UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ „ION IONESCU DE LA BRAD” DIN IAŞI

Utilizarea tehnicilor de biologie moleculară pentru identificarea organismelor

modificate genetic

Cuprins

Introducere.................................................................................................. Pag.3

1.Obṭinerea OMG-urilor............................................................................. Pag.5

2.Tehnici de identificare a OMG urilor...................................................... Pag.8

I.Tehnica PCR............................................................................... Pag.9

II.Tehnica microarray................................................................... Pag.10

III.Metoda cromatografică............................................................. Pag.10

IV.Spectroscopia infraroşie apropiată (SIA)............................ Pag.10

V. Metoda ELISA............................................................................. Pag.11

VI. Metoda LAMP............................................................................. Pag.14

3. Potenţialele riscuri pentru sănătatea umană şi pentru mediul

înconjurător............................................................................................. Pag.15

Concluzii.................................................................................................... Pag.16

Bibliografie

2

Introducere

În decursul ultimelor decenii, biotehnologia a cunoscut progrese importante datorită

descoperirilor ce ţin de mecanismul funcţionării acizilor nucleici (ADN-ului şi ARN-ului) şi

investigaţiilor desfăşurate apoi în domeniul geneticii moleculare. Relevarea particularităţilor

materialului genetic la animale, plante şi microorganisme, precum şi posibilitatea de

modificare a unităţilor lor componente au lărgit considerabil domeniile aplicării

biotehnologiei, generând însă în societate o profundă nelinişte faţă de gradul de securitate şi

caracterul etic al unor asemenea cercetări.

Biotehnologia modernă include aplicarea tehnicilor de recombinare a acizilor nucleici şi

a tehnicilor de fuziune celulară invitro, înlăturând barierele naturale de reproducere sau

recombinare genetică. Astfel, prin metode de inginerie genetică, metode care reprezintă un

sistem de tehnici contemporane de manipulare a genomului, a fost posibilă inserarea unui

spectru larg de gene „de interes"(transgene) în mai mult de 120 de specii de plante care

aparţin la 35 de familii.

O importanţă practică deosebită o au numeroasele varietăţi de plante modificate genetic

(PMG), rezistente la diferite erbicide, insecte dăunătoare, boli, patogeni fungali, bacteriali şi

virali. Un rol aparte va reveni în viitorul apropiat plantelor modificate genetic, ce conţin gene

ale rezistenţei la stresul abiotic, inclusiv la secetă şi la salinitatea solurilor, care astăzi

cauzează până la 50% din pierderile de producţie agricolă mondială. Biofortificarea

plantelor de cultură prin introducerea genelor implicate în îmbunătăţirea calităţilor nutritive

ale produselor alimentare, precum conţinutul de proteine, vitamine şi minerale este o direcţie

relativ nouă, în continuă dezvoltare.

Produsele alimentare derivate din PMG sunt prezente în magazinele şi marketurile

Uniunii Europene (UE) din anul 1996. Acest fapt a condiţionat apariţia unei serii de directive

şi legi emise de Comunitatea Europeană, menite să supună unui control strict comercializarea

şi cultivarea organismelor modificate genetic (OMG). Conform cerinţelor, produsele

alimentare care conţin cel puţin 0,9 - 1% OMG trebuie supuse analizelor şi etichetării.

Necesitatea monitorizării prezenţei PMG şi cantităţii acestora în culturile agricole şi

3

în produsele alimentare derivate din acestea a impus căutarea metodelor analitice eficiente în

detectarea, identificarea şi cuantificarea alogenelor şi a produselor de expresie, care reprezintă

constituenţii genetici de bază. Laboratoarele UE au elaborat şi dezvoltat metode de testare a

PMG la nivel de ADN prin metoda PCR şi/sau proteine, prin analize imunoenzimatice.

4

1.Obṭinerea OMG-urilor

Transformarea genetică reprezintă modificarea genomului unui organism prin

tehnicile biotehnologiilor contemporane, care permit introducerea genelor noi, „de interes",

sau modificarea expresiei unei/ unor gene prezente deja în celulă. Organismele astfel obţinute,

sunt denumite organisme modificate genetic (OMG) sau transgenice.

Evoluṭia tehnico-experimentală a ingineriei genetice, în special a metodelor de transfer al

genelor peste barierele de sex şi la distanţe taxonomice mari, a permis transgeneza unui număr

impunător de plante cu importanţă economică: cereale, leguminoase, specii pomicole sau

forestiere etc. Obţinerea autorizării unei varietăţi modificate genetic (MG) în conformitate

cu reglementările de rigoare impune respectarea următoarelor cerinţe: stabilitate în expresia şi

moştenirea transgenelor în generaţiile succesive; segregare mendeliană a fenotipului

transgenic, reglarea organ-specifică a expresiei alogenelor şi exploatarea produsului său în

scop agronomic, alimentar, medical, farmaceutic etc. În afara aplicaţiilor practice,

manipulările genetice permit analiza structurii şi funcţiei genelor, oferind posibilităţi de a

cunoaşte şi a interveni în mecanismele de dezvoltare a plantelor.

Alimentele în care se pot regăsi evenimente modificate genetic pot fi:

produse pe bază de porumb: mălai şi griş de porumb, ulei de porumb, chips

de porumb, fulgi de porumb pentru micul dejun,

produse pe bază de soia : ulei de soia, creme-desert pe baza de soia, lapte de

soia, branză de soia,

cartofi şi subproduse de cartofi,

ingrediente:

- faină de porumb utilizată la producerea pâinii, cerealelor pentru micul dejun,

biscuiţi aperitiv;

- grişul de porumb în : biscuiţi aperitiv, pesmet, bere, cereale pentru micul dejun;

- amidonul de porumb: în sosuri, mezeluri, creme pentru deserturi, preparate pentru

deserturi deshidratate, ciorbe, mâncare pentru nou-născuţi, produse de patiserie;

- siropul de glucoză, dextroză, maltodextrinele în : sosuri, biscuiţi, batoane de cereale,

bere, ciorbe, biscuiţi pentru aperitiv, fructe cu zahar încorporate în iaurturi şi diferite

deserturi, îngheţate;

5

- aditivi din soia (lecitina) sau din porumb (amidon oxidat, amidon acetilat, arome).

Pentru o justă apreciere a efectelor pe care alimentele modificate genetic le pot

avea asupra stării de sănătate, este necesară cunoaşterea modului în care sunt obţinute

aceste organisme şi apoi studierea potenţialelor efecte.

Obţinerea organismelor modificate genetic include câteva etape, care pot fi

rezumate astfel:

I. Identificarea, izolarea şi clonarea genelor „de interes".

II. Transferul genelor la plante.

III. Regenerarea, selecţia şi testarea plantelor MG.

Figura 1.1. Etapele transformării genetice

1,2- Identificarea şi izolarea genei „ de interes", obţinerea ADN-ului recombinat (integrarea

transgenei în vector);

3 - Transferul genei himere în celula vegetală prin metode directe sau indirecte;

4 - Selectarea celulelor modificate genetic;

5 - Regenerarea plantelor din celulele transformate genetic;

6 - Reproducerea sexuată/ asexuată a plantelor modificate genetic.

6

Metodele folosite pentru realizarea de organisme modificate genetic sunt prezentate

schematic in figura 2.

Fig. 2.1. Prezentare schematică a metodelor de obţinere a OMG-urilor

7

2. Tehnici de identificare a OMG -urilor

Pentru analiza calitativă şi cantitativă a materialului modificat genetic în

produsele alimentare, au fost elaborate şi implementate numeroase metode analitice.

Concomitent cu metodele clasice, ca PCR şi ELISA, sunt utilizate şi alte procedee de

analiză precum cromatografia şi spectroscopia infraroşie.

Necesitatea de a monitoriza şi verifica prezenţa şi cantitatea materialului modificat

genetic în culturile agricole MG şi în produsele derivate a generat o cerere crescândă de

metode analitice de detecţie, identificare şi cuantificare a secvenţei de nucleotide inserate şi a

produşilor de expresie a transgenei, deoarece anume aceste componente sunt considerate ca

fiind contituienţi de bază.

Unele laboratoare au elaborat metode de analiză bazate pe detecţia ADN-ului utilizând

tehnica de amplificare PCR (Polymerase Chain Reaction) ori pe proteine, apelând la

analizele imunoenzimatice ELISA (enzyme linked immunosorbent assays), care se deosebesc

prin unele avantaje şi dezavantaje în funcţie de scopul cercetării şi de posibilităţile

laboratorului.

Fig.2.1. Detecṭia, identificarea ṣi cuantificarea OMG

Alte laboratoare s-au orientatat spre dezvoltarea unor tehnologii analitice care pot oferi

8

soluţii alternative la metodele de testare a OMG existente. Acestea includ masspectrometria,

cromatografia, tehnologia ADN - chip, Electro.spray.ionisation (ESI), spectroscopia

infraroşie apropiată etc. (fig. 2.1.).

I. Tehnica PCR

Reacṭia PCR permite amplificarea selectivă, într-un număr foarte mare de copii, a unei

secvenṭe ADN prezentă într-o proporṭie relativ redusă în cadrul unui amestec complex

de fragmente ADN. Analiza produṣilor rezultaṭi prin amplificare într-o reacṭie PCR

clasică permite formularea unei concluzii calitative („da" sau „nu") asupra prezenṭei

OMG-urilor în proba testată. În practică, evaluarea ampliconilor se face, în

general,prin separare electroforetică în gel de agaroză, marcare cu EtBr, vizualizare în prezeṭa

luminii UV ṣi compararea cu probe standard.

Pentru obṭinerea informaṭiilor cantitative referitoare la conṭinutul de acizi nucleici,

este utilizată tehnica real-time PCR care reprezintă o variantă mult mai performantă a

reacṭiei PCR clasice.

Principiul real-time PCR

Tehnica real-time PCR utilizează primeri specifici pentru amplificarea secvenṭei ṭintă,

iar în tandem cu aceṣtia constructe oligonucleotidice speciale sau alte tipuri de

molecule incluse în mediul de reacṭie indică acumularea produsului PCR . Astfel, de-a

lungul mai multor cicluri de amplificare constructele oligonucleotidice care sunt

de asemenea specifice secvenṭei ṭintă vor determina modificarea semnificativă a

semnalului fluorescent.

 PCR este o tehnica de laborator ce necesita personal instruit si echipament special.

 Caracteristici de baza ale analizei prin PCR:

- poate fi foarte sensibilă, capabilă de detecṭia uneia sau mai multor copii ale genelor

sau secvenṭei ṭintă de interes în cadrul unui material genetic al unui organism sau genom.

Trebuie luate toate masurile pentru evitarea contaminării încruciṣate.

- necesită puṭin timp de reacṭie în comparaṭie cu testele imunologice, aproape toṭi

reactivii necesari, sunt disponibili în comerṭ ṣi pot fi uṣor obṭinuṭi.

- impul de analiză a probelor este de aproximativ o zi.

- PCR facilitează diferenṭierea între anumite tipuri de modificări genetice. Metodele de

9

diagnostic pentru identificarea evenimentelor transgenice specifice necesită timp de

dezvoltare adiṭional ṣi eforturi de validare.

II. Tehnica microarray

Tehnica microarray are la baza hibridarea moleculară dintre două fragmente

complementare de ADN. În contextul testării OMG, este utilizată în combinaṭie cu

amplificarea PCR multiplex, corespunzând, practic, etapei post-PCR - analiza produṣilor de

reacṭie. Această tehnică are o mare capacitate de procesare, constituind o strategie

foarte potrivită pentru o problemă majoră cu care se confruntă domeniul testării OMG -

creṣterea numărului de evenimente de transformare.

III. Metoda cromatografică

Metoda cromatografică permite identificarea OMG la nivelul metaboliţilor -

dizaharide (trehaloza, maltoza şi izomaltoza), alcooli (maltitolul) sau al diferenţelor depistate

în profilul chimic, constatate la analiza uleiului provenit din rapiţa modificată genetic.

Combinarea metodelor de cromatografie lichidă şi masspectrometrie au permis evidenţierea

diferenţelor din cadrul paternelor de trigliceride. Rapiditatea, sensibilitatea înaltă şi analiza

cantitativă a diferitor metaboliţi, implicaţi în metabolismul carbonului (glucidele di- şi

trimere), azotului (aminele, aminoacizi, acizi organici), oferă posibilitatea identificării

simultane a diferitor metaboliţi într-o singură probă, fără a impune o separare ulterioară a

acestora.

IV. Spectroscopia infraroşie apropiată (SIA)

Spectroscopia infraroşie apropiată (SIA) are o gamă largă de aplicare în

agricultură, industria farmaceutică, controlul produselor alimentare etc. şi reprezintă o metodă

analitică rapidă, care permite măsurarea compoziţiei chimice a materialelor. Legăturile

covalente dintre atomii de C, N, H, O şi P absorb energia în regiunea infraroşie, în care

posedă frecvenţe oscilatorii specifice, iar combinaţiile formate sunt detectabile la lungimea de

undă de 400 - 2500 nm, adică în regiunea infraroşie. Unele transgene pot modifica structura

fibrelor în plante, diferenţe care nu pot fi evidenţiate după conţinutul de proteine sau ulei, însă

se evidenţiază cu uşurinţă prin SIA.

V. Metoda ELISA

10

ELISA, implica testarea pentru detecṭia proteinelor specifice prin exploatarea

specificităṭii legăturii între antigenul exprimat ṣi anticorpul ṭintă.

Testul de marcare enzimatică (enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) (metoda

ELISA) este unul de alternativă PCR şi permite identificarea proteinelor (enzimelor)

codificate de transgene, cum ar fi, de exemplu, neomicin- fosfotransgeraza (nptII), EPSPS,

proteinele Bt, enzima PAT etc.

Metoda ELISA are ca principiu utilizarea unui marker enzimatic legat de un anticorp,

antigen sau haptenă (substanţă care reacţionează cu anticorpii, dar nu induce sinteza de

anticorpi - adică nu determină un răspuns imun). Prezenţa markerului enzimatic permite

detectarea reacţiei antigen-anticorp. Deci antigenele sau anticorpii sunt cuplaţi covalent cu o

enzimă (în locul radioizotopului sau fluorocromului). Cuplarea markerului enzimatic cu

antigenele sau cu anticorpii se face cu ajutorul unor molecule bifuncţionale care leagă cei doi

compuşi (fig.2.2). Evidenţierea reacţiei antigen-anticorp se realizează prin degradarea unui

substrat specific (marker enzimatic), urmată de o modificare de culoare, măsurată

spectrofotometric. De exemplu, paranitrofenil fosfatul (galben) se utilizează pentru fosfataza

alcalină; 3,3',5,5'-tetrametil-benzidina (galben) sau 3-Amino-9-etilcarbazolul (roşu) - pentru

peroxidaza.

Fig. 2.2 Prezentare schematică a principiului testului ELISA;

A - Anticorpii specifici antigenelor se ataşează de suprafaţa solidă;

B - Adăugarea probei în care se pot conţine sau pot lipsi antigenele;

11

C – Adăugarea enzimelor legate de anticorpi şi conjugarea lor;

D – Adaugarea substratului cromogenic. În prezenţa enzimei se formează produşi de reactie

cu culoare modificata, care poate fi masurata spectofotemetric.

Actualmente, există mai multe tipuri ale acestei metodologii, şi anume proce-

deul „Sandwich" ELISA şi ELISA competitivă.

Metoda „sandwich" ELISA. O varietate a tehnicii imunoenzimatice este procedeul

ELISA cu utilizarea a doi anticorpi („sandwich" ELISA) (fig. 3.2.), fiind unul dintre cel

mai des utilizat în analiza transgenelor. Acest procedeu este rapid şi simplu în efectuare. Dacă

antigena standard purificată este competentă, atunci tehnologia permite şi determinarea

cantitativă a antigenului în proba cercetată. Testul dat necesită doi anticorpi, unul numit

anticorp de captare şi altul de detectare.

Denumirea „sandwich" a acestei variante de ELISA provine de la complexul format

dintre cei doi anticorpi între care se află legată antigena. Produsele formate sunt

cuantificate prin măsurarea cantităţii de anticorpi secundari legaţi de matrice, utilizând

substrate colorimetrice.

Fig. 3.2 Etapele principale ale metodei „sandwich" ELISA

Metoda ELISA competitivă. În cazul în care o pereche de anticorpi nu sunt potriviţi

pentru scopul propus, există o altă varietate a tehnologiei imunoenzimatice şi anume testul

12

ELISA tip competitiv (fig. 4.2.). Pentru utilizarea acestui tip de ELISA, este necesar ca un

reagent să fie conjugat cu enzima de detecţie. Enzima poate fi linkată cu altă imunogenă sau

anticorp primar.

Fig.4.2 Etapele principale ale metodei ELISA competitivă

Principale caracteristici ale analizelor ELISA:

- mai putin sensibila decat PCR, de aceea mai putin susceptibila decat PCR in rezultate

„pozitive false” cauzate de mici nivele de contaminare;

- costuri mari pentru dezvoltarea testelor si generarea de standarde pentru anticorpi si

proteine;

- cost mic pentru proba din momentul elaborarii rectivilor;

- metodele bazate pe proteina necesita timp pentru reactivi si dezvoltarea metodei;

- testarea bazata pe proteina furnizeaza un proces de testare cantitati 656f59g va in cazul

in care este produsa proteina detectabila. Totusi produsele MG pot fi produse numai

urmand anumite etape sau numai in anumite parti ale plantelor si aceste organisme

modificate genetic sunt putin probabil de a fi usor detectate prin ELISA.

- Aditional,  procesarea industriala denatureaza usor proteinele, lucru ce face

problematica utilizarea metodelor ELISA pentru alimentele procesate.

13

VI. Metoda LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification)

Noua metodă permite identificarea Organismelor Modificate Genetic (OMG) chiar şi

în concentraţii mai mici, de până la 0,1%. Tehnologia folosită se bazează pe o combinaţie de

tehnici de amplificare bioluminiscentă şi izotermă care poate monitoriza contaminarea

alimentelor cu ingrediente ce conţin OMG-uri.

Metoda se bazeaza pe amplificarea DNA-ului la o temperatură constantă, urmată de

aplicarea noii tehnologii de reportare a biolumiscenţei (BART), pentru determinarea în timp

real a conţinutului de OMG. Această metodă necesită doar un echipament standard pentru

extragerea ADN-ului şi asigurarea unei temperaturi constante pentru detectarea şi

amplificarea ADN-ului. În acest fel, soluţia LAMP-BART poate asigura monitorizarea în

timp real a existenţei culturilor modificate genetic, precum şi a interacţiunii acestora cu plante

sau culturile nemodificate genetic.

3. Potenţialele riscuri pentru sănătatea umană şi pentru mediul

înconjurător prezentate de organismele modificate genetic

14

Pe de o parte, aceste organisme sunt promovate ca fiind sigure şi necesare societăţii

umane, în timp ce opozanţii le consideră neesenţiale şi potenţial cauzatoare de efecte negative

asupra sănătăţii şi mediului. Niciuna dintre aceste opinii nu poate fi însă corectă, din simplu

considerent că OMG-urile nu reprezintă o categorie omogenă, punerea în balanţă

a beneficiilor şi riscurilor trebuind făcută pentru fiecare caz în parte.

Analiza impactului potenţial al introducerii şi utilizării OMG-urilor are în vedere o

serie de factori ca: implicaţiile tehnice pentru practica agricolă, inputurile din

agricultură, fluxul de gene, biodiversitatea, impactul economic, avantajele pentru

sistemul sanitar, riscurile pentru sănătatea consumatorilor şi organismele non-ţintă,

asigurarea securităţii alimentare, implicaţiile de natură etică sau culturală.

Fig 4. Aspecte cu impact pe sănătatea publică date de utilizarea OMG

Concluzii

15

1. OMG-urile reprezintă o realitate a societăṭii moderne, iar utilizarea lor prezintă o

serie de avantaje, dar ṣi potenṭiali factori de risc pentru mediul înconjurător, pentru cel

economico-social ṣi pentru sănătatea consumatorilor.

2. Utilizarea OMG-urilor în obţinerea produselor alimentare, ca în cazul oricărei

alte tehnologii, prezintă o serie de avantaje, dar poate genera şi riscuri pentru mediu şi

sănătate, de aceea trebuie acţionat în sensul identificării şi eliminării riscurilor pentru

îndeplinirea celor două deziderate principale ale Organizaţiei Mondiale a Sănătăţii

privind alimentaţia: securitatea şi siguranţa.

3. Testarea moleculară reprezintă un instrument esenṭial în contextul implementării

politicilor europene din domeniul OMG.

16

Bibliografie

BADEA E.M., SĂNDULESCU D. Biotehnologii.vegetale, Bucureşti, 2001

DUCA M., KALOSHIAN I. Tehnici de cercetare în biologia moleculară, Chişinău, CE

USM, 2002.

http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/gmomethods/

http://www2.biologie.fu-berlin.de/lampart/gp03/GUS_assay.html.

http://www.brutarul.ro/index.php/ro/altestiri/481-soluie-pentru-identificarea-culturilor-

modificate-genetic.html

17