VALIDASI METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)-DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR KURKUMIN DALAMSEDIAAN KAPSUL LUNAK OBAT HERBAL TERSTANDAR (OHT)
“RHEUMAKUR®”
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu SyaratMemperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh:
Andreas Suseno Wimbo Hapsoro
NIM : 078114057
FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA2011
i
VALIDASI METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)-DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR KURKUMIN DALAMSEDIAAN KAPSUL LUNAK OBAT HERBAL TERSTANDAR (OHT)
“RHEUMAKUR®”
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu SyaratMemperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh:
Andreas Suseno Wimbo Hapsoro
NIM : 078114057
FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA2011
ii
iii
iv
Karya ini kupersembahkan bagikedua orang tuaku,
adikku,teman-teman dan almamaterku
yang luar biasa
v
vi
vii
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan yang penuh kasih, karena
berkat dan kasih karunia-Nya maka skripsi berjudul “VALIDASI METODE
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)-DENSITOMETRI PADA
PENETAPAN KADAR KURKUMIN DALAM SEDIAAN KAPSUL LUNAK
OBAT HERBAL TERSTANDAR (OHT) RHEUMAKUR®” ini dapat
diselesaikan oleh penulis. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat
memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) di Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma, Yogyakarta.
Selama penyusunan skripsi ini, banyak pihak yang telah membantu
penulis dalam menyelesaikannya, maka pada kesempatan ini penulis
mengucapkan terima kasih kepada:
1. Ipang Djunarko, S.Si, Apt, M.Sc selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku Dosen Pembimbing yang telah
banyak meluangkan waktunya dalam memberikan masukan, kritik, solusi,
semangat baik selama penelitian, penyusunan skripsi maupun saat
perkuliahan.
3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku Dosen Pembimbing Akademik dan Dosen
Penguji yang telah banyak memberikan masukan dan semangat baik selama
penyusunan skripsi maupun dalam perkuliahan.
4. Jeffry Julianus, M.Si. selaku Dosen Penguji yang telah memberikan saran,
kritik dan semangat dalam penyusunan skripsi ini maupun dalam perkulihan.
viii
5. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku dosen pengajar mata kuliah
Validasi Metode Analisis sehingga sangat membantu dalam penyusunan
skripsi, serta telah memberikan senyawa baku kurkumin kepada penulis
sehingga sangat berguna dalam penelitian
6. Dr.C.J. Soegihardjo, Apt. atas saran dan diskusi yang telah diberikan dalam
penyusunan skripsi.
7. Segenap dosen dan karyawan atas ilmu dan pengalaman yang berharga
sehingga berguna dalam proses penyusunan skripsi.
8. Theresia Weliana Kosasih dan Lilis Dumaria Pasaribu selaku teman
seperjuangan selama penelitian dan penyusunan skripsi.
9. Eliz, Yunita, Venny, Katiti, Lala, Toro, Katarina, Benny, dan Dian selaku
teman yang melakukan penelitian dalam satu tema yang sama, terima kasih
atas dukungannya.
10. Seluruh staf laboratorium kimia: Bimo, Kunto, Parlan, dan Wagiran yang
telah membantu penulis selama penelitian di laboratorium.
11. Cinthya, Yosafat, Edhi, Siska, Dika, Bella, Vivi, Robby, Tika, dan Puput
selaku teman yang sering bekerja kelompok bersama penulis, terima kasih
atas kerjasama, pengalaman, dan semangat yang luar biasa selama ini.
12. Kak Dewi, Grace, Zi, dan Bayu, atas laporan dan saran yang sangat berguna
bagi perkuliahan maupun penyusunan skripsi.
13. Teman-teman FST angkatan 2007 dan kelompok KKN 23 angkatan XL atas
pengalaman dan kebersamaannya.
ix
14. Semua pihak yang telah membantu penulis dan tidak tertulis di sini, terima
kasih atas semua dukungan dan bantuannya.
Penulis menyadari bahwa skripsi yang disusun ini masih banyak
memiliki kekurangan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran
untuk perbaikan dan perkembangan selanjutnya. Semoga skripsi ini dapat
bermanfaat demi perkembangan ilmu pengetahuan.
Yogyakarta, 11 Januari 2011
Penulis
x
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL................................................................................................ i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..................................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN................................................................................ iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................................ iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..................................................................v
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH.. vi
PRAKATA............................................................................................................ vii
DAFTAR ISI............................................................................................................x
DAFTAR TABEL................................................................................................ xiv
DAFTAR GAMBAR .............................................................................................xv
DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................... xvii
INTISARI........................................................................................................... xviii
ABSTRACT........................................................................................................... xix
BAB I PENGANTAR..............................................................................................1
A. Latar Belakang ...................................................................................................1
1. Permumusan masalah...................................................................................3
2. Keaslian penelitian .......................................................................................3
3. Manfaat penelitian........................................................................................4
B. Tujuan Penelitian ...............................................................................................5
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA.......................................................................6
A. Kapsul Lunak Obat Herbal Terstandar ..............................................................6
xi
B. Standarisasi Ekstrak ...........................................................................................7
C. Ekstrak Rimpang Kunyit....................................................................................9
D. Kurkumin ...........................................................................................................9
E. Kromatografi Lapis Tipis.................................................................................16
1. Kromatografi lapis tipis (KLT) secara umum............................................16
2. Jenis fase diam dan fase gerak KLT ..........................................................16
3. Migrasi dan retensi solut ............................................................................17
4. Pemisahan kromatografi lapis tipis ............................................................17
5. Proses sorpsi-adsorpsi ................................................................................18
6. Profil puncak dan pelebaran puncak ..........................................................21
7. Puncak asimetri ..........................................................................................23
8. Resolusi kromatogram ...............................................................................24
9. Analisis kualitatif .......................................................................................25
10. Analisis kuantitatif .....................................................................................26
11. Aplikasi penotolan sampel .........................................................................27
F. Densitometri.....................................................................................................28
G. Validasi Metode Analisis .................................................................................32
1. Parameter validasi metode .........................................................................32
2. Kategori metode analisis ............................................................................38
H. Landasan Teori.................................................................................................39
I. Hipotesis...........................................................................................................40
BAB III METODE PENELITIAN.........................................................................41
A. Jenis dan Rancangan Penelitian .......................................................................41
xii
B. Variabel dan Definisi Operasional ...................................................................41
1. Klasifikasi variabel.....................................................................................41
2. Definisi operasional ...................................................................................42
C. Bahan................................................................................................................42
D. Alat...................................................................................................................43
E. Cara Penelitian .................................................................................................43
1. Pembuatan metanol pH 4 ...........................................................................43
2. Pengaktifan silika gel G 60 ........................................................................43
3. Pembuatan dan penjenuhan fase gerak ......................................................43
4. Penetapan panjang gelombang serapan maksimum...................................44
5. Penentuan kurva baku kurkumin................................................................44
6. Penetapan perolehan kembali (recovery) dan koefisien variasi (KV)
baku kurkumin ...........................................................................................45
7. Penentuan selektivitas kurkumin dalam sampel serta akurasi dan
presisi baku yang ditambahkan ke dalam sampel ......................................46
F. Analisis Hasil ...................................................................................................47
1. Selektivitas .................................................................................................47
2. Linearitas dan rentang ................................................................................48
3. Akurasi baku kurkumin..............................................................................48
4. Presisi baku kurkumin................................................................................49
5. Akurasi baku kurkumin yang ditambahkan ke dalam sampel ...................49
6. Presisi baku kurkumin yang ditambahkan ke dalam sampel .....................49
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...............................................................51
xiii
A. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum Kurkumin .....................52
B. Pengamatan Profil Kromatogram Baku Kurkumin..........................................55
C. Preparasi Sampel dan Pengamatan Profil Kromatogram Kurkumin dalam
Sampel..............................................................................................................59
D. Pembuatan Kurva Baku....................................................................................63
E. Validasi Metode Kromatografi Lapis Tipis-Densitometri ...............................65
1. Selektivitas .................................................................................................65
2. Linearitas dan rentang ................................................................................67
3. Akurasi .......................................................................................................68
4. Presisi .........................................................................................................69
F. Penentuan Akurasi dan Presisi Baku Kurkumin dalam Sampel ......................69
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN.................................................................72
A. Kesimpulan ......................................................................................................72
B. Saran.................................................................................................................72
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................73
LAMPIRAN...........................................................................................................77
BIOGRAFI PENULIS .........................................................................................103
xiv
DAFTAR TABEL
Tabel I. Daftar fase gerak ...............................................................................16
Tabel II. Parameter-parameter aplikasi penotolan yang direkomendasikan....27
Tabel III. Rentang kesalahan perolehan kembali yang diperbolehkan .............35
Tabel IV. Kriteria yang diperbolehkan untuk presisi pada kadar analit
yang berbeda .....................................................................................36
Tabel V. Kategori Analisis Kimia ...................................................................39
Tabel VI. Data pengukuran panjang gelombang serapan maksimum
kurkumin...........................................................................................54
Tabel VII. Data nilai Rf baku dan sampel ..........................................................60
Tabel VIII. Data kurva baku kurkumin ...............................................................63
Tabel IX. Resolusi puncak kurkumin dengan puncak senyawa 2.....................67
Tabel X. Hasil penentuan perolehan kembali (recovery) kurkumin baku.......68
Tabel XI. Hasil penentuan KV kurkumin baku ................................................69
Tabel XII. Perolehan kembali dan KV baku kurkumin dalam sampel...............70
Tabel XIII. Perbandingan AUC kurkumin dalam sampel dan kurkumin
dalam sampel yang ditambah baku...................................................70
Tabel XIV. Perbandingan tinggi puncak kurkumin dalam sampel dan
kurkumin dalam sampel yang ditambah baku ..................................71
xv
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Logo Obat Herbal Terstandar (OHT) .................................................7
Gambar 2. Seyawa Kurkumin, Demetoksi Kurkumin, dan Bis-demetoksi
kurkumin...........................................................................................10
Gambar 3. Isomer geometrik cis-trans dari kurkumin .......................................10
Gambar 4. Tautomerisasi bentuk keto-enol senyawa kurkuminoid ...................12
Gambar 5. Strukutur kimia kurkumin dalam berbagai pH .................................13
Gambar 6. Produk degradasi kurkumin pada pH alkali......................................14
Gambar 7. Struktur trans-6-(4-hydroxy-3- methoxyphenyl )-2,4-dioxo-5-
hexenal ..............................................................................................15
Gambar 8. Produk fotodegradasi kurkumin........................................................15
Gambar 9. Cara penentuan harga Rf ...................................................................18
Gambar 10. Interaksi antara analit dengan fase diam silika gel ...........................19
Gambar 11. Keadaan simetris dan pelebaran puncak kromatogram ....................22
Gambar 12. Ilustrasi 3 prinsip utama yang menggambarkan puncak; (a).
Pengaruh lintasan ganda (multiple-path effect); (b). Pengaruh
difusi longitudinal; (c). Pengaruh transfer massa .............................22
Gambar 13. Isoterm sorpsi serta profil-profil puncak yang dihasilkan. (a).
Isoterm linier (b). Puncak tailing dan (c). Puncak fronting ..............23
Gambar 14. Ilustrasi resolusi pada KLT: (a) kromatogram; (b) profil
kromatografi masing-masing bercak ................................................24
Gambar 15. Pengukuran resolusi 2 puncak yang berdekatan ...............................25
xvi
Gambar 16. Pemantulan sinar...............................................................................29
Gambar 17. Gugus kromofor dan auksokrom pada struktur kurkumin................53
Gambar 18. Kromatogram panjang gelombang maksimum kurkumin ................54
Gambar 19. Kromatogram baku kurkumin 260 ppm............................................56
Gambar 20. Gugus polar dan gugus non polar pada kurkumin ............................56
Gambar 21. Interaksi hidrogen antara kurkumin dengan fase diam.....................57
Gambar 22. Interaksi kurkumin dengan fase gerak ..............................................57
Gambar 23. Interaksi antara asam asetat glasial dengan silika gel.......................58
Gambar 24. Perbandingan kromatogram sampel (A) dan kromatogram baku
kurkumin (B).....................................................................................60
Gambar 25. Ilustrasi keadaan kesetimbangan pada pemisahan senyawa A
(kurkumin) dengan senyawa lainnya ................................................61
Gambar 26. Hubungan antara konsentrasi kurkumin dengan AUC/50
( replikasi I).......................................................................................65
Gambar 27. Nilai Rs puncak kurkumin sampel dan kesamaan Rf baku
dengan puncak kurkumin pada sampel .............................................66
xvii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Sertifikat analisis baku kurkumin...................................................78
Lampiran 2. Hasil uji pH stabilitas kurkumin.....................................................79
Lampiran 3. Hasil kromatogram pengukuran panjang gelombang serapan
maksimum ......................................................................................81
Lampiran 4. Sistem KLT-Densitometri yang digunakan....................................84
Lampiran 5. Kromatogram kurva baku kurkumin ..............................................86
Lampiran 6. Penimbangan baku dan contoh perhitungan kadar baku ................88
Lampiran 7. Kromatogram hasil validasi metode...............................................90
Lampiran 8. Data penimbangan dan contoh perhitungan recovery ....................93
Lampiran 9. Contoh perhitungan SD dan CV .....................................................95
Lampiran 10. Kromatogram penentuan akurasi dan presisi baku dalam sampel..96
Lampiran 11. Data perhitungan nilai resolusi antara puncak kurkumin dengan
puncak senyawa 2 dan contoh perhitungannya ............................100
Lampiran 12. Data dan contoh perhitungan nilai recovery dan CV baku dalam
matriks sampel..............................................................................101
xviii
INTISARI
Kurkumin merupakan senyawa polifenol yang memiliki aktivitas sebagaiantiinflamasi namun tidak stabil terhadap pH di atas 7 dan paparan cahaya.Kandungan kurkumin dalam ekstrak kunyit dimanfaatkan dalam produksi sediaankapsul lunak Obat Herbal Terstandar (OHT). Oleh karena itu, stabilitas kadarkurkumin pada saat distribusi dan penyimpanan sediaan OHT penting untukdiketahui.
Metode penetapan kadar kurkumin dalam sediaan kapsul lunak OHTdilakukan secara KLT-Densitometri. Sistem KLT-Densitometri yang digunakanadalah fase normal dengan fase gerak kloroform : asam asetat glasial : heksana(85 : 10 :5) v/v dan fase diam silika gel G 60 yang diukur pada 425 nm.
Parameter validasi metode yang ditentukan adalah selektivitas, linearitas,akurasi, presisi, dan rentang. Hasil penelitian validasi baku menunjukkan metodeKLT-Densitometri memiliki selektivitas yang baik dengan nilai resolusi padapemisahan sampel adalah 2,2399. Metode ini memiliki linearitas yang baik padakonsentrasi kurkumin 100 – 500 ppm (r = 0,9996) dan rentang 260 - 500 ppm.Perolehan kembali dan KV untuk kadar rendah, sedang dan tinggi berturut-turutadalah 104,07%, 2,72%; 99,28%, 0,34%; dan 100,11%, 0,79%. Hasil validasibaku dalam matriks sampel memiliki perolehan kembali dan KV berturut-turutyaitu 102,07% dan 3,64%.
Kata kunci : kurkumin, kapsul lunak OHT, KLT-densitometri
xix
ABSTRACT
Curcumin is a polyphenol compound which has activity as an anti-inflammatory but not stable to pH above neutral and light exposure. The contentof curcumin in turmeric extract used in the production of Scientific Based HerbalMedicine (SBHM) soft capsule. Therefore, the stability of curcumin contentduring distribution and storage of SBHM dosage form important to know.
Curcumin content determination method performed by TLC-Densitometry. TLC-Densitometry system used is a normal phase with mobilephase chloroform: glacial acetic acid: hexane (85: 10: 5) v/v and stationary phasesilica gel G 60 that was measured at 425 nm.
Specified validation parameters are selectivity, linearity, accuracy,precision, and range. The results show the validation of raw-Densitometry TLCmethod has good selectivity with the resolution of the separation of the sample is2.2399. This method has good linearity of concentrations of curcumin from 100 to500 ppm (r = 0.9996) and range about 260 – 500 ppm. The recoveries and CV forlow, medium and high concentration respectively is 104.07%, 2.72%, 99.28%,0.34%, and 100.11%, 0.79%. The validation raw material in the sample matrixhad the recovery and CV, respectively, are 102.07% and 3.63%.
Key words: curcumin, SBHM soft capsule, TLC-densitometry
1
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Kurkumin merupakan senyawa polifenol berwarna kuning oranye yang
berkhasiat sebagai analgesik-antiinflamasi. Kurkumin yang terkandung dalam
ekstrak simplisia rimpang kunyit (Curcumae domesticae Rhizoma) ditemukan
bersama kedua turunannya yaitu demetoksi kurkumin dan bis-demetoksi
kurkumin. Beberapa perusahaan telah mempergunakan kunyit sebagai bahan dasar
pembuatan Obat Herbal Terstandar (OHT) (Usia, 2010).
Dalam dua dasawarsa terakhir penggunaan obat tradisional mengalami
perkembangan yang sangat pesat (Usia, 2010). Minat masyarakat terhadap
sediaan obat tradisional meningkat karena sediaan obat tradisonal diyakini sebagai
obat alam yang memiliki akses hingga seluruh lapisan masyarakat, selain itu
harganya terjangkau bagi seluruh lapisan masyarakat. Oleh karena itu, Badan
Pengawas Obat dan Makanan melakukan peningkatan mutu obat tradisional
melalui standarisasi bahan baku dan uji praklinik menjadi produk OHT
(Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 1994).
Salah satu produk OHT yang mengandung kurkumin sebagai senyawa
aktif dominan adalah Rheumakur®. Rheumakur® mengandung kurkuminoid (10
mg) dan minyak atsiri dari ekstrak kunyit dan temulawak (100 mg). Rheumakur®
merupakan salah satu obat tradisional dalam sediaan kapsul lunak.
2
Senyawa aktif yang diteliti pada penelitian ini adalah kurkumin.
Kurkumin memiliki stabilitas yang rendah terhadap pH dan paparan cahaya
(Stankovic, 2004). Hal ini mempengaruhi mutu sediaan karena kurkumin menjadi
tidak stabil dalam proses distribusi dan penyimpanan sehingga dimungkinkan
kadar kurkumin menjadi berkurang. Kadar kurkumin yang berkurang akan
berpengaruh terhadap besarnya efek antiinflamasi yang ditimbulkan. Mutu
sediaan OHT akan terjamin apabila jumlah dan kadar senyawa aktif pada setiap
sediaan yang didistribusikan seragam dan sesuai dengan yang tertera pada
kemasan. Untuk itu diperlukan penetapan kadar kurkumin dalam kapsul lunak
OHT merk Rheumakur® pada nomor batch yang sama namun berbeda apotek
untuk mengetahui stabilitas kurkumin dalam penyimpanan.
Penelitian ini merupakan serangkaian proses yaitu optimasi, validasi
metode dan penetapan kadar kurkumin. Metode yang dilakukan pada penelitian
analisis kurkumin ini adalah KLT-densitometri. Sistem KLT yang digunakan
merupakan fase normal dengan fase diam silika gel G 60 dan fase gerak
kloroform : asam asetat glasial : heksana (85 : 10 : 5) yang merupakan hasil
optimasi. Metode yang digunakan adalah KLT-densitometri karena memiliki
kelebihan yaitu dapat digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif secara
simultan.
Validasi metode diperlukan untuk membuktikan bahwa parameter
metode analisis yang dilakukan memenuhi persyaratan sesuai dengan yang
diharapkan. Parameter-parameter yang harus dipenuhi meliputi akurasi, presisi,
selektivitas, linearitas dan rentang. Nilai yang baik untuk akurasi baku kurkumin
3
ditentukan melalui perhitungan perolehan kembali (98-102%), presisi baku
kurkumin ditentukan melalui perhitungan koefisien variasi (<2%), selektivitas
ditentukan melalui nilai resolusi (>1,5) dan kesamaan faktor retardasi sampel dan
baku, serta linearitas dengan nilai r >0,999. Sedangkan akurasi dan presisi baku
kurkumin dengan kadar 0,01% dalam matriks sampel yang baik secara berturut-
turut ditunjukkan melalui nilai perolehan kembali 90-107% dan KV < 5,3%
(Harmita, 2004; United States Pharmacopeial Convention, 1995; Yuwono dan
Indrayatno, 2005).
1. Perumusan masalah
Berdasarkan latar belakang, maka diperoleh permasalahan sebagai
berikut: Apakah metode KLT-Densitometri yang digunakan pada penetapan kadar
kurkumin dalam sediaan kapsul lunak OHT “Rheumakur®” memenuhi parameter
validasi meliputi selektivitas, linearitas, rentang , akurasi, dan presisi?
2. Keaslian penelitian
Sejauh pengetahuan penulis, penelitian validasi penetapan kadar
kurkumin secara KLT-densitometri yang sudah pernah dilakukan, antara lain:
Penentuan kadar kurkumin secara kromatografi lapis tipis-densitometri (Martono,
1996) dalam serbuk rhizoma Curcuma longa L. dengan fase gerak kloroform :
etanol : air suling (25 : 0,96 : 0,04), Simultaneous determination of curcuminoids
in curcuma samples using high performance thin layer chromatography (Gupta,
Gupta, Kumar, 1999) dengan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5),
Quantitative Analysis of Curcumin, Demethoxycurcumin and
Bisdemethoxycurcumin in the Crude Curcuminoid Extract from Curcuma longa in
4
Thailand by TLC-Densitometry (Pothitirat, Gritsanapan, 2005) dan Occurrence of
curcuminoids in curcuma longa: a quality standardization by HPTLC
(Paramasivam, Aktar, Poi, Banerjee, Bandyopadhyay, 2008) dengan fase gerak
kloroform : metanol (48 : 2).
Penelitian yang dilakukan penulis memiliki perbedaan terhadap
penelitian yang tercantum di atas. Penulis lebih menekankan pada penjaminan
mutu obat tradisional khususnya stabilitas kadar kurkumin dalam sediaan kapsul
Obat Herbal Terstandar, bukan dalam simplisia maupun ekstrak. Parameter lain
yang membedakan dengan penelitian sebelumnya adalam sistem fase gerak yang
digunakan penulis yaitu kloroform : asam asetat glasial : heksana (85 : 10 : 5) v/v.
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan mampu memberikan
metode baru karena digunakan sistem fase gerak yang belum dilakukan pada
penelitian sebelumnya. Selain itu, penelitian ini juga diharapkan dapat
memberikan pemahaman mengenai parameter validasi antara lain selektivitas,
linearitas, rentang, akurasi, dan presisi pada validasi metode penetapan kadar
kurkumin secara Kromatografi Lapis Tipis-Densitometri
b. Manfaat praktis. Hasil dari penelitian ini diharapkan mampu
memberikan suatu informasi bahwa metode KLT-Densitometri dapat digunakan
untuk penetapan kadar kurkumin dalam sediaan OHT.
5
B. Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini secara umum adalah untuk melakukan
penjaminan mutu pada sediaan obat tradisional. Penjaminan mutu dilakukan
melalui penetapan kadar kurkumin. Untuk itu, tujuan penelitian ini secara khusus
adalah untuk mengetahui bahwa validasi metode KLT-Densitometri pada
penetapan kadar kurkumin dalam kapsul lunak OHT Rheumakur® memenuhi
parameter validasi yang baik meliputi selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan
presisi.
6
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Kapsul Lunak Obat Herbal Terstandar
Kapsul adalah sediaan padat yang terdiri dari obat dalam cangkang keras
atau lunak yang dapat larut. Kapsul cangkang lunak umumnya terbuat dari gelatin.
Cangkang gelatin lunak umumnya mengandung 6% hingga 13% air. Umumnya
kapsul cangkang lunak diisi dengan cairan. Khususnya bahan aktif dilarutkan atau
disuspensikan dalam bahan pembawa cair. Digunakan pula bahan pembawa
minyak seperti minyak nabati. Keunggulan kapsul cangkang lunak adalah
keseragaman kandungan dan disolusi obatnya lebih baik daripada kapsul berisi
serbuk kering. Namun, kontak antara cangkang lunak atau keras dengan isi zat
cair lebih besar dibandingkan dengan kapsul berisi serbuk kering (Direktorat
Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995).
Teknik pembuatan kapsul lunak yang berisi suspensi telah banyak
dilakukan pada produk obat maupun nutraceutical. Formulasi suspensi
membutuhkan agen pensuspensi untuk mencegah pengendapan padatan dan
menjaga homogenitas dalam kapsul. Agen pensuspensi yang banyak digunakan
dengan basis minyak adalah wax, contohnya adalah beeswax, sedangkan polietilen
glikol untuk basis tidak berminyak. Pada industri kapsul lunak, ekstrak kering
biasa dikombinasikan dengan minyak kedelai sebagai pembawa, beeswax kuning
sebagai agen pensuspensi dan pengental, dan lesitin sebagai lubrikan. Jumlah
7
ekstrak dan bahan lain bergantung pada dosis ekstrak yang hendak
diadministrasikan (Naguib, 2000).
Gambar 1. Logo Obat Herbal Terstandar (OHT)
Berdasarkan PERMENKES No.246/MENKES/PER/V/1990 obat
tradisional adalah bahan atau ramuan bahan yang berupa bahan tumbuhan, bahan
hewan, bahan mineral, sediaan galenik atau campuran dan bahan-bahan tersebut,
yang secara tradisional telah digunakan untuk pengobatan berdasarkan
pengalaman. Sedangkan kapsul lunak Obat Herbal Terstandar adalah sediaan
kapsul lunak obat bahan alam yang telah dibuktikan keamanan dan khasiatnya
secara ilmiah dengan uji praklinik dan bahan bakunya telah distandarisasi
(Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 1990).
B. Standarisasi Ekstrak
Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi
senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani dengan menggunakan
pelarut yang sesuai. Ekstrak tumbuhan obat yang dibuat dari simplisia nabati
dapat digunakan sebagai bahan awal, bahan antara, atau bahan produk jadi.
Ekstrak sebagai bahan awal dianalogkan dengan komoditi bahan baku obat yang
dengan teknologi fitofarmasi diproses menjadi produk jadi. Sedangkan ekstrak
sebagai bahan antara merupakan bahan yang dapat diproses lagi menjadi fraksi-
8
fraksi, isolat senyawa tunggal ataupun tetap sebagai campuran dengan ekstrak lain
(Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2005).
Adapun jika sebagai produk jadi berarti ekstrak yang berada dalam
sediaan obat jadi siap digunakan. Ekstrak tersebut bisa dalam bentuk ekstrak
kering, ekstrak kental dan ekstrak cair yang proses pembuatannya disesuaikan
dengan bahan aktif yang dikandung serta maksud penggunaannya, apakah akan
dibuat menjadi sediaan dalam bentuk kapsul, tablet, cairan obat dalam, pil, dan
lainnya (Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2005).
Terpenuhinya standar mutu produk atau bahan ekstrak tidak terlepas dari
pengendalian proses, artinya bahwa proses yang terstandar dapat menjamin
produk yang terstandar tanpa penerapan pengujian atau pemeriksaan. Untuk
menjaga kualitas bahan baku obat alam perlu dilakukan usaha budidaya dan
standarisasi terhadap bahan baku tersebut, baik yang berupa simplisia maupun
yang berbentuk ekstrak atau sediaan galenik (Badan Pengawas Obat dan Makanan
Republik Indonesia, 2005).
Persyaratan mutu ekstrak terdiri dari berbagai parameter standar umum
dan parameter standar spesifik. Pengertian standardisasi juga berarti proses
menjamin bahwa produk akhir mempunyai nilai parameter tertentu yang konstan
dan ditetapkan terlebih dahulu (Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik
Indonesia, 2005).
Senyawa aktif yang terdapat dalam berbagai simplisia dapat digolongkan
ke dalam golongan minyak atsiri, alkaloid, flavonoid, fenolik, dan lain-lain.
Struktur kimia yang berbeda-beda akan mempengaruhi kelarutan serta stabilitas
9
senyawa-senyawa tersebut terhadap pemanasan , udara, cahaya, logam berat dan
derajat keasaman (Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia,
2005).
C. Ekstrak Rimpang Kunyit
Curcumae domesticae Rhizoma (rimpang kunyit) adalah rimpang
Curcuma domestica Val. Pemerian yang dimiliki yaitu berbau khas aromatik, rasa
agak pahit, agak pedas, dan lama kelamaan menimbulkan rasa tebal. Dosis lazim
rimpang Kunyit yang diperbolehkan adalah 8 mg/kg (Direktorat Jenderal
Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1977).
Ekstrak kental rimpang kunyit adalah ekstrak yang dibuat dari rimpang
tumbuhan Curcuma domestica Val., mengandung minyak atsiri ≥ 3,2% dan
kurkuminoid ≥ 33,9% (Badan Pengawas Obat dan Makanan, 2004). Kandungan
dari ekstrak rimpang Kunyit antara lain kurkuminoid, minyak atsiri, lemak 1 -3 %,
karbohidrat 3%, protein 30%, pati 8%, vitamin C 45-55%, dan garam-garam
mineral (Rukmana, 1994). Dalam kurkuminoid, kandungan kurkumin sebesar 77
%, demetoksi kurkumin 17 % dan bis-demetoksi kurkumin 3% (Anggarwal,
1995).
D. Kurkumin
Kurkumin adalah senyawa aktif polifenol dengan rumus kimia
C21H20O6. Kurkumin memiliki nilai log P = 2,56 dan merupakan zat warna
kuning utama (0,5 –6%) yang terdapat dalam rhizoma Curcuma longa L atau
Curcuma domestica Val.. Kurkumin bersama turunan demetoksinya yaitu
10
demetoksi kurkumin (log P = 2,69) dan bis-demetoksi kurkumin (log P = 2,81)
dikenal dengan nama kurkuminoid (Martono, 1996). Kurkumin memiliki panjang
gelombang serapan maksimum pada 430 nm dalam pelarut metanol dan 425 nm
dalam pelarut etanol (Anggarwal, 1995). Kurkumin larut dalam alkohol dan asam
asetat glasial, tetapi tidak dapat larut dalam air dan eter (Windholz, 1981).
Struktur kurkumin ditampilkan sebagai berikut :
OH
R1 R2
OH
O O
R1 = -OCH3 dan R2 = -OCH3 (Kurkumin)R1 = -H dan R2 = -OCH3 (Demetoksi kurkumin)R1 = -H dan R2 = -H (Bis-demetoksi kurkumin)
Gambar 2. Seyawa Kurkumin, Demetoksi Kurkumin, dan bis-demetoksi kurkumin(Anggarwal, 1995)
Selain konstituen mayor (kurkumin, demetoksi kurkumin, dan bis
demetoksi kurkumin), konstituen minor juga dapat diisolasi yang memiliki bentuk
isomer geometrikal dari senyawa 1-3 (Gambar 2). Satu dari antaranya berbentuk
isomer geometrik cis-trans (Gambar 3) memiliki titik lebur, stabilitas dalam
larutan dan cahaya yang lebih rendah (Stankovic, 2004).
Gambar 3. Isomer geometrik cis-trans dari kurkumin (Stankovic, 2004)
11
Kurkumin memiliki aktivitas sebagai antiinflamasi pada penyakit
osteoartritis. Osteoartritis adalah penyakit reumatik dengan prevalensi yang terus
meningkat sesuai dengan pertambahan usia. Secara klinis osteoartritis ditandai
oleh nyeri, deformitas, pembesaran sendi, hambatan gerak; disamping itu juga
terjadi inflamasi tingkat ringan sampai berat (Kalim, 1996; Rahardjo, 1994).
Ekstrak rimpang kunyit dengan kadar kurkuminoid 3,66 ± 0,65 % b/b
dan 25 mL minyak atsiri rimpang temulawak yang mengandung kamfora, kamfen,
kurkumen, bergamoten, germakren B, kurserenon, germakron dan xanthorrhizol
mampu menurunkan angka leukosit di dalam cairan sinovial penderita
osteoartritis. Sehingga produksi sitokin yang menyebabkan inflamasi menjadi
berkurang (Kertia, Sudarsono, Imono, Mufrod, Catur, Rahardjo, dkk, 2005).
Kurkuminoid mempunyai aktivitas anti inflamasi yang menarik meliputi
penghambatan lipid peroksidase (anti oksidan) serta penghambatan aktivitas
enzim siklooksigenase dan lipooksigenase (Timmerman, 1995; Kohli, Ali, Ansari,
dan Raheman, 2005). Kurkumin mempunyai aktivitas yang paling kuat (IC 50 =
0,05 цM) dibandingkan senyawa turunannya (Agnam dkk, 1995). Selain itu,
jumlah kurkumin yang aman dikonsumsi oleh manusia adalah 100 mg/hari
(Commandeur dan Vermeulen, 1996). Oleh sebab itu, ekstrak rimpang kunyit
dimanfaatkan sebagai bahan dalam pembuatan obat tradisional (Anggarwal,
1995).
Parameter yang harus diperhatikan dalam pemanfaatan kurkumin dalam
pembuatan sediaan obat tradisional adalah stabilits kurkumin. Stabilitas kurkumin
sangat dipengaruhi oleh pH lingkungan. Dalam larutan berair, kurkumin
12
mengalami reaksi hidrolisis dan degradasi yang disebabkan oleh adanya gugus
metilen aktif pada senyawa tersebut. Reaksi tersebut sangat dipengaruhi oleh pH
lingkungannya (Tonnesen dan Karlsen, 1985a).
Kurkumin di dalam larutan mengalami tautomerisasi menjadi bentuk
keto-enol bergantung pada pelarut yang digunakan. Sembilan puluh lima persen
berada dalam bentuk enol (Stankovic, 2004).
Gambar 4. Tautomerisasi bentuk keto-enol senyawa kurkuminoid (Stankovic, 2004)
Kinetika reaksi degradasi hidrolisis dari senyawa cis-trans (Gambar 3)
terjadi pada rentang pH 1-11 (Tonnesen dan Karlsen, 1985a). Pada pH <1,
diferuloilmetan pada larutan berair berwarna merah yang diindikasikan terjadi
protonasi dengan membentuk (H4A+). Pada pH 1-7, sebagian besar
diferuloilmetan berada dalam bentuk netral (H3A). Pada pH ini kelarutannya
dalam air sangat rendah dan larutan berwarna kuning. Pada pH>7,5 warna
berubah menjadi merah. Nilai pKa untuk disosiasi 3 proton asam pada senyawa
kurkumin (bentuk H2A-, HA2-, dan A3-) secara berturut-turut adalah 7,8;8,5; dan
9,0 (Stankovic, 2004).
13
OHO
OCH3
OH
H3CO
HO
OHOH
OCH3
O
H3CO
HO H
OHO
OCH3
O
H3CO
HO
OHO
OCH3
O
H3CO
O
OO
OCH3
O
H3CO
O
H4A+
H3A
H2A-
HA2-
A3-
Gambar 5. Strukutur kimia kurkumin dalam berbagai pH (Stankovic, 2004)
Prinsipnya kurkumin relatif stabil pada pH asam, tetapi akan
terdekomposisi secara cepat pada pH di atas netral. Pada penelitian degradasi
kimia pada pH basa terhadap senyawa kurkumin (Tonnesen dan Karlsen, 1985),
produk dekomposisi pada pH 7-10 ditentukan secara HPLC. Produk degradasi
terbentuk setelah 5 menit dan kromatogram diperoleh setelah 28 jam pada pH 8,5
menunjukkan degradasi alkali sehingga terbentuk asam ferulat dan feruloilmetan.
Feruloilmetan secara cepat membentuk produk kondensasi warna (kuning sampai
kuning kecoklatan). Produk degradasi yang terbentuk dari hidrolisis feruloilmetan
14
adalah vanilin dan aseton serta jumlahnya meningkat seiring bertambahnya waktu
(Stankovic, 2004).
Gambar 6. Produk degradasi kurkumin pada pH alkali (Stankovic, 2004)
Penelitian lain (Wang dkk, 1997) kurkumin diinkubasi pada 0,1 M buffer
fosfat; pH 7,2 pada 37 ºC; dan sejumlah 90% terdekomposisi tidak kurang dari 30
menit. Trans-6-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5-hexenal diprediksi
sebagai produk degradasi terbanyak sedang vanilin, asam ferulat, dan
feruloilmetan diidentifikasi sebagai produk degradasi minor. Pada bentuk netral,
kurkumin tidak stabil pada larutan berair dengan pH >7 (Stankovic, 2004).
15
O
O O
O
HO
Gambar 7. Struktur trans-6-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5-hexenal(Stankovic,2004)
Instabilitas kurkumin juga dipengaruhi oleh adanya cahaya yang
menyebabkan terjadinya degradasi fotokimia senyawa tersebut (Van der Goot,
1997). Prinsipnya, kurkumin tidak stabil terhadap cahaya, terutama dalam bentuk
larutan. Setelah mengalami foto-iradiasi, akan terdeteksi produk siklisasi, sama
halnya dengan produk dekomposisi asam vanilat, vanilin, dan asam ferulat
(Sasaki, Sat, Abe, Sugimoto, dan Maitani, 1998).
Gambar 8. Produk fotodegradasi kurkumin (Stankovic, 2004)
16
E. Kromatografi Lapis Tipis
1. Kromatografi lapis tipis (KLT) secara umum
Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan metode pemisahan
komponen-komponen berdasarkan perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam
di bawah gerakan pelarut pengembang atau pelarut pengembang campur (Mulja
dan Suharman, 1995). KLT dapat dipakai untuk dua tujuan, yaitu sebagai metode
untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, dan preparatif. Tujuan kedua yaitu
dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga (Gritter, Bobit, dan
Schwarting, 1991).
2. Jenis fase diam dan fase gerak KLT
Fase diam yang banyak terpilih adalah silika gel. Silika gel G adalah
silika gel yang dicampur perekat CaSO4 lebih kurang 13% (Jork, Funk, Fischer,
dan Wimmer, 1990). Fase gerak dalam mediun KLT merupakan medium angkut
dan terdiri atas satu atau beberapa bahan pelarut yang bergerak di dalam fase
diam, karena ada gaya kapiler (Stahl, 1985). Berikut ini merupakan daftar fase
gerak beserta indeks polaritasnya:
Tabel I. Daftar fase gerak
EluotropicValue (e°)(on silica)
PolarityIndex(p’)
Viscosity(cP, 25°C)
Density(g/ml)
RefractiveIndex(25°)
BoilingPoint(°C)
Heksana 0.00 0.06 0.30 0.659 1.372 69Kloroform 0.31 4.40 0.53 1.483 1.443 61
AsamAsetatGlasial
>0.73 6.20 1.10 1.049 1.370 118
Metanol 0.73 6.60 0.54 0.791 1.326 65(Stahl, 1985)
17
3. Migrasi dan retensi solut
Kecepatan migrasi solut melalui fase diam ditentukan oleh perbandingan
distribusinya (D), dan besarnya D ditentukan oleh afinitas relatif solut pada pada
kedua fase (fase diam dan fase gerak). Dalam konteks kromatografi, nilai D
didefinisikan sebagai perbandingan konsentrasi solut dalam fase diam (Cs) dan
dalam fase gerak (Cm) (Gandjar dan Rohman, 2007).
(1)
Jadi semakin besar nilai D maka migrasi solut semakin lambat; dan
semakin kecil nilai D maka migrasi solut semakin cepat. Solut akan terelusi
menurut perbandingan distribusinya. Jika perbedaan perbandingan distribusi solut
cukup besar maka campuran-campuran solut akan mudah dan cepat dipisahkan
(Gandjar dan Rohman, 2007).
4. Pemisahan kromatografi lapis tipis
Pemisahan kromatografi planar ini pada umumnya dihentikan sebelum
semua fase gerak melewati seluruh permukaan fase diam. Solut pada kedua
kromatografi ini dikarakterisasi dengan jarak migrasi solut terhadap jarak ujung
fase geraknya. Faktor retardasi solut (Rf) didefinisikan sebagai:
(2)
(Gandjar dan Rohman, 2007)
18
Gambaran untuk menghitung Rf terdapat dalam gambar berikut ini:
Gambar 9. Cara penentuan harga Rf (Gandjar dan Rohman, 2007)
Nilai Rf dihitung dengan menggunakan perbandingan sebagaimana dalam
persamaan berikut:
(3)
(Gandjar dan Rohman, 2007)
Nilai maksimum Rf adalah 1 dan ini dicapai ketika solut mempunyai
perbandingan distribusi (D) dan faktor retensi (k’) sama dengan 0 yang berarti
solut bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak. Nilai minimum
Rf adalah 0 dan ini teramati jika solut tertahan pada posisi titik awal di
permukaan fase diam (Gandjar dan Rohman, 2007).
5. Proses sorpsi – adsorpsi
Sorpsi merupakan proses pemindahan solut dari fase gerak ke fase diam,
sementara itu proses sebaliknya (pemindahan solut dari fase diam ke fase gerak)
disebut dengan desorpsi. Kedua proses ini (sorpsi dan desorpsi) terjadi secara
19
terus menerus selama pemisahan kromatografi karenanya sistem kromatografi
berada dalam keadaan kesetimbangan dinamis. Solut akan terdistribusi diantara
dua fase yang bersesuaian dengan perbandingan distribusinya (D) untuk menjaga
keadaan kesetimbangan ini (Gandjar dan Rohman, 2007).
Adsorpsi merupakan penyerapan pada permukaannya saja. Adsorpsi pada
permukaan melibatkan interaksi-interaksi elektrostatik seperti ikatan hidrogen,
penarikan dipol-dipol, dan penarikan yang diinduksi oleh dipol. Solut akan
bersaing dengan fase gerak untuk berikatan dengan sisi-sisi polar pada permukaan
adsorben (Skoog, Holler, dan Nieman, 1998).
Silika gel memiliki permukaan yang terdiri atas gugus Si-O-Si dan gugus
silanol (Si-OH). Gugus silanol bersifat sedikit asam dan polar karenanya gugus ini
mampu membentuk ikatan hidrogen dengan solut-solut yang agak polar sampai
sangat polar (Gandjar dan Rohman, 2007).
Gambar 10. Interaksi antara analit dengan fase diam silika gel (Skoog, dkk, 1998)
Adanya air dari atmosfer yang diserap oleh permukaan silika gel mampu
mendeaktifkan permukaan silika gel karena air akan menutup sisi aktif silika gel.
Hal seperti ini dapat diatasi dengan memanaskan pada suhu 105ºC (Gandjar dan
Rohman, 2007).
20
Semakin polar solut maka semakin tertahan kuat ke dalam adsorben
silika gel ini. Solut-solut non polar tidak mempunyai afinitas atau mempunyai
sedikit afinitas terhadap adsorben polar, sementara solut-solut yang terpolarisasi
memiliki afinitas yang kecil terhadap adsorben polar disebabkan adanya interaksi
dipol atau interaksi-interaksi yang diinduksi oleh dipol. Solut-solut polar,
terutama yang mampu membentuk ikatan hidrogen, akan terikat kuat pada
adsorben karenanya butuh fase gerak yang cukup polar untuk mengelusinya.
Berikut adalah urutan polaritas solut-solut organik: alkana < alkena < aromatis <
eter < ester < keton dan aldehid < tiol < amin dan amida < alkohol < fenol <
asam-asam organik (Gandjar dan Rohman, 2007).
Adsorbsi solut oleh fase diam atau oleh adsorben sangat tergantung pada:
(a) struktur kimia solut atau adanya gugus aktif tertentu yang berinteraksi dengan
adsorben; (b) ukuran partikel adsorben. Semakin kecil ukuran partikel adsorben,
maka luas permukaannya semakin luas sehingga interaksinya dengan solut juga
semakin luas; (c) kelarutan solut dalam fase gerak. Solut yang semakin mudah
larut dalam fase gerak akan semakin mudah lepas dari fase diam (Gandjar dan
Rohman, 2007).
Kedudukan gugus fungsional tertentu dalam suatu senyawa juga
menentukan interaksinya. Sorpsi adsorpsi ini umumnya terjadi pada kromatografi
padat cair sebagaimana dalam kromatografi lapis tipis dan pada kromatografi gas-
padat (Gandjar dan Rohman, 2007).
21
6. Profil puncak dan pelebaran puncak
Selama pemisahan kromatografi, solut individual akan membentuk
profil konsentrasi yang simetri atau dikenal juga dengan profil Gaussian dalam
arah aliran fase gerak. Profil, dikenal juga dengan puncak atau pita, secara
perlahan-lahan akan melebar dan sering juga membentuk profil yang asimetrik
karena solut-solut melanjutkan migrasinya ke fase diam. Prinsip yang mendasari
alasan-alasan bentuk puncak dan pelebaran puncak dapat diringkas sebagai
berikut:
a. Sorpsi dan desorpsi solut yang terus menerus antara fase diam dan fase gerak,
secara inheren akan menghasilkan profil konsentrasi Gaussian yang akan
melebar karena solut bermigrasi lebih lanjut.
b. Perjalanan solut melalui partikel fase diam sedikit berbeda, sehingga
menyebabkan profil konsentrasinya melebar secara simetris. Keadaan seperti
ini disebut dengan pengaruh lintasan ganda (multiple-path effect).
c. Spesies solut menyebar ke segala arah dengan difusi ketika berada di dalam
fase gerak. Difusi terjadi dengan arah yang sama dan berlawanan dengan
aliran fase gerak (longitudinal or axial diffusion) karenanya akan
berkontribusi terjadinya pelebaran pita secara simetris.
d. Sorpsi dan desorpsi, atau transfer massa antara fase diam dan fase gerak,
bukanlah suatu proses yang instan dan terkadang proses tersebut terjadi secara
lambat. Karena fase gerak berjalan secara terus-menerus, maka distribusi
kesetimbangan solut yang sebenarnya tidak pernah terjadi . Profil konsentrasi
dalam fase diam tertinggal sedikit dibanding profil konsentrasi dalam fase
22
gerak yang akan mengakibatkan adanya pelebaran puncak lebih lanjut.
Desorpsi yang lambat dapat juga menghasilkan puncak yang asimetris atau
condong.
e. Adanya variasi rasio distribusi solut dengan total konsentrasinya juga berperan
terjadinya puncak yang asimetris atau condong (Gandjar dan Rohman, 2007).
Gambar 11. Keadaan simetris dan pelebaran puncak kromatogram (Gandjar dan Rohman,2007)
Gambar 12. Ilustrasi 3 prinsip utama yang menggambarkan puncak; (a). Pengaruh lintasanganda (multiple-path effect); (b). Pengaruh difusi longitudinal; (c). Pengaruh transfer massa
(Gandjar dan Rohman, 2007)
23
7. Puncak asimetri
Profil konsentrasi solut yang bermigrasi akan simetris jika rasio distribusi
solut (D) konstan selama kisaran konsentrasi keseluruhan puncak, sebagaimana
ditunjukkan oleh isoterm sorpsi yang linier yang merupakan plot konsentrasi solut
dalam fase diam (Cs) terhadap konsentrasi solut dalam fase gerak (Cm).
Meskipun demikian, kurva isoterm akan berubah menjadi 2 jenis puncak asimetris
yakni membentuk puncak yang berekor (tailing) dan adanya puncak pendahulu
(fronting) jika ada perubahan rasio distribusi solut kearah yang lebih besar
(Gandjar dan Rohman, 2007).
.
Gambar 13. Isoterm sorpsi serta profil-profil puncak yang dihasilkan. (a). Isoterm linier (b).Puncak tailing dan (c). Puncak fronting (Gandjar dan Rohman, 2007)
Adanya puncak asimetri dapat disebabkan oleh beberapa hal. Yang
pertama apabila ukuran sampel yang dianalisis terlalu besar. Yang kedua adalah
interaksi yang kuat antara solut dengan fase diam dapat menyebabkan solut sukar
terelusi sehingga dapat menyebabkan terbentuknya puncak yang mengekor.
Ketiga adalah adanya kontaminan dalam sampel yang dapat muncul terlebih
dahulu sehingga menimbulkan puncak mendahului (fronting) (Gandjar dan
Rohman, 2007).
24
8. Resolusi kromatogram
Resolusi didefinisikan sebagai perbedaan antara waktu retensi 2 puncak
yang saling berdekatan (Δz = z2 – z1) dibagi dengan rata-rata lebar puncak (W1 +
W2)/2 sebagaimana dalam ilustrasi dan persamaan berikut ini:
Gambar 14. Ilustrasi resolusi pada KLT: (a) kromatogram; (b) profil kromatografi masing-masing bercak (Sherma dan Fried, 1996)
(4)
(Sherma dan Fried, 1996)
Dari persamaan ini dapat diketahui bahwa yang sangat berpengaruh
terhadap pemisahan suatu komponen adalah: jarak masing-masing bercak solut
terhadap titik awal pengembanagn (z2 dan z1) serta lebar puncak masing-masing
komponen yang dipisahkan ((W1 dan W2) (Sherma dan Fried, 1996).
Nilai Rs harus mendekati atau lebih dari 1,5 karena akan memberikan
pemisahan puncak yang baik (base line resolution).
25
Gambar 15. Pengukuran resolusi 2 puncak yang berdekatan (Gandjar dan Rohman, 2007)
9. Analisis kualitatif
Ada 3 pendekatan untuk analisis kualitatif yaitu:
a. Perbandingan antara data retensi solut yang tidak diketahui dengan data
retensi baku yang sesuai (senyawa yang diketahui) pada kondisi yang sama.
Untuk kromatografi lapis tipis, faktor retardasi (Rf) baku dan senyawa yang
tidak diketahui dibandingkan dengan cara kromatografi secara bersama-sama
untuk menghilangkan adanya variasi kondisi bahan yang digunakan dan
laboratorium.
b. Dengan cara spiking. Spiking dilakukan dengan menambah sampel yang
mengandung senyawa tertentu yang akan diselidiki dengan senyawa baku
pada kondisi kromatografi yang sama. Hal ini dilakukan dengan cara: pertama,
dilakukan proses kromatografi sampel yang tidak di-spiking. Kedua, sampel
yang telah di-spiking dengan senyawa baku dilakukan proses kromatografi.
Jika pada puncak tertentu yang diduga mengandung senyawa yang diselidiki
terjadi peningkatan tinggi puncak/luas puncak setelah di-spiking dibandingkan
dengan tinggi puncak/luas puncak yang tidak dilakukan spiking maka dapat
diidentifikasi bahwa sampel mengandung senyawa yang kita selidiki.
26
c. Menggabungkan alat kromatografi dengan spektrometer massa. Cara ini
memberikan informasi data spektra solut dengan waktu retensi tertentu.
Spektra solut yang tidak diketahui dapat dibandingkan dengan spektra yang
ada di base komputer atau diinterpretasi sendiri. Cara ini dapat dilakukan
untuk solut yang belum ada baku murninya (Gandjar dan Rohman, 2007).
10. Analisis kuantitatif
Untuk menjamin kondisi yang digunakan dalam analisis kuantitatif stabil
dan reprodusibel, baik pada penyiapan sampel atau proses kromatografi, berikut
beberapa syarat yang harus dipenuhi dalam analisis kuantitatif: Analit (solut)
harus telah diketahui dan terpisah sempurna dari komponen-komponen lain dalam
kromatogram. Baku dengan kemurnian yang tinggi dan telah diketahui harus
tersedia. Prosedur kalibrasi yang sudah diketahui harus digunakan. Penyerap atau
adsorben yang digunakan murni, begitu pula pelarutnya (Skoog, dkk, 1998).
Pengukuran respon dapat dilakukan dengan mengukur tinggi puncak atau dengan
menghitung luas puncak (Gandjar dan Rohman, 2007).
Salah satu metode kuantitasi untuk analisis kuantitatif dengan
kromatografi dapat dilakukan dengan menggunakan metode baku eksternal.
Metode yang paling umum untuk menetapkan konsentrasi senyawa yang tidak
diketahui konsentrasinya dalam suatu sampel adalah dengan menggunakan plot
kalibrasi menggunakan baku eksternal. Larutan-larutan baku ini dirujuk sebagai
baku eksternal karena larutan-larutan baku ini disiapkan dan dianalisis secara
terpisah dari kromatogram senyawa tertentu yang ada dalam sampel. Sampel yang
mengandung senyawa tertentu yang akan ditetapkan konsentrasinya dan telah
27
disiapkan, selanjutnya diinjeksikan dan dianalisis dengan cara yang sama.
Konsentrasi senyawa tersebut ditentukan dengan metode grafik dari plot kalibrasi
atau secara numerik (Gandjar dan Rohman, 2007).
Larutan baku disiapkan dengan konsentrasi tertentu yang sudah
diketahui. Sejumlah tertentu volume larutan ini diinjeksikan dan dianalisis, lalu
respon detektor (luas puncak) diplotkan terhadap konsentrasi (Gandjar dan
Rohman, 2007).
11. Aplikasi penotolan sampel
Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh
hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit
mungkin. Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang lain, jika sampel yang
digunakan terlalu banyak maka akan menurunkan resolusi. Penotolan sampel yang
tidak tepat akan menyebabkan bercak yang menyebar dan puncak ganda.
Berdasarkan pada tujuan analisis, berbagai macam jumlah sampel telah
disarankan untuk digunakan dan diringkas pada tabel II.
Tabel II. Parameter-parameter aplikasi penotolan yang direkomendasikan
TujuanDiameter bercak
(mm)Konsentrasisampel (%)
Banyaknyasampel (μg)
Densitometri2 mm untuk
volume sampel 0,5μl
0,02-2
0,1-1 (untukKLT-KT
1-10(konvensional)
Identifikasi3 mm untuk
volume sampel 1μl0,1-1 1-20
Ujikemurnian
4 mm untukvolume sampel 2μl
5 100
(Gandjar dan Rohman, 2007)
28
F. Densitometri
Densitometri merupakan salah satu dari metode analisa KLT kuantitatif.
Penetapan kadar suatu senyawa dengan metode ini dilakukan dengan mengukur
kerapatan bercak senyawa yang dipisahkan dengan cara KLT. Syarat-syarat untuk
senyawa standar adalah murni, inert, dan stabil (Sastrohamidjojo, 1985).
Metode densitometri mempunyai cara kerja yang sederhana dan cepat.
Pada metode densitometri diperlukan adsorben dan fase gerak yang murni. Untuk
memperoleh hasil yang baik lazimnya digunakan adsorben siap pakai yang telah
mengalami pencucian (Gritter dkk, 1991).
Alat densitometri mempunyai sumber sinar yang bergerak di atas bercak
pemisahan pada lempeng kromatografi yang akan ditetapkan kadar komponennya.
Lazimnya lempeng itu digerakkan menyusuri berkas sinar yang berasal dari
sumber sinar tersebut(Sudjadi, 1988).
Teknik pengukuran dapat didasarkan atas pengukuran intensitas sinar
yang diserap (absorbansi), intensitas sinar yang dipantulkan (reflaktansi) atau
intensitas sinar yang difluoresensikan (fluoresensi). Teknik pengukuran
berdasarkan refleksi di mana sinar datang sebagian diserap dan sebagian lagi
dipantulkan.
29
Gambar 16. Pemantulan Sinar
(Mintarsih, 1990)
Sifat pemantulan ini akan menjadi sensitif dan selektif bila sinar yang
datang adalah monokromatis. Disini biasanya dipilih sinar pada panjang
gelombang yang diserap atau dipantulkan paling banyak oleh noda yang diteliti.
Banyaknya sinar yang direfleksikan akan ditangkap oleh suatu alat yang disebut
reflection photomultiplier yang akan diteruskan ke pencatat atau rekorder untuk
diubah menjadi suatu puncak atau kromatogram. Luas puncak atau tinggi puncak
sesuai dengan konsentrasi senyawa pada noda yang diukur kerapatannya
(Mintarsih, 1990).
Pada beberapa TLC scanner sudah dilengkapi alat pemproses data atau
mikro komputer, sehingga integrasi luas puncak atau tinggi puncak tersebut dapat
langsung direkam atau dicatat sebagai data sekaligus dengan kromatogramnya dan
dapat pula direkam dan dicatat langsung sebagai kadarnya, melalui teknik
pemprograman tertentu. Noda yang kecil dan intensif akan menghasilkan suatu
puncak yang sempit dan tajam, sebaliknya noda yang lebar dan kurang intensif
akan menghasilkan puncak yang lebar maupun tumpul (Mintarsih, 1990).
Penelusuran bercak dapat dilakukan secara horisontal maupun vertikal
(scanning horizontal atau scanning vertikal). Penelusuran bercak secara horisontal
30
dapat dilakukan satu per satu, atau apabila satu pelat bercak yang diperoleh
segaris semua maka dapat dilakukan penelusuran untuk semua bercak sekaligus.
Sedangkan cara penelusuran vertikal, hanya dapat dilakukan satu per satu
(Mintarsih, 1990).
Pada penelusuran bercak horisontal dengan penelusuran beberapa bercak
sekaligus hanya dapat dilakukan apabila bercak-bercak tersebut benar-benar
dalam satu baris. Cara ini akan mengalami kesulitan jika bercak yang sangat dekat
dengan bercak yang ditetapkan, karena ada kemungkinan bercak yang tidak
diinginkan ikut pula ditetapkan (Mintarsih, 1990).
Berdasarkan atas jalannya sinar, penelusuran dapat dilakukan dengan dua
cara yaitu penelusuran lurus dan penelusuran zig-zag (naik turun). Pada
penelusuran lurus, sinar yang mengenai bercak berjalan lurus dari kiri ke kanan,
sedangkan pada penelusuran zig-zag, sinar yang mengenai bercak berjalan zig-zag
dari kiri ke kanan. Besarnya jarak, naik turunnya sinar dapat diatur menurut
kebutuhan, yang diperhitungkan dengan besar kecilnya bercak, yang dalam
operasi alat dikenal sebagai lebar penelusuran (scan widht) (Mintarsih, 1990).
Penelusuran bercak akan mendapatkan hasil yang baik apabila dilakukan
pada panjang gelombang maksimum, karena perubahan konsentrasi pada bercak
sedikit saja sudah terdeteksi. Pengukuran dilakukan dengan menelusuri bercak
yang akan ditetapkan kadarnya pada kisaran panjang gelombang zat tersebut
(Mintarsih, 1990).
Pelat yang digunakan untuk KLT pada densitometri sebaiknya digunakan
pelat buatan pabrik, karena pada pelat buatan sendiri fase diamnya kurang
31
kompak sehingga akan mempengaruhi hasil penelusuran dengan densitometri,
yaitu berupa puncak yang lebar dan kasar. Puncak yang lebar disebabkan kurang
kompaknya fase diam, sedangkan puncak yang kasar disebabkan permukaan pelat
yang kurang rata (Mintarsih, 1990).
Pada umumnya tebal lapisan tipis pada lempeng yang digunakan adalah
0,20-0,25 mm maksimum 0,33 mm, untuk mengurangi efek hamburan sinar yang
disebabkan oleh fase diam terhadap linearitas hubungan serapan dan konsentrasi
dari senyawa yang diteliti. Hubungan antara serapan terhadap konsentrasi
dilinearkan dengan dasar teori Kubelka-Munk, menggunakan kurva kerja linear
yang telah diprogramkan oleh suatu mikro komputer. Kurva serapan konsentrasi
tersebut ditentukan oleh harga parameter hamburan yang disebabkan oleh fase
diam. Harga parameter hamburan tersebut tergantung ukuran dan distribusi
partikel fase diam pada lempeng KLT ( Supardjan, 1987).
Ada dua cara penetapan kadar dengan alat densitometer. Pertama, setiap
kali penetapan ditotolkan sediaan baku dari senyawa yang bersangkutan dan
dielusi bersama dalam satu lempeng, kemudian AUC (luas daerah di bawah kurva)
sampel dibandingkan dengan harga AUC zat baku. Yang kedua, dengan membuat
kurva baku hubungan antara jumlah zat baku dengan AUC. Kurva baku diperoleh
dengan membuat totolan zat baku pada pelat KLT dengan bermacam-macam
konsentrasi (minimal tiga macam konsentrasi). Bercak yang diperoleh dicari
AUCnya dengan alat densitometer. Dari kurva baku diperoleh persamaan y = bx +
a dimana x adalah banyaknya zat yang ditotolkan dan y adalah AUC (Supardjan,
1987).
32
G. Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis merupakan serangkaian prosedur yang
digunakan untuk membuktikan apakah suatu metode analisis yang digunakan
tersebut sesuai yang diharapkan dengan akurasi dan presisi yang memadai(United
States Pharmacopeial Convention, 1995).
1. Parameter validasi metode
a. Akurasi. Akurasi dapat diartikan sebagai kedekatan hasil analisis
yang diperoleh menggunakan metode analisis tertentu dengan nilai yang
sebenarnya. Hal tersebut diperoleh dengan cara membandingkan kadar terukur
dari sejumah tertentu senyawa standar yang sengaja ditambahkan ke dalam
sampel dengan jumlah tertentu pula. Harga perbandingan tersebut disebut
perolehan kembali (United States Pharmacopeial Convention, 1995).
Nilai perolehan kembali untuk bahan obat dengan kadar kecil biasanya
disepakati 90-110%, untuk kadar obat yang lebih besar 95-105%, akurasi untuk
bahan baku disepakati 98-102%, sedang untuk bioanalisis rentang akurasi 80-
120% masih bisa diterima (Mulja dan Suharman, 1995).
Kecermatan ditentukan dengan dua cara yaitu metode simulasi (spiked-
placebo recovery) atau metode penambahan baku (standard addition method).
Dalam metode penambahan baku, sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit
yang diperiksa ditambahkan ke dalam sampel dicampur dan dianalisis lagi. Selisih
kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya (hasil yang diharapkan).
Dalam kedua metode tersebut, persen peroleh kembali dinyatakan sebagai rasio
antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya. Persen perolehan
33
kembali dapat ditentukan dengan cara membuat sampel plasebo (eksepien obat,
cairan biologis) kemudian ditambah analit dengan konsentrasi tertentu (biasanya
80% sampai 120% dari kadar analit yang diperkirakan), kemudian dianalisis
dengan metode yang akan divalidasi. Tetapi bila tidak memungkinkan membuat
sampel plasebo karena matriksnya tidak diketahui seperti obat-obatan paten, atau
karena analitnya berupa suatu senyawa endogen misalnya metabolit sekunder
pada kultur kalus, maka dapat dipakai metode adisi (Harmita, 2004).
Metode adisi dapat dilakukan dengan menambahkan sejumlah analit
dengan konsentrasi tertentu pada sampel yang diperiksa, lalu dianalisis dengan
metode tersebut. Persen perolehan kembali ditentukan dengan menentukan berapa
persen analit yang ditambahkan tadi dapat ditemukan. Kriteria kecermatan sangat
tergantung kepada konsentrasi analit dalam matriks sampel dan pada keseksamaan
metode (RSD). Selisih kadar pada berbagai penentuan (Xd) harus 5% atau kurang
pada setiap konsentrasi analit pada mana prosedur dilakukan. Harga rata-rata
selisih secara statistik harus 1,5% atau kurang. Kriteria tersebut dinyatakan secara
matematik sebagai berikut:
(5)(Harmita, 2004)
34
Kadar analit dan perolehan kembali dalam metode penambahan baku
dapat dihitung sebagai berikut:
(6)(Harmita, 2004)
Pada metode penambahan baku, pengukuran blanko tidak diperlukan
lagi. Metode ini tidak dapat digunakan jika penambahan analit dapat mengganggu
pengukuran, misalnya analit yang ditambahkan menyebabkan kekurangan
pereaksi, mengubah pH atau kapasitas dapar, dan lain-lain. Kriteria kecermatan
dilakukan sama seperti pada metode simulasi (Harmita, 2004).
Pada percobaan penetapan kecermatan, sedikitnya lima sampel yang
mengandung analit dan plasebo yang harus disiapkan dengan kadar antara 50%
sampai 150% dari kandungan yang diharapkan. Persen perolehan kembali
seharusnya tidak melebihi nilai presisi RSD. Rentang kesalahan yang diijinkan
pada setiap konsentrasi analit pada matriks dapat dilihat pada tabel III:
35
Tabel III. Rentang kesalahan perolehan kembali yang diperbolehkan
Konsentrasi analit (%) UnitRata-rata perolehan kembali
(%)100 100 % 98-102≥ 10 10 % 98-102≥ 1 1 % 97-103≥ 0.1 0.1% 95-1050.01 100 ppm 90-107
0.001 10 ppm 90-1070.0001 1 ppm 80-110
0.00001 100 ppb 80-1100.000001 10 ppb 60-115
0.0000001 1 ppb 40-120
(Harmita, 2004)
b. Presisi. Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat
kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual
dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang
diambil dari campuran yang homogen (Harmita, 2004).
Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku
relatif (koefisien variasi). Suatu metode dikatakan memberikan presisi yang bagus
jika koefisien variasi (KV) < 2% (Mulja dan Suharman, 1995). Akan tetapi
kriteria ini sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa,
jumlah sampel, dan kondisi laboratorium. Dari penelitian dijumpai bahwa
koefisien variasi meningkat dengan menurunnya kadar analit yang dianalisis. Pada
kadar 1% atau lebih, standar deviasi relatif antara laboratorium adalah sekitar
2,5% ada pada satu per seribu adalah 5%. Pada kadar satu per sejuta (ppm)
RSDnya adalah 16%, dan pada kadar part per bilion (ppb) adalah 32%. Pada
metode yang sangat kritis, secara umum diterima bahwa RSD harus lebih dari 2%
(Harmita, 2004).
36
Untuk menetapkan presisi bahan campuran dan bahan sisa pada artikel
obat, formula berikut ini harus digunakan untuk menentukan metode ketertiruan
yang tepat (interlaboratorium) (Harmita, 2004).
RSD < 2 (1-0,5 log c) (7)
dan untuk keterulangan :
RSD < 2 (1-0,5 log c) x 0,67 (8)
c = konsentrasi analit sebagai fraksi desimal (contoh: 0,1% = 0,001)
Keseksamaan dapat dihitung dengan cara sebagai berikut: Hasil analisis adalah
x1, x2, x3, x4,.....................xn maka simpangan bakunya adalah
(9)
Simpangan baku relatif atau koefisien variasi (KV) adalah:
(10)
(Harmita, 2004)
Tabel IV. Kriteria yang diperbolehkan untuk presisi pada kadar analit yang berbeda
Konsentrasi analit (%) Unit Presisi (RSD) ( %)100 100 % 1,3≥ 10 10 % 2,7≥ 1 1 % 2,8≥ 0,1 0,1% 3,70,01 100 ppm 5,3
0,001 10 ppm 7,30,0001 1 ppm 11
0,00001 100 ppb 150,000001 10 ppb 21
0,0000001 1 ppb 30
(Yuwono dan Indrayatno, 2005)
c. Sensitivitas. LOD (Limit of Detection) merupakan konsentrasi
analit terkecil dalam sampel yang masih dapat dideteksi tetapi tidak secara
37
kuantitatif. Penentuan LOD dengan cara membandingkan respon dari pengukuran
analit terhadap respon blangko. Konsentrasi analit yang mampu memberikan
respon 2-3 kali respon blangko disebut LOD(United States Pharmacopeial
Convention, 1995). LOQ merupakan konsentrasi analit terkecil dalam sampel
yang masih dapat dianalisis dengan hasil penentuan kualitatif yang menuju
akurasi yang memadai. Penentuan LOQ pada metode instrumen dengan cara
membandingkan respon dari pengukuran analit terhadap respon blanko
konsentrasi analit yang mampu memberikan respon 10 kali respon blanko (United
States Pharmacopeial Convention, 1995).
d. Selektivitas. Selektivitas dapat diartikan sebagai kemampuan dari
suatu metode analisis untuk mengukur keberadaan analit dalam sampel secara
tepat (United States Pharmacopeial Convention, 1995). Jadi metode yang
digunakan hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan
adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas
seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias)
metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang
ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya,
dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan
lain yang ditambahkan (Harmita, 2004).
Selektivitas metode ditentukan dengan membandingkan hasil analisis
sampel yang mengandung cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing
lainnya atau pembawa plasebo dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan
bahan-bahan tadi. Penyimpangan hasil jika ada merupakan selisih dari hasil uji
38
keduanya. Jika cemaran dan hasil urai tidak dapat diidentifikasi atau tidak dapat
diperoleh, maka selektivitas dapat ditunjukkan dengan cara menganalisis sampel
yang mengandung cemaran atau hasil uji urai dengan metode yang hendak diuji
lalu dibandingkan dengan metode lain untuk pengujian kemurnian seperti
kromatografi, analisis kelarutan fase, dan Differential Scanning Calorimetry.
Derajat kesesuaian kedua hasil analisis tersebut merupakan ukuran selektivitas.
Pada metode analisis yang melibatkan kromatografi, selektivitas ditentukan
melalui perhitungan daya resolusinya (Rs) (Harmita, 2004).
e. Linearitas dan rentang. Linearitas adalah rentang kadar terendah
sampai kadar tertinggi yang ditentukan dengan metode analisis dan dihubungkan
dengan tanggap detektor sehingga memberikan harga koefisien relasi pada tabel
statistik (Mulja dan Suharman, 1995). Rentang adalah interval antara kadar
terendah sampai kadar tertinggi dari analit yang dapat diukur secara kuantitif
menggunakan metode analisis tertentu dan menghasilkan presisi dan keakuratan
yang mencukupi (United States Pharmacopeial Convention, 1995). Persyaratan
data linearitas yang bisa diterima jika memenuhi nilai koefisien korelasi (r)
>0,999 (Snyder, Kirkland, dan Glajch, 1997).
f. Ketidakpastian. Ketidakpastian metode merupakan tingkat
kebolehjadian dari hasil tes analisis pada sampel yang sama di bawah kondisi
variasi tes normal (United States Pharmacopeial Convention, 1995).
2. Kategori metode analisis
Kategori uji umum yang harus memenuhi validitas data yaitu kategori I,
II, dan III. Kategori I ini meliputi metode-metode analitik yang digunakan untuk
39
mengukur secara kuantitatif sejumlah besar komponen dari serbuk obat atau
senyawa aktif dalam sediaan obat jadi. Kategori II meliputi metode-metode
analitik yang digunakan untuk penentuan kemurnian dalam serbuk obat atau
penentuan senyawa degradasi dalam sediaan obat jadi. Kategori III meliputi
metode-metode analitik yang digunakan untuk penentuan sifat-sifat khusus seperti
kecepatan disolusi dan pelepasan obat. Parameter-parameter yang harus dipenuhi
pada masing-masing kategori dapat dilihat pada tabel V.
Tabel V. Kategori Analisis Kimia
Parameteranalitik
Kategori I Kategori II Kategori III
Uji kuantitatif Uji kualitatifAkurasiPresisiSpesifikasiLODLOQLinearitasRangeKetidakpastian
YaYaYa
TidakTidak
YaYaYa
YaYaYa
TidakYaYaYaYa
*YaYaYa
TidakTidak
*Ya
*Ya*****
Ya*Mungkin diperlukan, tergantung sifat uji spesifik yang dilakukan
(United States Pharmacopeial Convention,
1995).
H. Landasan Teori
Obat Herbal Terstandar adalah sediaan obat bahan alam yang telah lulus
uji praklinik dan bahan bakunya telah distandarisasi. Salah satu senyawa aktif
dominan yang biasa terdapat dalam sediaan Obat Herbal Terstandar adalah
kurkumin. Kurkumin memiliki stabilitas yang rendah dalam larutan dan
40
dipengaruhi oleh pH dan paparan cahaya. Kurkumin memiliki panjang gelombang
maksimum pada daerah panjang gelombang 425 nm dalam pelarut etanol.
KLT merupakan metode pemisahan komponen-komponen berdasarkan
perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan pelarut
pengembang atau pelarut pengembang campuran. Densitometri merupakan salah
satu dari metode analisa KLT kuantitatif untuk penetapan kadar suatu senyawa
dengan mengukur kerapatan bercak senyawa yang dipisahkan dengan cara KLT.
Validasi metode analisis adalah serangkaian prosedur yang digunakan
untuk membuktikan apakah suatu metode analisis yang digunakan tersebut sesuai
yang diharapkan dengan selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan presisi yang
memadai. Nilai selektivitas yang baik untuk metode KLT memiliki resolusi > 1,5.
Linearitas dan rentang yang baik ditunjukkan melalui nilai faktor korelasi (r)
>0,999. Nilai akurasi yang memadai untuk senyawa baku dengan kemurnian
100% adalah memiliki perolehan kembali 98-102%, sedangkan untuk analit dalam
matriks sampel pada kadar 100 ppm adalah 90-107%. Nilai presisi yang baik
untuk senyawa baku memiliki nilai KV < 2%, sedang untuk analit dalam matriks
sampel pada kadar 100 ppm adalah 5,3%.
I. Hipotesis
Validasi metode KLT-Densitometri pada penetapan kadar kurkumin
dalam sediaan kapsul lunak OHT “Rheumakur®” memenuhi parameter validasi
meliputi selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan presisi.
41
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian non eksperimental deskriptif
karena tidak ada manipulasi dan perlakuan terhadap fenomena yang diamati.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Klasifikasi variabel
a. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah sistem kromatografi yang
menghasilkan pemisahan paling optimum. Sistem kromatografi yang
digunakan adalah fase normal dengan fase diam silika gel G 60 dan fase gerak
kloroform:asam asetat glasial:heksana (85 : 10 : 5) v/v.
b. Variabel tergantung pada penelitian ini adalah parameter-parameter validasi
yaitu selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan presisi.
c. Variabel pengacau terkendali yang terdapat dalam penelitian ini adalah
paparan cahaya, kemurnian pelarut dan pH. Paparan cahaya diminimalkan
dengan menutup larutan dengan kertas aluminium dan pengerjaan dilakukan
di ruang gelap. Pelarut dan fase gerak yang digunakan seluruhnya berkualitas
pro analisis. Seluruh larutan diatur pada pH 4 dimana kurkumin tetap stabil
dalam pelarut metanol.
42
2. Definisi operasional
a. Kurkumin dalam sampel kapsul lunak OHT merupakan salah satu senyawa
kurkuminoid, terdapat bersama minyak atsiri yang berasal dari Curcumae
xanthorrizae Rhizoma yang disuspensikan oleh beeswax sehingga berbentuk
semi padat dalam sediaan kapsul lunak.
b. Kromatografi lapis tipis (KLT) fase normal yang digunakan adalah seperangkat
bejana kromatografi (CAMAG) dengan fase diam silika gel G 60 (E. Merck)
dan fase gerak kloroform : asam asetat glasial : heksana (85 : 10 : 5) v/v.
c. Kadar kurkumin dalam larutan sampel ditetapkan dengan satuan ppm
d. Parameter validasi metode analisis yang ditetapkan adalah selektivitas,
linearitas, rentang, akurasi, dan presisi.
C. Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah metanol p.a.
EMSURE® ACS, ISO, Reag. Ph Eur (E. Merck), kloroform p.a. EMSURE® ACS,
ISO, Reag. Ph Eur (E. Merck), heksana p.a. EMSURE® ACS (E. Merck), asam
asetat (glasial) 100% p.a. EMPARTA® ACS (E. Merck), lempeng KLT silika gel
G 60 (E. Merck), sampel kapsul lunak OHT Rheumakur®, dan kurkumin baku
(hasil sintesis Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt yang telah dikonfirmasi
strukturnya dengan metode spektroskopi 1H-NMR dan Mass Spectra, kurkumin
hasil sintesis tersebut memiliki titik lebur 181,2-182,4 °C).
43
D. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi neraca; neraca analitik
(OHAUS Carat Series PAJ 1003 dengan spesifikasi max 60/120g; d = 0,01/0,1 mg
;dan e = 1 mg); Densitometer (CAMAG TLC Scanner 3 CAT. No. 027.6485 SER.
No.160602); labu takar 5,0 mL; labu takar 10,0 mL; labu takar 50,0 mL, labu
takar 100,0 mL; cawan arloji; pipet mikro volume 0,1-2 μL; pipet mikro volume
0,5-5 mL; corong; flakon; pipet tetes; Bekker glass; sendok; pengaduk;
ultrasonikator Retsch tipe T460 (Schwing.1 PXE, FTZ-Nr. C-066/83 HF-Frequ. :
35 kHz); oven; dan bejana kromatografi (CAMAG).
E. Cara Penelitian
1. Pembuatan metanol pH 4
Metanol ditambahkan dengan asam asetat glasial dengan perbandingan
9:1 untuk setiap pembuatan larutan.
2. Pengaktifan silika Gel G 60
Lempeng silika gel G 60 dipanaskan di dalam oven pada suhu 105ºC
selama 1 jam sebelum digunakan.
3. Pembuatan dan penjenuhan fase gerak
Fase gerak dibuat dengan perbandingan kloroform:asam asetat
glasial:heksana sesuai hasil optimasi (85:10:5) v/v pada labu takar hingga 100,0
mL. Fase gerak dituang pada bejana kromatografi kemudian kertas saring
dimasukkan hingga menutup 2 sisi dinding bejana. Bejana ditutup rapat dan
dibiarkan hingga seluruh kertas saring terbasahi oleh fase gerak.
44
4. Penetapan panjang gelombang serapan maksimum
Lebih kurang 10,0 mg baku kurkumin ditimbang seksama, dilarutkan
dalam metanol pH 4 , kemudian dimasukkan ke dalam labu takar dan diencerkan
dengan metanol pH 4 hingga 10,0 mL (larutan induk 1000 ppm). Larutan induk
diencerkan dengan metanol pH 4 hingga diperoleh seri larutan baku yang
mengandung kurkumin 100; 300; dan 500 ppm. Pembuatan larutan baku
kurkumin direplikasi sebanyak 3 kali. Semua larutan baku harus terlindung dari
cahaya.
Seri larutan baku ditotolkan sebanyak 1,0 L pada lempeng silika gel G
60 kemudian segera dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah
dijenuhkan dengan campuran kloroform : asam asetat glasial : heksana (85:10:5)
v/v selama 15 menit. Pengembangan dilakukan setinggi 10 cm. Lempeng silika
gel G 60 segera dikeluarkan dan dikeringkan setelah pengembangan selesai.
Bercak seri larutan baku yang mengandung kurkumin 100; 300; dan 500
ppm diukur dengan densitometer pada panjang gelombang 400-500 nm. Panjang
gelombang maksimum ditentukan berdasarkan serapan maksimum yang
dihasilkan oleh bercak tersebut.
5. Penentuan kurva baku kurkumin
Lebih kurang 10,0 mg baku kurkumin ditimbang seksama, dilarutkan
dalam metanol pH 4 , kemudian dimasukkan ke dalam labu takar dan diencerkan
dengan metanol pH 4 hingga 10,0 mL (larutan induk 1000 ppm). Larutan induk
diencerkan dengan metanol pH 4 hingga diperoleh seri larutan baku yang
45
mengandung kurkumin 100; 180; 260; 340; 420 dan 500 ppm. Semua larutan
baku harus terlindung dari cahaya.
Seri larutan baku ditotolkan sebanyak 1,0 L pada lempeng silika gel G
60 kemudian segera dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah
dijenuhkan dengan campuran kloroform : asam asetat glasial : heksana (85:10:5)
v/v selama 15 menit. Pengembangan dilakukan setinggi 10 cm. Lempeng silika
gel G 60 segera dikeluarkan dan dikeringkan setelah pengembangan selesai.
Bercak seri larutan baku kurkumin diukur AUC-nya dengan densitometer
pada panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh. Puncak kromatogram
dan nilai AUC yang muncul diamati. Dengan metode regresi linear, nilai
konsentrasi (ppm) diplotkan terhadap nilai AUC masing-masing seri larutan baku
sehingga diperoleh persamaan y = bx + a dimana y merupakan nilai respon
(AUC), x merupakan konsentrasi senyawa baku (ppm), a adalah intersept, dan b
adalah slope. Pembuatan kurva baku direplikasi sebanyak 3 kali.
6. Penetapan perolehan kembali (recovery) dan koefisien variasi (KV) baku
kurkumin
Lebih kurang 10,0 mg baku kurkumin ditimbang seksama, dilarutkan
dalam metanol pH 4 , kemudian dimasukkan ke dalam labu takar dan diencerkan
dengan metanol pH 4 hingga 10,0 mL (larutan induk 1000 ppm). Larutan induk
diencerkan dengan metanol pH 4 hingga diperoleh seri larutan baku yang
mengandung kurkumin 100; 260; dan 500 ppm. Pembuatan larutan baku
direplikasi sebanyak 3 kali. Semua larutan baku harus terlindung dari cahaya.
46
Seri larutan baku ditotolkan sebanyak 1,0 L pada lempeng silika gel G
60 kemudian segera dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah
dijenuhkan dengan campuran kloroform : asam asetat glasial : heksana (85:10:5)
v/v selama 15 menit. Pengembangan dilakukan setinggi 10 cm. Lempeng silika
gel G 60 segera dikeluarkan dan dikeringkan setelah pengembangan selesai.
Tiga replikasi bercak seri larutan baku yang mengandung kurkumin 100;
260; dan 500 ppm diukur dengan densitometer pada panjang gelombang
maksimum yang telah diperoleh. Puncak kromatogram dan nilai AUC yang
muncul diamati. Kadar kurkumin dihitung dengan persamaan kurva baku yang
telah diperoleh. Masing-masing seri kadar dihitung nilai perolehan kembali dan
koefisien variasinya (KV).
7. Penentuan selektivitas kurkumin dalam sampel serta akurasi dan presisi
baku yang ditambahkan ke dalam sampel
Lebih kurang 10,0 mg baku kurkumin dilarutkan dalam metanol pH 4
hingga 10,0 mL (larutan A). Sejumlah lebih kurang 1000,0 mg sampel ditambah
metanol pH 4 sebanyak 40 mL (larutan B). Larutan B kemudian diultrasonikasi
selama 15 menit. Sampel dipastikan sudah larut seluruhnya. Kemudian larutan B
disentrifugasi selama 15 menit. Supernatan kemudian diambil seluruhnya dengan
pipet. Supernatan ditambah metanol pH 4 hingga 50,0 mL (larutan C).
Sejumlah 0,5 mL larutan A dimasukkan dalam labu takar 5 mL (masing-
masing 5 kali). Sejumlah 3,2 mL larutan C dimasukkan dalam labu takar yang
telah ditambahkan larutan A (masing-masing 5 kali). Masing-masing labu takar
47
ditambahkan metanol pH 4 hingga 5,0 mL(larutan D). Semua larutan harus
terlindung dari cahaya.
Sejumlah 3,2 mL larutan C dimasukkan dalam labu takar 5,0 mL
(masing-masing 5 kali). Masing-masing labu takar ditambahkan metanol pH 4
hingga 5,0 mL (larutan E). Semua larutan sampel harus terlindung dari cahaya.
Masing-masing larutan D dan E ditotolkan sebanyak 1,0 L pada
lempeng silika gel G 60 kemudian segera dikembangkan dalam bejana
kromatografi yang telah dijenuhkan dengan campuran kloroform : asam asetat
glasial : heksana (85:10:5) v/v selama 15 menit. Pengembangan dilakukan
setinggi 10 cm. Lempeng silika gel G 60 segera dikeluarkan dan dikeringkan
setelah pengembangan selesai. Bercak masing-masing larutan D dan E diukur
dengan densitometer pada panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh.
F. Analisis Hasil
Perhitungan kadar kurkumin dalam setiap larutan dilakukan dengan
memasukkan nilai AUC sebagai y pada persamaan kurva baku y = bx + a
sehingga diperoleh nilai x sebagai kadar dengan satuan ppm. Sedangkan
kesahihan metode ditentukan dengan parameter selektivitas, linearitas, rentang,
akurasi, dan presisi dengan rumus sebagai berikut:
1. Selektivitas
Selektivitas ditentukan melalui pengamatan terhadap profil kromatogram
sampel yang menunjukkan pemisahan analit kurkumin hingga baseline terhadap
senyawa lain. Selektivitas ditunjukkan melalui kesamaan nilai Rf puncak
48
kurkumin sampel dengan Rf puncak kurkumin baku. Selain itu, pemisahan yang
baik ditunjukkan dengan nilai resolusi (Rs) > 1,5. Berikut ini merupakan metode
perhitungan Rf dan Rs:
(11)
(12)
Z2 – z1 merupakan selisih antara nilai Rf maksimum kurkumin dengan
nilai Rf maksimum senyawa di dekatnya. W1 adalah jarak yang ditempuh senyawa
di dekat puncak kurkumin, sedangkan W2 adalah jarak yang ditempuh puncak
kurkumin.
2. Linearitas dan rentang
Nilai linearitas ditunjukkan melalui nilai koefisien korelasi (r) yang
diperoleh melalui penentuan kurva baku dengan metode regresi linear. Nilai r
yang baik adalah > 0,999. Rentang yang baik ditunjukkan melalui seberapa besar
rentang konsentrasi seri baku dari kadar paling rendah hingga paling tinggi yang
masih memiliki linearitas, akurasi, dan presisi yang baik.
3. Akurasi baku kurkumin
Akurasi baku kurkumin ditentukan melalui nilai perolehan kembali
(recovery). Metode memiliki akurasi bahan baku yang baik apabila memiliki nilai
perolehan kembali 98-102% (Mulja dan Suharman, 1995).
(13)
49
4. Presisi baku kurkumin
Presisi baku kurkumin ditentukan melalui nilai koefisien variasi (KV)
atau Coefficient Variation (CV). Metode dikatakan memenuhi presisi yang baik
apabila nilai koefisien variasinya < 2% (Mulja dan Suharman, 1995).
(14)
5. Akurasi baku kurkumin yang ditambahkan ke dalam matriks sampel
Akurasi baku kurkumin dalam matriks sampel ditentukan melalui nilai
perolehan kembali (recovery) kadar baku yang ditambahkan ke dalam sampel.
Metode memiliki akurasi bahan baku yang baik apabila memiliki nilai perolehan
kembali 90-107% pada kadar 100 ppm(Harmita, 2004).
(15)
CF merupakan kadar kurkumin yang terukur dalam larutan sampel yang
ditambah baku (larutan D). CA merupakan kadar kurkumin dalam larutan sampel
yang terukur (larutan E). C*A merupakan konsentrasi teoritis baku kurkumin yang
ditambahkan dalam volume pengenceran yang sama dengan larutan D dan E.
6. Presisi baku kurkumin yang ditambahkan ke dalam matriks sampel
Presisi baku kurkumin yang ditambahkan dalam matriks sampel
ditentukan melalui nilai koefisien variasi (KV) atau Coefficient Variation (CV).
Metode dikatakan memenuhi presisi yang baik apabila nilai koefisien variasinya <
5,3% pada kadar 100 ppm (Yuwono dan Indrayatno, 2005).
50
Kadar kurkumin baku yang ditambahkan (x) = kadar kurkumin larutan D – kadar
kurkumin larutan E
(16)
(17)
51
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah metode KLT-
Densitometri memenuhi parameter validasi yang ditetapkan. Metode yang
digunakan adalah KLT-Densitometri karena metode ini mampu memisahkan
senyawa dalam suatu campuran. Sampel yang dianalisis pada penelitian ini
merupakan Obat Herbal Terstandar yang dipastikan mengandung lebih dari satu
senyawa. Selain itu, metode KLT-Densitometri memiliki kelebihan yaitu dapat
digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif secara simultan. Penelitian ini
menggunakan KLT fase normal dengan fase diam silika gel G 60 dan fase gerak
kloroform : asam asetat glasial : heksana (85 : 10 : 5).
Pada penelitian optimasi metode telah dilakukan penentuan stabilitas
kurkumin dalam pelarut metanol pH 3, 4, dan 5. Penentuan pH dimana kurkumin
tetap stabil dilakukan dengan mengukur panjang gelombang serapan maksimum
baku kurkumin dengan metode spektrofotometri visibel. Pelarut yang digunakan
adalah metanol karena kurkumin larut dalam pelarut metanol dan sukar larut
dalam air (Windholz, 1981). Metanol ditambahkan asam asetat untuk mengatur
pH larutan. Hasil pengukuran menunjukkan bahwa stabilitas kurkumin pada pH 4
lebih baik karena panjang gelombang maksimum kurkumin stabil pada 432 nm.
Stabilitas kurkumin pada pH 3 dan 5 kurang baik karena panjang gelombang
maksimumnya tidak stabil dengan rentang 429 nm hingga 435 nm.
52
Kurkumin lebih stabil pada pH 4 karena kurkumin merupakan senyawa
yang bersifat asam lemah. Penambahan asam asetat glasial hingga pH 4 akan
menjaga kurkumin tetap dalam bentuk molekulnya sehingga kurkumin tetap stabil
dalam larutan. Pembuatan larutan baku maupun sampel dilakukan pada pH 4
dengan penambahan asam asetat glasial karena hasil menunjukkan kurkumin tetap
stabil pada pH 4.
A. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum
Penentuan panjang gelombang serapan maksimum bertujuan untuk
memperoleh besar area di bawah kurva (AUC) kurkumin yang paling maksimum.
Penentuan panjang gelombang serapan maksimum dilakukan dengan mengukur
kerapatan bercak dari larutan baku kurkumin kadar rendah (100 ppm), tengah
(300 ppm), dan tinggi (500 ppm) pada rentang panjang gelombang 400-500 nm.
Densitometer yang dipergunakan memiliki detektor visibel yang dapat
mengukur sinar yang dipantulkan oleh bercak suatu senyawa pada panjang
gelombang 380-800 nm. Untuk dapat diukur pada panjang gelombang tersebut,
senyawa yang dianalisis harus memiliki gugus kromofor dan auksokrom sehingga
energi eksitasi yang dibutuhkan kecil (Gandjar dan Rohman, 2007). Kedua gugus
ini bertanggungjawab terhadap penyerapan sinar radiasi elektromagnetik pada
kurkumin.
Pada struktur kimia kurkumin terdapat gugus kromofor yang berupa
ikatan rangkap yang memiliki elektron π. Elektron π akan mudah tereksitasi ke
tingkat yang lebih tinggi (π*) ketika dikenai sinar radiasi elektromagnetik. Sedang
53
gugus auksokrom merupakan gugus yang memiliki atom dengan elektron bebas.
Gugus auksokrom terikat secara langsung pada gugus kromofor. Pasangan
elektron bebas pada elektron O akan berinteraksi dengan elektron π pada gugus
kromofor. Pengikatan ini akan menyebabkan pergeseran panjang gelombang
maksimum dan intensitas serapan maksimum dari kurkumin ke panjang
gelombang yang lebih besar. Berikut ini merupakan gugus kromofor dan
auksokrom yang terdapat pada struktur kurkumin (Gambar 17).
Gambar 17. Gugus kromofor dan auksokrom pada struktur kurkumin
Gugus kromofor kurkumin yang panjang terdiri dari banyak ikatan π.
Energi yang dibutuhkan oleh ikatan π untuk mengalami eksitasi ke π* lebih
rendah daripada ikatan σ ke σ*, begitupula ikatan n pada atom O gugus
auksokrom dan gugus kromofor. Energi yang dibutuhkan untuk eksitasi
berbanding terbalik dengan panjang gelombang serapan suatu senyawa, oleh
karena itu kurkumin memiliki panjang gelombang maksimum yang besar yaitu
pada daerah tampak. Hal tersebut menjadi dasar pemilihan pengukuran panjang
gelombang maksimum kurkumin pada rentang 400-500 nm.
54
Gambar 18. Kromatogram panjang gelombang maksimum kurkumin
Chan, Lam, Lee, dan Zhang (2004) menyatakan bahwa pergeseran
panjang gelombang maksimum yang diperbolehkan untuk rentang panjang
gelombang visibel adalah 3 nm. Kesesuaian panjang gelombang serapan
maksimum kurkumin pada percobaan dengan panjang gelombang maksimum
kurkumin teoritis menunjukkan bahwa senyawa yang dianalisis tetap stabil (tabel
VI).
Tabel VI. Data pengukuran panjang gelombang serapan maksimum kurkumin
Panjang gelombang serapan maksimumSeri Kadar
Replikasi I Replikasi II Replikasi III
100 ppm 425 nm 425 nm 425 nm
300 ppm 425 nm 425 nm 425 nm
500 ppm 425 nm 425 nm 425 nm
55
Pengukuran panjang gelombang maksimum dilakukan terhadap bercak
kurkumin, sehingga yang terukur merupakan senyawa murni karena fase gerak
maupun pelarut telah menguap. Anggarwal (1995) menyatakan bahwa panjang
gelombang maksimum senyawa murni kurkumin adalah 425 nm. Hasil
pengukuran menunjukkan bahwa seluruh bercak larutan baku kurkumin memiliki
panjang gelombang maksimum 425 nm dan tidak terjadi pergeseran. Hal ini
menunjukkan bahwa kualitas baku dan stabilitas kurkumin dalam larutan masih
baik.
Hasil pengukuran panjang gelombang maksimum pada rentang panjang
gelombang ultraviolet hingga visibel, hanya terdapat satu puncak saja. Profil
tersebut menunjukkan bahwa senyawa baku kurkumin memiliki kemurnian yang
tinggi dan tidak mengandung senyawa lain maupun produk degradasinya.
B. Pengamatan Profil Kromatogram Baku Kurkumin
Pengamatan profil kromatogram kurkumin baku dilakukan untuk
memastikan senyawa kurkumin dapat terelusi dengan baik. Parameter yang
digunakan dalam pengamatan profil kromatografi adalah nilai faktor retardasi (Rf)
dan warna bercak. Rf biasa digunakan dalam analisis kualitatif. Hal ini disebabkan
karena nilai Rf bersifat selektif untuk senyawa tertentu dalam kondisi tertentu
pula.
Besarnya nilai Rf sangat dipengaruhi oleh interaksi antara senyawa yang
dianalisis (kurkumin) dengan fase gerak dan fase diam yang digunakan. Besarnya
56
nilai Rf ini ditentukan pula oleh polaritas senyawa analit, fase gerak, dan fase
diam.
Gambar 19. Kromatogram baku kurkumin 260 ppm
Dari kromatogram (Gambar 19) dapat diketahui bahwa sistem fase gerak
pada KLT mampu mengelusi kurkumin dengan baik. Hal ini ditunjukkan dengan
nilai Rf baku kurkumin yaitu 0,85. Pada kromatogram baku kurkumin ini hanya
terdapat 1 buah peak saja. Hal ini menunjukkan bahwa baku kurkumin yang
digunakan memiliki kemurnian yang tinggi yaitu 100%.
O O
H3CO
HO
OCH3
OH
Gugus non polar
Gugus polar
Gambar 20. Gugus polar dan gugus non polar pada kurkumin
Struktur kurkumin memiliki gugus polar dan gugus non polar. Masing-
masing gugus ini dapat berinteraksi dengan komponen fase gerak dan fase diam.
Fase gerak yang digunakan adalah kloroform : asam asetat glasial : heksana (85 :
10 : 5) v/v dengan indeks polaritas 4,11 dan pH 4. Gugus polar kurkumin
57
berinteraksi dengan silika gel G 60 dan asam asetat glasial. Sedang gugus
nonpolar kurkumin berinteraksi dengan heksana. Gambar 21 dan 22 menunjukkan
interaksi kurkumin dengan fase diam dan fase gerak.
OO
O
O
O
O
Si
O
Si
O
H
O O
O O
Si
Si
O H
O
O
O Si
Si
O
H
O
O Si
O Si
O
O Si
O
O Si
O
O
H
H
O Si
O
SiO
O
H
O Si
O Si
O
O
H
Si
O
H
O
Si
H
CH3CH3
H
Gambar 21. Interaksi hidrogen antara kurkumin dengan fase diam
Interaksi gugus polar kurkumin dengan fase diam merupakan interaksi
hidrogen. Atom O pada silika gel, gugus metoksi dan fenol pada kurkumin
memiliki pasangan elektron bebas yang mampu berinteraksi dengan atom H yang
berada di dekatnya.
O
O
O
O
O O
H
interaksi van Der WaalsHeksana
interaksi Van der Waals kloroform
CH3
O
O
H
H
OH
O
CH3
interaksi hidrogenasam asetat glasial
interaksi van Der Waals Heksanainteraksi hidrogenasam asetat glasial
CH2
HCH3
H
O
OH2CH
interaksi hidrogenasam asetat glasial
H
O
O
CH3
Cl
H
Cl
Cl
Cl
H
Cl
Cl
Gambar 22. Interaksi kurkumin dengan fase gerak
58
Interaksi yang terjadi antara kurkumin dengan fase gerak adalah interaksi
Van der Waals antara atom C karbonil pada struktur kurkumin yang bersifat
parsial positif dan atom Cl pada kloroform yang bersifat parsial negatif. Interaksi
Van der Waals juga terjadi pada gugus non polar kurkumin dengan heksana.
Interaksi hidrogen terjadi antara atom O pada gugus karbonil, gugus metoksi, dan
gugus fenol kurkumin dengan asam asetat glasial.
Si
O
Si
O
H
O O
O O
Si
Si
O
H
O
Si
O
H
O
Si
H
O
O
H3C
Gambar 23. Interaksi antara asam asetat glasial dengan silika gel
Interaksi hidrogen yang terjadi antara kurkumin dengan silika, kurkumin
dengan asam asetat glasial serta asam asetat glasial dengan silika gel bersifat
kompetitif. Besarnya kekuatan masing-masing ikatan dipengaruhi oleh perbedaan
elektronegatifitas antar atom pada senyawa masing-masing.
Semakin polar komponen, maka akan lebih kuat diadsorpsi oleh silika
dan terelusi lebih lama. Polaritas fase gerak memiliki pengaruh utama dalam
pemisahan. Semakin polar fase gerak, semakin kompetitif untuk proses adsorpsi
sehingga analit lebih cepat terelusi. Asam asetat glasial bersifat lebih polar
daripada kurkumin sehingga interaksi asam asetat glasial dengan silika gel G lebih
kuat daripada interaksi kurkumin dengan silika gel G.
59
Kurkumin tidak larut dalam air sehingga dibutuhkan fase gerak yang
dapat melarutkan kurkumin. Kloroform dan heksana berfungsi untuk membantu
melarutkan kurkumin. Asam asetat glasial berfungsi untuk menjaga kurkumin
tetap stabil dan secara kompetitif berinteraksi dengan silika. Kekuatan adsorpsi
silika terhadap kurkumin lebih lemah dibandingkan dengan asam asetat glasial.
Asam asetat glasial bersifat lebih polar daripada kurkumin sehingga pada saat
bercak kurkumin dilewati oleh fase gerak yang mengandung asam asetat glasial,
interaksi hidrogen kurkumin dengan silika akan tergantikan oleh ikatan hidrogen
asam asetat dengan silika sehingga kurkumin berada dalam bentuk bebas.
Kurkumin dalam bentuk bebas akan lebih mudah berinteraksi dengan fase gerak
sehingga kurkumin lebih terbawa fase gerak. Hasil pengembangan menunjukkan
bahwa harga Rf kurkumin 0,85. Harga Rf yang tinggi menunjukkan bahwa fase
gerak dengan indeks polaritas 4,11 mampu mengelusi kurkumin dengan baik.
C. Preparasi Sampel dan Pengamatan Profil Kromatogram Kurkumin
dalam Sampel
Preparasi sampel dilakukan 2 tahap yaitu ultrasonikasi dan sentrifugasi.
Ultrasonikasi merupakan cara untuk memaksimalkan proses ekstraksi. Pemberian
getaran ultrasonik pada frekuensi 35 kHz akan melepas ikatan kurkumin dengan
matriks sampel sehingga akan mempermudah metanol untuk menarik kurkumin
dan melarutkannya. Sentrifugasi merupakan teknik pemisahan dengan prinsip
gaya sentrifugal. Partikel basis kapsul lunak yang tersuspensi dengan bobot
60
molekul lebih besar akan mengendap sehingga akan terpisah dengan kurkumin
yang telah larut dalam metanol.
Pengamatan profil kromatogram kurkumin dalam sampel bertujuan untuk
mengetahui dan memastikan bahwa kurkumin dalam sampel memiliki bercak
dengan nilai Rf dan warna yang sama dengan baku. Nilai Rf dan warna bercak
yang sama digunakan sebagai analisis kualitatif untuk mengetahui keberadaan
senyawa analit dalam sampel. Gambar 24 A merupakan data kromatogram sampel
dan 24 B merupakan kromatogram baku.
A
BGambar 24. Perbandingan kromatogram sampel (A) dan kromatogram baku kurkumin (B)
Tabel VII. Data nilai Rf baku dan sampel
RfReplikasiBaku kurkumin Kurkumin dalam sampel
I 0,85 0,84
II 0,83 0,84
III 0,85 0,84
IV 0,84 0,83
V 0,84 0,84
Rata-rata 0,84 0,84
61
Hasil kromatogram menunjukkan bahwa puncak kurkumin pada sampel
(puncak 3) memiliki nilai Rf yang sama dengan baku. Nilai Rf baku yaitu 0,84
sedangkan Rf sampel yaitu 0,84. Bercak kurkumin sampel memiliki warna yang
sama dengan bercak kurkumin baku yaitu kuning-oranye. Oleh karena itu, puncak
3 pada kromatogram sampel benar-benar merupakan puncak kurkumin.
Pada kromatogram sampel (Gambar 24 A) terlihat bahwa terjadi
pemisahan antara puncak kurkumin dengan puncak senyawa lain. Pemisahan
dapat terjadi karena setiap molekul memiliki keadaan kesetimbangan (equilibrium
state) yang berbeda dengan fase gerak serta fase diam. Keadaan setimbang
merupakan keadaan dimana analit berpindah dari keadaan bebas ke keadaan
teradsorpsi atau sebaliknya. Keadaan bebas yaitu seluruh analit terlarut dalam fase
gerak, sedangkan keadaan teradsorpsi yaitu analit tertahan pada permukaan fase
diam.
Gambar 25. Ilustrasi keadaan kesetimbangan pada pemisahan senyawa A (kurkumin)dengan senyawa lainnya
62
Keadaan setimbang dipengaruhi oleh polaritas dan ukuran molekul;
polaritas dari fase diam; dan polaritas fase gerak. Kurkumin (BM = 368,126)
bersifat tidak larut air. Puncak kurkumin terelusi lebih jauh daripada dua senyawa
lain karena bersifat lebih non polar. Semakin non polar analit, adsorpsi silika
terhadap analit akan lebih lemah sehingga analit akan terelusi lebih jauh.
Polaritas silika sangat berpengaruh terhadap pemisahan kurkumin.
Selisih elektronegativitas silikon (1,8) dan elektronegativitas oksigen (3,5) yaitu
1,7 membuat fase diam bersifat polar. Maka, semakin polar molekul yang akan
dipisahkan, semakin kuat gaya tarik fase diam terhadap molekul tersebut.
Kurkumin dapat terpisah dengan dua senyawa yang lain karena senyawa yang lain
tertahan pada silika. Senyawa yang lain lebih kuat teradsorpsi oleh silika karena
memiliki polaritas yang tidak sesuai dengan fase gerak.
Hukum “like-dissolve-like” dapat diaplikasikan pada pemisahan
kurkumin dengan sistem KLT. Molekul yang tidak larut air seperti kurkumin akan
memiliki afinitas yang lebih rendah terhadap fase diam dan akan terbawa pada
fase gerak yang bersifat nonpolar lebih lama. Polaritas fase gerak kloroform :
asam asetat glasial : heksana ( 85 : 10 : 5) v/v mendekati kepolaran kurkumin
sehingga mampu mengelusi analit dengan baik sehingga dapat terpisah dengan
senyawa lain yang memiliki polaritas yang berbeda. Ilustrasi yang
menggambarkan pemisahan kurkumin dengan salah satu senyawa lain dalam
sampel dapat dilihat pada gambar 25.
63
D. Pembuatan Kurva Baku
Pembuatan kurva baku dilakukan untuk memperoleh persamaan regresi
linear. Pembuatan persamaan regresi linear dilakukan dengan mengukur AUC
beberapa bercak kurkumin dengan konsentrasi yang berbeda. Pada penelitian ini,
digunakan 6 seri konsentrasi kurkumin dari konsentrasi 100 hingga 500 ppm.
Pemilihan konsentrasi ini didasarkan pada pengamatan terhadap respon detektor
dan respon analit. Konsentrasi baku yang baik memiliki respon detektor yang
tidak dipengaruhi oleh noise (peak pengotor) dan dalam rentang 50-150 % respon
analit.
Tabel VIII. Data kurva baku kurkumin
ReplikasiKadar
kurkumin(ppm)
AUC AUC/50Perhitunganregresi linear
100 5537,6 110,752180 8894,3 177,886260 13097,4 261,948340 17220,8 344,416420 20902,0 418,04
I
500 24813,5 496,27
A= 8,9963B= 0,9752r= 0,9996α= 44,28ºy = 0,9752 x +8,9963
100 5871,6 117,432180 8134,9 162,689260 13011,2 260,224340 17132,2 342,644420 20613,8 412,276
II
500 25079,1 501,582
A= 4,6247B= 0,9828r= 0,9971α= 44,50ºy = 0,9828 x +4,6247
101 5932,8 118,656181,8 8488,7 169,774262,6 12945,1 258,902343,4 16880,4 337,608424,2 21156,3 423,126
III
505 24712,4 494,248
A= 9,3083B= 0,9607r= 0,9981α= 43,85ºy = 0,9607 x +9,3083
Kurva baku menunjukkan korelasi antara kenaikan kadar dengan
kenaikan respon yang berupa AUC. Dengan meningkatnya kadar maka AUC yang
64
terukur akan meningkat sebanding dengan peningkatan kadar sehingga hubungan
yang terbentuk merupakan hubungan yang proporsional. Hubungan yang
proporsional dipastikan memiliki korelasi yang baik.
Korelasi yang baik antara konsentrasi dan nilai AUC ditunjukkan dengan
nilai koefisien korelasi. Koefisien korelasi yang baik yaitu >0,999 (Snyder, dkk,
1997). Untuk mendapatkan koefisien korelasi yang terbaik, setiap seri konsentrasi
dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
Kurva baku yang dibuat dengan mengeplotkan nilai konsentrasi dan nilai
AUC menghasilkan kurva baku dengan sudut kemiringan 88º. Kurva baku tersebut
tidak layak untuk ditampilkan karena hampir menyentuh sumbu Y. Hubungan
konsentrasi dengan AUC yang baik ditunjukkan dengan kemiringan garis sebesar
45º. Oleh karena itu, faktor koreksi diperlukan untuk dapat menghasilkan segi
sensitivitas yang baik tersebut. Faktor koreksi yang digunakan yaitu 50 untuk
setiap perhitungan AUC.
Hasil pembuatan kurva baku dengan mengeplotkan nilai konsentrasi dan
AUC/50 menunjukkan bahwa kurva baku kurkumin replikasi I memiliki nilai r
yang memenuhi syarat yaitu sebesar 0,9996 dan kemiringan garis 44,28º. Oleh
karena itu, persamaan kurva baku replikasi I digunakan untuk perhitungan kadar
selanjutnya dan layak ditampilkan. Persamaan kurva baku tersebut yaitu y =
0,9752x + 8,9963.
65
Gambar 26. Hubungan antara konsentrasi kurkumin dengan AUC/50 (replikasi I)
E. Validasi Metode Penetapan Kadar Kurkumin
Validasi metode analisis dilakukan dalam penelitian ini karena bertujuan
untuk membuktikan bahwa metode KLT-densitometri untuk penetapan kadar
kurkumin memiliki validitas yang baik. Metode yang memiliki validitas yang
baik akan menghasilkan data yang terjamin realibilitas dan reprodusibilitasnya.
Metode dapat dikatakan valid apabila memenuhi syarat parameter-parameter yang
ditentukan berdasarkan pengujian yang dilakukan. Penelitian ini termasuk dalam
penelitian kategori I karena bertujuan untuk menganilisis senyawa aktif dalam
sampel dalam jumlah besar. Parameter-parameter yang harus dipenuhi pada
penelitian kategori I antara lain selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan
presisi.
1. Selektivitas
Selektivitas merupakan parameter yang menunjukkan bahwa metode
analisis yang digunakan mampu mengukur zat tertentu saja secara akurat dan
cermat walaupun dimungkinkan masih terdapat zat lain dalam matriks sampel.
Untuk mengetahui selektivitas metode KLT-densitometri, dilakukan pengamatan
66
terhadap profil kromatogram pemisahan sampel. Parameter selektivitas ditentukan
oleh nilai resolusi. Resolusi (Rs) merupakan parameter yang menunjukkan
seberapa besar senyawa yang dianalisis telah terpisah dengan senyawa yang lain.
Nilai Rs yang baik adalah lebih dari 1,5 sehingga senyawa yang dianalisis telah
terpisah secara sempurna dengan senyawa lain.
Pada penelitian ini, sampel mengandung senyawa kurkuminoid dan
minyak atsiri. Untuk dapat menetapkan kadar kurkumin, maka puncak kurkumin
harus terpisah dengan puncak-puncak senyawa lain.
Gambar 27. Nilai Rs puncak kurkumin sampel dan kesamaan Rf baku dengan puncakkurkumin pada sampel
67
Tabel IX. Resolusi puncak kurkumin dengan puncak senyawa 2
ReplikasiResolusi puncak kurkumin dengan
puncak senyawa 2I 2,1818II 2,4762III 2,1818IV 2,2727V 2,0870
Rata-rata 2,2399
Hasil penelitian menunjukkan nilai Rf kurkumin pada baku dan puncak
kurkumin pada sampel sama yaitu 0,84 dan 0,84 (Tabel VII). Rata-rata hasil
perhitungan resolusi antara puncak kurkumin dengan puncak senyawa 2 (Gambar
27) adalah 2,2399. Resolusi yang menunjukkan pemisahan yang baik adalah >
1,5. Hal ini menunjukkan bahwa kurkumin telah terpisah dengan senyawa 2
secara sempurna. Pemisahan antara puncak senyawa 2 dan kurkumin terjadi
secara sempurna karena respon garis menyentuh hingga baseline. Pemisahan yang
baik ini membuktikan bahwa metode KLT-Densitometri ini selektif untuk
menganalisis dan memisahkan kurkumin yang terdapat bersama dengan senyawa
lain. Dari hasil yang diperoleh, dapat disimpulkan bahwa metode KLT-
Densitometri untuk penetapan kadar kurkumin dengan fase gerak kloroform :
asam asetat glasial : heksana (85 : 10 :5) v/v memiliki selektivitas yang baik.
2. Linearitas dan rentang
Linearitas merupakan parameter yang ditunjukkan melalui besarnya
koefisien korelasi (r). Nilai r diperoleh melalui perhitungan kurva baku
menggunakan metode regresi linear. Metode dikatakan memiliki linearitas yang
baik apabila memiliki nilai r lebih besar dari 0,999 (Snyder dkk., 1997).
68
Kurva baku kurkumin yang memiliki linearitas yang baik ditunjukkan
pada kurva baku replikasi I dengan nilai 0,9996. Sedangkan untuk replikasi II dan
replikasi III berturut-turut adalah 0,9971 dan 0,9981. Metode KLT-Densitometri
memiliki linearitas yang baik untuk penetapan kadar kurkumin.
Rentang merupakan parameter yang menentukan pada rentang
konsentrasi baku kurkumin berapa, metode yang digunakan masih bisa diperoleh
hubungan korelasi yang baik (r > 0,999) antara konsentrasi dengan respon serta
memenuhi parameter akurasi dan presisi. Metode ini memiliki rentang yang baik
pada konsentrasi baku dengan konsentrasi 260 – 500 ppm.
3. Akurasi
Akurasi merupakan kesesuaian antara kadar yang terukur dengan kadar
yang sebenarnya. Besarnya nilai akurasi ditunjukkan melalui besarnya perolehan
kembali (recovery). Perolehan kembali ditentukan dengan cara mengukur
sedikitnya 3 seri konsentrasi dengan masing-masing 3 replikasi. Nilai perolehan
kembali yang baik pada senyawa baku adalah 98-102% (Harmita, 2004).
Tabel X. Hasil penentuan perolehan kembali (recovery) kurkumin baku
% recovery kurkuminLevel Kadar
Replikasi I Replikasi II Replikasi III Rata-rata
Kadar rendah 103,02% 107,42% 101,77% 103,02%Kadar sedang 98,96% 99,18% 99,69% 98,96%Kadar tinggi 98,70% 101,26% 100,36% 98,70%
Hasil penentuan perolehan kembali menunjukkan bahwa pada kadar
sedang (260 ppm) dan tinggi (500 ppm) memenuhi persyaratan nilai perolehan
kembali yang baik. Oleh karena itu penetapan kadar kurkumin dilakukan pada
69
rentang konsentrasi 260 hingga 500 ppm. Hasil penetuan perolehan kembali
ditunjukkan pada tabel X.
4. Presisi
Presisi merupakan ukuran seberapa besar keseksamaan dari suatu metode
analisis. Keseksamaan ini ditunjukkan melalui penentuan koefisien variasi (KV).
Nilai KV yang semakin kecil menunjukkan bahwa presisi dari metode analisis
yang dilakukan semakin baik. Harmita (2004), menyatakan bahwa metode analisis
untuk senyawa baku memenuhi persyaratan akurasi apabila memiliki KV kurang
dari 2%.
Tabel XI. Hasil penentuan KV kurkumin baku
Level kadar SD KVKadar rendah (100 ppm) 2,8416 2,72%Kadar tengah (260 ppm) 0,8810 0,34%Kadar tinggi (500 ppm) 3,9699 0,79%
Hasil penelitian menunjukkan bahwa nilai KV dari konsentrasi kurkumin
pada 260 dan 500 ppm memenuhi persyaratan KV yang baik. Oleh karena itu,
metode penetapan kadar kurkumin secara KLT-densitometri pada level kadar
tersebut memiliki presisi yang baik.
F. Penentuan Akurasi dan Presisi Baku Kurkumin dalam Sampel
Penentuan akurasi dan presisi baku kurkumin dalam sampel merupakan
tahap kedua dari validasi metode yang dilakukan. Percobaan ini bertujuan untuk
memastikan bahwa metode ini sesuai dan mampu memberikan hasil yang reliable
dan reprodusibel untuk sampel yang dianalisis. Selain itu penentuan akurasi dan
presisi baku kurkumin dalam sampel bertujuan untuk mengetahui bahwa puncak
70
kurkumin pada kromatogram sampel betul-betul merupakan puncak kurkumin.
Hal ini dibuktikan dengan penambahan baku kurkumin ke dalam sampel hanya
akan menambah tinggi puncak dan AUC dari puncak kurkumin saja (puncak 3
pada gambar 27) tanpa adanya penambahan AUC dan tinggi pada puncak yang
lainnya. Penentuan akurasi dan presisi baku dalam sampel juga bertujuan sebagai
pedoman seberapa besar pengambilan sampel ketika penetapan kadar agar masuk
dalam rentang daerah kurva baku yang memenuhi parameter validasi.
Perolehan kembali yang baik untuk analisis senyawa baku dalam matriks
sampel adalah 90-107% (Yuwono dan Indrayatno, 2005). Sedangkan untuk nilai
KV yang baik berdasarkan Yuwono dan Indrayatno (2005) adalah ≤ 5,3%.
Tabel XII. Perolehan kembali dan KV baku kurkumin dalam sampel
Replikasi
Kadarkurkumin
sampel(ppm)
Kadarkurkuminsampel +
baku (ppm)
Kadar bakukurkumin
dalamsampel
Perolehankembali
(%)KV
I 279,9853 379,9751 101,1670 101,17II 279,2368 382,9939 104,1858 104,19III 276,9542 381,3861 102,5780 102,58IV 280,2027 376,8003 97,9922 97,99V 277,6617 383,2216 104,4135 104,41
3,64%
Tabel XIII. Perbandingan AUC kurkumin dalam sampel dan kurkumin dalamsampel yang ditambah baku
AUC kurkumin dalam sampelAUC kurkumin dalam sampel
yang ditambah bakuReplikasi
PuncakI
PuncakII
Puncak III(kurkumin)
PuncakI
PuncakII
Puncak III(kurkumin)
I 1203,7 2807,5 14101,9 823,4 2647,7 18977,4II 830,4 2437,5 14064,4 684,8 2487,6 19124,6III 1233,7 2457,9 13954,1 955,7 1869,9 19046,2IV 985,5 2809,0 14112,5 773,4 2708,0 18822,6V 534,8 2458,8 13988,6 1050,7 2444,2 19135,7
71
Tabel XIV. Perbandingan tinggi puncak kurkumin dalam sampel dan kurkumindalam sampel yang ditambah baku
AU kurkumin dalam sampelAU kurkumin dalam sampel
yang ditambah bakuReplikasi
PuncakI
PuncakII
Puncak III(kurkumin)
PuncakI
PuncakII
Puncak III(kurkumin)
I 32,8 73,4 358,2 23,8 69,3 458,0II 23,8 69,2 355,9 21,9 65,8 465,7III 32,8 64,1 344,7 22,6 53,4 462,3IV 23,5 76,2 363,8 23,0 63,0 463,3V 25,3 65,7 370,0 30,2 75,0 485,8
Hasil pengukuran menunjukkan bahwa nilai KV dan besarnya perolehan
kembali memenuhi syarat akurasi dan presisi. Hal ini menunjukkan bahwa seluruh
baku kurkumin yang ditambahkan hanya terdeteksi pada puncak kurkumin saja
(puncak 3 pada gambar 27). Sedangkan puncak yang lain memiliki nilai AUC dan
tinggi puncak yang tidak berbeda setelah ditambahkan baku. Hal ini terlihat pada
tabel XIII dan XIV bahwa tidak terjadi peningkatan tinggi dan AUC pada senyawa
puncak 1 dan 2 (gambar 27 pada kromatogram sampel). Dari keseluruhan data
yang diperoleh, dapat diketahui bahwa metode KLT-Densitometri pada penetapan
kadar kurkumin dalam sampel kapsul lunak OHT “Rheumakur®” memenuhi
parameter validasi.
72
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Dari hasil penelitian yang telah diperoleh, dapat disimpulkan bahwa:
validasi metode KLT-Densitometri dengan instrumen yang digunakan adalah
CAMAC TLC Scanner 3 CAT. No. 027.6485 SER. No.160602, fase gerak
kloroform : asam asetat glasial : heksana ( 85 : 10 : 5) v/v, fase diam silika gel G
60, volume penotolan 1,0 μL, jarak pengembangan 10 cm, pada penetapan kadar
kurkumin dalam sediaan kapsul lunak OHT “Rheumakur®” memenuhi parameter-
parameter validasi yang meliputi selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan
presisi.
B. Saran
Perlu dilakukan penetapan kadar kurkumin terhadap sampel obat
tradisional Rheumakur® dengan menggunakan metode penelitian ini.
73
DAFTAR PUSTAKA
Aggarwal, B.B., 1995, Curcumin, Analogues, of Curcumin and Novel UsesThereof, http://www.thepowerhour.com/curcumin/Turmeric.pdf, diaksestanggal 20 Juli 2010.
Agnam, N., Samhoedi, H., Timmerman, H., Venie, U. A., Sugiyanto., Goot, H.,1995, The Relationship between Structure and Inhibition of LipoxygenaseActivity of Curcumin Derivates, International Symposium on CurcuminPharmacocheimistry (ISCP), Yogyakarta.
Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2004, Monografiekstrak Tumbuhan Obat Indonesia, Vol 1, Badan Pengawas Obat danMakanan Republik Indonesia, Jakarta, 51.
Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2005, StandarisasiEkstrak Tumbuhan Obat Indonesia, Salah Satu Tahapan Penting dalamPengembangan Obat Asli Indonesia, InfoPOM, 6(4), 1-5.
Chan, C.C., Lam, H., Lee, Y. C., Zhang, X-M., 2004, Analytical MethodValidation and Instrument Performance Verification, pp. 169, A John Wileyand Sons, Inc, Kanada.
Commandeur, J.N. dan Vermeulen, N.P., 1996, Cytotoxicity ang cytoprotectiveactivities of natural compounds : The case of curcumin, Xenobiotica 26, pp.667-680.
Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1977, Materia MedikaIndonesia, Jilid I, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 49-52, 147.
Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, FarmakopeIndonesia, Jilid IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2-4.
Gandjar, I.G., Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,Yogyakarta, 221-225.
Gritter, R.J., Bobit, J.M., Schwarting, A.E., 1991, Pengantar Kromatografi,diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, terbitan ke-2, 107-155, penerbitITB, Bandung.
Gupta, A.P., Gupta, M.M., Kumar, S., 1999, Simultaneous determination ofcurcuminoids in curcuma samples using high performance thin layerchromatography,http://203.190.147.121/bitstream/123456789/80/1/J_Journal_Liquid_Chromatography_Related_Technologies_22_1561.pdf , diakses tanggal 10 Februari2010.
74
Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya,Majalah Ilmu Kefarmasian, 1(3), 117-135.
Jork, Funk, Fischer, Wimmer, 1990, Thin-Layer Chromatography, volume 1a,Hellmut Jork-Weinheim; Basel (Zwitzerland); Cambridge; New York.
Kalim, H., 1996, Penyakit Sendi Degeneratif (Osteoarthritis), Buku Ajar IlmuPenyakit Dalam, Jakarta, 74-86.
Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 1990, Peraturan Menteri KesehatanRepublik Indonesia No.246/MENKES/PER/V/1990 tentang Izin UsahaIndustri Obat Tradisional dan Pendaftaran Obat Tradisional, DepartemenKesehatan Republik Indonesia, Jakarta.
Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 1994, Keputusan Menteri KesehatanRepublik Indonesia No.661/MENKES/SK/VII/1994 tentang Persyaratan ObatTradisional, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.
Kertia, N., Sudarsono, Imono, A.D., Mufrod, Catur., E., Rahardjo, P., dkk, 2005,Pengaruh pemberian kombinasi minyak atsiri temulawak dan ekstrak kunyitdibandingkan dengan piroksikam terhadap angka leukosit cairan sendipenderita dengan osteoarthritis lutut, Majalah Farmasi Indonesia, 16 (3),156-160.
Kohli, K., Ali J., Ansari M. J., dan Raheman Z., 2005, Curcumin : A NaturalAntiinflammatory Agent, Indian Journal of Pharmacology, New Delhi,Jarnia Hamdard University, pp. 141-142.
Martono, S., 1996, Penentuan kadar kurkumin secara kromatografi lapis tipis-densitometri, Buletin ISFI Yogyakarta, 2(4), 11-21.
Mintarsih, E.R.R., 1990, Penetapan Kadar Alkaloid Kinina dalam Akar, Batang,dan Daun Chinchona Succirubra Pavon et Klotzch dari Daerah Kaliurangsecara Spektrodensitometri (TLC-Scanner), Skripsi, Fakultas Farmasi, UGM,Yogyakarta.
Mulja, H.M., Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press,Surabaya, 6.
Naguib, Y., 2000, Soft Gel Capsules: An Elegant & Versatile Dosage Form,Supplement Industry Executive : The Business Magazine for DietarySupplement Industry Manufactures, East Brunswick.
Paramasivam, M., Aktar, W., Poi, R., Banerjee, H., Bandyopahyay, A., 2008,Occurrence of curcuminoids in Curcuma longa : A quality standardizationby HPTLC,http://www.banglajol.info/index.php/BJP/article/viewFile/833/913, diaksestanggal 10 Februari 2010.
75
Pothitirat, W., Gritsanapan, W., 2005, Quantitative Analysis of Curcumin,Demethoxycurcumin and Bisdemethoxycurcumin in the Crude CurcuminoidExtract from Curcuma longa in Thailand by TLC-Densitometry,http://www.bioponic.com/pdfs/TurmericAyurveda.pdf, diakses tanggal 10Februari 2010.
Rahardjo, P., 1994, Masalah dan Penanganan Osteoartritis, Konggres AhliRematologi Indonesia, Palembang.
Rukmana, R., 1994, Kunyit, Penerbit Kanisius, Yogyakarta, 2.
Sasaki, S.S., Sat, K., Abe, M., Sugimoto, N., & Maitani, T, 1998, Components ofturmeric oleoresin preparations and photo-stability of curcumin, Jpn. J. FoodChem., 5(1).
Sastrohamidjojo, H., 1985, Kromatografi, Edisi I, Liberty, Yogyakarta, 26-30.
Sherma, J., Fried, B., 1996, Handbook of Thin Layer Chromatography, MarcellDekker Inc., New York, pp. 56-57.
Skoog, D.A., Holler, F.J., & Nieman, T.A., 1998, Principles of InstrumentalAnalysis, 5th edition, Harcourt Brace College, Philadelphia, pp.329-351.
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., dan Glajch, K.L., 1997, Practical HPLC MethodDevelopment, 2nd Edition, 13, 690, 710, 723, John Wiley & Sons, Inc., NewYork.
Stahl, E., 1985, Drug Analysis by Chromatography and Microscopy,diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 3-7, Institut Teknologi Bandung,Bandung.
Sudjadi, 1988, Metode Pemisahan, Penerbit Kanisius, Yogyakarta, 75.
Supardjan, A.M., 1987, Pemisahan Tetrasiklin dan Hasil Uraiannya dalamSediaan Tetrasiklin Secara KLT-Densitometri, Laporan Penelitian LembagaPenelitian Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Supardjan, A.M., dan Meiyanto, E., 2002, Efek antiproliferatif pentagamavunon-0terhadap beberapa sel kanker, Laporan Penelitian Lembaga PenelitianUniversitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Stankovic, 2004, Curcumin : Chemical and Technical Assessment (CTA), JECFA61st edition, FAO, ftp://ftp.fao.org/es/esn/jecfa/cta/CTA_61_Curcumin.pdf,diakses tanggal 1 Desember 2010.
Timmerman, H., 1995, New perspective for anti-inflammatory drugs,International Symposium on Curcumin Pharmacochemistry (ISCP),Yogyakarta.
76
Tonnesen, H.H. & Karlsen, J., 1985, Studies of curcumin and curcuminoids: V.Alkaline degradation of curcumin, Z. Lebensm. Unters. Forsch. 180: 132-134.
Tonnesenn H.H., dan Karlsen, J., 1985a, Studies on curcumin and curcuminoids,VI: Kinetics of Curcumin Degradation in Aqueous Solution, Original Paper,Z. Lebensm. Unters. Fosch., pp. 402-404.
United States Pharmacopeial Convention, 1995, The United States Pharmacopeia,23th edition, United States Pharmacopeia Convention, Rockville, pp. 1982-1984.
Usia, T., 2010, Trend Penggunaan Obat Bahan Alam,http://www.isfinational.or.id/pt-isfi-penerbitan/123/433-trend-penggunaan-obat-bahan-alam.html, diakses tanggal 31 Maret 2010.
Van der Goot, H., 1997, The chemistry and qualitative structure-activityrelationships of curcumin, in Recent Development in CurcuminPharmacochemistry, Procedings of The International Symposium onCurcumin Pharmacochemistry (ISCP), Yogyakarta.
Wang, Y.J., Pan, M.H., Cheng, A.L., Lin, L.I., Ho, Y.S., Hsieh, C.Y., & Lin, J.K.,1997, Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of itsdegradation products, J. Pharm. Biomed. Anal., pp. 1867-1876.
Windholz, M., 1981, The Merck Index : An Encyclopedia of Chemicals and Drug,10th edition, Merck & Co., Inc., Rahmay, New York, pp. 2681.
Yuwono, M. and Indrayanto, G., 2005, Validation of Chromatographic Methodsof Analysis, Profile of Drugs Substances, Excipients, and RelatedMethodology, Elsevier Inc , 32.
77
LAMPIRAN
78
Lampiran 1. Sertifikat analisis baku kurkumin
79
Lampiran 2. Hasil uji pH stabilitas kurkumin
a. Panjang gelombang serapan maksimum larutan baku kurkumin 0,4 ppm
pada pH 4
b. Panjang gelombang serapan maksimum larutan baku kurkumin 1 ppm
pada pH 4
80
c. Panjang gelombang serapan maksimum larutan baku kurkumin 1,6 ppm
pada pH 4
Tabel hasil penentuan pH stabilitas kurkumin
Konsentrasi Repliaksi pH 3 pH 4 pH 5
I 425 nm 432 nm 432 nm
II 425 nm 432 nm 432 nm0,4 ppm
III 432 nm 432 nm 432 nm
I 432 nm 435 nm 435 nm
II 429 nm 435 nm 432 nm1 ppm
III 429 nm 433 nm 435 nm
I 432 nm 433 nm 429 nm
II 429 nm 432 nm 429 nm1,6 ppm
III 429 nm 432 nm 429 nm
81
Lampiran 3. Hasil kromatogram pengukuran panjang gelombang serapan
maksimum kurkumin
82
Lampiran 4. Sistem KLT-Densitometri yang digunakan
Sistem KLT-Densito yang digunakan pada penelitian ini adalah sebagaiberikut:
Stationary phasePlate size (X x Y) 7,0 x 13,0 cm dan 11,0 x 13,0 cmMaterial TLC plates silica gel GManufacturer E. MERCK KGaAPre-washing YesDrying device OvenTemperature 100ºCTime 60 MinutesCalibration parametersCalibration mode Single levelStatistics mode CVAvaluation mode Peak areaSample application-Nanomat / Manual deviceInstrument Graduated Disposable MicropipettesFirst application position X 10,0 mmApplication position Y 15,0 mmDistance between tracks 10,0 mmApplication volume 1,000 μlDevelopment – Glass tankChamber type Twin Trough Chamber 20x20 cmMobile phase Cloroform : Acetic Acid Glacial : Hexane
(85 : 10 : 5)Solvent front position 100,0 mmVolume 100,0 mLDrying device OvenTemperature 60ºCTime 5 MinutesDetection – CAMAG TLC Scanner 3Instrument CAMAG TLC Scanner 3
“Scanner3_160602” S/N 160602 (1. 14.28)Scan start pos. Y 15,0 mmScan end pos. Y 115,0 mmSlit dimensions 8,00 x 0,90 mm, MacroOptimize optical system LightScanning speed: 20 mm/sData resolution 100 μm/stepMeasurement TableWavelength 425Lamp D2 & WMeasurement Type RemissionMeasurement Mode AbsorptionOptical filter Second order
83
Detector mode AutomaticPM high voltage 312 VDetector propertiesY-position for 0 adjust 15,0 mmTrack # for 0 adjust 0Analog Offset 10%Sensitivity Automatic (27)IntegrationPropertiesData filtering Savitsky-Golay 7Baseline correction Lowest SlopePeak threshold min. slope 5Peak threshold min. height 10 AUPeak threshold min. area 50Peak threshold max. height 600 AUDisplay scaling 600
84
Contoh lampiran hasil analisis :
85
86
Lampiran 5. Kromatogram kurva baku kurkumin
a. Seri baku 1: 100 ppm
87
b. Seri baku 2: 180 ppm
c. Seri baku 3: 260 ppm
d. Seri baku 4: 340 ppm
88
e. Seri baku 5: 420 ppm
f. Seri baku 6: 500 ppm
Lampiran 6. Penimbangan baku dan contoh perhitungan kadar baku
a. Penimbangan baku kurkumin
Berat Replikasi I Replikasi II Replikasi IIIBerat Kertas 0,1345 gram 0,1256 gram 0,1447 gramBerat Kertas + Zat 0,1445 gram 0,1356 gram 0,1548 gramBerat Kertas + Sisa 0,1345 gram 0,1256 gram 0,1447 gramBerat Zat 0,0100 gram 0,0100 gram 0,0101 gram
b. Skema kerja singkat pembuatan seri larutan baku
Kurkumin baku 10 mg dilarutkan dalam methanol p.a pH 4 hingga 10,0 mL
↓
89
Ambil 0,5;0,9;1,3;1,7;2,1; dan 2,5 mL dari larutan di atas, dan ditambahkan
methanol p.a pH 4 hingga 5,0 mL
c. Data AUC baku
Replikasi
Kadarkurkumin
(ppm)AUC AUC/50
Perhitunganregresi linier
100 5537,6 110,752180 8894,3 177,886260 13097,4 261,948340 17220,8 344,416420 20902,0 418,04
I
500 24813,5 496,27
A= 8,9963B= 0,9752r= 0,9996α= 44,28ºy = 0,9752 x +8,9963
100 5871,6 117,432180 8134,9 162,689260 13011,2 260,224340 17132,2 342,644420 20613,8 412,276
II
500 25079,1 501,582
A= 4,6247B= 0,9828r= 0,9971α= 44,50ºy = 0,9828 x +4,6247
101 5932,8 118,656181,8 8488,7 169,774262,6 12945,1 258,902343,4 16880,4 337,608424,2 21156,3 423,126
III
505 24712,4 494,248
A= 9,3083B= 0,9607r= 0,9981α= 43,85ºy = 0,9607 x +9,3083
d. Contoh perhitungan kadar baku (Replikasi I)
Kurkumin baku memiliki tingkat kemurnian 100%
Jumlah kurkumin = 10,0 mg x 100 = 10 mg
C1 V1 = C2 V2
Seri 1 : 1000 ppm x 0,5 mL = C2 x 5 mL
C2 = 100 ppm
NB : Perhitungan kadar seri baku lainnya dilakukan dengan cara yang
sama dengan menyesuaikan volume pengambilan larutan stok baku
kurkumin.
90
Lampiran 7. Kromatogram hasil validasi metode
a. Kromatogram Baku kurkumin kadar rendah replikasi I
b. Kromatogram Baku kurkumin kadar rendah replikasi II
c. Kromatogram Baku kurkumin kadar rendah replikasi III
91
d. Kromatogram Baku kurkumin kadar sedang replikasi I
e. Kromatogram Baku kurkumin kadar sedang replikasi II
f. Kromatogram Baku kurkumin kadar sedang replikasi III
92
g. Kromatogram Baku kurkumin kadar tinggi replikasi I
h. Kromatogram Baku kurkumin kadar tinggi replikasi II
i. Kromatogram Baku kurkumin kadar tinggi replikasi III
93
Lampiran 8. Data penimbangan dan contoh perhitungan recovery
1. Data penimbangan untuk penentuan perolehan kembali dan KV
Berat Replikasi I Replikasi II Replikasi III
Berat Kertas 0,1295 gram 0,1368 gram 0,1342 gramBerat Kertas + Zat 0,1306 gram 0,1378 gram 0,1352 gramBerat Kertas + Sisa 0,1295 gram 0,1368 gram 0,1342 gramBerat Zat 0,0101 gram 0,0100 gram 0,0100 gram
2. Data AUC kurkumin
AUC kurkumin
Replikasi I Replikasi II Replikasi III
Level Kadar
AUC AUC/50 AUC AUC/50 AUC AUC/50
Kadar rendah 5523,5 110,47 5687,4 113,748 5412,0 108,24Kadar sedang 13104,8 262,096 13023,4 260,468 13087,9 261,758Kadar tinggi 24752,5 495,05 25138,2 502,764 24916,4 498,328
3. Skema kerja singkat pembuatan seri larutan baku
Kurkumin baku 10 mg dilarutkan dalam methanol p.a pH 4 hingga 10,0 mL
↓
Ambil 0,5; 1,3; dan 2,5 mL dari larutan di atas, dan ditambahkan methanol p.a pH
4 hingga 5,0 mL
↓
Masing-masing larutan seri dibuat sebanyak 3 kali
Contoh perhitungan perolehan kembali kurkumin
Replikasi I:
Perhitungan kadar teoritis
Kadar kurkumin = 10,1 x 100% (tingkat kemurnian kurkumin
= 10,1 mg
94
Cstok = 10,1 mg/10,0 mL
= 1010 ppm
C1V1=C2V2
Kadar rendah : 1010 ppm x 0,5 mL = C2 x 5 mL
C2 = 101 ppm
Kadar tengah : 1010 ppm x 1,3 mL = C2 x 5 mL
C2 = 262,26 ppm
Kadar tinggi : 1010 ppm x 2,5 mL = C2 x 5 mL
C2 = 505 ppm
Perhitungan kadar terukur:
y = 0,9752 x + 8,9963
y= AUC kurkumin/50
Kadar rendah : 110,47 = 0,9752 x + 8,9963
x = 104,0542 ppm
Kadar tengah : 262,096 = 0,9752 x + 8,9963
x = 259,5362 ppm
Kadar tinggi : 495,05= 0,9752 x + 8,9963
x = 498,4144 ppm
Perhitungan perolehan kembali (recovery):
Recovery =
95
Replikasi I
Data recovery kurkumin
% recovery kurkuminLevel Kadar
Replikasi I Replikasi II Replikasi IIIKadar rendah 103,02% 107,42% 101,77%Kadar sedang 98,96% 99,18% 99,69%Kadar tinggi 98,70% 101,26% 100,36%
Lampiran 9. Contoh perhitungan SD dan CV
Tabel perhitungan SD dan CV
Levelkadar
Replikasi Kadar terukur Kadar rata-rata (x- )2
Replikasi I 104,0452 0,1294
Replikasi II 107,4156 9,0643
Replikasi III 101,7675
104,4049
6,9559
Kadarrendah
Jumlah 16,1496
Replikasi I 259,5362 0,4516
Replikasi II 257,8668 0,9948
Replikasi III 259,1896
258,8642
0,1059
Kadartengah
Jumlah 1,5523
Replikasi I 498,4144 14,1158
Replikasi II 506,3245 17,2474
Replikasi III 501,7757
502,1715
0,1567
Kadartinggi
Jumlah 31,5199
96
Contoh perhitungan SD dan CV pada level kadar rendah :
SD =
SD = 2,8416
CV =
CV = 2,72 %
Data hasil perhitungan SD dan CV
Level kadar SD CVKadar rendah 2,8416 2,72%Kadar tengah 0,8810 0,34%Kadar tinggi 3,9699 0,79%
Lampiran 10. Kromatogram penentuan akurasi dan presisi baku dalam
sampel
97
a. Kromatogram sampel replikasi I
b. Kromatogram sampel replikasi II
c. Kromatogram sampel replikasi III
98
d. Kromatogram sampel replikasi IV
e. Kromatogram sampel replikasi V
f. Kromatogram sampel yang ditambah baku kurkumin replikasi I
99
g. Kromatogram sampel yang ditambah baku kurkumin replikasi II
h. Kromatogram sampel yang ditambah baku kurkumin replikasi III
i. Kromatogram sampel yang ditambah baku kurkumin replikasi IV
100
j. Kromatogram sampel yang ditambah baku kurkumin replikasi V
Lampiran 11. Data perhitungan nilai resolusi antara puncak kurkumin
dengan puncak senyawa 2 dan contoh perhitungannya
Replikasi
Rfmaksimumpuncak 2
(z1)
Rfmaksimumkurkumin
(z2)
W1 puncak 2W
2kurkuminRs
I 0,60 0,84 0,10 0,12 2,1818
II 0,58 0,84 0,09 0,12 2,4762
III 0,60 0,84 0,10 0,12 2,1818IV 0,58 0,83 0,08 0,14 2,2727V 0,60 0,84 0,11 0,12 2,0870
Rata-rata 2,2399
101
Lampiran 11. Data dan contoh perhitungan nilai recovery dan CV baku dalam matriks sampel
Tabel penentuan recovery dan CV baku dalam matriks sampel
Larutan E AUC AUC/50 Kadar(ppm)
Selisih kadarlarutan D-rerata kadarlarutan E
RecoveryBaku (%)
SD danCV
Replikasi I 14101,9 282,038 279,9853 101,1670 101,17
Replikasi II 14065,4 281,308 279,2368 104,1858 104,19
Replikasi III 13954,1 279,082 276,9542 102,5780 102,58
Replikasi IV 14112,5 282,25 280,2027 97,9922 97,99
Replikasi V 13988,6 279,772 277,6617 104,4135 104,41
Rata-rata 278,8081 102,0673
Larutan D AUC AUC/50 Kadar(ppm)
(x-x rata-rata)2
Replikasi I 18977,4 379,548 379,9751 0,8106 SD 3,7196
Replikasi II 19124,6 382,492 382,9939 4,4882 CV 3,64%
Replikasi III 19046,2 380,924 381,3861 0,2608
Replikasi IV 18822,6 376,452 376,8003 16,6060
Replikasi V 19135,7 382,714 383,2216 5,5046
102
103
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi yang berjudul “Validasi MetodeKromatografi Lapis Tipis (KLT)-Densitometri padaPenetapan Kadar Kurkumin dalam Sediaan Obat HerbalTerstandar (OHT) Rheumakur®” ini bernama lengkapAndreas Suseno Wimbo Hapsoro, lahir di Klaten, 12Juni 1989. Merupakan anak sulung dari dua bersaudarapasangan Y. Nardiyo dan Sutarmi. Penulis telahmenyelesaikan pendidikannya di Sekolah Dasar NegeriIV Prambanan pada tahun 2001, di Sekolah MenegahPertama Negeri I Kalasan pada tahun 2004, dan diSekolah Menengah Atas Kolese De Britto pada tahun2007. Penulis kemudian melanjutkan pendidikannya di
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2007.Selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma,penulis pernah menjadi asisten praktikum Spektroskopi, Farmasi Fisika II,Formulasi dan Teknologi Sediaan Solid A, serta Analisis Sediaan ObatTradisional. Selain kegiatan akademik penulis juga pernah mengikuti beberapakegiatan non akademik yaitu pada kepanitiaan Talk Show Hari AIDS 2008 yangdiadakan oleh JMKI dan Tiga Hari Temu Akrab Farmasi (TITRASI) 2009.