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R. Periodontia - Dezembro 2007 - Volume 17 - Número 04
INTRODUÇÃO
A cavidade bucal possui um habitat favorável a uma
grande variedade de bactérias, devido à presença cons-
tante de nutrientes e secreções. Algumas bactérias da
flora oral normal possuem potencial patogênico capaz
de causar danos ao hospedeiro (SILVA, 1999).
Embora a higienização bucal consiga reduzir a pla-
ca dentária, ela não é geralmente suficiente para elimi-
nar a fermentação dos restos de placa localizados em
lugares inacessíveis à escovação ou pela limpeza do fio
dental. Portanto, bochechos com soluções anti-sépti-
cas, como clorexidina, triclosan e associações como
mentol, timol e eucaliptol; são de grande valia como
complementação de higiene bucal (SILVA & ALVES,
2000).
Um método químico que está sendo atualmente
bastante estudado por suas propriedades terapêuticas
é a solução de própolis. Apesar de já ter sido utilizada
pelo homem empiricamente desde o Egito Antigo
(GALVÃO & GALVÃO, 2003). Na história da medicina
popular a própolis pode ser considerada como um dos
mais eficientes medicamentos naturais descobertos
(GERALDINI et al, 2000).
A própolis é uma substância resinosa coletada pe-
las abelhas de diversas partes das plantas (ALENCAR et
al, 2005). As abelhas, com incrível capacidade biosseletora
VERIFICAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DESOLUÇÕES À BASE DE PRÓPOLIS, SOBRE MICROBIOTAORIUNDA DE BOLSAS PERIODONTAIS - ESTUDO INVITROEvaluation of antimicrobial activity of solutions propolis upon microorganisms of the periodontal
pockets – Study in vitro
Paulo Augusto Sperança1, Leógenes Maia Santiago 2, Tharciana Bezerra Toscano de Carvalho3, Wedja Karla Florêncio Neves3
RESUMO
A atividade antimicrobiana do extrato alcoólico de própolis
em diferentes concentrações contra bactérias
periodontopatogênicas foi investigada através de testes in vitro.
Realizou-se o teste de difusão em culturas mistas oriundas de
bolsas periodontais, em condições de anaerobiose facultativa e
microaerofilia. A leitura e a mensuração dos halos de inibição
foram feitas pelo uso de régua milimetrada e computação grá-
fica. Os resultados encontrados permitiram observar que o
extrato em todas as concentrações testadas inibiu o cresci-
mento bacteriano. As soluções utilizadas foram de 30%, 20%,
10% e 5%, que na condição de anaerobiose facultativa apre-
sentaram, respectivamente, valores médios de halo de inibição
de 16,20 mm, 15,41 mm, 15,11 mm e 13,07 mm; na condi-
ção de microaerofilia os valores médios foram de 16,12mm,
15,03mm, 14,10mm e 13,20mm, respectivamente. Estes re-
sultados sugerem a continuidade dos estudos com a própolis,
tendo em vista que foi observada sua atividade antimicrobiana,
até mesmo em baixas concentrações, com base nas condi-
ções experimentais da presente pesquisa.
UNITERMOS:
1 Doutor em Farmacologia da FOP/UNICAMP-USP
2 Mestrando em Periodontia da AWU-USA
3 Pós-graduandas em Clínica Odontológica da Faculdade de Odontologia de Caruaru - FOC
Recebimento: 10/04/07 - Correção: 07/05/07 - Aceite: 11/05/07
Própolis; teste de sensibilidade microbiana;
bactérias periodontopatogênicas. R Periodontia 2007; 17:54-
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coletam as resinas de que necessitam e as transformam, com
uma enzima produzida por glândulas salivares, fornecendo-lhes
ácidos graxos insaturados que potencializam as propriedades
das resinas vegetais (GARCIA et al, 2004).
Alguns componentes estão presentes em todas as amos-
tras, enquanto outras ocorrem somente em própolis colhidas
de espécies particulares de plantas. Pelo menos 200 componen-
tes diferentes já foram identificados em amostras de própolis de
origens diversas, dentre esses, ácidos graxos e fenólicos, ésteres,
ésteres fenólicos, flavonóides, terpenos, esteróides, aldeídos e
álcoois aromáticos, sesquiterpenos e naftalina (MARCUCCI, 1995
apud MANARA et al, 1999).
A própolis tem atividade antibiótica, cicatrizante (AGOSTINI
et al, 1997), antiinflamatória, antioxidante (PARK et al, 1998),
antiviral, anestésica (MANARA et al, 1999), antifúngica (MARTINS
et al, 2002; OLIVEIRA et al, 2006), amebicida (SANTOS & ZAIA,
2002), antiulcerogênica (ARAÚJO et al, 2002), antitumoral, anti-
séptica (GARCIA et al, 2004), antibacteriana (FERREIRA, 1999;
KOO et al, 2002; DOS SANTOS, 2003; COELHO et al, 2004;
VARGAS et al, 2004) e anticariogênica (ALMEIDA et al, 2006),
além de possuir biocompatibilidade (ARAÚJO et al, 2001).
A atividade antimicrobiana possui maior ou menor efeito
mediante os componentes químicos, o gênero da abelha
coletora e os meios de preparo da própolis (SWERTS et al, 2002).
Como é extraída bruta, a própolis necessita de preparações para
o seu correto emprego, seja em in vitro ou em enxaquatórios
para os ensaios clínicos (PARK et al, 1998).
Todas as propriedades terapêuticas, associadas ao baixo
custo do produto, fazem das soluções de própolis um potencial
método de enxagüatório de uso em cavidade oral.
Apesar da atividade antimicrobiana do extrato alcoólico de
própolis ter sido estudada por vários autores, poucos a investiga-
ram em patógenos orais, dentre eles Gebara et al, 1996; Ferreira,
1999; Gebara et al, 2002; Pereira, 2003; Coelho et al, 2004;
Almeida et al, 2006.
Desta maneira, o presente estudo foi delineado para avaliar
in vitro a atividade antimicrobiana de soluções à base de própolis,
sobre microbiota de bolsas periodontais.
MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi realizado na Faculdade do Agreste
Pernambucano (FAAPE), no setor de microbiologia do Laborató-
rio de Análises Clínicas, situada na cidade de Caruaru-PE, mantida
pela Associação Caruaruense de Ensino Superior (ASCES).
Foram utilizadas culturas mistas de microorganismos (“pool”
de germes) periodontopatogênicos, cedidos em frascos
liofilizados pelo Laboratório de Microbiologia Experimental da
UFRJ. Armazenados em sangue desfibrinado de coelho jovem
no Laboratório de Microbiologia de FOP/UPE.
Foi verificada a atividade antimicrobiana, sob tais
microorganismos, dos seguintes produtos:
� EAP (P1): Extrato Alcoólico de Própolis a 30%
� EAP (P2): Extrato Alcoólico de Própolis a 20%
� EAP (P3): Extrato Alcoólico de Própolis a 10%
� EAP (P4): Extrato Alcoólico de Própolis a 5%
Todas as soluções testadas foram manipuladas em farmácia
de manipulação (Pharmaderme), respeitando-se as concentra-
ções e características galênicas recomendadas pela literatura
especializada.
A técnica que foi utilizada para realização dos testes de sen-
sibilidade seguiu a técnica preconizada por Bauer-Kirby (1966),
descrita pela NCCS-National Commitee for Clinical Laboratory
Standards subsidiados por informações técnicas de autores
como Ferreira & Ávila, 1996; Couto et al, 1999; Opplustil et al,
2000; Microbiology Manual Merck, 2000.
Oriundo dos tubos de armazenagem, os inóculos foram
transferidos para o meio líquido de tioglicolato de sódio USP
(Merck) encubados a 37º C por 48 horas, quando então se
transferiu uma alçada para o caldo de triptona soja (BBL) ajus-
tando-se então a densidade da suspensão bacteriana ao tubo 4
da escala de McFarland, objetivando-se padronizar o crescimen-
to microbiano nas placas de cultura.
Uma vez padronizada a turbidez do inóculo bacteriano, foi
semeado 0,1 ml de cada cultura mista no meio de ágar triptona
soja (Merck), previamente esterilizado em autoclave por 20 mi-
nutos a 01 ATM e distribuído assepticamente em placas de Petri
(Pirex) de 9 cm de diâmetro.
Os inóculos de cada cultura teste foram então espalhados
na superfície dos meios de cultura, com o auxílio de uma alça de
Drigalski, deixando-se as placas secando a temperatura ambien-
te por um período de 15 minutos. Os produtos químicos foram
levados para o interior das placas de Petri pela impregnação de
discos de papel de filtro estéreis de 6 mm de diâmetro, após a
remoção do excesso testando-se os produtos.
A incubação das placas foi realizada por um período de 48
horas a temperatura de 37°C, para a cultura mista em condi-
ções de anaerobiose facultativa, sendo o tempo de incubação
de 72 horas em condições de microerofilia, em jarra de fecho
hermético.
A leitura e a mensuração dos halos de inibição foram realiza-
das em triplicata, utilizando régua milimetrada, sendo os valores
expressos pela média aritmética, considerando que para cada
cultura foram realizados 10 testes, desconsiderando os halos de
inibição cujos valores fossem inferiores a 1 mm. Para maior segu-
rança na obtenção dos resultados, também foram utilizadas
técnicas de leitura computadorizadas, pela utilização de réguas
digitais e de softwares específicos, aplicando-se o filtro gráfico
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CARTONIZAÇÃO (PHOTOSUITE 2-MGI), como também o uso
do IMAGETOOL (FIGURA 1), de acordo com as recomenda-
ções de alguns autores, como Lafayette et al, 2004.
RESULTADOS
Os resultados do teste de difusão estão apresentados na
TABELA 1, os quais se referem à média dos halos de inibição
em mm.
Em condição de anaerobiose facultativa a microbiota mos-
trou-se sensível ao EAP em todas as concentrações estudadas.
Apresentando resultados de 16,20 mm, 15,41 mm, 15,11 mm
e 13,07 mm para as concentrações de 30%, 20%, 10% e 5%,
respectivamente (FIGURA 2).
Também se verificou a mesma sensibilidade ao EAP nas cul-
turas com incubação em microaerofilia, apresentando, para as
concentrações de 30%, 20%, 10% e 5%, valores de 16,12 mm,
15,03 mm, 14,10 mm e 13,20 mm, respectivamente
(FIGURA 3).
DISCUSSÃO
Concluída a parte experimental e a análise dos resultados,
observamos que as soluções testadas, em todas as concentra-
ções, apresentaram atividade inibitória sob as culturas teste, tan-
to em condições de anaerobiose facultativa, quanto em
microaerofilia.
Essa atividade antimicrobiana condiz com os achados de
autores como Fernandes Jr et al, 2001; Pereira, 2003; Vargas et
al, 2004; e Almeida et al, 2006, que relataram estar presente
esta propriedade inibitória, bem como a mesma ser desejável.
Koo et al, 2000, também comprovaram que a própolis é
agente antimicrobiano, através de um trabalho que avaliou essa
ação in vitro do EAP a 10%, o qual inibiu todos os 15
microorganismos testados. Da mesma forma Gebara et al, 2002,
obtiveram resultados semelhantes contra cepas
periodontopatogênicas de Prevotella intermédia, Prevotella
melaninogenica, Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus
actinomycetemcomitans, Capnocytophaga gingivalis e
Fusobacterium nucleatum.
Tomando por base as concentrações estudadas, esperava-
se que concentrações progressivamente menores apresentas-
sem igualmente valores médios de halos de inibição numerica-
mente menores, fato este confirmado em parte pelos resulta-
dos. Já que a análise mais detalhada, com os testes
antimicrobianos das duas culturas, permite observar que os va-
lores encontrados nas soluções com 30%, 20%, e 10% mos-
tram-se equivalentes, uma vez que foi encontrada pequena di-
ferença apenas no caso da diluição de 5%.
Resultado diferente do apresentado por Park et al, 1998, em
seu estudo sobre as aplicações da própolis, determinaram que
os EAP a 10% e 20% não apresentaram atividade antimicrobiana,
o EAP de 30% a 50% apresentaram uma ligeira atividade, mas
que concentrações de 60% a 80% aumentaram significativa-
mente a capacidade de inibição do crescimento microbiano.
Já Pereira, 2003, em seu estudo realizado com EAP a 5%,
confirmou que concentrações menores também possuem efei-
to antimicrobiano. Ele o utilizou uma vez ao dia, em blocos de
esmalte extraídos de terceiros molares inclusos e concluiu que a
própolis atua sobre o biofilme dental, diminuindo a população
dos microorganismos que foram avaliados (Streptococcus to-
tais, Streptococcus mutans e Lactobacilos).
Assim, com base nos resultados da presente pesquisa, ob-
serva-se que concentrações menores se mostram tão efetivas
quanto as maiores, sendo as mesmas, razão de resistência
microbiana e tolerância orgânica, de eleição quando compara-
das às mais concentradas. Desta forma, é factível que se passem
aos clínicos e especialistas esta lógica, diminuindo os riscos po-
tenciais de aparecimento de cepas resistentes, quadros de
superinfecção e recidiva da infecção por uso abusivo de princípi-
os antimicrobianos.
CONCLUSÕES
Os testes de difusão realizados perante culturas mistas de
bolsas periodontais, em condições de anaerobiose facultativa e
microaerofilia, mostram-se sensíveis quanto à atividade
antimicrobiana do extrato alcoólico de própolis, nas concentra-
ções de 30%, 20%, 10% e 5%, não existindo diferença significa-
tiva entre os valores encontrados. Essa equivalência pode servir
Culturas Mistas EAP 30% EAP 20% EAP 10% EAP 5%
Anaerobiose Facultativa 16,20 15,41 15,11 13,70
Microaerofilia 16,12 15,03 14,10 13,20
Tabela 1
VALORES MÉDIOS DOS HALOS DE INIBIÇÃO EM MM DO CRESCIMENTO BACTERIANO, RESULTANTE DO TESTE DE DIFUSÃO REALIZADO
PARA AS SOLUÇÕES DE EXTRATO ALCOÓLICO DE PRÓPOLIS EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES SOBRE CULTURAS MISTAS ISOLADAS DE
BOLSAS PERIODONTAIS COM INCUBAÇÃO EM CONDIÇÕES DE ANAEROBIOSE FACULTATIVA E MICROAEROFILIA
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de referencial para que se utilizem concentrações menores, evi-
tando-se quadros de tolerância e, principalmente, de resistência
microbiana.
ABSTRACT
The antimicrobial activity of the alcoholic extract of propolis
in different concentrations against bacteria of the periodontal
tissues was investigated through tests in vitro. The Test of Diffusion
was carried through in mixing cultures deriving of periodontal
pockets markets, in anaerobic facultative and microaerophilia
conditions. The reading and measurement of halos inhibition
was made by the use ruler in millimeters and graphical
computation. The joined results had allowed to observe that the
extract in all the tested concentrations inhibited the bacterial
growth. The used solutions had been of 30%, 20%, 10% and
5%, that in anaerobic facultative condicions, they had presented,
respectively, average values of halo inhibition of 16,20 mm, 15,41
mm, 15,11 mm and 13,07 mm; microaerophilia conditions, the
average values had been of 16,12mm, 15,03mm, 14,10mm
and 13,20mm, respectively. The gotten results encourage the
accomplishment of new studies with the propolis, in view of
FIGURA 1: teste de difusão da cultura mista em condição de anaerobiose facultativa apósaplicação de filtro gráfico de cartonização e utilizando-se de Software IMAGETOOL.
that was observed its antimicrobial activity, even though in low
concentrations, on the basis of the experimental conditions of
the present research.
UNITERMS:
FIGURA 3: teste de difusão das soluções de extrato alcoólico de própolis em diferentesconcentrações sobre cultura mista isolada de bolsas periodontais em placa contendo Bacto AgarTriptona-Soja (BBL), após 72 horas de incubação em microaerofilia.
FIGURA 2: teste de difusão das soluções de extrato alcoólico de própolis em diferentesconcentrações sobre cultura mista isolada de bolsas periodontais em placa contendo Bacto AgarTriptona-Soja (BBL), após 48 horas de incubação em anaerobiose facultativa.
Propolis, microbial sensitivity test, bacteria of
the periodontal timmes.
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