dr. med. vet. pÁll em İke rezumat al tezei de doctorat ... · de perioada de incubare stabilit...

Teză de doctorat - Biotehnologia obŃinerii celulelor stem embrionare de şoarece şi diferenŃierea acestora pe linie cardiacă

UNIVERSITATEA DE ŞTIIN łE AGRICOLE ŞI

MEDICIN Ă VETERINAR Ă CLUJ-NAPOCA

ŞCOALA DOCTORAL Ă Facultatea de Medicină

Veterinară

Dr. Med. Vet. PÁLL EM İKE

REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT

BIOTEHNOLOGIA OB łINERII CELULELOR STEM EMBRIONARE DE ŞOARECE

ŞI DIFERENłIEREA ACESTORA PE LINIE CARDIACĂ

Conducător ştiin Ńific,

Prof. Univ. Dr. IOAN GROZA

CLUJ-NAPOCA 2009


CUPRINS

CERCETĂRI PROPRII.................................................................... III

SCOPUL LUCRĂRII ....................................................................... III

MATERIALE ŞI METODĂ ............................................................IV

REZULTATE ŞI DISCUłII ............................................................XI

CONCLUZII GENERALE .......................................................XXVII

RECOMANDĂRI PRACTICE ...............................................XXXIV

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ............................................ XXXVIII


CERCETĂRI PROPRII

SCOPUL LUCRĂRII

În evoluŃia ei, medicina a impus multe sisteme experimentale care au încercat să explice miracolul prin care o celulă fertilizată se transformă în blastocist şi cum ulterior această structură primară stă la baza tuturor Ńesuturilor specializate dintr-un organism. Se pare că răspunsurile care au derivat din aceste studii au intensificat şirul întrebărilor medicale, generând o nouă temă de cercetare: celulele stem embrionare. ImportanŃa acestei teme este incomensurabilă, oferind noi speranŃe de viaŃă, atât pentru cercetători, cât şi pentru pacienŃi, dată fiind posibilitatea utilizării acestor celule atât în medicina reparatorie, cât şi în cea regenerativă.

Studiile internaŃionale efectuate până în prezent în domeniul celulelor stem embrionare au demonstrat caracteristicile acestor celule, devenite în zilele noastre un instrument foarte important al medicinii regenerative. În România, există doar câteva studii care urmăresc această direcŃie de cercetare, acestea fiind axate preponderent pe elucidarea particularităŃilor celulelor stem adulte.

Scopul prezentei teze de doctorat este reprezentat de elaborarea şi implementarea unei metodologii de identificare şi iniŃiere de linii celulare stem embrionare murine, studierea caracteristicilor morfologice şi fenotipice cu stabilirea unor corelaŃii între modificările microclimatului celular, modificările morfologice, caracteristicile biologice şi nu în ultimul rând cele moleculare survenite la populaŃiile celulare luate în studiu.

Datorită existenŃei unor controverse de ordin bioetic şi a unui cadru legislativ insuficient reglementat cu privire la cercetarea în domeniul celulelor stem embrionare umane, rezultatele prezentei teze pot deveni un instrument util prin extrapolarea lor în vederea susŃinerii cercetărilor în acest domeniu şi, nu în ultimul rând, în beneficiul sănătăŃii umane.


Cercetările efectuate s-au orientat spre câteva obiective prioritare:

- identificarea şi evaluarea metodelor de recoltare a embrionilor murini în vederea obŃinerii celulelor stem embrionare murine; - izolarea şi cultivarea celulelor stem embrionare murine recoltate din masa celulară internă a blastociştilor preimplantaŃionali; - stabilirea caracteristicilor morfologice, fenotipice şi citochimice precum şi funcŃiilor acestor celule; - stabilirea corelaŃiilor existente între modificarea habitatului celular şi modificarea caracteristicilor morfologice, fenotipice şi culturale; - inducerea diferenŃierii pe linie cardiacă a celulelor stem embrionare obŃinute şi identificarea lor prin analize imunohistochimice; - testarea efectului cronotrop a unor substanŃe chimice in vitro pe populaŃia celulară diferenŃiată.

MATERIALE ŞI METOD Ă

Cercetările au fost realizate în perioada ianuarie 2007 - februarie 2009 în laboratoarele a trei centre de cercetare: Disciplina de ReproducŃie Obstetrică şi Ginecologie Veterinară Cluj-Napoca, Institutul Oncologic „Ion ChirichuŃă” Cluj-Napoca şi Institutul de Biotehnologii Godollo Ungaria în cadrul a două burse Junior acordate de Domus Hungarica

În cele ce urmează vor fi descrise pe scurt materialele şi metodele utilizate pentru obŃinerea, identificarea şi diferenŃierea celulelor stem embrionare murine.

Pentru obŃinerea de embrioni murini s-au utilizat 750 de şoareci aparŃinând liniilor: C57Bl/6, NMRI, CD1, CD1/EGFP şi Swiss Albino. Pentru augmentarea numărului de embrioni s-au utilizat poliovularea femelelor. Lotul martor a fost reprezentat de femele la care nu s-a realizat inducerea hormonală.Experimentele au


fost repetate de 5 ori utilizând câte 30 de femele din fiecare linie pe experiment.

Tratamentele hormonale cuprinse în programul poliovulator al lotului I, au constat în administrarea gonadotropinei serice - PMSG (Folligon) în doză de 7 U.I., urmată la 48 de ore de administrarea intraperitoneală de gonadotropină serică - hCG (Gonacor) în doză de 7 U.I. În dimineaŃa zilei următoare, fiind examinate în vederea constatării prezenŃei dopului vaginal care certifică monta. Această zi se consideră ca prima zi de gestaŃie (d0).

Sacrificarea femelelor gestante s-au realizat după 24, 48 şi 72 de ore de la apariŃia dopului vaginal. Consecutiv izolării şi recoltării oviductelor şi a uterului, s-a trecut la spălarea acestora cu mediu M2 preîncălzit la 37oC cu ajutorul unei seringi la care s-a adaptat un ac bont foarte fin (26 G; 0,3 mm)

În urma aprecierii morfologice, embrionii au fost clasificaŃi în două categorii:embrioni cultivabili şi embrioni necultivabili .

Pentru cultivarea embrionilor s-au utilizat 4 tipuri diferite de medii de cultură: M1 - KSOM (Potassium Simplex Optimized Medium) (preparat în laborator), suplimentat cu BSA (Albumină Serică Bovină); M2 - KSOM suplimentat original cu mediu condiŃionat; M3 - PBS (Phosphate buffered saline) (Sigma) suplimentat cu BSA (Sigma) şi penicilină-streptomicină (Gibco); M4) - DMEM (Dulbecco’s modified essential medium) conc (Gibco) suplimentat cu ser fetal (Hyclone), glutamax (Sigma) şi penicilină-streptomicină (Gibco).Cultivarea s-a realizat în incubator, respectând următorii parametrii: temperatura de 37oC, umiditate 90% şi CO2

6%. Prepararea mediului condiŃionat s-a realizat după o reŃetă

originală. Pentru preparare s-au utilizat explante de mucoasă oviductală mărunŃite şi cultivate timp de 24 de ore în mediul Knock-out DMEM (Gibco) suplimentat cu 10% FCS (Sigma), 1mM β mercaptoetanol (Sigma) şi 1% penicilină - streptomicină (Gibco).

Protocolul de cultivare s-a realizat în două sisteme, în funcŃie de perioada de incubare stabilită: cultivarea pe termen mediu (24 de ore) şi cultivarea pe termen lung (72 de ore).

Pentru păstrarea capacităŃii de pluripotenŃă, celulele ESCs necesită un substrat hrănitor, reprezentat de către fibroblaştii


embrionari murini inactivaŃi mitotic. Pentru obŃinerea liniei de fibroblaşti embrionari murini, şoricioaicele din linia CD1, cu vârste cuprinse între 8-10 săptămâni au fost supuse montei naturale, după 24 de ore fiind examinate în vederea evidenŃierii dopului vaginal. Sacrificarea şoricioaicelor gestante (CD1-SPF) s-a realizat după 13,5 zile de la apariŃia dopului vaginal, prin dislocare cervicală, toate manoperele desfăşurându-se în sala de operaŃie.

Mediile de cultură utilizate în experiment au fost preparate pornind de la mediul DMEM (Dulbecco’s modified essential medium) la care au fost adăugate diferite substanŃe (FCS, antibiotice, aminoacizi neesenŃiali, glutamină).Pentru tratarea enzimatică a carcaselor izolate s-a utilizat soluŃia de tripsin ă-EDTA . După tratarea enzimatică a carcaselor fetuşilor, filtrarea şi centrifugarea suspensiei celulare rezultată 1x105 celule au fost cultivate.

Pentru prepararea MEF cu Medimachine, bucăŃile de carcase au fost introduse cu ajutorul unei pensete sterile în Medicons prevăzut cu 4 cuŃite fine, peste care s-a adăugat 1 ml de PBS, bucăŃile fiind mărunŃite timp de 1 minut. Suspensia celulară după filtrare, centrifugare, stabilirea viabilităŃii şi cuantificare a fost cultivată pe cele 3 medii de cultură, la incubator, în mediu îmbogăŃit cu CO2, la 37°C. După 24 de ore s-a efectuat schimbarea mediului de cultură, iar după alte 24 de ore s-a efectuat primul pasaj. După 2 pasaje succesive fibroblaştii embrionari au fost conservaŃi prin congelare şi depozitaŃi la -80°C.

Pentru iniŃierea de linii celulare ESCs s-au utilizat 720 de blaştocişti, proveniŃi din cultivarea in vitro pe termen mediu a embrionilor murini recoltaŃi de la liniile de şoareci CD1 şi CD1/EGFP. Experimentele au fost repetate de 5 ori utilizând câte 144 de embrioni pentru un experiment: 72 embrioni din linia CD1 şi 72 din linia CD1/EGFP.

Pentru iniŃierea de linii celulare stem embrionare murine s-au utilizat 2 tipuri de medii de cultură diferite şi o cultivare alternativă în medii de cultură şi medii de condiŃionare preparate original .

Pentru fiecare experiment s-au utilizat în total 2 plăci multicompartimentate pretratate cu MEF primari şi două plăci multicompartimentate pretratate cu gelatină (12-12 embrioni /linie).În fiecare godeu s-a adăugat câte un embrion în stadiul de


blastocist. După 24 şi respectiv 48 de ore de cultură, s-a urmărit procentul de ataşare al embrionilor murini şi evidenŃierea celulelor din masa celulară internă (ICM).

Pentru acest protocolul alternativ s-au utilizat 2 tipuri de medii de cultură şi două medii de condiŃionare. Aceste medii au fost preparate având ca şi punct de plecare o cultură primară de fibroblaşti embrionari murini şi o linie celulară stem embrionară murină R1E/NA obŃinută din blastocişti de şoareci din linia V129.

După 48 de ore de cultivare s-au efectuat recoltarea mecanică şi tripsinizarea celulelor provenite din masa celulară internă. Fiecare masă celulară internă, individual recoltată, s-a plasat pe plăci multicompartimentate pretratate fie cu substrat celular inhibat mitotic, fie gelatina. S-a preparat câte o placă de cultură pentru fiecare tip de mediu de cultură şi substrat testat. S-au utilizat în total 5 tipuri de medii de cultură dintre care două medii de cultură pentru metoda de cultivare alternativă: Mediul Resgro (Chemicon) suplimentat cu Glutamax, Mediul Knock-Out DMEM suplimentat 2-mercaptoetanol (Sigma), Non essential amino acids (Sigma), mLIF (Esgro) FCS (Hyclone), Penicilina-streptomicină (Gibco), Mediul Knock´out DMEM cu CM1+CM2,2-mercaptoetanol (Sigma), Mediul de condiŃionare CM1, Mediul de condiŃionare CM2, Mediul de cultură MA-1 (Resgro medium complet1 mM L-glutamina (Sigma Mediul de condiŃionare CM1 Mediul de condiŃionare CM2), Mediul de cultură MA-2 (Serum free), Knock'out DMEM ,LIF, SR (Serum replecement), 2-mercaptoetanol 0,1 M, Mediu de condiŃionare (CM1), Mediu de condiŃionare (CM1). În cazul metodei alternative celulele din ICM au fost recoltate după 6 zile în acest timp efectuînd altrenarea celor două tipuri de medii de cultură.

Monitorizarea culturilor celulare s-a efectuat zilnic, cu schimbarea mediului de cultură din două în două zile. Prepararea primei subculturi s-a efectuat după 7 zile de cultivare, prin selectarea coloniilor cu morfologie ES-like cu ajutorul microscopului în fază inversă. Coloniile selectate au fost tripsinizate individual şi fără resuspendare, au fost reînsămânŃate pe plăci cu 4 godeuri pregătite cu substratul de fibroblaşti inhibaŃi mitotic, la o densitate de 500 000-1 000 000 celule/ godeu şi pe plăci pretratate cu gelatină porcină.


După pasajul 5 s-a efectuat analiza imunohistochimică şi

moleculară a coloniilor obŃinute în vederea demonstării pluripotenŃei acestor celule. Anticorpii primari utilizaŃi pentru experiment au fost: ac anti-Nanog, Oct4, SSEA-1,iar anticorpii secundari au fost: ac. anti-goat IgG şi ac. anti-mouse IgM. Pentru evidenŃierea diferenŃierii spontane a celulelor obŃinute s-a efectuat trensferul acestora pe plăci bacteriologice, iar mediul de cultură fiind privat de LIF.

Pentru identificarea coloniilor fosfatază alcalină pozitive s-a utilizat coloraŃia propusă de Anna Wobus şi col, îmbunătăŃită de Gocza Elen. Preparatele au fost examinate la microscopul cu epifluorescenŃă Zeiss Axioplan 2, iar pentru captarea imagii microscopice s-a utilizat softwerul Applied Imaging Cytovision.

Pentru cariotipare, cu 24 de ore anterior manoperelor, s-a efectuat pasarea celulelor pe substrat gelatinat, iar după 24 h celulele au fost tratate cu Colcemid (Gibco) timp de 2,5-3,5 ore. După tripsinizare şi centrifugare celulele au fost resuspendate în soluŃie de KCl 0,56% (necesară hipotonizării). O picătură din suspensia celulară fixată cu metanol: acid acetic a fost adăugată pe o lamă SuperFrost şi colorată cu soluŃie Giemsa 4%. Numărarea cromosomilor la microscopul optic.

Caracterizarea moleculară a pluripotenŃialităŃii celulelor stem embrionare murine a constat în identificarea expresiei genelor implicate în mecanismele de menŃinere a stării de nediferenŃiere: Oct4, Utf1, Fgf4, Nanog. După sintetizarea ADN complementar cu ajutorul unor primeri specifici de gene au fost identificate unele gene implicate în menŃinerea pluripotenŃialităŃii celulelor stem embrionare obŃinute în timpul experimentelor. Probele astfel preparate au fost introduse în aparatul PCR tip Perkin – Elmer Cetus. Pentru a Sox-2 şi Oct-4 s-au stabilit 25 de cicluri, pentru Nanog 30 de cicluri, iar pentru Fgf-4 şi Utf-1 40 de cicluri. Produşii de amplificare au fost vizualizate prin electroforeză în gel de agaroză.

Pentru inducerea diferenŃierii cardiace, celulele ESCs din liniile CDE1 şi CEO2 au fost agregate în picătură suspendată şi în suspensie.

Mediu de diferenŃiere utilizat a fost mediul: ISCOVE (IMDM) suplimentat cu penicilină, streptomicină, ser fetal bovin şi 1-tyoglicerol (Sigma), (MTG). SoluŃia stoc de 1-tyoglicerol s-a preparat proaspăt în momentul schimbării mediului.


Spălarea corpusculilor embrionari formaŃi s-a realizat după

48 de ore iar în a cincea zi, corpusculii embrionari au fost transferaŃi pe plăci gelatinizate, multicompartimentate pravăzute cu lamele histologice sterile necesare proceselor de identificare cu ajutorul pipetei Gilson.

Pentru testarea efectului cardioinductor al unor factori de creştere s-au utilizat factorii de creştere: BMP-2 6ng/ml, FGF 5ng/ml, IGF 10 ng/ml, BMP-4 1ng/ml, deasemenea s-a testat efectul acidului retinoic asupra celulelor ESCs.

Pentru coloraŃiile imunohistochimice ulterioare s-a efectuat recoltarea zonelor cu contracŃii spontane de la nivelule EBs (n=10) mecanic cu ajutorul pipetelor din sticlă.

Pentru identificarea potenŃialului cardiogenic cât şi pentru identificarea unor markeri ai pluripotenŃei s-au efectuat analiza imunohistochimică a corpusculilor embrionari, în ziua a 19 a diferenŃierii. Fixarea s-a efectuat cu 4% PFA.

Identificarea celulelor precursoare cardiace s-a realizat cu ajutorul anticorpului anti-titin şi anti actin, iar pentru identificarea celulelor precursoare mezenchimale timpurii a fost utilizată anticorpul anti-citokertain endo. Pentru evidenŃierea roluli LIF şi a FCS s-au utilizat linia celulară CDE1. S-au testat un mediu fără LIF şi trei concentraŃii de ser fetal şi anume 5%, 7% şi respectiv 15% şi a unei înlocuitor de ser (Serum Replacement). La atingerea subconfluenŃei culturii celulare luată în studiu s-au efectuat disocierea coloniilor celulare cu ajutorul tripsinei cu EDTA 1:4, pentru 10 minute la 37°C. După 8 zile s-au efectuat fixarea cu 0,4% PFA şi s-a calculat indexul de proliferare a coloniilor celulare pozitive şi negative pentru PA.

Pentru caracterizarea moleculară s-a utilizat probe prelevate la 3,5,7 şi respectiv 14 de zile de cultură de la care s-au izolat ARN pentru analize ulterioare. Pentru extracŃie s-a utilizat metoda fenol-cloroform, iar pentru precipitarea şi spălarea ARN izopropanolul şi alcoolul etilic de 75%. Elutia ARN izolat s-a efectuat cu apă MQ sterilă iar păstrarea probelor până la cuantificare s-a efectuat la 4°C. Pentru stabilirea concentraŃiei ARN s-a utilizat aparatul NanoDrop.


Pentru evaluarea funcŃiei cardiomiocitelor derivate din

celulele CDE1s-a testat efectul unor substanŃe cardioactive dintre care isoprenaline (antagonist al receptorilor β1- adrenergici), phenyleprine (antagonist al receptorilor α1- adrenergici) şi carbacol (antagonist al receptorilor muscrinici). Testările s-au efectuat în trei stadii de dezvoltare diferit şi anume: timpuriu 5d +3, intermediar, 5d +7 şi terminal 5d +14.Pentru aceste testări s-au utilizat câte 20 de EBs cu contracŃii spontane trataŃi cu 10ng/ml VEGF şi câte 20 de EBs netrataŃi reprezentând lotul martor.

Cu 5 minute înainte şi după fiecare tratament s-a efectuat înregistrarea ratei contracŃiilor pe 1 minut şi s-a calculat diferenŃele survenite după aplicarea medicaŃiei cardioactive. Doza de aplicare pentru fiecare substanŃă luată în studiu a fost de 10-5M.

Pentru analiza imunohistochimică a EBs s-au utilizat anticorpii primari: Anti – Brachyury, Anti – VEGFR, Anti – Nestin, Anti – α-Actin, Anti – Nanog şi anticorpii secundari : Ac. anti goat-Ig G, Ac. anti goat-Ig G, Ac. anti mouse-Ig G. Pentru detectarea unor transcripŃi specifici cardiaci s-au utilizat reacŃia RT-PCR. Seturi de primers pentru Desmin, Cadherin 5, GATA4, GATA 6, nestin, Nkx2.5, Acta 2, Klf4, Kdr, VEGFA au fost utilizaŃi pentru amplificare. SegvenŃa primerilor, dimensiunea fragmentelor, temperatura de elongare. CondiŃiile de amplificare au fost următoarele: denaturarea iniŃială la 94°C pentru 5 minute urmat de 30 de cicluri de denaturare la 95°C pentru 30 de secunde, elongarea la 59-70°C pentru 45 secunde (depinzând de primerii utilizaŃi) şi extensia la 72°C pentru 45 de sec.şi polimerizarea finală la 72°C pentru 10 minute. Toate probele s-au realizat în triplicat.

Produsele PCR au fost migrate în 2% gel de agaroză cu adaos de etidium-bromid, iar cu ajutorul transiluminatorului s-a efectuat vizualizarea prezenŃei sau absenŃei benzilor precum şi s-a estimat dimensiunea acestora, comparativ cu scara standardizată. După citire, gelurile au fost fotografiate, iar imaginile au fost stocate pe calculator. Cu ajutorul Real Time PCR au fost identificate concentraŃia relativă a unor gene implicate în cardiomiogeneză.


REZULTATE ŞI DISCUłII

De la cele două loturi experimentale, prin intermediul examinărilor la stereolupă, s-a reuşit prelevarea unui număr total de 4418 embrioni, 1329 fiind în stadiul 2 celule (33,66%), 1059 în stadiul de 4 celule (26,82%), 698 în stadiul de 8 celule (17,67%), 1087 în stadiul de morulă compactă (27,53%) şi 245 blastocişti tineri (6,20%).

Embrioni murini în diferite stadii de dezvoltare În urma evaluării celor 3086 de embrioni aflaŃi în stadiul de

2, 4 şi respectiv, 8 celule s-au constatat următoarele: • 2226 (72,13%) au prezentat formă sferică, regulată, cu

blastomere integre, fără vacuole şi granulaŃii; • 860 (27,86%) au prezentat modificări de formă, cu

membrana pelucida fisurată sau întreruptă şi blastomere neuniforme . După 24 de ore de cultivare la o temperatură de 37OC, pe

baza aspectelor morfologice, embrionii s-au încadrat în două categorii de calitatate:

• Embrioni utilizabili pentru iniŃiere de linie celulară ; • Embrioni degeneraŃi care prezentau citoplasma puternic granulată,

vacuolizată sau retractată, zona pelucida ruptă sau degradată


Comparând rezultatele cultivării pe termen mediu, în cele

patru medii de cultură, cele mai bune rezultate au fost obŃinute în cazul cultivării în mediul M2, suplimentat cu mediu condiŃionat, provenit din explant oviductal, unde procentul de dezvoltare a fost de 100% (50 embrioni), urmat de mediul M 1 pe bază de KSOM suplimentat cu BSA, unde s-a înregistrat un procent de dezvoltare de 96% (48 embrioni).Procentele de embrioni degeneraŃi au prezentat variaŃii destul de largi, ele încadrându-se între 4%, în cazul utilizării mediului M1 şi 56% în cazul utilizării mediului M3.

Reprezentarea grafică a rezultatelor cultivării pe termen mediu a

embrionilor din lotul I

Analizând rezultatele obŃinute în cazul lotului III se poate afirma că utilizarea mediul KSOM suplimentat cu mediu condiŃionat a dus la dezvoltarea blastociştilor din stadiul de blastocist tânăr până în stadiul de blastocist expandat. Procentul de embrioni degeneraŃi în cazul utilizării acestui amestec de mediu a fost de numai 8,33%.

Reprezentarea grafică a rezultatelor cultivării pe termen mediu a

embrionilor din lotul III


Comparând rezultatele maturării pe termen lung (48 ore), în

cele patru medii, se evidenŃiază cele obŃinute în mediul M 2, unde procentul de blastocişti apŃi pentru iniŃiere a fost de 52,2% în cazul embrionilor din Lotul I şi de 90% în cazul embrionilor din lotul II (55 embrioni), urmat de mediul M1, unde s-a înregistrat un procent de 20% la Lotul I şi respectiv 67,5% în cazul embrionilor din Lotul II. Procentele de dezvoltare consemnate în celelalte variante de medii au fost apropiate ca şi valoare situându-se între 10,76% pentru Lotul I şi 16,92% pentru lotul II.

Embrioni apŃi pentru iniŃiere de linie celulară

Comparând rezultatele cultivării in vitro pe cele două

perioade de timp, concluzionăm faptul că procentele de embrioni apŃi pentru studii ulterioare sunt foarte variate, ele încadrându-se între 41,66% şi 100%, în urma cultivării pe termen mediu şi între 10,76% şi 90% în urma cultivării pe termen lung. Totuşi, se poate observa un procent mai ridicat de embrioni ajunşi în stadiul de blastocist expandat în cazul cultivării pe termen lung, mai ales în stadiile de 8 celule şi morulă compactă.

În cazul preparării fibroblaştilor embrionari murini prin metoda enzimatică, s-au utilizat în total 4 femele gestante, aparŃinând liniei CD1(SPF). În total s-a lucrat pe 24 de fetuşi. În urma testării viabilităŃii celulare s-a obŃinut o viabilitate de 100%, iar după numărare, un total de 6.240.000 celule/100-mm. Celulele astfel obŃinute au fost repartizate în câte 2 plăci Petri, pentru fiecare tip de mediu utilizat calculând 1x105/ 10 cm placă.


După 12 ore de cultivare, în cazul utilizării mediilor FM1 şi

FM2, doar o mică parte din celule au fost ataşate la plăcile de cultură, majoritatea aflându-se în suspensie. După 24 de ore de cultură s-a constatat o confluenŃă între 10% (FM2) şi 30% (FM1) şi iar după 48 de ore de cultură o confluenŃă de aproximativ 40% după cultivare în FM1 şi 25% în cazul cultivării în FM2..

Fibroblaşti embrionari murini după 12-24 de ore de culturivare

Caracterele culturale al MEF cultivaŃi în mediile FM1 şi FM2

În urma testării viabilităŃii celulare s-a obŃinut după preparare cu Medimachine o viabilitate de 85%, iar după numărare 5.540.000 celule/100-mm. Celulele astfel obŃinute au fost repartizate în câte 2 plăci Petri pentru fiecare tip de mediu utilizat, calculând 1x105/ 10 cm placă.

După 12 h, în cazul utilizării mediilor FM1 şi FM2, aproximativ 10 -15% din celule au fost ataşate la plăcile Petri, restul


de celulele aflându-se în suspensie. Examinarea plăcilor după 24 de ore a indicat o confluenŃă de 20-30% iar după 48 de ore de cultură o confluenŃă de aproximativ de 45-55%, cu o viabilitate de 45%.

Colorarea celulelor obŃinute cu Hoechst (200x După examinarea embrionilor proveniŃi de la şoareci din

linia CD1, cultivaŃi timp de 24 de ore în mediul de cultură ESM-1 şi pe substrat MEF inhibaŃi mitotic, s-a constatat un grad de ataşare mediu de 85,00% ± 0,14 (SD), iar la embrionii liniei CD1/EGFP în aceleaşi condiŃii culturale s-a observat un grad de ataşare de 86,66% ± 0,113 (SD).

Cultivând blastociştii pe MEF cu mediul de cultură ESM-2 compus din TX-WES cu adaos de glutamină, s-a constatat un grad de ataşare mediu de 88,33% ± 0,124 (SD) la embrionii CD1 şi respectiv de 91,66% ± 0,09 (SD) la embrionii aparŃinând liniei CD1/EGFP.

Utilizarea plăcilor de cultură pretratate cu gelatină cu mediu de cultură ESM-1 permite un grad de ataşare mediu de 48,33% ± 0,20 (SD) la embrionii CD 1 după 24 ore, iar gradul de ataşare în cazul mediului de cultură ESM-2 a fost de 56,66% ± 0,22 (SD).

După 24 de ore de cultivare a embrionilor CD1/EGFP în mediul de cultură ESM-1 pe plăci gelatinízate, s-a constatat un grad de ataşare de 56,66% ± 0,22 (SD), iar în cazul utilizării mediului ESM-2, un grad de ataşare de 53,33% ± 0,16 (SD).


Embrioni CD1/EGFP la 12 şi 48 de ore de cultivare

Analiza globală a celor două substraturi de cultivare după 24

h indică faptul că, gradul de ataşare în cazul utilizării fibroblaştilor embrionari murini este mai mare decât al blastociştilor cultivaŃi pe gelatină (p<0,05, diferenŃă semnificativă din punct de vedere statistic).

Reprezentarea globală a gradului de ataşare al blastociştilor murini pe diferite substraturi

După analiza rezultatelor cultivării ICM pe substrat de MEF

după 8 zile de cultivare s-a constatat că mediul de cultivare cel mai


favorabil pentru creşterea şi diviziunea celulelor din ICM după tripsinizare a fost mediul 2 (53%), urmat de mediul 3 (53%) şi de mediul 1 (46%). Mediul 1 are însă avantajul inhibării creşterii celulelor din trofoblast şi din endodermul primitiv ajuns accidental în cultură, favorizând în acest fel dezvoltarea celulelor stem embrionare murine.

Analiza comparativă a celor trei medii de cultivare

în cazul celulelor din ICM provenite de la linia CD1 după 8 şi 11 zile de cultivare pe MEF

Analizând rezultatele cultivăriilor ICM pe plăci

multicompartimentate pretratate cu gelatină s-a constatat că mediul 3 a condus la obŃinerea celor mai mari procente de colonii ES-like (24%), urmat de mediul 2 (21%) şi de mediul 1 (15%), iar după 11 zile procentul cel mai ridicat de godeuri cu colonii ES-like s-a obŃinut tot în cazul mediului 3 (8%).

Analiza comparativă a celor trei medii de cultivare

la culturile tratate cu gelatină


În urma analizei rezultatelor cultivării după 8 zile, a celulelor

din ICM provenite de la linia CD1/EGFP pe substrat de MEF, s-a constatat faptul că, mediul de cultivare cel mai favorabil pentru creşterea şi diviziunea celulelor din ICM după tripsinizare, a fost mediul 2 (49% viabilitate) urmat de mediul 1 (47%) şi de mediul 3 (28%), iar după 11 zile de cultivare s-a observat un procentaj nemodificat în cazul mediului 3 (28%), cu scăderea aproape la jumătate în cazul celorlate medii şi apariŃia de colonii diferenŃiate.

Analiza comparativă a celor trei medii de cultivare în cazul celulelor din ICM de la linia CD1/EGFP după 8 şi 11 zile de cultivare pe MEF

În cazul celulelor provenite din ICM de la şoareci

CD1/EGFP cultivate pe plăci pretratate cu gelatină, s-a reliefat faptul că, mediul cu rezultatele cele mai semnificative după 8 zile de cultivare, a fost mediul 3 (20,83%), urmat de mediul 2 cu un procent de 12,50% şi de mediul1 (11,11%), iar după 11 zile de cultivare mediul care favorizează apariŃia coloniilor ES-like şi păstrarea stării de nediferenŃiere a fost mediul 3.

După 5 zile de la recoltarea celulelor din ICM (6d+5) de la blastocişti CD1 cultivaŃi pe MEF s-a constatat apariŃia unor colonii mici, compacte fără delimitarea netă a celulelor individuale, în medie la 7 godeuri (58,33%, procent calculat total per cele 6 experimente individuale), comparativ cu cele cultivate pe gelatină unde s-a înregistrat apariŃia celulelor ES –like, în medie la 3,66 dintre godeuri (30,55%).


Grafic. nr. 103 - Numărul coloniilor ES-like provenite din celulele ICM a

blastociştilor CD1 şi CD1/EGFP cultivate prin metoda alternativă

In cazul embrioniilor CD1/EGFP cultivaŃi în condiŃii culturale identice cu cele prezentate anterior, s-a constatat apariŃia coloniilor ES- like în medie la 4,16 dintre godeuri (34,72%) pe substrat monocelular, în timp ce în cazul substratului cu gelatină s-a identificat colonii ES–like în medie la 4,16 dintre godeuri (34,72%).Rezultatele cultivării pe cele două substraturi a celulelor recoltate din masa celulară internă au fost prelucrate statistic prin calcularea mediilor celor 6 experimente, a deviaŃiilor standard şi a testului Student - TTEST. Nu s-au identificat diferenŃe statistic semnificative între embrionii proveniŃi din cele două linii murine, valoarea p în cazul cultivării pe MEF a fost de 0,379, iar în cazul utilizării gelatinei ca şi substrat valoarea p a fost de 0,794.

În schimb s-au înregistrat diferenŃe statistic semnificative între cele două substraturi de cultivare atât la embrionii CD1 cât şi la embrionii CD1/EGFP.

Valoarea p la linia CD1 între cele două substraturi de cultivare a fost de p= 0,017 (p<0,05), iar la CD1/EGFP p=0,049 (p<0,05).

Reprezentarea globală a celor două linii şi a celor două substraturi de cultivare


Pentru identificarea caracterului de pluripotenŃă al celulelor

obŃinute, s-a efectuat inducerea formării de corpusculi embrionari prin privarea mediului de cultură de LIF şi cultivarea celulelor pe plăci bacteriologice. După 48 de ore s-a constatat apariŃia de mici agregate celulare. Aceste agregate teoretic conŃin diferite tipuri de celule provenite din cele 3 straturi embrionare: ectoderm, endoderm şi mezoderm şi celule stem nediferenŃiate identificate prin coloraŃia pentru fosfataza alcalină.

Pentru identificarea unor markeri ai pluripotenŃei, s-au efectuat analize imunohistochimice, iar rezultatele acestor analize demonstrează faptul că, culturile selectate de la linia CD1şi CD1/EGFP sunt pluripotente. După analiza cariotipului fiecărei linii celulare izolate s-a reliefat un cariotip normal (40) diploid.

Gel obŃinut în urma electroforezei a 4 dintre probele de ADN amplificate

( 1= CDE1, 2=CDE2, 3=CEO1, 4=CEO2, S= scară, M=martor)

După 24 de ore de cultivare a corpusculilor embrionari din picătură suspendată pe plăci gelatinizate s-a constata ataşarea unui număr de 85 (88,54%) corpusculi embrionari preparat din linia CDE1 şi un număr de 90 (93,73%) de S în cazul liniei CEO2. După 48 respectiv 72 de ore s-a constata un procent de ataşare de 92,70% în cazul EBs din linia CDE1 şi 95,83% în cazul liniei CEO2.

La corpusculii embrionari proveniŃi din agregare în suspensie după 24 de ore s-a constatat un procent de 69,76% EBs ataşaŃi în


cazul agregatelor din linia CDE1 şi un procent de 73,96% în cazul EBs din CEO2. După 48 respectiv 72 de ore s-a observat un procent de 89,58% EBs ataşaŃi din linia CDE1 şi 88,54% în cazul EBs din CEO2.

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24--

52,80%

53,93%

57,30%

60,67%

61,79%

69,66%

70,78%

73,03%

77,52%

78,65%

%E

B c

u co

ntra

cþii

% E

B w

ith c

ontr

actio

n

PerioadãPeriod

hEB_CDE1 hEB_CEO2

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24--

0,00%

54,65%

59,30%

62,79%

63,95%

66,27%

70,93%

%E

B c

u co

ntra

cþii

% E

B w

ith c

ontr

actio

n

PerioadãPeriod

sEB_CDE1 sEB_CEO2

Procentul corpusculilor embrionari proveniŃi din picături

suspendate şi din suspensie cu contracŃii spontane Analizând statistic (TTEST) procentajul EBs din linia CDE1

cu contracŃii spontane s-a constatat existenŃa unor diferenŃe semnificative statistic (p=0,006) în ceea ce priveşte rata contracŃiilor pe cele două substraturi de cultivare.

În cazul linie CEO2 nu s-au înregistrat diferenŃe semnificative statistic.

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24--

52,80%

53,93%

57,30%

60,67%

61,79%

69,66%

70,78%

73,03%

77,52%

78,65%

%E

B c

u co

ntra

ctii

spon

tane

%E

B w

ith s

pont

aneo

us

cont

ract

ions

Perioadã/Period

B C D E

Analiza global a corpusculilor embrionari obŃinuŃi

prin cele două metode de agregare


Prin utilizarea factorilor de creştere contracŃii timpurii

caracteristice, fără utilizarea vreunui stimul, s-a constatat în cazul corpusculilor embrionari la care s-a adăugat amestecul I şi FGF (5d+3).

Cu înaintarea perioadei de diferenŃiere s-a constatat creşterea numărului contracŃiilor spontane şi la restul corpusculior. zone contractile localizate încercuite de un halou de celule mai strălucitoare.

La corpusculii embrionari trataŃi cu BMP2 şi BMP4 s-a constatat contracŃii pe arii restrânse încercuite de un halou de celule mai strălucitoare. În cazul acestor corpusculi, contacŃiile apar tardiv, în ziua 15-a diferenŃierii deoarece se cunoaşte faptul că BMP-4 are un efect inhibitor asupra diferenŃierii cardiace.

Procentajul corpusculiilor embrionari care pulsează

Măsurarea zonelor de contracŃii spontane ale corpusculilor embrionari s-a realizat prin utilizarea microscopului Zeiss şi a softwerul Applied Imaging Cytovision.

S-a constatat zone cele mai mari de contracŃii în cazul EBs cultivaŃi în IGF 2104173, 1 ± 5444,1 µm urmate de corpusculii cultivaŃi în mediu de cultură cu FGF cu o medie de 62185,91 ± 4766,0 µm şi de BMP 2 cu o medie de 53859,17 ± 2314,07µm.

La corpusculii embrionari trataŃi cu acidul retinoic s-a observat apariŃia contracŃiilor spontane mai tardiv în medie la 9 zile după adăugarea pe plăci gelatinate iar intensitatea contracŃiilor au fost mai reduse (9-15 contracŃii/minut) şi de multe ori asincrone.

Pe lîngă markerii caracteristici lineajelor diferenŃiate au fost detectate şi markeri ale pluripotenŃei celulelor stem embrionare murine.

În cazul ambelor grupuri (lot martor şi lotul tratat cu VEGF) de corpusculi embrionari s-au observat apariŃia contracŃiilor spontane


după 1-4 zile de la cultivarea acestora pe plăci gelatinizate. Totuşi la corpusculii embrionari trataŃi cu factorul de creştere VEGF, EBs cu contracŃii spontane apar într-un procentaj mai redus faŃă de martor .

Deasemenea s-au efectuat şi măsurături ale dimensiunilor corpusculilor embrionari în primele trei zile de cultivare pe gelatină şi s-au constatat diferenŃe semnificative între cele două loturi de corpusculi embrionari.

La corpusculii embrionari trataŃi cu VEGF corpusculii embrionari au avut dimensiuni în medie de 129,95 µm ± 34,54 (SD) comparativ cu lotul martor unde s-au constatat dimensiuni în medie de 152,84 µm ± 41,51 (SD). Prin aplicarea testului t nu s-au obŃinut diferenŃe semnificative statistic, valoarea p a fost de 0,116. După 5d+8 s-au constatat apariŃia corpusculilor embrionari chistici mai ales la corpusculii embrionari netrataŃi cu VEGF.

La corpusculii embrionari în cazul cărora s-au efectuat tratament cu factorul de creştere VEGF s-au constatat apariŃia contracŃiilor spontane într-un procentaj mai ridicat 79,16% ± 4,97 (SD) comparativ cu lotul martor unde în medie procentajul corpusculilor înregistrat cu contracŃii spontane a fost de 58,33% ± 10,9 (SD). DiferenŃe cele mai semnificative (41,66%) s-au înregistrat după prima zi de cultivare a EBs pe gelatină.

După 17 zile de cultură a corpusculilor embrionari în cazul lotului tratat s-au constat creşterea ratei de contracŃie a EBs iar această rată a rămas constantă încă două săptămâni după terminarea experimentului cu apatriŃia de grupuri celulare cu contracŃii specifice musculaturii netede. La lotul netratat s-au observat o descreştere accentuată a ratei de contracŃie cu ocazia maturării celulelor diferenŃiate. PrezenŃa cardiomiocitelor în cele două loturi experimentale au fost confirmate prin analize imunohistochimice a EBs fixaŃi prin utilizarea unor anticorpi specifici. S-au înregistrat coloraŃii pozitive cu anticorpi β III tubulin, anti- nestin, brachyury, VEGFR, anti-smooth muscle actin,

FuncŃionarea receptorilor adrenergici s-au identificat prin tratarea EBs cu isoprenaline care este un antagonist a receptorilor β1 adrenergici şi prin aplicarea phenyleophrine care este antagonist pentru adrenoreceptorii α1. Schimbăriile ratei de contacŃii spontane au fost monitorizate cu ajutorul microscopului în fază inversată.


În stadiul timpuriu al diferenŃierii în cazul ambelor loturi

experimentale s-au identificat efect cronotropic pozitiv după aplicarea isoprenalinei.

În stadiul timpurii al diferenŃierii în cazul corpusculilor embrionari netrataŃi cu VEGF, înaintea aplicării tratamentului cronotrop s-au constatat în medie de 41,41 ± 4,95 (SD, n=20) de contracŃii pe minut.

În stadiul timpuriu şi intermediar al diferenŃierii creşterea ratei de contracŃie a fost mai mare la lotul tratat comparativ cu cel martor, diferenŃa fiind semnificativ statistic

(p<0,05). Răspunsul cronotrop în stadiul terminal al diferenŃierii a fost aproape similar la cele două loturi experimantale.Tratarea corpusculilor embrionari cu antagonistul adrenoreceptoriilor α1 phenyleophrina duce la creşterea frecvenŃei contracŃiilor în cazul ambelor loturi experimentale. Nu s-au constatat diferenŃe semnificative între loturile tratat cu VEGF şi la loturile netratate.Tratamentul cu Carbacol (antagonist al colinoreceptorilor muscarinici) duce la scăderea ratei contracŃiilor în ambele loturi experimentale. Efect negativ semnificativ s-a observat în stadiul timpuriu al diferenŃierii la ambele loturi experimentale. În stadiul intermediar şi terminal al diferenŃierii nu s-au înregistrat modificări semnificative între cele două loturi.

ARN din probele biologice tratate cu TriReagent au fost izolate prin metoda fenol-cloroform iar pentru stabilirea concentraŃiei de ARN (262, 263, 264) a fost utilizat aparatul Nanodrop.

Reprezentarea grafică a concentraŃiilor de ARN izolat din EBs


După sinteza AND complementar prin utilizarea unor sonde

fluorescente şi a primerilor specifici pentru genele implicate în diferenŃierea cardiacă şi endotelială (GATA 4, GATA6, Kdr,nestin, desmin, Nkx2,5, Acta 2, Tie 2, Klf4, VEGFA) s-a efectuat sinteza şi amplificarea secventelor de ADNc. S-au evidenŃiat o heterogenitate în expresia genelor studiate înregistrând supra cât şi subexpresia acestora. Expresia genelor cardiace α-MHC şi β-MHC au fost detectate atât în stadiul timpuriu (5d+3) cât şi în cel intermediar (5d+7) al diferenŃierii pe linie cardiacă. Expresia genei ANF a fost deasemenea identificată. Gena ANF are rol rol în specificaŃia camerală. Expresiei genei T (Brachyury) apare în stadiile timpurii ale diferenŃierii. Nu s-au constatat diferenŃe semnificative între loturile tratate şi cele martor. S-a constatat deasemenea o descreştere semnificativă a expresie în stadiul intermediar şi terminal al diferenŃierii.

La reacŃia de RT –PCR concentraŃia relativă a fiecărui probe luate în studiu a fost normalizată cu ajutorul expresiei genei de referinŃă GAPDH.

După analizarea comparativă a concentraŃiilor relative în cazul corpusculilor embrionari de 8d netrataŃi cu Vegf s-a obŃinut o concentraŃie relativă de 0,95 ± 0,02 (SD), comparativ cu corpusculii embrionari de 12 d unde s-au înregistrat o scădere a concentraŃiei relative până la 0,625 ± 0,09 (SD). În cazul acestor corpusculi embrionari trataŃi cu 10 ng/ml de Vegf s-au identificat o concentraŃie relativă de 0,63 ± 0,07 (SD) la corpusculii embrionari în stadiul timpuriu al diferenŃierii. La EBs de 12 d trataŃi cu Vegf concentraŃia relativă a fost de 0,685 ± 0,15 (SD). ConcentraŃia relativă a fost cea mai mare a fost înregistrată la corpusculii embrionari netrataŃi cu Vegf în stadiul timpuriu al diferenŃierii.

La a doua amplificarea a genei T (la care s-au utilizat EBs de 12 respectiv de 19 zile) concentraŃiile relative în cazul ambelor loturi experimentale a fost 0, ceea ce demonstrează faptul că concentraŃia relativă a genei T scade drastic cu înaintarea diferenŃierii.


Media concentraŃiilor relative înregistrate în cazul genei Kdr şi T Cardiomiocitele generate din mESCs prezintă activitate

contractilă spontană, iar studiile moleculare şi fenotipice demonstrează că aceste celule sunt cardiomiocite. Cardiomiocitele derivate din mESCs au o rată de contracŃie aproximativ 30- (88)130 de minute şi răspund la un număr de substanŃe farmaceutice. De exemplu rata contracŃiilor şi amplutidinea contracŃilor creşte după adăugarea de Isoproterenol un antantagonist a receptorului beta 1 adrenergic în timp ce răspuns cronotropic negativ a fost observat după adăugarea de Carbachol un antantagonist muscarinic.


CONCLUZII GENERALE

În urma cercetărilor efectuate în perioada 2005 - 2009 şi interpretării rezultatelor obŃinute, am considerat necesară cumularea principalelor concluzii şi punctarea în special a celor cu aspect practic:

1. tratamentul poliovulator realizat cu produsele Folligon şi Gonacor a permis sporirea numărului mediu de embrioni recoltaŃi/şoricioaică la 10,16 (p<0,05), diferenŃă semnificativă din punct de vedere statistic);

2. s-a constatat capacitatea mai bună de răspuns la terapia de inducere a poliovulaŃiei a liniei CD1/EGFP, cu media embrionilor recoltaŃi (20 ± 9,5) (SD) de embrioni/ donatoare(p<0,05, diferenŃă semnificativă din punct de vedere statistic);

3. aprecierea morfologică a embrionilor după recoltare permite identificarea şi selecŃia celor cu potenŃial pentru parcurgerea etapelor de dezvoltare, condiŃie esenŃială pentru utilizarea lor ulterioară în vederea iniŃierii liniilor celulare stem embrionare murine.

4. comparând rezultatele cultivării pe termen mediu, se evidenŃiază rezultate semnificative în cazul utilizării mediului KSOM suplimentat în proporŃie de 1:1 cu mediu condiŃionat, preparat din explante oviductale murine, unde procentul de maturare este de 91,66 % pentru lotul III şi 100% pentru lotul II, urmat de mediul M1 pe bază de KSOM, suplimentat cu BSA unde s-a înregistrat un procent de maturare de 99% pentru lotul II şi 83,33 pentru lotul III.

5. procentele de maturare consemnate în celelalte variante de medii au fosit apropiate ca şi valoare situându-se între 44% şi 46% pentru lotul II şi 41,66 şi 50% pentru lotul III. Procentele cele mai mici de embrioni pretabili pentru iniŃierea maturării s-au obŃinut în cazul utilizării soluŃiei PBS cu BSA

6. utilizarea şoricioaicelor gestante din linia CD1 (SPF) permite obŃinerea unor culturi de fibroblaşti de calitate superioară, cu


evitarea pericolului de apariŃie a unor infecŃii primare de origine fetală (testul pentru detectarea Micoplasmei spp., fiind negativ);

7. în urma cultivării fibroblaştilor în mediul de cultură M1, obŃinuŃi prin prelucrarea carcaselor cu Medimachine, s-a înregistrat un procent de ataşare de 15%, după 12 h de cultură, o confluenŃă de 20%, după 24 de ore şi 55% după 48 de ore, viabilitatea înregistrând valori de de 45% după 24 de ore şi 55% după 48 de ore de cultivare;

8. prin analiza globală a celor două substraturi de cultivare a blastociŃilor murini putem aprecia că, gradul de aderare pe substratul MEF precum şi utilizarea mediului ESM-2 permit o bună ataşare a embrionilor murini din ambele linii de şoareci, comparativ cu cei cultivaŃi pe substratul de gelatină (p<0,05 diferenŃă semnificativă din punct de vedere statistic);

9. cultivarea embrionilor CD1 pe substrat celular prin utilizarea alternativă a două medii de cultură cu componente preparate original, permite un grad de ataşare mediu de 76,66% ± 0,08 (SD) după 24 de ore, iar după schimbarea mediului de cultură o ataşare de 82,50% ± 0,07(SD);

10. comparând rezultatele obŃinute pentru gradul de ataşare prin cele două metode (cultivarea pe MEF şi gelatină în medii speciale şi cultivarea prin metoda alternativă) se poate concluziona faptul că, utilizarea mediului ESM-2 în combinaŃie cu substratul celular (MEF) permite o mai bună ataşare a embrionilor murini din ambele linii, comparativ cu cultivarea embrionilor pe gelatină.

11. utilizarea liniei murine CD1/EGFP permite identificarea cu uşurinŃă la microscopul cu epifluorescenŃă a celulelor din masa celulară internă şi a coloniilor ES-like derivate ulterior, datorită integrării randomizate a proteinei GFP;

12. tripsinizarea celulelor din ICM nu trebuie să depăşească 10 minute, iar pentru apariŃia timpurie de colonii ES-like nediferenŃiate este necesară cultivarea celulelor ICM în conglomerate mici (5-6 celule) care se obŃin prin pipetări repetate ;


13. prin utilizarea mediului de cultură 1 compus din mediul

special Resgro Complet (Chemicon) în cazul embrionilor CD1, în combinaŃie cu monostratul celular, s-a remarcat apariŃia după 8 zile (3 +5d) a coloniilor mici ES-like recunoscute după aspectul compact, cu imposibilitatea observării de celule individuale, în medie la 5,5 (45,83%) dintre godeuri;

14. caracterele culturale pe gelatină suferă modificări majore şi anume, s-au constatat colonii aplatizate cu tendinŃă de dezlipire de pe suprafaŃa plăcii de cultură şi un grad avansat de diferenŃire, iar după 11 zile de cultivare s-a remarcat dezlipirea şi diferenŃierea celulelor ES-like;

15. mediul 2 compus din Knock´out DMEM suplimentat cu FCS, NEA, glutamină, β-mercaptoetanol, P-S şi LIF duce la apariŃia de colonii ES-like în medie la 6,5 (54%) dintre godeuri în cazul embrionilor CD1, remarcându-se de asemenea apariŃia celulelor endoderm-like şi a celor gigante din trofoblast;

16. la linia de şoareci CD1/EGFP pentru iniŃiere de linii celulare stem embrionare murine s-au utilizat 72 de embrioni (totalul a celor 6 experimente individuale);

17. la 8 zile de la recoltare, în cazul ICM de la linia CD1/EGFP s-a remarcat apariŃia coloniilor ES-like bine individualizate cu celule gigante şi poligonale, în medie la 5,66 (47,22%) dintre godeuri, iar după 11 zile în condiŃii de creştere similare, s-au identificat colonii ES-like într-o medie de 3,16 (26,33%) dintre godeuri, la restul godeurilor s-au identificat colonii cu tendinŃă accentuată de diferenŃiere;

18. după prelucrarea statistică a rezultatelor cultivării pe cele două substraturi a celulelor recoltate din masa celulară internă nu s-au identificat diferenŃe statistic semnificative între embrionii proveniŃi din cele două linii murine, valoarea p în cazul cultivării pe MEF a fost de 0,379, iar în cazul utilizării ca şi substrat a gelatinei valoarea p a fost de 0,794. Dar, în schimb, s-au înregistrat diferenŃe statistic semnificative atât între cele două substraturi de cultivare, cât şi între embrionii CD1 şi embrionii CD1/EGFP;


19. valoarea p la linia CD1 între cele două substraturi de cultivare

a fost de p= 0,017 (p<0,05), iar la CD1/EGFP de p=0,049 (p<0,05);

20. prezenŃa acestui factor de transcripŃie paralel cu păstrarea morfologiei celulare după mai multe pasaje şi a caracterului diploid (40), demonstrează pluripotenŃa liniilor obŃinute;

21. după 24 de ore de cultivare a corpusculilor embrionari din picătură suspendată pe plăci gelatinizate s-a constata ataşarea unui număr de 85 (88,54%) de corpusculi embrionari preparat din linia CDE1 şi un număr de 90 (93,73%) de EBS în cazul liniei CEO2;

22. la 48 respectiv 72 de ore s-a constatat un procent de ataşare de 92,70% la EBs din linia CDE1 şi 95,83% la linia CEO2;

23. procentul de corpusculi embrionari neataşaŃi proveniŃi de la linia CDE1 a fost de 7,29% şi de 4,34% la EBs din linia CEO1. Media corpusculilor ataşaŃi pe substat cu gelatină a fost de 94,22% ± 0,02(SD);

24. la EBs din picături suspendate proveniŃi de la linia CDE1 s-a constatat apariŃia contracŃiilor spontane după 7 zile de cultură (2+5d) într-un procent de 52,80%, la linia CEO2 în procent de 66,30%;

25. rata contracŃiilor spontane din ariile de contracŃie prezintă o ascensiune cu înaintarea diferenŃierii cu observarea unor platouri între zilele 15 şi 18 (78,65%) la EBs din CDE1 după care apare o descreştere accentuată;

26. la EBs CEO2 din agregarea în picătură s-a constatat o descreştere a contracŃii spontane din ziua 17-a a diferenŃierii direcŃionate;

27. contracŃiile spontane la EBs din suspensie apar la10 zile (2+7d) cu un procent de 62,79% (n=54) în cazul corpusculilor CDE1 şi la 9 zile cu un procent de 57,64% (n=49) la CEO2;

28. în ziua fixării numărul corpusculilor cu contracŃii spontane a fost de 47 (54,65%) cu o medie de 51,50% ± 0,24 (SD) în cazul linie CDE1 şi de 40 de EBS (47,05%) cu o medie de 48,53% ± 0,18 (SD)a contracŃiilor spontane.


29. analiza statistic (TTEST-Origin 7) procentajul EBS din linia

CDE1 cu contracŃii spontane s-a constatat existenŃa unor diferenŃe semnificative statistic (p<0,005) în ceea ce priveşte rata contracŃiilor pe cele două substraturi de cultivare. În cazul linie CEO2 nu s-au înregistrat diferenŃe semnificative statistic;

30. prin analiza globală a corpusculilor embrionari proveniŃi din liniile CDE1 şi CEO2 s-a reliefat faptul că pentru inducerea diferenŃierii pe linie cardiacă cu rezultate semnificative pot fi folosiŃi corpusculii embrionari proveniŃi din picătură suspendată;

31. utilizarea factori de creştere: IGF, FGF, BMP2, BMP4 şi două amestecuri dintre aceasta contracŃii spontane ritmice apar după 8 zile de diferenŃire;

32. la EBs trataŃi cu BMP2 şi BMP4 contacŃiile apar tardiv, în ziua 15-a diferenŃierii deoarece datorită efectului inhibitor al BMP-4;

33. tratarea cu factorul IGF a EBs duce la apariŃia contracŃiile caracteristice în ziua17 a diferenŃierii;

34. zone cele mai mari de contracŃii s-au înregistrat la EBs trataŃi cu IGF 2104173, 1 ± 5444,1 µm urmate de corpusculii cultivaŃi în mediu de cultură cu FGF cu o medie de 62185,91 ± 4766,0 µm şi de BMP 2 cu o medie de 53859,17 ± 2314,07µm.

35. tratarea EBs cu carotenoidul organic acidul retinoic a indus dezvoltarea paralelă a lineajului cardiac şi cel neural;

36. după 12 zile de cultivare a EBs în suspensie trataŃi cu RA s-au observat apariŃia unor fimanente foarte subŃiri între grupurile de celule cu contracŃii ritmice, s-a constatat deasemenea apariŃia unor celule elongate cu interpunere între două grupuri de celule cu contracŃii spontane;

37. s-a constatat că adaosul de acid retinoic la mediul de cultură în faza iniŃială duce la inhibarea diferenŃierii pe linie cardiacă cu favorizarea dezvoltării celulelor nervoase;

38. numai la corpusculii embrionari obŃinuŃi din agregare în suspensie, trataŃi cu acidul retinoic s-a constatat apariŃia de celule elongale care au format nişte punŃi subŃiri de legătură între grupuri de celule contractile;


39. analiza imunohistochimică prin utilizarea anticorpilor

speciali ne-a permis identificarea celulelor precursoare cardiace şi a celor dezvoltate în paralel după diferite strategii de inducere a diferenŃierii;

40. detectarea markerilor pluripotenŃei celulelor stem embrionare murine indică faptul că procesul de diferenŃiere celulară nu este ceva simultan la toate celulele din aceeaşi agregat ci se produce treptat, de aceea în cazul utilizării acestor celule pentru transplant este imperios necesar sortarea lor pentru a preveni apariŃiei teratoamelor;

41. în cazul ambelor loturi (lot martor şi lotul tratat cu VEGF) s-au observat apariŃia contracŃiilor spontane după 1-4 zile de la cultivarea acestora pe plăci gelatinizate;

42. EBs trataŃi cu Vegf au avut dimensiuni în medie de 129,95 µm ± 34,54 (SD) comparativ cu lotul martor unde s-au înregistrat dimensiuni în medie de 152,84 µm ± 41,51 (SD);

43. la 5d+8 s-au constatat apariŃia corpusculilor embrionari chistici mai ales la corpusculii embrionari netrataŃi cu VEGF;

44. prezenŃa cardiomiocitelor în cele două loturi experimentale au fost confirmate prin analize imunohistochimice prin utilizarea unor anticorpi specifici (anticorpi anti- nestin, brachyury, VEGFR, anti-smooth muscle actin);

45. s-au evidenŃiat şi grupuri de celule nediferenŃiate Nanog pozitive ceea ce arată faptul că în corpusculii embrionari pe lângă celule diferenŃiate se găsesc şi celule nediferenŃiate;

46. la 5d+3 al diferenŃierii la EBs netrataŃi cu VEGF, înaintea aplicării tratamentului cronotrop s-au constatat în medie de 41,41 ± 4,95 (SD, n=20) de contracŃii pe minut, iar după aplicarea Isoproterenol s-au înregistrat o creştere a ratei de contracŃie până la 55,66 ± 4,04 de contracŃii pe minut;

47. tratarea corpusculilor embrionari cu Phenyleprine duce la creşterea ratei de contracŃie de la 28 ± 6,27 până la 32 ± 6,5 (SD), iar în cazul tratamentului cu Carbacol s-a constatat o scădere a ratei de contracŃii spontane de la 40,33 ± 3,18 la 29,33 ± 3,01 de contracŃii/minut;


48. în stadiul iniŃial al diferenŃierii s-a constatat expresia crescută

a factorului de transcripŃie Nanog cu o reducere semnificativă în timpul diferenŃierii comparativ cu martorul pozitiv (CDE1).

49. expresia genelor cardiac α-MHC şi cardiac β-MHC rămâne constantă în timpul diferenŃierii;

50. în stadiile timpurii ale diferenŃierii s-au constatat expresia Brahyury un marker timpuriu al diferenŃierii cu o scădere semnificativă a expresiei în stadiul terminal al diferenŃierii.

51. din prelucrarea datelor obŃinute după RT-PCR (revers transcriptase) s-a evidenŃiat modificări semnificative în expresia genelor implicate în diferenŃiere cu o heterogenitate a expresia genelor studiate înregistrând supra cât şi subexpresia acestora;

52. expresia genelor cardiace α-MHC şi β-MHC au fost detectate atât în stadiul timpuriu (5d+3) cât şi în cel intermediar (5d+7) al diferenŃierii. Identificarea acestor gene s-au reuşit atât la grupul martor cît şi la cel tratat cu Vegef, neevidenŃiind diferenŃe semnificative statistic între EBs trataŃi şi cel netrataŃi cu factorul de creştere. Expresia genei α-MHC ne indică faptul că între celulele diferenŃiate din EBs o parte sunt miocite atriale.

53. expresia genei ANF cu rol în specificaŃia camerală a fost deasemenea identificată. S-a identificat un nivel de expresie relativ mare în stadiul timpuriu (5d +3) al diferenŃierii mai ales în cazul corpusculilor embrionari cultivaŃi în mediul de cultură fără adaos de VEGF. În stadiul intermediar al diferenŃierii s-a identificat expresia mai slabă a acestei gene.

54. expresiei genei T (Brachyury) apare în stadiile timpurii ale diferenŃierii. Nu s-au constatat diferenŃe semnificative între loturile tratate şi cele martor. S-a constatat deasemenea o descreştere semnificativă a expresie în stadiul intermediar şi terminal al diferenŃierii;

55. în cazul corpusculilor embrionari recoltaŃi în stadiile timpurii ale diferenŃierii s-au constatat o expresie mai slabă a Nkx2.5 a acestor gene , neevidenŃiând diferenŃe semnificative între loturile tratate şi cele netratate;


56. după analizarea comparativă a concentraŃiilor relative a Kdr în

cazul corpusculilor embrionari de 8d netrataŃi cu Vegf s-a obŃinut o concentraŃie relativă de 0,95 (1,23) ± 0,02 (0,16) (SD), comparativ cu corpusculii embrionari de 12 d unde s-au înregistrat o scădere a concentraŃiei relative până la 0,625 (0,01) ± 0,09 (SD). La corpusculi embrionari trataŃi cu 10 ng/ml de Vegf s-au identificat o concentraŃie relativă de 0,63 ± 0,07 (SD). ConcentraŃia relativă cea mai mare a fost înregistrată la corpusculii embrionari netrataŃi cu Vegf în stadiul timpuriu al diferenŃierii.

57. în cazul corpusculilor embrionari trataŃi cu 10 ng/ml de Vegf s-au identificat o concentraŃie relativă de 1,7 ± 0,59 (SD) la corpusculii embrionari în stadiul timpuriu al diferenŃierii. La EBs de 12 d trataŃi cu Vegf concentraŃia relativă a fost de 0,43 ± 0,08 (SD);

58. după analizarea comparativă a concentraŃiilor relative în cazul corpusculilor embrionari de 8d netrataŃi cu Vegf pentru T s-a obŃinut o concentraŃie relativă de 0,55 ± 0,33 (SD), comparativ cu corpusculii embrionari de 12 d unde s-au înregistrat o scădere a concentraŃiei relative până la 0;

RECOMANDĂRI PRACTICE

1. Recomandăm utilizarea embrionilor în stadiu de blastocist

expandat pentru iniŃiere de linii celulare stem embrionare. Recomandăm utilizarea mediului condiŃionat pentru cultivarea in vitro embrionilor murini.Recomandăm utilizarea fetuşilor a căror vârstă să nu depăşească 13,5 zile.

2. Recomandăm utilizarea şoarecilor din linia CD1 SPF, în scopul prevenirii infecŃiilor primare de origine fetală. Recomandăm de asemenea utilizarea mediului de cultură DMEM hight glucose cu 10% FCS, 1% NEA, 1% glutamină, care permite atingerea unei viabilităŃi de 100% a celulelor cultivate. Pentru iniŃierea de linii celulare stem embrionare murine recomandăm utilizarea embrionilor murini cu grad de dezvoltare corespunzător. De asemenea,


considerăm utilă cultivarea blastociştilor murini pe fibroblaşti embrionari inhibaŃi mitotic, cu mediul de cultură care să conŃină LIF în doză de 2000 U.I cu 15% ser fetal. Recomandăm introducerea în practica de laborator a mediilor de condiŃionare, care pe lângă faptul că sunt uşor de obŃinut, pot să asigure substanŃe indispensabile pentru păstrarea pluripotenŃei celulelor din masa celulară internă, un considerent foarte important pentru obŃinerea ulterioară de linii celulare stem embrionare stabilizate.

3. Pentru obŃinerea de linii celulare stem embrionare murine pluripotente s-au utilizat blastocişti de 3,5 zille recoltaŃi de la două linii diferite de şoareci CD1 şi CD1/EGFP.

4. Recomandăm pentru iniŃierea de linii celulare stem embrionare murine embrionii în stadiul de blastocist, maturaŃi fie in vivo sau in vitro, alături de utilizarea mediului Knock´out DMEM suplimentat cu LIF şi cu factori de condiŃionare. Recomandăm de asemenea utilizarea mediului Resgro Complet în alternanŃă cu mediul de cultură liber de ser, care permite obŃinerea de colonii pluripotente cu rată de diviziune crescută, stabile genetic. Recomandăm utilizarea monostratului de fibroblaştilor embrionari murini inhibaŃi mitotic pentru o bună ataşare, viabilitate şi stabilitate genetică, chiar şi după pasaje multiple, precum şi a substratului de gelatină alături de mediile de condiŃionare, eventual amestecarea celor două substraturi. Embrionii ataşaŃi pe MEF în combinaŃie cu mediul SR-ES determină formarea unei cantitati mari de matrice extracelulară, ducând la detaşarea dificilă a blastocistului de la nivelul substratului, de aceea recomandăm utilizarea pipetelor cu un conŃinut mic de tripsină şi efectuarea de mişcări circulare în jurul blastocistului pentru facilitarea detaşării lui.

5. Recomandăm utilizarea agregării în hanging drops, sau picături verticale deoarece aceasta, fiind o metodă controlată duce la obŃinerea de corpusculi embrionari de aceeaşi dimensiuni şi cu caracteristici identice în etapele de cultivare ulterioară. Prin cunoaşterea numărului iniŃial de celulele


agregate experimentele pot fi oricând reproductibile pentru testări ulterioare. Corpusculii embrionari oferă avantajul unor structuri tri-dimensionale, care prin conglomeratul celular format intensifică interacŃiunile celulă-celulă, care se pare că sunt importante în stadiile iniŃiale ale diferenŃierii direcŃionate. Pe de altă parte complexitatea corpusculilor embrionari poate fi un dezavantaj chiar major prin secreŃia unor citokine şi a unor factori necontrolabili care pot duce la o supraveghere mai puŃin precisă a diferenŃierii.

6. Putem să afirmăm faptul că o strategie destul de bună pentru inducerea diferenŃierii pe lineaj neural este inducerea diferenŃierii spontane pe vase de culturi cu aderenŃă scăzută şi adăugarea unui agent inductor nefiziologic cum este acidul retinoic (RA). Doza de administrare recomandată de către noi este de10-4. Această metodă pe lângă celule nervoase poate să ne furnizeze şi celule cardiace dezavantajul fiind procentul lor mai mic. Se poate afirma că liniile obŃinute de către noi sunt linii pluripotente fapt dovedit prin suportarea diferenŃierii direcŃionate in vitro. Recomandăm stabilirea unei nivel optim de ser fetal de calitate superioară care împreună cu alte componente ale mediilor speciale să aibă calitatea de a asigura o bună dezvoltare culturală cu menŃinerea capacităŃii pluripotente

7. Recomandăm utilizarea înlocuitorului de ser pentru cultivarea celulelor stem embrionare murine.

8. Recomandăm utilizarea fibroblaştiilor embrionari murini care pe lîngă factori de creştere, molecule speciale de adeziune au capacitatea de a sintetiza LIF indispensabil menŃinerii pluripotenŃialităŃii celulelor stem embrionare murine.

9. Recomandăm utilizarea factorului de creştere Vegef pentru inducerea diferenŃierii pe linie cardiacă paralel cu agregarea celulelor în picături suspendate. Recomandăm utilizarea tehnicilor de imunohistochimie pentru identificarea celulelor diferenŃiate.


10. Recomandăm utilizarea techinicii RT-PCR pentru

identificare genelor cardiospecifice implicate în diferenŃiere. Recomandăm utilizarea tehnicii de Real –Time PCR care ne permite precizarea cu exactitate a concentraŃiei relative a expresilor genelor studiate.

11. Factorii de creştere specifici în combinaŃie cu anumite condiŃii culturale nu sunt suficienŃi pentru diferenŃierea direcŃionată spre un anumit lineaj specific. Datorită faptului că în urma diferenŃierii direcŃionate pe lângă linia celulară dorită apar şi alte tipuri celulare care după grefare pot induce formarea teratoamelor, de aceea recomandăm introducerea în practica curentă a manipulării genetice şi sau sortarea acestor celule prediferenŃiate şi diferenŃiate înainte de utilizarii acestora pentru terapia regenerativă.


XXXVIII

BIBLIOGRAFIE SELECTIV Ă

1. Agapios S., B.K. Fleischmann, E. Kollosov, Maria Wartenberg, H.

Sauer, J. Hescheler, 2003, Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells, Cardiovascular Reserch, 58:278-291;

2. Anna M. Wobus, Kenneth R.B., 2005, Prospects for developmental biology and cell terapy, Physiol Rev. Bethseda 85:635-678;

3. Ariff B., Eng Hin Lee , 2005, Stem cells, from bench to bedside, Word Scientific Publishing Co.Pte.Ltd, Singapore;

4. Arnoud C. F., Antoni C.G. van G., Piet A.J. de Boer, Juan M. Ruijter, Vincent M. C., Antoon F.M. M., Ronald H. L . D., 2003, Cardiomyocites derived from embryonic heart tube; Cardiovascular Research nr.58; pag. 399 – 409;

5. Bernard Lo, Patricia Zettler, Marcelle I. Cedars, Elena Gates, Arnold R. Kriegstein Michelle Oberman, Renee Reijo Pera, Richard M. Wagner, Mary T. Wuerth, Leslie E. Wolf, Keith R. Yamamoto, 2005, A New Era in the Ethics of Human Embryonic Stem Cell Research Stem Cells;

6. Bouhon A.I., Kato H., Sidharthen C., Allen N.D., 2005, Neural differentiation of mouse embryonic cells in chemically defined medium. Brain Research Bulletin 68:62-75;

7. Capecchi M. R. , 2005, Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet 6(6), 507-512;

8. Carayannopoulos M.O., Chi M.M., Cui Y., Pingsterhaus J.M., McKnight R.A., Mueckler M., Devaskar S.U., Moley K.H., 2000, GLUT8 is a glucose transporter responsible for insulin-stimulated glucose uptake in the blastocyst. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 7313–7318;

9. Chambers I., Colby D., Robertson M., Nichols J., Lee S., Tweedie S., Smith A., 2003, Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell 113(5), 643-655;

10. Chien K.R., Domian I.J., Parker K.K., 2008, Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine., Science, 5;322(5907):1494-7;


XXXIX

11. Clarke D.L., Johansson C.B., Wilbertz J., Veress B., Nilsson E., Karlström H., Lendahl U., Frisen J., 2000, Generalized potential of adult neural stem cells. Science. 288, 1660-1663;

12. Conley B., Julia C. Young, Trounson A.O., Mollard R., 2004, Derivation, propagation and differentiation of human embryonic stem cells, The International Journal of Biochemistry and Celll Biology 36/ 555-567;

13. Curtis M.W., Russell B., 2009, Cardiac Tissue Engineering. J Cardiovasc Nurs. 2009;

14. Doss M.X., Koehler C.I., Gissel C., Hescheler J., S., 2004, A: Embryonic stem cells: a promising tool for cell replacement therapy. J Cell Mol Med 8:465-473;

15. Doss M.X., Sachinidis A., Hescheler J., 2008, Human ES cell derived cardiomyocytes for cell replacement therapy: a current update.Chin J Physiol. 31;51(4):226-9. Review;

16. Draper J. S., Moore H. D., Ruban L. N., Gokhale P. J., Andrews P. W. 2004, Culture and characterization of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev 13(4), 325-336;

17. Edwards R.G., 2000, The role of embryonic polarities in preimplantation growth and implantation of mammalian embryos. Hum. Reprod. 15 Suppl 6, 1–8;

18. Eggan K., Rode A., Jentsch I., Samuel C., Hennek T., Tintrup H., Zevnik B., Erwin J., Loring J., Jackson-Grusby L., Speicher M. R., Kuehn R., Jaenisch R. ,2002, Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol 20(5), 455-459.

19. Elena Notariani, Martin E., 2006, Embryonic stem cells, Practical approach,Oxford University Press, p.7-128;

20. Erghelegiu Marina, 2005, Medicina regenerativa, Cadran Politic, Bucureşti;

21. Evans M.J., M.H. Kaufman, 1981, Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156;

22. Feldman B., Poueymirou W., Papaioannou V.E., DeChiara T.M., Goldfarb, M., 1995, Requirement of FGF-4 for postimplantation mouse development. Science. 267, 246–249;

23. Ferrari G., Cusella-De Angelis G., Coletta M., Paolucci E., Stornaiuolo A., Cossu G., Mavilio F., 1998, Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. Science. 279, 1528–1530;


XL

24. Fraichard A., Chassande O., Bilbaut G., Dehay C., Savatier P., Samarut J., 1995, In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188.

25. Fujikura J., Yamato E., Yonemura S., Hosoda K., Masui S., Nakao K., Miyazaki Ji, J., Niwa, H., 2002, Differentiation of embryonic stem cells is induced by GATA factors. Genes Dev 16(7), 784-789;

26. Fumiaki Nakajima, Katsushi Tokunaga, Norio Nakatsuji, 2006, HLA Matching Estimations in a Hypothetical Bank of Human Embryonic Stem Cell Lines in the Japanese Population for Use in Cell Transplantation Therapy, Stem Cells published online Dec 21;

27. Gardner R.L. , 2002, Stem cells:potency, plasticity and public perception, Journal of Anatomy 200 (3): 277-282;

28. Gilbert, S.F., 2000, Developmental biology, Sunderland, MA: Sinauer Associates;

29. Gocza Elen, 2004, Embrionalis ossejtek es ossejt vonalak, Magyar Tudomany, Budapest, 285-292;

30. Gocza Elen, Lichner Zsuzsanna, Pall Emoke, Bontovics Babett, Bosze Zsuzsanna, 2008, Embrionális eredető ıssejt vonalak szerepe a differenciálodás során lejátszodo folyamatok mechanizmusainak tanulmányozásaban, Visegrad;

31. Gócza Elen, Lichner Zsuzsanna, Páll Emıke, Bontovics Babett, Pouneh Maraghehechi , Bısze Zsuzsanna, 2008, A mir-290-295 ıssejt specifikus mikro rns-ek, illetve ıssejt specifikus transzkripciós faktorok expressziós mintázatának vizsgálata egér embrionális ıssejt vonalakban, MBK Napok, Godollo, Hungary;

32. Graham C.F., 1977, Teratocarcinoma cells and normal mouse embryogenesis.In concepts in mammalian embryogenesis, p315-394, MIT Press, Cambridge, Massachusetts;

33. Graham C.P, 2005, Stem Cells and Development, 14: 463-469; 34. Groza I., Ciupe Simona, D.D. Ciupercescu, Emıke Páll, Brandusa

Stegeran, Daria Groza, 2006, Rescherches regarding the collection of mouse embryos and their use to obtain the stem cells, Buletin Simpozion StinŃific, Bucureşti, pag.228-238;

35. Groza I., I. Morar , Andrologie veterinară, Ed. Gryphon, Braşov, 2004;

36. Groza I., D.D. Ciupercescu, Emıke Páll, Elen Gocza, 2006, In vitro production embryoid bodies from a mouse embryonic stem cell line and differentiation protocols towards cardiomyocyte and neuron lineages, Buletin Medicina Veterinară, Vol. 63, pag 264-269;


XLI

37. Groza I., M. Muntean, Elemente de fiziologia reproducŃiei la animale, Ed. Academic Press, Cluj – Napoca, 2002;

38. Groza I., Simona Ciupe, Brînduşa Stegeran, M. Cenariu, Daria Groza, 2006, Cercetări privind biotehnica procedurii embrionilor de şoricioaică în vederea izolării Celulelor Stem Embrionare, Simpozion FMV Iaşi, volum în curs de editare;

39. Hadjantonakis A. K., Macmaster S., Nagy A., 2002, Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol 2, 11;

40. Hashimoto N., Waranabe N., Furuta Y., Tamemoto H., Sagata N., Yokoyama M., Okazaki K., Nagayoshi M., Takeda N., Ikawa Y, Aizawa S., 1994, Parthenogenetic activation of oocytes in c-mos-deficient mice, Nature, 370:68-71;

41. He W., 2001, Multipotent stem cells from the mouse basal forebrain contribute GABAergic neurons and oligodendrocytes to the cerebral cortex during embryogenesis, J.Neuroscience 21, 8854-8862;

42. Hescheler J., .K. Fleischmann, S. Lentini, V.A. Maltsev, J. Rohwedel, A.M. Wobus, K. Addicks, 1997, Embrionic stem cells: a model to study structural and functional properties in cardyomiogenesis; Elsevier Science - Cardiovascular Research 36, pag. 149 – 162;

43. Heszky L, L. Fesus, L. Hornok, 2005, Mezogazdasagi biotehnologia. Allattenyesztesi biotehnologia, Agroinform Kiado, 239-354;

44. Hidemasa OH, Xuan Chi, Steven B. Bradfute, Yuji Mishina, Jennifer Pocius, Lloyd H. Michael, Richard R. Behringer, Robert J. Schwartz, Mark L. Entman, Michael D. Schneider, 2004; New York Academy of Sciences nr. 1015; pag. 182 – 189;

45. Hossein B., K.I. Matthaei, 2004, Culture condition for esrablishment of new embryonic stem cell lines from the C57Bl/6 and Balb/c mouse strains, In Vitro Cell Dev.Biol, SFEF, Paris;

46. Jiang Y., Jahagirdar B. N., Reinhardt R. L., Schwartz R. E., Keene C. D., Ortiz-Gonzalez X. R., Reyes M., Lenvik T., Lund T., Blackstad M., Du, J., Aldrich S., Lisberg A., Low W. C., Largaespada D. A., Verfaillie C. M., 2002, Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 418(6893), 41-49;

47. Johansson C.B., Momma S., Clarke D.L., Risling M., Lendahl U., Frisen, J., 1999, Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96, 25–34;


XLII

48. Juergen H., Marcel H., Ulrich E., Zhong Ju Lu, Heribert B., Bernd K. F., Michael R., 2004, Determination of Electrical Properties of ES Cell - derived Cardiomyocytes Using MEAs; Journal of Electrocardiology vol. 37;

49. Julienne Marina, 2004, Cellules souches, Science&Vie, 1038, 60-65; 50. K.Sue O´Shea, 2004, Self-renewal vs.differentiation of mouse

embryonic stem cells, Biology of reproduction 71, 1755-1765; 51. Kenneth R. B., Jaoslaw C., David T., Huang - Tian Yang, Sergey V.

Anisimov, M. Wobus, 2002; Differentiation of Pluripotent Embryonic Stem Cells Into Cardiomyocytes - Circulation Research; Journal of the American Heart Association nr. 91; pag.189 – 201;

52. Kues W. A., Carnwath J. W., Niemann H. , 2005, From fibroblasts and stem cells: implications for cell therapies and somatic cloning. Reprod Fertil Dev 17(1-2), 125-134;

53. Kursad T., 2006, Embryonic stem cells protocols, vol I şi II, Humana Press Inc.3-273;

54. L. Martínez De Villarreal , D. L. Fisher, 2005, Cultivation of mouse embryos explanted at 11 days, Journal of Experimental Zoology, Volume 223 Issue 2, Pages 189 – 191;

55. Lanza R., 2004, Handbook of Stem Cells, vol.1; 56. Laurent Christine, Marie-Laure Moinet, V.N. Sondé, 2000,

Bioéthique. Les enjeux d`un loi, Science&Vie, 996, 110-127; 57. Ledermann Birgit , 2000, Embryonic stem cells and gene targeting,

Experimental Physiology, 85.6. 603-613; 58. Lee S.H., Lumelsky N., Studer L., Auerbach J.M., McKay R.D.,

2000, Efficient generation of midbrain and hindbrain neurons from mouse embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 18, 675-679;

59. Li SC, Wang L, Jiang H, Acevedo J, Chang AC, Loudon WG, 2008, Stem cell engineering for treatment of heart diseases: Potentials and challenges., Cell Biol Int.;

60. Lichner Zsuzsanna Páll, Emıke, Gócza Elen, Bısze Zsuzsanna, 2006, miR-1 szerepe a szöveti elkötelezıdésben, MBK, Gödöllı;

61. Lichner Zsuzsanna, Emoke Pall, Zsuzsanna Bosze, Elen Gocza, 2008, Investigation the role of stem cells specific MMU-MIR-290-295 Cluster, First International Conference of Functional Annotation of the Mammalian Genome, Rottach-Egern, Germany;

62. Lichner Zsuzsanna,Emıke Páll, Zsuzsanna Bısze, Elen Gócza, 2008, Overexpression of miR290-295 miRNA cluster in mouse ES, Transgenic Research Springer Netherlands, ISSN 0962-8819, Vol. 17 No. 5/oct. 2008, pag. 993-1023


XLIII

63. Luft F. C., 2001, Twins in cardiovascular genetic research. Hypertension 37(2 Part 2), 350-356;

64. Lumelsky N., Blondel O., Laeng P., Velasco I., Ravin R., McKay, R., 2001, Differentiation of Embryonic Stem Cells to Insulin-Secreting Structures Similiar to Pancreatic Islets. Science. 292, 1389-1394;

65. Madarasz Emilia, 2004, Az idegi ossejtek es lehetseges orvosi alkalmazasuk, Magyar Tudomany, Budapest, 351-364;

66. Martin G.R., 1981, Isolation of a Pluripotent Cell Line from Early Mouse Embryos Cultured in Medium Conditioned by Teratocarcinoma Stem Cells, Proc.Natl., Acad.Sci.USA, Vol 78. 12/7634-7638;

67. Nagy A., Janet Rossant, Nagy Reka ,Wanda Abramow-Neverly, Roder J.C., 1993, Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells, Proc. Natl. Acad,Sci.USA, 90/8424-8428;

68. Nagy A., Marina Gertsenstein, Kristina Vintereten, Richard B., 2003, Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York;

69. Strubing C., Ahnert-Hilger G., Shan J., Wiedenmann B., Hescheler J., Wobus A.M., 1995, Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275–287;

70. Suckow M.A., Danneman P., Brayton C., 2001, The laboratory mouse, CRC Press;

71. Suemori H., Nakatsuji N., 1987, Establishment of the Embryo-derived Stem(ES) Cell Lines from Mouse Blastocysts:Effects of the Feeder Cell Layer,Develop.Growth and Differ., 29 (2) 100-139;

72. Sukoyan M.A., Kerkis A.Y., Mello M.R.B., Kerkis I.E., Visintin J.A., Pereira L.V, 2002, Establishment of new murine embryonic stem cell lines for the generation of mouse models of human genetic diseases, Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 35:535-542;

73. Winkler J, Hescheler J, Sachinidis A., 2005, Embryonic stem cells for basic research and potential clinical applications in cardiology. Biochim Biophys Acta, 1740:240-248;

dr. med. vet. pÁll em İke rezumat al tezei de doctorat ... · de perioada de incubare stabilit...

Documents