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REDVET. Revista electrónica de Veterinaria 1695-75042010 Volumen 11 Número 03

Hallazgo de Ehrlichiosis canina causada por E. canis en una Comunidad del Municipio deLeón, Nicaragua http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n030310/031002.pdf

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REDVET Rev. electrón. vet. http://www.veterinaria.org/revistas/redvet -http://revista.veterinaria.org Vol. 11, Nº 03, Marzo/2010– http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n030310.html

Hallazgo de Ehrlichiosis canina causada porE. cani s

enuna Comunidad del Municipio de León, Nicaragua Find of canine Ehrlichiosis caused for E. canis in aCommunity of León's Municipality, Nicaragua)

Vanessa Rivas Lara; Daniel Morales Arancibia; MiltonSaenz; José Luis Bonilla.

Centro Veterinario de Diagnóstico eInvestigación (CEVEDI), Dpto. SanidadAnimal, Escuela de Veterinaria,

Universidad Nacional Autónoma deNicaragua, León (UNAN - LEÓN)

Tutor principal: MSc. José Luis Bonilla, DMV.Microbiología e Inmunología Veterinaria Director CEVEDI Dpto.Sanidad Animal Escuela de Veterinaria UNAN-LEON e-mail: [email protected] , [email protected]

Resumen

La ehrlichiosis es una enfermad producida por bacterias intracelularesobligadas del género Ehrlichia que en los canes (Canis familiaris) secaracteriza por pancitopenia. El objetivo del presente trabajo es dar aconocer la situación de la Ehrlichiosis canina en una comunidad delmunicipio de León, mediante una evaluación sanguínea, tinción ydetección serológica a través de un test inmunocromatográfico.Materiales y Método: Tamaño y toma de muestra; El estudio serealizó en 27 caninos (Canis familiaris) tomados al azar pertenecientesa la Comunidad Rubén Darío, Municipio de León. Se realizó la toma demuestra de sangre entera mediante venopunción cefálica y se depositó

en tubos con y sin EDTA. Las muestras fueron remitidas al CentroVeterinario de Diagnóstico e Investigación (CEVEDI) de la Escuela deVeterinaria UNAN-LEON. Análisis de las muestras; A todas las muestrasse les realizó Biometría Hemática Completa (BHC), extendido periféricoy una prueba rápida para la detección de Ehrlichia canis. Resultados: De un total de 27 muestras se encontró un 70% de los animales convalores bajos de hematocrito, un 77,7% tenía los niveles dehemoglobina por debajo del parámetro fisiológico y el 85% de loscasos presentó un conteo eritrocitario bajo de lo normal. En elextendido periférico no se identificaron cuerpos de inclusiónintracitoplasmático en eritrocitos o leucocitos compatibles con





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Ehrlichia. A las 27 muestras se les realizó también un ensayoinmunocromatográfico (SNAP) donde se detectó E. canis en un 63% delos casos. Conclusiones: La mayoría de los animales presentó valoresde hematocrito, hemoglobina y conteo eritrocitario por debajo de los

parámetros fisiológicos. No se observaron cuerpos de inclusiónintracitoplasmáticos compatibles con erhlichia en trombocitos ymonocitos con la tinción de Giemsa. Se detectaron anticuerpos frente aEhrlichia canis, mediante el test inmunocromatográfico.

Palabras claves: Ehrlichia canis, perros (Canis familiaris),inmunocromatografía, biometría hemática completa.

Abstract

The ehrlichiosis is a disease produced by intracellular bacteria forced of the kind Ehrlichia that in the dogs (Canis familiaris) is characterized forpancytopenia. The aim of the present work is to announce the situationof the canine Ehrlichiosis in a community of León's municipality, bymeans of a blood evaluation, tint and serologic detection across animmunochromatographic test. Materials and Method: Size andcapture of sample; the study were carried out in 27 dogs (Canisfamiliaris) taken at random belonging to the Community Ruben Dario,

León's Municipality. There was realized the capture of sample of entireblood by means of cephalic venopuntion and settled in pipes with andwithout EDTA. The samples were sent to the Veterinary Center of Diagnosis and Research of the School of Veterinary, UNAN-LEON.Analysis of the samples; To all the samples they there was realizedComplete Biometry Blood, extended peripheral and a rapid test for thedetection of Ehrlichia canis. Results: Of 27 samples be found 70 % of the animals with low values of hematocrite, 77,7 % had the levels of hemoglobin below the physiological parameter and 85 % of the casespresented a count red blood low of the normal thing. In the widespread

peripheral bodies of inclusion were not identified intracitoplasmic in redblood or leukocytes compatible with Ehrlichia. To 27 samples (SNAP)realized also an immunochromatographic test where it was detected E.canis in 63 % of the cases. Conclusions: The majority of the animalspresented values of hematocrite, hemoglobin and count red bloodbelow the physiological parameters. Bodies of inclusion were notobserved intracitoplasmatics compatible with Erhlichia in trombocitesand monocites with Giemsa's tint. Antibodies were detected opposite toEhrlichia canis, by means of the immunochromatographic test.





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Keys Words: Ehrlichia canis, dogs (Canis familiaris),immunochromatographic test, complete biometry blood.

Introducción

La Ehrlichiosis es una enfermedad causada por una bacteriaintracelular obligada, Gram positiva, que requiere de un mamíferocomo reservorio y de un artrópodo como vector. Presenta tropismo porcélulas sanguíneas (leucocitos y plaquetas) de animales y humanos, einvade su citoplasma, alojándose dentro de vacuolas, donde semultiplica por fisión binaria, dando origen a un agregado de la bacteriao microcolonia, que por su apariencia se ha denominado "mórula"

(Pérez et al., 2006).

Actualmente este género comprende cinco especies, de las cualesEhrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis y Ehrlichia ewingii tienen lacapacidad de causar enfermedad en caninos y humanos (Buller et al.,1999; Pérez et al., 2006). Ehrlichia canis es la especie representantedel género y es el agente clásico causante de la ehrlichiosis monocíticacanina o pancitopenia tropical canina, importante no sólo por su ampliadistribución en el trópico y subtrópico de todo el mundo, sino también,por el hallazgo de afectación de humanos (Pérez et al., 2006). E

chaffeensis fue inicialmente reportada en infecciones en humanos yposteriormente en caninos, mientras que E. ewingii se encontró engranulocitos de perros enfermos y más tarde de forma inesperada enmuestras de humanos, existiendo hasta el momento evidenciamolecular de estos últimos dos agentes únicamente en Estados Unidos,además de un reporte de E. ewingii en perros de Camerún.

Para el diagnóstico de la ehrlichiosis se emplean diversas técnicaslaboratoriales como la identificación de cuerpos de inclusión en frotissanguíneos, el aislamiento primario mediante cultivo celular, la

detección de anticuerpos, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)y la secuenciación.

La evaluación microscópica de cuerpos de inclusión en frotissanguíneos resulta una técnica rápida, sencilla y económica, sinembargo, aproximadamente sólo en un 4% de los casos agudos esposible demostrar la mórula intracitoplasmática de E. canis (Waner yHarrus, 2000), mientras que para las demás especies no se reporta laeficacia de la prueba.





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En el caso del aislamiento in vitro de Ehrlichia, E. canis y E. chaffeensis han logrado cultivarse en la línea celular macrófago-monocítica caninaDH82, derivada de un caso de histiocitosis maligna canina (Dawson etal., 1991); sin embargo, E. ewingii no ha sido posible de aislar hasta la

fecha (Dawson et al., 1996; Dumler et al., 2001). Desventajasimportantes del aislamiento en cultivo celular, son la necesidad deexperiencia técnica y períodos prolongados de hasta 34 días para laobtención de resultados (Waner & Harrus, 2000; Standaert et al.,2000; Iqbal et al., 1994), lo que convierte a esta técnica en un procesocostoso, laborioso e impráctico para el diagnóstico oportuno de laenfermedad. El aislamiento en cultivo celular es considerado, sinembargo, como la “prueba de oro” para el diagnóstico de ehrlichiosis.

Las técnicas serológicas han sido ampliamente utilizadas en el

diagnóstico de ehrlichiosis debido a que son pruebas altamentesensibles; sin embargo, presentan la desventaja de que únicamenteevidencian un contacto con el agente sin determinar la existencia de laenfermedad o incluso la presencia o ausencia actual del agente en elanimal (Iqbal et al., 1994; Dawson et al., 1996; Murphy et al., 1998).Otra desventaja importante en el diagnóstico serológico, es el altogrado de reacción cruzada existente entre E. canis, E. chaffeensis y E.ewingii (Liddell et al., 2003); que dificulta la diferenciación entreespecies (Waner et al., 2001) y para el caso de E. ewingii, no existenpruebas específicas disponibles, por no haberse logrado aún ningún

aislamiento del agente en cultivo celular.

En relación a las técnicas moleculares, diversos estudios han mostradoa la técnica de PCR como un método efectivo y extremadamentesensible para la detección de especies de Ehrlichia, incluyendo a E.ewingii (Ndip et al., 2005). La técnica de PCR convencional basado enla amplificación de regiones del gen 16S ARNr de Ehrlichia hademostrado efectividad en muestras de sangre de humanos y perros,con un límite de detección de 20pg para ADN de E. canis extraído decélulas DH82 infectadas (Iqbal et al., 1994; Dawson et al., 1996), y se

han obtenido aún mejores resultados, utilizando una técnica de PCRtipo anidado, que ha incrementado la sensibilidad de la prueba hasta0.2 pg de ADN (Wen et al., 1997). Además, la técnica de PCR tipoanidado ofrece la ventaja de poder determinar las especies E. canis, E.chaffeensis y E. ewingii utilizando el mismo producto de la primerareacción. Esta técnica de PCR anidado, ha demostrado ser útil para eldiagnóstico de ehrlichiosis en distintas partes del mundo como Israel,España, Estados Unidos y México (Aguirre et al., 2004; Hori-Oshima etal., 2006), ya sea para diagnosticar los agentes en muestras dehumanos, venados, perros, garrapatas y coyotes (Kocan et al., 2000).





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Otra ventaja es, la capacidad de la prueba para detectar a los agentesaún en la fase temprana de la enfermedad y en la fase subclínica,permitiendo determinar animales portadores, incluso cuando no se halogrado establecer aún una respuesta inmune (Standaert et al., 2000),

permitiendo iniciar el tratamiento incluso antes de la manifestación designos clínicos.

Estudios sobre ehrlichiosis en caninos de Nicaragua son bastanteescasos. Aspectos epidemiológicos de relevancia, tales comoprevalencia, y especies involucradas son aún poco comprendidos.Igualmente, se desconoce si la misma especie de ehrlichia que afecta alos caninos podría estar asociada a procesos febriles en humanos quehan sido negativos por diagnóstico laboratorial a malaria, dengue,leptospirosis, entre otras. Por lo que el objetivo del presente trabajo es

dar a conocer el hallazgo de Ehrlichia canis en perros de la comunidadRubén Darío del municipio de León, mediante una evaluaciónsanguínea, tinción y detección serológica a través de un testinmunocromatográfico.

Material y Método

Tamaño y toma de muestra. Un total de 27 muestras sanguíneasfueron tomadas aleatoriamente por venopunción cefálica y periférica(oreja) en caninos (Canis familiaris). Los perros tenían aptitud de

compañía con un estado nutricional regular (desperdicios de cocina) ensu mayoría, casi todos los canes tenían presencia de ectoparásitos(garrapatas); pero aparentemente no presentaban ningún estadopatológico, ya que tenían un buen estado de alerta. Es importantemencionar que se tuvo el consentimiento de los propietarios pararealizar dicho trabajo, tomando en cuenta las buenas prácticas deasepsia y antisepsia a la hora de la toma de muestra por venopunción,el cualse realizó en casa de habitación de cada uno de los animales.Las muestras se depositaron en tubos con y sin EDTA y fueronremitidas al Centro Veterinario de Diagnóstico e Investigación

(CEVEDI), laboratorio de Biopatología de la Escuela de Veterinaria,UNAN-LEON.

Análisis de las muestras. A todas las muestras se les realizóBiometría Hemática Completa (BHC) tomando en cuentaprincipalmente los valores de Hematocrito, Hemoglobina y niveles deeritrocitos; en el extendido periférico se valoró la presencia de cuerposde inclusión compatibles con ehrlichia y finalmente a todas lasmuestras se les realizó una prueba rápida para la detección deEhrlichia canis.





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Nº Caso Hematocrito Hemoglobina Glóbulos Rojos Inmunocromatografía

Rango fisiológico 37-55 (%) 12-18,0 (g/dl) 5,5-8,5 (1012

/ l)

1 30 10 2,62 +

2 44 14,6 0,31 -

3 32 10,6 2,54 +

4 36 12 3,12 +

5 37 12,3 3,61 +

6 34 11,3 0,91 -

7 30 10 3,25 -

8 36 12 3,28 +

9 26 8,6 1,21 +

10 38 12,6 5,7 +

11 35 11,6 3,54 -

12 31 10,3 5,08 +13 39 13 3,15 +

14 40 13,3 4,86 +

15 32 10,6 2,19 -

16 30 10 5,77 -

17 28 9,3 2,19 -

18 28 9,3 6,33 -

19 22 7,3 3,19 +

20 34 11,3 3,58 +

21 45 15 3,51 +

22 29 9,6 1,01 -

23 22 7,3 3,9 +

24 30 10 1,02 +

25 26 8,6 1,75 +

26 20 6,6 1,48 -

27 41 13,6 3,07 +

La BHC se realizó según el Manual Práctico de Análisis Clínico enVeterinaria (Marca A., 1992). El frotis de sangre periférica se tiñó conGiemsa. Primeramente el extendido es fijado con metanol (100%)dejándose 5 minutos a temperatura ambiente, luego se tiñó con

solución Giemsa a razón de 3 ml de solución Giemsa diluido en 8 ml deagua destilada y se dejó 15 minutos secándose a temperaturaambiente, finalmente se lavó con agua de grifo y se dejó secar paraposteriormente ser observado al microscopio con un lente de 100X conaceite de inmersión (Marca A., 1992). Para la prueba serológica seutilizó un kit inmuncromatográfico canino para la detección deanticuerpos contra E. canis de IDEXX Laboratories, se les realizó a las27 muestras, utilizándose sangre total con anticoagulante o suero y elprocedimiento se llevó a cabo según las indicaciones del kit comercial.

Resultados y Discusión

De un total de 27 muestras de sangre completa con y sin EDTArecolectadas, se encontró un 70% de los animales con valores bajos dehematocrito, un 77,7% tenía los niveles de hemoglobina por debajodel parámetro fisiológico y el 85% de los casos presentó un conteoeritrocitario bajo de lo normal, tal como se muestra en la tabla 1. Enbase a los resultados obtenidos en la BHC se muestra una disminuciónmarcada de los valores hematológicos (Hematocrito, hemoglobina yGlóbulos Rojos) lo que significa que los pacientes caninos en su

mayoría presentaban síntomas de anemia.

Tab la 1 . Valores Hematológicos(Hematocrito, Hemoglobina yGlóbulos Rojos) y serologíaencontrados en caninos (Canisfamiliaris) muestreados en lacomunidad Rubén Darío,Municipio de León.

Tab la 2 . Cantidad y Porcentajede caninos (Canis familiaris)positivos al testInmunocromatográfico.

Técnica positivos Porcentaje

Microscopía 0/27 0%

Serología 17/27 63%





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De las 27 muestras que se les realizó el frotis del extendido periféricoteñidos con Giemsa, ninguno presentó cuerpos de inclusión dentro deplaquetas ni monocitos compatibles con Ehrlichia; según trabajosrealizados en otras localidades hacen referencia a la sensibilidad baja

de la técnica de tinción, lo que difulta evidenciar hemoparásitos pormétodos convencionales de parasitología o biopatología, necesitándosepara esto una alta parasitemia en el individuo; así lo confirma tambiénestudios realizados en Costa Rica donde han utilizado por muchotiempo técnicas microscópicas y que a pesar de ser muy útilespresentan baja sensibilidad (Rímolo, 2006). Cabe mencionar que lamuestra de los caninos fueron tomados aleatoriamente sin tomar encuenta la edad, el sexo y la raza; Sin embargo todos presentabanectoparásitos (garrapatas) unos en cantidades moderadas y otros enabundancia, esto pudo ser debido a las condiciones de la localidad, ya

que es una comunidad donde las calles son de tierra, existen muchosárboles y no hay un buen sistema de alcantarillado (aguas residuales).

Finalmente a las 27 muestras que se les realizó el ensayoinmunocromatográfico un total de 17 (63%) muestras resultaronpositivas a la prueba. Esto demuestra que el ensayo serológico esmucho más sensible. Es muy importante tomar en cuenta que éstaprueba (inmunocromatografica) es de tipo serológica y por ende puedepresentar ciertas limitantes, como la imposibilidad de discernir entreuna infección inicial, aguda, latente, crónica o pasada, ya que detecta

anticuerpos (Iqbal et al., 1994; Dawson et al., 1996; Murphy et al.,1998).

Estudios similares han demostrado la presencia de E. canis en perros,como el de Costa Rica, donde se identificó a 8 de 30 perrosseropositivos mediante serología SNAP 3X IDEXX (Luis Romero, 2007).

Conclusiones

La mayoría de los animales presentó valores de hematocrito,

hemoglobina y conteo eritrocitario por debajo de los parámetrosfisiológicos.

No se observaron cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos compatiblescon erhlichia en trombocitos y monocitos con la tinción de Giemsa.

Se detectaron anticuerpos frente a Ehrlichia canis, mediante el testinmunocromatográfico.

Es importante valorar en estudios posteriores la relación que puedatener E. canis detectada en el hombre, ya que por ser animales de





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compañía se mantienen en estrecha relación, así como la presencia degarrapatas, así lo demuestra un estudio realizado en Venezuela dondese detectó la presencia en sangre humana del ADN delmicroorganismo, diagnosticado morfológicamente como Ehrlichia

trombocítica, utilizando la prueba de reacción en cadena de lapolimerasa (PCR), observándose una migración electroforética igual ala de Ehrlichia platys, conocido agente de Ehrlichiosis trombocítica canina en el campo veterinario (Tamí I, Jordán L, 2002).

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REDVET: 2010, Vol. 11 Nº 03

Recibido: 09.11.09 – Ref. prov. NOV0919B – Revisado: 22.12.09 - Aceptado: 28.01.10Ref. def. 031002_REDVET - Publicado: 01.03.2010

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