高速溶媒抽出装置を用いた迅速前処理から...
TRANSCRIPT
The world leader in serving science
サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社 クロマトグラフィー&MS事業部 マーケティング部 高原 健太郎
高速溶媒抽出装置を用いた迅速前処理から、Orbitrap質量分析計 による高精度測定まで ~様々な化学特性の化合物の前処理・分離・検出~
2
技術革新のリーダーシップ
• 質量分析計
• 液体クロマトグラフィー
• 分光法
研究・発見 生産 特別診断
• タンパク質サンプル前処理
• ラボ用消耗品
• 化学研究(研究試薬)
• シングルユースバイオプロセス技術
• セルファクトリー
• 次世代シーケンス
システム
• 定量PCR
• キャピラリー
電気泳動
• 細胞生物学
• 分子生物学試薬
• 血清・培地
• クロマトグラフィー
• がん
• 感染症
• バイオマーカー
• 移植
• 微生物学
• アレルギー
お客様の革新を加速する独自の能力
応用分野
• 法医学(DNA鑑定)
• 動物医療
• フードセーフティ
• 環境
3
Chromatography & Mass Spectrometry
Mass Spectrometry
Column
HPLC
Chromatography & Mass Spectrometry
Accelerated Solvent Extractor
(ASE)
Ion chromatograph Charged Aerosol Detector (CAD)
Solid Phase Extraction
(SPE)
4
固液抽出
サンプル分析
前処理 分離 検出 サンプル
固相抽出
紫外可視吸収
蛍光
電気化学
電気伝導度
荷電化粒子
質量分析
分析対象を検出しやすい状態へ
・抽出
・精製・分画
・濃縮
固体
液体
十分な前処理・分離 ⇔ 検出器の選択性・感度
・分析対象数(ターゲット or ノンターゲット)
・測定の信頼性、再現性、スループットを考慮
気体
混合物から分離
クロマトグラフィー
移動相と固定相による分離 ・液体(LC)
・イオンクロマトグラフィー(IC)
・ガス(GC)
・超臨界流体(SFC)
電気泳動
濃度に応じたシグナルを検出
液液抽出(分液)
5
サーモフィッシャーが提供するソリューション
固体
気体
液体
液液抽出(試薬)
固相抽出
高速溶媒抽出
(ASE)
・ 逆相
・ HILIC
・ SEC
・ イオン交換
・ アフィニティ
LC(装置・カラム) 紫外可視吸収、蛍光
電気化学、電気伝導度
荷電化粒子
MS
・四重極・イオントラップ
・フーリエ変換
前処理 分離 検出 サンプル
濃縮
(Orbitarp)
IC(装置・カラム)
GC(装置・カラム)
6
分析を始める前に… ~分析のための情報収集~
分析対象化合物は? 標的あり
ワイドターゲット
ノンターゲット
過去の知見(論文)は? ・ サンプル情報、化合物情報、分析機器情報
・既存メソッドのトレース
・既存メソッドの編集
分析条件の新規検討
・前処理
・分離
・検出
標的の化学特性を大まかに設定 (指標となる化合物を設定)
情報あり 情報なし
類似物質の情報は?
情報なし
情報あり
紙媒体での情報管理
情報源までの距離(引用、孫引き)
分析メソッド移管の煩雑さ
7
AppsLab Library: https://appslab.thermoscientific.com/
目的の分析手法に迅速・手軽にたどり着く
8
AppsLab Library を用いた分析メソッド取得の流れ
一般の検索エンジンと
同様の使い勝手
クロマトグラムと分析条件
拡大・縮小・注釈表示
前処理・消耗品・分析装置・ 分析条件などの詳細情報
eWorkflowによる分析条件
のダウンロード
そのまま分析
9
• Chromelon Chromatography Data System (CDS)とは
• クロマトグラフィー/質量分析装置の制御、処理、およびデータ管理を行うソフトウェア(マルチベンダー対応)
• クロマトグラフィーのデータ解析を簡便化する数々の機能
ミニプロット、分離シュミレーション、カスタマイズレポート、eWorkflow など
• マルチネットワーク(ワークステーションから遠隔操作、サーバーでデータ管理)
eWorkflow
• eWorkflowに含まれる情報
• 分析から解析までの条件(装置メソッド、シークエンス、データ解析、レポート)
• 任意のファイル(word, text, pdfなど) ⇒ SOPや関連資料
数クリックで解析開始 ⇒ 迅速・ヒューマンエラーの軽減
効率的な分析メソッドの管理 ⇒ 業務引き継ぎ・共同研究
10
サーモフィッシャーが提供するソリューション
固体
気体
液体
液液抽出(試薬)
固相抽出
高速溶媒抽出
(ASE)
・ 逆相
・ HILIC
・ SEC
・ イオン交換
・ アフィニティ
LC(装置・カラム) 紫外可視吸収、蛍光
電気化学、電気伝導度
荷電化粒子
MS
・四重極・イオントラップ
・フーリエ変換
前処理 分離 検出 サンプル
濃縮
(Orbitarp)
IC(装置・カラム)
GC(装置・カラム)
・AppsLab Library
・Chromeleon
(クロマトグラフィーデータ管理システム)
eWorkflow
11
サンプル前処理の役割
• 抽出 ⇒ 分析対象の獲得
• 精製・分画 ⇒ 妨害物質の除去(クリーンナップ)
• 濃縮 ⇒ 高感度化
固液抽出 ⇒ 固体から溶媒により抽出(抽出&分画)
液液抽出 ⇒ 混じり合わない溶媒(水と非極性有機溶媒など)に対する溶解度
の差で抽出(抽出&分画)
固相抽出 ⇒ 固定相との相互作用により抽出(抽出&精製・分画、濃縮も可能)
代表的な前処理
12
•抽出
• 目的成分の溶媒に対する溶解度
• 抽出効率(サンプルの形状⇒破砕が必要? 静置時間)
•精製・分画
• 液液抽出の場合、100%片方の溶媒に分配されるわけではない
• 固相抽出でどこまで精製するか(条件検討に割く労力)
•濃縮
• Dry-upする場合、目的成分は揮発しないか
• 固相に保持された目的成分を少量溶媒で溶出することで濃縮可
•全体を通して
• 目的成分の安定性(pH、温度、抽出時間)
• 再現できるか?想定するサンプル数を処理できるか?
前処理の考慮すべきこと
13
固相抽出カートリッジの選択
http://www.separatedbyexperience.
com/spe-tool/
https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/
BR20834-sample-preparation-lr.pdf
14
• 試料を抽出用セルロースにセット
• 12-24時間の高温のトルエン/メタノール(95/5) による 抽出
• 100-300 ml の溶媒
• マニュアルでのセットアップが必要
ASE (Accelerated Solvent Extractor: 高速溶媒抽出装置)
• 高圧・高温下により迅速抽出
• 少ない使用溶媒量 (10 ~ 30 mL)
• 簡便な操作と自動化
• 溶媒の大気放出なし ⇒ ドラフト必要なし
固液抽出:ソックスレー抽出
抽出効率良好だが、時間と手間がかかる
固液抽出:高速溶媒抽出法
ASE150
(ワンショット) ASE350(汎用タイプ) 効率的な抽出を迅速・簡便化
15
ASEの装置概略
捕集バイアル
オーブン
抽出セル
ポンプ
N2ガス
抽出溶媒
粉砕した試料をつめる
16
ASEによる測定の流れ
メソッドの設定例
セル温度 静置時間 溶媒量 サイクル パージ時間 100℃ 5 min 10 mL 3 60 sec
捕集バイアル
オーブン
抽出セル
ポンプ
N2ガス
抽出溶媒
①セルの加温
17
ASEによる測定の流れ
メソッドの設定例
セル温度 静置時間 溶媒量 サイクル パージ時間 100℃ 5 min 10 mL 3 60 sec
捕集バイアル
オーブン
抽出セル
ポンプ
N2ガス
抽出溶媒
①セルの加温
②高圧溶媒注入(高温でも溶液)
18
ASEによる測定の流れ
メソッドの設定例
セル温度 静置時間 溶媒量 サイクル パージ時間 100℃ 5 min 10 mL 3 60 sec
捕集バイアル
オーブン
抽出セル
ポンプ
N2ガス
抽出溶媒
①セルの加温
②高圧溶媒注入(高温でも溶液)
③セルを密閉し、静置
19
ASEによる測定の流れ
メソッドの設定例
セル温度 静置時間 溶媒量 サイクル パージ時間 100℃ 5 min 10 mL 3 60 sec
捕集バイアル
オーブン
抽出セル
ポンプ
N2ガス
抽出溶媒
①セルの加温
②高圧溶媒注入(高温でも溶液)
③セルを密閉し、静置
④②、③を繰り返し
20
ASEによる測定の流れ
メソッドの設定例
セル温度 静置時間 溶媒量 サイクル パージ時間 100℃ 5 min 10 mL 3 60 sec
捕集バイアル
オーブン
抽出セル
ポンプ
N2ガス
抽出溶媒
①セルの加温
②高圧溶媒注入(高温でも溶液)
③セルを密閉し、静置
④②、③を繰り返し
⑤スタティックバルブの開放
21
ASEによる測定の流れ
メソッドの設定例
セル温度 静置時間 溶媒量 サイクル パージ時間 100℃ 5 min 10 mL 3 60 sec
捕集バイアル
オーブン
抽出セル
ポンプ
N2ガス
抽出溶媒
①セルの加温
②高圧溶媒注入(高温でも溶液)
③セルを密閉し、静置
④②、③を繰り返し
⑤スタティックバルブの開放
⑥N2ガスでパージ
22
セルで試料と混ぜることでASE抽出を効率化
ASE Prep DE
充填用珪藻土。
試料の乾燥、および粘着などを防止
ASE Prep MAP
吸水ポリマー。湿気のある試料に使用
水分除去(動植物細胞試料など) さらなるクリーンナップ
目的成分を吸着しない担体を混合
⇒ 夾雑成分の除去
吸着剤のラインナップ
23
ASEの拡張性 ~サンプルに特化したメソッドのカスタマイズ~
植物からの過塩素酸塩の選択的抽出時の例
魚粉からのPCB類の選択的抽出時の例
24
ASE Prep DE(珪藻土)への乳製品の流し込み
ASE法
半固体~液体サンプル
乾燥・秤量
ASEのアプリケーション例① 乳製品中の脂肪抽出
25
そのままホモジナイズ
ASE法
生薬、サプリメントサンプル
HPLCによる定量
ASEのアプリケーション例② 天然物からの有効成分の抽出
26
ASEのアプリケーション例③ 魚組織から抽出(同時クリーンナップ)
27
ASEのアプリケーション例④ ヘスペリジンの抽出(多段階抽出)
サンプル: みかんの皮
Step 1でヘスペリジン検出の妨害物質(ナフサ分解物)を抽出
⇒ヘスペリジンは抽出されない
Step2でヘスペリジンの抽出
28
サーモフィッシャーが提供するソリューション
固体
気体
液体
液液抽出(試薬)
固相抽出
高速溶媒抽出
(ASE)
・ 逆相
・ HILIC
・ SEC
・ イオン交換
・ アフィニティ
LC(装置・カラム) 紫外可視吸収、蛍光
電気化学、電気伝導度
荷電化粒子
MS
・四重極・イオントラップ
・フーリエ変換
前処理 分離 検出 サンプル
濃縮
(Orbitarp)
IC(装置・カラム)
GC(装置・カラム)
・AppsLab Library
・Chromeleon
(クロマトグラフィーデータ管理システム)
eWorkflow
29
分離(クロマトグラフィー)
順相 ⇒ シリカゲルとの吸着により分離
逆相 ⇒ 疎水性の相互作用で分離
サイズ排除 ⇒ 分子の大きさで分離
イオン交換 ⇒ イオン性の相互作用で分離
アフィニティ ⇒ 相互作用分子を担体に結合させ、目的成分を特異的に保持
代表的な固定相
代表的なクロマトグラフ
ガスクロマトグラフ ⇒ 移動相が気体 固定相との相互作用により分離
液体クロマトグラフ ⇒ 移動相が液体 固定相との相互作用により分離
イオンクロマトグラフ ⇒ 電荷をもつ分子を分離するクロマトグラフ
30
カラム内での成分の挙動
:溶出の遅い成分
:溶出の中位成分
注入直後
溶出開始
:溶出のはやい成分 分離:複雑性の緩和
31
専用カラム(標的の特徴的な化学特性を利用)
http://thermo.dirxion.com/chromatography
/app.php?RelId=6.0.9.2
https://www.thermoscientific.com/en/about-
us/promotions/hplc-column-selection-app.html
カラム選択のためのアプリ
32
イオンクロマトグラフ基本構成
ポンプ 溶離液
電気伝導度セル
インジェクション バルブ
サプレッサー
カラム
サンプル (オートサンプラー)
ERS
• カラム
• 陰イオン交換
• 陽イオン交換
• イオン排除
• イオンペア
• 検出器
• 電気伝導度検出器(サプレッサー付)
• UV/VIS検出器
• 電気化学検出器
• 電荷検出器
• 質量分析計
排液
33
イオン交換分離モードによる分析例 ~無機イオン~
Dionex IonPac CS12A
Li
12 14 0 2 4 6 8 10
Time (min)
Dionex IonPac AS22
F
Cl
NO2
Br
NO3
PO4
SO4
Ace
For
12 14 0 2 4 6 8 10
Time (min)
Na
NH4
K
Mg Ca
条件
カラム
溶離液
流量
カラム温度
サプレッサー
検出器
:Dionex IonPac CG12A, 4x50mm
/ Dionex IonPac CS12A, 4x250mm
:20mmol/L メタンスルホン酸
:1.0mL/min.
:30℃
:CERS-500, 4mm
:電気伝導度検出器
条件
カラム
溶離液
流量
カラム温度
サプレッサー
検出器
:Dionex IonPac AG22, 4x50mm
/ Dionex IonPac AS22, 4x250mm
:4.5mmol/L Na2CO3 / 1.4mmol/L NaHCO3
:1.2mL/min.
:30℃
:AERS-500, 4mm
:電気伝導度検出器
イオン交換容量
樹脂疎水性
:2800μeq/column
:中
イオン交換容量
樹脂疎水性
:210μeq/column
:超低
34
4μmカラムによる高分離分析例 ~無機イオンと有機酸~
カラム
溶離液
流量
注入量
温度
検出器
40 0 10 20 30 -2
25
µS
/cm
Time (min)
1
2
3
4
5 6
7
8
9
10
11 12
13 14
15
16 17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36 37
38
39
40
:Dionex IonPac AG11-HC-4µm, 0.4x50mm
/Dionex AS11-HC-4µm , 0.4 × 250 mm
:1mM KOH for 0.01min,
1-5mM KOH in 15 min;
5 to 55mM KOH in 25 min
:0.015 mL/min
:0.4 µL
:30˚C
:電気伝導度(サプレッサー使用)
ピーク 1.
3.
5.
7.
9.
11.
13.
15.
17.
19.
21.
23.
25.
27.
29.
31.
33.
35.
37.
39.
キナ酸
乳酸
2-ヒドロキシ酪酸
ギ酸
メタンスルホン酸
イソ吉草
モノクロロ酢酸 Cl-
NO2-
トリフルオロ酢酸 NO3
-
リンゴ酸
マロン酸
マレイン酸
α-ケトグルタル酸
フマル酸 PO4
3-
AsO43-
CrO42-
cis-アコニット酸
ピーク 2.
4.
6.
8.
10.
12.
14.
16.
18.
20.
22.
24.
26.
28.
30.
32.
34.
36.
38.
40.
F-
酢酸
プロピオン酸
酪酸
ピルビン酸
吉草酸 BrO3
-
2-オキソ吉草酸
エチルリン酸 Br-
シトラマル酸 CO3
2-
SO42-
シトラコニット酸 SO4
2-
シュウ酸 WO3
2-
フタル酸
クエン酸
trans-アコニット酸
[mg/L]
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
2.5
5.0
5.0
5.0
7.5
7.5
7.5
7.5
7.5
10.0
10.0
10.0
-
[mg/L]
1.5
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
7.5
7.5
7.5
7.5
7.5
7.5
10.0
10.0
10.0
10.0
35
具体的な分析例)オレンジジュース中の糖質
1. グルコース(ブドウ糖) 1.7 µg/L
2. フルクトース(果糖) 1.5
3. スクロース(ショ糖) 3.2
0
0 2 4 6 8 10 12
40 1
2
3
nC
Time (min)
カラム: CarboPac PA1
溶離液: 100 mmol/L NaOH
流量: 1.0 mL/min
検出: IPAD※, Au電極
前処理:超純水で10倍希釈後、0.45μmフィルターにより微粒子の除去
※IPAD; インテグレーテッドパルスドアンペロメトリー検出
36
具体的な分析例)ビール中のマルトオリゴ糖
0 30 10 20
Time(min)
40
0.2
0
mC
0.2
0
mC
0.2
0
mC
Brand A
Brand B
Brand C
1
4 5 6
2 3 カラム: CarboPac PA1Guard,
CarboPac PA1
溶離液: #A 0.1M NaOH
#B 0.1M NaOH/ 1.0M NaOAc
グラジエント: 0-50 % #B in 60 min (Carve5)
流量: 1.0 mL/min
検出: 電気化学(PAD) Au電極
注入量: 25mL
サンプル: Beer
前処理: 超音波で脱気後、超純水で希釈
Peaks;
1. Maltose
2. Maltotriose
3. Maltotetraose
4. Maltopentaose
5. Maltohexaose
6. Maltoheptaose
キーポイント
気泡により液相と担体の相互作用が妨げられないために脱気
37
具体的な分析例)インスタントコーヒー中の糖質
15
0
0 5 25 10 20 15 30 35 40 45 50
nC
カラム: CarboPac PA10
溶離液: 1mM NaOH
流量: 0.5 mL/min
検出: IPAD, Au電極
1. マンニトール
2. フコース
3. アラビノース
4. ラムノ-ス
5. ガラクトース
6. グルコース
前処理:Dionex OnGuardⅡ-RP前処理カートリッジにより乳脂肪分を除去
Time(min)
7. スクロース
8. キシロース
9. マンノース
10. フルクトース
11. リボース
キーポイント
カラムの樹脂に吸着しうる成分や塩により析出しうる成分は予め除去
38
サーモフィッシャーが提供するソリューション
固体
気体
液体
液液抽出(試薬)
固相抽出
高速溶媒抽出
(ASE)
・ 逆相
・ HILIC
・ SEC
・ イオン交換
・ アフィニティ
LC(装置・カラム) 紫外可視吸収、蛍光
電気化学、電気伝導度
荷電化粒子
MS
・四重極・イオントラップ
・フーリエ変換
前処理 分離 検出 サンプル
濃縮
(Orbitarp)
IC(装置・カラム)
GC(装置・カラム)
・AppsLab Library
・Chromeleon
(クロマトグラフィーデータ管理システム)
eWorkflow
39
代表的な検出器の比較
検出器 最小検出感度 (g) 選択性 温度の影響 流速の影響 グラジエント溶離
紫外可視吸光光度検出器 10-11 有(吸光物質) 小 無 可
蛍光検出器 10-13 有(蛍光物質) 有 無 可
示唆屈折率検出器 10-7 無 有 無 不可
電気化学検出器 10-12 有(酸化還元物質) 有 有 可
電気伝導度検出器 10-10 有(イオン) 有 有 困難
質量分析計 10-14 無 有 有 可
蒸発光散乱検出器 10-8 無 無 無 可
荷電化粒子検出器 10-9 無 無 無 可
ICP発光分光分析計 10-11 有 無 無 可
ICP質量分析計 10-14 有 無 無 可
高速液体クロマトグラフィー通則 JIS K 0124:2011 表2-高速液体クロマトグラフィーに用いられる代表的な検出器とその特徴
高速液体クロマトグラフィー通則 JIS K 0124: 2011 2011年3月22日改正版
40
検出器の選択性 ~ICによる有機酸と陰イオンの一斉分析~
F
乳酸
グリコール酸
ギ酸
ピルビン酸
Cl
NO2
Br NO3
SO4
酒石酸
リンゴ酸
シュウ酸
コハク酸
PO4
n-フタル酸
クエン酸 iso-フタル酸
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 27.00
Time(min)
電気伝導度では共溶出した成分を識別不可
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
F: 6.57
Cl: 9.39 NO2: 10.60
Br: 11.82
PO4: 15.77
NO3: 12.66
SO4: 12.96
ピルビン酸: 7.96
n-フタル酸: 15.67
Iso-フタル酸: 24.68
酒石酸: 13.90
乳酸: 6.95 グリコール酸: 7.11
ギ酸: 7.94
リンゴ酸: 13.85 シュウ酸: 14.15
コハク酸: 14.33
クエン酸: 18.35
Time(min)
IC-電気伝導度検出器
IC-MS
質量分析計は、共溶出した成分を質量の違いで識別
41
質量分析装置
検出器 データ
解析部
質量
分析部
イオン化
導入部
質量分析装置(真空)
サンプルの形状 液体 気体 固体 (結晶)
イオン化法 ESI EI, CI MALDI
APCI
APPI
42
各種イオン化の特徴
ESI
APCI
APPI
小(50Da~)
極性
分子質量
脂質
低
高
大きい(~150,000Da)
医薬
農薬
代謝物
アミノ酸
単糖 オリゴ糖 多糖
RNA DNA
ペプチド タンパク質
複合脂質
合成ポリマー 化成品
◩ 広範囲の化合物のイオン化が可能
43
質量分析装置
検出器 データ
解析部
質量
分析部
イオン化
導入部
質量分解能 低 高
四重極 イオントラップ 飛行時間 フーリエ変換型
(オービトラップ etc.)
質量分析装置(真空)
44
Q Exactiveシリーズ ~高分解能データが取得できる汎用MS~
45
LC-Orbitrap ~HILICカラムによる極性化合物分析例~
RT: 0.00 - 45.00
0 20 40
Time (min)
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
10014.90
15.10
10.41
14.78
18.46
15.66
18.72
12.38
Gly
Ser
Leu Ile
Gln
Lys
Glu
Arg
Tyr
RT: 9.23 - 11.10
10 11
Time (min)
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
10.419.98
10.85
9.66
10.23
10.12 10.609.44
10.359.48
10.889.70
9.80 10.359.55
RT: 0.00 - 45.00
0 20 40
Time (min)
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
1009.33
7.71
8.68
10.68
10.56
7.75
10.09
11.51
Cytosine
Adenine
Hypo-
xanthine
Guanine
Cythidine
Adenosine
Guanosine
Inosine
RT: 0.00 - 45.01
0 20 40
Time (min)
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
10013.28
10.99
17.81
15.40
17.85
15.88
19.28
15.71
GABA
Orn
Choline
Citrulline
GSH
GSSG
S-adenosyl
methionine
Arginino
succinate
Positive mode Negative mode RT: 0.00 - 45.01
0 20 40
Time (min)
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
10016.17
3.76
15.88
15.74
18.4318.13
17.80
17.29
16.92
18.810.82
RT: 16.32 - 21.08
18 20
Time (min)
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
16.43 18.67 20.35
16.46 18.09 18.83
17.00
18.22 18.35
18.4318.13
17.80
17.29
16.92
18.81
Fumarate
Succinate
α-keto
glutarate
Iso/Citrate
PEP
G3P
G1P/G6P/
F6P
FBP
RT: 16.32 - 21.08
18 20
Time (min)
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
16.43 18.67 20.35
16.46 18.09 18.83
17.00
18.22 18.35
18.4318.13
17.80
17.29
16.92
18.81
RT: 0.00 - 45.01
0 20 40
Time (min)
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
10015.25
16.14
17.00
17.46
18.29
19.12
18.02
18.47
AMP
ADP
ATP
GMP
GDP
GTP
UTP
CTP
RT: 0.00 - 45.01
0 20 40
Time (min)
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
10015.92
14.51
15.55
19.76
18.0618.15
17.38
17.30
15.28
14.30
NAD
NADH
NADP
NADPH
CoA
Acetyl-
CoA
Hexose
Di-Hexose
HILICカラム 極性切り換え測定
46
IC-Orbitrapによる極性低分子の分離例
CapICとHILICの分離比較
D-Glucose
Mevalonate
Lactate
Uridine
G6P G1P
cAMP
Tartrate
2-oxoglutarate
AMP
2-phosphoglycerate
Citrate Isocitrate
cis-Aconitate trans-Aconitate
Phosphoenolpyruvate
F-1,6-DP F-2,6-DP
Dihydroxy acetone-P
IMP
CapIC ZIC-pHILIC
F6P
CapIC ZIC-pHILIC CapIC
60ppt
CapIC
60ppt 600ppb 600ppb 600ppb 600ppb
◩ on column 0.9-4 fmol, LOD 0.05-0.5 nM
47
mzCloudライブラリ (https://www.mzcloud.org)
48
ノンターゲット分析への応用 ~mzCloudライブラリによる同定~
mzCloudでヒットした化合物
49
オービトラップによるノンターゲット分析例
3種類の食事サンプルをモデルに分析例をご紹介
・液体クロマトグラフ(LC) ⇒ 極性化合物(ODS, HILIC)、脂質(ODS)
・イオンクロマトグラフ(IC) ⇒ 極性低分子(アニオン)
・ガスクロマトグラフ(GC) ⇒ 非極性低分子
LC-Orbitrap IC-Orbitrap GC-Orbitrap
50
使用したサンプル (NIH West Coast Metabolomics Center Food Samples)
Davis California USA
白米 鮭 ハンバーガーバンズ
目玉焼き 玄米 白米 牛肉
ゴマ スライスアーモンド チーズ
スパイシーソース レモンスライス ベーコン
豆腐 蒸しニンジン レタス
ホウレンソウ 蒸しブロッコリー ピクルス
豆苗 蒸し玉ねぎ トマト
もやし 蒸しキャベツ ケチャップ
ニンジン 蒸しパプリカ フライドポテト
ズッキーニ ブドウ ベイクドビーンズ
ラディッシュ ヨーグルト チョコレートチップクッキー
ライスパンチ(甘酒) ブルーベリー コーラ
緑茶
51
LC-Orbitrapで同定されたサンプル特異的な成分
ネオテーム(人工甘味料): USA (チョコチップクッキー? ベイクドビーンズ?)
グリシテイン(大豆イソフラボン): Davis(もやし?豆腐?)
52
IC-Orbitrapで同定されたサンプル特異的な成分
酒石酸: CA (ブドウ)
シアル酸: Davis(目玉焼き)
Davis
Davis
CA USA
CA USA
53
RP-ESI(+)
HILIC-ESI(+)
RP-ESI(-)
HILIC-ESI(-)
IC-ESI(-)
Fatty Acid
Secondary
metabolites
Nucleotides
Pentose and
ascorbate
Galactose,
nucleotide sugar
Energy
Amino Acid
Amino Acid
Amino Acid
Amino Acid
TCA Carbon
Fixation Xenobiotics
Biodegradation
GC(CI,EI)
Lipids
RP-Lipids
多彩なクロマトグラフ法でカバーできる広範囲な代謝物
メソッド RP/MS+
化合物数 2105
RP/MS-
426
メソッド RP/MS+
化合物数 2105
HILIC/MS+
1925
HILIC/MS-
450
IC/MS-
1028
GC/MS
1508
Lipids+/-
731
54
• AppsLabにより、既存の分析手法の検索・メソッド移管をスムーズに行うことができる(Chromeleon CDSと一緒に用いることでメソッド管理を効率化)
• ASEにより、固体あるいは半固体のサンプルから溶媒を使い高・高圧条件で迅速に自動抽出できる(疎水性の高い化合物に適した前処理)
• ICは、従来のLCで分離が困難な極性化合物の分離に優れる
• Orbitrap質量分析計は、最も汎用な検出器の一つ。ターゲット分析に加えて、ワイドターゲットやノンターゲットといった分析に非常に有用。(mzCloudライブラリが化合物同定を強力にサポート)
まとめ