Aus dem
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Vergleichende Untersuchungen zur
dermalen Penetration und Permeation
in Diffusionszellen
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Silke Riedel (geb. Franzbach)
aus Gronau
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H.C. Krebs
Tag der mündlichen Prüfung: 27.05.2003
Meinen Eltern
und
meiner Familie
in Dankbarkeit
gewidmet
1 EINLEITUNG 1
2 LITERATURÜBERSICHT 2
2.1 Aufbau und Funktion der Haut 2
2.1.1 Epidermis 2
2.1.2 Dermis 5
2.1.3 Hypodermis 7
2.1.4 Hautanhangsgebilde 7
2.1.5 Gefäßsystem der Haut 8
2.2 Transdermale Penetration, Permeation und Resorption 9
2.2.1 Barrierefunktion der Haut 9
2.2.2 Penetration in die Haut und Pharmakokinetik topisch applizierter Substanzen 12
2.2.3 Penetrationsbeeinflussung 19
2.3 Modelle zur Untersuchung der transkutanen Penetration und Permeation 22
2.3.1 In-vivo-Modelle 22
2.3.2 In-vitro-Modelle 23
2.3.2.1 Diffusionszellen 23
2.3.2.2 Saarbrücker Penetrationsmodell 26
2.3.2.3 Zellkulturen und künstliche Haut 29
2.3.2.4 Perfusionsmodelle 30
2.4 Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison als Testsubstanzen der
transdermalen Penetration und Permeation 32
3 MATERIAL UND METHODEN 35
3.1 Versuchsmaterial 35
3.2 Verwendete Testsubstanzen 37
3.2.1 Benzoesäure 37
3.2.2 Hydrocortison 37
3.2.3 Testosteron 38
3.3 Diffusionszellen 38
3.4 Versuchsdurchführung 39
3.5 Nachweis der Testsubstanzen 40
3.5.1 Enzymimmunoassay 40
3.5.2 Bestimmung von Benzoesäure mittels Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
(HPLC) 41
3.6 Statistische Auswertung 43
4 ERGEBNISSE 44
4.1 Benzoesäurepenetration und -permeation 44
4.1.1 Rattenhaut 44
4.1.2 Hundehaut 45
4.1.3 Pferdehaut 46
4.1.4 Schweinehaut 46
4.1.5 Rinderhaut 49
4.2 Hydrocortisonpenetration und -permeation 51
4.2.1 Rattenhaut 51
4.2.2 Hundehaut 52
4.2.3 Pferdehaut 53
4.2.4 Schweinehaut 54
4.2.5 Rinderhaut 55
4.3 Testosteronpenetration und -permeation 57
4.3.1 Rattenhaut 57
4.3.2 Hundehaut 58
4.3.3 Pferdehaut 59
4.3.4 Schweinehaut 60
4.3.5 Rinderhaut 61
5 DISKUSSION 63
5.1 Vergleich der Hautlokalisationen innerhalb der Tierarten 63
5.1.1 Benzoesäurepermeation 63
5.1.2 Hydrocortisonpermeation 64
5.1.3 Testosteronpermeation 65
5.2 Vergleich der Tierarten anhand der Körperregionen 66
5.2.1 Benzoesäurepermeation 66
5.2.2 Hydrocortisonpermeation 69
5.2.3 Testosteronpermeation 70
5.3 Vergleich der Testsubstanzen Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison 73
5.4 Schlußfolgerung 76
6 ZUSAMMENFASSUNG 77
7 SUMMARY 79
8 LITERATURVERZEICHNIS 81
9 ANHANGSTABELLEN 99
Abkürzungsverzeichnis
A. Arteria
Abb. Abbildung
cm Zentimeter
cm² Quadratzentimeter
ELISA enzyme-linked immuno sorbent assay
g Gramm
°C Grad Celsius
h Stunde
HPLC high performance liquid chromatography
i.v. intravenös
l Liter
ln Logarithmus
m männlich
mg Milligramm
min Minute
ml Milliliter
mm Millimeter
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
n Anzahl der Versuche
ng Nanogramm
s. siehe
S. Seite
Tab. Tabelle
V. Vena
w weiblich
1
1 EinleitungDie Entwicklung von Arzneimitteln zur topischen Anwendung bei Mensch und Tier macht es
erforderlich, die dermale Penetration, Permeation und Resorption verschiedener Wirkstoffe an
Modellen zu untersuchen. Hier bieten In-vitro-Modelle den Vorteil, daß die resorbierte
Wirkstoffmenge direkt bestimmt und, wenn notwendig, auch mit toxischen Konzentrationen
gearbeitet werden kann. Im Gegensatz zu In-vitro-Modellen werden In-vivo-Untersuchungen
durch ethische Aspekte limitiert. Ferner erschweren die Verteilung eines resorbierten Stoffes
im Organismus sowie dessen mögliche Metabolisierung (Leber) die Interpretation von
Ergebnissen aus In-vivo-Versuchen. In-vitro-Untersuchungen werden an menschlicher und
tierischer Haut und an sogenannten Hautäquivalenten („künstliche Haut“) durchgeführt.
Hinsichtlich der Barriereeigenschaften der Haut bestehen offensichtlich ausgeprägte
speziesspezifische Unterschiede, die die Übertragbarkeit von Ergebnissen im Einzelfall
erheblich einschränken können. So ist im Vergleich zur menschlichen Haut die
Barriereeigenschaft der Haut von Labortieren (z.B. Ratte, Maus) sehr viel geringer
(MARZULLI et al. 1969; BARTEK et al. 1972). Weiter ist zu berücksichtigen, daß die
Hautpermeabilität bei allen Spezies in Abhängigkeit von der Körperregion variiert
(FELDMANN und MAIBACH 1967; BRONAUGH 1985; BEHL et al. 1985).
Die zugängliche Literatur weist eine große Anzahl von In-vivo- und In-vitro-Untersuchungen
auf, in denen die kutane Pharmakokinetik untersucht wird. Für In-vitro-Penetrationsstudien
werden oft Diffusionszellen eingesetzt, die die Messung der passiven Diffusion einer topisch
applizierten Substanz durch die Haut ermöglichen. Ein Vergleich der Ergebnisse vorliegender
Studien zur dermalen Penetration, Permation und Resorption gestaltet sich aufgrund nicht
einheitlicher Versuchsbedingungen, Hautlokalisationen sowie Unterschieden der Spezies
recht schwierig bzw. unmöglich.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es daher, tierartliche und regionale Unterschiede in einer
vergleichenden Untersuchung der transdermalen Penetration und Permeation unter
identischen Bedingungen darzustellen. In den Versuchen soll die Haut von Schweinen,
Hunden, Rindern, Pferden und Ratten untersucht werden. Für die Darstellung regionaler
Unterschiede werden die Lokalisationen seitliche Brustwand, Rücken, Bauch und Euter
(Rind) gewählt. Die vielfach in vorliegenden Studien eingesetzten Testsubstanzen
Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison sollen aufgrund ihrer unterschiedlichen
Pharmakokinetik in der vorliegenden Arbeit Verwendung finden.
2
2 Literaturübersicht
2.1 Aufbau und Funktion der Haut
Die Haut stellt als äußere Körperbedeckung sowohl eine schützende Grenzfläche als auch
eine breite Kontaktfläche zur Außenwelt dar. Sie ist in erster Linie ein Schutzorgan gegenüber
mechanischen, thermischen, chemischen und biologischen Einflüssen (LIEBICH et al. 1999).
Die Körpertemperatur und der Wasserhaushalt werden u.a. über Hautdrüsen und -blutgefäße
reguliert; weiter fungiert die Haut als Sinnesorgan, welches zur Wahrnehmung von
mechanischen, thermischen und Schmerzreizen dient (LEONHARDT 1990). Die Dicke und
Festigkeit der Haut ist abhängig von Tierart, Rasse, Alter und Körpergegend. Im Allgemeinen
ist die Haut des Rückens dicker als die Bauchhaut, mechanisch stark beanspruchte Hautstellen
sind dicker als geschützt liegende (HABERMEHL 1984). An behaarten Körperstellen ist die
Hautdicke geringer als in haarlosen und haararmen Regionen (LIEBICH et al. 1999).
2.1.1 Epidermis
Die Epidermis (Oberhaut) ist ein mehrschichtiges, verhornendes Plattenepithel, welche als
äußerste Grenzschicht der Haut eine undurchlässige Hornschicht trägt (FRITSCH 1998). Die
Epidermisdicke der behaarten Haut ist stark variabel. In Tab. 1 ist die Epidermisdicke für den
Menschen und für verschiedene Tierarten angegeben.
Spezies vitale Epidermis
(ohne Stratum corneum)
Gesamtdicke der Epidermis
(inklusive Stratum corneum)
Mensch 75-150 (ODLAND 1983)
Ratte 10-30 (UHR 1984) ~ 32 (BRONAUGH et al. 1982b)
Hund 12-45 (SCHWARZ u. MEYER 1994) 10-45 (CREED 1958)
Pferd 25-45 (MEYER 2002) 30-90 (TALUKDAR et al. 1972)
Schwein 34-47 (m) (MEYER 1986)41-57 (w)
70-140 (MEYER u. NEURAND 1975)
Rind ~ 32 (MEYER 2001) 40-60 (GOLDSBERRY u. CALHOUN 1958)
Rindereuter 50-80 (SEEGERS 2003) 60-200 (LUDEWIG et al. 1996)
Tab. 1: Epidermisdicke der behaarten Haut bei verschiedenen Spezies (Angaben in µm)
3
In den folgenden Abbildungen (Abb. 1-6) ist die Epidermis (Bauchhaut) der im Rahmen
dieser Arbeit untersuchten Tierarten histologisch dargestellt.
50 µm
Abb. 1-6: Epidermis (Bauchhaut) von Ratte (1), Hund (2), Pferd (3), Schwein (4),
Rind (5) sowie von Euterhaut (6)
1
65
43
2
4
Die Keratinozyten machen mit etwa 90 % den Hauptanteil der Epidermis aus, daneben enthält
die Epidermis Langerhans-Zellen, Lymphozyten, Melanozyten und Merkelzellen. Die
Epidermis besteht aus vier Schichten, die jeweils durch ihre Morphologie und Funktion
charakterisiert sind (FRITSCH 1998). Abbildung 7 zeigt den schematischen Aufbau der
Epidermis.
Abb. 7: Schematischer Aufbau der Epidermis (nach FRITSCH 1998)
Das Stratum basale besteht aus einer Lage zylindrisch aufgebauter Zellen, die durch
Hemidesmosomen mit einer Basalmembran verbunden sind (RICHTER und LINSS 1998).
Hier beginnt die Erneuerung der Keratinozyten aus den Stammzellen durch Mitose, wobei
Zellgewinn im Gleichgewicht mit Zellverlust steht (FRITSCH 1998).
Das Stratum spinosum ist durch größere, polygonale Keratinozyten charakterisiert. Trotz
deutlicher Interzellularspalten sind die Zellen durch stachelförmige Fortsätze über
Desmosomen miteinander verbunden (LEONHARDT 1990). Eine Besonderheit des Stratum
spinosum sind die sog. „Odland bodies“, Zellorganellen, die Lipide und Enzyme enthalten.
In der aus 2–5 Zelllagen bestehenden Stachelzellschicht geht die Fähigkeit zur Zellteilung mit
dem Eintritt der terminalen Differenzierung verloren. Nur unter besonderen Umständen (z.B.
Stratumcorneum
Stratumgranulosum
Stratumspinosum
Stratumbasale
Desmosom
Keratohyalin-granula
Hemidesmosom
Basallamina
Odlandbodies
5
Wundheilung) finden vereinzelt noch Mitosen statt. Das Stratum basale und das Stratum
spinosum werden daher auch als Stratum germinativum zusammengefaßt (FRITSCH 1998).
Mit dem Übergang in das Stratum granulosum flachen die durch basophile Keratohyalin-
granula charakterisierten Keratinozyten ab. Dehydratation tritt ein, Zellkerne und –organellen
gehen verloren. Durch Exozytose der Odland bodies wird im Interzellularraum die Bildung
einer wenig permeablen Kittsubstanz induziert, wodurch die Zellen starr fixiert werden
(FRITSCH 1998).
Das Stratum corneum ist das Endprodukt der keratinisierten Epidermis, die sich etwa im
Zeitraum von 1-2 Wochen erneuert. Die Anzahl der Zellschichten im Stratum corneum ist
recht variabel. Die Hornschicht besteht jedoch zumeist aus ca. 10 bis 20 Zellschichten voll
keratinisierter Korneozyten. Diese verhornten Zellen sind überwiegend aus Keratinfilamenten
aufgebaut und werden von einer dicht vernetzten, äußerst stabilen Hülle von Proteinen und
Lipiden, dem „cornified envelope“ umgeben. Entsprechend einem „Ziegelstein-Mörtel“-
Modell ist die Hornschicht im wesentlichen aus den Korneozyten und der interkorneozytären,
lamellären Lipidschicht aufgebaut (ELIAS 1983) (siehe 2.2.1).
In den tieferen Schichten des Stratum corneum erschwert ein enger Interzellularraum die
transepitheliale Stoffpassage, oberflächlich lösen sich die Zellen aus dem Epithelverband und
schilfern ab. Die Schichtdicke ist neben Geschlecht, Alter und Körperregion von der Intensität
der mechanischen Beanspruchung und der Abschilferungsrate der Haut abhängig (LIEBICH
et al. 1999).
Die Hornschicht ist für Wasser und wasserlösliche Substanzen fast undurchlässig, sie ist in
ihrer Gesamtheit Träger der Barrierefunktion. Eine hohe Widerstandsfähigkeit besteht gegen
physikalische und chemische Noxen, relativ empfindlich reagiert sie dagegen auf organische
Lösungsmittel und Detergenzien (FRITSCH 1998) (siehe 2.2.3).
2.1.2 Dermis
Die Dermis (Lederhaut) ist der zwischen der Unterhaut und Epidermis gelegene
bindegewebige Anteil der Körperdecke. Vom Grad ihrer Ausbildung wird die Dicke der Haut
bestimmt, so hat z.B. unter Haussäugetieren das Schaf die dünnste und das Rind die dickste
Lederhaut. Im Allgemeinen ist die Dicke der Dermis auch vom Alter der Tiere und von der
Körpergegend abhängig (HABERMEHL 1984).
6
Die Dermis erfüllt komplexe biologische Aufgaben, wie Ernährung der Epidermis und
Bereitstellung von Abwehrzellen. Sie ist zudem für die mechanische Festigkeit der Haut
verantwortlich. Es lassen sich zwei Schichten unterscheiden: ein dünnes, zell- und
gefäßreiches, subepidermales Stratum papillare und ein dickes, faserreiches Stratum reticulare
(SMOLLE 1998).
Das Stratum papillare ist über die Basalmembran mit der Epidermis verbunden. Es ist aus
feinmaschigen kollagenen und elastischen Fasern aufgebaut und enthält reichlich ungeformte
Grundsubstanz, die für das Wasserbindungsvermögen und damit für den Hautturgor
maßgeblich ist. Die Austauschfläche und die Haftung werden durch die regional
unterschiedlich starke Ausbildung von Papillarkörpern - fingerförmigen, papillenartigen
Verzahnungen von Epidermis und Dermis - bestimmt (RICHTER und LINSS 1998). Die
Versorgung, insbesondere die des Stratum germinativum der Epidermis, erfolgt über
haarnadelförmige Kapillarschlingen (die auch zur Regulierung der Körpertemperatur
beitragen), die gemeinsam mit nervösen Endapparaten in die Papillarkörper hineinreichen.
Vorzugsweise befinden sich in dieser Schicht Haare, Talg- und Schweißdrüsen als
Abkömmlinge der Epidermis (LIEBICH et al. 1999). Außerdem charakterisieren freie
Entzündungszellen (Lymphozyten, Plasmazellen, Makrophagen, Granulozyten) das Stratum
papillare als relevant für die Abwehr (SALT = skin associated lymphoepithelial tissue)
(RICHTER und LINSS 1998). Beim Pferd ist der Papillarkörper der Körperhaut nur schwach
entwickelt bzw. kann fehlen (MEYER et al. 1978a).
Das Stratum reticulare stellt ein Netz aus gröberen kollagenen und elastischen Fasern dar, das
mechanisch hoch belastbar ist (RICHTER und LINSS 1998). Diese Schicht ist relativ arm an
Zellen und Gefäßen, vorzugsweise kleinere Arterien und Venen zu und von den
oberflächlichen Hautschichten passieren diese Bindegewebslagen (LIEBICH et al. 1999). Das
Pferd besitzt als spezielle Bildung eine zusätzliche Schicht der Dermis aus feinen kollagenen
Fasern, in die feine elastische und retikuläre Fasern eingewoben sind. Hier handelt es sich um
den sog. „Roßspiegel“; diese Schicht ruft einen leichten Glanz der Haut hervor. Diese
Struktur überzieht die Kruppe und den Rücken bis zu den Tubera coxae sowie die dorsale
Hälfte des Thorax (MEYER et al. 1978a).
7
2.1.3 Hypodermis
Die Hypodermis, die auch als Tela subcutanea, Subcutis oder Unterhaut bezeichnet wird,
besteht aus lockerem Bindegewebe, elastischen Fasern (Stratum fibrosum) und Fettgewebe
(Stratum adiposum). Sie stellt das Bindeglied zwischen der Dermis und den innenliegenden
Faszien, Muskeln oder Knochen dar und ermöglicht so die Verschieblichkeit der Haut
(ECKERT 1992). Die Fetteinlagerungen dienen als Energiereserven und als Kälteschutz und
an manchen Stellen auch einer mechanischen Polsterung (z.B. Sohlenballen) (LIEBICH et al.
1999). Die wärmeisolierende Eigenschaft ist abhängig vom Grad der Ausprägung des Stratum
adiposum. Dieses ist beim Rind und Pferd nur spärlich, beim Hund und Schwein hingegen
deutlich ausgeprägt (MEYER et al. 1978a). Die Unterhaut des Rindereuters hebt sich von der
Dermis nur undeutlich ab. Auffällig ist hier das Fehlen von Adipozyten (LUDEWIG et al.
1996).
2.1.4 Hautanhangsgebilde
Die Hautdrüsen und deren Modifikationen sind embryonal als Abkömmlinge der Epidermis
anzusehen, sie ragen jedoch größtenteils in die Dermis hinein. Bei den Haussäugetieren
unterscheidet man die holokrin sezernierenden Talgdrüsen von den apokrin sezernierenden
Schweiß- und Duftdrüsen, deren Sekrete die Haut mit einem dünnen Fett- und Säuremantel
bedecken (LIEBICH et al. 1999). Ekkrine „echte Schweißdrüsen“ wie beim Menschen
kommen bei unseren Haussäugern nicht vor.
Die apokrinen Schweißdrüsen (Gll. sudoriferae) gehen aus dem Epithel der Haaranlage hervor
und geben ihr Sekret in die Haarbälge ab; sie können sekundär auch von den Haarbälgen frei
werden (HABERMEHL 1984). Sie haben nur beim Rind und besonders beim Pferd durch
Feuchtigkeits- bzw. Wärmeabgabe in Form erhöhter Schweißsekretion eine Bedeutung für die
Thermoregulation. Bei den Karnivoren sowie bei Schaf, Ziege und Schwein produzieren die
Drüsen individualspezifische Duftstoffe und Substanzen zur Haut- und Haarpflege (MEYER
et al. 1978b).
Die Talgdrüsen (Gll. sebaceae) liegen verhältnismäßig oberflächlich, sie sind kranzförmig um
die Haarbälge herum angeordnet (Haarbalgdrüsen) (HABERMEHL 1984). Der holokrin
sezernierte lipidreiche Talg (Sebum) gelangt über weite Ausführungsgänge in den Haarbalg;
8
auf der Epidermis entsteht ein dünner Fettfilm, der die Durchlässigkeit für Wasser und
wäßrige Flüssigkeiten vermindert und das Stratum corneum und die Oberfläche der Haare
geschmeidig hält (LIEBICH et al. 1999).
Die Haare sind aus Epithelzellen der Epidermis entstandene, biegsame und zugfeste
Hornfäden, die mit ihren Wurzeln schräg in die Dermis eingelassen sind (HABERMEHL
1984). Haare bieten einen Schutz gegen mechanische und thermische Umwelteinflüsse, weiter
wird durch eine dichte Behaarung und starke Pigmentierung UV-Strahlung abgeschirmt
(MONTAGNA 1967; BANKS 1993).
Durch die sensible Innervation des Haarbalges kommt dem Haar eine bedeutende Funktion
als Sinnesorgan zu. Alle Säugetiere außer dem Menschen verfügen über Sinushaare, die im
Gesicht mit Ästen des Nervus trigeminus in Verbindung stehen (MONTAGNA 1967).
Am Haar kann ein proximaler Teil, die Haarwurzel mit ihrem Haarbulbus, von einem distalen
Teil, dem Haarschaft, unterschieden werden, der mit der Haarspitze die Epidermis überragt.
Funktionell läßt die Epidermis-Trias, bestehend aus Haar, Talg- und Schweißdrüsen nach
LIEBICH et al. (1999) ein gemeinsames Haarorgan entstehen.
2.1.5 Gefäßsystem der Haut
Die Haut beinhaltet ein tiefes (fasziales), ein oberflächliches (kutanes) und ein subepitheliales
Gefäßnetz. Über Arteriolen entsteht eine Verbindung zwischen dem tiefen und
oberflächlichen Netz, dessen Gefäße schließlich in einen subepithelialen Venenplexus
münden. Arteriovenöse Anastomosen ermöglichen eine Wärmeregulation in der Lederhaut.
Aus dem kutanen Gefäßnetz entspringen Kapillargefäße, die als haarnadelartige
Kapillarschlingen in die Papillarkörper des Stratum papillare ziehen und von dort über
Diffusion die Epidermis versorgen. Der Rückfluß erfolgt über Kapillaren, Venolen und
Venen, die in der Hypodermis Anschluß an größere Venennetze finden (LIEBICH et al.
1999).
9
2.2 Transdermale Penetration, Permeation und Resorption
2.2.1 Barrierefunktion der Haut
Das intakte Stratum corneum stellt mit seiner lipidreichen Interzellularsubstanz die wichtigste
Permeabilitätsbarriere der Haut dar. Die Lipide der Hornschicht sind lebensnotwendig, da sie
vor einer Dehydratation schützen; ohne sie würde der Wasserverlust um das 2500fache, bei
Fehlen der Hornschicht um das 4millionenfache zunehmen (LANDMANN 1988). Die Folge
einer großflächigen Eliminierung dieser Hautbarriere wäre eine kurzfristig sich entwickelnde
hochgradige Exsikkation mit maximaler Erhöhung des Hämatokritwertes (STÜTTGEN
1990).
Die Barrierefunktion der Hornschicht läßt sich durch ein Zweikompartimentenmodell (sog.
„brick and mortar model“) (siehe 2.1.1) beschreiben. Demnach sind die ziegelsteinähnlich
geschichteten Korneozyten in einem interzellulären Lipidmörtel eingebettet, welcher sich
vorwiegend aus Ceramiden (ca. 40 %), freien Fettsäuren (ca. 25 %), Cholesterol (ca. 25 %),
Anteilen von Cholesterolsulfat (ca. 6 %) und Triglyceriden zusammensetzt (ELIAS 1983).
Die Lipide der Hornschicht sind als multiple Bilayer ausgebildet und machen 10 – 30 % des
gesamten Hornschichtvolumens aus (ELIAS und LEVENTHAL 1979). Im Gegensatz zu
anderen Biomembranen, die hauptsächlich aus Phospholipiden aufgebaut sind, enthält die
Lipidbarriere der Hornschicht sehr wenige Phospholipide (LAMPE et al. 1983). Im Vergleich
zu anderen Biomembranen ist die Permeabilität des Stratum corneum außergewöhnlich
gering. Nach POTTS und FRANCOEUR (1991) liegt die Erklärung hierfür in der besonderen
Morphologie des Stratum corneum mit ihren großen Permeationswegen durch die
Interzellularräume, die wesentlich zur Effektivität der Hornschichtbarriere beiträgt.
Bereits BURR und BURR (1929) stellen im Tierversuch fest, daß sich durch eine Diät, die
arm an essentiellen Fettsäuren ist, eine Permeabilitätsstörung der Barriere erreichen läßt. Die
Lipide, die für die kutane Hautbarriere verantwortlich sind, entstammen dem Stoffwechsel der
Epidermis (FEINGOLD et al. 1982, 1983). Einen direkten Beweis dafür, daß die kutane
Cholesterolsynthese für die Erhaltung der Barrierefunktion notwendig ist, liefern FEINGOLD
et al. (1990) in Versuchen an Mäusen. Ihre Untersuchungsergebnisse zeigen, daß nach einer
Störung der Permeabilitätsbarriere durch Lipidextraktion die Wiederherstellung der
Barriereeigenschaften durch topische Applikation von Lovastatin gehemmt wird. Lovastatin
10
ist ein kompetitiver Hemmer der HMG CoA-Reduktase, das die Cholesterolsynthese
regulierende Enzym. Cholesterol gehört neben Sphingolipiden und essentiellen Fettsäuren zu
den Bestandteilen der Lipiddoppelschichten des Stratum corneum, die für die
Aufrechterhaltung der epidermalen Barrierefunktion verantwortlich sind (HOLLERAN et al.
1991).
WERTZ et al. (1987) zeigen mittels Elektronenmikroskopie, daß die interzellulären
Lipidlamellen in der gesamten Hornschicht lokalisiert sind. Im Stratum corneum als
morphologisch heterogener Membran sind die interzellulären Lipide der äußeren Zelllagen
lockerer gepackt als die der inneren (PELLETT et al. 1997). Untersuchungen von BLANK
(1952, 1953) über die Wasserdurchlässigkeit der Hornschicht nach Abrissen derselben mittels
eines adhäsiven Klebebandes (z.B. Tesa-Film) zeigen, daß für die Barrierefunktion vor allem
die unterste Schicht des Stratum corneum verantwortlich ist. Mit der Tesa-Film-
Abrißmethode werden durch den Klebstoff die Lamellen des Stratum corneum mehr oder
weniger schichtweise abgetragen. PELLETT et al. (1997) bestätigen diese Ergebnisse durch
spektroskopische Untersuchungen. Ihre Resultate bekräftigen, daß sich die morphologischen
Unterschiede zwischen den inneren und äußeren Schichten des Stratum corneum in
Permeabilitätsunterschieden ausdrücken.
Der Wassergehalt der Hornschicht nimmt von innen nach außen ab (TAGAMI et al. 1980). Er
ist mit maximal 20 % sehr viel niedriger als der Wassergehalt in der lebenden Epidermis, in
der er mit 60 - 80 % relativ konstant ist (WARNER et al. 1988). Dieser deutliche Unterschied
ist in der lipidreichen Zusammensetzung der interkorneozytären Substanz begründet.
Hautanhangsgebilde unterbrechen die Kontinuität der Hornschicht. Die für die Hornschicht
charakteristische Barrierefunktion geht in den tieferen Abschnitten der Haarfollikel verloren.
Diese Regionen sind aufgrund des ihres lipophilen Charakters (Talg) für die Aufnahme
lipophiler Substanzen prädestiniert, während in den oberen Abschnitten die Aufnahme
wasserlöslicher Stoffe im Vordergrund steht (STÜTTGEN 1990).
FELDMANN und MAIBACH (1965) untersuchen die dermale Resorptionsrate von 14C-
markiertem Hydrocortison über einen Zeitraum von zehn Tagen durch normale und
geschädigte Haut im Vergleich zur i.v. Applikation anhand der Nierenausscheidung. Die
Resorptionsrate durch normale und durch Tesa-Film-Abrisse geschädigte Haut liegt
zwischen 0,1 und 1 % der lokal aufgetragenen Hydrocortisonmenge. Hingegen stellen sie fest,
11
daß die Resorptionsrate bei intradermaler Injektion nahezu 100 % beträgt. Da hierbei das
Stratum corneum umgangen wird, kommt es hier zu keiner Depotbildung. Im Gegensatz dazu
wird der Wirkstoff bei intakter Haut über einen längeren Zeitraum kontinuierlich abgegeben.
Bei mit Tesa-Film-Abrissen vorgeschädigter Haut fehlt ebenfalls die Depotbildung; die
Resorptionsrate ist im Vergleich zu normaler Haut signifikant erhöht. Unter okklusiven
Bedingungen wird im Vergleich zu normaler Haut die zehnfache Hydrocortisonmenge
resorbiert, was bedeutet, daß die hydratisierte Hornschicht für Hydrocortison durchgängiger
ist als die durch Tesa-Film-Abrisse vorgeschädigte Haut. Unter Anwendung eines
Okklusionsverbandes wird durch Abdeckung der Haut ihr Feuchtigkeitsgehalt, jedoch
besonders der der Hornschicht, erhöht.
Das Stratum corneum ist mit seiner lipidreichen Interzellularsubstanz die wichtigste
Diffusionsbarriere bei der dermalen Resorption (MARZULLI 1962; ELIAS 1983;
STÜTTGEN 1990). Die darunterliegende, avaskuläre lebende Epidermis ist eher eine
hydrophile Matrix. Voraussetzungen für eine transdermale Diffusion sind sowohl lipophile als
auch hydrophile Eigenschaften penetrierender Moleküle. Im Allgemeinen ist der
Diffusionswiderstand der Hornschicht für polare Lösungen im Vergleich zur lebenden
Epidermis und Dermis groß. Für lipophilere Substanzen hingegen ist er geringer. Dennoch ist
die Hornschicht die mengenbegrenzende Barriere, da die lipophilen Moleküle sich in ihr
anreichern und nur langsam und zu einem geringen Anteil in die wässrige lebende Epidermis
übertreten. Die Dermis ist schließlich mit einem wässrigen Gel vergleichbar, dessen Struktur
aus Kollagenfasern und Elastin besteht. Aufgrund der dermalen Vaskularisation werden bis
hierher vorgedrungene Moleküle letztlich abtransportiert (POTTS et al. 1992). Unter der
Annahme, daß das Stratum corneum, die lebende Epidermis und die Dermis als
aufeinanderfolgende Membranen fungieren, resultiert die Barrierefunktion der Haut aus der
Summe der individuellen Barriereeigenschaften (POTTS et al. 1992).
Für den Prozeß des Wirkstofftransportes in und durch die Haut stellt eine intakte Hornschicht
die Hauptbarriere dar. Neben dieser Funktion fungiert die Hornschicht auch als Reservoir für
topisch applizierte Substanzen. Die Barrierefunktion der Hornschicht nimmt von außen nach
innen zu und im gleichen Umfang nimmt ihre Reservoirfunktion ab (ZESCH et al. 1973).
Zahlreiche topisch applizierte Substanzen sind in der Hornschicht nur schwer löslich, woraus
ein eingeschränktes Diffusionsvermögen resultiert. Es kommt zu einer Anreicherung der
12
Stoffe in den oberen Hornlagen, aus welchen sie, den Gesetzen der Fick´schen Diffusion
gehorchend, in die tieferen Epidermislagen diffundieren (SCHAEFER et al. 1978a, b).
2.2.2 Penetration in die Haut und Pharmakokinetik topisch applizierter Substanzen
Nach STÜTTGEN und SCHAEFER (1974) versteht man unter der Penetration das
Eindringen einer Substanz in und durch die Hornschicht. Permeation kann als Ausdruck einer
Durchwanderung der Haut aufgefasst werden. Unter einer Adsorption ist der physikalisch-
chemische Vorgang oberflächlicher Bindung und Haftung zu verstehen. Sie ist abhängig von
der Affinität der Hornschicht zum extern zugeführten Stoff. Resorption ist schließlich die
Aufnahme in Blut- und/oder Lymphgefäße. In Abb. 8 sind Penetration, Permeation und
Resorption graphisch dargestellt.
Abb. 8: Substanzaufnahme durch die Haut (nach STÜTTGEN und SCHAEFER 1974)
Einfache Penetrationsversuche an exzidierter Säugetierhaut zeigen, daß der perkutane Flux
direkt proportional zum Konzentrationsgradienten ist (BLANK und SCHEUPLEIN 1969). Es
wird daraus geschlossen, daß der Transport durch die Haut vorwiegend durch passive
Diffusion erfolgt (POTTS et al. 1992). Für die Penetration von Substanzen durch das Stratum
corneum gelten prinzipiell die physikalischen Gesetze der Membrandiffusion. Aktive
Transportvorgänge spielen bei der Aufnahme durch die Haut praktisch keine Rolle
(SCHEUPLEIN 1978a; SCHAEFER et al. 1982; BARRY 1983). Nach dem Auftragen eines
Wirkstoffes besteht initial ein großes Konzentrationsgefälle von der galenischen
Formulierung zum Stratum corneum. Für den Diffusionsvorgang gelten somit die Gesetz-
mäßigkeiten des 1. Fick´schen Gesetzes:
Penetration Permeation Resorption
Gefäß
Epidermis
Hornschicht
Dermis
13
m= D* F/d (c1-c2)
m = Diffusionsstrom d = Schichtdicke
D = Proportionalitätsfaktor c1-c2 = Konzentrationsgefälle
F = Fläche
Gelangt ein in ein Vehikel inkorporiertes Pharmakon mit einer Membranoberfläche in
Kontakt, kommt es nach einer zeitlichen Verzögerung während der Anreicherung der
Substanz in der Membran allmählich zu einem Gleichgewichtszustand des transmembranären
Flusses. Dieser bleibt so lange bestehen, wie einerseits auf der Membranoberfläche ein
genügend großer Pharmakonvorrat gegeben und andererseits ein kontinuierlicher
Substanzabstrom gewährleistet ist (MERK und BICKERS 1992).
Geschwindigkeitsbestimmend für die dermale Resorption eines Stoffes sind seine chemisch-
physikalischen Eigenschaften. Hierzu zählen Löslichkeit, Polarität, Affinität zum Vehikel und
Struktur- sowie Molekülgröße (STÜTTGEN 1972).
Ein einfaches Modell, um die Pharmakokinetik der dermalen Penetration und Permeation
topisch applizierter Substanzen zu beschreiben, stellen GUY und HADGRAFT (1983) auf
(Abb. 9). Danach sind die zwei geschwindigkeitsbestimmenden Schritte für die Pharmako-
kinetik eines dermal applizierten Wirkstoffes erstens der Übertritt aus der Grundlage in die
Hornschicht und zweitens die Permeation aus der Hornschicht in das lebende Gewebe. Eine
für jeden Stoff charakteristische Konstante k beschreibt die Geschwindigkeit des
Wirkstoffübertrittes zwischen den jeweiligen Kompartimenten.
Abb. 9: Schematische Darstellung der Wirkstoffaufnahme aus einer galenischen
Formulierung in die Haut (nach GUY und HADGRAFT 1984)
k1 – k4 = Geschwindigkeitskonstanten
k1 k2
k3
k4
galenischeFormulierung
Stratumcorneum
Blut bzw.Rezeptor-flüssigkeit
14
Direkt nach Applikation eines Pharmakons auf die Haut besteht ein großes
Konzentrationsgefälle von der galenischen Formulierung zum Stratum corneum. Der
Wirkstoff gelangt durch passive Diffusion in die Hornschicht. Die Diffusion erfolgt
hauptsächlich vom Stratum corneum in das Blutgefäßsystem und stoffabhängig meist nur in
geringem Maße vom Blutgefäßsystem in die Hornschicht zurück. Die Kenntnis der
Geschwindigkeitskonstanten erlaubt eine Abschätzung des pharmakokinetischen Verhaltens
einer Testsubstanz (siehe 2.4).
Nach dem strukturellen Aufbau der Haut sind verschiedene Möglichkeiten für den dermalen
Stofftransport gegeben. Der transepidermale Transport kann entsprechend der
Zweikompartiment-Struktur der Hornschicht interzellulär und transzellulär erfolgen (Abb.
10). Der letztere Weg setzt voraus, daß die Substanz die Zellmembran und die Lipidschicht
durchqueren kann (KARZEL und LIEDTKE 1989).
Abb. 10: Transportwege durch das Stratum corneum (nach ELIAS 1981)
Die Penetration über die Haarfollikel und Talgdrüsen und/oder die ekkrinen Schweißdrüsen
wird als „Shunt“-Weg bezeichnet (STÜTTGEN et al. 1986). SCHEUPLEIN (1967) geht
davon aus, daß dieser Weg vornehmlich zu Beginn eines Diffusionvorgangs Bedeutung hat.
Auch ILLEL und SCHAEFER (1988) messen diesem Transportweg vor allem initial
Bedeutung bei. Das Erreichen eines Gleichgewichtzustandes zwischen den
15
Geschwindigkeitskonstanten von außen nach innen und denen von innen nach außen resultiert
aus einem Ausgleich dieser beiden Penetrationswege (STÜTTGEN und SCHAEFER 1974).
HUEBER et al. (1993) liefern in einem In-vitro-Resorptionsvergleich von vier unterschiedlich
lipophilen Steroiden an Humanhaut Beweise dafür, daß die Permeation durch normale Haut
signifikant größer ist als durch Narbenhaut, also Haut ohne Haarfollikel und Talgdrüsen.
Aufgrund des geringen Oberflächenanteils von 0,1 – 1 % scheint der transfollikuläre
Transport jedoch insgesamt von untergeordneter Bedeutung zu sein. ILLEL und SCHAEFER
(1988) gewinnen drüsenlose Haut, indem sie die Rückenhaut narkotisierter Ratten eine
Minute mit 60 °C heißem Wasser behandeln, danach wird die Epidermis entfernt. Nach
abgeschlossener Wundheilung nach drei bis vier Monaten ist die neugebildete Epidermis
drüsenfrei. Die Untersuchungsergebnisse an drüsenloser Haut zeigen, daß der transfollikuläre
Weg hauptsächlich bei polaren Stoffen eine Rolle spielt. Für lipophile Pharmaka ist dieser
Weg weniger bedeutsam (ILLEL und SCHAEFER 1988).
Wie bereits erwähnt, ist das Stratum corneum als eigentliche Barriere für den Durchtritt eines
Stoffes durch die Haut zu sehen. Es gelangt zunächst nur ein kleiner Teil der aufgetragenen
Substanz in die tiefen Lagen der Haut. Stoffabhängig verbleibt ein beachtenswerter Teil im
Stratum corneum. Aus diesem kann die Substanz schließlich, dem Konzentrationsgefälle
folgend, in die tieferen Hautschichten eindringen. Die übereinander liegenden Zelllagen
bilden ein System von aufeinanderfolgenden lipophilen und hydrophilen Schichten, in
welchen die Diffusion eines Stoffes, den Gesetzen der Fick´schen Diffusion gehorchend, nach
innen hin zunehmend erschwert bzw. verlangsamt wird (SCHAEFER et al. 1982; DUPUIS et
al. 1984). Unterhalb der Hornschicht ist die Penetration durch die lockeren Zellanordnungen
im Stratum spinosum und Stratum basale entsprechend erleichtert (NEURAND und MEYER
1987). Das Eindringen in die Epidermis allein ist jedoch nicht gleichbedeutend mit einer
Aufnahme durch den Gesamtorganismus. Da sich die Epidermis stetig von unten her
regeneriert, können Substanzen, die hier länger verweilen, mit den Zellen wieder eliminiert
werden (ZESCH und SCHAEFER 1976). Nach dem Durchdringen des Stratum papillare der
Dermis können aufgetragene Substanzen in die Blut- und Lymphbahnen gelangen; sie können
jedoch schon in der Haut metabolisiert werden, da auch in der Haut eine große Anzahl von
Enzymen mit metabolischer Aktivität vorhanden sind (STÜTTGEN und SCHAEFER 1974).
Qualitativ sind die Enzyme solchen in anderen Organgeweben gleich, die quantitative
16
Umwandlungsrate der Arzneimittel ist in der Haut im Vergleich zur Leber allerdings deutlich
geringer. Bei systemischer Applikation spielt die Haut bei der Metabolisierung von
Arzneimitteln daher nur eine untergeordnete Rolle. Auf der anderen Seite ist die
Metabolisierung in der Haut nach topischer Applikation von entscheidender Bedeutung.
KAPPUS (1989) zeigt auf, daß die Metabolisierungsrate stoffabhängig erhöht oder erniedrigt
ist, woraus eine verminderte bzw. gesteigerte Bioverfügbarkeit resultiert. Ferner weist er
darauf hin, daß neben der Umwandlung zu exkretionsfähigen Verbindungen die enzymatische
Metabolisierung auch zu einer kovalenten Bindung an das Gewebe führen und in Toxizität,
Mutagenität und Kanzerogenität enden kann (BICKERS und KAPPUS 1980; BICKERS
1983).
Die Faktoren, welche auf die perkutane Penetration und Resorption Einfluß nehmen, sind
vielfältig. Nach STÜTTGEN und SCHAEFER (1974) vergrößert sich die Permeationsrate mit
steigender Löslichkeit der angebotenen Substanz im Stratum corneum entsprechend den
Gesetzen der Diffusion.
Hydrophile Stoffe diffundieren nach topischer Applikation nur in begrenztem Umfang in die
Hornschicht, da durch die Lipidmembran nur ungeladene lipophile Substanzen diffundieren.
Auch höhermolekulare Stoffe zeigen in der Regel eine geringere perkutane Penetration. Die
Lipophilie des Arzneistoffes spielt somit für die Diffusion durch die Hornschicht eine
entscheidende Rolle (SCHAEFER et al. 1982). Moleküle mit sowohl polaren als auch
apolaren Eigenschaften penetrieren in der Regel recht gut durch die Hornschicht (KOCH
1985). Außerordentlich gering ist die Penetration von Elektrolyten durch das Stratum
corneum (SCHEUPLEIN 1978b). Soweit diese stattfindet, dürfte sie in erster Linie
interzellulär erfolgen, da die Zellmembranen nach MIDDLETON (1969) für Elektrolyte
undurchlässig sind.
Abgesehen von hochmolekularen Substanzen spielt die Molekülgröße für die Penetration und
Permeation durch die Haut eine eher untergeordnete Rolle. Festzustellen ist, daß bei allen
Molekülen, die die Haut gut durchwandern, eine Beziehung zwischen Molekülgröße und
Permeabilitätsgeschwindigkeit nicht zu belegen ist (STÜTTGEN und SCHAEFER 1974).
Untersuchungen von FELDMANN und MAIBACH (1970) zeigen, daß chemisch verwandte
Verbindungen große Resorptionsunterschiede aufweisen können. So ist die Resorptionsrate
17
für Benzoesäure wesentlich höher als für Hippursäure, dem Glycinkonjugat dieser
Verbindung.
Aufgrund der speziesabhängigen Unterschiede der Morphologie der Haut muß die
Beurteilung der Penetrationsfähigkeit einzelner Substanzen für jede Spezies gesondert
betrachtet werden. Beim Menschen scheint die Barrierefunktion des Stratum corneum recht
stark ausgebildet zu sein (BARTEK et al. 1972). Dem Menschen am ähnlichsten reagieren
nach BARTEK et al. (1972) unter den Tieren Schweine, haarlose Mäuse und einzelne
Affenarten. Meerschweinchen, Hunde, Ratten und Kaninchen zeigen eine deutlich
schwächere Barrierefunktion (siehe auch Tab. 3, S. 27). PRÍBORSKÝ und
MÜHLBACHOVÁ (1990) ermitteln dagegen annähernd gleiche Resorptionsraten bei
Menschen und Meerschweinchen, während sie bei Ratten deutlich höhere Resorptionsraten
ermitteln. MARZULLI et al. (1969) sowie BRONAUGH et al. (1982a) führen die
Permeabilitätsunterschiede der Arten auf die Zahl der Haare und Drüsen sowie die
abweichende Stärke und Zusammensetzung des Stratum corneum zurück.
Von erheblicher Bedeutung sind die großen Permeationsunterschiede in den verschiedenen
Körperregionen. In In-vitro-Untersuchungen an Rattenhaut zeigt BRONAUGH (1985), daß
die dünnere Abdominalhaut permeabler für Wasser, Harnstoff und Kortison ist als die dickere
Rückenhaut. Mit In-vitro-Untersuchungen an haarloser Mäusehaut bestätigen BEHL et al.
(1985) einen Zusammenhang zwischen Hautdicke und regionalen Permeationsunterschieden.
CHAMBIN et al. (1996) testen verschiedene Estradiolformulierungen in vitro an
Schweinehaut von unterschiedlichen Körperregionen. Auch in ihren Untersuchungen hat die
Hautdicke Einfluß auf die Fluxrate, die perkutane Penetration durch dünnere Haut ist
gesteigert.
FELDMANN und MAIBACH (1967) zeigen unter Verwendung von radioaktiv markiertem
Hydrocortison (Messung im Urin nach topischer Applikation), daß die resorbierte Substanz-
menge an Kopfhaut, Achselhöhle, Stirn und Kieferwinkel besonders hoch ist. Mit der 42
fachen resorbierten Substanzmenge bezogen auf die Unterarmhaut (=1) ist die Resorptionsrate
am Skrotum am größten (Tab. 2).
18
Tab. 2: Urinausscheidung von 14C-Hydrocortison nach externer Applikation bezogen
auf die Haut am Unterarm (=1) (FELDMANN und MAIBACH 1967)
Unterarm (ventral) 1,00
Fußsohle 0,14
Fußknöchel (lateral) 0,42
Handfläche 0,83
Unterarm (dorsal) 1,10
Rücken 1,70
Kopfhaut 3,50
Achselhöhle 3,60
Stirn 6,00
Kieferwinkel 13,00
Skrotum 42,00
Nicht nur die Körperregion, sondern auch das Hautalter hat Einfluß auf die perkutane
Penetration und Resorption. Neonatale Haut ist im Allgemeinen deutlich permeabler. Ursache
hierfür ist der im Vergleich zum Erwachsenen höhere Wassergehalt und der verringerte
Lipidgehalt der Hornschicht (POULSEN 1972). Mit zunehmendem Alter weist die Haut
Veränderungen wie erhöhte Trockenheit auf, welche auf der verminderten transepidermalen
Wasserabgabe beruht, die durch die Verhärtung der gealterten Epidermis bedingt ist (RAAB
1990b). Die Verringerung des Lipidgehaltes - den Fettfilm auf der Haut betreffend - geht auf
eine eingeschränkte Funktion der Talgdrüsen zurück (STRAUSS et al. 1986). ROSKOS et al.
(1986) untersuchen die renale Elimination von Testosteron, Östradiol, Hydrocortison und
Benzoesäure nach topischer Anwendung bei 18-35-jährigen und 65-75-jährigen Probanden.
Für das lipophile Testosteron und Östradiol resultiert bei beiden Gruppen kein
Eliminationsunterschied, wohl aber für das weniger lipophile Hydrocortison und für
Benzoesäure, deren Elimination bei den älteren Probanden reduziert ist. Dieses deutet auf eine
geringere Resorptionsrate von weniger lipophilen Substanzen bei älteren Menschen hin.
19
2.2.3 Penetrationsbeeinflussung
Eine intakte Funktion und Struktur der Haut garantiert einen größtmöglichen Schutz
gegenüber externen Substanzen. So ist für viele Substanzen bekannt, daß sie auch nach
längerer Einwirkungszeit in sehr hohem Prozentsatz wieder von der Hautoberfläche eliminiert
werden können. Das ist zunächst von den Eigenschaften der betreffenden Substanz selbst
abhängig, andererseits vom Zustand der Zusammensetzung des Hautoberflächenfilms. Als
Folge verschiedener struktureller Veränderungen der Hornschicht ist eine Beschleunigung der
Penetration topisch applizierter Arzneistoffe bzw. Schadstoffe nachweisbar. Von Bedeutung
sind nach WOHLRAB (2001b) besonders folgende Veränderungen:
- Entfettung der Haut
- Entfernung der oberflächlichen Hornlagen
- Störung der lamellären Struktur des Horns
- Erhöhung der Hydratation der Hornschicht (z.B. bei Okklusion)
- erhöhte Transpiration
- Sonnenlichtexposition
- erhöhte Hautdurchblutung
Organische Lösungsmittel führen aufgrund der Lipidentfernung zu gesteigerter Permeabilität
der Hornschicht. Am meisten wird der transepidermale Wasserverlust durch ein Gemisch aus
Chloroform und Methanol gesteigert (GRICE 1980). HARADEA et al. (1992) machen
deutlich, daß die Entfernung der mehr polaren Lipide durch Chloroform-Methanol-Extraktion
vor allem zu einer Penetrationsverbesserung lipophiler Wirkstoffe führt. IMOKAWA und
HATTORI (1985) zeigen, daß eine Entfettung der Hornschicht mit einem Aceton-Ether-
Gemisch zu einem Verschwinden der lamellären Lipidstrukturen und zu einer Abnahme des
gebundenen Wassers führt. Je länger die Acetonbehandlung anhält, umso ausgeprägter ist die
Exsikkation. IMOKAWA et al. (1986) stellen fest, daß der Hautzustand nach Lipidextraktion
reversibel ist. Durch Auftragen von Lipiden, insbesondere Ceramiden und Glykolipiden,
kommt es wieder zu einer Zunahme des Wasserbindungsvermögens. KIETZMANN und
BLUME (1997) vergleichen am Modell des isoliert perfundierten Rindereuters die Resorption
von Betamethasondipropionat durch unbehandelte Euterhaut und durch mit Aceton
20
vorgeschädigte Euterhaut. Ihre Ergebnisse zeigen, daß Aceton die Hornschicht für den
Wirkstoff durchlässiger macht.
DOWNING et al. (1993) untersuchen die Beeinflussung der Hornschichtbarriere durch
Tenside. Sie zeigen, daß es zu einer Einlagerung der Tenside in das Stratum corneum kommt.
Sie stellen fest, daß die Hornschichtpermeabilität allein durch die Einlagerung von Tensiden
erhöht werden kann, ohne daß die Hornschichtbarriere zerstört wird. Trotzdem kann es
darüber hinaus bei starker Tensideinwirkung zu einer Schädigung der Barrierefunktion durch
Herausemulgieren von Lipiden kommen (DOWNING et al. 1993).
Bei Verlust der Hornschicht gibt es keine wesentliche Barriere mehr für eindringende
Agenzien. Experimentell läßt sich diese Situation, die bei Verbrennungen und teilweise auch
bei Ekzemen vorliegt, durch Entfernen der Hornschicht mittels der Tesa®-Film-Abrißmethode
simulieren (GLOOR 1982). Die Menge des Stratum corneum, die pro Abriss entfernt wird, ist
nicht linear proportional zur Anzahl der Abrisse (TSAI et al. 1991). SCHALLA et al. (1980)
zeigen für Kortikosteroide, daß durch die Tesa®-Film-Abrißmethode die Wirkstoffpenetration
verstärkt wird.
Aus der klinischen Praxis ist die Penetrationssteigerung durch Okklusivverbände bekannt
(GLOOR 1982). Diese führen zu einem Wärme- und Feuchtigkeitsstau mit nachfolgender
Hydratation, Quellung und Auflockerung der Hornschichten. Die Penetration topischer
Arzneistoffe läßt sich dadurch wirkstoffabhängig deutlich steigern (AUBÖCK 1992). Einige
Autoren stellen jedoch fest, daß die Penetration von hydrophilen und einigen lipophilen
Substanzen, insbesondere Methanol, Ethanol (BEHL et al. 1980) und Hydrocortison (BUCKS
et al. 1988) nicht oder nur in geringem Maße durch Hydratation und Okklusion beeinflußt
wird. Obwohl es unter Okklusionsbedingungen zu einer Hydratation der Hornschicht kommt,
unterstützen Untersuchungen von TREFFEL et al. (1992) die Ansicht, daß eine Okklusion
nicht notwendigerweise die perkutane Resorption von Substanzen steigert.
Die perkutane Penetration topisch applizierter Substanzen ist weiterhin temperaturabhängig.
BLANK et al. (1967), GOLDEN et al. (1987) sowie EMILSON et al. (1993) zeigen in In-
vitro-Versuchen, daß die perkutane Penetration mit steigender Temperatur ansteigt. Durch die
Temperaturerhöhung wird die Fluidität der Lipiddoppelschichten der Hornschicht erhöht. Die
Bilayer sind so weniger dicht gepackt, und die entstandene Minderung der Barriere führt zu
gesteigerter Penetration (CLARYS et al. 1996). Die Temperatur kann die Stoffresorption
21
direkt über die Diffusionsrate, aber auch indirekt über die Durchblutung beeinflussen
(KARZEL und LIEDTKE 1989). So beeinflussen Kortikosteroide ihr eigenes pharmako-
kinetisches Profil, da sie durch ihren vasokonstriktorischen Effekt einen negativen Einfluß auf
den Blutstrom ausüben (GIBSON 1990).
Um ein möglichst großes Konzentrationsgefälle von der galenischen Formulierung zum
Stratum corneum zu erreichen, können nach DAVIS und HADGRAFT (1991) übersättigte
Lösungen, wie z.B. Mikroemulsionen verwendet werden. Diese legen einen weiteren
Mechanismus dar, die perkutane Penetration zu verbessern. WATKINSON et al. (1996)
zeigen an einem synthetischen Membranmodell, daß unter konstanten Bedingungen der Flux
durch die Membran sein Maximum erreicht, wenn die äußere Membranschicht gesättigt ist.
Das trifft zu, wenn das Vehikel ebenfalls mit dem Wirkstoff gesättigt ist.
Eine große Anzahl von Substanzen ist bekannt, die für unterschiedliche topisch applizierte
Substanzen als Penetrationsförderer wirksam sind. Diese Eigenschaft wird vielfach für die
Verbesserung der therapeutischen Effektivität galenischer Zubereitungen genutzt
(WOHLRAB 2001a). Penetrationsförderer erhöhen durch Veränderung der Hautstruktur die
Hautpermeabilität, ohne irreversible Schäden hervorzurufen. Dabei haben sie in der
angewandten Konzentration in der Regel keine eigenen pharmakologischen Eigenschaften
(RITSCHEL und SPROCKEL 1988). Lange bekannt ist beispielsweise die
penetrationsfördernde Eigenschaft des Dimethylsulfoxid (DMSO). Die Wirkung ist mit der
Fähigkeit zu erklären, die Durchlässigkeit der Barriere zu vergrößern. Dabei kommt es zu
einer Reaktion mit den polaren Gruppen der Membran und zu einer Lockerung der
Bindungsenergie, gefolgt von Strukturänderungen, die letztlich zu neuen Wegen durch das
Gewebe führen (SCHAEFER et al. 1982; BARRY 1987). Auch Stoffe wie Harnstoff und
Salicylsäure finden aufgrund ihrer keratolytischen Eigenschaft Einsatz als
Penetrationsförderer. Die Anwendung von Harnstoff bewirkt ebenso wie eine
Okklusionsbehandlung einen Anstieg des interzellulären freien Wassergehaltes (GLOOR
1982). 5 - 10 %ige Harnstoffpräparate bewirken in Gegenwart von Wasser eine Auflösung der
Interzellularbrücken und damit eine Lösung der Korneozytenhaftung (WOHLRAB 1996). In
Untersuchungen zur Salicylsäurewirkung auf die Haut zeigen HUBER und CHRISTOPHERS
(1977), daß durch die topische Applikation von Salicylsäure die Haftfähigkeit der Hornzellen
22
untereinander gemindert und in den tieferen Hornschichtlagen das Verbundsystem der
Hornzellen gelockert wird.
2.3 Modelle zur Untersuchung der transkutanen Penetration und Permeation
Für Untersuchungen der perkutanen Pharmakokinetik stehen derzeit eine Vielzahl von In-
vivo- und In-vitro-Methoden zur Verfügung (SCHAEFER und HENSBY 1990). Die
Untersuchungen werden zumeist an menschlicher und tierischer Haut und an sogenannten
Hautäquivalenten („künstliche Haut“) durchgeführt (WESTER und MAIBACH 1985;
SCHAEFER-KORTING 1996).
2.3.1 In-vivo-Modelle
In-vivo-Untersuchungen am Menschen werden nach RIVIERE et al. (1986) durch ethische
Fakten limitiert. Weiter können In-vivo-Methoden wegen toxikologischer Gefährdung oder
aus Gründen des Strahlenschutzes (radioaktiv markierte Substanzen) nur sehr begrenzt am
Menschen angewendet werden (GLOOR 1982). Dagegen bieten sich sowohl in vivo als auch
ex vivo viele Möglichkeiten im Tierversuch an. Untersuchungen an Tieren haben das Ziel, die
perkutane Resorption beim Menschen vorhersagen zu können. Zur Messung der perkutanen
Permeation von Substanzen und deren anschließender Resorption kann nach Applikation
einer Substanz auf die Haut im Blut und Urin des Versuchstieres die Menge der resorbierten
bzw. ausgeschiedenen Substanz in Abhängigkeit von der Kontaktdauer gemessen werden.
Auch die Bestimmung der Verteilung der Substanz in verschiedenen Organen ist möglich
(WOHLRAB 2001b). Allerdings ergibt sich bei der Auswahl eines Tiermodells die
Problematik der Übertragbarkeit der Ergebnisse auf die Verhältnisse beim Menschen. So ist
die Barrierefunktion der Hornschicht von Labortieren (z.B. Meerschweinchen, Maus, Ratte)
im Vergleich zur menschlichen Haut deutlich geringer (HOWES et al. 1996). Nach WESTER
und MAIBACH (1985) ist die perkutane Resorption beim Affen und Schwein in den meisten
Fällen mit der des Menschen am ehesten vergleichbar bzw. nahezu identisch.
Die Messung der Resorption hydrophober Substanzen gestaltet sich in vivo oft schwierig, da
die resorbierten hydrophoben Substanzen sich in das Körperfett verteilen und nur sehr
langsam ausgeschieden werden. Aus diesem Grund wären Messungen über Monate
23
notwendig, da es möglich ist, daß nach einer Woche nur ein geringer Prozentsatz der
absorbierten Menge ausgeschieden wurde (BRONAUGH und COLLIER 1991b).
In-vivo-Untersuchungen schließen die Wirkungen des Organismus auf die resorbierte
Substanz, wie Metabolisierung, Verteilung und Exkretion mit ein, so daß die Penetrationsrate
nur indirekt ermittelt wird. Weiterhin ist es mit In-vivo-Modellen nicht möglich, exakte
qualitative und quantitative Aussagen über den Hautmetabolismus zu machen (BRONAUGH
et al. 1982b).
2.3.2 In-vitro-Modelle
In Anbetracht der Nachteile von In-vivo-Methoden ergeben sich für In-vitro-Modelle weitere
Vorteile in einer Einsparung von Tierversuchen und in der Möglichkeit, auch mit toxischen
Dosen arbeiten zu können (WESTER und MAIBACH 1985). Bei den In-vitro-Methoden
unterscheidet man zwischen Modellen mit nicht perfundierter und perfundierter Haut. Zu den
erstgenannten gehören Diffusionszellen und Zellkulturen. Die Perfusionsmodelle sind unter
2.3.2.3 aufgeführt.
2.3.2.1 Diffusionszellen
Die Anwendung von Diffusionszellen basiert auf der Annahme, daß die Barriereeigenschaften
der Hornschicht von exzidierter Haut mit In-vivo-Verhältnissen identisch sind, eine Annahme,
die durch viele Untersuchungen gestützt wird. Nach BRONAUGH und MAIBACH (1985)
behält die Haut auch nach Exzision vom Körper ihre Barriereeigenschaften, da das Stratum
corneum als nicht mehr vitales Gewebe die wichtigste Penetrationsbarriere für Substanzen
darstellt. Vitale Haut ist nach BRONAUGH und MAIBACH (1985) weiterhin keine
Voraussetzung für Penetrationsversuche, weil die Penetration ein passiver Diffusionsprozeß
ist. Die Barriereeigenschaften der Haut können normalerweise nach Gewinnung der Haut vom
Körper und geeigneter Lagerung (-20 °C) bis zu drei Monaten erhalten bleiben (HARRISON
et al. 1984). Unter standardisierten Bedingungen gewonnene Haut von verschiedenen
Tierspezies ist im Gegensatz zu Humanhaut leicht erhältlich. Letztere steht nur in begrenztem
Umfang bei Operationen oder post mortem zur Verfügung. PFLUCKER et al. (1997)
untersuchen morphologische Veränderungen und die dermale Permeation in vitro an
exzidierter Schweinehaut nach Lagerung unter verschiedenen Bedingungen im Vergleich zu
24
frischer Haut. Sie finden nach topischer Applikation verschiedener Substanzen keine
Änderungen in den Penetrationseigenschaften der Haut. Das gebräuchlichste In-vitro-Modell
zum Studium des dermalen Wirkstofftransportes ist die Diffusionszelle nach Franz (FRANZ
1975) (Abb. 11) bzw. davon abgeleitete Modifikationen.
Abb. 11: Schematische Darstellung des Aufbaus sog. „Franz-Zellen“ (nach FRANZ 1975)
Die „Franz-Zelle“ besteht aus einer doppelwandigen, temperierbaren Glaskammer zur
Aufnahme der Rezeptorflüssigkeit. Auf dieses Gerät wird entweder das vom subkutanen Fett
befreite Hautstück oder nur die Epidermis gelegt und durch einen Glasring und eine
Metallklammer so fixiert, daß es mit der dermalen Seite in Kontakt zum Rezeptormedium
gelangt. Die epidermale Seite der Haut wird in die trockene bzw. kontrolliert hydratisierte
Umgebung gerichtet eingesetzt. Als Diffusionsbarriere können auch synthetische Materialien
benutzt werden (NACHT und YEUNG 1985). Da das wässrige dermale Gewebe
wasserlösliche Substanzen leicht diffundieren lässt, stellt es nur eine minimale Beeinflussung
für die Penetration der applizierten Substanzen dar. Hydrophobe Substanzen hingegen
diffundieren nur sehr langsam durch die Dermis, weshalb im Vergleich zu In-vivo-
Untersuchungen die Resorption lipophiler Substanzen langsamer erscheint (BRONAUGH
und COLLIER 1991).
Probe-entnahmerohr
Hautpräparat
Abdeckung
Dichtungsring
Temperatur-mantel
Zufluß
AbflußMagnetrührer
25
Eine auf das Stratum corneum aufgetragene Substanz diffundiert, den Gesetzen der
Fick´schen Diffusion folgend, durch die Schichten der Haut und kann anschließend in der
Rezeptorflüssigkeit nachgewiesen werden. Die gewählte Rezeptorflüssigkeit darf das Ausmaß
der Penetration der Testsubstanz nicht begrenzen, d.h. die Substanz muß im Rezeptormedium
vollständig löslich sein. Die Konzentration der Testsubstanz im Rezeptormedium muß
während der Versuchsdauer gering bleiben, um eine signifikante Rückdiffusion zu vermeiden.
Es muß weiterhin beachtet werden, daß die Barriereeigenschaften der Haut, sowie die
physikalisch-chemischen Eigenschaften der zu untersuchenden Substanz und die Analytik
nicht nachteilig durch die Rezeptorflüssigkeit verändert werden (HOWES et al. 1996). Bei
längerandauernden Experimenten ist nach COLLIER und BRONAUGH (1991) eine
Antibiotikazugabe zur Rezeptorflüssigkeit erforderlich.
Eine besondere Modifikation der Diffusionszelle ist die Durchflußdiffusionszelle („flow-
through“-Diffusionszelle). Sie wurde entwickelt, um die Probennahme zu automatisieren.
Weiter läßt sich hier die Problematik der Rückdiffusion von Stoffen aus der
Rezeptorflüssigkeit in die Haut, die unter Verwendung der Diffusionszelle eintreten kann,
vermeiden. Diese Durchflußdiffusionszellen entsprechen eher der In-vivo-Situation, da durch
den ständigen Austausch der Rezeptorflüssigkeit die penetrierende Substanz durch die
Mikrozirkulation aus der Haut entfernt wird. Im Vergleich zu statischen Diffusionszellen
stimmen die Penetrationsprofile und die penetrierenden Mengen von Wasser, Kortison und
Benzoesäure überein (BRONAUGH und STEWART 1985). Im Gegensatz dazu stellen
WESTER und MAIBACH (1985) signifikante Unterschiede zwischen statischen und „flow
through“-Diffusionszellen fest. Sie untersuchen die Penetration des Desinfektionsmittels
Triclocarban in die menschliche Bauchhaut. Die Penetration im statischen System beträgt 0,1
%, im Durchflußsystem 6,0 % der applizierten Dosis. Die geringe Penetrationsrate wird durch
die schlechte Löslichkeit des Triclocarban in der Rezeptorflüssigkeit erklärt, weshalb diese
Substanz in der Haut verbleibt. Die Löslichkeit im „flow-through“-System ist durch das
höhere Volumen größer, weshalb dieser Zustand eher dem kontinuierlichen Blutfluß in vivo
entspricht. Die perkutane Resorption von Triclocarban in vivo beträgt etwa 7 %. Um die
Resorption vorherzusagen, eignet sich in diesem Fall das „flow-through“-System besser
(WESTER und MAIBACH 1985).
26
Bei der Verwendung von Diffusionszellen ist zu beachten, daß Enzyme aus der Dermis in die
Rezeptorflüssigkeit übertreten können, so daß penetrierte Substanzen möglicherweise erst in
der Rezeptorflüssigkeit metabolisiert werden (BUNDGAARD et al. 1983). DECARVALHO
et al. (1996) zeigen, daß auch eine Diffusion des Wassers aus der Rezeptorkammer in die
Donatorkammer möglich ist, was die Penetration einer Testsubstanz beeinflussen kann.
2.3.2.2 Saarbrücker Penetrationsmodell
Das sog. Saarbrücker Penetrationsmodell (SB-M) wurde auf der Basis von exzidierter
Humanhaut entwickelt. Es können die Arzneistoffkonzentrationsverläufe in den einzelnen
Hautschichten ermittelt werden. Im Gegensatz zur „Franzzelle“, die für die
Wirkstoffpermeation durch die Haut entwickelt wurde, dient das SB-M der Untersuchung der
Wirkstoffpenetration in die Haut.
Am SB-M werden die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Wirkstoffpenetration in die
verschiedenen Hautschichten untersucht, wobei die Haut selbst als Akzeptor für die zu
penetrierende Substanz fungiert. Eine Hydratation der Haut wird vermieden und damit auch
mögliche Veränderungen der Hauteigenschaften, die bei Verwendung der „Franzzelle“ durch
die Rezeptorflüssigkeit entstehen können. Jedoch stellt die Inkubationszeit hier in
Abhängigkeit von der verwendeten Substanz einen limitierenden Faktor dar, da die
Voraussetzungen für das Eindringen der Substanz über die gesamte Versuchsdauer erhalten
werden müssen.
Für den Versuchsablauf wird ein Hautstück zusammen mit einem mit Ringerlösung
getränkten Papierfilter in die Aushöhlung eines Teflonblocks gebracht. Die Arzneimittel-
zubereitung mit der zu penetrierenden Substanz befindet sich in der Aushöhlung eines
Gegenstückes, welches ebenfalls aus Teflon besteht. Dieses Gegenstück wird auf die
Oberfläche der Haut aufgelegt und mit Schrauben fixiert. Um einen transepidermalen
Wasserverlust zu vermeiden, wird die Lücke zwischen den beiden Teflonstücken mit
Plastibase versiegelt. Die gesamte Apparatur wird in in einer Plastikbox in einem 32 °C
warmen Wasserbad über unterschiedlich lange Zeit inkubiert.
Zur Bestimmung der Verteilung der Substanz in den verschiedenen Hautschichttiefen wird
das Hautstück im Anschluß an den Versuch mit zwei verschiedenen Methoden segmentiert:
mit der Tesa-Film-Abrißmethode wird das Stratum corneum Schicht für Schicht abgetragen.
27
Die „lebende“ Epidermis wird mit dem Gefriermikrotom parallel zur Hautoberfläche in
definierten Schichtdicken abgetragen. Durch anschließende Extraktion der zu untersuchenden
Substanz aus den Hautschnitten und Bestimmung der Konzentrationen mittels HPLC kann die
Verteilung in den Hautschichten errechnet werden (WAGNER et al. 2000).
WAGNER et al. (2000) vergleichen das SB-M mit der etablierten „Franzzelle“ und In-vivo-
Daten, wobei sowohl für das SB-M als auch für die „Franzzelle“ für den Arzneistoff
Flufenaminsäure eine gute In-vitro-/ In-vivo-Korrelation gefunden wird. Außerdem stellen sie
fest, daß die starke Hydratation der Haut bei Verwendung der „Franzzelle“ insbesonders den
Arzneistoffkonzentrationsverlauf in den tieferen Hautschichten stark beeinflußt.
Zur Bestimmung der In-vitro-Permeabilitätseigenschaften der Haut gibt es zahlreiche
Untersuchungen. Tabelle 3 faßt in absteigender Reihenfolge in vitro bestimmte
Hautpermeabilitäten bei verschiedenen Spezies zusammen.
TREGEAR (1966) MARZULLI et al. (1969) McCREESH (1965) Hautpermeabilität
Kaninchen Maus Kaninchen
Ratte Meerschweinchen Ratte
Meerschweinchen Ziege Meerschweinchen
Mensch Kaninchen Katze
Pferd Ziege
Katze Affe
Hund Hund
Affe Schwein
Schwein
Mensch
Schimpanse
Tab. 3: In vitro-Hautpermeabilität bei verschiedenen Spezies in absteigender
Reihenfolge (nach TREGEAR 1966; MARZULLI et al. 1969; McCREESH
1965)
Schweinehaut ist nach DICK et al. (1997) für Voraussagen bezüglich der Permeabilität durch
die Haut des Menschen sehr gut geeignet. Rattenhaut stellt ebenfalls ein geeignetes Modell
+++++
+
28
für menschliche Haut dar, wenn die applizierte Substanz hydrophiler Natur ist, führt aber
grundsätzlich zu einer Überschätzung der penetrierten Menge bei lipophilen Substanzen.
BRONAUGH (1985) kann auch in vitro an Rattenhaut regionale Unterschiede feststellen. Die
dünnere Abdominalhaut ist für Wasser, Kortison und Harnstoff permeabler als die dickere
Rückenhaut. BEHL et al. (1985) dagegen zeigen in Versuchen an haarlosen Mäusen, daß hier
die Rückenhaut dünner und gleichzeitig permeabler als die Bauchhaut ist.
Im Hinblick auf die Darstellung der Penetration, also dem Weg durch die Hornschicht und
Anreicherung in der Epidermis, kann zwischen In-vivo- und In-vitro-Versuchen kein
prinzipieller Unterschied festgestellt werden. Wesentliche Abweichungen ergeben sich
jedoch, sobald die Kutis mit ihren Gefäßsystemen in die Penetrationsuntersuchungen
einbezogen wird. Da der Transport durch die Gefäße und die davon abhängige
Gleichgewichtseinstellung in vitro nicht mehr möglich ist, sofern die Haut nicht perfundiert
ist, sind solche Ergebnisse auf In-vivo-Verhältnisse schlecht übertragbar (STÜTTGEN und
SCHAEFER 1974).
Nach KLIGMANN (1983) ist die Auswertbarkeit der In-vitro-Ergebnisse leichter, da bei
diesen Untersuchungen nur die Haut erfasst wird. Er ist daher der Ansicht, daß In-vitro-
Ergebnisse valider sind als In-vivo-Daten, und daß bei bestehenden Unterschieden die In-vivo-
Ergebnisse fragwürdiger sind.
BRONAUGH et al. (1982b) untersuchen die Resorption von Benzoesäure, Acetylsalicylsäure,
Harnstoff und Coffein durch Rattenhaut. Sie vergleichen die erzielten In-vivo- und In-vitro-
Ergebnisse und stellen fest, daß sich sowohl qualitativ als auch quantitativ eine gute
Übereinstimmung zeigt. Andere Autoren stellen ebenfalls zwischen In-vivo- und In-vitro-
Untersuchungen gute Übereinstimmungen fest (AINSWORTH 1960; SEKURA und SKALA
1972; CREASY et al. 1978).
29
2.3.2.3 Zellkulturen und künstliche Haut
Da zu Untersuchungen zur Hautphysiologie und -pathophysiologie frisch exzidierte gesunde
Humanhaut nicht immer in ausreichend großer Menge zur Verfügung steht und Ergebnisse
aus Resorptionsstudien am Tier nur begrenzt auf den Menschen übertragbar sind, stehen als
Ersatzverfahren u.a. kultivierte Hautzellen und rekonstruierte Epidermis bzw. künstliche Haut
zur Verfügung (SCHAEFER-KORTING 1996).
Zellkulturen werden heute in großem Umfang zur Testung von Pharmaka eingesetzt. Hierbei
werden Zellen von Epidermis und Korium in künstlichen Nährmedien vermehrt. Kultiviert
man Keratinozyten in Gegenwart physiologischer Kalziumionenkonzentration, d.h. in einem
kalziumreichen Nährmedium, gelingt es, einen Differenzierungsprozeß in Gang zu setzen, aus
dem mehrschichtige (2-5 Zelllagen) Präparate hervorgehen. In kalziumarmen Nährmedien
wird dagegen nur eine Zelllage ausgebildet (SCHAEFER-KORTING 1996).
Schon DUBERTRET (1990) verwendet ein Hautäquivalent zur Untersuchung dermo-
epidermaler Wechselwirkungen, indem er menschliche Fibroblasten mit Kollagen Typ I und
III mischt. Die Kollagenfasern werden durch die Fibroblasten zusammengezogen. Diese
dreidimensionale Kultur wird anschließend mit Keratinozyten bedeckt.
Für die Herstellung „künstlicher Haut“ werden Keratinozyten beispielsweise auf
mesenchymalem Gewebe (isoliertes Korium oder in Kollagen eingebettete Fibroblasten)
gezüchtet und durch Inkubation an der Luft-Medium-Grenze zur Verhornung gebracht. Diese
„Ersatzhaut“ weist allerdings eine geringere Barrierefunktion als gesunde Humanhaut auf.
Während die verstärkte Durchlässigkeit tierischer Haut auf die Vielzahl von Haarfollikeln
(Shuntweg der Penetration) zurückgeführt wird, ist sie bei der Kunsthaut auf eine den
physiologischen Bedingungen nicht entsprechende Ausbildung des Stratum corneum
zurückzuführen. Epidermale Lipide (Ceramide) entstehen in geringerer Konzentration,
werden unzureichend sezerniert und zudem nicht gemäß der Beschreibung unter 2.2.1
arrangiert. Die in vitro kultivierten Keratinozyten haben jedoch das Potential zur normalen
Ausreifung keinesfalls verloren. Nach Transplantation von „Kunsthaut“ in Nacktmäuse
resultiert nämlich eine Normalisierung der Barrierefunktion (SCHAEFER-KORTING 1996).
Es liegen verschiedene Permeabilitätsstudien und Untersuchungen zur Barrierefunktion von
künstlicher Haut vor (RÉGNIER et al. 1992; DOUCET et al. 1997). LOTTE et al. (1997)
zeigen, daß die Penetrationskinetik von Wasser, Benzoesäure, Coffein und Hydrocortison an
30
rekonstruierter Epidermis deutlich unterschieden werden kann. In dieser Reihenfolge nehmen
die Penetrationsraten der genannten Stoffe ab. Dieses entspricht auch der Reihenfolge der
Permeabilität durch Humanhaut, wobei die mit rekonstruierter Epidermis erzielten absoluten
Werte jedoch wesentlich höher liegen.
SCHMOOK et al. (2001) vergleichen die Penetrationseigenschaften von Menschen-, Ratten-
und Schweinehaut mit kommerziell erhältlichen Hautäquivalenten. Sie kommen zu dem
Ergebnis, daß die momentan angebotenen Kunsthautmodelle (z.B. Graftskin®, Skinethik ®,
Skin²®, Episkin®) nicht ohne Einschränkung für In-vitro-Penetrationsstudien einsetzbar sind.
2.3.2.4 Perfusionsmodelle
Nach HOWES et al. (1996) ist die Verwendung perfundierter Haut aus physiologischer Sicht
wünschenswert, da die Versuchsanordnung in Diffusionszellen nur Aussagen zur dermalen
Penetration, jedoch nicht zur Resorption topisch applizierter Substanzen erlaubt
(KIETZMANN und LÖSCHER 1993). In-vitro-Verfahren, die die In-vivo-Situation am
ehesten widerspiegeln, stellen Perfusionsmodelle dar (BEHRENDT et al. 1989). Es gibt
jedoch nur eine begrenzte Anzahl von Modellen, die als aussagekräftig angesehen werden.
Für Routineuntersuchungen der perkutanen Absorption werden sie aufgrund ihres höheren
technischen Aufwandes und der begrenzten Lebensfähigkeit der perfundierten Organe
seltener genutzt (HOWES et al. 1996). Wie bereits beschrieben, ist zu beachten, daß die
dermale Penetration und Resorption regional erheblich variiert (FELDMANN und
MAIBACH 1969). Diese Tatsache schränkt die Übertragbarkeit von Ergebnissen generell auf
Zieltierarten bzw. auf den Menschen ein (SCHAEFER et al. 1987).
Eine etablierte Versuchsanordnung stellt das isoliert perfundierte Kaninchenohr dar, welche
erstmals von PISSEMSKI (1914) im Rahmen physiologischer Untersuchungen beschrieben
wird. Später werden verschiedene Modifikationen dieser Methode für Untersuchungen zur
Resorption und zum Hautmetabolismus topisch applizierter Substanzen entwickelt (EKERDT
et al. 1985; KELLNER et al. 1986; BEHRENDT und KAMPFFMEYER 1987, 1989; BAST
und KAMPFFMEYER 1994), jedoch ist die Übertragbarkeit der am Kaninchenohr
gemessenen Resorptionsrate auf andere Tierarten oder den Menschen nur mit
Einschränkungen möglich (PERSHING und KRUEGER 1987).
31
Ein weiteres Modell stellt die isoliert perfundierte Hundehaut dar (KJAERSGAARD 1954).
Die Haut des Hinterlaufes wird exzidiert und über die A. saphena mit heparinisiertem
Hundeblut perfundiert. Nach BEHRENDT et al. (1989) ist diese Methode für
Routineuntersuchungen weniger geeignet, da aus anatomischen Gründen kein geschlossenes
arteriovenöses System mittels zusätzlicher venöser Kanülierung erreicht werden kann.
Alternativ zur isoliert perfundierten Hundehaut kann das isoliert perfundierte Hundebein
verwendet werden. Die Gliedmaße wird im Bereich des Hüftgelenkes abgesetzt; als Anschluß
an die Perfusionsapparatur dienen die A. femoralis und die V. saphena medialis (FRIEDMAN
1966; McELFRESH und KELLY 1973; VICK 2000).
Beim isoliert perfundierten Hinterbein der Ratte erfolgt die Perfusion über die A. femoralis.
CROSS et al. (1993) stellen fest, daß durch Erhöhung des Perfusionsflusses um das
Zweifache die Flußrate in der tiefer gelegenen Muskulatur auf das Fünffache ansteigt,
während sich die Flußrate in der Haut und den oberflächlichen Muskeln nur verdoppelt.
Entsprechend der Flußrate nimmt die Wirkstoffkonzentration in den verschiedenen Geweben
zu.
Die Methoden zur Durchführung der Perfusion an isolierten Gliedmaßen werden immer
wieder modifiziert und verbessert. Das isoliert perfundierte Schweinebein ist heute als Modell
für pharmakologische und toxikologische Untersuchungen etabliert (NOGUEIRA et al.
1999).
Mit dem Modell der isoliert perfundierten Humanhaut nach HIERNICKEL (1986) ist die
zusätzliche Perfusion des subkutanen Fettgewebes und eines Lymphknotens möglich. Ein bei
Operationseingriffen exzidierter Leistenhautlappen wird über die A. epigastrica perfundiert,
Venen- und Lymphflüssigkeit werden gesammelt. Das Perfusionsmedium ähnelt in seiner
Zusammensetzung Plasmaersatzflüssigkeit. Nach einer Perfusionszeit von 50 Stunden läßt
sich sowohl makroskopisch als auch mikroskopisch kein Unterschied zu frisch entferntem
Gewebe erkennen.
Einen höheren Arbeitsaufwand im Vergleich zu anderen Perfusionsmodellen erfordert das
Modell des isoliert perfundierten Schweinehautlappens (RIVIERE et al. 1986). Ein zunächst
operativ gewonnener, mit kanülierbaren Gefäßen (A. und V. epigastrica superficialis
caudalis) versehener Hautstiellappen wird nach sechs Tagen in einem zweiten operativen
Eingriff isoliert und steht dann zur Perfusion zur Verfügung. Licht- und
32
elektronenmikroskopische Untersuchungen nach acht Stunden zeigen eine normal
erscheinende Schweinehaut (MONTEIRO-RIVIERE et al. 1987).
Sowohl das menschliche Leistenhautpräparat als auch die Schweinehautplastik enthalten
erhebliche Fettmengen, in die lipophile Pharmaka diffundieren und die die Kinetik von
Substrat und Metaboliten verändern. Diese Nachteile sind am isoliert perfundierten
Schweineohr nicht vorhanden. DE LANGE et al. (1992) perfundieren Schweineohren mit
Carbogen begastem Blut über einen Zeitraum von vier Stunden. Bei der Durchführung von
perkutanen Penetrationsstudien mit diesem Modell ermitteln ELLIOT et al. (1997) jedoch
Penetrationsraten mit einer großen Variabilität.
Ein weiteres Modell zur Prüfung der dermalen Resorption ist das isoliert perfundierte
Rindereuter, welches von Schlachttieren gewonnen wird. Das Rindereuter besitzt eine am
isolierten Organ gut zugängliche arterielle und venöse Gefäßversorgung, die die isolierte
Perfusion ermöglicht (KIETZMANN et al. 1993). Erste Versuche am isoliert perfundierten
Rindereuter wurden bereits unternommen, um die Physiologie der Milchbildung zu
untersuchen (PETERSEN et al. 1939, 1941). ARENS (1991) untersucht am isoliert
perfundierten Rindereuter die dermale Penetration von topisch applizierten Substanzen. Hier
weist sie neben einer Penetration und Resorption auch eine In-vitro-Metabolisierung von
Wirkstoffen nach.
2.4 Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison als Testsubstanzen der
transdermalen Penetration und Permeation
Die Substanzen Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison werden aufgrund ihrer
unterschiedlichen Pharmakokinetik in vielen Penetrationsstudien als Modellsubstanzen
verwendet. GUY und HADGRAFT (1984) nutzen unter Verwendung dieser Substanzen ein
pharmakokinetisches Modell zur Beschreibung des pharmakokinetischen Verhaltens von
Stoffen (siehe 2.2.2). Sie können anhand der am Menschen in vivo ermittelten
Geschwindigkeitskonstanten k1 – k4 (gemäß Abb. 9, S. 13) zeigen, wie deutlich sich
Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison voneinander unterscheiden. Die Unterschiede in
der Pharmakokinetik dieser Substanzen resultieren hauptsächlich aus der unterschiedlichen
transepidermalen Penetration und Permeation, was auch aus den Halbwertzeiten (t50), die sich
33
auf die Eindringgeschwindigkeit beziehen, ersichtlich ist. Der Zusammenhang zwischen
Halbwertzeit (t50) und Geschwindigkeitskonstante (k) ergibt sich aus der Formel t50 = ln2 / k
(Tab. 4).
Substanz k1 t50 k2 t50 k3 t50 k4 t50
Benzoesäure 0,184 3,8 2,88 0,2 0,014 49,5 0,592 1,2
Testosteron 0,058 12,0 1,44 0,5 2,70 0,3 0,104 6,7
Hydrocortison 0,022 31,5 1,44 0,5 0,180 3,9 0,158 4,4
Tab. 4: Geschwindigkeitskonstanten k1-k4 (1/h) (gemäß Abb. 3, S. 13) und
Halbwertzeiten t50 (h) (t50 = ln2 / k) für Benzoesäure, Testosteron und Hydro-
kortison (nach GUY und HADGRAFT 1984)
Es wird deutlich, daß Hydrocortison im Vergleich zu Benzoesäure und Testosteron nur
langsam in die Hornschicht penetriert (t50 = 31,5 Stunden), woraus eine sehr langsame
Anflutung resultiert. Aufgrund seiner chemisch-physikalischen Eigenschaften permeiert es
anschließend jedoch relativ schnell durch die Dermis in das Blut bzw. die Rezeptorflüssigkeit
(t50 = 0,5 Stunden). Benzoesäure dagegen tritt mit einer Halbwertzeit von 0,2 Stunden fast
doppelt so schnell aus der Hornschicht in das Blut bzw. in die Rezeptorflüssigkeit über wie
Testosteron und Hydrocortison (t50 = 0,5 Stunden). Etwas langsamer, aber im Vergleich zur
Anflutung in das Stratum corneum relativ schnell, diffundiert Hydrocortison aus dem Blut
bzw. der Rezeptorflüssigkeit zurück in die Haut (t50 = 3,9 Stunden). Auch Testosteron hat mit
einer Halbwertzeit von 0,3 Stunden eine hohe Affinität zur Hornschicht, wohingegen
Benzoesäure nur zu einem minimalen Teil zurückdiffundiert (t50 = 49,5 Stunden). Für die drei
Wirkstoffe ergeben sich folglich unterschiedliche Verteilungsprofile in der Haut (Abb. 12).
k2 k1 k3
k4
galenischeFormulierung
Stratumcorneum
Blut bzw.Rezeptor-flüssigkeit
34
Somit ergibt sich, daß sich das Stratum corneum mit Benzoesäure schnell anfüllt. Dann flutet
es sehr schnell wieder ab. Eine Rückdiffusion erfolgt nur in sehr geringem Maße.
Testosteron tritt dagegen relativ langsam in die Hornschicht über. Die Abflutung erfolgt nur
langsam, da es fast doppelt so schnell in das Stratum corneum zurückdiffundiert, wie es aus
diesem freigesetzt wird.
Die Anflutung von Hydrocortison erfolgt noch langsamer. Es flutet in gleichem Maße wie
Testosteron aus der Hornschicht ab, diffundiert aber langsamer wieder in diese zurück.
Daraus resultiert ein geringerer Nettofluß des Hydrocortisons, wodurch sich der sog.
Reservoireffekt der Hornschicht erklärt. GUY und HADGRAFT (1984) errechnen aus dem
Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten k3/k2 die relative Affinität einer Substanz zum
Stratum corneum (20 = hoch; 0,5 = mittel; 0,002 = gering). Für die drei hier untersuchten
Substanzen ergibt sich demnach die höchste Affinität für Testosteron (1,88), gefolgt von
Hydrocortison (0,13) und Benzoesäure (0,005).
Da sich die Substanzen Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison in ihrer
Pharmakokinetik so deutlich voneinander unterscheiden und weil bereits viele Studien
vorliegen, in denen diese Substanzen verwendet werden, dienen sie in der vorliegenden Arbeit
ebenfalls als Untersuchungssubstanzen, um die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse mit
Ergebnissen aus der zugänglichen Literatur vergleichen zu können.
0
Zeit (h)
72
1
0,1
0,01
Konzentration(Dimension)
36
Abb. 12: Schematische Verteilungs-
profile in der Haut als Zeitfunktion
für Benzoesäure (B), Testosteron (T)
und Hydrocortison (H)
(nach GUY und HADGRAFT 1984)
35
3 Material und Methoden
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, tierartliche und regionale Unterschiede der transdermalen
Penetration und Permeation in einer vergleichenden Untersuchung unter identischen
Bedingungen darzustellen. Als Testsubstanzen dienten Benzoesäure, Testosteron und
Hydrocortison, die aufgrund unterschiedlicher physikalisch-chemischer Eigenschaften
unterschiedlich schnell durch die Haut diffundieren und vielfach eingesetzte
Modellsubstanzen sind (siehe 2.4).
3.1 Versuchsmaterial
Die in den Versuchen verwendeten Häute wurden von euthanasierten Schweinen, Hunden,
Rindern, Pferden und Ratten gewonnen. Die Euterhaut stammte aus Schlachthofmaterial von
gesunden Deutschen Holsteinischen Kühen (5-6 Jahre alt). Bei den Schweinen handelte es
sich um drei Monate alte Tiere (2 weiblich und 2 männlich) aus dem zentralen Tierlabor der
Medizinischen Hochschule Hannover. Sowohl die Ratten der Rasse Wistar (weiblich) als
auch die Hunde (Beagle, 9-11 Jahre alt, männlich) stammten aus dem Institut für
Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Die
Rinderhaut wurde von Deutschen Holsteinischen Kühen (3-6 Jahre alt) im Institut für
Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover entnommen. Bei den Pferden handelte es
sich um Tiere (> 20 Jahre alt), die im Institut für Anatomie der Tierärztlichen Hochschule
Hannover euthanasiert worden waren.
Wie aus den Abb. 13 - 15 zu entnehmen ist, wurden bei den Tierarten Pferd, Schwein, Rind
und Hund Hautproben aus den Regionen der seitlichen Brustwand (Regio costalis), des
Rückens (Regio lumbalis) und des Bauches (Regio umbilicalis) entnommen. Rattenhaut
stammte nur aus der Rücken- und Bauchregion. Die Euterhaut wurde von der seitlichen
Euterwand gewonnen.
36
Abb. 13: Hautentnahmestellen beim Hund (analoge Hautstellen beim Pferd,
Schwein und Rind)
Abb. 14: Hautentnahmestellen bei der Ratte
Abb. 15:
Hautentnahmestelle
am Euter
dorsal ventral
Rücken Bauch
Brustwand Brustwand
dorsal ventral
37
Die Haut wurde von subkutanem Fett befreit, mit Enthaarungscreme (Veet®) behandelt, in
4x4 cm große Stücke geteilt und bis zum Versuchsbeginn in flüssigem Stickstoff bei –196 °C
aufbewahrt.
3.2 Verwendete Testsubstanzen
Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison standen als Reinsubstanzen (Sigma Chemie,
Deisenhofen) zur Verfügung. Sie wurden vor Versuchsbeginn in 70 %igem Ethanol (Merck,
Darmstadt) gelöst. Die Substanzen wurden als 0,8 %ige alkoholische Lösung appliziert.
3.2.1 Benzoesäure (Abb. 16)
Benzoesäure ist bei 25 °C relativ schlecht in Wasser löslich (3,4 mg/ml), die Löslichkeit
nimmt jedoch mit der Zugabe von alkalischen Substanzen zu. Benzoesäure ist sehr gut in
kaltem Alkohol (435 mg/ml) und Aceton (333 mg/ml) löslich (ANONYMUS 1983).
COOH
3.2.2 Hydrocortison (Abb. 17)
Hydrocortison ist bei 25 °C schlecht in Wasser löslich (0,28 mg/ml), dagegen löst es sich gut
in Ethanol (15 mg/ml) und Aceton (9,3 mg/ml) (ANONYMUS 1983).
O
CH3
HO
H
H H
CH3C
OH
O
CH2OH
Abb. 16:Strukturformel vonBenzoesäure
Abb. 17:Strukturformelvon Hydrocortison
38
3.2.3 Testosteron (Abb. 18)
Testosteron ist wie alle Steroide in Wasser unlöslich, dagegen in Alkohol, Ether und anderen
organischen Lösungsmitteln sowie Ölen gut löslich (ANONYMUS 1983).
CH3
CH3OH
O
3.3 Diffusionszellen
Abb. 19: Darstellung des Versuchsaufbaus
Die in Abb. 19 dargestellten statischen Diffusionszellen bestehen aus einer nach oben offenen
Rezeptorkammer mit 50 ml Fassungsvermögen. Es befindet sich ein Zugang zu der
Abb. 18:Strukturformelvon Testosteron
1 = “Franzzelle“ (siehe auch Abb. 11, S. 24)
2 = Magnetrührer3 = Wasserbad4 = Pumpe
1
2 3
4
1
39
Rezeptorkammer am Boden und ein weiterer unter dem Hals. Über den oberen Zugang erfolgt
die Probennahme, der untere dient dem Volumenersatz. Auf dem trichterförmigen Hals der
Rezeptorkammer befindet sich ein Glaszylinder mit einem Durchmesser von 1,6 cm. Durch
das Einspannen der Haut wird er zur nach oben offenen Donatorkammer. Der Zylinder ist mit
einer Klammer an der Rezeptorkammer befestigt. Die Rezeptorkammer ist von einem
Glasmantel mit Zu- und Ablauf umgeben. Mittels einer Pumpe wird durch diesen Glasmantel
in einem Wasserbad erwärmtes Wasser gepumpt, so daß die Temperatur der
Rezeptorflüssigkeit mit 32 - 34 °C der der Hautoberflächentemperatur entspricht. Als
Rezeptorflüssigkeit wird ein Phosphatpuffer verwendet. Sie wird kontinuierlich gerührt.
Zusammensetzung der verwendeten Rezeptorflüssigkeit (pH 7,4):
11,50 g Na2HPO4*2 H2O (Merck, Darmstadt)
2,96 g NaH2PO4 (Merck, Darmstadt)
5,84 g NaCl (Merck, Darmstadt)
ad 1 l Aqua bidest.
3.4 Versuchsdurchführung
Die Testsubstanzen Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison wurden als 0,8 %ige
alkoholische Lösungen appliziert. Die jeweils aufgetragene Substanzmenge betrug 800 µg pro
Applikationsfläche von 2 cm² (400 µg/cm²). Je Tierart und Hautlokalisation (seitliche
Brustwand, Rücken und Bauch bzw. Euter) wurden pro Testsubstanz vier Versuche
durchgeführt. Die Versuchsdauer betrug sechs Stunden. Unmittelbar vor dem Auftragen der
Testsubstanzen auf die vorbereiteten Hautstücke erfolgte eine erste Probennahme von 300 µl
Rezeptorflüssigkeit. Weitere Proben von 300 µl wurden nach 1, 2, 4 und 6 Stunden
entnommen. Nach jeder Probennahme wurden die Diffusionszellen mit 300 µl
Rezeptorflüssigkeit wieder aufgefüllt. Die Proben wurden bis zur Auswertung bei –20 °C
eingefroren.
40
3.5 Nachweis der Testsubstanzen
Die Benzoesäurekonzentration wurde mittels Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
(HPLC) gemessen. Die Bestimmung der Hydrocortison- und Testosteronkonzentrationen
erfolgte mit enzymgebundenen Immunadsorptionstests (ELISA) (Cortisol Saliva Nr. RE
52261, IBL, Hamburg; Testosteron Nr. RE 52151, IBL, Hamburg).
3.5.1 Enzymimmunoassay
Das Prinzip der beiden Enzymimmunoassays (ELISA) ist gleich. Das Hormon in der Probe
konkurriert mit Meerrettichperoxidase markiertem Hormon um die Bindung an eine begrenzte
Anzahl von Antikörpern, mit denen eine Mikrotiterplatte beschichtet ist. Nach Inkubation und
Waschen der Mikrotiterplatte wurde zur Entwicklung des Assays ein Farbreagenz
hinzugegeben, das Tetramethylbenzidin enthält. Nach einer weiteren Inkubation wurde die
Enzymreaktion durch die Zugabe einer Stop-Lösung (0,5 M Schwefelsäure) beendet. Die
Intensität des gebildeten Farbstoffes wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 450 nm
im Mikroplate Reader MRX (Dynatech Deutschland GmbH, Denkendorf) gemessen. Die
Extinktion des gelben Farbstoffes ist umgekehrt proportional zur Antigenkonzentration in den
Proben.
Bei jedem Messansatz wurde eine Standardreihe mitgeführt, die von 2 - 80 ng/Ansatz (Hydro-
kortison) bzw. 0,2 - 16 ng/Ansatz (Testosteron) reichte. Aus den Standards wurden die
Bindungsraten des Hormons ermittelt. Diese Bindungsraten (%-Bindung) dienten der
Berechnung einer Kalibrationskurve nach Probittransformation. Die Extinktionen der Proben
wurden auf diese Eichkurve bezogen. Die Nachweisgrenze lag bei 2 ng/ml (Hydrocortison)
bzw. 0,5 ng/ml (Testosteron). Die Inter- und Intra-Assay-Varianz der Tests liegt nach
Herstellerangaben bei 4,6 - 6,3 % (Hydrocortison) und 3,8 - 5,8 % (Testosteron). Die
Kreuzreaktivitäten der Immunoassays sind in Tab. 5 zusammengefaßt.
41
Tab. 5: Spezifität der verwendeten Antikörper:
a) Hydrocortison - Antikörper
Hydrocortison 100 %
Prednisolon 60 %
Kortikosteron 29 %
Übrige Steroide < 3 %
b) Testosteron - Antikörper
Testosteron 100 %
Androstendion 0,9 %
Androsteron 1 %
Übrige Steroide < 0,9 %
3.5.2 Bestimmung von Benzoesäure mittels Hochdruck-Flüssigkeits-Chromato-
graphie (HPLC)
Reagenzien
Na2HPO4*2 H2O (Merck, Darmstadt)
NaH2PO4 (Merck, Darmstadt)
NaCl (Merck, Darmstadt)
KH2PO4 (Merck, Darmstadt)
Phophorsäure 85% (Merck, Darmstadt)
Benzoesäure-Reinsubstanz (Sigma Chemie, Deisenhofen)
Acetonitril (Labscan, Dublin, Irland)
Aqua bidest.
42
Aufarbeitung der Proben
Die Proben wurden bei 4 °C und 15000 g/Minute 5 Minuten lang zentrifugiert (Eppendorf
Zentrifuge 5403, Hamburg). Dem Überstand jeder Probe wurden 16 µl 8,5 %ige Phosphor-
säure zugegeben, um einen pH-Wert von 3,0 zu erhalten. Dieses Volumen wurde zuvor
mittels Titration der Rezeptorflüssigkeit mit 8,5 %iger Phosphorsäure ermittelt.
HPLC-Anlage
Autosampler: Gilson Model 231, Abimed mit Dilutor 401, Langenfeld
Pumpe: System Gold 116, Beckman, München
Detektor: Modell 2050, Varian, Darmstadt
P.C./Software: Gold Nouveau, Beckman, München
Vorsäule: LiChrospher 100 RP-18e (5 µm)
Merck, Darmstadt
Trennsäule: LiChrospher 100 RP18 endcapped, (5 µm), 250-4
Merck, Darmstadt
HPLC-Bedingungen
Eluent: Acetonitril : Phosphatpuffer (110 : 200), pH-Wert 3,0
Phosphatpuffer: 6,804 g KH2PO4 ad 1 l Aqua bidest.
mittels 85 %iger Phosphorsäure auf pH 2,4 eingestellt
Fluß: 1 ml/ Minute
Detektion: UV 230 nm
Injektionsmenge: 100 µl
Für die Kalibrationsreihe wurden aus einer Stammlösung von Benzoesäure (1 mg
Benzoesäure/ml Rezeptorflüssigkeit) Verdünnungen von 20, 30, 40, 50, 100, 200, 400, 600,
800, 1000, 2000, 4000, 6000, 8000, 10000, 15000 und 20000 ng/ml Phosphatpuffer
43
hergestellt. Aus den ermittelten Peakhöhen der Standards wurde mittels linearer Regression
(Excel 7.0) die Funktion der Kalibrationskurve errechnet. Es ergab sich folgende Funktion:
x (ng Benzoesäure/ml) = (y – 4150,5) / 65,236
(r = 0,9998)
Die Berechnung der Benzoesäurekonzentration in der Rezeptorflüssigkeit erfolgte mit Hilfe
der Regressionsgeraden. Mit der Methode wurde eine Nachweisgrenze von 40 ng/ml erreicht.
3.6 Statistische Auswertung
Aus den Wirkstoffkonzentrationen in der Rezeptorflüssigkeit wurde die pro Fläche (cm2) und
Zeiteinheit (h) penetrierte Menge berechnet. Die Menge (µg/cm² Haut) errechnet sich nach
folgender Gleichung:
M = C x R / F
M = penetrierte Menge (µg/cm² Haut)
C = gemessene Wirkstoffkonzentration (ng/ml)
R = Menge der Rezeptorflüssigkeit (50 ml)
F = Hautfläche (2 cm²)
Wegen der jeweils geringen Versuchsanzahl (n=4) wurden die penetrierten Wirkstoffmengen
mit Hilfe des nicht parametrischen U-Tests für ungebundene Stichproben nach MANN und
WHITNEY (1947) verglichen. Die Berechnungen erfolgten mit dem Computerprogramm
SigmaStat für Windows (Version 1.0, Jandel Corporation). Eine Irrtumswahrscheinlichkeit
von 5 % (p < 0,05) galt als schwach signifikant, eine von 1 % (p < 0,01) als signifikant, eine
Irrtumswahrscheinlichkeit von 0,1 % (p < 0,001) als hoch signifikant. Einige wenige der
Hautproben waren nicht auswertbar, da die gemessenen Wirkstoffkonzentrationen in der
Rezeptorflüssigkeit eine Schädigung der Haut auswiesen.
44
4 Ergebnisse
4.1 Benzoesäurepenetration und -permeation
4.1.1 Rattenhaut (Abb. 20–21)
Von der aufgetragenen Benzoesäuremenge (400 µg/cm² Haut) permeierten binnen sechs
Stunden 256 – 291 µg/cm² durch die Rückenhaut und 194 – 291 µg/cm² durch die Bauchhaut.
Das sind jeweils mehr als 50 % der aufgetragenen Menge. Die Berechnung der permeierten
Benzoesäuremenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6. Die Symbole in den nachfolgenden
Abbildungen kennzeichnen jeweils das Ergebnis eines Versuches.
Im statistischen Vergleich (U-Test) der Benzoesäurepermeation ist zwischen Rücken- und
Bauchhaut der Ratte kein signifikanter Unterschied ersichtlich (p > 0,05). Die Ergebnisse der
statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle 7 aufgeführt.
Abb. 20:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteRückenhautproben der Ratte.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 1.
Abb. 21:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBauchhautproben der Ratte.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 1.
0
100
200
300
400
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
0
100
200
300
400
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
45
4.1.2 Hundehaut (Abb. 22-24)
Von der aufgetragenen Benzoesäuremenge (400 µg/cm² Haut) permeierten binnen sechs
Stunden 50 – 135 µg/cm² durch die Rückenhaut, 42– 203 µg/cm² durch die Bauchhaut und
134– 350 µg/cm² durch die Haut der Brustwand. Das sind am Rücken und Bauch weniger als
50 % und an der Brustwand mehr als 50 % der aufgetragenen Menge. Die Berechnung der
permeierten Benzoesäuremenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6.
Abb. 22:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteRückenhautproben des Hundes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 2.
Abb. 23:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBauchhautproben des Hundes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 2.
Abb. 24:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBrustwandhautproben des Hundes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 2.
0
100
200
300
400
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
0
100
200
300
400
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
0
100
200
300
400
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
46
Im statistischen Vergleich (U-Test) der Benzoesäurepermeation sind zwischen Rücken-,
Bauch- und Brustwandhaut des Hundes keine signifikanten Unterschiede ersichtlich (p >
0,05). Die Ergebnisse der statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle 7 aufgeführt.
4.1.3 Pferdehaut (Abb. 25-27)
Von der aufgetragenen Benzoesäuremenge (400 µg/cm² Haut) permeierten binnen sechs
Stunden 13 – 76 µg/cm² durch die Rückenhaut, 260 – 386 µg/cm² durch die Bauchhaut und
374 – 397 µg/cm² durch die Haut der Brustwand. Das sind am Rücken weniger als 25 % und
am Bauch und an der Brustwand biszu fast 100 % der aufgetragenen Menge. Die Berechnung
der permeierten Benzoesäuremenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6.
Im statistischen Vergleich (U-Test) der Benzoesäurepermeation durch die Rücken-, Bauch-
und Brustwandhaut des Pferdes bestehen schwach signifikante Unterschiede (p < 0,05)
sowohl zwischen der Rücken- und Bauchhaut als auch zwischen der Rücken- und
Brustwandhaut. Hier ist die Rückenhaut für Benzoesäure weniger permeabel als die Bauch-
und Brustwandhaut des Pferdes. Die Ergebnisse der statistischen Berechnung sind im Anhang
in Tabelle 7 aufgeführt.
4.1.4 Schweinehaut (Abb. 28-30)
Von der aufgetragenen Benzoesäuremenge (400 µg/cm² Haut) permeierten binnen sechs
Stunden 51 – 96 µg/cm² durch die Rückenhaut, 29 – 246 µg/cm² durch die Bauchhaut und 81
– 124 µg/cm² durch die Haut der Brustwand. Das sind am Rücken weniger als 25 % und am
Bauch und an der Brustwand durchschnittlich 25 % der aufgetragenen Menge. Die
Berechnung der permeierten Benzoesäuremenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6.
Im statistischen Vergleich (U-Test) der Benzoesäurepermeation sind zwischen Rücken-,
Bauch- und Brustwandhaut des Schweines keine signifikanten Unterschiede ersichtlich (p >
0,05). Die Ergebnisse der statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle 7 aufgeführt.
47
Abb. 25:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteRückenhautproben des Pferdes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 3.
Abb. 26:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBauchhautproben des Pferdes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 3.
Abb. 27:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBrustwandhautproben des Pferdes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 3.
0
100
200
300
400
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
0
100
200
300
400
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
0
100
200
300
400
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
48
Abb. 30:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBrustwandhautproben desSchweines.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 4.
Abb. 28:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteRückenhautproben des Schweines.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 4.
Abb. 29:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBauchhautproben des Schweines.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 4.
0
100
200
300
400
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
0
100
200
300
400
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
0
100
200
300
400
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
49
4.1.5 Rinderhaut (Abb. 31-34)
Von der aufgetragenen Benzoesäuremenge (400 µg/cm² Haut) permeierten binnen sechs
Stunden 4 – 31 µg/cm² durch die Rückenhaut, 24 – 282 µg/cm² durch die Bauchhaut, 47 –
380 µg/cm² durch die Haut der Brustwand und 181 – 285 µg/cm² durch die Euterhaut. Das
sind am Rücken weniger als 10 %, am Bauch und an der Brustwand bei Vernachlässigung der
Ausreißer (*) weniger als 50 % und an der Euterhaut mehr als 50 % der aufgetragenen
Menge. Die Berechnung der permeierten Benzoesäuremenge erfolgte gemäß Angaben unter
3.6.
Im statistischen Vergleich (U-Test) der Benzoesäurepermeation sind zwischen der Rücken-,
Bauch- und Brustwandhaut des Rindes bei Vernachlässigung der Ausreißer keine
signifikanten Unterschiede ersichtlich (p > 0,05). Es scheint jedoch die Rückenhaut
tendenziell für Benzoesäure weniger permeabel als die Bauch- und Brusthaut zu sein. Die
Euterhaut des Rindes ist im Vergleich zur Rückenhaut für Benzoesäure wesentlich
permeabler. Hier besteht ein schwach signifikanter Unterschied (p < 0,05). Im Vergleich der
Benzoesäurepermeation durch die Euter-, Bauch und Brustwandhaut sind auch bei
Vernachlässigung des Ausreißers (*) keine signifikanten Unterschiede ersichtlich (p > 0,05).
Die Euterhaut scheint jedoch tendenziell für Benzoesäure permeabler als die Bauch- und
Brusthaut zu sein. Die Ergebnisse der statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle 7
aufgeführt.
50
Abb. 31:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteRückenhautproben des Rindes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 5.
Abb. 32:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBauchhautproben des Rindes(* = Ausreißer).Einzelwerte siehe Anhangstabelle 5.
Abb. 33:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBrustwandhautproben des Rindes(* = Ausreißer).Einzelwerte siehe Anhangstabelle 5.
Abb. 34:Permeation von Benzoesäure(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteEuterhautproben des Rindes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 5.
0
100
200
300
400
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
0
100
200
300
400
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
ene
(µg/
cm²)
*
0
100
200
300
400
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
0
100
200
300
400
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
*
51
4.2 Hydrocortisonpenetration und -permeation
4.2.1 Rattenhaut (Abb. 35-36)
Von der aufgetragenen Hydrocortisonmenge (400 µg/cm² Haut) permeierten binnen sechs
Stunden 1,7 – 3,9 µg/cm² durch die Rückenhaut und 1,9 – 3,4 µg/cm² durch die Bauchhaut.
Das ist jeweils weniger als 1 % der aufgetragenen Menge. Die Berechnung der permeierten
Hydrocortisonmenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6.
Im statistischen Vergleich (U-Test) der Hydrocortisonpermeation ist zwischen Rücken- und
Bauchhaut der Ratte kein signifikanter Unterschied ersichtlich (p > 0,05). Die Ergebnisse der
statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle 7 aufgeführt.
Abb. 35:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteRückenhautproben der Ratte.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 1.
Abb. 36:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBauchhautproben der Ratte.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 1.
0
1
2
3
4
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
0
1
2
3
4
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
52
4.2.2 Hundehaut (Abb. 37-39)
Von der aufgetragenen Hydrocortisonmenge (400 µg/cm² Haut) permeierten binnen sechs
Stunden bis zu 0,4 µg/cm² durch die Rückenhaut, bis zu 3,5 µg/cm² durch die Bauchhaut und
bis zu 0,26 µg/cm² durch die Haut der Brustwand. Das sind am Rücken 0,1 %, am Bauch
weniger als 1 % und an der Brustwand weniger als 0,1 % der aufgetragenen Menge. Bei der
Rücken-, Bauch- und Brustwandhaut eines Hundes (Nr. 1, s. Anhangstab. 2) lag die in der
Rezeptorflüssigkeit gemessene Hydrocortisonkonzentration unterhalb der Nachweisgrenze.
Die Berechnung der permeierten Hydrocortisonmenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6.
Abb. 37:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteRückenhautproben des Hundes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 2.
Abb. 38:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBauchhautproben des Hundes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 2.
Abb. 39:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBrustwandhautproben des Hundes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 2.
0
1
2
3
4
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
0
1
2
3
4
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
0
1
2
3
4
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
53
Im statistischen Vergleich (U-Test) der Hydrocortisonpermeation durch die Rücken-, Bauch-
und Brustwandhaut des Hundes sind zwar keine signifikanten Unterschiede ersichtlich (p >
0,05), dennoch deutet sich an, daß ist die Bauchhaut für Hydrocortison permeabler als die
Rücken- und Brusthaut sein könnte. Die Ergebnisse der statistischen Berechnung sind im
Anhang in Tabelle 7 aufgeführt.
4.2.3 Pferdehaut (Abb. 40-41)
Von der aufgetragenen Hydrocortisonmenge (400 µg/cm² Haut) permeierten binnen sechs
Stunden 3,6 – 12,7 µg/cm² durch die Bauchhaut und 23,8 – 97,2 µg/cm² durch die Haut der
Brustwand. Das sind am Bauch weniger als 5 % und an der Brustwand bis zu 25 % der
aufgetragenen Menge. Bei der Rückenhaut (keine Abbildung) lag die in der
Rezeptorflüssigkeit gemessene Hydrocortisonkonzentration unterhalb der Nachweisgrenze.
Die Berechnung der permeierten Hydrocortisonmenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6.
Abb. 40:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBauchhautproben des Pferdes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 3.
Abb. 41:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBrustwandhautproben des Pferdes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 3.
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
54
Im statistischen Vergleich (U-Test) der Hydrocortisonpermeation durch die Bauch- und
Brustwandhaut des Pferdes ist kein signifikanter Unterschied ersichtlich (p > 0,05).
Tendenziell scheint die Bauchhaut jedoch für Hydrocortison weniger permeabel als die
Brusthaut zu sein. Die Ergebnisse der statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle 7
aufgeführt.
4.2.4 Schweinehaut (Abb. 42-43)
Von der aufgetragenen Hydrocortisonmenge (400 µg/cm² Haut) permeierten binnen sechs
Stunden 0,2 – 1,3 µg/cm² durch die Bauchhaut und bis zu 2,4 µg/cm² durch die Haut der
Brustwand. Das ist jeweils weniger als 1 % der aufgetragenen Menge. Bei den Rückenhäuten
(keine Abbildung) und bei der Bauchhaut eines Schweines (Nr. 1, s. Anhangstab. 4) lag die in
der Rezeptorflüssigkeit gemessene Hydrocortisonkonzentration unterhalb der
Nachweisgrenze. Die Berechnung der permeierten Hydrocortisonmenge erfolgte gemäß
Angaben unter 3.6.
Abb. 42:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBauchhautproben des Schweines.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 4.
Abb. 43:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBrustwandhautproben desSchweines.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 4.
0
1
2
3
4
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
0
1
2
3
4
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
55
Im statistischen Vergleich (U-Test) der Hydrocortisonpermeation durch die Bauch- und
Brustwandhaut des Schweines ist kein signifikanter Unterschied ersichtlich (p > 0,05). Die
Ergebnisse der statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle 7 aufgeführt.
4.2.5 Rinderhaut (Abb. 44-46)
Von der aufgetragenen Hydrocortisonmenge (400 µg/cm² Haut) permeierten binnen sechs
Stunden bis zu 6,1 µg/cm² durch die Bauchhaut, bis zu 0,2 µg/cm² durch die Haut der
Brustwand und 2,7 - 4,8 µg/cm² durch die Euterhaut. Das sind am Bauch weniger als 2 %, an
der Brustwand weniger als 0,1 % und am Euter mehr als 1 % der aufgetragenen Menge. Bei
den Rückenhäuten (keine Abbildung), bei zwei Bauchhäuten (Nr. 3 und 4, s. Anhangstab. 5)
und bei einer Brustwandhaut (Nr. 1, s. Anhangstab. 5) lag die in der Rezeptorflüssigkeit
gemessene Hydrocortisonkonzentration unterhalb der Nachweisgrenze. Die Berechnung der
permeierten Hydrocortisonmenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6.
Im statistischen Vergleich (U-Test) der Hydrocortisonpermeation ist zwischen Bauch- und
Brustwandhaut des Rindes kein signifikanter Unterschied ersichtlich (p > 0,05). Die Euterhaut
des Rindes ist im Vergleich zur Brustwandhaut für Hydrocortison wesentlich permeabler.
Hier besteht ein schwach signifikanter Unterschied (p < 0,05). Im Vergleich der
Hydrocortisonpermeation durch die Euter-, Bauchhaut ist kein signifikanter Unterschied
ersichtlich (p > 0,05). Die Ergebnisse der statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle
7 aufgeführt.
56
Abb. 44:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBauchhautproben des Rindes(* = Ausreißer).Einzelwerte siehe Anhangstabelle 5.
Abb. 45:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteBrustwandhautproben des Rindes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 5.
Abb. 46:Permeation von Hydrocortison(µg/cm² Haut) durch vier inDiffusionszellen untersuchteEuterhautproben des Rindes(Cave: Skalierung bis 5 µg/cm²).Einzelwerte siehe Anhangstabelle 5.
0
1
2
3
4
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²) *
0
1
2
3
4
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
0
1
2
3
4
5
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
57
4.3 Testosteronpenetration und -permeation
4.3.1 Rattenhaut (Abb. 47-48)
Von der aufgetragenen Testosteronmenge (400 µg/cm² Haut) permeierten binnen sechs
Stunden 2,3 – 3,0 µg/cm² durch die Rückenhaut und 2,6 – 3,7 µg/cm² durch die Bauchhaut.
Das ist jeweils weniger als 1 % der aufgetragenen Menge. Die Berechnung der permeierten
Testosteronmenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6.
Im statistischen Vergleich (U-Test) der Testosteronpermeation ist zwischen Rücken- und
Bauchhaut der Ratte kein signifikanter Unterschied ersichtlich (p > 0,05). Die Ergebnisse der
statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle 7 aufgeführt.
Abb. 47:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Rückenhautproben derRatte.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 1.
Abb. 48:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Bauchhautproben derRatte.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 1.
0
1
2
3
4
5
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
0
1
2
3
4
5
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
58
4.3.2 Hundehaut (Abb. 49-51)
Von der aufgetragenen Testosteronmenge (400 µg/cm² Haut) permeierten binnen sechs
Stunden 0,6 – 1,8 µg/cm² durch die Rückenhaut, 0,8 – 1,9 µg/cm² durch die Bauchhaut und
1,4 – 2,3 µg/cm² durch die Haut der Brustwand. Das ist jeweils weniger als 1 % der
aufgetragenen Menge. Die Berechnung der permeierten Testosteronmenge erfolgte gemäß
Angaben unter 3.6.
Abb. 49:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Rückenhautproben desHundes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 2.
Abb. 50:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Bauchhautproben desHundes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 2.
Abb. 51:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Brustwandhautprobendes Hundes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 2.
0
1
2
3
4
5
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
0
1
2
3
4
5
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
0
1
2
3
4
5
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
59
Im statistischen Vergleich (U-Test) der Testosteronpermeation durch die Rücken-, Bauch-
und Brustwandhaut des Hundes sind keine signifikanten Unterschiede ersichtlich (p > 0,05).
Die Ergebnisse der statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle 7 aufgeführt.
4.3.3 Pferdehaut (Abb. 52-53)
Von der aufgetragenen Testosteronmenge (400 µg/cm² Haut) permeierten binnen sechs
Stunden 2,3 – 4,4 µg/cm² durch die Bauchhaut und 4,8 – 8,9 µg/cm² durch die Haut der
Brustwand. Das sind am Bauch etwas mehr als 1 % und an der Brustwand etwas mehr als 2 %
der aufgetragenen Menge. Bei der Rückenhaut (keine Abbildung) lag die in der
Rezeptorflüssigkeit gemessene Hydrocortisonkonzentration unterhalb der Nachweisgrenze.
Die Berechnung der permeierten Testosteronmenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6.
Im statistischen Vergleich (U-Test) der Testosteronpermeation ist zwischen Bauch- und
Brustwandhaut des Pferdes kein signifikanter Unterschied ersichtlich (p > 0,05). Tendenziell
Abb. 52:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Bauchhautproben desPferdes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 3.
Abb. 53:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Brustwandhautprobendes Pferdes (Cave: Skalierung bis 10µg/cm²).Einzelwerte siehe Anhangstabelle 3.
0
1
2
3
4
5
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
0
2
4
6
8
10
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
60
scheint die Bauchhaut jedoch für Testosteron weniger permeabel als die Brustwandhaut zu
sein. Die Ergebnisse der statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle 7 aufgeführt.
4.3.4 Schweinehaut (Abb. 54-55)
Von der aufgetragenen Testosteronmenge (400 µg/cm² Haut) permeierten binnen sechs
Stunden 1,2 – 4,3 µg/cm² durch die Bauchhaut und 0,2 – 1,2 µg/cm² durch die Haut der
Brustwand. Das sind am Bauch etwas mehr als 1 % und an der Brustwand weniger als 1 %
der aufgetragenen Menge. Bei der Rückenhaut (keine Abbildung) lag die in der
Rezeptorflüssigkeit gemessene Hydrocortisonkonzentration unterhalb der Nachweisgrenze.
Die Berechnung der permeierten Testosteronmenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6.
Im statistischen Vergleich (U-Test) der Testosteronpermeation durch die Bauch- und
Brustwandhaut des Schweines besteht ein schwach signifikanter Unterschied (p < 0,05). Hier
Abb. 54:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Bauchhautproben desSchweines.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 4.
Abb. 55:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Brustwandhautprobendes Schweines.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 4.
0
1
2
3
4
5
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
0
1
2
3
4
5
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µg/
cm²)
61
ist die Bauchhaut für Testosteron permeabler als die Brustwandhaut des Schweines. Die
Ergebnisse der statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle 7 aufgeführt.
4.3.5 Rinderhaut (Abb. 56-58)
Von der aufgetragenen Testosteronmenge (400 µg/cm² Haut) permeierten binnen sechs
Stunden 0,3 – 2,1 µg/cm² durch die Bauchhaut, 0,1 – 1,4 µg/cm² durch die Haut der
Brustwand und 0,9 – 10,4 µg/cm² durch die Euterhaut. Das sind am Bauch und an der
Brustwand weniger als 1 % und am Euter mehr als 2 % der aufgetragenen Menge. Bei der
Rückenhaut (keine Abbildung) lag die in der Rezeptorflüssigkeit gemessene
Hydrocortisonkonzentration unterhalb der Nachweisgrenze. Die Berechnung der permeierten
Testosteronmenge erfolgte gemäß Angaben unter 3.6.
Im statistischen Vergleich (U-Test) der Testosteronpermeation ist zwischen Bauch- und
Brustwandhaut des Rindes kein signifikanter Unterschied ersichtlich (p > 0,05). Im Vergleich
der Testosteronpermeation durch die Euter-, Bauch- und Brustwandhaut sind keine
signifikanten Unterschiede ersichtlich (p > 0,05). Die Euterhaut scheint jedoch tendenziell für
Testosteron permeabler als die Bauch- und Brustwandhaut zu sein. Die Ergebnisse der
statistischen Berechnung sind im Anhang in Tabelle 7 aufgeführt.
62
Abb. 56:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Bauchhautproben desRindes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 5.
Abb. 57:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Brustwandhautprobendes Rindes.Einzelwerte siehe Anhangstabelle 5.
Abb. 58:Permeation von Testosteron (µg/cm²Haut) durch vier in Diffusionszellenuntersuchte Euterhautproben desRindes. An einem Euter (Nr. 4)permeierten insgesamt 10,4 µg/cm².Einzelwerte siehe Anhangstabelle 5.
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cm²)
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cm²)
63
5 Diskussion
In der vorliegenden Arbeit sollen tierartliche und regionale Unterschiede der transdermalen
Penetration und Permeation in einer vergleichenden Untersuchung unter identischen
Bedingungen dargestellt werden. Es ist zu untersuchen, ob eine allgemein gültige Reihenfolge
für verschiedene Hautlokalisationen, Tierarten und Untersuchungssubstanzen mit variablen
chemisch-physikalischen Eigenschaften aufgestellt werden kann.
Für einen Vergleich der Ergebnisse vorliegender Studien zur dermalen Penetration, Permation
und Resorption sind detaillierte Informationen über die Versuchsbedingungen notwendig, da
die Stoffpenetration in Abhängigkeit von dem Versuchsmodell, der Tierspezies und Haut-
lokalisation erheblich variiert. Die Angabe der penetrierten bzw. resorbierten Menge erfolgt
meist in % der applizierten Dosis. Hier muß berücksichtigt werden, daß nur der Anteil des
Wirkstoffes aus der Formulierung in die Haut penetrieren kann, der mit dieser in Berührung
steht. Daher ist ein direkter Vergleich der in der Literatur genannten Ergebnisse aufgrund der
unterschiedlichen Versuchsbedingungen kaum möglich.
Die „Franz“-Diffusionszelle ist als In-vitro-Modell etabliert und scheint zur Untersuchung der
Penetrationsraten verschiedener Stoffe durch das Stratum corneum hinreichend geeignet zu
sein (FRANZ 1975). Für Resorptionsstudien ist perfundierte Haut notwendig, da hier die
Versuchsbedingungen den tatsächlichen biologischen Verhältnissen am nächsten kommen.
5.1 Vergleich der Hautlokalisationen innerhalb der Tierarten
Die Permeabilitätsunterschiede zwischen den Hautlokalisationen Rücken, Bauch und seitliche
Brustwand werden im Folgenden einzeln für jede der Testsubstanzen Benzoesäure, Hydro-
kortison und Testosteron diskutiert.
5.1.1 Benzoesäurepermeation (s. 4.1)
Beim Vergleich der Benzoesäurepermeation durch die Bauchhaut und die Haut der seitlichen
Brustwand aller untersuchten Tierarten sind weder statistisch noch tendenziell generelle
Permeabilitätsunterschiede erkennbar. Beim Vergleich der Benzoesäurepermeation durch die
Ratten-, Hunde- und Schweinehaut lassen sich ebenfalls keine generellen
Permeabilitätsunterschiede zwischen den Hautlokalisationen Rücken, Bauch und seitliche
64
Brustwand darstellen. Beim Pferd ist die Rückenhaut für Benzoesäure weniger permeabel als
die Bauch- und Brustwandhaut. Beim Rind scheint die Rückenhaut für Benzoesäure
tendenziell weniger permeabel als die Bauch- und Brustwandhaut zu sein. Die Euterhaut des
Rindes ist für Benzoesäure permeabler als die Rückenhaut und scheint auch durchlässiger als
die Bauch- und Brustwandhaut zu sein.
Bereits FELDMANN und MAIBACH (1967) stellten in In-vivo-Untersuchungen am
Menschen fest, daß an der Haut in Abhängigkeit von der Körperregion
Permeabilitätsunterschiede bestehen (s. Tab. 2, S. 18). In den eigenen Untersuchungen kann
zwar bestätigt werden, daß auch bei Tieren Permeabilitätsunterschiede in Abhängigkeit von
der Körperregion bestehen, jedoch kann für Benzoesäure keine allgemein gültige Aussage
über eine Reihenfolge der Permeabilität der verschiedenen Hautlokalisationen der
untersuchten Tierarten gemacht werden.
5.1.2 Hydrocortisonpermeation (s. 4.2)
Im Vergleich der Hydrocortisonpermeation durch die Rattenhaut kann zwischen Rücken- und
Bauchhaut weder statistisch noch tendenziell ein Unterschied festgestellt werden. Die
Hydrocortisonpermeation durch die Rücken-, Bauch und Brustwandhaut des Hundes läßt
auch hier keine signifikanten Unterschiede erkennen, jedoch scheint die Bauchhaut
permeabler als die Rücken- und Brustwandhaut zu sein. Bei den Tierarten Pferd, Schwein und
Rind ist an der Rückenhaut keine Hydrocortisonpermeation nachweisbar. Zwischen Bauch-
und Brustwandhaut dieser Tierarten bestehen auch keine statistischen Unterschiede bezüglich
der Permeabilität für Hydrocortison. Beim Pferd allerdings scheint die Bauchhaut weniger
permeabel für Hydrocortison zu sein als die Haut der Brustwand. Beim Rind ist festzustellen,
daß die Euterhaut für Hydrocortison permeabler ist als die Haut der Brustwand.
Auch hier können für die eigenen Untersuchungen die von FELDMANN und MAIBACH
(1967) (s. Tab. 2, S. 18) festgestellten Permeabilitätsunterschiede der Haut in Abhängigkeit
von der Körperregion bestätigt werden, jedoch kann keine allgemein gültige Aussage über
eine Reihenfolge der Hydrocortisonpermeabilität der verschiedenen Hautlokalisationen der
untersuchten Tierarten gemacht werden. Es kann jedoch festgestellt werden, daß die
Rückenhaut der Großtiere Pferd, Schwein und Rind während einer Versuchsdauer von sechs
Stunden für Hydrocortison nicht permeabel ist.
65
5.1.3 Testosteronpermeation (s. 4.3)
Im Vergleich der Testosteronpermeation durch die Ratten- und Hundehaut kann zwischen
Rücken-, Bauch- und Brustwandhaut weder statistisch noch tendenziell ein Unterschied
festgestellt werden. Bei den Tierarten Pferd, Schwein und Rind ist an der Rückenhaut keine
Testosteronpermeation nachweisbar. Die Bauchhaut des Pferdes scheint weniger permeabel
für Testosteron zu sein als die Haut der Brustwand. Beim Schwein allerdings ist die
Bauchhaut für Testosteron permeabler als die Haut der Brustwand. Die Euterhaut des Rindes
erscheint für Testosteron permeabler als die Bauch- und Brustwandhaut.
Wie auch für Hydrocortison können hier für die eigenen Untersuchungen die von
FELDMANN und MAIBACH (1967) (s. Tab. 2, S. 18) festgestellten Permeabilitäts-
unterschiede der Haut in Abhängigkeit von der Körperregion bestätigt werden, jedoch kann
auch hier keine allgemein gültige Aussage über eine Reihenfolge der Testosteronpermeabilität
der verschiedenen Hautlokalisationen der untersuchten Tierarten gemacht werden. Es kann
jedoch festgestellt werden, daß die Rückenhaut der Großtiere Pferd, Schwein und Rind
während einer Versuchsdauer von sechs Stunden für Testosteron nicht permeabel ist.
Zusammenfassend wird jedoch festgestellt, daß in den vorliegenden Untersuchungen bei der
Ratte zwischen Rücken- und Bauchhaut Permeabilitätsunterschiede weder für Benzeosäure,
noch für Hydrocortison, noch für Testosteron bestehen. Dasselbe gilt für die Hundehaut
(Rücken, Bauch und Brustwand), wobei allerdings zu berücksichtigen ist, daß hier die
Bauchhaut für Hydrocortison permeabler zu sein scheint als die Haut der Brustwand. Die
Rückenhaut des Pferdes ist für alle drei Testsubstanzen am wenigsten permeabel. Es besteht
kein Unterschied zwischen der Bauch- und Brustwandhaut bezüglich der Benzoesäure-
permeabilität, allerdings fällt beim Pferd auf, daß die Haut der Brustwand sowohl für
Hydrocortison als auch für Testosteron permeabler zu sein scheint als die Bauchhaut. Bei den
Hautlokalisationen des Schweines bestehen bezüglich der Benzoesäurepermeation keine
Unterschiede. Für die Substanzen Hydrocortison und Testosteron ist, wie beim Pferd, die
Rückenhaut des Schweines am wenigsten permeabel. Im Gegensatz zu Hydrocortison, für das
zwischen Bauch- und Brustwandhaut kein Permeabilitätsunterschied besteht, permeiert
Testosteron besser durch die Bauchhaut als durch die Haut der Brustwand des Schweines. Die
Rückenhaut des Rindes ist, wie beim Pferd, für alle drei Testsubstanzen am wenigsten
66
permeabel. Zwischen Bauch- und Rückenhaut bestehen hinsichtlich der Permeabilität der
Substanzen keine Unterschiede. Es deutet sich an, daß die Euterhaut die durchlässigste Haut
aller untersuchten Körperregionen des Rindes sein könnte. Hier scheint die Permeabilität für
Benzoesäure, Hydrocortison und Testosteron im Vergleich zur Rücken-, Bauch- und
Brustwandhaut am größten (bei Vernachlässigung der Ausreißer) zu sein.
5.2 Vergleich der Tierarten anhand der Körperregionen
Die Permeabilitätsunterschiede zwischen den Rücken-, Bauch- und Brustwandhäuten der
verschiedenen Tierarten sollen im Folgenden einzeln für jede der Testsubstanzen
Benzoesäure, Hydrocortison und Testosteron diskutiert werden. Die Ergebnisse der
statistischen Berechnungen sind im Anhang in Tabelle 8 aufgeführt.
5.2.1 Benzoesäurepermeation
Die Rückenhaut der Ratte ist im Vergleich zu den Rückenhäuten der anderen Tierarten für
Benzoesäure am durchlässigsten. Hier bestehen jeweils schwach signifikante Unterschiede (p
< 0,05). Zwischen der Rückenhaut des Schweines und des Rindes besteht ebenfalls ein
schwach signifikanter Unterschied (p < 0,05), hier ist die Schweinehaut für Benzoesäure
permeabler als die Rinderhaut. Zwischen den Rückenhäuten von Hund, Pferd und Schwein
können im statistischen Vergleich keine Unterschiede festgestellt werden (p > 0,05).
Tendenziell scheint jedoch die Rückenhaut des Hundes für Benzoesäure permeabler zu sein
als die Pferde- und Schweinehaut, die sich nicht voneinander unterscheiden; diese wiederum
sind für Benzoesäure permeabler als die Rückenhaut des Rindes (s. Abb. 20, 22, 25, 28, 31).
Um den Vergleich zwischen den Tierarten anhand der Körperregionen anschaulicher zu
machen, werden die Abbildungen 20, 22, 25, 28 und 31, die bereits im Ergebnisteil dargestellt
wurden, exemplarisch für die Benzoesäurepermeabilität auf der folgenden Seite noch einmal
wiederholt.
67
Abb. 20: Benzoesäurepermeation durch Abb. 22: Benzoesäurepermeation durchdie Rückenhaut der Ratte die Rückenhaut des Hundes
Abb. 25: Benzoesäurepermeation durch Abb. 28: Benzoesäurepermeation durchdie Rückenhaut des Pferdes die Rückenhaut des Schweines
Abb. 31: Benzoesäurepermeation durchdie Rückenhaut des Rindes
Die Benzoesäurepermeation durch die Bauchhaut der verschiedenen Tierarten läßt, statistisch
gesehen, einen schwach signifikanten Unterschied (p < 0,05) nur zwischen der Pferde- und
Hundehaut erkennen. Hier ist die Bauchhaut des Pferdes für Benzoesäure permeabler als die
des Hundes. Im statistischen Vergleich der übrigen Bauchhäute sind zwischen den Tierarten
keine Unterschiede nachweisbar (p > 0,05). Tendenziell scheint jedoch die Bauchhaut des
Pferdes für Benzoesäure permeabler zu sein als die der Ratte, welche wieder permeabler
erscheint als die Hunde- und Schweinehäute, die sich nicht voneinander unterscheiden; diese
wiederum scheinen für Benzoesäure permeabler zu sein als die Rückenhaut des Rindes (bei
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²)
68
Vernachlässigung des Ausreißers) (s. Abb. 21, 23, 26, 29, 32). Die Haut der Brustwand ist bei
Pferd und Hund für Benzoesäure durchlässiger als beim Schwein. Hier bestehen im
statistischen Vergleich schwach signifikante Unterschiede (p < 0,05). Im statistischen
Vergleich der übrigen Brustwandhäute sind zwischen den Tierarten keine Unterschiede
nachweisbar (p > 0,05). Tendenziell scheint jedoch die Haut der Brustwand des Hundes für
Benzoesäure permeabler zu sein als die Schweine- und Rinderhäute (bei Vernachlässigung
des Ausreißers) (s. Abb. 24, 27, 30, 33).
Weiter wurde die Euterhaut des Rindes mit den verschiedenen Körperregionen bezüglich der
Benzoesäurepermeabilität verglichen. Der Euterhaut am ähnlichsten erschienen unter den
Rücken- und Bauchhäuten die Rattenhaut und unter den Häuten der Brustwand die Hundehaut
(s. Abb. 20, 21, 34).
Die in diesem Abschnitt beschriebenen Ergebnisse der Benzoesäurepermeation durch die
verschiedenen Häute werden mit bekannten Untersuchungen zur In-vitro-Hautpermeabilität
bei verschiedenen Spezies (TREGEAR 1966; MARZULLI et al. 1969; McCREESH 1965)
verglichen (s. Tab. 3, S. 27). Diese Untersuchungen geben allerdings keinen Aufschluß
darüber, welche Hautlokalisationen in vitro untersucht wurden. So fällt hier auf, daß die
Reihenfolge der untersuchten Tierarten bezüglich ihrer Hautpermeabilität nicht einheitlich ist.
Für die Tierarten, die auch in der vorliegenden Arbeit untersucht wurden, ergab sich nach
McCREESH (1965) folgende In-vitro-Permeabilität in absteigender Reihenfolge: Ratte >
Hund > Schwein. MARZULLI et al. (1969) untersuchten Pferdehaut und stellten fest, daß
diese durchlässiger sei als die Hunde- und Schweinehaut. Rattenhaut wurde hier nicht
untersucht, allerdings ist die Hautpermeabilität dieser Spezies nach BARTEK et al. (1972) mit
den in dieser Studie untersuchten Labornagern Meerschweinchen und Kaninchen
vergleichbar, deren Hautpermeabilität größer ist als die des Pferdes. Für die
Benzoesäurepermeation durch die Brustwandhaut kann diese Reihenfolge (Pferd > Hund >
Schwein) bestätigt werden. Bei der Rückenhaut konnte jedoch festgestellt werden, daß die
Hundehaut tendenziell permeabler erscheint als die Pferdehaut; an der Bauchhaut zeigt sich,
daß die Pferdehaut permeabler ist als die Rattenhaut (bzw. Labornager), womit die Reihung
nach MARZULLI et al. (1969) hier nicht bestätigt werden kann.
69
5.2.2 Hydrocortisonpermeation
Die Permeabilität der Rückenhaut für Hydrocortison ist bei der Ratte am größten. Es besteht
ein schwach signifikanter Unterschied zur Rückenhaut des Hundes (p < 0,05) (Abb. 35, 37).
Bei Pferd, Schwein und Rind liegt die Hydrocortisonkonzentration in der Rezeptorflüssigkeit
unterhalb der Nachweisgrenze. Der Grund hierfür ist die sog. „lag“-Phase, die die Zeitspanne
der „Auffüllung“ des Stratum corneum mit einer Substanz bis zur Freisetzung derselben aus
der Hornschicht beschreibt. Für die meisten der hier untersuchten Hautlokalisationen dauert
diese „lag“-Phase 1 – 2 Stunden, erst danach können Hydrocortisonkonzentrationen in der
Rezeptorflüssigkeit nachgewiesen werden. GUY und HADGRAFT (1984) (s. 2.2.2 und 2.4)
zeigen, daß die Halbwertzeit, mit der Hydrocortison aus der galenischen Formulierung in die
Hornschicht freigesetzt wird, mehr als 30 Stunden beträgt. Für die Rückenhaut von Pferd,
Rind und Schwein reicht die Versuchszeit von sechs Stunden daher nicht aus, um
Hydrocortison in der Rezeptorflüssigkeit nachzuweisen, da hier die „lag“-Phase länger als
sechs Stunden anhält.
Im statistischen Vergleich der Hydrocortisonpermeation durch die Bauchhaut ist ein schwach
signifikanter Unterschied (p < 0,005) nur zwischen Ratten- und Schweinhaut erkennbar. Hier
ist die Rattenhaut permeabler als die Schweinehaut. Zwischen den übrigen Bauchhäuten sind
keine signifikanten Unterschiede nachweisbar (p > 0,05). Tendenziell scheint jedoch die
Bauchhaut des Pferdes für Hydrocortison sehr viel permeabler zu sein als die Rattenhaut, die
wieder durchlässiger erscheint als die Bauchhäute von Hund, Schwein und Rind, die sich
wiederum nicht voneinander unterscheiden (Abb. 36, 38, 40, 42, 44).
Extrem auffällig ist die Hydrocortisondurchlässigkeit der Haut der Brustwand des Pferdes.
Hier permeieren bis zu 25 % der aufgetragenen Menge, wogegen bei Hund und Rind weniger
als 0,1 % und beim Schwein weniger als 1 % permeieren. Hier bestehen jeweils schwach
signifikante Unterschiede (p < 0,05). Zwischen den Brustwandhäuten von Hund, Schwein und
Rind bestehen keine signifikanten Unterschiede (p > 0,05). Dieses soll anhand der
Abbildungen 39, 41, 43 und 45, die bereits im Ergebnisteil dargestellt wurden und an dieser
Stelle exemplarisch für die Hydrocortisonpermeation noch einmal wiederholt werden,
veranschaulicht werden.
70
Abb. 39: Hydrocortisonpermeation durch Abb. 41: Hydrocortisonpermeation durch die Haut der Brustwand des Hundes die Haut der Brustwand des Pferdes
Abb. 43: Hydrocortisonpermeation durch Abb. 45: Hydrocortisonpermeation durch die die Haut der Brustwand des Schweines Haut der Brustwand des Rindes
Bezüglich der Permeabilität für Hydrocortison erschienen der Euterhaut des Rindes unter den
untersuchten Körperregionen die Rücken- und Bauchhaut der Ratte am ähnlichsten (s. Abb.
35, 36, 46).
Der Vergleich der in diesem Abschnitt beschriebenen Ergebnisse mit den Untersuchungen zur
In-vitro-Hautpermeabilität nach MARZULLI et al. (1969) und McCREESH (1965) (s. Tab. 3,
S. 27) zeigt bezüglich der Permeabilität der Rücken- und Bauchhaut keine Übereinstimmung
mit der dargestellten Reihenfolge (Labornager > Pferd > Hund > Schwein). Die Rückenhaut
des Hundes ist für Hydrocortison permeabler als die Pferdehaut und an der Bauchhaut besitzt
die Pferdehaut die größere Durchlässigkeit für Hydrocortison als die Rattenhaut (bzw.
Labornager). Allein die Reihung der Häute der Brustwand bestätigt die Reihenfolge der In-
vitro-Untersuchungen nach MARZULLI et al. (1969).
5.2.3 Testosteronpermeation
Auch für Testosteron ist die Permeabilität der Rückenhaut bei der Ratte am größten. Es
besteht ein schwach signifikanter Unterschied zur Rückenhaut des Hundes (p < 0,05) (Abb.
47, 49). Bei Pferd, Schwein und Rind liegt die Testosteronkonzentration in der
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71
Rezeptorflüssigkeit, wie auch bei Hydrocortison, unterhalb der Nachweisgrenze. GUY und
HADGRAFT (1984) (s. 2.2.2 und 2.4) zeigen, daß die Halbwertzeit, mit der Testosteron aus
der galenischen Formulierung in die Hornschicht freigesetzt wird, 12 Stunden beträgt. Für die
Rückenhaut von Pferd, Rind und Schwein reicht die Versuchszeit von sechs Stunden daher
auch hier nicht aus, um Testosteron in der Rezeptorflüssigkeit nachzuweisen, da hier die
„lag“-Phase (s.o.) länger als sechs Stunden anhält.
Die Testosteronpermeation durch die Bauchhäute läßt einen schwach signifikanten
Unterschied (p < 0,05) nur zwischen der Ratten- und Hundehaut erkennen. Hier ist die
Rattenhaut permeabler als die Hundehaut. Zwischen den übrigen Bauchhäuten sind keine
signifikanten Unterschiede (p > 0,05) nachweisbar. Tendenziell scheinen jedoch die
Bauchhäute von Pferd und Schwein, wie auch die Rattenhaut, für Testosteron durchlässiger
zu sein als die Hunde- und Rinderhaut (Abb. 48, 50, 52, 54, 56).
Die Haut der Brustwand ist beim Pferd für Testosteron durchlässiger als beim Schwein und
Rind. Hier bestehen jeweils schwach signifikante Unterschiede (p < 0,05). Zwischen Pferd
und Hund besteht kein signifikanter Unterschied (p > 0,05), tendenziell ist die Haut der
Brustwand des Pferdes jedoch wesentlich permeabler als die Brustwandhaut des Hundes,
welche sich nicht von der Rinderhaut unterscheidet, jedoch etwas permeabler als die
Schweinehaut zu sein scheint. Anhand der Abbildungen 51, 53, 55 und 57, die bereits im
Ergebnisteil dargestellt wurden, soll auf der folgenden Seite die Testosteronpermeation
exemplarisch veranschaulicht werden.
Der Vergleich der Euterhaut des Rindes mit den o.a. Körperregionen bezüglich der
Permeabilität für Testosteron gestaltet sich aufgrund der starken Streuung der Ergebnisse der
Testosteronpermeation durch die Euterhaut eher schwierig. Es deutet sich jedoch an, daß der
Euterhaut die Bauchhaut von Ratte, Pferd und Rind und die Rückenhaut der Ratte am
ähnlichsten ist (s. Abb. 47, 48, 52, 56).
Die erzielten Ergebnisse der Testosteronpermeation durch die Rücken- und Bauchhaut
stimmen mit der dargestellten Reihenfolge (Labornager > Pferd > Hund > Schwein) der
Untersuchungen zur In-vitro-Hautpermeabilität nach MARZULLI et al. (1969) und
McCREESH (1965) (s. Tab. 3, S. 27) nicht überein. Die in der vorliegenden Arbeit erzielten
Ergebnisse zeigen z. B., daß die Rückenhaut des Hundes für Testosteron permeabler ist als
die Pferdehaut und die Bauchhaut von Ratte, Pferd und Schwein für Testosteron durchlässiger
72
erscheint als die Hundehaut. Wie auch für Benzoesäure und Hydrocortison bestätigt allein die
Reihung der Häute der Brustwand bezüglich der Permeabilität für Testosteron die
Reihenfolge der In-vitro-Untersuchungen nach MARZULLI et al. (1969).
Abb. 51: Testosteronpermeation durch die Abb. 53: Testosteronpermeation durch die Haut der Brustwand des Hundes Haut der Brustwand des Pferdes
Abb. 55: Testosteronpermeation durch die Abb. 57: Testosteronpermeation durch dieHaut der Brustwand des Schweines Haut der Brustwand des Rindes
Insgesamt wird hier deutlich, wie sehr sich die Hauteigenschaften in Abhängigkeit von der
Körperregion unterscheiden. Um einen Vergleich zwischen verschiedenen Spezies
anzustellen, ist es demnach von besonderer Wichtigkeit, für Permeabilitätsuntersuchungen
immer die gleiche Hautlokalisation zu wählen. Die Frage der „Übertragbarkeit“ erzielter
Ergebnisse auf den Menschen kann somit ebenfalls beantwortet werden. Bereits
FELDMANN und MAIBACH (1967) zeigten in In-vivo-Untersuchungen am Menschen
Permeabilitätsunterschiede der Haut in Abhängigkeit von der Körperregion (s. Tab. 2, S. 18).
Demnach ist es notwendig, sowohl am Menschen als auch am Tier eine bestimmte
Körperregion zu definieren, die für zukünftige Permeabilitätsstudien als „Standardregion“
verwendet werden kann. Die Frage der „Übertragbarkeit auf den Menschen“ muß somit auf
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1
2
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0 2 4 6Zeit (h)
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²)
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0 2 4 6Zeit (h)
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²)
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1
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0 2 4 6Zeit (h)
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te M
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(µ
g/cm
²)
0
1
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3
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µ
g/cm
²)
73
die „Übertragbarkeit auf eine Körperregion des Menschen“ (s. FELDMANN und MAIBACH
(1967)) erweitert werden, um die Vergleichbarkeit zu gewährleisten.
5.3 Vergleich der Testsubstanzen Benzoesäure, Testosteron und
Hydrocortison
Die Substanzen Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison wurden in der vorliegenden
Arbeit aufgrund ihrer unterschiedlichen pharmakokinetischen Eigenschaften verwendet. Da
sie sich so deutlich voneinander unterscheiden, werden diese Stoffe in vielen Studien der
transdermalen Penetration, Permeation und Resorption als „Modellsubstanzen“ eingesetzt. So
dienten sie auch GUY und HADGRAFT (1984) zur Beschreibung des pharmakokinetischen
Verhaltens von Stoffen mittels eines pharmakokinetischen Modells (s. 2.2.2 und 2.4).
Es soll untersucht werden, ob die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse die Ergebnisse von
GUY und HADGRAFT (1984) bestätigen. Dabei muß allerdings berücksichtigt werden, daß
bei den in der eigenen Arbeit erzielten Ergebnissen die Werte der Freisetzung aus der
galenischen Formulierung (k1), der Rückverteilung (k3) und der Ausscheidung aus dem Blut
(k4) nicht errechnet werden konnten.
Substanz k1 t50 k2 t50 k3 t50 k4 t50
Benzoesäure 0,184 3,8 2,88 0,2 0,014 49,5 0,592 1,2
Testosteron 0,058 12,0 1,44 0,5 2,70 0,3 0,104 6,7
Hydrocortison 0,022 31,5 1,44 0,5 0,180 3,9 0,158 4,4
1Tab. 6: Geschwindigkeitskonstanten k1-k4 (1/h) (gemäß Abb. 9, S. 13) und Halbwertzeiten t50
(h) (t50 = ln2 / k) für Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison (nach GUY und
HADGRAFT 1984)
1 Tab. 6 = Tab. 4 (S. 33), um Lesbarkeit der Arbeit zu erleichtern
k2 k1 k3
k4
galenischeFormulierung
Stratumcorneum
Blut bzw.Rezeptor-flüssigkeit
74
Weiter wird das Permeationsverhalten der Testsubstanzen Benzoesäure, Testosteron und
Hydrocortison durch die Hautlokalisationen der verschiedenen Spezies miteinander
verglichen. Die Ergebnisse der statistischen Berechnungen sind im Anhang in Tabelle 9
aufgeführt.
Beim Vergleich der drei Testsubstanzen fällt auf, daß die Permeabilität aller untersuchten
Hautlokalisationen für Benzoesäure am größten ist. Hier bestehen für die meisten
Hautlokalisationen schwach signifikante Unterschiede (p < 0,05) sowohl zwischen der
Benzoesäure- und Hydrocortisonpermeation als auch zwischen der Benzoesäure- und
Testosteronpermeation. In wenigen Fällen ergeben sich laut statistischer Berechnung keine
signifikanten Unterschiede (p > 0,05), tendenziell ist jedoch auch in diesen Fällen die
Benzoesäurepermeation wesentlich höher als die Permeation der Steroide.
Die Tatsache, daß die Diffusionsrate von der Haut in die Rezeptorflüssigkeit für Benzoesäure
am größten ist, bestätigt die Geschwindigkeitskonstante (k2 = 2,88) und die daraus errechnete
Halbwertzeit (t50 = 0,2 Stunden) nach GUY und HADGRAFT (1984). Hier erfolgt der
Übertritt von Benzoesäure aus der Haut in das Blut bzw. die Rezeptorflüssigkeit fast doppelt
so schnell wie der Übertritt der Steroide (t50 = 0,5 Stunden). Nach GUY und HADGRAFT
(1984) erfolgt eine Rückdiffusion der Benzoesäure nur in geringem Maße (k3 = 0,014, t50 =
49,5 Stunden). In der vorliegenden Arbeit wurde dieser Diffusionsweg zwar nicht untersucht,
jedoch zeigt sich in den Ergebnissen, daß der prozentuelle Anteil der diffundierten
Benzoesäuremenge im Vergleich zu Hydrocortison und Testosteron sehr hoch ist.
Abgesehen vom Pferd (s.u.) ist im statistischen Vergleich der Permeationsraten zwischen
Testosteron und Hydrocortison, außer am Hunderücken, kein signifikanter Unterschied
erkennbar. Die Permeabilität der Haut scheint jedoch, abgesehen von der Rattenhaut, der
Brustwandhaut des Schweines und der Euterhaut des Rindes, für Testosteron tendenziell
höher zu sein als für Hydrocortison. Bezüglich der Permeationsraten für Hydrocortison und
Testosteron stellt das Pferd eine Ausnahme dar. Hier ist die Permeabilität der Haut der
Brustwand für Hydrocortison viel höher als für Testosteron; es besteht ein schwach
signifikanter Unterschied (p < 0,05). Tendenziell verhält es sich an der Bauchhaut des Pferdes
genauso, allerdings ist hier kein signifikanter Unterschied (p > 0,05) ersichtlich. Zur
Veranschaulichung der Permeationsverhältnisse von Hydrocortison und Testosteron an der
75
Pferdehaut werden die Abbildungen 40, 41, 52 und 53, die bereits im Ergebnisteil dargestellt
wurden, an dieser Stelle noch einmal wiederholt.
Abb. 40: Hydrocortisonpermeation durch die Abb. 52: Testosteronpermeation durch die Bauchhaut des Pferdes Bauchhaut des Pferdes
Abb. 41: Hydrocortisonpermeation durch die Abb. 53: Testosteronpermeation durch die Haut der Brustwand des Pferdes Haut der Brustwand des Pferdes
Nach GUY und HADGRAFT (1984) gibt es bezüglich der Übertrittsgeschwindigkeit von der
Haut in das Blut bzw. die Rezeptorflüssigkeit für Hydrocortison und Testosteron keinen
Unterschied (k3 = 1,44; t50 = 0,5 Stunden). Läßt man die Parameter k1 und k3 außer Acht, so
bestätigt dieses Schema die Verhältnisse an der Rattenhaut, an der Brustwandhaut des
Schweines und an der Euterhaut des Rindes. So wurde hier zwischen Hydrocortison und
Testosteron weder statistisch noch tendenziell ein Unterschied festgestellt. An der Hunde- und
Rinderhaut, sowie an der Bauchhaut des Schweines ist die Permeabilität für Testosteron
jedoch tendenziell höher als für Hydrocortison. So wird nach GUY und HADGRAFT (1984)
Hydrocortison aus der galenischen Formulierung viel langsamer (t50 = 31,5 Stunden)
freigesetzt als Testosteron (t50 = 12 Stunden). Dieses führt bei den genannten
Hautlokalisationen während der kurzen Versuchsdauer von sechs Stunden insgesamt zu einer
höheren Testosteronkonzentration in der Rezeptorflüssigkeit.
0
5
10
15
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µ
g/cm
²)
0
1
2
3
4
5
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µ
g/cm
²)
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µ
g/cm
²)
0
2
4
6
8
10
0 2 4 6Zeit (h)
perm
eier
te M
enge
(µ
g/cm
²)
76
5.4 Schlußfolgerung
Die Ergebnisse der vorliegenen Arbeit machen insgesamt deutlich, daß die transdermale
Permeation nicht einem starren Schema unterliegt. Für einen Vergleich der Hauteigenschaften
verschiedener Tierarten ist es notwendig, die gleichen Hautlokalisationen zu untersuchen, da
sich teilweise gravierende Permeabilitätsunterschiede ergeben. Weiter sind die
Permeabilitätseigenschaften der Haut bezüglich der Testsubstanzen von großer Bedeutung. So
stellte sich heraus, daß die Pferdehaut im Vergleich zu anderen Spezies wohl eine Ausnahme
bezüglich der Permeation von Steroiden darstellt (s. 5.3). Aufgrund der in dieser Arbeit
erzielten Ergebnisse ist es unter pharmakologischen und toxikologischen Aspekten
notwendig, Untersuchungen zur transdermalen Penetration, Permeation und Resorption an
Hautstellen durchzuführen, an denen die Permeation von Stoffen auch während einer kurzen
Versuchsdauer erfolgt. So wurde in den vorliegenden Untersuchungen z.B. festgestellt, daß
weder Hydrocortison noch Testosteron während einer Versuchsdauer von sechs Stunden
durch die Rückenhäute der Tierarten Pferd, Schwein und Rind in nachweisbarer Menge
permeierte. Diese Hautlokalisation eignet sich demnach weniger für eine Prüfung von
Wirkstoffen.
Die sich bei Betrachtung der Untersuchungsergebnisse immer wieder zeigenden Streuungen
können verschiedene Ursachen haben. Neben genetischer Varianzbreite der ausgewählten
Tiere kommen Alters- und Rasseunterschiede hinzu. Da von den ausgewählten Tierarten nur
eine geringe Anzahl für Versuchszwecke euthanasiert bzw. geschlachtet wird, steht keine
„Standardhaut“ zur Verfügung. Die geringere Streuung der Ergebnisse, die an der Rattenhaut
ermittelt wurden, beruht wahrscheinlich auf den homogenen biologischen Gegebenheiten,
denen die Versuchstiere entstammen (gleiche Rasse, gleiches Alter und Geschlecht).
Wegen des großen Umfangs an Untersuchungsobjekten wurden pro Tierart und
Hautlokalisation jeweils nur vier Proben untersucht (n=4). Bei speziellen Untersuchungen
hinsichtlich der transdermalen Penetration sollte eine höhere Anzahl an Versuchsobjekten
(n>4) gewählt werden.
In der vorliegenden Arbeit konnten tierartliche und regionale Unterschiede der transdermalen
Penetration und Permeation dargestellt werden, die bei pharmakologischen und
toxikologischen Untersuchungen zu berücksichtigen sind.
77
6 Zusammenfassung
Silke Riedel
Vergleichende Untersuchungen zur dermalen Penetration und Permeation in
Diffusionszellen
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, tierartliche und regionale Unterschiede der transdermalen
Penetration und Permeation in einer vergleichenden In-vitro-Untersuchung unter identischen
Bedingungen darzustellen. Es wurde untersucht, ob eine allgemein gültige Reihenfolge für
verschiedene Hautlokalisationen, Tierarten und Untersuchungssubstanzen mit variablen
chemisch-physikalischen Eigenschaften aufgestellt werden kann.
Als In-vitro-Modell mit nicht perfundierter Haut wurden statische Diffusionszellen nach
FRANZ (1975) eingesetzt. Diese Versuchsanordnung erlaubt Aussagen zur dermalen
Penetration und Permeation, nicht jedoch zur Resorption topisch applizierter Substanzen. In
den Versuchen wurde Haut aus den Regionen der seitlichen Brustwand, des Rückens und des
Bauches der Tierarten Ratte, Hund, Pferd, Schwein und Rind untersucht. Rattenhaut stammte
nur aus der Rücken- und Bauchregion. Zusätzlich wurde Euterhaut von der seitlichen
Euterwand gewonnen. Als Testsubstanzen dienten Benzoesäure, Testosteron und
Hydrocortison, die in Ethanol gelöst auf die Hautstücke appliziert wurden. Der Nachweis der
während einer Versuchsdauer von sechs Stunden in die Rezeptorflüssigkeit der Diffusions-
zellen diffundierten Testsubstanzen erfolgte mittels Enzymimmunoassay (Hydrocortison und
Testosteron) und Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (Benzoesäure).
Beim Vergleich der Hautlokalisationen innerhalb der Tierarten konnten regionale
Permeabilitätsunterschiede teilweise nur tendenziell dargestellt werden. Für Pferd, Schwein
und Rind wurde festgestellt, daß bei der Rückenhaut während einer Versuchsdauer von sechs
Stunden sowohl die Hydrocortison- als auch die Testosteronkonzentrationen in der
Rezeptorflüssigkeit unterhalb der Nachweisgrenze lagen.
78
Beim Vergleich der Tierarten anhand der Körperregionen konnte für Benzoesäure,
Hydrocortison und Testosteron eine für die Hautpermeabilität absteigende Reihenfolge Ratte
> Pferd > Hund > Schwein für die Haut der Brustwand aufgestellt werden. Für die Rücken-
bzw. Bauchhaut galt diese Reihenfolge nicht.
Der Vergleich der Permeationsraten von Benzoesäure, Hydrocortison und Testosteron zeigte,
daß die Permeabilität der verschiedenen Häute für Benzoesäure am größten war.
Insgesamt bleibt festzustellen, daß speziesbedingte und regionale Unterschiede der
transdermalen Penetration und Permeation vorliegen, welche bei pharmakologischen und
toxikologischen Untersuchungen zu berücksichtigen sind und eine sorgfältige Standardi-
sierung durchzuführender Versuche erforderlich machen. Basierend auf In-vitro-Studien
erscheinen allgemein gültige prädiktive Aussagen für den Menschen oder andere Spezies zur
transdermalen Penetration und Permeation schwierig.
79
7 Summary
Silke Riedel
Comparative examinations of dermal penetration and permeation with diffusion cells
Object of the present studies was to show differences in transdermal penetration and
permeation. A comparative in vitro examination dependent on species and anatomical sites
was done under identical conditions. It was examined whether it was possible to arrange a
general ranking for different anatomical sites of skin, species and substances with various
chemical and physical characteristics.
Static `Franz´ diffusion cells were used as in vitro model with non perfused skin. These
experiments with diffusion cells allow statements about dermal penetration and permeation,
but not about absorption of topically applied substances. Skin samples of the costal, lumbar
and umbilical region of rats, dogs, horses, pigs and cattle were used in the experiments. Rat
skin was only taken from the lumbar and umbilical region. Additionally, udder skin was taken
from the lateral udder region. Benzoic acid, testosterone and hydrocortisone dissolved in
ethanol were used as test substances and were applied to the skin (400 µg/cm² skin). The
drugs diffused over six hours into the receptor fluid of the diffusion cells. Benzoic acid was
detected via high performance liquid chromatography, while hydrocortisone and testosterone
were measured with enzyme linked immuno assays.
The anatomical sites of the skin of each tested species were compared. Differences in
permeability, dependent on the anatomical site, were shown in tendencies. Using skin samples
of the back from horse, pig and cattle, hydrocortisone and testosterone were not detectable in
the receptor fluid after six hours.
The different species were compared according to their anatomical sites. A decrease in the
rank of the skin permeability could be shown for rat > horse > dog > pig on the costal skin for
each of the tested substances benzoic acid, hydrocortisone and testosterone. This ranking did
not apply to the skin of the lumbar and umbilical region.
80
The comparison of permeation rates of benzoic acid, hydrocortisone and testosterone showed
the skin as most permeable to benzoic acid.
In conclusion, species dependent and regional differences do exist in transdermal penetration
and permeation which must be considered in pharmacological and toxicological studies and
require test standardization. Based on in vitro studies, predictive statements for mankind or
other species concerning transdermal penetration and permeation appear to be difficult.
81
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9 Anhangstabellen
Anhangstabelle 1: Menge der permeierten Versuchssubstanzen Benzoesäure, Hydrocortison undTestosteron (µg/cm² Haut) bei in Diffusionszellen untersuchter Rücken- undBauchhaut der Ratte (NWG = Nachweisgrenze: Benzoesäure = 1 µg;Hydrocortison = 0,05 µg; Testosteron = 0,0125 µg).
Zeit(h)
Ratte Ben-zoe-säure
Hydro-korti-son
Tes-tos-teron
Ratte Ben-zoe-säure
Hydro-korti-son
Tes-tos-teron
0 Rücken 1 < NWG < NWG < NWG Bauch 1 < NWG < NWG < NWG1 2.39 < NWG < NWG 2.12 0.28 0.172 34.88 0.07 0.16 18.33 1.50 1.334 271.89 1.01 2.27 181.41 2.77 2.806 286.96 1.68 2.83 194.19 3.41 3.030 Rücken 2 < NWG < NWG < NWG Bauch 2 < NWG < NWG < NWG1 1.03 < NWG < NWG 8.36 < NWG 0.242 13.50 0.07 0.09 76.95 0.46 1.644 180.63 1.31 1.48 271.21 1.50 3.226 291.02 2.94 2.39 291.24 1.92 3.410 Rücken 3 < NWG < NWG < NWG Bauch 3 < NWG < NWG < NWG1 2.27 < NWG < NWG 5.64 0.10 0.202 13.91 0.15 0.04 26.85 0.63 1.014 207.38 1.13 1.14 265.85 2.80 2.386 256.32 3.87 2.29 271.75 3.00 2.630 Rücken 4 < NWG < NWG < NWG Bauch 4 < NWG < NWG < NWG1 1.55 < NWG 0.07 21.88 0.13 0.772 21.15 0.90 0.93 85.23 1.15 3.004 220.49 1.68 2.67 250.66 2.27 3.516 287.65 3.60 3.03 276.15 2.50 3.68
Anhangstabelle 2: Menge der permeierten Versuchssubstanzen Benzoesäure, Hydrocortison undTestosteron (µg/cm² Haut) bei in Diffusionszellen untersuchter Rücken-,Bauch- und Brustwandhaut des Hundes (NWG = Nachweisgrenze:Benzoesäure = 1 µg; Hydrocortison = 0,05 µg; Testosteron = 0,0125 µg).
Zeit(h)
Hund Ben-zoe-säure
Hydro-korti-son
Tes-tos-teron
Hund Ben-zoe-säure
Hydro-korti-son
Tes-tos-teron
Hund Ben-zoe-säure
Hydro-korti-son
Tes-tos-teron
0 Rücken 1 < NWG < NWG < NWG Bauch 1 < NWG < NWG < NWG Brust 1 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG2 0.26 < NWG 0.05 < NWG < NWG 0.02 < NWG < NWG 0.044 39.09 < NWG 0.66 99.90 < NWG 0.26 105.91 < NWG 0.586 88.84 < NWG 1.66 125.30 < NWG 0.78 350.00 < NWG 1.410 Rücken 2 < NWG < NWG < NWG Bauch 2 < NWG < NWG < NWG Brust 2 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG 0.02 < NWG 0.21 0.04 < NWG < NWG 0.022 0.71 < NWG 0.11 4.07 1.08 0.22 2.27 < NWG 0.134 103.62 0.21 1.07 21.72 2.23 1.09 132.19 < NWG 1.196 135.33 0.40 1.84 42.46 3.47 1.90 232.34 0.07 1.870 Rücken 3 < NWG < NWG < NWG Bauch 3 < NWG < NWG < NWG Brust 3 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 0.04 < NWG < NWG 0.102 0.87 < NWG 0.08 7.28 < NWG 0.17 5.53 < NWG 0.214 50.74 0.07 0.47 151.05 < NWG 1.10 167.94 0.09 0.986 111.27 0.19 1.39 171.97 0.42 1.82 202.28 0.26 2.250 Rücken 4 < NWG < NWG < NWG Bauch 4 < NWG < NWG < NWG Brust 4 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG < NWG 1.31 0.03 < NWG < NWG 0.812 0.12 < NWG 0.05 3.61 6.13 0.24 < NWG < NWG 1.324 12.08 < NWG 0.16 183.51 13.68 1.12 49.75 0.06 12.036 50.00 0.06 0.61 203.32 13.98 1.33 133.92 0.07 17.68
100
Anhangstabelle 3: Menge der permeierten Versuchssubstanzen Benzoesäure, Hydrocortison undTestosteron (µg/cm² Haut) bei in Diffusionszellen untersuchter Rücken-,Bauch- und Brustwandhaut des Pferdes (NWG = Nachweisgrenze:Benzoesäure = 1 µg; Hydrocortison = 0,05 µg; Testosteron = 0,0125 µg).
Zeit(h)
Pferd Ben-zoe-säure
Hydro-korti-son
Tes-tos-teron
Pferd Ben-zoe-säure
Hydro-korti-son
Tes-tos-teron
Pferd Ben-zoe-säure
Hydro-korti-son
Tes-tos-teron
0 Rücken 1 < NWG < NWG < NWG Bauch 1 < NWG < NWG < NWG Brust 1 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG 5.17 < NWG 0.06 13.07 < NWG 0.122 < NWG < NWG < NWG 78.85 0.23 0.16 127.27 1.46 2.214 1.25 < NWG < NWG 304.39 2.84 2.41 312.59 22.01 4.906 12.50 < NWG < NWG 386.44 12.69 4.07 391.35 29.58 8.880 Rücken 2 < NWG < NWG < NWG Bauch 2 < NWG < NWG < NWG Brust 2 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG 27.79 < NWG 0.04 13.68 0.74 0.142 < NWG < NWG < NWG 156.72 0.11 0.43 98.60 5.35 1.924 9.69 < NWG < NWG 240.09 1.88 3.04 276.21 48.38 4.626 39.08 < NWG < NWG 366.43 6.33 4.36 374.38 70.83 6.530 Rücken 3 < NWG < NWG < NWG Bauch 3 < NWG < NWG < NWG Brust 3 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG 3.40 < NWG 0.24 26.37 0.12 0.052 < NWG < NWG < NWG 73.52 < NWG 0.26 166.32 2.19 0.924 23.38 < NWG < NWG 233.30 0.46 0.87 363.10 9.48 4.016 75.75 < NWG < NWG 338.45 3.61 2.30 396.65 23.75 4.830 Rücken 4 < NWG < NWG < NWG Bauch 4 < NWG < NWG < NWG Brust 4 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG < NWG 1.16 0.73 20.10 0.09 0.462 < NWG < NWG < NWG 24.74 8.06 4.07 161.45 4.74 3.274 8.25 < NWG < NWG 125.15 74.55 6.43 314.73 40.88 6.106 37.07 < NWG < NWG 259.59 146.25 11.43 397.17 97.20 7.95
Anhangstabelle 4: Menge der permeierten Versuchssubstanzen Benzoesäure, Hydrocortison undTestosteron (µg/cm² Haut) bei in Diffusionszellen untersuchter Rücken-,Bauch- und Brustwandhaut des Schweines (NWG = Nachweisgrenze:Benzoesäure = 1 µg; Hydrocortison = 0,05 µg; Testosteron = 0,0125 µg).
Zeit(h)
Schwein Ben-zoe-säure
Hydro-korti-son
Tes-tos-teron
Schwein Ben-zoe-säure
Hydro-korti-son
Tes-tos-teron
Schwein Ben-zoe-säure
Hydro-korti-son
Tes-tos-teron
0 Rücken 1 < NWG < NWG < NWG Bauch 1 < NWG < NWG < NWG Brust 1 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG 0.10 < NWG 0.05 < NWG < NWG 0.052 < NWG < NWG < NWG 4.13 < NWG 0.26 < NWG < NWG 0.074 11.26 < NWG < NWG 65.77 0.18 1.49 45.14 < NWG 0.176 50.99 < NWG < NWG 113.31 0.20 3.07 122.59 < NWG 0.260 Rücken 2 < NWG < NWG < NWG Bauch 2 < NWG < NWG < NWG Brust 2 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG < NWG 0.05 0.06 < NWG < NWG 0.012 < NWG < NWG < NWG 10.01 0.07 0.38 < NWG < NWG 0.014 9.37 < NWG < NWG 227.72 0.19 3.53 28.91 < NWG 0.026 44.51 < NWG < NWG 245.77 0.20 4.33 124.28 0.06 0.220 Rücken 3 < NWG < NWG < NWG Bauch 3 < NWG < NWG < NWG Brust 3 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG < NWG 0.10 0.12 < NWG 0.08 0.022 < NWG < NWG < NWG 0.11 0.17 0.50 < NWG 0.11 0.024 36.50 < NWG < NWG 12.87 0.29 2.64 37.31 0.22 0.046 72.86 < NWG < NWG 29.43 0.31 3.95 96.32 0.30 0.200 Rücken 4 < NWG < NWG < NWG Bauch 4 < NWG < NWG < NWG Brust 4 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 0.30 < NWG < NWG 0.032 < NWG < NWG < NWG < NWG 0.27 0.38 < NWG 0.09 0.084 31.57 < NWG < NWG 95.01 1.12 0.64 28.38 0.58 0.416 95.80 < NWG < NWG 118.19 1.30 1.23 80.67 2.38 1.21
101
Anhangstabelle 5: Menge der permeierten Versuchssubstanzen Benzoesäure, Hydrocortison undTestosteron (µg/cm² Haut) bei in Diffusionszellen untersuchter Rücken-,Bauch-, Brustwand- und Euterhaut des Rindes (NWG = Nachweisgrenze:Benzoesäure = 1 µg; Hydrocortison = 0,05 µg; Testosteron = 0,0125 µg).
Zeit(h)
Rind Ben-zoe-säure
Hydro-korti-son
Tes-tos-teron
Rind Ben-zoe-säure
Hydro-korti-son
Tes-tos-teron
Rind Ben-zoe-säure
Hydro-korti-son
Tes-tos-teron
0 Rücken 1 < NWG < NWG < NWG Bauch 1 < NWG < NWG < NWG Brust 1 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG < NWG 0.11 0.01 < NWG < NWG < NWG2 < NWG < NWG < NWG 3.36 0.26 0.08 < NWG < NWG < NWG4 10.01 < NWG < NWG 11.44 2.02 0.72 12.48 < NWG 0.026 13.26 < NWG < NWG 23.70 4.98 2.12 47.03 < NWG 0.080 Rücken 2 < NWG < NWG < NWG Bauch 2 < NWG < NWG < NWG Brust 2 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG 3.14 < NWG < NWG 3.92 < NWG 0.112 < NWG < NWG < NWG 48.57 1.00 0.06 55.64 < NWG 0.174 4.83 < NWG < NWG 218.58 2.74 0.10 248.64 < NWG 0.296 30.56 < NWG < NWG 282.38 6.09 0.29 379.84 0.05 0.670 Rücken 3 < NWG < NWG < NWG Bauch 3 < NWG < NWG < NWG Brust 3 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 0.11 < NWG < NWG < NWG2 < NWG < NWG < NWG 0.95 < NWG 0.16 1.42 < NWG < NWG4 < NWG < NWG < NWG 24.36 < NWG 0.29 50.77 < NWG 0.186 3.57 < NWG < NWG 44.33 < NWG 0.76 140.76 0.21 1.010 Rücken 4 < NWG < NWG < NWG Bauch 4 < NWG < NWG < NWG Brust 4 < NWG < NWG < NWG1 < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 0.10 < NWG < NWG < NWG2 < NWG < NWG < NWG < NWG < NWG 2.16 2.48 < NWG 0.034 < NWG < NWG < NWG 37.62 < NWG 13.65 30.85 < NWG 0.546 < NWG < NWG < NWG 126.49 < NWG 22.28 76.61 0.23 1.44
Zeit(h)
Rind Ben-zoe-säure
Hydro-korti-son
Tes-tos-teron
0 Euter 1 < NWG < NWG < NWG1 8.82 < NWG < NWG2 100.21 0.06 < NWG4 251.45 0.87 0.186 271.65 2.70 0.870 Euter 2 < NWG < NWG < NWG1 1.05 < NWG < NWG2 25.37 < NWG 0.054 118.96 0.78 1.666 181.28 4.18 4.090 Euter 3 < NWG < NWG < NWG1 1.25 < NWG < NWG2 17.22 < NWG 0.054 209.08 0.92 0.996 284.72 2.86 2.370 Euter 4 < NWG < NWG < NWG1 7.13 < NWG < NWG2 73.46 0.06 0.354 222.60 2.24 3.996 280.81 4.84 10.38
102
Anhangstabelle 7: Ergebnisse der Berechnung der statistischen Unterschiede des Vergleiches derKörperregionen von Ratte, Hund, Pferd, Schwein und Rind (*p < 0,05 =schwach signifikant; p < 0,01 = signifikant; p < 0,001 = hoch signifikant).
Tierart VergleichKörperregion
Benzoe-säure
Hydro-kortison
Testos-teron
Ratte Rücken-Bauch 0.686 0.686 0.114Hund Rücken-Bauch 0.486 0.400 0.886
Rücken-Brustwand 0.057 0.886 0.229Bauch-Brustwand 0.200 0.400 0.400
Pferd Rücken-Bauch *0.029 0.057 0.057Rücken-Brustwand *0.029 *0.029 *0.029Bauch-Brustwand 0.057 0.057 0.057
Schwein Rücken-Bauch 0.343 *0.029 *0.029Rücken-Brustwand 0.057 0.114 *0.029Bauch-Brustwand 1.000 0.686 *0.029
Rind Rücken-Bauch 1) 0.057 0.343 *0.029 1) p = 0,114 bei Vernachlässigung von Bauch 2Rücken-Brustwand 2) *0.029 0.114 *0.029 2) p = 0,057 bei Vernachlässigung von Brustwand 2Bauch-Brustwand 3) 0.486 0.886 0.049 3) p = 0,400 bei Vernachlässigung von Bauch 2 undRücken-Euter *0,029 *0,029 *0,029 Brustwand 2Bauch-Euter 4) 0,200 1,000 0,114 4) p = 0,057 bei Vernachlässigung von Bauch 2Brustwand-Euter 5) 0,343 *0,029 0,114 5) p = 0,057 bei Vernachlässigung von Brustwand 2
Anhangstabelle 8: Ergebnisse der Berechnung der statistischen Unterschiede des Vergleiches derTierarten anhand der Hautlokalisationen Rücken, Bauch, seitliche Brustwandund Euter (*p < 0,05 = schwach signifikant; p < 0,01 = signifikant; p < 0,001= hoch signifikant).
Benzoesäure Hydrocortison TestosteronVergleich
TierartRücken Bauch Brust-
wandRücken Bauch Brust-
wandRücken Bauch Brust-
wandRatte-Hund *0.029 0.057 *0.029 0,629 *0.029 *0.029Ratte-Pferd *0.029 0.200 *0.029 0,057 *0.029 0,629Ratte-Rind *0.029 0.200 *0.029 1.000 *0.029 0,057Ratte-Schwein *0.029 0.057 *0.029 *0.029 *0.029 0.686Hund-Pferd 0.057 *0.029 0.057 0.114 0,100 *0.029 *0.029 0,057 0,343Hund-Rind *0.029 0.886 0.343 0.114 0,857 0.886 *0.029 0,629 0,114Hund-Schwein 0.343 0.686 *0.029 0.114 0,857 0.686 *0.029 0.200 0,057Pferd-Rind 0.114 0.571 0.057 - 0,229 *0.029 - 0,100 *0.029Pferd-Schwein 0.200 *0.029 *0.029 - 0,057 *0.029 - 0,629 *0.029Rind-Schwein *0.029 1.000 1.000 - 1.000 0.486 - 0,114 0.686Euter-Ratte 0.200 0.886 0.686 0.343 0.886 1.000Euter-Hund *0.029 0.057 0.686 *0.029 0,229 *0.029 0.200 0.200 0,400Euter-Pferd *0.029 0.200 *0.029 *0.029 0,229 *0.029 *0.029 1,000 0.343Euter-Rind *0.029 0.200 0.343 *0.029 1.000 *0.029 *0.029 0,114 0.114Euter-Schwein *0.029 0.057 *0.029 *0.029 *0.029 *0.029 *0.029 1.000 0.057
Anhangstabelle 9: Ergebnisse der Berechnung der statistischen Unterschiede des Vergleiches desPermeationsverhaltens der Testsubstanzen Benzoesäure (BS), Hydrocortison(HC) und Testosteron (T) (*p < 0,05 = schwach signifikant; p < 0,01 =signifikant; p < 0,001 = hoch signifikant).
Ratte Hund Pferd SchweinVergleichSubstanz
Rücken Bauch Rücken Bauch Brust-wand
Rücken Bauch Brust-wand
Rücken Bauch Brust-wand
BS - HC *0.029 *0.029 *0.029 0.057 *0.029 *0.029 0.057 *0.029 *0.029 *0.029 *0.029BS - T *0.029 *0.029 *0.029 *0.029 0.057 *0.029 0.057 *0.029 *0.029 *0.029 *0.029HC - T 0.486 0.200 *0.029 0,629 0.057 1.000 0.400 *0.029 1.000 0.057 0.886
RindVergleichSubstanz
Rücken Bauch Brust-wand
Euter
BS - HC 0.114 *0.029 *0.029 *0.029BS - T 0.114 0.057 *0.029 *0.029HC - T 1.000 1,000 0.114 0.686
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. M. Kietzmann für die Überlassung dieses Themas sowie
für seine stets freundliche Betreuung und Unterstützung bei der Anfertigung der vorliegenden
Arbeit.
Allen Mitarbeitern und Doktoranden des Instituts für Pharmakologie, Toxikologie und
Pharmazie möchte ich für die angenehme Zusammenarbeit und ihre jederzeit freundliche
Hilfestellung danken. Dr. Frank Niedorf danke ich für seine tatkräftige Unterstützung bei
HPLC-Problemen. Dr. Ulrike Seegers möchte ich für die Bereitstellung der histologischen
Schnitte danken.
Ebenso danke ich den Mitarbeitern des Instituts für Anatomie und des Instituts für Pathologie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover und den Mitarbeitern des Zentralen Tierlabors der
Medizinischen Hochschule Hannover für ihre Unterstützung bei der Beschaffung der
Hautproben.
Mein herzlicher Dank gilt Tanja Wolf für das aufmerksame Korrekturlesen.
Meinem Sohn Joshua danke ich dafür, daß er mich auch in stressigeren Zeiten immer wieder
zum Lachen brachte.
Mein besonderer Dank gilt meinen Eltern, Schwiegereltern und nicht zuletzt meinem
Ehemann. Ohne ihre unendliche Unterstützung wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen.