U. M. S. N .H. Facultad de Biología Microbiología
Manual de Prácticas
Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo
Facultad de Biología
MICROBIOLOGÍA
Manual de Prácticas
U. M. S. N .H. Facultad de Biología Microbiología
Manual de Prácticas
Morelia, Michoacán, agosto de 2014
INTEGRANTES DE LA MATERIA DE MICROBIOLOGÍA
PROFESORES: Dra. Irene Ávila Díaz
Dra. Yazmín Carreón Abud M.C. Rosenda Aguilar Aguilar
Dr. José López Bucio Dr. Eduardo Valencia Cantero
TECNICOS ACADÉMICOS
Biól. Ana Isabel Reza Maqueo Biól. Manuel Medina Barriga M.C. Cornelio Téllez Sánchez
Q.F.B. Rita Sandra Mendoza Olivares
PARTICIPANTES EN LA ACTUALIZACIÓN DEL MANUAL
Biól. Ana Isabel Reza Maqueo M.C. Cornelio Téllez Sánchez
Q.F.B. Rita Sandra Mendoza Olivares
Agosto de 2014
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Nombre del alumno: ________________________________________
Sección: ___________________ Matrícula:__________________ Profesor: ________________________________________ Técnico Académico: ________________________________________ Ciclo escolar: __________ Evaluación: ___________
Morelia, Mich., Agosto de 2014
Manual de Prácticas de Microbiología
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Manual de Prácticas
CONTENIDO
Presentación.................................................................................................. i
Reglas para el trabajo en el laboratorio.............................................................. ii
Práctica No. 1. Técnicas de esterilización en bacteriología....................... 1
Práctica No. 2. Principales medios de cultivo y su preparación............... 11
Práctica No. 3. Técnicas de aislamiento bacteriano.................................. 18
Práctica No. 4. Morfología bacteriana y colonial....................................... 29
Práctica No. 5. Preparación de frotis y tinciones.….................................. 36
Práctica No. 6. Requerimientos nutricionales de los microorganismos..... 45
Práctica No. 7. Fermentación de Lactosa……………….………………… 48
Práctica No. 8. Determinación de coliformes............................................. 54
Práctica No. 9. Agentes físicos y ambientales……........................... 61
Práctica No. 10. Evaluación de productos comerciales antimicrobianos...... 64
Práctica No. 11. Diferencia entre un agente bactericida y un
Bacteriostático……………………………………………….. 68
Práctica No. 12. Prueba de sensibilidad a los antibióticos…………………. 71
Bibliografía……………………………………………………..79
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PRÁCTICA No. 1
TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN EN BACTERIOLOGÍA
INTRODUCCIÓN
Existen diversos métodos físicos de esterilización y de inhibición del crecimiento
microbiano, como pueden ser el calor, la filtración y la radiación, pero el más ampliamente
usado es el calor, ya sea húmedo ó seco, los cuales tienen diferente penetrabilidad.
El calor, de cualquier forma, es utilizado extensamente como un agente letal
bacteriano y se puede aplicar a numerosos instrumentos, materiales y substancias, con el
propósito de matar a las bacterias que ellos contengan.
Este proceso se llama “Esterilización” y al material, cultivo ó medio de cultivo
sometido a éste, se le denomina entonces “Estéril”, es decir, desprovisto de toda forma
viviente.
Cuando se efectúa experimentalmente la esterilización de una población microbiana,
contenida en un medio de cultivo ó en todo el material utilizado en bacteriología es de suma
importancia conocer los diversos métodos de esterilización los cuales se dividen en:
1).Métodos físicos tales como: calor, rayos ultravioleta, filtración, etc.
2).Métodos químicos, en donde se utilizan substancias bactericidas o bacteriostáticos como
son alcoholes, fenoles, halógenos, detergentes, entre otros.
La elección del método de esterilización depende del tipo de material a esterilizar,
así como la finalidad que se persiga.
La esterilización por calor es uno de los métodos más comúnmente utilizados en el
laboratorio, es muy útil para la cristalería, los medios de cultivo y para la esterilización de
los medios después de su utilización y este puede ser:
a) Calor Húmedo
b) Calor Seco
c) Calor Directo
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a) Calor Húmedo
Se utiliza para esterilizar medios de cultivo, la esterilización se hace por el vapor a
presión en una autoclave (Chamberland) u olla de presión.
Descripción de la autoclave.
Construido según el principio de la Marmita de Papins, es un cilindro de acero
inoxidable que consta de los siguientes elementos (Fig. 1a):
Figura 1.Una autoclave es un dispositivo
que sirve para esterilizar el material de
laboratorio, utilizando vapor de agua a alta
presión y temperatura para ello. Por lo
general, la utilización de una autoclave
inactiva todos los virus y bacterias, aunque
recientemente se ha llegado a saber de
algunos microorganismos, así como los
priones, que pueden soportar las
temperaturas de autoclave.
- Un fondo de acero inoxidable con
resistencia eléctrica
- Un nivel con llave de paso para
fluido de agua al cual se puede fijar
solidamente una tapadera de acero
inoxidable por medio de pernos
- Un empaque ó junta de hule para
asegurar su hermeticidad
- Una tapadera que contiene un
indicador de presión, una válvula de
seguridad y una espitia de escape de
vapor
- Un control de tres calores (bajo,
medio y alto)
- Un foco piloto
- Una cesta metálica
Descripción de la olla. Fig. (2)
Es de forma cilíndrica de acero inoxidable y consta de los siguientes elementos:
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- Un cuerpo cilíndrico con topes herméticos
- Una tapa que contiene un indicador de presión y temperatura, una válvula de
seguridad y una espitia de escape de vapor.
Figura 2. El tipo olla de presión es el más común, es un aparato para agua hirviendo a
presión. Tiene una cámara vertical de metal provista de una tapa metálica fuerte que se
aprieta y cierra herméticamente mediante un aro de goma. Se disponen en la tapa una espita
para la salida del aire y el vapor, un indicador de presión y una válvula de seguridad. El
agua del fondo de la autoclave se calienta mediante mecheros de gas exterior, un calentador
eléctrico de inmersión o un serpentín de vapor.
b) Calor Seco
La esterilización se hace por medio de un horno que permite alcanzar temperaturas
más elevadas (150- 180°C) que no pueden soportar los medios de cultivo y el material de
goma ó plástico, se utiliza más para la esterilización del material de vidrio (matraces,
pipetas, cajas de petri, etc.) y en los instrumentos.
Descripción del Horno de Pasteur (Fig.3)
Es de forma rectangular, tiene doble
pared que permite circular el calor producido
por unos picos de gas ó una resistencia eléctrica.
Se utiliza para esterilizar material de vidrio,
porcelana y también para objetos metálicos. El
material deberá introducirse en el horno una vez
limpio y seco, una vez introducido hay que
procurar que estos no toquen las paredes de la
estufa, porque alcanza temperaturas muy altas.
Una vez introducido el material, se cierra el
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horno y se enciende, dejándolo calentar hasta 180 º, dejándolo a estas temperaturas por
espacios de tiempo variables, dependiendo del tipo de material que se ha introducido. Una
vez transcurrido el tiempo deseado se apagará y se dejará enfriar totalmente antes de sacar
el material.
c) Calor Directo
Se utiliza en asas bacteriológicas y agujas de inoculación. La esterilización se
efectúa directamente en la flama del mechero hasta al rojo vivo del metal (Fig.4).
Figura 4. La esterilización adecuada del material es importante para obtener los resultados
esperados.
OBJETIVO
1. Conocer y aplicar las técnicas de esterilización utilizadas en bacteriología, así como
comprender la importancia de este proceso.
MATERIALES
- Medios de cultivo: SIM, caldo nutritivo, agar sangre, agar nutritivo, etc.
- Alcohol ó fenol
- Cajas de petri
- Tubos de ensaye
- Pipetas
- Matraz Erlermeyer
- Asas y aguja de siembra
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- Pipeteros
- Autoclave u olla de presión
- Horno de esterilización
- Papel revolución
- Algodón y gasas
METODOLOGÍA
a) TÉCNICA DE ESTERILIZACIÓN DE CALOR HÚMEDO
Se utiliza principalmente la autoclave ó la olla de presión, es útil para medios de
cultivo.
AUTOCLAVE
1.- Lavar el material de vidrio (matraces) hasta dejarlos perfectamente limpios y libres de
sales, para lo cual se lavan y después se les da un enjuague final con agua destilada.
2.- Colocar el ó los medios de cultivo ya preparados (de acuerdo a las indicaciones del
frasco) en los matraces ó tubos de ensaye antes de su esterilización.
3.- Tapar el material de vidrio ya sea con sus tapaderas o fabricarlas con algodón ó gasa.
4.- Depositar el material en la cubeta de la autoclave, cuidando de colocar un capuchón de
papel aluminio en el cuello del material.
5.- Vaciar el agua destilada en la autoclave hasta donde indica la marca del nivel.
6.- Cerrar la tapa cuidando de apretar los pernos como lo indique el instructor.
7.- Encender y girar el reóstato (botón) en la posición “alto”.
8.- Cuando el agua contenida dentro de la autoclave hierve, el vapor elimina el aire de la
autoclave, el escape del vapor por la espitia (que estará abierta) es irregular. Un chorro
continuo indica la eliminación completa del aire, con lo que se procede a cerrar la espitia, la
temperatura y la presión suben enseguida.
9.- Cuando se ha obtenido la temperatura deseada de 120°C que corresponde a 1 Kg. de
presión, girar el botón en la posición de “medio” lo cual nos permite conservar la
temperatura y la presión deseada por un tiempo determinado de 120°C por 15 minutos a 1
Kg. de presión.
10.- Trascurridos los 15 minutos se coloca el reóstato en la posición de “OFF” (apagado), el
manómetro indicará un descenso en la presión.
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11.- Cuando la presión es nula, se abre la espitia de escape de vapor, penetrando el aire al
aparato. Solamente entonces puede abrirse la tapadera y retirar los objetos húmedos
ya esterilizados.
NOTA: para la cristalería el procedimiento es de la misma manera.
OLLA DE VAPOR
1.- Colocar en la olla de presión el agua suficiente para que el nivel llegue hasta la rejilla.
2.- Introducir el material perfectamente limpio y libre de sales con el medio de cultivo ya
preparado a esterilizar (ya con tapones).
3.- Cerrar la olla herméticamente.
4.- Poner calor y esperar a que salga el aire contenido dentro de la olla.
5.- Cerrar la válvula y dejar que el manómetro marque 120°C ó 15 libras de presión.
6.- Mantener la temperatura necesaria para que la presión permanezca constante durante 15
minutos.
7.- Transcurrido el tiempo, retirar la olla del fuego y dejar que baje la presión hasta cero
para poder destapar la olla.
b) TÉCNICA DE ESTERILIZACIÓN CON CALOR SECO
1.- El material de vidrio debe encontrarse limpio y libre de sales.
2.- Se procede a tapar el material ya sea con sus tapaderas ó fabricarlas con algodón ó gasa.
3.- Envolver en papel y llevarlo al horno (evitando el contacto con las paredes del horno),
las extremidades de los objetos que llevan algodón ó papel deben colocarse hacia arriba.
4.- Encender y controlar la calidad de la flama si el calentamiento es con gas.
5.- Para tubos de vidrio, pipetas (por separado) y cristalería en general, utilizar 170°C por
espacio de 1 hora.
6.- Transcurrido el tiempo de esterilización se apaga el horno y se deja enfriar para sacar el
material.
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NOTA: Los pipeteros requieren de un tiempo de 2 horas.
c) TÉCNICA DE ESTERILIZACIÓN CON CALOR DIRECTO
Se utiliza para asas bacteriológicas y agujas de inoculación.
1.- Estas se deben esterilizar antes y después de llevar acabo la siembra de cualquier tipo de
bacteria.
2.- Poner el asa o aguja directamente en la parte azul de la flama durante algunos segundos.
3.- Cuando el metal se torna de color rojo, se retira y se enfría en las paredes inferiores del
recipiente de cultivo.
REPORTE
Resultados
Escribir los resultados de las técnicas anteriores en la siguiente tabla:
A a)
b)
c)
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CUESTIONARIO
1) ¿Qué métodos de esterilización son utilizados en bacteriología?
2) ¿Explica químicamente que le sucede al microorganismo en cada uno de los métodos?
3) ¿Cuál es la importancia de la esterilización de todo el material usado en bacteriología?
4) ¿Qué métodos se usan para esterilizar los medios de cultivo? y ¿Por qué no se utilizan
las otras técnicas conocidas?
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5) ¿Cuál es la temperatura, presión y tiempo para la esterilización en autoclave, olla de
presión y horno de Pasteur?
6) ¿Por qué el asa bacteriológica se debe esterilizar siempre antes y después de usarse?
7) Mencione otras técnicas de esterilización diferentes a las explicadas en la práctica.
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PRÁCTICA No. 2
PRINCIPALES MEDIOS DE CULTIVO Y SU PREPARACIÓN
INTRODUCCIÓN
El estudio adecuado de las bacterias, exige como requisito previo, poder cultivarlas
en condiciones de laboratorio. Para lograr esto, es preciso conocer, los elementos nutritivos
para la obtención de energía que será empleada para la biosíntesis y la reproducción celular
y las condiciones físicas. Las exigencias nutritivas de las bacterias se han establecido
después de dilatadas investigaciones, cuyos resultados han sido el desarrollo de numerosos
medios de cultivo artificiales, estas necesidades nutritivas son muy diversas, debido a ello
existen grandes diferencias.
Los medios de cultivo más comunes utilizados son los que están constituidos con
peptonas, extractos de carne o carne parcialmente digerida y extractos de levadura llamados
también medios básales.
Cuando hay que utilizar medios sólidos, se agregan agar a los medios líquidos,
como agente coagulante o solidificante. La preparación de los medios de cultivo, ha sido
reemplazada en gran medida por el uso de medios de cultivo deshidratados a los cuales se
les agrega agua destilada, tales medios son estables y bien estandarizados con respecto a pH
y concentración de materiales. Según el propósito para lo que son fabricados los medios de
cultivo se pueden clasificar en:
a) Medios básales, básicos o generales: Son medios simples que contienen en general
los nutrientes esenciales para promover el desarrollo de microorganismos poco
exigentes nutricionalmente in vitro, ejemplo: agar nutritivo (A.N.), caldo nutritivo
(C.N.), agar soya triptosa (T.A.S.), caldo soya tripticasa (T.C.S.) y caldo cerebro
corazón (B.H.I.).
b) Medios enriquecidos: Son medios que han sido complementados con otros
nutrientes que proporcionan factores de crecimiento y cuya finalidad es promover el
desarrollo de microorganismos de requerimiento nutricional más exigentes,
ejemplo: gelosa sangre (G.S.), gelosa chocolate (G.CH.).
c) Medios selectivos o inhibitorios: Cuando una muestra contiene gran cantidad de
microorganismos, su crecimiento puede ser excesivo por lo que es necesario suprimir
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su desarrollo y al mismo tiempo promover y/o seleccionar el crecimiento de los
microorganismos de interés que pudieran encontrarse en dicha muestra, ejemplo: agar
verde brillante (A.V.B.), agar salmonella –shigella (S.S).
d) Medios diferenciales, Son aquellos en los que se ponen de relieve propiedades
(normalmente pruebas bioquímicas) que un determinado microorganismos posee y de
esa forma se puede distinguir ese microorganismo de otros que también pueden crecer
en ese medio.
e) Medios de transporte, sirve para mantener varios microorganismos por un lapso
corto de tiempo, ejemplo: cary-blair.
Figura 5. Tipos de medios de cultivo: a) y b) Medios generales; c) Medios enriquecidos;
d) y e) Medios selectivos (por ej. Inhibidores de Gram+ y los medios para antibióticos); f)
Medios diferenciales (por ej. el agar-sangre).
OBJETIVO
1. Conocer y preparar los medios de cultivo más comunes empleados en bacteriología.
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MATERIALES
- Agar nutritivo
- Caldo nutritivo
- E.M.B.
- Agar(S-110)
- Medio SIM
- Agua destilada
- Cajas de Petri esterilizadas
- Tubos de ensaye
- Matraces Erlenmeyer
- Probetas.
- Balanza granataria
- Algodón ó gasa estéril
- Marcador permanente
METODOLOGÍA
1.- Preparar 75 ml. o lo que indique su instructor o de agar nutritivo como lo señala el
frasco, esterilizar a 121°C por 15 min en autoclave u olla de presión. Vaciar el medio en
cajas de petri esterilizadas, dejar solidificar. Marcar las cajas con lápiz graso.
2.- Preparar 70 ml. de agar (S-110) como lo indica el frasco, vaciar en cajas de Petri
estériles marcadas.
3.- Preparar la cantidad en mililitros que indique el instructor de E.M.B. según
especificaciones del frasco, esterilizar, dejar enfriar un poco, vaciar en cajas de petri
estériles y marcar las cajas.
4.- Preparar la cantidad en mililitros que indique el instructor de medio SIM según
especificaciones del frasco, esterilizar y vaciar en tubos de ensaye.
5.- Preparar 50 ml. de caldo nutritivo como lo indica el frasco, distribuirlo en tubos de
ensaye (3 ml. c/u) esterilizar a 121 °C por 15 minutos.
6.- Preparar la cantidad en mililitros que indique el instructor de medio Agar nutritivo
según especificaciones del frasco, distribuirlo en tubos de ensaye (6 ml cada uno),
esterilizar y dejarlos enfriar en superficie inclinada.
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Figura 6. Antes de ser esterilizados en autoclave, los medios líquidos se distribuyen en los
recipientes adecuados (tubos o matraces) y se tapan; en ningún caso la altura del líquido en
el recipiente debe exceder un tercio del volumen total de éste. Si se trata de un medio que
contenga agar (sólido o semisólido) suele ser preciso calentarlo (al baño María o al
microondas) para fundir el agar antes de esterilizarlo en el autoclave. Una vez fundido se
reparte en matraces o en tubos (nunca en placas de Petri), se tapa y se esteriliza.
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Figura 7. Finalizada la esterilización en al autoclave los medios líquidos se dejan enfriar a
temperatura ambiente. Los medios sólidos contenidos en tubo deben inclinarse para que al
solidificarse adopten la forma de agar inclinado, si tal es su finalidad.
REPORTE
Resultados
Elaborar una tabla con los resultados:
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CUESTIONARIO
1.- ¿Cómo preparó c/u de los medios de cultivo?
2.- ¿Qué diferencia hay entre un cultivo y un medio de cultivo?
3.- ¿Qué sucede si el medio está muy frió y se desea vaciar en caja de Petri o en tubo de
ensaye?
4.- Contesta correctamente
a. ¿Qué es el agar?
b. ¿A qué temperatura solidifica?
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c. ¿Con qué finalidad se utiliza en los medios de cultivo?
5.- ¿Por qué no se utiliza la gelatina como solidificante o coagulante para los medios
sólidos?
6.- ¿Por qué es tan importante que el agua utilizada en la preparación de medios de cultivo
sea destilada?
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFÍA.
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PRÁCTICA No 3
TÉCNICAS DE AISLAMIENTO BACTERIANO
INTRODUCCIÓN
Una técnica muy común en el laboratorio de microbiología es la transferencia de
microbios de un ambiente a otro con el propósito de cultivarlos. Es necesario tomar las
debidas precauciones para evitar la contaminación de los cultivos.
Para el estudio e identificación de microorganismos éstos deben aislarse o separarse
a partir de un cultivo mixto o de poblaciones que se encuentran en la naturaleza. Existen
varias técnicas para el aislamiento de microorganismos y la obtención de cultivos puros,
dentro de las más utilizadas se encuentran:
a) Siembra por estrías en caja de Petri o tubo de ensaye.
b) Vaciado en placa donde se obtienen colonias tanto en la superficie como en
partes profundas del medio inoculado.
c) Cultivo por dilución y agitación.
d) Aislamiento de bacterias con una varilla angular de vidrio.
e) Aislamiento de microbios extraídos con un aplicador de algodón.
f) Siembra por picadura, etc.
Después de que una población de microorganismos ha estado creciendo por cierto
tiempo en el mismo tubo de ensaye o caja de Petri, debe ser transferido a un medio de
cultivo nuevo para que pueda continuar su crecimiento y supervivencia.
OBJETIVO
1. Aprender las técnicas fundamentales empleadas para la transferencia y aislamiento de
microorganismos.
MATERIALES
-Tubos de ensaye con caldo nutritivo
-Tubos de ensaye con agar nutritivo (superficie inclinada)
- Cajas de Petri con agar EMB
-Tubos de ensaye con medio SIM (superficie horizontal)
-Cajas de Petri con agar nutritivo
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-Tubos de ensaye con S-110
-Asa y aguja de inocular
-Mechero
-Algodón
-Masking tape
-Kleen pack
-Muestra mixta
Cultivos:
-Bacillus subtilis
-Escherichia coli
-Staphylococcus epidermidis
-Pseudomonas aeruginosa
-Proteus vulgaris
METODOLOGÍA
Técnica aséptica:
1.- Limpiar perfectamente la mesa de trabajo con alcohol, flamearla con el mechero.
2.- Lavarse las manos con jabón y después frotárselas con un algodón con alcohol.
3.- Colocar los tubos y demás material en una posición adecuada en la que se puedan
alcanzar sin dificultad y sin peligro de quemarse.
4.- Trabajar siempre junto al mechero, ya que este proporciona una zona de esterilidad de
aproximadamente 20 cm. de radio.
5.- Antes de realizar cualquier siembra, esterilizar el asa o aguja a fuego directo hasta el
rojo vivo de la base a la punta y enfriar cerca del mechero.
6.- Para tomar el inoculo de siembra debe tocar con el asa una colonia seleccionada o asada
si es liquido. Inocular y volver esterilizar.
7.- Durante la siembra, deben permanecer cerradas las puertas y ventanas y no se debe
hablar o generar corrientes de aire.
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Técnicas de sembrado.
1.- Inoculación de medios líquidos:
a) Tomar con una mano el tubo que contenga el cultivo y otro con caldo nutritivo estéril.
b) Con la otra mano, tomar el asa y esterilizarla hasta el rojo vivo de base a punta dejar
enfriar. Quitar y sostener los tapones de los tubos con los dedos libres de la mano que sujeta
el asa, tener cuidado de no acercarlo demasiado al mechero.
c) Flamear los bordes de ambos tubos, introducir el asa al cultivo y tocar una colonia si el
medio es sólido tomando una pequeña muestra sin rasgar el medio.
d) Introducir el asa con el inóculo dentro del tubo con el caldo y agitar el asa en circulos.
e) Retirar el asa, flamear nuevamente los bordes de los tubos y colocar los tapones.
f) Esterilizar el asa de la base a la punta.
g) Etiquetar el tubo inoculado (medio de cultivo empleado, microorganismo inoculado,
número de equipo, sección y fecha)
h) Guardar a temperatura ambiente.
Figura 8. Método correcto de la inoculación con el asa en medio líquido.
Figura 9.Para la inoculación de un medio líquido a partir de un cultivo en medio sólido se utiliza un asa de siembra.
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2.-Inoculación en medio inclinado
a) Tomar un tubo que contenga el cultivo y otro con el medio inclinado.
b) Sujetar los tubos, remover los tapones y realizar los pasos asépticos como se
explicó anteriormente.
c) Esterilizar el asa de la base a la punta, dejar enfriar y tomar un inóculo del
medio de cultivo.
d) Introducir el asa hasta el fondo del tubo y deslizarla a manera de estrías sobre
la superficie del medio hasta el extremo externo, sin repetir la operación.
e) Flamear los bordes de los tubos y taparlos.
f) Esterilizar el asa como se indico anteriormente.
g) Etiquetar el tubo inoculado.
h) Incubar.
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Figura 10 y 10a. Siembra en medio sólido inclinado
3.- Cultivo por picadura:
a) Tomar el tubo que contenga el cultivo y otro con medio de cultivo SIM.
b) Realizar los pasos de flameado y remoción de tapones.
c) Esterilizar la aguja de la base ala punta, enfriar y tomar una muestra de
cultivo.
d) Introducir la aguja en el medio sin llegar al fondo del tubo, sacarla por el
mismo trayecto de la entrada sin repetir la operación.
e) Flamear los bordes de los tubos y taparlos.
f) Esterilizar la aguja como lo realizo anteriormente.
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g) Etiquetar el tubo.
h) Incubar.
Figura 11. Esquema de la siembra por picadura.
4.- Siembra por estrías en caja de Petri
Aislamiento primario de bacterias:
Todo el proceso se realizará en zona estéril, junto al mechero y abriendo la caja sólo
que sea necesario. Los pasos son los siguientes:
a) Esterilizar el asa de siembra como se ha indicado y tomar una asada de la
muestra mixta.
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b) Tomar la caja de Petri, reposarla sobre la palma de la mano, abrir la tapa con
el pulgar y el dedo medio.
c) Colocar el inóculo en el borde del agar y hacer una estría inicial sin despegar el
asa, presionando, pero sin perforar el agar, hasta cubrir aproximadamente una
cuarta parte de la caja como se indica en la figura 12.
d) Bajar la tapa de la caja y esterilizar el asa.
e) Girar la caja de petri un cuarto de vuelta, levantar la tapa, enfriar el asa
tocando la superficie de agar, lejos de la estría recién hecha.
f) Tocar una vez más la superficie de la estría recién hecha con el asa y hacer un
segundo grupo de estrías. Tener cuidado de no cruzar ninguna de las estrías
originales.
g) Tapar la caja y repetir los paso d, e y f
h) Sellar la caja con kleen pack
i) Etiquetar con marcador indeleble la caja (medio de cultivo utilizado, muestra
empleada, No. de equipo, sección y fecha)
j) Incubar la caja de manera invertida.
Si se trata de un cultivo puro, se puede sembrar por estrías en un tubo de ensaye con
superficie inclinada o bien en una caja de petri realizando únicamente una estría en
toda la superficie.
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Figura 12. Método de aislamiento por siembra por estría en placa. Para obtener un cultivo
axénico: (a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero, (b)
introducirla en la suspensión bacteriana para recoger una muestra, (c) sembrar haciendo
estrías sobre la superficie de un medio sólido en una placa Petri, y (d) volver a esterilizar
el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo grupo de estrías en
una región nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta
conseguir que los grupos de células se diluyan y se separen células aisladas. (e) Después de
la incubación, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que el cultivo es puro,
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repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estrías una
segunda placa.
Figura 13. Algunos de los diseños que se pueden dibujar sobre el agar al inocular una caja
de petri.
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Figura 14.Características de los cultivos de bacterias
5.- Aislamiento de microbios extraídos con un aplicador de algodón
a) Introducir el aplicador de algodón a un cultivo mixto.
b) Trazar con el algodón unas líneas inoculando una pequeña zona en el borde de una
caja de Petri con agar nutritivo.
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c) Cubrir la caja, sumergir el aplicador en solución desinfectante, para posteriormente
quemarlo.
d) Esterilizar el asa como lo has realizado y pasarla al sector inoculado con el algodón,
realizando estrías por cuadrantes.
e) Esterilizar el asa, invertir la caja e incubar.
REPORTE
Resultados
a) Cultivos en medio líquido:
Característica
Microorganismo
Película
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b) Cultivos en medio inclinado:
Características
Medio
Medio
Microorganismo
Microorganismo
Forma de crecimiento
Pigmento
Turbidez
Sedimento
Pigmento
Otros
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Consistencia
Otros
c) Representar un cuadro de los resultados de los microorganismos sembrados en el
medio SIM.
Características
Microorganismo
Microorganismo
Forma de crecimiento
Pigmento
Consistencia
Otros
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d) Realizar esquemas de las estrías formadas en las cajas de petri.
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CUESTIONARIO
1.- ¿Qué es una cepa en bacteriología?
2.-¿Qué es un cultivo mixto? Y menciona 3 ejemplos.
3.- ¿Por qué los cultivos en caja de Petri deben de manejarse de manera invertida?
4.- ¿Cómo se puede evitar la introducción y desarrollo de microorganismos contaminantes
en un medio de cultivo?
5.- ¿Cuándo es recomendable utilizar el método de dilución en un cultivo?
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA
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Manual de Prácticas
PRÁCTICA No. 4
MORFOLOGÍA BACTERIANA Y COLONIAL
INTRODUCCIÓN
Las células bacterianas pueden presentar diversas formas, pero las más comunes son
los bastones llamados bacilos, las esferas llamadas cocos y en forma de espiral o
sacacorchos llamadas espirilos o vibriones.
Las formas más comunes son los bacilos, cuyo tamaño puede variar de tal manera
que algunos son tan cortos que se confunden con los cocos; sus extremos pueden ser
redondeados o rectos. Algunos al dividirse quedan alineados formando cadenas largas.
Las formas esféricas se presentan con frecuencia en agrupaciones coloniales de
distintas maneras: pueden formar cadenas, recibiendo entonces el nombre de estreptococos;
otros forman racimos irregulares, éstos son los llamados estafilococos; o se pueden agrupar
en paquetes de formas muy regulares como las sarcinas. En ocasiones se ordenan en pares
y reciben el nombre de diplococos.
Las bacterias en forma de espiral pueden ser cortos o largos, cuando son cortos
pueden tener solo una vuelta por lo que parecen bacilos curvos y en este caso se conocen
como vibriones, mientras que los espirilos presentan varias vueltas helicoidales, por lo que
son más largos.
Las agrupaciones se forman cuando la bacteria se divide dando origen a muchas
otras que cuando se desarrollan en un medio de cultivo aparecen en masas relativamente
grandes que se aprecian a simple vista. El término colonia se aplica a cada una de las masas
de crecimiento que se desarrollan sobre el medio sólido y se puede inferir que se trata de un
cultivo puro al suponerse que se formó a partir de una sola célula bacteriana.
Las colonias presentan características propias de cada especie (forma, color,
tamaño, elevación, tipo de bordes, etc.), por lo que pueden ser de utilidad en la
identificación; por esta razón es importante en un estudio bacteriológico realizar un
reconocimiento de la morfología colonial.
OBJETIVOS
1.- Reconocer las diferentes características que presentan las colonias bacterianas.
2.- Identificar las formas y tipos de agrupaciones que se pueden presentar en las bacterias.
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MATERIALES
- Microscopio compuesto
- Asa microbiológica
- Portaobjetos
- Regla
- Marcador indeleble
- Cultivos de bacterias en caja de Petri
METODOLOGÍA
a) Estudio de la morfología colonial.
1) Tomar un cultivo en caja de Petri y seleccione para su estudio algunas colonias
que se encuentren aisladas, procurando seleccionar una de cada tipo de los que hayan
desarrollado.
2) Numerar cada una de las colonias seleccionadas para que pueda identificarlas
(marcar los números con marcador permanente por fuera de la caja de Petri)
3) Tomar nota del color que presenta cada tipo seleccionado.
4) Anotar también el tamaño aproximado de las colonias, haciendo uso de una regla,
pero sin tocar el cultivo.
5) Analizar las características de forma, borde y tipo de elevación que presentan las
colonias.
6) Hacer esquemas de cada tipo de colonia.
b) Reconocimiento de las diferentes formas bacterianas.
1) Siguiendo siempre la técnica aséptica, prepare un frotis de cada una de las
colonias seleccionadas para el ejercicio anterior (la técnica para la preparación del frotis se
describe en la práctica de tinciones)
2) Aplique en cada frotis una técnica de tinción diferente.
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3) Observe al microscopio usando el objetivo de inmersión e identifique la forma de
las células bacterianas en cada una de las muestras.
4) Identifique el tipo de agrupación que presentan las bacterias.
Figura 15. Aspectos más comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre
medio sólido.
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Coco. Bacterias en forma
redonda, esferoides.
Bacilos: Bacterias de forma
cilíndrica. Los bacilos pueden
presentarse aislados o
agrupados.
Cocobacilos: Ciertas especies se
presentan como bacilos
pequeños, redondos difíciles de
distinguir de los cocos.
Diplobacilos: Pares de bacilos.
Estreptobacilos: Bacilos
agrupados en cadenas.
Vibriones: Bacterias curvas (en
forma de coma).
Bacterias en forma de espiral:
Muchas bacterias poseen una
forma semejante a bacilos largos
retorcidos para formar espirales
o hélices.
Dependiendo de las especies,
presentan diferencias
significativas en el número y
rigidez de las espiras y en la
longitud. A estas bacterias se los
denomina espirilos si son rígidas
y espiroquetas cuando son
flexibles.
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Figura 16. Diferentes formas de bacterias. A la izquierda se presenta un dibujo y a la
derecha el ejemplo de una especie bacteriana vista al microscopio.
Diplococos: Pares de células
Estreptococos: Cadenas de
cuatro o más células.
Tétradas: Son agrupaciones de
cuatro cocos en una disposición
cuadrada.
Se dividen en dos direcciones
perpendiculares.
Sarcinas: Paquetes cúbicos de
ocho células. Resultan de la
división en tres direcciones
perpendiculares.
Estafilococos: Se agrupan en
forma de racimos, no siguen un
patrón regular de orientación en
divisiones sucesivas.
Figura 17. Los tipos de agrupación que pueden presentar las bacterias de forma esférica
(cocos).
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REPORTE
Resultados
Escribir los resultados a continuación:
Morfología colonial
Colonia No.
Tamaño
Color
Forma
Bordes
Elevación
Superficie
Morfología bacteriana
Colonia No.
Forma
bacteriana
Agrupación
Reacción al
Gram
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CUESTIONARIO
1.- ¿Qué formas bacterianas no se encontraron en sus muestras?
2.- ¿Cuántos tipos de colonias encontró en su cultivo? ¿Qué indica esto?
3.- ¿Qué tipo de agrupaciones encontró?
4.- Investigue a qué se debe que las bacterias formen grupos de forma típica.
5.- ¿Se observó el núcleo de las bacterias? ¿Por qué?
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA
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PRÁCTICA No. 5
PREPARACIÓN DE FROTIS Y TINCIONES
INTRODUCCIÓN
Dado que por lo general las bacterias no tienen pigmentos y son incoloras en estado
natural en su forma real. Algunos investigadores como Robert Koch, Paul Erlich y otros
vencieron esta dificultad usando métodos de fijación (preparación de frotis) y tinción de
bacterias ya que es necesario teñirlas para poder observar su morfología así como también
poner de manifiesto algunas características de su estructura.
Los métodos de tinción pueden ser simples o diferenciales.
a) Tinciones Simples: son aquellas en las que solo se utiliza un colorante ya que
muchas bacterias tienen material ácido (RNA o DNA) distribuido en su célula, por
lo que se colorea intensamente con colorantes básicos estos son colorantes
nucleares ejemplo: fucsina básica, cristal violeta, azul de metileno entre otras.
b) Las tinciones diferenciales son aquellas en las que se utilizan dos o más colorantes
que ponen de manifiesto alguna(s) estructura (s) o un tipo de células se tiñen de un
color y el resto de otro.
El método de tinción más utilizado es el de la tinción del Gram, ya que es la
coloración más importante para bacterias fue ideada por Hans Cristian Gram en 1884,
permitió distinguir entre varias especies de bacterias que pueden presentar morfología
colonial similar.
Cuando las bacterias retienen el complejo cristal violeta-yodo, tiñéndose de violeta,
son bacterias gram (+), las bacterias que se tiñan de rojo por la safranina son gram
negativas.
Las células bacterianas gram (+) se les adhiere el cristal violeta, porque hay
disminución de la permeabilidad de la pared celular causada por el efecto deshidratante del
alcohol, mientras que las gram (-) el complejo sale por el aumento de la permeabilidad
causada por la solubilidad de los lípidos de la pared celular al alcohol.
Existen también bacterias gram variables (Nisseria spp) y bacterias gram no
reactivas (Mycobacterium spp) otros ejemplos de tinciones diferenciales son: la tinción
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ácido-alcohol-resistente (utilizada para diferenciar bacterias del género Mycobacterium de
otros tipos) y la tinción de endosporas.
OBJETIVOS
1. Aprender a realizar frotis y preparaciones fijas de bacterias.
2. Conocer los métodos de tinciones, practicar la técnica de tinción simple usada en
bacteriología.
3. Conocer y distinguir que es tinción diferencial así como aplicar la técnica de
Tinción de Gram.
MATERIALES
- Cultivos de: Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis
- Azul de metileno
- Cristal violeta 0.1% en solución acuosa
- Yodo lugol
- Alcohol-cetona (1:1)
- Safranina
- Aplicador estéril (sí el instructor lo cree necesario).
- Agua destilada
- Aceite de inmersión
- Papel seda
- Asa bacteriológica
- Marcador permanente
- Alcohol y algodón para limpiar su mesa
- Goteros y micro pipeta
- Mecheros
- Portaobjetos
- Microscopio compuesto
METODOLOGÍA
a) Preparación de Frotis y Fijado
1. - limpiar con alcohol el portaobjetos donde se realizará el frotis, dejarlo
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secar, una vez seco pasarlo por el mechero 2 o 3 veces.
2.- Cuando este frió, marcar la cara donde se hará el frotis.
3.- Calentar el asa de inoculación hasta que este al rojo vivo el metal.
4.-. Tomar el cultivo del que se hará el frotis y flamear la boca
de este. Tomar la porción de la muestra que se va a examinar
por medio de un asa.
5.- Colocar la muestra sobre un portaobjetos limpio y sin grasa,
debidamente marcado
***Si la muestra se encuentra en un medio líquido, basta con colocar
una pequeña gota con el asa estéril sobre el portaobjetos.
***Si la muestra está en un medio sólido, colocar una gotita de solución salina o agua
destilada estéril sobre el portaobjetos y con el asa estéril se transfiere una pequeña muestra
de bacterias en la gotita.
6.- Trazar con la muestra una espiral del centro a la periferia. Extienda con
el asa la gotita para obtener un frotis delgado y uniforme. Secar al aire.
7.- Calentar nuevamente el asa para esterilizarla.
8.- Dejar secar el frotis cerca del mechero encendido durante 10
min o hasta que seque completamente.
9.- Fijar el frotis con calor suave sobre la flama del mechero,
pasándolo tres veces a través de la llama con la muestra hacia arriba, de tal forma que
pueda tolerarlo sobre el dorso de la mano.
b) Tinción Simple
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1.- Cubra el frotis (B. subtilis) con la solución de azul de metileno durante 2 minutos.
a) Lave el portaobjetos, con una corriente
suave de agua, de manera que el agua no
incida directamente sobre la preparación
hasta que ya no escurra colorante.
b) Deje secar el frotis al aire.
c) Enfocar y Localizar la zona teñida con el objetivo de 10X, observar las bacterias al
microscopio con el objetivo de 100X.
2.- Hacer frotis de cada uno de los cultivos.
A) dejar secar a temperatura ambiente.
B) Fijar al calor.
C) Agregar cristal violeta durante 1 minuto.
D) Lavar con agua y secar.
E) Observar a inmersión.
3.- Repetir el inciso C, en lugar de cristal violeta usar safranina.
4.- Opcional.
A) con un aplicador tomar un exudado de su boca de preferencia por el borde gingival.
B) Hacer un frotis.
C) Teñir con cristal violeta 0.1 % durante un minuto
D) Observar a inmersión e identificar cocos, bacilos, etc.
A) Tinción de Gram.
Consta de cuatro reactivos diferentes: el cristal violeta es el primer colorante o colorante
primario que imparte color a todos los microorganismos del frotis. Enseguida se utiliza una
solución del yodo (lugol), la que actúa como mordente (que aumenta o refuerza la unión,
entre un colorante y un sustrato ), el tercer reactivo es un decolorante que disuelve y
arrastra el colorante primario, los organismos que resisten la decoloración y conserva una
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tonalidad azul son Gram (+), el cuarto reactivo es el colorante de contraste la safranina que
se aplica como contra tinción ya que los organismos se destiñeron con el decolorante, ahora
toman el color rojo de la safranina denominándose gram (-).
PASOS A SEGUIR EN LA TÉCNICA DE GRAM
1.- Preparar los frotis como en la técnica de tinciones simples. Y preparación de frotis y
fijado.
2.- Preparar los frotis con cultivos de S. epidermis, E. coli.
3.- Cubrir los frotis con cristal violeta durante un minuto.
4.- Lavar los portaobjetos con una corriente suave de agua.
5.- Cubrir los frotis con yodo – lugol durante 1 minuto.
6.- Lavar como se indicó en el paso (4).
7.- Decolorar con alcohol-cetona hasta que no escurra líquido azul.
8.- Lavar inmediatamente como se hizo en el paso (4).
9.- Cubrir el frotis con safranina durante 1 minuto.
10.- Lavar como en el paso (4).
11.- Observar al microscopio a inmersión. OB (100 X). Ver figura Tinción Gram.
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Figura 18. Al finalizar el proceso de Tinción de Gram, las bacterias gram-positivas se tiñen
de color púrpura-violeta y las bacterias gram-negativas se tiñen de color rojizo-rosado.
Gram positivos
(De violeta a azul claro) Gram negativos
(De rosa a rojo intenso)
Forma: cocos y bacilos (finos, gruesos,
ramificados) Agrupaciones: racimos,
cadenas, tétradas
Forma: cocos, bacilos y vibrios.
Agrupaciones: aislados, en parejas
(diplos)
Figura 19. Interpretación de resultados a partir de la tinción de Gram.
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REPORTE
Resultados
A) Realizar esquemas de lo observado.
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B) Realizar una tabla donde indique cada uno de los microorganismos observados su
forma, agrupación y reacción al Gram.
CUESTIONARIO
1. ¿Por qué es necesario fijar el frotis al calor?
2. Ejemplos de tinción simple o colorantes básicos
3. Explica:
a) Las diferencias en composición química por estructura de las paredes
celulares gram (+) y gram (-).
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b) ¿Qué tipo de bacterias toma el colorante primario y que tipo el de contraste?
4. ¿Podría sustituirse el colorante primario por otro colorante en la tinción de Gram?
Explica.
5. ¿Qué inconveniente encontraría si agrega primero safranina en esta técnica?
6. Mencione 5 bacterias gram (+) patógenas así como las enfermedades que causan.
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA
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PRÁCTICA No. 6
REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LOS MICROORGANISMOS
INTRODUCCIÓN
Una de las facetas más importantes de cualquier estudio de los seres vivos es la
NUTRICIÓN. La nutrición trata sobre las clases de alimentos que un organismo debe
incluir en su dieta.
Al igual que todos los seres vivos los microorganismos requieren una fuente de
NITRÓGENO utilizable, proveniente de alguna sustancia que contenga dicho Nitrógeno;
como las Proteínas o los aminoácidos. Pero muchos otros no requieren formas tan
complejas de este elemento, los compuestos de amonio; inclusive el Nitrógeno como su
forma natural gaseosa que de hecho constituyen la única fuente de Nitrógeno, todas ellas
para que la célula produzca sus proteínas celulares.
Otro compuesto familiares nutritivo son los CARBOHIDRATOS que por lo general
proporcionan energía inmediata o rápida. La fuente de energía varía entre los
microorganismos; algunos pueden emplear la mayoría de los carbohidratos, mientras que
otros únicamente algunos o ninguno.
Muchos microorganismos requieren fuentes de energía muy compleja
molecularmente, pero otros poseen requerimientos muy sencillos.
Idealmente, todos los distintos medios de cultivo que se emplean en Microbiología deberían
ser del tipo llamado sintético, por lo que la formula química estructural se conoce con
exactitud.
Otras sustancias nutritivas son en general las Sales Minerales que proporcionan
iones o elementos que intervienen en el metabolismo de la célula.
En el estudio de la nutrición microbiana, es práctica común preparar una “dieta”
completa que incorpore todos los factores esenciales para el crecimiento o excepto aquel
que se quiera probar para determinar si el microorganismo es capaz de degradar o no.
Los microorganismos necesitan para su subsistencia que el sustrato los provea de
Agua, Carbono, Nitrógeno, Fósforo, Azufre y sales de sodio o de potasio, que toma por
diferentes procesos de asimilación.
Las bacterias se pueden clasificar de acuerdo a los requerimientos nutricionales en:
Autotrofas y Heterotrofas. Las primeras son aquellas que transforman sustancias
inorgánicas en orgánicas y las últimas, toman los elementos necesarios para su nutrición de
compuestos orgánicos.
OBJETIVO
1. El alumno inoculará microorganismos en medios con diferentes contenidos de
requerimientos nutricionales y diferenciará su crecimiento en los mismos.
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Manual de Prácticas
MATERIALES - Cultivo de 24 hrs. de Escherichia coli, Saccharomyces cereviceae y Streptococcus
feacalis o Staphylococcus epidermidis.
- 4 cajas de Petri con:
- Únicamente agar.
- Agar y minerales.
- Agar, minerales y fuente de Carbono orgánico (glucosa)
- Agar, minerales, glucosa y fuentes de Nitrógeno (peptona).
- Asa bacteriológica
- Mechero.
- Marcador permanente
METODOLOGÍA
a) Dividir las 4 cajas de Petri en 4 partes cada una.
b) Inocular las 3 cepas en cada parte dividida, una parte quedará sin inocular.
c) Incubar a 35°C /48 hrs.
d) Anote sus resultados y haga los esquemas de lo que realizó.
e) Escriba sus observaciones y conclusiones.
REPORTE
Resultados
C) Realizar esquemas de lo observado.
D) Elaborar una tabla donde indique cada uno de los microorganismos observados su
crecimiento y los diferentes requerimientos que asimilo.
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CUESTIONARIO
1. Defina lo que es un Nutriente.
2. Enumere 3 sustratos como fuente de Carbono.
3. Enumere 3 sustratos como fuente de Nitrógeno.
4. Explique ¿Por qué los microorganismos tienen diferentes requerimientos
nutricionales?
5. En base a los resultados obtenidos. Explica con qué nutrientes se obtuvo el mayor
crecimiento bacteriano.
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA
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Manual de Prácticas
PRÁCTICA No. 7
FERMENTACIÓN DE LACTOSA
INTRODUCCIÓN
La fermentación de la lactosa, también llamada fermentación láctica, es el proceso
celular donde se utiliza glucosa para obtener energía teniendo como producto de desecho
la formación de ácido láctico.
Se produce en muchas bacterias (bacterias lácticas), también en algunos protozoos y
en el músculo esquelético humano. Es responsable de la producción de productos lácteos
acidificados tales como yogurt, quesos, cuajada, crema ácida, etc. El ácido láctico tiene
excelentes propiedades conservantes de los alimentos.
Las bacterias difieren en los hidratos de carbono que pueden utilizar y en los tipos y
cantidades de ácidos mixtos producidos. Estas diferencias de actividades enzimáticas
constituyen una de las características importantes por las cuales se reconocen las diferentes
especies.
La fermentación bacteriana de la lactosa es más compleja que la de la glucosa, ya
que la lactosa es un disacárido compuesto de glucosa y galactosa unido por un enlace
glucosídico.
La capacidad de un microorganismo para fermentar un carbohidrato dado, depende
de las enzimas que contenga el microorganismo. Los productos finales de la fermentación
varían de un microorganismo a otro.
Un ejemplo de este tipo de fermentación es la acidificación de la leche. Ciertas
bacterias (lactobacilos), al desarrollarse en la boca utilizan la lactosa (azúcar de leche)
como fuente de energía. La lactosa, al fermentar, produce energía que es aprovechada por
las bacterias y el ácido láctico es eliminado. La precipitación de las proteínas de la leche,
ocurre por el descenso de pH debido a la presencia de ácido láctico. En ausencia de
oxígeno, las células animales convierten el ácido pirúvico en ácido láctico. El ácido láctico
puede ser un veneno celular. Cuando se acumula en las células musculares produce
síntomas asociados con la fatiga muscular.
El ácido láctico se produce mediante la fermentación alcohólica y fermentación
láctica. En condiciones anaerobias (ausencia de oxígeno), la fermentación responde a la
necesidad de la célula de generar la molécula de NAD+, que ha sido consumida en el
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proceso energético de la glucólisis. En la glucólisis la célula transforma y oxida la glucosa
en un compuesto de tres átomos de carbono, el ácido pirúvico, obteniendo dos moléculas de
ATP; sin embargo, en este proceso se emplean dos moléculas de NAD+ que actúan como
aceptores de electrones y pasan a la forma NADH. Para que puedan tener lugar las
reacciones de la glucólisis que producen energía es necesario restablecer el NAD+ por otra
reacción.
Figura 20. La Glucólisis, del griego glycos: azúcar y lysis: ruptura, es el primer paso de la
respiración, es una secuencia compleja de reacciones que se realizan en el citosol de la
célula y por el cual la molécula de glucosa se desdobla en dos moléculas de ácido pirúvico.
Es el ciclo metabólico más difundido en la naturaleza, también se lo conoce como ciclo de
Embden-Meyerhof.
OBJETIVO
1.- Realizar una prueba presuntiva de fermentación de carbohidratos
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MATERIALES
Muestras problema de agua y alimentos
Caldo lactosado
Tubos de ensaye con agua estéril
Tubos para campana Durham
Algodón
Asa de siembra
Incubadora
Termómetro
Mechero
Alcohol
Pipetas estériles
Pinzas estériles
Papel aluminio estéril
Balanza
Marcador permanente
METODOLOGÍA
1) Con el marcador permanente
Etiquetar cada uno de los tubos que
contiene caldo lactosado con los
siguientes datos:
Tipo de muestra
Fecha
No. de equipo
Sección.
2) Con las muestras líquidas ejemplo fig. 23, medir 1 ml. y verterlo al tubo con caldo
lactosado fig. 24mezclar perfectamente agitando el tubo, incubar a 36°C + - 0.5
durante 48 hrs.
Figura 21. Los datos deben marcarse perfectamente en cada tubo para evitar confusiones en los
resultados.
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Figura 23.-Muestras liquidasFig. 24.- Tubos con caldo lactosado inoculados
3) Si la muestra es sólida, pesar un gramo del alimento y depositarlo en el tubo con agua
estéril, agitar y tomar 1 ml. de esta muestra e incorporarla al tubo con el caldo
lactosado. Incubar como se explicó en el paso anterior.
Figura 25.-Incubadora
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NO GAS GAS
SIN VIRAJE DE COLOR CON
VIRAJE DE COLOR
Figura 26. Tubos con campana Durham.
REPORTE
Resultados
Dibujar cada uno de los tubos e indicar si son positivos o negativos.
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CUESTIONARIO
1.- ¿Qué se forma con la fermentación de carbohidratos?
2.- ¿Cuál es la función de la campana Durham?
3.- ¿Qué es una prueba presuntiva para la determinación de coliformes?
4.- En base a la clasificación de medios de cultivo, ¿Qué tipo de medio es el caldo lactosado
según sus componentes?
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA
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PRÁCTICA No. 8
DETERMINACIÓN DE COLIFORMES
INTRODUCCIÓN
Con el análisis bacteriológico del agua o de los alimentos se puede determinar
parcialmente si son aptos o no para el consumo humano. Con este tipo de estudios es
posible detectar a microorganismos que son muy numerosos en las aguas negras y en las
heces fecales, son las bacterias coliformes fecales de la familia Enterobacteraceae.
Cuando estos organismos se encuentran presentes en el agua o alimentos, nos indica
que han sido contaminados con aguas negras o materia fecal. Puede ser que contengan
bacterias que causen enfermedades gastrointestinales como la fiebre tifoidea o disentería.
OBJETIVO
1.- Realizar una prueba confirmativa para coliformes.
MATERIALES:
- Tubos positivos de la práctica anterior
- Caldo bilis verde brillante
- Caldo EC
- Incubadora
- Baño María
- Termómetro
- Algodón
- Alcohol
- Asa bacteriológica
- Marcador permanente
METODOLOGÍA
1.- Separar los tubos positivos de la práctica anterior.
2.- Por cada tubo positivo, con el marcador permanente etiquetar un tubo con caldo EC y
otro con caldo bilis verde brillante.
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3.-Determinación de Coliformes Totales: Esterilizar el asa y tomar una muestra de caldo
lactosado e inocular el tubo con caldo bilis verde brillante, incubar a 36°C por 48 hrs.
4.- Determinación de Coliformes Fecales: Repetir el paso anterior pero ahora inoculando el
tubo con caldo EC , incubar a 45°C en baño María durante 24 hrs.
5.- Realizar una tinción de Gram de las muestras positivas.
Calde EC o CBVB Incubar
Figura 27
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Interpretación de resultados
La reacción es positiva cuando se produce fermentación de los carbohidratos del
medio que provoca que este vire a amarillo y produzca gas que queda retenido en la
campana Durham.
Figura 28. El viraje de color del medio indica crecimiento de la bacteria inoculada con utilización de la lactosa como fuente de carbono.
Figura 29. El gas en la campana de Durham indica fermentación de la lactosa con formación de gas a esa temperatura de 37 ºC.
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Figura 30. La determinación de coliformes se realiza mediante la utilización de medios de
cultivo selectivos.
Figura 31.El grupo coliforme está formado por los siguientes géneros: a) Enterobacter,
b)Klebsiella, c) Citrobacter y d) Escherichia (No todos los autores incluyen al género
Citrobacter dentro de este grupo).
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REPORTE
Resultados
a) Dibujar y reportar las muestras positivas como coliformes totales y/o fecales.
b) Indicar el sitio exacto donde fueron comprados los alimentos.
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CUESTIONARIO
1.¿Qué características tienen las bacterias coliformes?
2. Menciona 3 géneros de bacterias coliformes indicando su importancia.
3. Los medios que se utilizaron en esta práctica, son diferenciales o selectivos, ¿por qué?
4. Indica las diferencias entre coliformes totales y fecales.
5.- Completa el siguiente cuadro correctamente.
Medio de cultivo Componentes
Caldo lactosado
Caldo bilis verde brillante
Caldo EC
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PRACTICA No. 9
AGENTES FÍSICOS Y AMBIENTALES
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos responden de manera distinta a cualquier cambio que puede
presentarse en su entorno que no sea de índole nutricional o química; sino más bien de
carácter físico y ambiental; los cuales tienen una relación muy estrecha en consecuencia de
su desarrollo y finalmente de su crecimiento. Estos efectos hacen responder a los
microorganismos de tal virtud que se han agrupado en diferentes categorías en
consecuencia a dicho resultado:
1. Cuando se toma como parámetro la temperatura los microorganismos se clasifican
en:
a) Psicotróficos
b) Mesofílicos
c) Termofílicos y termodúricos
De los agentes físicos, el calor tienen las mayores aplicaciones y los métodos más
importantes para el estudio y cultivo de los microorganismos. Y para la destrucción de
éstos bajo ciertas condiciones son la esterilización y la pasteurización.
2. Refiriéndose al pH está enfocado a la preferencia que tienen ciertos grupos de
microorganismos, sin embargo podemos encontrar bacterias que pueden crecer no
solo a pH neutro, sino que también a pH tanto acido ( de 5.0 a 6.5) y alcalinos (de
8.0 a 9.0). Por otra parte los hongos y levaduras desarrollan a pH por debajo de 5.0,
y muchos hongos filamentosos desarrollan a márgenes de pH extremos.
3. De acuerdo a la capacidad de resistir presiones osmóticas considerablemente altas se
encuentran los halofílicos. Tiene mucho que ver la Actividad Acuosa (Aw) que se
relaciona con esta tipo de parámetro.
4. Cuando los microorganismos se desarrollan y crecen adecuadamente respondiendo a
condiciones de atmosfera de incubación se clasifican en:
a) Aerobios estrictos
b) Aerobios y anaerobios facultativos
c) Anaerobios estrictos
d) Microaerofílicos
e) Capnofílicos
5. Existe un factor fisicoquímico denominado Potencial Redox (Eh), que tiene mucho
que ver tanto con el comportamiento aerobio y anaerobio de los microorganismos,
como su capacidad de reducir u oxidar sustancias orgánicas e inorgánicas.
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OBJETIVO
1. Realizar técnicas de carácter físico que alteran el entorno en que se desarrollan los
microorganismos y estudiar la clasificación que se les da de acuerdo a cada parámetro
físico.
DESTRUCCIÓN DE LAS BACTERIAS POR EL CALOR.
MATERIALES
Cultivos bacterianos.
2 tubos o matraces con caldo nutritivo estéril.
2 cajas de Petri con agar nutritivo (A.N.).
Asa bacteriológica
Mechero.
Marcador permanente
MÉTODO
f) Inocule los tubos o matraces con las cepas bacterianas proporcionadas.
g) Marcar los tubos perfectamente y calentarlos de la siguiente forma:
Tubo 1: 61 °C por 10 minutos.
Tubo 2: 61 °C por 20 minutos.
Tubo 3: 100 °C por 10 minutos.
Tubo 4: 100 °C por 20 minutos
Tubo 5: 121 °C por 15 minutos.
Tubo 6: No calentar (control).
h) Dividir una caja de Petri con A.N. en 6 partes y sembrar una asada de cada uno de
los tubos.
i) Incubar a 37°C /24 hrs.
j) Haga lo mismo, usando la otra cepa.
k) Llene la siguiente tabla con los resultados para el efecto del calor de las bacterias.
Microorganismos CRECIMIENTO DESPUÉS DEL CALENTAMIENTO
CONTROL 61°C/10’ 61°C/20’ 100°C/10’ 100°C/20’ 120°C/15’
l) Haga los esquemas representativos
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CUESTIONARIO
6. ¿Cuáles son los intervalos de temperatura óptima de cada uno de los siguientes
grupos de microorganismos?
Anote ejemplos de cada uno de los grupos
a) Psicotróficos,__________________________________________________Ejemplo
s:__________________________________________________________________
____
b) Mesofílicos,_________________Ejemplos: __________________________.
c) Termofílicos y termodúricos, _____________________________________
Ejemplos: ____________________________________________________.
7. Mencione algunas bacterias patógenas que sean sensibles al calor.
8. ¿Cuál es el pH óptimo de crecimiento de las bacterias, hongos y levaduras que sean
patógenas?
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA
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PRÁCTICA No. 10
EVALUACIÓN DE PRODUCTOS COMERCIALES
ANTIMICROBIANOS
INTRODUCCIÓN
Desde que se tuvo conocimiento de que muchas enfermedades son ocasionadas por
microorganismos, la humanidad ha estado buscando la forma de exterminarlos.
En la actualidad existen en el mercado infinidad de productos a los que se les
atribuyen propiedades germicidas y que tienen muy diversos usos: pastas de dientes,
líquidos desinfectantes, etc.
Es interesante valorar el poder antimicrobiano que tienen este tipo de productos.
Para ello existen técnicas como la de difusión en agar y la técnica de diluciones en tubo. En
esta ocasión se aplicará la técnica en tubos, la cual consiste en agregar a un cultivo del
microorganismo, una cantidad conocida del producto que se desea probar.
OBJETIVOS
1.- Evaluar la eficacia en la actividad antimicrobiana de diferentes productos comerciales.
2.- Comparar diferentes marcas de productos de este tipo.
MATERIALES
- Tubos con caldo nutritivo estéril
- Mechero
- Asa bacteriológica
- Diferentes agentes antimicrobianos comerciales
- Cultivos puros de Escherichia coli y Staphylococcus sp.
- Marcador permanente
- Pipetas estériles de 1ml
- Pipetero de Acero Inoxidable
- Horno Pasteur
METODOLOGÍA
1) En un tubo con caldo nutritivo estéril, con la pipeta esterilizada de 1ml agregar
0.l ml. de solución del antimicrobiano que se desea probar.
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2) Enseguida inocular en un tubo un cultivo puro de Escherichia coli.
Como se muestra en la fig.32
3) Repetir la operación del inciso 1 y 2 con Staphylococcus sp.
4) Agitar los tubos para distribuir uniformemente las bacterias.
5) Incubar durante 48 horas a 35 o 37ºC
6) Después de la incubación observar si hay desarrollo.
Figura 32
Figura 32. Es importante cuidar la asepsia durante la evaluación de los productos
antimicrobianos, ya que así se sabrá en verdad cual es su alcance y eficacia en el control de
microorganismos indeseables.
Figura 33. Difusión en agar y diluciones en tubo para probar la eficacia de los productos
antimicrobianos.
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REPORTE
Resultados
Escribir los resultados a continuación:
Microorganismo
Agente
antimicrobiano
Desarrollo
Efectividad
CUESTIONARIO
1.- Mencione dos de los diferentes efectos que pueden tener los agentes químicos sobre los
microorganismos.
2.- ¿Qué aplicación tienen los agentes probados?
3.- ¿Qué indica un resultado con desarrollo microbiano en presencia del agente químico?
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4.- ¿Cuál de los agentes probados tuvo mayor efectividad con E. coli?
5.- ¿Cuál de los microorganismos utilizados presentó mayor sensibilidad a los agentes
químicos?
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA
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PRÁCTICA No. 11
DIFERENCIA ENTRE UN AGENTE BACTERICIDA
Y UN BACTERIOSTÁTICO
INTRODUCCIÓN:
Por sus efectos en los microorganismos los agentes químicos pueden ser de dos
tipos básicos: bactericidas y bacteriostáticos.
Cuando un antibiótico mata a los microorganismos se dice que es bactericida;
mientras que cuando simplemente impide su desarrollo se habla de un bacteriostático. Por
lo general los agentes bacteriostáticos tienen un efecto reversible; es decir, que al eliminar
el agente, los microorganismos vuelven a su actividad normal y pueden crecer si se les
coloca en las condiciones que necesitan para su crecimiento.
OBJETIVO
1. Probar la acción bactericida o bacteriostática de algunos agentes químicos con efecto
antimicrobiano.
MATERIALES:
- Tubos con caldo nutritivo estéril
- Asa bacteriológica
- Mechero
- Tubos problema de la práctica anterior
-.Marcador permanente
METODOLOGÍA
1) Con el asa estéril Tomar una asada del material contenido en cada uno de los tubos en
que se probaron los agentes químicos de la práctica anterior. (los negativos)
2) Inocular por separado en tubos que contengan caldo nutritivo estéril.
3) Incubar a 37ºC por 48 horas.
4) Después del tiempo de incubación, observar si hay desarrollo del cultivo.
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NOTA: Se toman como positivos aquellos tubos en los que se presente turbidez en el medio
y como negativos los que estén cristalinos (Fig. 34).
Figura 34. Tubos con microorganismos y dosis de productos antimicrobianos.
REPORTE
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Resultados
Escribir los resultados a continuación:
Microorganismo
Agente
Químico
Turbidez en
el medio
Efecto
del agente
CUESTIONARIO
1.- ¿Qué diferencia hay entre un agente bactericida y un bacteriostático?
2.- En ausencia de un agente químico antimicrobiano, ¿qué otros factores pueden inhibir
del crecimiento de las bacterias?
3.- Por qué se utilizaron únicamente los tubos negativos de la práctica anterior?
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PRACTICA No. 12
PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS
INTRODUCCIÓN
Un antibiótico se ha definido como una sustancia producida por un organismo
viviente, que inhibe el crecimiento o la actividad de otro organismo y que tiene una
toxicidad selectiva.
El uso de los antibióticos en la quimioterapia tuvo su origen en 1929 cuando
Fleming encontró que el hongo Penicillium inhibía el crecimiento de los estafilococos,
desde entonces se han descubierto otros organismo productores de este tipo de sustancias y
en la actualidad muchos se preparan por síntesis.
Aunque se han encontrado cientos de antibióticos diferentes, no todos se utilizan en
medicina, ya que la mayoría de ellos presentan una alta toxicidad para el organismo
humano. Los que se utilizan son aquellos que tienen efecto sobre los microorganismos, a
concentraciones relativamente inofensivas para las células humanas.
No todas las substancias con propiedades antibióticas actúan de la misma manera,
sino que se pueden presentar diferentes mecanismos de acción.
La actividad antimicrobiana se mide in vitro para determinar: 1) la potencia de un
agente antimicrobiano en solución; 2) la concentración de agentes en los líquidos del
cuerpo o en los tejidos y 3) la sensibilidad de un microorganismo dado, a concentraciones
conocidas de la droga.
En muchos casos de infección es necesario conocer la sensibilidad del
microorganismo al antibiótico, incluso cuando se conoce la identidad del agente causal, ya
que existen muchas cepas mutantes que se tornan resistentes.
La sensibilidad a los antibióticos se puede medir por un método de difusión en agar,
o utilizando una técnica de dilución en tubo para determinar la concentración inhibitoria
mínima (CIM).
Existen varios aspectos importantes en la interpretación de los métodos de
sensibilidad con discos, ya que la zona de inhibición de crecimiento depende de varios
factores:
1.) El poder de difusión del antibiótico en el medio. Algunos antibióticos no
difunden bien en el medio de cultivo utilizado.
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2.) El espesor del medio de cultivo. Una capa gruesa del medio permite una mayor
difusión vertical del antibiótico, disminuyendo entonces la difusión en la superficie; por
estas razones la zona de inhibición resulta relativamente menor en las placas gruesas.
3.) La colocación correcta del disco. Mientras mayor sea la superficie del medio
que toque el disco, mayor será la difusión del antibiótico, y por lo tanto, será mayor su
efectividad.
4.) Agentes bloqueadores. Existen algunas substancias con efecto bloqueador de la
acción de los antibióticos. Por ejemplo, el ácido paraaminobenzoico bloquea la acción de
las sulfonamidas; por lo tanto si quiere investigarse la sensibilidad a estas sustancias debe
utilizarse un medio que no contenga este ácido.
5.) El pH del medio. La aureomicina da zonas de inhibición más anchas en los
medios ácidos que en los alcalinos, mientas que para el caso de la estreptomicina los
resultados son a la inversa.
6.) La tasa de desarrollo de los microorganismos que se investigan. Un
microorganismo de desarrollo lento permite que un antibiótico de difusión rápida
establezca un nivel bactericida en el medio ambiente antes de que el desarrollo produzca
fenómenos visibles. Un microorganismo de desarrollo rápido, alrededor del mismo disco
de antibiótico, podría alcanzar un nivel bastante alto antes de que se obtuvieran
concentraciones bactericidas en el medio; en estas condiciones la zona de inhibición sería
mucho menor.
OBJETIVO
1. Probar la efectividad de algunos antibióticos sobre dos cepas de Escherichia coli y
Staphylococcus aureus.
MATERIALES:
- Discos impregnados con diferentes antibióticos
- Pinzas
- 2 Cajas de Petri con agar nutritivo estéril
- Mechero
- Pipetas estériles
- Hisopos estériles
- Cultivos puros de: Escherichia coli y Staphyococcus aureus.
- Marcador permanente
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METODOLOGÍA
Método de Kirby-Bauer (difusión en agar)
1) Tomar una caja de Petri con agar nutritivo estéril.
2) Inocular cerca de la periferia del medio, con una asada llena de cultivo puro de
Escherichia coli.
3) Con un hisopo estéril distribuir uniformemente el inóculo por toda la superficie del
medio de cultivo como se ilustra en la figura 35.
4) Sumergir en solución desinfectante el hisopo, para posteriormente esterilizarlo.
5) En otra placa hacer lo mismo con un cultivo de Staphylococcus aureus.
6) Enseguida colocar sobre la superficie sembrada, los discos impregnados de diferentes
antibióticos, procurando que se adhieran bien al medio para que pueda efectuarse la
difusión sin problemas.
7) Etiquetar las cajas con los datos correspondientes.
8) Incubar a 35ºC por 48 horas.
9) Observar, interpretar los resultados y tomar nota de ellos.
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Figura 35
Interpretación de resultados:
Durante la incubación, el agente antimicrobiano difunde desde el disco hacia el
agar; cuanto más se aleja del disco, menor será su concentración.
A una cierta distancia del disco se alcanza la MIC (concentración mínima
inhibitoria); pasado este punto hay crecimiento, pero pasado este punto no hay desarrollo
bacteriano, sino que se presenta una zona de inhibición (ver fig. 36 y 38), y el diámetro de
esta zona es proporcional a la cantidad de agente antimicrobiano añadida al disco y a la
efectividad total del agente contra el microorganismo.
Cada disco debe tener especificada la concentración de antibiótico que contiene y
después de la incubación, se podrá observar la presencia o ausencia de la zona de
inhibición. Si existe esta zona deberá medirse el diámetro de la misma, hasta donde
empieza el crecimiento bacteriano.
Las medidas de las zonas inhibitorias dadas en milímetros, se comparan con datos
estándar para saber si realmente el microorganismo es sensible al antibiótico en cuestión
(ver tabla).
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Figura 36. Disco de antibióticos (también llamado disco de Kirby-Bauer)
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Figura 37. Método de la difusión en agar para determinar la actividad de los antibióticos.
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FIGURA 38. Después de la incubación se observan zonas de inhibición alrededor de los
antibióticos que son efectivos.
REPORTE
Resultados
En el siguiente cuadro anote sus resultados para las dos especies probadas:
a) El nombre del antibiótico.
b) El código que corresponde al antibiótico en el disco.
c) El diámetro de la zona de inhibición, medida en milímetros.
d) De acuerdo a las medidas del diámetro, compare en la tabla de datos del inserto estándar
y anote si el microorganismo es sensible, intermedio o resistente al antibiótico.
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Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Agente
antimicrobiano
Código
Diámetro
en mm.
Sensibi-
lidad
Código
Diámetro
en mm.
Sensibi-
lidad
CUESTIONARIO
1.- ¿Qué diferencia existe entre un agente antimicrobiano y un antibiótico?
2.- ¿Por qué en algunas ocasiones los antibióticos no funcionan?
3.- ¿Qué aplicación tiene la prueba de sensibilidad a los antibióticos?
4.- ¿Qué indica la ausencia de una zona de inhibición?
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5.- De acuerdo a sus resultados ¿qué antibiótico recomendaría aplicar para el caso de una
infección por Staphylococcus aureus?
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA
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BIBLIOGRAFÍA
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Cowan K. y Park. K. T. 2006. Microbiology systems approach. McGraw Hill International
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Editorial REPLA- España. 836.pp.
Tortora, F. C. 2001. Microbiology. Addison Wesley Longman
887 pp.