333 （ ）

い。一方，軟体動物（カタツムリ，ナメクジなど）の脳（神

経節）はニューロンの数が少なく（ 1つの神経節で数百

～数千程度），神経回路が比較的単純である。このよう

な比較的単純な脳を持ちながら，軟体動物は高度な学習

を行うことから，学習・記憶メカニズムを解明するため

の実験動物として古くから用いられてきた 1）。軟体動物

のニューロンは比較的大きいことから，微小ガラス電極

を用いた電気生理的手法により個々のニューロンの活動

を容易に測定することが可能である。また，生体から取

1．はじめに

学習・記憶は動物が周囲の環境に適応する上で重要な

機能であり，その機能を理解するには脳の情報処理機構

を各階層（個体レベル，神経回路レベル，神経細胞

（ニューロン）レベル，分子レベル）で理解する必要があ

る。しかし，哺乳動物の脳はニューロン数が非常に多く

（例えば，ヒトの場合は数百億個以上），その 1つ 1つが

数千個以上の細胞と結合している非常に複雑な構造をも

ち，その脳の情報処理機構を理解するのは容易ではな

The pond snail Lymnaea stagnalis can acquire a long-term memory by taste aversive training. The central giant cell (CGC) plays a key role in the feeding system of the pond snail, and exhibits spontaneous neural activity. In this study, we examined changes in the neural activity of the CGC induced by taste aversive training. We performed taste aversive training with sucrose as the conditioned stimulus and KCl as the unconditioned stimulus. After the training, we decided whether the snail was “a good learner” or “a poor learner”. The feeding response of the good learner to sucrose was significantly inhibited compared with control. We next performed intracellular recording for the CGC in the isolated central nervous system. The spontaneous firing rate of the CGC of the good learner decreased significantly compared with control, while that of the poor learner did not decrease significantly. It is considered that the inhibition of neural activity of the CGC results in the inhibition of central pattern generator in the feeding system in the good learner. Additionally, the inhibitory effect of γ -aminobutyric acid (GABA) on the CGC firing rate was more significant in the good learner. This result suggests that the GABA sensitivity of a neuron connecting with the CGC increased in the good learner.

Keywords : pond snail, taste aversive training, feeding response, modulatory neuron, 　　　　　 firing rate, γ -aminobutyric acid

軟体動物ヨーロッパモノアラガイの味覚嫌悪学習による

咀嚼調節ニューロンの神経活動変化

Minoru SAITO＊，＊＊＊, Kouya KATO＊＊, Yuki AIKAWA＊, Shogo KAWAMOTO＊,Shogo NAKADA＊＊＊and Yoshimasa KOMATSUZAKI＊＊＊＊

（Accepted November 11, 2015）

＊ 日本大学大学院 総合基礎科学研究科 相関理化学専攻： 156-8550　東京都世田谷区桜上水3-25-40

＊＊ 日本大学大学院 理工学研究科 物理学専攻 101-8308　東京都千代田区神田駿河台1-8-14

＊＊＊ 日本大学 文理学部 自然科学研究所 156-8550　東京都世田谷区桜上水3-25-40

＊＊＊＊ 日本大学 理工学部 物理学科 101-8308　東京都千代田区神田駿河台1-8-14

＊ Department of Correlative Study in Physics and Chemistry, Graduate School of Integrated Basic Sciences, Nihon University, 3-25-40 Sakurajousui, Setagaya-ku, Tokyo 156-8550, Japan

＊＊ Department of Physics, Graduate School of Science and Technology, Nihon University, 1-8-14 Kandasurugadai, Chiyoda-ku, Tokyo 101-8308, Japan

＊＊＊ The Institute of Natural Sciences, College of Humanities and Sciences, Nihon University, 3-25-40 Sakurajousui, Setagaya-ku, Tokyo 156-8550, Japan

＊＊＊＊ Department of Physics, College of Sciences and Technology, Nihon University, 1-8-14 Kandasurugadai, Chiyoda-ku, Tokyo 101-8308, Japan

日本大学文理学部自然科学研究所研究紀要

No.51 （2016） pp.333－338

13

斎藤稔＊，＊＊＊・加藤功弥＊＊・相川裕貴＊・川本祥悟＊・仲田正吾＊＊＊・小松崎良将＊＊＊＊

Changes in Neural Activity of a Feeding Modulatory Neuron of the Pond Snail Inducedby Taste Aversive Training

斎藤　稔・加藤功弥・相川裕貴・川本祥悟・仲田正吾・小松崎良将

334（ ）14

習である。モノアラガイは，嗜好性味覚刺激であるショ

糖溶液に対しては咀嚼運動を示し，忌避性味覚刺激であ

るKCl溶液に対しては殻引込み反応を示す。味覚嫌悪学

習は，ショ糖溶液（条件刺激）とKCl溶液（無条件刺激）

を交互に提示することによって成立する条件付け学習で

ある。その学習効果は，ショ糖溶液に対する咀嚼回数で

定量的に評価することができる。条件付け後，モノアラ

ガイはショ糖溶液に対する咀嚼運動を有意に低下させ，

この行動変化は1ヵ月以上にわたって長期記憶として保

持される 2）。ショ糖溶液が咀嚼運動を引き起こす神経回

路と，KCl溶液が殻引込み行動を引き起こす神経回路が

統合される部分に巨大ニューロンCGC（大きさ約100

µm）が存在する。

モノアラガイの中枢神経系は11個の神経節（図 1 B）

で構成されており，ニューロンの数は全ての神経節を合

わせても10万個程度である。また，比較的大きな細胞

や色・形に特徴のある細胞が多い 3）。このため，組織学

的手法による神経回路の同定が容易であり，神経生理学

的研究において重要な実験動物として用いられてきた。

モノアラガイの神経節の 1つであるcerebral ganglionに

咀嚼運動を調節するCGCが存在し（図 1B），自発的な

神経活動を行っている。そして，咀嚼リズムを作り出す

神経回路（central pattern generator; CPG）に神経投射を

して，その活動を調節する（図2）4）。

モノアラガイのいくつかの行動に対しては，神経伝達

物質GABA（γ -aminobutyric acid）の関与が報告されてい

る 5, 6）。例えば，GABAは移動行動を抑制し，殻引込み行

動を引き起こす。また，GABAは呼吸行動に関わるCPG

の 1つのニューロンの活動を抑制し，さらにGABA受容

り出した神経節標本を生理食塩水中で長時間生かしてお

くことができるという利点もある。

本研究では，軟体動物ヨーロッパモノアラガイ

（Lymnaea Stagnalis；以下，単にモノアラガイと呼ぶ）

（図 1A）の味覚嫌悪学習に着目し，それによって咀嚼調

節ニューロン（cerebral giant cell; CGC）の神経活動にど

のような変化が生じるかを明らかにすることを目的とし

た。

味覚嫌悪学習は摂食行動に見られる古典的条件付け学

A

B

約 1 mm

CGC （cerebral giant cell）

CGC CGC

cerebralganglion

図１

図２

図 1 （A）ヨーロッパモノアラガイ，（B）神経節の模式図（左）とcerebral ganglionの拡大写真（右）．CGCは左右のcerebral ganglionに 1つずつ存在する．

図 2 モノアラガイの咀嚼運動に関わる神経回路（P. R. Benjamin, Neural Systems & Circuits, 2012より，許可を得て転載）．CGC, SO, OCは調節性介在ニューロン，N1M, N1L, N2, N3tはCPG介在ニューロン，CBIsはその他の介在ニューロン群，B7, B10, B4は運動ニューロンである．黒丸（）などは抑制性シナプス，バー（⊥）は興奮性シナプス，抵抗記号は電気シナプスを表す．

335 （ ）

軟体動物ヨーロッパモノアラガイの味覚嫌悪学習による咀嚼調節ニューロンの神経活動変化

15

ず，シャーレ内の蒸留水を抜き取り，条件刺激である

ショ糖溶液を15秒間モノアラガイに与えた。次に，

シャーレ内のショ糖溶液を抜き取り，無条件刺激である

KCl溶液（10 mM）を15秒間与えた。そして，再び蒸留

水に交換して 9分30秒間放置した。このような過程を

さらに 9回（合計10回）繰り返し行った。

対照実験として，ナイーブコントロールとバックワー

ドコントロールを別の個体に対して行った。ナイーブコ

ントロールは蒸留水のみを与えたトレーニングである。

この際，条件付けトレーニングでショ糖溶液やKCl溶液

の交換を行ったように，15秒間ずつ蒸留水の交換を行っ

た。バックワードコントロールはショ糖溶液（条件刺激）

とKCl溶液（無条件刺激）を与える順序を入れ換えたト

レーニングである。

2-2-3　ポストテスト

条件付けトレーニングの30分後にポストテストを

行った。その手順としては，プレテストと同様にモノア

ラガイにショ糖溶液を15秒間与え，その後，蒸留水に

交換して咀嚼回数を 5分間測定した。

2-3　電気生理実験

味覚嫌悪学習実験を行ったモノアラガイのCGCに対

して細胞内電位記録を行い，その電気的な神経活動を測

定した。まず，神経節を体から単離し，CGCの周りの表

面を薄く覆っている膜を先鋭ピンセットなどで丁寧に取

り除いた。この際，必要に応じてプロテアーゼ（タンパ

ク質分解酵素）に15分間浸し，膜を取り除きやすくした。

単離した神経節は虫ピンで測定用バッファー（24 mM

NaCl, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2, 4 mM CaCl2, 0.3 mM

glucose, 0.1 mM NaH2PO4, 35.4 mM HEPES-NaOH （pH

7.9））を満たしたシャーレに固定し，それをファラデー

ケージ内の光学顕微鏡（ECLIPSE FN1，NIKON）のス

テージ上に設置した。

測定に用いる微小ガラス電極は，フィラメント付きガ

ラスキャピラリー（外径：1.0 mm，内径：0.78 mm）を

プラー（P-97, Sutter Instrument）によって先端径が約0.5

µmになるように引き延ばし，これに3M酢酸カリウム

溶液を満たして作製した（抵抗：25～35 MΩ）。作製し

た電極は，電極ホルダを取り付けてマニュピレータ

（NMN-25，Narishige）に固定した。そして，顕微鏡下で

マニュピレータを操作しCGCに電極を刺入した。なお，

CGCは左右のcerebral ganglionに 1つずつ存在するが，

本実験では常に右側のCGCに電極を刺入した。CGCの

細胞内電位はアンプ（Model 3100，A-M Systems）で増

体の阻害剤（picrotoxin）をそのニューロンに与えると脱

分極が生じる。このように，GABAはモノアラガイの行

動の基盤となるニューロンの活性に重要な役割を果たす

ことが分かる。しかしながら，摂食行動や味覚嫌悪学習

に関わる神経回路におけるGABAの役割についてはあま

り調べられていない。そこで本研究では，味覚嫌悪学習

が成立した際のCGCの神経活動に対するGABAの作用

についても調べた。

2．実験方法

2-1　実験動物

実験動物として用いたモノアラガイは，熱帯魚などを

飼育するものと同様な水槽中で飼育した。水は通常の水

道水を用い，ろ過装置とエアバルブフィルタを取り付け

た。水温はウォータークーラーにより約20に調節し

た。

2-2 味覚嫌悪学習実験

2-2-1 プレテスト

実験に用いるモノアラガイは，実験 1日前に飼育用水

槽から無作為に選び，別の水槽に移して24時間絶食さ

せた。絶食させることで条件刺激に対する嗜好性を増

し，条件付けトレーニングの成功率を上げるためであ

る。

条件付けトレーニングの前には条件刺激（ショ糖溶液

（10 mM））に対する咀嚼回数を測定するプレテストを

行った。咀嚼の様子が手鏡で観察できる実験台を用意

し，その実験台の上に蒸留水を入れたプラスティック

シャーレを置き，その中にモノアラガイを一匹ずつ入れ

た。モノアラガイを新しい環境に慣れさせるために30

分間放置した後，蒸留水中で咀嚼回数を 5分間測定した。

次に，シャーレ内の蒸留水をアスピレータで抜き取り，

ショ糖溶液をモノアラガイの口唇部が浸る程度に入れ

た。15秒間ショ糖溶液を与えた後，シャーレ内のショ糖

溶液を抜き取り，再び蒸留水をモノアラガイの口唇部が

浸る程度に入れた。蒸留水に交換した後，モノアラガイ

の咀嚼回数を 5分間測定した（プレテスト）。このよう

なプレテストで十分な咀嚼回数（20回）を示さない，あ

るいは最初の咀嚼回数よりも減少した場合には，そのモ

ノアラガイには次に述べる条件付けトレーニングは行わ

なかった。

2-2-2　条件付けトレーニング

プレテストの後，30分間放置してモノアラガイを環境

に慣れさせてから条件付けトレーニングを行った。ま

斎藤　稔・加藤功弥・相川裕貴・川本祥悟・仲田正吾・小松崎良将

336（ ）16

に放出され，その調節作用を担う。軟体動物の中枢神経

系でもGABA受容体が発現していることが報告されてお

り 8），前述の通りモノアラガイでもいくつかの行動に対

してGABAの関与が報告されている 5, 6）。

そこで，単離した神経節にGABA（1 mM）を投与し，

CGCの神経活動の変化を細胞内電位記録により調べた

（図 5A）。図 5BにGABAを投与する前に対する投与後

のCGCの1分間当たりの平均発火数の変化率を示す。

ナイーブコントロール群では106 ± 20 ％ （n = 4） で顕著

な変化が見られなかったのに対し，学習成立群では発火

が完全に抑制される個体も見られ（図 5A），CGCの活動

に対するGABAの抑制作用が有意に増大した（16 ± 9 ％

（n = 5）; p < 0.01）。このようなGABAに対する抑制作用

幅 し，A/Dコ ン バ ー タ（PowerLab2/26，AD Inst

ruments），測定用ソフトウェア（LabChart 7，AD

Instruments）を用いて1 kHzのサンプリングレートでコ

ンピュータに取り込んだ。記録したデータからCGCの

発火頻度などを求めた。

2-4 統計解析

2群間の差の検定にはStudent’s t 検定を用い，3群以

上の検定にはTurkey-Kramer法を用いて多重比較検定を

行い，どのペアに有意差が存在するのかを検定した。本

文中のデータは平均値 ± SEMで示した。

3．実験結果および考察

図3に味覚嫌悪学習実験によるモノアラガイの咀嚼回

数の変化率（プレテストに対するポストテストの咀嚼回

数の割合（％））を示す。ナイーブコントロール群では咀

嚼回数の変化率は116 ± 10 ％ （n = 8），バックワードコ

ントロール群では116 ± 15 ％ （n = 7） であり，プレテス

トに対してポストテストの咀嚼回数は顕著な変化が見ら

れなかった。一方，10回の条件付けトレーニングをした

場合でも咀嚼回数に顕著な変化が見られなかった個体も

いたが，多くの個体で咀嚼回数の変化率が顕著に減少し

た。咀嚼回数の変化率が70 ％以下の個体を学習成立群

とすると，17匹のうち6匹（35 ％）で学習が成立しなかっ

たが，残りの11匹（65 ％）では学習が成立した。学習成

立群ではポストテストの咀嚼回数は36 ± 5 ％ （n = 11）

に減少し，コントロール群に比べて有意な差が見られた

（p < 0.01）。

図 4Aに，味覚嫌悪学習実験を行った個体に対して，

CGCの神経活動を細胞内電位記録で測定した結果を示

す。このような電気生理実験は，条件付けトレーニング

の24時間後に行った。24時間は長期記憶形成に不可欠

なタンパク質の合成に十分な時間であり，学習が成立し

た個体では短期記憶から長期記憶に移行しているものと

考えられる 7）。結果として，CGCの1分間当たりの平均

発火数はナイーブコントロール群では33.2 ± 5.4 （n =

4），学習不成立群では34.3 ± 5.5 （n = 5） であったのに

対して，学習成立群では12.2 ± 4.3 （n = 3） であり，他

の群に比べて有意に減少した（p < 0.05）（図 4B）。この

ようなCGCの活動低下がCPG，運動ニューロンの活動

低下を引き起こし（図2），咀嚼運動を減少させたものと

考えられる。本研究では，GABA作動性ニューロンをこ

のような味覚嫌悪学習に関わるニューロンの候補と考え

た。GABAは，哺乳動物においては抑制性神経伝達物質

として作用し，主に介在ニューロンから他のニューロン

ナイーブコントロール

学習不成立

学習成立

30 s

50 mV

ナイーブコントロール

学習不成立 学習成立

0

10

20

30

40

50

１分間当たりの平均発火数

A

B

図４

ナイーブコントロール

バックワードコントロール

学習成立

0

20

40

60

80

100

120

140

咀嚼

回数

の変

化率

（％

）

図３

図 3 味覚嫌悪学習実験によるモノアラガイの咀嚼回数の変化率．プレテストに対するポストテストの咀嚼回数の

割合（％）を咀嚼回数の変化率とした．＊＊p < 0.01．

図 4 （A）味覚嫌悪学習実験を行ったモノアラガイのCGCの神経活動の一例，（B）CGCの1分間当たりの平均発火数．＊p < 0.05．

337 （ ）

軟体動物ヨーロッパモノアラガイの味覚嫌悪学習による咀嚼調節ニューロンの神経活動変化

17

の増大は学習不成立群にも見られたが（72 ± 5 ％ ; n =

3），ナイーブコントロール群に対して有意なものではな

かった。以上の結果は，学習が成立した個体ではGABA

作動性ニューロンと結合するニューロン（CGC自体であ

ることも考えられる）のGABA感受性が増大しているこ

とを示す。結果として生じるそのニューロンの活動低下

が，CGCの活動低下を引き起こしているものと考えられ

る。また，このGABA感受性の増大はGABA受容体の数

や構造の変化によるものと考えられる。このような

GABA受容体の関与を確かめるため，単離した神経節に

GABAA受容体（イオンチャネル型GABA受容体）のアン

タゴニストであるビククリン（1 mM）を投与し，CGC

の神経活動の変化を調べた。この実験は味覚嫌悪学習実

験を行っていない個体に対して行った。その結果，ビク

クリンを投与することにより，CGCの 1分間当たりの平

均発火数が3.3倍 （n = 2） に増加した（図 6）。これは，

GABAA受容体が阻害されたことによってGABAの抑制

作用がなくなったためであり，CGCへの入力経路におい

てGABAA受容体が関与していることを示すものである。

本研究の結果および伊藤らの先行研究の結果 9）より，

モノアラガイの味覚嫌悪学習に関わる神経回路は図 7の

ようにまとめられる。GABA作動性ニューロンとしては，

カレキシチン（味覚嫌悪学習によって活性化するニューロ

ンの特異的マーカー）による神経節の免疫染色の結果 10）

とGABA作動性ニューロンの免疫染色の結果 11）から，

RPeD11細胞がその候補として挙げられる。RPeD11細胞

は神経節の1つであるpedal ganglionに存在する殻引込

み行動に関わるニューロンで，呼吸リズムを抑制する役

割を担う 12）。このRPeD11細胞が上記の 2つの染色実験

の両方で選択的に染色されていることから，学習成立後

のGABAの抑制作用の変化に関わっていることが示唆さ

れる。

4．結　論

本研究では，軟体動物ヨーロッパモノアラガイの味覚

嫌悪学習に着目し，それによって咀嚼調節ニューロン

CGCの神経活動にどのような変化が生じるかを調べた。

条件付けトレーニングにより咀嚼回数が減少した味覚嫌

悪学習の成立した個体では，CGCの1分間当たりの平均

図６

1 mM ビククリン

50 mV

120 s

Central Pattern Generator

運動ニューロン

CGC

N3t

N1MN2

B1

B3

条件刺激 無条件刺激

GABAによる調節（単シナプス？多シナプス？）

GABA作動性ニューロンを含む神経回路

図７

図5 （A）味覚嫌悪学習実験を行ったモノアラガイのGABAによるCGCの神経活動変化の一例，（B）CGCの 1分間当たりの平均発火数の変化率．GABAを投与する前に対する投与後の平均発火数の割合（％）を平均発火

数の変化率とした．＊＊p < 0.01．

図 6　ビククリンによるCGCの神経活動変化の一例

図 7 モノアラガイの味覚嫌悪学習に関わる神経回路（一部はE. Ito et al., PLOS ONE, 2012より，許可を得て改変の上転載）．黒丸（）は抑制性シナプス，白丸（）

は興奮性シナプスを表す．

1 mM GABA

250 s

50 mV

ナイーブコントロール

学習不成立

学習成立

ナイーブコントロール

学習不成立 学習成立

平均発火数の変化率（％）

0

20

40

60

80

100

120

140

A

B

図５

＊＊

斎藤　稔・加藤功弥・相川裕貴・川本祥悟・仲田正吾・小松崎良将

338（ ）18

謝辞

本研究で使用したヨーロッパモノアラガイは徳島文理大

学・伊藤悦郎教授から提供して頂いたものである。また，本

研究は平成25・26年度自然科学研究所総合研究（課題名：学際的分析法・解析法に基づく生命動態の解明）の助成を受け

行われたものである。ここに深く感謝致します。

発火回数も減少した。このCGCの活動低下がCPG，運

動ニューロンの活動低下を引き起こし，咀嚼運動を減少

させたものと考えられる。このような学習成立群では，

CGCの活動に対するGABA抑制作用が増大した。この

結果はGABA作動性ニューロンと結合するニューロン

（CGC自体であることも考えられる）のGABA感受性が増

大していることを示す。そのGABA感受性の増大は

GABA受容体の数や構造の変化によるものと考えられた。

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参考文献