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● シンポジウム 2　神経保護と神経再生

要　　旨　虚血再灌流時に人工酸素運搬体 liposome-encapsulated hemoglobin（LEH）を再開通動脈から灌流させることによる脳保護効果について報告する．ラットの一過性中大脳動脈閉塞再灌流モデルを用い，再開通した内頸動脈から LEHの灌流を 15分間行い，その脳保護効果について検討した．LEHの投与により，再灌流 24時間後の神経機能の改善，脳梗塞および浮腫面積の減少を認めた．LEHはラット赤血球よりも末梢微小血管まで灌流していた．LEHは，粒径が小さいことで狭小化した微小血管まで効果的に酸素を運搬し，微小血管内皮細胞の障害を抑制し，脳内への好中球の浸潤ならびに産生される matrix metalloprotease-9の産生を抑えることで脳血液関門の破綻を抑制し，脳保護効果を示すことが考えられた．再開通動脈からの LEHの経動脈的投与は，臨床においても虚血再灌流障害を軽減化する可能性がある．

（脳循環代謝　25：51～55，2014）

キーワード: liposome-encapsulated hemoglobin，虚血再灌流障害，血管内皮細胞，好中球，matrix

metalloprotease-9

1．はじめに

　虚血再灌流障害のメカニズムの一つとして，低酸素によって血管内皮細胞が障害されることで intercellular

adhesion molecue-1（ICAM-1）を発現，好中球を中心とする白血球の接着と活性化が起こり，matrix

metalloprotease-9（MMP-9）が産生され，blood-brain

barrier（BBB）を破綻させるという一連の反応が挙げられる．好中球を主体とする一連の反応を抑制する目的で，齧歯類での一過性中大脳動脈閉塞（transient middle

cerebral artery occlusion; tMCAO）モデルを使用し，全身性に好中球を抑制する実験が多く報告されているが1~4），全身性の好中球の抑制は感染症等の問題があり，臨床応用には至っていないのが現状である5）．

我々は，虚血領域局所での好中球の作用を抑制する新たな治療戦略として，人工酸素運搬体である liposome-

encapsulated hemoglobin（LEH）に着目した．LEHはヒト hemoglobin（Hb）を liposome内に封入したもので，血液型がないことで安全な輸血が可能であり，循環血液中での安定性と比較的長期の保存期間を可能とした輸血用赤血球製剤としてテルモ株式会社（東京，日本）で開発された6）．LEHは好中球を含めた白血球を含まないという特徴があり，我々はラットを用いた tMCAO

モデルにおいて再灌流動脈から LEHを虚血領域に向けて 2時間灌流することで，虚血領域への好中球の浸潤を抑制し，産生されるMMP-9の作用を軽減することで虚血再灌流障害の軽減化が得られることを示した7）．　本研究では，LEHは粒径が赤血球の 1/30～1/40であることからより末梢の組織まで灌流されうるという特徴に注目し，より短時間の LEH投与でも脳保護効果が示せるかどうかを検討した．

2．実験方法

　実験動物として 7～8週，雄の Sprague-Dawley（SD）

人工酸素運搬体 liposome-encapsulated hemoglobinの脳保護効果

新保　大輔1, 2，鐙谷　武雄1，七戸　秀夫1，中山　若樹1

数又　　研1，宝金　清博1，石塚　隆伸3

1北海道大学大学院医学部医学研究科脳神経外科2手稲渓仁会病院脳神経外科3テルモ株式会社研究開発本部〒 006-8555　北海道札幌市手稲区前田 1条 12-1-40

TEL: 011-681-8111　FAX: 011-685-2998

E-mail: dshimbod@gmail.com

脳循環代謝　第 25巻　第 2号

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ラットを使用した．Intraluminal suture methodを用いて一過性中大脳動脈閉塞（tMCAO）を作成し，2時間の虚血の後にラットを以下の 3群に振り分けた．LEH群（n=9）：糸栓子を抜去直後の内頸動脈に動物用カテーテルを挿入し，酸素化した LEHを 20 ml/kgで 15分間投与した．Vehicle群（n=8）：LEHの溶媒である生理食塩水を同様に投与した．Control群（n=8）：通常の再灌流のみを行った．24時間の再灌流を行った後に，ラットを sacrificeした．再灌流 24時間後の神経機能，脳梗塞および脳浮腫面積の評価を行い，脳内への好中球の浸潤，MMP-9の産生，微小血管内皮細胞の障害について，それぞれ抗 myeloperoxidase（MPO）抗体，抗MMP-9抗体，抗 ICAM-1抗体を使用して western

blottingを行った．MMP-9の活性化は gelatin zymography

を行い，BBBの破綻の程度については Evans Blue

（EB）の脳内漏出量を定量した．また LEHの特徴である，粒径が小さいことによる末梢組織への効果的な酸素運搬能について，ヒト Hb（LEHの構成要素），ラット Hbに対する免疫染色を行い，LEHとラット赤血球の灌流範囲を検討した．

3．結果と考察

　MCAO作成後の 18 point scaleによる神経機能評価8）

では，各群に差は認めなかったが，再灌流 24時間後には LEH投与群において神経機能の改善を認めた（図 1）．脳梗塞および浮腫面積は，Control群，Vehicle

群と比較し LEH群において有意な減少を認めた（図 2）．梗塞面積は皮質を中心に減少する傾向にあった．LEHの再開通内頸動脈からの 2時間投与によって

図 1．18 point scaleによる神経機能評価18 point scaleによるMCAO作成後と再灌流 24時間後の神経機能評価について示した．MCAO作成後は 3群いずれも 12点前後を示すが，再灌流 24時間後には Con-trol，Vehicle群では症状の悪化を認めた．LEH群では神経症状の改善を認めた．＊＊p<0.01: Tukey-Kramer test.

図 2．TTC染色による脳梗塞，脳浮腫面積の評価梗塞，浮腫面積は健常側比で示した．梗塞，浮腫面積ともに LEH群では Control，Vehicle群と比較して有意に小さかった．＊＊p<0.01: Tukey-Kramer test.

人工酸素運搬体 liposome-encapsulated hemoglobinの脳保護効果

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脳実質内への好中球の流入が抑制されることを我々は示したが，本研究での LEHの 15分投与においても，MPOの発現が低下，すなわち好中球の脳実質への浸潤が抑制されていることが示された（図 3）．同様にMMP-9の発現，活性も LEHの投与で抑制された（図 4）．好中球の浸潤が抑制されたことから，好中球由来のMMP-9の産生が減少したことが予想された．また，LEH群では脳実質内への EBの漏出量が少なく，BBBの破綻が抑えられていることがわかった（図 5）．これは好中球やMMP-9の作用の減少によるものと考えられた．次に，LEHの灌流範囲について図 6に示した．MCA皮質領域の末梢微小血管には，LEH群では多くのヒト Hbが存在する一方で，Control

群ではラット Hbはまばらに散在する程度であった．

図 3．脳実質内への好中球の浸潤抗MPO抗体を用いた western blottingの結果を示した．MPOの発現は LEH群において有意に抑制されており，脳実質への好中球の浸潤が抑制されていると考えられた．＊p<0.05, ＊＊p<0.01: Tukey-Kramer test.

図 4．MMP-9の発現および活性抗MMP-9抗体を用いた western blottingおよび gelatin zymographyの結果を示した．MMP-9の発現および活性はLEHの投与で抑制されることが示された．＊p<0.05, ＊＊p<0.01: Tukey-Kramer test.

図 5．BBBの破綻の程度EBの脳実質内への漏出量を定量化した．LEH群において有意に抑制されていた．＊p<0.05, ＊＊p<0.01: Tukey-Kramer test.

脳循環代謝　第 25巻　第 2号

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図 6．LEHの灌流範囲についての検討再開通内頸動脈からの LEHの 15分間の灌流直後に断頭採取した脳切片に対して，LEH群では抗ヒト Hb抗体（ヒト Hb→ LEHの構成要素），Control群では抗ラット Hb抗体（ラット Hb→ラット赤血球を示す）を用いて免疫染色を行った．MCA領域の皮質末梢において，Hbを内在する微小血管数を countした．Control群と比較し LEH群では Hbを含有する微小血管数が有意に多く，LEHは赤血球が到達しづらい末梢微小血管まで灌流することが示された．＊＊p<0.01: t-test.

図 7．内皮細胞の障害の程度抗 ICAM-1抗体を用いた western blottingの結果を示した．ICAM-1の発現は，LEH群において有意に抑制されており，LEHによる内皮細胞保護効果が考えられた．＊p<0.05, ＊＊p<0.01: Tukey-Kramer test.

Hbを内在する微小血管数は LEH群で有意に多かった．つまり，ラット赤血球が到達困難である末梢の微小血管まで LEHは灌流していることが示された．末梢微小血管への酸素供給が効率的に行われることで，内皮細胞の障害も抑制されることが予想されたが，実際に ICAM-1の発現は LEH群において有意に抑制されることが確認された（図 7）．　LEHの脳保護効果についてはいくつかの報告がある．KawaguchiらはMCA永久閉塞モデルで LEHを静脈投与し，皮質領域の脳梗塞が縮小したと報告しているが，微小血管内を蛍光顕微鏡で観察した結果，ラット赤血球と比較して LEHは微小血管をスムーズに灌流することを認めている9）．また，Hamadateら，Kakehataらはそれぞれラットの two-vessel occlusion

model，four-vessel occlusion modelを用いて，LEHを静脈内投与して認知機能が改善したと報告している10, 11）．これらはいずれも経静脈的投与による研究であるが，微小循環レベルでの LEHの酸素運搬能のアドバンテージが脳保護効果につながったと考察されている．近年，脳虚血再灌流傷害における微小血管の電子顕微鏡を用いた形態的検討で，Neurovascular unitを構成する astrocyteの end feetが膨化し，微小血管の内

空が狭小化，狭窄した微小血管内では赤血球はトラップされて血管閉塞を起こすことが報告されている12）．LEHはその粒径が赤血球の 1/30～1/40であるため，このような狭小化した微小血管を通過することで末梢組織の酸素化を改善していると考えられる．この酸素化の改善が引き続いて生じる血管内皮細胞の障害，ICAM-1の発現を抑え，好中球や産生されるMMP-9

の活動を抑制し，BBBを保護することで虚血再灌流傷害を抑制していると考えられた．

4．まとめ

　今回我々は，虚血再灌流時に再開通内頸動脈からの経動脈的 LEH投与の脳保護効果について検討した．LEHの脳保護効果は，粒径が小さいことで狭小化した微小血管まで効果的に酸素を運搬し，内皮細胞の障害を抑制していることに起因すると考えられた．急性期の虚血性脳血管障害の臨床では，rt-PAの静脈内投与に加えて血管内治療による閉塞血管の機械的血栓除去術も普及してきている．LEHの臨床応用をふまえた場合，機械的血栓除去術後に再開通した動脈から LEH

を投与することで虚血再灌流障害の軽減化が図れる可能性が示されたと考える．

文　　献

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Abstract

Neuroprotective effect of liposome-encapsulated hemoglobin as an artificial oxygen carrier

Daisuke Shimbo1, 2, Takeo Abumiya1, Hideo Shichinohe1, Naoki Nakayama1,

Ken Kazumata1, Kiyohiro Houkin1, and Takanobu Ishizuka3 1Department of Neurosurgery, Hokkaido University Graduate School of Medicine, Hokkaido, Japan

2Department of Neurosurgery, Teine Keijinkai Medical Center, Hokkaido, Japan 3R & D Headquarters, TERUMO Corporation, Tokyo, Japan

In the present study we examine whether the intra-arterial infusion of liposome-encapsulated

hemoglobin (LEH) via the recanalized internal carotid artery can have the neuroprotective effect on

ischemia-reperfusion (I/R) injury by using transient middle cerebral artery occlusion model of rats.

Neurological function was significantly improved and infarct and edema area were significantly reduced

in the LEH treatment group. LEH was distributed in more microvessels compared with rat erythrocyte.

Because of its small size, LEH can effectively deliver oxygen to narrow microvessels. This advantage

may contribute to the inhibition of endothelial damage, and, moreover, the inhibition of neutrophil

activation, neutrophil-derived matrix metalloprotease-9 production, and the breakdown of blood-brain

barrier. The intra-arterial infusion of LEH may be a promising candidate to prevent I/R injury after

thrombolysis and/or thrombectomy.

Key words: liposome-encapsulated hemoglobin, ischemia-reperfusion injury, endothelial cell, neutrophil, matrix metalloprotease-9