줄무늬 패턴을 이용하여 분해능의 한계를 넘어서다 structured...
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물리학과 첨단기술 MAY 2012 21
줄무늬 패턴을 이용하여 분해능의 한계를 넘어서다: Structured Illumination Microscopy의 소개 DOI: 10.3938/PhiT.21.022 고유빈 ․정은석 ․정연수 ․정의헌
REFERENCES
[1] E. Abbe, Archiv fur mikroskopische Anatomie 9, 413 (1873).
[2] R. Y. Tsien, Annu Rev Biochem 67, 509 (1998).
[3] Nature Methods 6, 1 (2009).
저자약력
고유빈은 광주과학기술원 학사과정생으로서 초분해능 현미경을 연구하고 있
정은석은 광주과학기술원 대학원생으로서 초분해능 현미경을 연구하고 있
정연수는 광주과학기술원 대학원생으로서 초분해능 현미경을 연구하고 있
정의헌 교수는 미국 Harvard-MIT 의공학 박사(2007)로서, Harvard
Medical School 박사 후 연구원(2007-2010)을 거쳐, 2011년부터 현재까
지 광주과학기술원 의료시스템학과 및 기전공학부 조교수로 재직 중이다
Overcoming the Resolution Limit Using Striped
Patterns: Structured Illumination Microscopy
Yoobin KOH, Eunseok JUNG, Yeonsu JUNG and Euiheon
CHUNG
Optical microscopy has entered a new era of super-res-olution imaging. This technology is revealing sub-cel-lular structures and dynamic functions on a nano-meter scale that were previously impossible. A number of ideas have been realized in order to surpass the dif-fraction limit of optical microscopy. Among others struc-tured illumination microscopy (SIM) has been widely studied due to its wide-field imaging nature and less dependence on the fluorophore choice. SIM uses a fine striped pattern of light illumination to extract minute features from the sample. Various advances have been achieved to obtain better resolution, robustness, faster imaging speed, and 3-dimensional imaging of fixed and live specimens based on the principle of SIM.
머릿말
학 미경은 17세기 벤후크(von Leeuwenhoek)가 발
명한 이후로 이 에는 불가능했던 미생물이나 세포 소기 구
조의 찰이 가능하도록 하 으며, 의생명 과학이 발 함에
있어서 큰 기여를 해왔다. 1873년 에른스트 아베(Ernst Abbe)의 주장에 따르면 미경의 분해능은 회 상(diffraction)으로 인해 사용되는 의 반 장 정도-가시 선의 경우 수백
나노미터-로 보고되었으며, 이후 수백 년 동안 이 한계는 넘
어서기 힘든 것으로 여겨졌다.[1] 이러한 빛의 동 인 특성
에 의하여 결정되는 분해능의 한계는 근래에 들어 분해능
(super-resolution) 미경이 개발되면서 극복되었다. 높은
분해능을 갖는 미경의 등장은 미소 수 의 생명 상에
한 연구를 가능하게 함으로서 생물학과 기 의학 연구에 새
로운 장을 열고 있다. 살아있는 세포의 복잡한 상호작용을 수십 나노미터 수 에
서 선택 으로 찰할 수 있다는 에서 분해능 형 미
경의 개발은 녹색형 단백질(green fluorescence protein)의
발견과 더불어 앞으로도 넓은 분야에서 응용될 것으로 기
된다.[2] 이러한 경향을 반 하여 분해능 형 미경은
Nature Methods 학술지에서 2008년 올해의 방법론(Method of the year 2008)으로 선정되기도 하 다.[3]
분해능의 한계를 극복한 기술들
입사된 빛이 측 상으로부터 원거리로 하게 되면 회
상이 두드러지기 때문에 원래의 정보를 획득하는데 제
한이 생긴다. 이러한 이유로 표본에 매우 가까이 근 하여
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Fig. 2. The principle of SIM: Under uniform illumination as in
conventional microscopy, two closely adjacent fluorescent molecules
are not distinguishable. However using localized illumination
could reveal each fluorescent molecule by precisely shifting its
phase and taking individual images.
REFERENCES
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(a) (b) (c)
Fig. 1. Resolution extension through the moiré effect. If an
unknown sample pattern (a) is multiplied by a known regular
illumination pattern (b), and moiré fringes will appear (c). It is
enough to observe through the microscope even if the original
unknown sample pattern is unresolvable.[10]
찰하는 근 장 미경(Near-field optical microscopy)이 개
발되었다. 그 에서도 탐침을 이용해 표면 가까이에서 형
분자의 신호를 감지하고 탐침을 표면을 따라 이동시키며 이
미징을 하는 근 장 주사 학 미경(Near-field scanning optical microscopy)이 표 이다.[4] 하지만 이 장치를 이용
한 이미징 방법은 샘 의 표면에서 매우 가까운 역만을 볼
수 있다는 에서 한계를 보인다. 한편 원거리장 분해능
미경(far-field super-resolution microscopy) 기술은 오랫동
안 이론 으로만 측되어 왔으나, 근래에 들어서야 실험 인 증명 사례가 등장하기 시작했다. 형 물질의 비선형성을 이용한
STED 미경,[5] 활성화가 가능한 형 단백질(photo-activat-able fluorescent protein)의 치추정법을 이용한 STORM/ (F)PALM,[6-8] 무늬 패턴모양의 입사 을 사용하여 분해능을
높인 SIM(Structured illumination microscopy),[9] SIM의
원리를 바탕으로 형 물질의 비선형성을 이용해 해상도를 더
욱 높인 SSIM(saturated structured illumination micro-scopy)[10] 등 회 한계를 극복한 기술들이 근래에 들어서 다
양하게 개발되었다.이 에서는 분해능 형 미경 기술 에서도 역
이미징(wide-field imaging) 기법인 SIM의 원리와 최근에 이
룩한 SIM의 기술 진보 SIM 기술이 생명과학 연구에 응
용되는 사례들을 소개하여 분해능 미경 기술 개발의
요성과 응용 가능성에 해 다 보고자 한다.
SIM(structured illuminated microscopy)의 원리
SIM에서 미경의 분해능은 간섭무늬를 이용하여 증가될
수 있다. 서로 다른 무늬 a와 b를 겹치면 우리 으로 쉽게
볼 수 있는 새로운 무늬 c가 생긴다 (Fig. 1 참조). 이 간섭무
늬를 무아 무늬(moiré pattern, 용어설명 참조)라 하며, 각각의 무늬 a 는 b가 분해능보다 작더라도 무아 무늬는
찰이 가능하다. 만약 b 무늬에 한 정보를 사 에 알고 있
었다면 무아 무늬 c를 측함으로써 a 무늬의 정보를 역으
로 계산해 낼 수 있다. SIM에서 무늬 a는 기존의 미경으로
는 찰할 수 없는 표본의 모양이고 b는 우리가 이미 알고
있는 무늬(structured illumination)의 입사 이며 a와 b가
서로 겹쳐 생긴 c를 실제로 이미징하게 된다. 무늬 b의 상
을 바꾸어 가면서 획득한 여러 장의 c의 이미지를 역으로 추
정했을 때, 이론 으로는 기존의 미경보다 두 배 가량 향상
된 분해능으로 표본의 이미지를 얻을 수 있다.에서 설명한 SIM의 원리를 Fig. 2에서 도식으로 나타내
었다. 원(point source)의 이미지를 퍼짐 함수(point- spread function, PSF, 용어설명 참조)라고 한다. 따라서
PSF보다 가까운 거리의 물체들은 구분이 되지 않는다. 즉, 보통의 형 미경에서는 입사 을 샘 에 균일하게 비추며
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Fig. 4. SLM patterns at three phases and their corresponding
illumination patterns: The black ones in the SLM patterns indicate
no phase retardation on the incident beam.[13]
REFERENCES
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Fig. 3. Example of SIM imaging of biological sample: The actin
cytoskeleton at the edge of a HeLa cell, as imaged by (a)
conventional, and (b) structured illumination microscopy. Fibers
separated by less than the resolution limit of the conventional
microscope are well resolved using structured illumination.[9]
(uniform illumination) 결과 인 형 이미지(Fig. 2의 F)에서는 회 한계보다 가까이 치한 물체들은 PSF가 겹치게 되
어서 구분할 수 없게 된다. 만약 국소 인 입사 (localized illumination)을 이용하여 형 분자들을 개별 으로 들뜨게
하고 빛의 상을 조 씩 바꾸면서 여러 장의 이미지를 얻는
다면 이를 토 로 PSF보다 가까운 거리의 물체들의 존재도
알아낼 수 있다. 이것이 바로 SIM의 원리이다. 실제로는 국
소화된 입사 의 상을 바꾸어가며 이미징을 하여 한 방향
으로만 높은 분해능을 얻게 된다. 따라서 몇 가지 방향으로
이 과정을 반복하여야만 체 으로 골고루 분해능을 높일
수 있다. SIM을 이용한 로 Fig. 3에서는 세포 소기 인
actin cytoskeleton의 이미지에 한 기존의 미경(a)과
SIM(b)의 차이를 비교하여 보여 다.
SIM 기술의 구현 및 진보
1. 공간 빛 변조기(Spatial light modulator)를 이용한 패턴
생성
이 까지는 패턴을 가진 입사 을 만들기 해 회 격자
를 이용한 방법이 리 사용되어 왔다. 하지만 회 격자는
격자 간격(fringe period)이 고정되어 있고, 기계 으로 이동
하고 회 시키는 방법은 근본 으로 정 도의 한계가 있고
시간 으로도 문제가 될 수 있다. 공간 빛 변조기(spatial
light modulator, 용어설명 참조)는 자 으로 패턴을 만들
수 있기 때문에 회 격자의 단 을 극복한 장치로서 표본에
임의의 패턴을 지닌 입사 을 생성할 수 있게 한다 (Fig. 4 참조). 공간 빛 변조기 표면의 무늬를 컴퓨터로 제어함으로써
회 격자를 이동하거나 회 할 때 생기는 기계 인 오차를
일 수 있게 되었다.[11,12]
2. 정상파 원리를 이용한 패턴 생성
한편 입사 무늬의 간격이 좁아질수록 SIM의 분해능이 높
아지므로 정상 (Standing wave 용어설명 참조)에서 빛의 세
기(intensity)의 장이 원래 장의 반이 되는 상(Fig. 5 참조)을 응용한 정상 형 미경(standing wave fluorescence microscopy)이 등장했다.[14,15] 이것은 회 한계보다 작은 패
턴을 만들 수 있는 새로운 기술임에 동시에 분해능을 향상시
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Fig. 5. Standing wave: Standing wave is made when
two waves encounter and interfere. SIM based on SW
utilizes the fact that the wavelength of standing wave
intensity is a half of the original. Thus the resultant
narrow pattern can lead to higher resolution.
Fig. 6. Experimental setup of SW-SPRF (standing wave-surface plasmon reso-
nance fluorescence).[18]
REFERENCES
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[21] P. J. Keller et al., Nat Methods 7, 637 (2010).
킬 수 있는 획기 인 방법이었다. 이 원리로부터 나아가 보다 미세한 패턴을 구 하여 분해
능을 높인 SW-TIRF와 같은 진보된 기술이 등장하 다.[16,17] 입사된 빛이 굴 률이 다른 매질의 경계면에서 반사될 때, 한쪽 매질에서 에바네센트 (evanescent wave 용어설명 참
조)가 형성되는데 이 동을 이용해서 표본에서 가까운 (약
100 nm 이내) 형 분자만을 선택 으로 여기시킬 수 있다. 에바네센트 를 정상 로 만들면 보다 미세한 패턴을 구
할 수 있기 때문에 분해능을 더 높일 수 있다는 장 이 있
다.[16,17] 나아가서 반사 구조에 표면 라즈몬 공명(surface plasmon resonance 용어설명 참조) 상을 용함으로써 형
신호를 몇 배로 증폭시키고 동시에 배경 노이즈(background noise)를 일 수 있게 되었다 (Fig. 6 참조).[18]
3. 형광의 비선형성을 이용하여 무제한으로 작은 패턴을 생성하
는 Saturated SIM (SSIM)
입사 의 세기가 특정 값 이상으로 증가하여 형 신호가
비선형 인 반응을 보이는 포화상태가 되면 이론 으로 무제
한 으로 작은 패턴을 만들 수 있게 된다. 이 게 형성된 입
사 의 패턴을 SIM에 용시킨 방법을 SSIM(saturated SIM)이라고 한다. SSIM 방법을 통하여 50 nm 이내의 분해
능이 실험 으로 입증되었다.[10] 하지만 강한 입사 으로 인
하여 형 분자의 표백(photobleaching)이 심해지는 등의
단 도 있다. 이를 보완하기 해 몇 시간 동안 강한 빛을 조
사해도 쉽게 표백되지 않는 다이아몬드 나노결정(diamond nanocrystals)을 사용한 바가 있다. 한 실제 살아있는 세포
를 이미징하는 경우 상을 얻는 도 에 물체가 수십 나노미터
씩 움직일 수 있으므로 실시간 이미징을 해서는 천천히 움
직이는 표본만을 찰할 수 있다는 제한 이 있다.[20] Table 1에서는 SIM 연 된 기술들을 구조화된 입사 이 만들어
진 원리에 따라 분류하고 이미징 방법, 장단 그리고 여러
가지 명칭들로 나 어 보여주었다.
4. 이미징 속도를 향상시킨 SIM
기의 SIM은 회 격자나 샘 을 직 손으로 움직여 미
세하게 치를 조정하여야 하 으므로 이미징을 한 시간이
많이 들었다. 하지만 컴퓨터를 이용하여 입사 을 빠르고 정
하게 제어할 수 있게 되었다. 를 들어 입사 의 세기를
조 하는 AOTF(acousto-optical tunable filter)를 통해 공간
주 수를 유동 으로 변화시켜 사인 형 무늬를 얻는 장치와[21] 상제어기(phase controller)와 같이 실시간으로 정상 의
상을 피드백하여 보정해주는 알고리즘을 이용해 열 표류
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Classification Methods Resolution Advantages Disadvantages Alternative names
Structured illumination microscopy (SIM)
Grating[9]
110 - 130 nm
Relatively simple.
Extension to 3D possible.
Limited resolution enhancement (upto twice than conventional microscopy).
Harmonic excitation light microscopy (HELM)[15]
Laterally modulated excitation microscopy (LMEM)[24]
Spatial light modulator (SLM)[13]
Standing wave (SW)[15]
Structured illumination microscopy based on total internal reflection geometry (SIM-TIR)
Structured illumination under TIR geometry (TIR achievable with a prism or a high NA objective lens)
About 100 nm
Higher signal-to- background ratio.
Further resolution enhancement than SIM.
More complicated alignment due to TIR geometry.
Still linear resolution enhancement.
Standing wave-Total internal reflection fluorescence(SW-TIRF)[16,17]
Harmonic excitation light microscopy-total internal reflection fluorescence (HELM-TIRF)[12]
TIRF SIM[25]
Nonlinear Structured illumination microscopy
Deliberate saturation of fluorophores’ excited state
< 50 nmEven further resolution enhancement.(theoretically unlimited).
Fast photobleaching may limit the use of biological sample.
Saturated Patterned excitation microscopy (SPEM)[24]
Saturated structured illumination microscopy (SSIM)[10]
Table 1. Comparison of super-resolution microscopy techniques based on structured illumination.
Fig. 7. The principle of SSIM: A diffractive grating in the
excitation path splits the light into two beams. Their interference
after emerging from the objective and reaching the sample
creates a sinusoidal illumination pattern. Strong excitation light
saturates the fluorescence emission at the peaks leading to sharp
dark regions in the effective illumination pattern.[19]
REFERENCES
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(thermal drift)와 미세한 진동으로 인해 생기는 향을 이
는 장치는 선명한 이미지를 신속히 얻는데 도움을 주었다.[16] 컴퓨터 제어를 이용한 것과는 다르게 수직의 선형 편 된 두
빛을 한번에 두 방향으로 입사시켜 상을 회 하는데 드는
시간을 단축시키는 방법도 등장하 다.[22]
5. 삼차원 이미징 기술
한편 지 까지 소개된 SIM은 부분 2차원에서의 분해능
을 향상시킨 방법인데 반하여, 축 방향으로도 분해능을 증가
시킬 수 있는 3차원 SIM 기반 기술들도 개발되어 왔다. 3차
원의 이미지는 을 z축 방향으로 이동시키면서 얻을 수
있다. SIM은 XY와 Z 방향 모두 각각 100 nm, 300 nm 수으로 기존 비 두 배 이상 분해능을 증가시킬 수 있다
(Fig. 8 참조). SSIM에서와 같이 형 분자의 비선형 인 발
특성을 이용한다면 이를 더욱 향상시킬 수 있다. 3차원 SIM은 이 에서 잘 보여주지 못하던 세포 핵, 바이러스, 시냅스
액틴 등의 구조를 더 자세하게 보여주게 되었다.
맺는말
지 까지 SIM의 원리와 최근 진 되고 있는 연구결과를 소
개했다. SIM은 기존의 리 사용되고 있는 형 분자를 그
로 사용할 수 있어서 다양한 형 표지를 통해 다색 삼차원
이미징이 용이하다. 최근에는 Carl Zeiss사와 Nikon사에서
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Fig. 8. Super-resolution microscopy of biological samples: Conven-
tional wide-field image (left) and 3D-SIM image (right) of a mouse
C2C12 prometaphase cell stained with primary antibodies against
lamin B and tubulin, and secondary antibodies conjugated to Alexa
488 (green) and Alexa 594 (red), respectively. Nuclear chromatin
was stained with DAPI (blue).[23]
분해능이 100 nm 수 인 SIM 제품을 출시하 다. 이에 따
라 더욱 많은 생물학 연구자들이 이 기술을 사용할 수 있을
것으로 기 된다. 분해능 형 미경이 등장한 이래로 짧
은 시간에도 불구하고 다양한 방법들이 개발되어 상용화에
성공할 정도로 많은 진 이 이루어졌다. 이 까지는 찰할
수 없었던 것들을 볼 수 있게 됨으로써 복잡한 생명 상의
이해를 한층 깊게 해 것이다. 상 으로 짧은 역사에도 불
구하고 분해능 미경은 불변으로 믿어져 왔던 회 한계
를 극복하며 발 하게 되었고, 세포생물학, 미생물학, 신경 생
물학 등에서 새로운 통찰력을 제시하게 될 것이다.
감사의 글
본 연구는 주과학기술원 바이오 학 상센터(K0267C), 의료시스템공학연구소(iMSE), 그리고 교과부 한국연구재단 바
이오․의료기술개발사업(No. 2011-0019619, 2011-0019632)의 지원 하에 이루어졌으며, 이에 감사드립니다.
용어 설명
무아레 무늬(Moire pattern) 2개의 격자 무늬가 겹쳐지게 되면 간섭 현상이 일어나게 되는데, 이에 따라 생겨나는 무늬를 무아레 무늬라 한다.
점퍼짐 함수(Point-spread function) 현미경에서 점광원 물체의 이미지를 점퍼짐 함수라고 하며 회절 현상 등으로 인하여 유한한 크기를 가지게 된다. 분해능을 가늠하는 척도가 된다.
정상파(Standing wave) 진폭과 진동수가 같은 파동이 서로 반대방향으로 이동할 때 파동의 합성에 의해 생성된다. 이때, 생겨난 정상파의 파장은 원 파동의 파장의 절반과 같다.
에바네센트 파(Evanescent wave) 전반사가 일어날 때 매질의 경계면에서 (입사면 반대쪽에) 형성되는 국소 전자기장. 경계면으로부터 약 100 nm 정도의 매우 제한된 영역에서만 형성되므로 형광 분자의 국소 활성화를 가능하게 한다.
공간 빛 변조기(Spatial light modulator) 형성된 빛의 세기 혹은 위상의 공간적 분포를 변조하는 장치.
표면 플라즈몬 공명(Surface plasmon resonance) 금속과 유전체의 두 물질 경계면에 입사광이(p-polarization) 특정 각도로 입사할 때 에바네센트 파의 세기가 크게 증가하는 현상.