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Dual Indexを持つLibraryのシーケンサーセットアップ

小林孝史

テクニカルアプリケーションサイエンティスト

2

Indexシーケンシングとはなにか？

解析を行うDNA断片（library）の端に、識別のためのインデックスが付加されてある

→それぞれのDNA断片がどのサンプル由来か同定が可能・簡単

ということは？

→サンプルを混ぜて（pooling)解析して、後でクラスターをそれぞれのサンプルに

振り分ければいい（de-multiplex）→多サンプル解析(multiplex analysis)が可能

必要な作業・試薬は？

→サンプル調製の際にインデックス配列をつける作業

→index配列を読むためのシーケンスプライマー

→解析のためのソフトウェア（イルミナの製品で全て揃います）

解析を行うDNA断片（Single-index library）の例

イルミナでは矢印の部分が

インデックス配列を指します

3

Dual-Indexシーケンシングとはなにか？

インデックス配列を両端に２つ持つライブラリを解析する

→一つのインデックスを持つもの（Single-Index; 最多24サンプル）よりも

たくさんのサンプル（Dual-Index; 最多96サンプル）の多サンプル解析が可能です！

ということは？

→１サンプル当たり、より経済的に安価に解析が可能です！

より具体的には、

１サンプルにつきデータ量がたくさん要らないサンプルについて

まとめて多くのサンプルを解析できる

MiSeq Output: max 8Gbases

必要なデータ量: 1Gbases

別なサンプル


別なサンプル


残った部分のデータは

実質捨ててしまう

4

Dual-Indexシーケンシングに用いるライブラリは？

P5 Index 2 P7 Index 1

解析を行うDNA断片（Dual-index library）の例

イルミナでは矢印の部分が

デュアルインデックス配列を指します

Index 1 (i7): P7配列近傍の8塩基：12種類

Index 2 (i5): P5配列近傍の8塩基：8種類

12 x 8 = 96種類の組み合わせ

Single-index library

5

Nextera kit全般

TruSeq Amplicon製品

TruSeq HT sample prep kit

かんたんに調製が可能

– TruSeq AmpliconとNextera kitでは専用のキットが用意されています

サンプル調製時(Nextera/TruSeq Amplicon)に:

– 96wellプレートの横にindex1の12個のチューブを並べ

– 次に縦にindex2の8個のチューブを並べる

– それぞれの組み合わせにより96個のインデックスの組み合わせが可能。

IlluminaのキットでDual-Indexを使用している製品は？

Index 1

Ind

ex 2

6

Nextera kit全般

TruSeq Amplicon製品

TruSeq HT sample prep kit


TruSeq DNA Adapter Plate (DAP)

TruSeq HT kitではDual-Indexの付加したアダプターは96wellプレートで用意しております

注意）一般的にキットが異なるとインデックスの配列も異なります。

一緒に解析したい場合には、サンプルシートの作成などご注意ください。

7

TruSeq HT Sample Prep Kits

- TruSeq DNA HT sample prep kit

Nextera Sample Prep Kits

- Nextera DNA sample prep kit

- Nextera XT sample prep kit

- Nextera Exome sample prep kit

TruSeq Amplicon Kits

- TruSeq TSCA sample prep kit

- TruSeq Amplicon cancer panel

Dual Index

ライブラリ


（まとめ）

8

Indexシーケンスの種類

シングルリードでSingle-Indexを読む

→短いリード、少ないサンプル

シングルリードでDual-Indexを読む

→短いリード、たくさんのサンプル

ペアエンドでSingle-Indexを読む

→長いリード、少ないサンプル

ペアエンドでDual-Indexを読む

→長いリード、少ないサンプル

実際の解析方法は？→フローセルの種類によって異なります

9

Region complementary to P5 grafting primer

Index 2

P5 primer

DNA insert

P7 primer

Index 1

P7 grafting primer

Flow cell surface

シングルリードのフローセルでDual-Indexを読む

10


P5 primer

DNA insert

P7 primer

P7 grafting primer

Read 1 sequencing primer

Flow cell surface

Read1のシーケンシングプライマーが結合

Index 2

Index 1


11


P5 primer

DNA insert

P7 primer

Sequence

P7 grafting primer

Flow cell surface

Read1を解析

(Read1)

Index 2

Index 1

Index 2

Index 1



12


P5 primer

DNA insert

P7 primer

P7 grafting primer

Sequence

Flow cell surface

Read1の伸長鎖を外す

Index 2

Index 1



13


P5 primer

DNA insert

P7 primer

P7 grafting primer

Flow cell surface

Index1のシーケンシングプライマーが結合

Index 2

Index 1

Index 1 Sequencing Primer


14


P5 primer

DNA insert

P7 primer

P7 grafting primer

Index 1 read – 8 cycles

Flow cell surface

Index1を解析

(Index1 read)


Index 2

Index 1


15


P5 primer

DNA insert

P7 primer

P7 grafting primer

Flow cell surface

Index1 readの伸長鎖を外す

Index 2

Index 1


16


P5 primer

DNA insert

P7 primer


P7 grafting primer

Flow cell surface

Index2のシーケンシングプライマーを結合

Index 2

Index 1


17


P5 primer

DNA insert

P7 primer



P7 grafting primer

Flow cell surface

Index2を解析→ラン終了

Index 2

Index 1


18

ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む

19


P5 primer

DNA insert

P7 primer

P7 grafting primer

Flow cell surface

Read1 Sequencing Primer

P5 grafting primer

Read1シーケンシングプライマーを結合

Index 2

Index 1


20


P5 primer

DNA insert

P7 primer

P7 grafting primer

SBS Sequencing Primer

Sequence

Flow cell surface

P5 grafting primer

Read1を解析

Index 2

Index 1


21


P5 primer

DNA insert

P7 primer

P7 grafting primer

SBS Sequencing Primer

Sequence

Flow cell surface

P5 grafting primer

Read1の伸長鎖を外す

Index 2

Index 1


22


P5 primer

DNA insert

P7 primer

P7 grafting primer


Flow cell surface

P5 grafting primer

Index1のシーケンシングプライマーを結合

Index 2

Index 1


23


P5 primer

DNA insert

P7 primer

P7 grafting primer

Flow cell surface

P5 grafting primer


Index1を解析

Index 2

Index 1



24


P5 primer

DNA insert

P7 primer

P7 grafting primer

Flow cell surface

P5 grafting primer


Index1 readの伸長鎖を外す

Index 2

Index 1


25

Flow cell surface

P5 grafting primer

保護基を外し、フローセル上の

P5 grafting primerに結合させる


26

Flow cell surface

7 chemistry only cycles

P5 grafting primer

画像を取得しない7cycle


27


Index 2 - 8 cycles

Flow cell surface

P5 grafting primer

Index2を解析

→フローセル上のDNA鎖を使用するので、

(Index2)プライマーは必要ない


28

Index 2 index read

8 cycles

Flow cell surface

P5 grafting primer

クラスターの再形成を行う（ブリッジPCR）



29

Original strand New strand

Flow cell surface

DNA鎖を変性する。


30

New strand

Flow cell surface

Read1で用いた鎖を切断し

P5のブロックする


31

Read 2 Sequencing Primer

Flow cell surface

Read2シーケンシングプライマーを結合


32

Read 2 Sequencing Primer

Sequence

Flow cell surface

Read2を解析→ラン終了


33

２つのインデックス配列（Index 1(i7) and Index 2 (i5) ）を持つDual Indexライブラリを解析。

最も多くて96種類のDual-Indexライブラリが作製できる (12 Index 1 x 8 Index 2)。

Dual-Indexライブラリは下記のキットで作製可能。

TruSeq HT、 Nextera各種、 TruSeq Amplicon kit.

Dual Indexの概要→:

ここまでのまとめ、Dual-Indexシーケンシングとは？

34

HiSeq/Genome Analyzerを使用する場合

35

Dual-Indexシーケンスに必要な試薬キット

ライブラリ

• Nextera sample prep kit

• TruSeq HT sample prep kit

クラスター

形成

• TruSeq Cluster Kit v2 – GA

• TruSeq Cluster Kit v3 – HS

シーケンス

• TruSeq SBS Kit v5 – GA

• TruSeq SBS Kit v3 – HS

シーケンス

プライマー

• Dual-Index Sequencing Primer Box – Nextera、TruSeq HT single flow cell

サンプル調製キット

cBot/cluster generation

HiSeq/GA

HiSeq/GA

36

TruSeq Dual-Index Sequencing Primer Kit

TruSeq Dual-Index Sequencing Primer Kit for Single-Read flow cell

HP10- Read1 sequencing primer mix

HP12- Index 1(i7) sequencing primer mix

HP9- Index 2 (i5) sequencing primer

TruSeq Dual-Index Sequencing Primer Kit for Paired-End flow cell

HP10-Read1 sequencing primer mix

HP12- Index 1 (i7) sequencing primer mix

HP11- Read2 sequencing primer mix

FC-121-1003 PE-121-1003

必要な時

Nextera各種のキットを使用して作製されたライブラリ

Single-Read TruSeq HT flow cellを使用してDual Indexランを行う場合

TruSeq あるいは Nexteraの各種のキットを使用して作製された全てのライブラリに対応

TruSeqとNexteraで作製されたライブラリを同じフローセルの別レーンで解析する場合

37

シーケンスプライマーについて

TruSeq HTライブラリ – Dual-

Index Sequencing Primer Kit,

Single-read flow cellが必要

Nexteraライブラリ – Dual-Index

Sequencing Primer Kitが必要

Single- Read FC

R1: HP6/10

I1: HP8/12

I2: HP9

Paired-End Read FC

R1: HP6/10

I1: HP8/12

I2: grafted

P5

R2: HP7/11

Single- Read FC

R1:HP10

I1: HP12

I2: HP9

Paired-End Read FC

R1: HP10

I1: HP12

I2: grafted

P5

R2: HP11

38

シングルリードのランに必要な試薬

IEMを用いた

サンプルシート

の作成

SBS試薬の

セット

Index read用の試薬のセット

それぞれの

シーケンス反応

の開始

Single-Index

#19: HT2

#18: Diluted HP3- 3.5mls

#17: HP8 か HP12

Dual index

#19: HT2

#18: Diluted HP3- 4mls

#17: HP8 or HP12

#16: HP9

39

シングルリードのランに必要な試薬

IEMを用いた

サンプルシート

の作成

SBS試薬の

セット

Index read用の試薬のセット

それぞれの

シーケンス反応

の開始

Single index

#19: HT2

#18: Diluted HP3- 3.5mls

#17: HP8 or HP12

Dual-Index

#19: HT2


#17: HP8 か HP12

#16: HP9

40

IEMを

用いた

サンプル

シート

の作成

SBS試薬のセット

Index readに用いる試薬のセット

Read1と Index read sequencing

Read2に使用する試薬のセット

Read2用のSBS試薬のセット

Read2の sequencing

Single-Index

#19: HT2

#18: Diluted HP3 -3.5mls

#17: HP8 か HP12

Dual index

#19: HT2


#17: HP8 or HP12

#10: RMX

ペアエンドのランに必要な試薬

41

Single index

#19: HT2

#18: Diluted HP3 -3.5mls

#17: HP8 or HP12

Dual-Index

#19: HT2


#17: HP8 か HP12

#10: RMX


IEMを

用いた

サンプル

シート

の作成






Read2の sequencing

42

IEMを

用いた

サンプル

シート

の作成






Read2の sequencing

Single-Index

RMXを含めすべての試薬をセット

Dual index

Prepare PE reagents except RMX


43

IEMを

用いた

サンプル

シート

の作成






Read2の sequencing

Single index

Prepare RMX along with all other reagents

Dual-Index

RMX以外の試薬をセット


44

必要なSBS試薬–HiSeq

ランの種類サイクル数総サイクル数 SBS Kits

(200-cycle)

SBS kits

(50-cycle)

Dual-

Indexed

Paired-End

101+8+(7)+8+101

225 -- 4*

93+8+(7)+8+93 209 1 4*

76+8+(7)+8+76 175 1 3

51+8+(7)+8+51 125 1 3

36+8+(7)+8+36 95 1 2

Dual-

Indexed

Single-

Read

101+8+8 117 1 2

76+8+8 92 1 2

51+8+8 67 1 2

36+8+8 52 1 1

45

必要なSBS試薬–HiSeq

ランの種類サイクル数総サイクル数 SBS Kits

(200-cycle)

SBS kits

(50-cycle)

Dual-

Indexed

Paired-End

101+8+(7)+8+101

225 -- 4*

93+8+(7)+8+93 209 1 4*

76+8+(7)+8+76 175 1 3

51+8+(7)+8+51 125 1 3

36+8+(7)+8+36 95 1 2

Dual-

Indexed

Single-

Read

101+8+8 117 1 2

76+8+8 92 1 2

51+8+8 67 1 2

36+8+8 52 1 1

46

HCS 1.5.15を使用してのRecipeの作成

47

Recipeの互換性- GA

ランの種類 Recipe

Non-Indexed Single-Read GA2_151Cycle_SR_v10

Single-Indexed Single-Read GA2-PEM(2X)_MP_151+7Cycle_SR_v8.5(px)- single-indexed library

GA2-PEM(2X)_MP_151+8Cycle_SR_v10(px)- dual-indexed library

Dual-Indexed Single-Read GA2-PEM(2X)_MP_151+8+8Cycle_SR_v10(px)

Non-Indexed Paired-End GA2-PEM(2X)_2x151Cycle_v10(px)

Single-Indexed Paired-End GA2-PEM(2X)_MP_151+7+151Cycle_v8.5(px)- single-indexed library

GA2-PEM(2X)_MP_151+7+151Cycle_v10(px)- dual-indexed library

Dual-Index Paired-End GA2-PEM(2X)_MP_151+8+8+151Cycle_PE_v10(px)

Single-Indexライブラリ: recipe v8.5

Index無しのライブラリとDual-Indexライブラリ: recipe v10

48

Recipeの互換性- GA

ランの種類 Recipe

Non-Indexed Single-Read GA2_151Cycle_SR_v10

Single-Indexed Single-Read GA2-PEM(2X)_MP_151+7Cycle_SR_v8.5(px)- single-indexed library

GA2-PEM(2X)_MP_151+8Cycle_SR_v10(px)- dual-indexed library

Dual-Indexed Single-Read GA2-PEM(2X)_MP_151+8+8Cycle_SR_v10(px)

Non-Indexed Paired-End GA2-PEM(2X)_2x151Cycle_v10(px)

Single-Indexed Paired-End GA2-PEM(2X)_MP_151+7+151Cycle_v8.5(px)- single-indexed library

GA2-PEM(2X)_MP_151+7+151Cycle_v10(px)- dual-indexed library

Dual-Index Paired-End GA2-PEM(2X)_MP_151+8+8+151Cycle_PE_v10(px)

Single-Indexライブラリ: recipe v8.5

Index無しのライブラリとDual-Indexライブラリ: recipe v10

49

Illumina Experiment Manager (IEM; 最新版はversion1.4）を使用しての

サンプルシートの作成をお薦めしております.

CASAVAで解析を行うためには必ずサンプルシートの作成が必要です

サンプルシートが作成されていればindex配列の情報がラン中に閲覧することが出来ます。

サンプルシートの作成- HiSeq/GA

CASAVA

50

ソフトウェアの互換性

Platform Control software * Analysis * Sample

sheet *

Sequencing

primers #

HiSeq1000/2000 HCS1.5 CASAVA1.8.2 Illumina

Experiment

Manager 1.2

TruSeq dual Index

sequencing primer

kit

Genome Analyzer SCS2.10 CASAVA 1.8.2 Illumina

Experiment

Manager 1.2

TruSeq dual Index

sequencing primer

kit

MiSeq MCS1.2 MiSeq

Reporter 1.1

Illumina

Experiment

Manager 1.2

--

* このバージョンより新しいもの

# Nextera由来のライブラリとSingle-Read TruSeq HT flow cellsを使用する場合に必要

51

シーケンスプライマー:

– Nextera ライブラリ、あるいはSingle-Read TruSeq HT flow cellを使用の場合:

Dual-Index sequencing primer box (SR: FC-121-1003; PE: PE-121-103)が必要

– Paired-End TruSeq HT flow cell: クラスターキット内のsequencing primerを使用

装置と解析用のソフトウェアのアップデートを忘れずに

Index read用の試薬:

SBS試薬

– たとえば、HiSeqで2x100 dual indexのランを行う場合には、23 cycles (8+7+8)分を考慮して50 cycle kits を４キット用意する必要が有ります

レシピ

– (HiSeq) HCS1.5を使用される場合は

7塩基のインデックス配列を読む場合にはTruSeq multiplex sequencing primer box

を、8塩基のインデックス配列を読む場合にはTruSeq Dual-Index sequencing primer

Kitを使用する。

– (GA) Dual-Indexライブラリを解析するにはGA recipe v10を使用する

まとめ

Single-Read Paired-End

HT2 HT2

Diluted HP3 Diluted HP3

HP8/HP12 HP8/HP12

HP9 RMX

52

MiSeqを使用される場合

53

Dual-Indexシーケンスのワークフロー

TruSeq

HT

TruSeq Amplicon

Nextera

P5 Index 2 Rd1 seq primer

P7 Index 1

Rd2 seq primer

Insert

54

「TruSeq Dual-Index Sequencing Primer Box (FC-121-1003, PE-121-1003)」は

MiSeqを使用される場合には必要ございません！

（MiSeqカートリッジに必要なプライマーがすべて入っている）

MiSeqのフローセルはPaired-Endのみです。

そのため、カートリッジにはHP09（index2プライマー）がありません。

必要なSequencing Primer

Position Reagent Name Description

12 HP10 Read 1 Primer Mix

13 HP12 Index 1 Primer Mix

14 HP11 Read 2 Primer Mix

55

MiSeq

Illumina Experiment Manager (IEM)を使用します。

MiSeqのOSであるMCS (MiSeq Control Software) は「ランの種類」や「サイク

ル数」についてサンプルシートを参照する設定になっておりますので、サンプルシートはすべてのランに必要になります。

Index配列の入力フォーマットはCASAVAとMCSで異なるので注意。

サンプルシートの作成

CASAVA

56

MiSeqを使用する際のまとめ

Dual-Indexシーケンスに必要なプライマーは、MiSeqのカートリッジに標準装備されています。

サンプルシートはそれぞれのランに対して用意します。

Illumina Experiment Manager (IEM; 現行version 1.4)を使用してサンプルシートを作成します。(MyIlluminaからダウンロード可能)

http://support.illumina.com/downloads/illumina_experiment_manager.ilmn



57

Sequencing Primersについて

58

TruSeq HT

Nextera

TruSeq Amplicon

MiS

eq

MiSeq reagent kit

Sequencing Primersについて（まとめ）

TruSeq Sequencing

primer box for SR

TruSeq HT

Single-Read

Paired-End PE cluster kit v3

TruSeq Sequencing

primer box for PE

HiS

eq1

000/2

000

Ge

no

me

An

aly

ze

r

Nextera

Single-Read

Paired-End

TruSeq Sequencing

primer box for SR

TruSeq Sequencing

primer box for PE

59

ペアエンドフローセル、ペアエンドライブラリを用いてDual Indexのシングルリードを行うことは出来ますか？

– Read2のサイクル数を0に設定すれば可能。その場合はIndex2を解析した時点で終了します。

Sequencing Analysis Viewer (SAV)でIndex readの結果が見られないのはなぜですか？

– ランを開始する前にサンプルシートが必要です。SAV v1.8以上のバージョンがインデックス情報を得るのに必要です。

Dual-IndexシーケンシングでRMXが使用されるのはいつですか？

– ペアエンドのランにはRMXはIndex 2 (i5) Readの際に必要です。

– Read 2では必要ではありません。

現行のTruSeq Dual-Index Primer KitはすべてのTruSeqライブラリに対応していますか? 昔 Epicentre社より販売されていました Nextera kitにも対応していますか?

– TruSeq Dual Index primer kitはIllumina Nextera primersに加えすべてのTruSeqライブラリに対応していますが、昔販売されていましたEpicentreのNextera kitには対応しておりません。

よくあるご質問リスト

60

Dual-IndexのインデックスランでもSingle-Indexの場合と同様に補正のための1サイクルが必要になりますか？

– No, 6塩基（＋補正1塩基）のSingle-Indexに比べてDual-Indexは8塩基の配列になるので補正のサイクルが必要になりません。

Dual-Indexシーケンシングでは通常のシーケンシングに比べてどれだけの時間がかかりますか？

– HiSeq でv3 SBS reagents とv3 flow cellを使用される場合、それぞれのサイクルごとに 53分 (計16サイクル（8+8）) とペアエンドの場合はケミストリーオンリーの7

サイクルに 2時間かかるので、通常のHiSeqランに比べて~16時間ほど必要です。

Illumina Dual-Indexライブラリはほかのライブラリと同一レーンで解析可能ですか？

– No, ですが同じフローセルで解析することは可能です。その際は、TruSeq Dual-

Index Sequencing Primer kitを必ずご使用ください。また、その際は Illumina PhiX

control libraryのスパイクインをお試しください。

Dual Indexing FAQs

61

ご清聴ありがとうございました。

ご質問は[email protected]でも承ります。

mailto:ご質問は[email protected]

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