒子 160 nm Ag/100 nm 粒子

100522 No18Ag80nmOnSiO2

50nmR6G10mM(80K)

100522 No20Ag80nmOnSiO2

150nmR6G10mM(80K)

80 nm Ag/50 nm 粒子 80 nm Ag/150 nm 粒子

蒸着厚と微粒子の形態

表面 増強ラマン

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ガラススライド

金薄膜(20 nm)

シリカ粒子(100 nm)

銀(160 nm)

ガラススライド

金薄膜(20 nm)

シリカ粒子(100 nm)

金(160 nm)

プロトコール：微粒子を10 mM のrhodamine 6 G メタノール液に10分間浸漬。大気中で乾燥。 測定条件： 堀場製作所HR 800 励起波長 514. 5 nm 光強度 50 μ W 対物レンズ倍率 100倍 露光時間 3 x 5 秒

信号強度

銀微粒子が14.7 倍有効（1644.7cm-1ピークを判定基準とする）

信号強度の比較：銀 vs.金

表面 増強ラマン

ラマンシフト (cm-1)

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100714

No03R6G10mMDippAg60nmAu2-5-

10nmSiO2100nm 3 MONTHS

100714

No07R6G10mMDippAg60nmAu2-5-

10nmSiO2100nm FRESH

信号強度

信号強度

2,0

00

2,0

00

表面増強法を広めるためには安定化が必須であるが、現状

では、数日から数週間の“賞味期限”が一般的。硫化、酸化が

原因とされているが、防ぐことは可能か。 →金薄膜で保護？

作製数日後 作製３ヵ月後

保護膜の効果はあり

金薄膜 （2,5,10 nm）

2 nm

10 nm

5 nm

金保護膜により若干信号が下がるが、

銀粒子の安定化（３か月が目標）

表面 増強ラマン

ラマンシフト (cm-1)

ラマンシフト (cm-1)

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表面増強比色法：原理

Y Y Y Y

Y Y Y Y

ALP修飾二次抗体

アッセイのイメージ

金ナノ粒子

不溶性生成物

堆積した不溶性生成物

金微粒子の色が変化

5 mm

表面 増強比色法

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比色法の高感度化 Time Course Change of the Spectrum

(25 nm Au at x 200 Dilution)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

400 500 600 700 800 900 1000

Wavelength (nm)

O.D

.

ALP Reaction on Plane Au Film

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

400 500 600 700 800 900 1000

Wavelength (nm)

O.D

.

金微粒子のスペ クトルが変化

金薄膜上における スペクトル変化 （コントロール）

波長 (nm)

ΔO.D.=0.8

ΔO.D.=0.19

４倍程増大

表面 増強比色法

波長 (nm)

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表面増強蛍光法：イムノアッセイ

Y Y Y Y

Il-6に対するアッセイ

Control

Il-6 濃度(pg/ml)

蛍光信号強度（a.

u.）

RPE修飾二次抗体

抗Il-6 一次抗体

Il-6

銀微粒子 （粒径100 nm）

ガラス基板

表面 増強蛍光

RPE: 蛍光性タンパク質の一種

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10000

2000

400

0

Bare

Con

cen

tratio

n o

f RP

E / n

g/m

l

比較対象

Polymer surface (Nunc)

(1)

Polymer surface

Polymer surface

(2)

(3)

(4)

Gold (10 nm)

Silver (10 nm)

Polystyrene spheres

(108 nm)

Polymer surface

Gold

(10nm)

Polymer surface

Gold

(10nm)

Silver (10nm)

Controls

蛍光イメージ 本方式 Polystyrene spheres

(108 nm)

励起波長 543 nm 検出波長 570 nm Perkin Elmer Scan Array Light

Y Y Y Y

表面増強蛍光法：比較

表面 増強蛍光

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まとめ

ラマン分光法：低分子の同定 （原料の品質管理、環境モニタリング） 比色法：ALP、POD等の酵素反応を 用いた検査方法の高感度化・定量化 （臨床検査、環境モニタリング） 蛍光測定法：蛍光物質もしくは、 蛍光ラベルで標識された検体の 検出（臨床検査、環境モニタリング）

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新技術の特徴・従来技術との比較

理想 アニーリング法 吸着法 電子線描画法 本方式

粒子密度 ◎ ◎ ○ ○ ◎

均一性 ◎ × ○ ◎ ◎

性能 ◎ × △ ◎ ◎

作製の手間 ◎ ◎ ○ × ◎

粒子サイズ 40-100 nm

数10nm 数10nm 数10nm 30-300 nm

“高性能、簡単、安い”の三拍子

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実用化に向けた課題

• 特定応用に対する微粒子の物性の最適化

• 表面のコーティング

• 大手企業（分析関連）: 環境モニタリング

システムヘの導入

• 大手企業（食品）: 原料分析

• 分析センター：新メニューの導入

• 開発型中小企業 : 簡易分析装置の開発

企業への期待

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本技術に関する知的財産権

• 発明１の名称 ：金属・誘電体多孔質膜構造による比色アッセイ法の高感度化

• 出願番号 ：出願済

• 出願人 ：東洋大学

• 発明者 ：竹井弘之

• 発明２の名称 ：高感度分析方法のマルチ化

• 出願番号 ：出願済

• 出願人 ：東洋大学

• 発明者 ：竹井弘之

• 発明３の名称 ：フラクタル構造によるラマン増強効果用基板

• 出願番号 ：出願済

• 出願人 ：東洋大学

• 発明者 ：竹井弘之

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お問い合わせ先

東洋大学

知的財産・産学連携推進センター（研究協力課）

ＴＥＬ 03-3945-7564

ＦＡＸ 03-3945-7906

e-mail ml-chizai＠toyo.jp