UNIVERSIDAD DE PANAMÁ
VICERECTORÍA DE POSTGRADO E INVESTIGACIÓN
FACULTAD DE MEDICINA
EVALUACIÓN DEL MÉTODO DE INACTIVACIÓN DE
CARBAPENEMES (mIC) FRENTE A LA TÉCNICA DE PCR
PUNTO FINAL PARA LA DETECCIÓN DE CARBAPENEMASAS
EN AISLAMIENTOS CLÍNICOS DE BACILOS GRAM
NEGATIVOS (BGN) Y BACILOS GRAM NEGATIVOS NO
FERMENTADORES (BGNNF) DEL LCRSP, 2015- JUNIO 2017.
TESIS DE INVESTIGACIÓN PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE
MAESTRÍA EN SALUD PÚBLICA
ELABORADO POR
JACKELINE MORÁN PIMENTEL
ASESOR: DR. CARLOS BRANDARIS
PANAMÁ
2018
1
DEDICATORIA
A Luca´s, mi hijo, la razón de mi vida y la única persona que me motiva día a día a
mejorar. Te amo mi niño.
2
AGRADECIMIENTOS
A la Red Nacional de Vigilancia en Microbiología Clínica por los aislamientos enviados
y al Laboratorio Central de Referencia en Salud Pública del ICGES por el apoyo
brindado.
3
ÍNDICE GENERAL
RESUMEN 8
INTRODUCCIÓN 9
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 10
JUSTIFICACIÓN DEL PROBLEMA 13
FUNDAMENTO TEÓRICO 18
HIPÓTESIS 40
OBJETIVO GENERAL Y ESPECÍFICOS 40
DISEÑO DEL ESTUDIO 41
ASPECTOS METODOLÓGICOS 42
ASPECTOS ÉTICOS 46
RESULTADOS 47
DISCUSIÓN 53
CONCLUSIONES 57
RECOMENDACIONES 58
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 59
4
ÍNDICE DE FIGURAS
Fig. 1. Estructuras químicas de antibióticos carbapenémicos. 27
Fig. 2. Esquema de la PCR punto final. 38
Fig. 3. Esquema del Método de Inactivación de Carbapenems. 45
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Condiciones de amplificación de la Reacción en Cadena de la
Polimerasa. 43
Tabla 2. Programa de amplificación. 43
Tabla 3. Resultado de la prueba de evaluación diagnóstica (Método de
inactivación de Carbapenems) frente a la prueba de oro (PCR punto final) en
Bacilos gram negativos.
47
Tabla 4. Tabla de contingencia del Método de Inactivación de Carbapenems
(mIC) en Bacilos gram Negativos (BGN). 48
Tabla 5. Validez de la prueba diagnóstica: Determinación de la Sensibilidad y
especificidad del Método de inactivación de Carbapenems (mIC) en Bacilos
gram Negativos (BGN).
48
Tabla 6. Seguridad de la prueba diagnóstica: Determinación del valor predictivo
positivo y negativo del Método de inactivación de Carbapenems (mIC) en
Bacilos gram Negativos (BGN).
48
Tabla 7. Determinación del nivel de concordancia (Índice Kappa) del Método
de inactivación de Carbapenems (mIC) en Bacilos gram Negativos (BGN) con
respecto a la prueba de oro.
49
Tabla 8. Resultado de la prueba de evaluación diagnóstica (Método de
inactivación de Carbapenems) frente a la prueba de oro (PCR punto final) en
Bacilos gram negativos no fermentadores.
50
Tabla 9. Tabla de contingencia del Método de Inactivación de Carbapenems
(mIC) en Bacilos gram Negativos no fermentadores (BGNNF). 51
5
Tabla 10. Validez de la prueba diagnóstica: Determinación de la Sensibilidad y
especificidad del Método de inactivación de Carbapenems (mIC) en Bacilos
gram Negativos no fermentadores (BGNNF).
51
Tabla 11. Seguridad de la prueba diagnóstica: Determinación del valor
predictivo positivo y negativo del Método de inactivación de Carbapenems
(mIC) en Bacilos gram negativos no fermentadores (BGNNF).
52
Tabla 12. Determinación del nivel de concordancia (Índice Kappa) del Método
de inactivación de Carbapenems (mIC) en Bacilos gram Negativos no
fermentadores (BGNNF) con respecto a la prueba de oro.
52
6
ABREVIATURAS UTILIZADAS
1.1. CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute
1.2. mIC: Método de inactivación de carbapenems.
1.3. CIM: concentración inhibitoria mínima.
1.4. BLEE: Betalactamasas de espectro extendido.
1.5. PCR: Reacción en cadena de la polimerasa.
1.6. BGN: Bacilo gram negativos.
1.7. BGNNF: Bacilo gram negativos no fermentadores.
1.8. KPC: Klebsiella pneumoniae productora de carbapenemasas.
1.9. MBL: Metalobetalactamasas.
1.10. NDM: Metalobetalactamasa New Delhi.
1.11. Oxa: oxacilinasas.
1.12. ADN: Ácido desoxirribonucleico.
1.13. Tm: Temperatura de melting.
1.14. ICGES: Instituto Conmemorativa Gorgas de Estudios de la Salud.
7
DEFINICIONES
1.15. Resistencia antimicrobiana: es el fenómeno por el cual un microorganismo
deja de ser afectado por un antimicrobiano al que anteriormente era sensible.
1.16. Carbapenemasa: enzimas que actúan sobre los antibióticos betalactámicos
subclase carbapenems.
1.17. AmpC plasmídica: Las β-lactamasas AmpC pueden hidrolizar penicilinas,
cefamicinas, oximinocefalosporinas y monobactams, pero no son activas frente a
cefalosporinas de cuarta generación y carbapenémicos.
1.18. Antimicrobiano: se refiere a un conjunto de compuestos que tienen la
capacidad de inhibir o eliminar la proliferación de bacterias.
1.19. Impermeabilidad: mecanismo de resistencia de membrana en donde hay
cambios en el diámetro y/o número de porinas que pueden bloquear el ingreso del
antimicrobiano a la bacteria.
1.20. Porinas: son proteínas de la membrana externa en las bacterias Gram-
negativas, que funcionan como canales de transporte de diferentes moléculas
hidrofílicas, con grados de selectividad y complejidad.
1.21. Bombas de Eflujo: mecanismo de resistencia de membrana en donde se
transporta al antimicrobiano hacia el exterior de la célula sin modificaciones y sin
acción antimicrobiana.
1.22. Tasa de Mortalidad: indican el número de defunciones por lugar, intervalo
de tiempo y causa.
8
RESUMEN
La detección de Bacilos gram negativos (BGN) y bacilos gram negativos no
fermentadores (BGNNF) productores de carbapenemasas es un reto para los
laboratorios de microbiología clínica. En Panamá, la sospecha de la presencia de estas
enzimas es a través de los equipos automatizados Vitek 2C en donde los valores de
concentración inhibitoria mínima (CIM) para el antibiótico Imipenem es de ≥1 ug/mL
y de Meropenem ≥2 ug/mL; sin embargo existen otros mecanismos de resistencias como
las cefalosporinasas tipo AmpC, que pueden causar alteraciones en los valores del CIM
de los antibióticos carbapenémicos; de igual manera estas bacterias pueden presentar
mecanismos de membrana como lo son impermeabilidad o pérdidas de porinas y
bombas de eflujo; todo esto conlleva a un reporte incorrecto por los laboratorios de
microbiología o un tratamiento inapropiado al paciente.
Ese estudio permite sospechar de mecanismos de resistencia a los antibióticos
carbapenémicos en bacilos gram negativos, utilizando insumos y reactivo de uso
rutinario en los laboratorios de microbiología.
9
INTRODUCCIÓN
La resistencia a los antibióticos carbapenémicos hace unos años era un evento
poco común, especialmente en miembros de la familia Enterobacteriaceae. Sin
embargo, en los últimos años han aumentado los reportes de cepas resistentes a
carbapenems. Por otro lado, la resistencia a carbapenems es más frecuente en bacilos
gram negativos no fermentadores (BGNNF) como la Pseudomonas spp. y
Acinetobacter spp.
Las investigaciones han demostrado que para adquirir resistencia a los
carbapenems se requiere de la combinación de varios mecanismos de resistencia. La
combinación más importante reportada hasta el momento ha sido la producción de una
β-lactamasa (AmpC y carbapenemasas) junto a la disminución de la permeabilidad de
la membrana externa por la pérdida de porinas.
La emergencia de resistencia no solo limita el uso de terapias efectivas, sino que
también favorece el crecimiento y diseminación de patógenos resistentes, derivados de
la presión selectiva que ejercen antimicrobianos empíricos inapropiados que eliminan
las poblaciones susceptibles.
La vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos requiere laboratorios de
microbiología que puedan identificar con exactitud los microorganismos resistentes. La
detección de mecanismos de resistencia en bacilos gram negativos y bacilos gram
negativos no fermentadores tiene una gran repercusión clínica y epidemiológica. Existen
muchos métodos fenotípicos para la detección de mecanismos de resistencia a los
carbapenems, sin embargo, se requiere insumos pocos disponibles para los laboratorios
y algunos pueden tener un costo elevado como las técnicas moleculares. La detección
10
en pacientes de BGN Y BGNNF productores de carbapenemasas de manera oportuna,
permitirá implementar precauciones de contacto y facilitará un abordaje terapéutico
apropiado. Este estudio propone evaluar el método de inactivación de carbapenems
(mIC) frente al “gold Estándar” la prueba de Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
de manera que permita ofrecer una opción costo efectiva para el abordaje inicial ante
estas enzimas.
11
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La resistencia a los antimicrobianos se produce cuando los microorganismos (bacterias,
hongos, virus y parásitos) sufren cambios al verse expuestos a los antimicrobianos
(antibióticos, antifúngicos, antivíricos, antipalúdicos o antihelmínticos, por ejemplo).
Como resultado, los medicamentos se vuelven ineficaces y las infecciones persisten en
el organismo, lo que incrementa el riesgo de propagación a otras personas.
Están apareciendo nuevos mecanismos de resistencia que se propagan a nivel mundial
y ponen en peligro nuestra capacidad para tratar enfermedades infecciosas comunes, con
el consiguiente aumento de la discapacidad y las muertes, y la prolongación de la
enfermedad.
La emergencia de resistencia a los antibióticos no solo limita el uso de terapias efectivas,
sino que también favorece el crecimiento y diseminación de patógenos resistentes,
derivados de la presión selectiva que ejercen antimicrobianos empíricos inapropiados
que eliminan las poblaciones susceptibles.
La resistencia de Klebsiella pneumoniae (una bacteria intestinal común que puede
causar infecciones potencialmente mortales) al tratamiento utilizado como último
recurso (los antibióticos carbapenémicos) se ha propagado a todas las regiones del
mundo. K. pneumoniae es una importante causa de infecciones nosocomiales, como la
neumonía, la sepsis o las infecciones de los recién nacidos y los pacientes ingresados en
unidades de cuidados intensivos. Debido a la resistencia, en algunos países los
antibióticos carbapenémicos ya no son eficaces en más de la mitad de los pacientes con
infecciones por K. pneumoniae.
12
Actualmente, los métodos para vigilar la resistencia microbiana pueden clasificarse en
tres tipos: in vivo, in vitro y moleculares. El grado en que se usa cada uno de estos
métodos depende del agente patógeno o enfermedad de que se trate y de las instalaciones
disponibles. Los métodos in vitro son los preferidos para la vigilancia de la resistencia
de la gran mayoría de las bacterias patógenas, incluso la de Mycobacterium tuberculosis.
Sin embargo, no hay un método estandarizado internacional único. Hay técnicas
modernas que han facilitado el desarrollo y la aplicación de métodos moleculares para
determinar la presencia de genes que codifican resistencia específica en los
microorganismos que podrían constituir la base de sistemas para vigilar la resistencia a
los antimicrobianos. Los métodos moleculares, sin embargo, utilizan tecnologías
complejas, la cual no se dispone en muchos laboratorios de microbiología.
Por lo tanto, se hace indispensable la disponibilidad de una prueba sensible, especifica,
comparable con las técnicas moleculares en los laboratorios para la detección de
carbapenemasas en bacilos gram negativos (BGN) y bacilos gram negativos no
fermentadores (BGNNF).
¿Cuál es la exactitud o validez diagnóstica de métodos fenotípicos (Método de
inactivación de carbapenems mIC) con respecto a pruebas moleculares (PCR)?
13
JUSTIFICACIÓN DEL PROBLEMA
Cuando las bacterias se vuelven resistentes a los medicamentos, se reducen las opciones
para tratar las enfermedades que provocan. Esa resistencia a los medicamentos
antimicrobianos ocurre en todas partes del mundo y afecta a una amplia selección de
microorganismos, con una creciente prevalencia que amenaza la salud humana y animal.
Las consecuencias directas de una infección por microorganismos resistentes pueden
ser graves, ejemplo, enfermedades más largas, mayor mortalidad, estancias prolongadas
en el hospital, pérdida de protección en el caso de los pacientes que se someten a
operaciones y otros procedimientos médicos, e incremento de los costos. La resistencia
a los antimicrobianos afecta a todos los ámbitos de la salud, implica a muchos sectores
y tiene efectos en el conjunto de la sociedad.
La resistencia a los antimicrobianos erosiona la economía mundial con pérdidas
económicas debidas a la menor productividad a causa de la enfermedad (de los seres
humanos y también de los animales) y al incremento de los costos de tratamiento. Para
combatirla se requieren inversiones a largo plazo, por ejemplo, apoyo financiero y
técnico a los países en desarrollo, en el desarrollo de nuevos medicamentos, medios de
diagnóstico, vacunas y otras intervenciones, y en el fortalecimiento de los sistemas de
salud para utilizar los agentes antimicrobianos, y acceder a ellos, de forma más
adecuada.
La resistencia a los antimicrobianos puede afectar a todos los pacientes y sus familias.
Algunas de las enfermedades infantiles más comunes en los países en desarrollo
paludismo, neumonía, otras infecciones respiratorias y disentería ya no se curan con
muchos de los antibióticos o medicamentos más antiguos. En países de ingresos bajos,
14
es crucial contar con antibióticos eficaces y accesibles para salvar las vidas de niños con
esas enfermedades, y otras afecciones como las bacteriemias.
Los primeros datos publicados por la Organización Mundial de la Salud sobre la
vigilancia de la resistencia a los antibióticos indican que los niveles de resistencia a
algunas infecciones bacterianas graves son elevados tanto en los países de ingresos altos
como en los de ingresos bajos.
El nuevo Sistema Mundial de Vigilancia de la Resistencia a los Antimicrobianos de la
Organización, denominado GLASS por sus siglas en inglés, ha revelado la presencia
generalizada de resistencia a los antibióticos en muestras de 500 000 personas de 22
países en las que se sospechaban infecciones bacterianas.
Las bacterias resistentes más frecuentes eran Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae, seguidas de Salmonella spp.
En los pacientes en los que se sospechó una infección sanguínea se observó una amplia
variación entre países en la proporción de los que presentaban resistencias bacterianas
al menos a uno de los antibióticos más utilizados, desde un 0% hasta un 82% La
resistencia a la penicilina, el fármaco utilizado durante décadas en todo el mundo para
tratar la neumonía, osciló entre un 0% y un 51% en los países estudiados. Además, entre
un 8% y un 65% de las muestras de E. coli, una bacteria que causa infecciones de las
vías urinarias, presentaba resistencia al ciprofloxacino, un antibiótico utilizado
habitualmente para tratar estas infecciones.
El Dr. Marc Sprenger, director de la secretaría para la resistencia a los antimicrobianos
de la OMS, señala que «el informe confirma la grave situación que representa la
resistencia a los antibióticos en todo el mundo».
15
En España, se han llevado a cabo 2 estudios multicéntricos en los años 2000 y 2010. En
el año 2010, el 94% de los aislados eran multirresistentes y el 86% presentaron
resistencia extrema, resultando preocupante que el 2% de los aislados eran ya pan-
resistentes (no se identificó ninguno en 2000). La resistencia a carbapenémicos ha
aumentado significativamente entre 2000 y 2010, habiéndose observado también
incrementos en las tasas de resistencia a ceftazidima, piperacilina y colistina. Todo ello
supone una seria limitación en las opciones terapéuticas frente agentes no fermentadores
como Acinetobacter baumanii y Pseudomonas aeruginosa. (7)
Antes del año 2010 en Panamá la resistencia a las carbapenems era poco conocida, aún
más en BGN y BGNNF; los principales mecanismos detectados eran las Betalactamasas
de espectro extendido (BLEE) e impermeabilidad.
Durante el año 2010 en Panamá se registraron muertes por infecciones intrahospitalarias
dando paso a uno de los eventos de salud pública más importantes del país la
carbapenemasa de K. pneumoniae (KPC) se trataba de una enzima plasmídica
epidémica asociada a un aumento importante en las tasas de mortalidad y morbilidad en
los lugares donde ocurría, con un importante potencial de diseminación. (2).
Existen otras carbapenemasas presentes BGNNF como las Metalobetalactamasas
(MBL) comunes en Pseudomonas aeruginosa y las oxacilinasas carbapenemasas
(OXA) presentes en el complejo Acinetobacter baumannii cuyo diagnóstico por parte
del laboratorio clínico se hace difícil ya que los equipos automatizados no las
diferencian; además se evidencia que los valores de los CIM (concentración inhibitoria
mínima) son elevados en casi todas las familias de antibióticos, en particular los b-
lactámicos.
16
Las técnicas moleculares son consideradas los métodos de referencia para confirmar la
presencia de los genes de carbapenemasas, estas técnicas no suelen estar disponibles en
la mayoría de los laboratorios clínicos, por lo que es importante implementar una
metodología fácil, de bajo costo, confiable y accesible, que permita un diagnóstico lo
bastante rápido al mismo nivel que las pruebas moleculares.
El concepto de “diagnóstico molecular” es un término amplio que incluye técnicas de
extracción, amplificación, cuantificación e hibridación de material genético (DNA o
RNA). En la actualidad, cerca del 50-60% del diagnóstico molecular se ha enfocado
principalmente en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, siendo las encefalitis y
meningitis las que abarcan un gran porcentaje de las pruebas disponibles, dado que el
diagnóstico molecular es mucho más sensible que la detección por métodos
microbiológicos clásicos.
Los altos valores de sensibilidad y especificidad de las técnicas moleculares las han
transformado en el gold standard para el diagnóstico de patologías infecciosas (Espy
MJ, 2006). La eficiencia de las técnicas moleculares radica en sus altos porcentajes de
sensibilidad (70-99%) y especificidad (86-100%), con un tiempo de detección de 1 a 4
h, en promedio (Tsongalis GJ, 2006). (8)
Este trabajo pretende evaluar la sensibilidad y especificidad diagnóstica del método de
inactivación de carbapenemasas mIC frente a la prueba de referencia PCR en
aislamientos clínicos de BGN y BGNNF teniendo en cuenta las nuevas
recomendaciones de la M100 S27 de la CLSI y del artículo publicado por Kim et. Al.
La detección de los mecanismos de resistencia en los microrganismos gram negativos
tiene una gran repercusión clínica y epidemiológica, existiendo aún hoy en día una cierta
17
discusión sobre cuál es la mejor técnica fenotípica para este fin, así como si se deben o
no interpretar los resultados in vitro de sensibilidad.
18
FUNDAMENTO TEÓRICO
Bacilos gram negativos (BGN)
Las infecciones por especies de BGN como la Klebsiella spp, Enterobacter spp,
y Serratia spp, a menudo son intrahospitalarias, y se producen principalmente en
pacientes con alteraciones de las defensas orgánicas. Por lo general, géneros
como Klebsiella spp, Enterobacter spp, y Serratia spp causan infecciones variadas,
entre ellas, bacteriemias, infecciones de las heridas quirúrgicas, infecciones de los
catéteres vasculares e infecciones respiratorias o urinarias que se manifiestan en forma
de neumonía, cistitis o pielonefritis, y que pueden progresar a abscesos pulmonares,
empiema, bacteriemia y sepsis. Ejemplo, la neumonía por Klebsiella spp, se manifiesta
por formación de abscesos pulmonares y empiema. Los grupos de Serratia, en especial
la S. marcescens, tiene una mayor afinidad por el tracto urinario.
Los Enterobacter causan más a menudo infecciones intrahospitalarias, pero pueden
causar otitis media, celulitis y sepsis neonatal.
El tratamiento se lleva a cabo con cefalosporinas de tercera generación,
cefepima, carbapémicos, fluoroquinolonas, piperacilina/tazobactam o aminoglucósidos.
Sin embargo, dado que algunos aislamientos son resistentes a múltiples antibióticos, son
esenciales las pruebas de susceptibilidad.
Las cepas de Klebsiella spp que producen β-lactamasas de espectro extendido
pueden desarrollar resistencia a las cefalosporinas durante el tratamiento, especialmente
a ceftazidima. Estas cepas son inhibidas en grado variable por los inhibidores de las β-
lactamasas (p. ej., sulbactam, tazobactam, ácido clavulánico). Se han aislado especies
19
de K. pneumoniae productoras de carbapenemasas (KPC) en los Estados Unidos y en
otros países, lo que hace muy problemático al tratamiento de algunas infecciones.
Las cepas de Enterobacter spp. pueden volverse resistentes a la mayoría de
los β-lactámicos, incluso las cefalosporinas de tercera generación; la enzima β-
lactamasa que producen no es inhibida por los inhibidores de β-lactamasas comunes
(clavulanato, tazobactam, sulbactam). Sin embargo, estas cepas de Enterobacter
spp. pueden ser sensibles a los carbapémicos (Imipenem, meropenem, ertapenem). Se
han detectado también Enterobacterias resistentes a carbapenemasas. En ciertos casos,
la tigeciclina y quizás la colistina pueden ser los únicos antibióticos activos disponibles.
(10)
Bacilos gram negativos no fermentadores (BGNNF)
Los Bacilos gram negativos no fermentadores como la Pseudomonas
aeruginosa son patógenos oportunistas que con frecuencia causan infecciones
intrahospitalarias, especialmente en pacientes con asistencia respiratoria mecánica,
pacientes quemados y aquellos con debilidades crónicas. Pueden infectar muchos sitios,
y los cuadros suelen ser graves. El diagnóstico se establece con el cultivo. La elección
de antibióticos depende del patógeno y debe estar guiada por el antibiograma, porque es
común la resistencia.
Las Pseudomonas spp. son ubicuas y prefieren los ambientes húmedos. En los
seres humanos, el patógeno más común de este grupo es la P. aeruginosa, pero también
pueden producirse infecciones por P. paucimobilis, P. putida, P. fluorescens o P.
acidovorans.
20
La mayoría de las infecciones por P. aeruginosa se producen en pacientes
internados, en especial los debilitados o inmunocomprometidos. La P. aeruginosa es
una causa frecuente de infecciones en las unidades de cuidados intensivos. Los pacientes
infectados por HIV, especialmente los que están en etapas avanzadas, tienen riesgo de
adquirir infecciones por P. aeruginosa extrahospitalaria.
Las infecciones por Pseudomonas spp, pueden aparecer en muchos sitios
anatómicos, entre ellos, la piel, los tejidos subcutáneos, el hueso, los oídos, los ojos, el
tracto urinario y las válvulas cardíacas. El sitio afectado varía según la puerta de entrada
y la susceptibilidad del paciente. En pacientes internados en el hospital, el primer signo
puede ser una septicemia por bacilos gramnegativos.
En los pacientes quemados, la región por debajo de la escara puede infiltrarse
con abundantes microorganismos y actuar como foco para una bacteriemia posterior,
que suele ser una complicación mortal.
Las heridas punzantes profundas de los pies a menudo se infectan con P.
aeruginosa. Esto puede dar origen a fístulas, celulitis y osteomielitis.
Muchas infecciones por Pseudomonas spp. pueden producir bacteriemia. En
pacientes no intubados sin un foco urinario detectable, y en especial si la infección se
debe a otras especies y no a la P. aeruginosa, la bacteriemia indica que se administraron
líquidos intravenosos o medicamentos contaminados, o que estaban contaminados los
antisépticos utilizados al colocar la vía venosa. (11).
21
Resistencia a los antibióticos Betalactámicos
El primer antibiótico de esta clase la penicilina fue descubierto por Alexander
Fleming en 1928, cuando estudiaba los cultivos de Staphylococcus spp, y era producida
por una especie no caracterizada hasta el momento de Penicilium spp.
Estructura química
La presencia de un anillo betalactámico define químicamente a esta familia de
antibióticos, de la que se han originado diversos grupos: penicilinas, cefalosporinas,
carbapenemas, monobactamas e inhibidores de las betalactamasas. Las penicilinas son
un grupo de antibióticos que contienen un anillo betalactámico y un anillo de tiazolidina,
formando el ácido 6-aminopenicilánico, estructura que deriva de la condensación de una
molécula de valina y una de cisteína para dar lugar al doble anillo característico.
Además, tienen una cadena lateral, que varía de unas penicilinas a otras en la posición
6 del anillo betalactámico y que es la que define sus propiedades. Las cefalosporinas
son fármacos estructuralmente similares a las penicilinas, cuya estructura básica está
constituida por el núcleo cefem, que consiste en la fusión de un anillo dihidrotiacínico
(en lugar del anillo tiazolidínico característico de las penicilinas) y un anillo
betalactámico. La introducción de modificaciones en las cadenas laterales origina las
diversas cefalosporinas.
La estructura básica de las carbapenemas consiste en un anillo betalactámico fusionado
a uno pirrolidínico compartiendo un nitrógeno. Estas modificaciones y las cadenas
laterales, así como la posición espacial de éstas, condiciona la mayor afinidad por las
proteínas fijadoras de penicilina (PBP) diana, un incremento de la potencia, del espectro
antibacteriano y de la resistencia a las betalactamasas, siendo los betalactámicos de más
22
amplio espectro y actividad. Los monobactámicos son derivados del ácido 3-
aminomonobactámico (3-AMA). Tienen una estructura betalactámica sencilla con una
estructura monocíclica en la que el anillo betalactámico no está fusionado a otro
secundario.
Los betalactámicos son antibióticos de actividad bactericida lenta, relativamente
independiente de la concentración plasmática alcanzada, siempre que ésta exceda la
concentración inhibitoria mínima (CIM) del agente causal. La actividad bactericida y
probablemente la eficacia clínica se relacionan mejor con el tiempo durante el cual dicha
concentración excede la CIM (T > CIM). Para la mayoría de infecciones se considera
adecuado que el tiempo que supera la CIM sea como mínimo del 40% del intervalo entre
dosis; pero en pacientes neutropénicos o con meningitis es probable que sea mejor estar
todo el tiempo por encima de la CIM. El efecto postantibiótico (EPA) consiste en la
acción residual del antibiótico sobre la bacteria después de descender las
concentraciones terapéuticas en la sangre y los tejidos por debajo de la CIM. En el caso
de los antibióticos betalactámicos, el EPA es de corta duración, con la excepción de los
carbapenémicos, que presentan un EPA apreciable tanto sobre grampositivos como
sobre gramnegativos. Estos parámetros indican que alargar los intervalos entre dosis
puede llevar a fracasos terapéuticos. Obviamente estas consideraciones no son válidas
en el caso de betalactámicos con semivida muy prolongada, que se administran cada 24
h, como la ceftriaxona (parenteral) o la cefixima (oral). La actividad bactericida de los
betalactámicos disminuye cuanto mayor es el tamaño del inóculo bacteriano; este hecho
es especialmente relevante en el tratamiento de los abscesos, donde además las
poblaciones bacterianas pueden hallarse en fase estacionaria. En infecciones con un gran
23
inóculo, como la neumonía nosocomial causada por bacilos gramnegativos (BGN) es
también más fácil seleccionar mutantes resistentes, por lo que puede no ser adecuado el
empleo de los betalactámicos en monoterapia. La combinación de penicilinas y
aminoglucósidos es sinérgica frente a estreptococos y enterococos y la de penicilinas y
cefalosporinas lo es también frente a ciertos BGN, sobre todo Pseudomonas aeruginosa.
Este hecho tiene especial relevancia en el tratamiento de la endocarditis bacteriana, de
las infecciones por Pseudomonas y de las infecciones en pacientes neutropénicos.
Mecanismo de acción
Los antibióticos betalactámicos son agentes bactericidas que inhiben la síntesis de la
pared celular bacteriana e inducen además un efecto autolítico. La destrucción de la
pared celular bacteriana se produce como consecuencia de la inhibición de la última
etapa de la síntesis del peptidoglucano. En las bacterias grampositivas, la pared celular
es gruesa y su componente principal es dicha proteína. Las bacterias gramnegativas
tienen una pared más fina y compleja que consta de una membrana externa formada por
lípidos y proteínas y de una delgada capa interna de peptidoglucano.
El peptidoglucano está constituido por largas cadenas de glúcidos (-glucano), formadas
por la repetición de moléculas de ácido N-acetilmurámico y N-acetilglucosamina. El
ácido murámico fija cadenas de tetrapéptidos (péptido-) que se unen entre sí para formar
una malla, bien directamente (gramnegativos) o mediante un pentapéptido de glicina
(grampositivos). Los betalactámicos inhiben precisamente esta unión o
transpeptidación, última etapa de la síntesis de la pared celular. De este modo, la pared
queda debilitada y puede romperse por la presión osmótica intracelular. Para que actúen
los betalactámicos es necesario que la bacteria se halle en fase de multiplicación, ya que
24
es cuando se sintetiza la pared celular. Los componentes del peptidoglucano se
sintetizan en el citoplasma y son transportados a través de la membrana citoplasmática
al espacio que existe entre ésta y la pared celular. A este nivel existen unas proteínas
con actividad enzimática (transpeptidasas y carboxipeptidasas), que son las encargadas
de formar los tetrapéptidos unidos. Estas enzimas fijan a las penicilinas y otros
betalactámicos, por lo que se llaman PBP. La función de las PBP es alargar, dar forma
y dividir la bacteria. Los anillos de los betalactámicos poseen una estructura similar a
los dos últimos aminoácidos del pentapéptido (D-alanina-D-alanina) y eso permite una
unión covalente en el lugar activo de la transpeptidasa. También pueden inhibir a las
carboxipeptidasas y algunas endopeptidasas. Los betalactámicos también actúan
activando una autolisina bacteriana endógena que destruye el peptidoglicano. La lisis se
produce con concentraciones que superan entre 4 y 10 veces la CIM de un determinado
microorganismo. Las bacterias que carecen de autolisina son inhibidas, pero no
destruidas, por lo que se dice que son tolerantes. Se define el fenómeno de tolerancia
como la necesidad de una concentración al menos 32 veces mayor a la CIM para que un
antimicrobiano destruya una cepa bacteriana.
Espectro de acción
Las carbapenémicos son los betalactámicos de más amplio espectro. Sólo carecen de
actividad frente a los estafilococos resistentes a meticilina, enterococos resistentes a
vancomicina, algunas especies de Pseudomonas, Stenotrophomonas maltophilia, y son
poco activos frente a Clostridium difficile. Ertapenem es poco activo frente a P.
aeruginosa. Aztreonam, el único monobactámico disponible para uso clínico, posee una
25
excelente actividad sobre bacterias gramnegativas aerobias y facultativas. Por el
contrario, carece de actividad frente a grampositivos y bacterias anaerobias.
Carbapenems
La obtención de la tienamicina (Streptomyces cattleya) es el momento clave en el
desarrollo de los carbapenems. Sus propiedades antibacterianas la convertían en un
antibiótico ideal, pero era químicamente inestable, por lo que se desarrolló un derivado
estable que conservaba las buenas características antibacterianas, la N-formimidoil
tienamicina o imipenem. Presentaba el inconveniente de ser inactivado por la
dehidropeptidasa I renal (DHP-I), por lo que se asoció (1:1) a un inhibidor de esta
enzima, la cilastatina. La asociación imipenem/cilastatina fue el primer carbapenem
autorizado en terapéutica humana (EMEA, European Medicines Agency [Agencia
Europea del Medicamento] 1985, España 1987). Posteriormente, se introdujeron el
meropenem (EMEA 1994, España 1995), el ertapenem (EMEA 2001, España 2002) y
en julio de 2008 la EMEA aprobó el doripenem que se ha introducido en España en
mayo de 2009.
Estructura química y relación estructura/función
El anillo carbapenem es un azobiciclo formado por la condensación de un anillo β-
lactámico y otro pirrolidínico de 5 miembros e insaturado. Posee en posición 1 un átomo
de carbono (carba) y un enlace no saturado entre 2 y 3 (-em). Todos tienen en posición
6 un grupo hidroxietilo en configuración trans que protege al anillo β-lactámico de
muchas serino-β-lactamasas y en posición 3 un radical carboxilo, importante para que
el anillo pirrolidínico active al β-lactámico. Los distintos carbapenems son fruto de
sustituciones en 1 y 2. En imipenem los hidrógenos del C1 no están sustituidos, por lo
26
que es sensible a la DHP-I renal y potencialmente nefrotóxico. En meropenem,
ertapenem y doripenem el H en posición β está sustituido por un metilo que le confiere
estabilidad frente a esta enzima (1-β-metil-carbapenems). En 2, hay una cadena lateral
tioacílica de carácter básico que diferencia a los distintos carbapenems determinando
actividad antimicrobiana, potencial neurotóxico, atrapamiento por algunas bombas de
expulsión, farmacocinética, etc. y colabora en la estabilidad frente a la DHP-I. En
imipenem esta cadena es un iminometil-amino-etil-tio. En meropenem está sustituida
por un grupo hidrofóbico dimetil-carbomoil-pirrolidin-tio que incrementa la actividad
frente a gramnegativos y es responsable de la ligera disminución de actividad frente a
grampositivos, y puede, además, explicar la reducción del efecto proconvulsionante
observado en imipenem/ cilastatina. En ertapenem es un grupo carboxifenil amino-
carbomoilpirrolidin-tio, similar al de meropenem, al que se une un grupo benzoato
(carboxifenil). Este último aumenta el peso molecular (497,50) y la lipofília de la
molécula. El radical carboxílico, ionizado a pH fisiológico, proporciona una carga
negativa y determina una mayor fijación proteica que es responsable de un aumento de
la semivida de eliminación y permite una sola administración diaria. Su falta de
actividad efectiva sobre Pseudomonas aeruginosa puede deberse al carácter aniónico, la
lipofilia y el elevado peso molecular que dificultarían su penetración a través de las
porinas OprD no alcanzando unas concentraciones adecuadas en el espacio
periplásmico. Además, el peso molecular facilitaría su eliminación por las bombas de
eflujo. En doripenem es una cadena lateral sulfamoil-aminometil-pirrolidin-tio que lo
dota de la buena actividad de meropenem frente a gramnegativos y de la de imipenem
frente a grampositivos. Su menor alcalinidad, en comparación con otros carbapenems,
27
determina un aumento de la actividad de la molécula frente a P. aeruginosa. Imipenem,
meropenem y doripenem tienen un menor peso molecular (317,26; 437,51 y 420,51
respectivamente), son hidrofílicos y de estructura compacta y zwiteriónica, lo que
permite una penetración rápida a través de las porinas de los gramnegativos.
Fig. 1. Estructuras químicas de antibióticos carbapenémicos.
Mecanismos de acción
Inhiben la síntesis de la pared celular durante la transpeptidacion uniéndose a residuos
de serina de peptidasas situadas en la cara externa de la membrana citoplasmática
denominadas PBP (penicillin binding protein, proteínas que fijan penicilinas). La pared
celular se debilita y la bacteria normalmente se lisa2. Por ello, son habitualmente
bactericidas. Imipenem es menos bactericida que meropenem o doripenem en P.
aeruginosa. El poder bactericida es rápido y dependiente del tiempo. Frente a Listeria
monocytogenes meropenem y ertapenem se comportan como bacteriostáticos, aunque
la actividad intracelular de meropenem es bactericida a las 24 h.
28
Para ejercer su acción deben atravesar la pared celular para acceder a las PBP, lo que es
fácil en grampositivos, pero más complicado en gramnegativos. Sus características
estructurales les permiten acceden a las PBP de las bacterias gramnegativas a través de
las porinas de la membrana externa. En P. aeruginosa imipenem emplea exclusivamente
la vía de la OprD mientras que meropenem y doripenem emplean ésta y, además, otras
porinas. La penetración de ertapenem en esta bacteria no se ha estudiado.
Farmacocinética-farmacodinamia
Los carbapenems, como el resto de los β-lactámicos, son antimicrobianos con actividad
dependiente del tiempo. Por este motivo, un parámetro de valoración de eficacia clínica
adecuado es el denominado “tiempo sobre la CMI” (T > CMI), es decir, el tiempo –en
porcentaje– del intervalo de dosificación en el que la concentración de antimicrobiano
supera a las CMI de las bacterias diana. Por su elevado poder bactericida, efecto
postantibiótico y elevada afinidad por PBP esenciales los carbapenems requieren un T
> CMI menor que otros β-lactámicos. Se ha sugerido que T > CMI del 20% (el 30% en
penicilinas y el 40% en cefalosporinas) son suficientes para lograr un efecto
bacteriostático y T > CMI del 30-40% (el 50% en penicilinas y el 60- 70% en
cefalosporinas) son adecuados para garantizar un efecto bactericida máximo.
Indicaciones clínicas
Por el amplio espectro de actividad y especiales características farmacocinéticas,
imipenem y meropenem están indicados en el tratamiento de infecciones nosocomiales
graves. Son los antimicrobianos de elección en el tratamiento empírico de infecciones
en las que se sospecha la implicación de microorganismos productores de BLEE o de
AmpC que desarrollan resistencia a las cefalosporinas de tercera generación, y en
29
pacientes que han recibido previamente antimicrobianos de amplio espectro por la
posibilidad de haber seleccionado cepas multirresistentes. También son de elección en
infecciones de etiología polimicrobiana o mixta.
Numerosos estudios clínicos han avalado la efectividad de ambos, bien en monoterapia
o asociados a otros antimicrobianos, en el tratamiento nosocomial de bacteriemias y
sepsis, infecciones graves de piel y tejidos blandos, infecciones osteoarticulares,
infecciones intraabdominales (no indicado en las de adquisición comunitaria),
infecciones urinarias complicadas, infecciones ginecológicas complicadas, y en la
neumonía nosocomial grave. La mayor actividad de meropenem frente a Pseudomonas
spp. determina que sea el fármaco de elección en la fibrosis quística y en el paciente
neutropénico febril. Está indicado en el tratamiento de meningitis en niños y adultos, en
especial en meningitis nosocomiales producidas por Pseudomonas spp. y bacilos
gramnegativos resistentes a otros antimicrobianos. Algunos trabajos han demostrado su
eficacia en meningitis por S. pneumoniae resistentes a penicilina y cefalosporinas de
tercera generación. La alta incidencia de convulsiones asociadas a imipenem limita su
uso en esta indicación. Para evitar el desarrollo de resistencias, no deben utilizarse en
profilaxis quirúrgica al haber otras alternativas con menor espectro, igual eficacia y más
económicas. Ertapenem presenta un espectro más reducido que no incluye patógenos
nosocomiales relevantes como Pseudomonas spp. y Acinetobacter spp., lo que relega su
uso al tratamiento de infecciones leves o moderadas adquiridas en la comunidad que
precisan ingreso hospitalario.
30
Efectos ecológicos
Los más importantes derivan del impacto sobre la flora normal favoreciendo la
colonización/infección por bacterias patógenas y/o multirresistentes y la inducción de
resistencias. El efecto de todos los carbapenems sobre la flora fecal no es muy marcado
debido a la escasa eliminación en heces. Además, tras la interrupción del tratamiento la
flora fecal se recupera en 1-2 semanas. Pueden ocasionar diarrea asociada a
antimicrobianos, incluida colitis seudomembranosa, en un porcentaje muy bajo de
pacientes (doripenem < 1%). Ocasionalmente, se han descrito colonizaciones y
sobreinfecciones por microorganismos resistentes, como enterococos, estafilococos
coagulasa negativa, Pseudomonas spp., etc. En unidades de oncología y hematología,
con amplio uso de carbapenems, se ha comunicado un mayor aislamiento de S.
malthophilia. La candidiasis oral y vulvar es frecuente tras la administración de
doripenem18. Imipenem es inductor de la producción de AmpC en P. aeruginosa, E.
cloacae y C. freundii, aunque habitualmente no produce desrepresión. Meropenem y
doripenem tienen menor poder de inducción. El riesgo de inducción de resistencias con
ertapenem es bajo siempre que se utilice adecuadamente. Se ha comunicado la
emergencia de resistencia durante el tratamiento con ertapenem en una cepa de K.
pneumoniae productora de BLEE. La ausencia de actividad de ertapenem frente a P.
aeruginosa y otros BGNNF reduce la presión selectiva frente a estas bacterias y, en
consecuencia, disminuye la probabilidad de selección de resistencias a otros
carbapenems. Imipenem en enterobacterias es inductor de la producción de
carbapenemasas cromosómicas de la clase A28 y en P. aeruginosa de mutaciones en nfxC
(aproximadamente en el 15-25% de los pacientes tratados) que determinan la pérdida
31
de la proteína OprD y, en consecuencia, resistencia a imipenem. Doripenem es poco
inductor de resistencias a carbapenems en P. aeruginosa (10–9 doripenem y meropenem,
10–7 imipenem) y menos si se asocia a un aminoglucósido.
Mecanismos de resistencia
Las bacterias pueden desarrollar resistencia a los betalactámicos por varios mecanismos,
que en ocasiones se asocian. El control genético de estos mecanismos puede ser
cromosómico, plasmídico o por transposones. La resistencia cromosómica aparece por
mutación, mientras que los plásmidos y los transposones pueden ser autotransferibles
entre bacterias. Los mecanismos implicados son los siguientes:
1. Alteraciones de la permeabilidad. La presencia de membrana externa en los
bacilos gramnegativos dificulta la penetración de sustancias hidrofílicas, como los
betalactámicos, que necesitan utilizar los poros proteicos (porinas) para tal fin. La
resistencia es secundaria a alteraciones en dichas porinas.
2. Modificación de las dianas. Los betalactámicos deben unirse a las PBP para
ejercer su efecto bactericida. Cambios a nivel de las PBP implican una pérdida de
afinidad de los betalactámicos por ellas, con la consiguiente disminución de su
actividad. Este mecanismo afecta fundamentalmente a cocos grampositivos.
3. Producción de enzimas. Actualmente constituye el principal mecanismo de
resistencia a los betalactámicos, sobre todo en las bacterias gramnegativas. Las
betalactamasas son enzimas catalíticas de naturaleza proteica cuya producción está
controlada por un gen, bien cromosómico o bien transferido por plásmidos o
transposones12. Actúan rompiendo el enlace amídico del anillo betalactámico, previa
unión al grupo carboxilo, con lo que éste pierde la capacidad de unirse a las PBP. El
32
grado de resistencia que determinan se correlaciona con su concentración, afinidad por
los diferentes betalactámicos y propiedades hidrolíticas. La producción de
betalactamasas puede ser constitutiva (se producen siempre) o inducible (sólo en
presencia de un betalactámico). En este sentido no todos los betalactámicos tienen el
mismo poder de inducción, pudiendo ser desde poco a altamente inductores. En los
microorganismos gramnegativos, las betalactamasas plasmídicas son constitutivas y su
grado de producción está en relación con el número de copias del plásmido, mientras
que en los estafilococos suelen ser inducibles. Las betalactamasas cromosómicas, que
son producidas fundamentalmente por bacterias gramnegativas, pueden ser constitutivas
o inducibles.
4. Expresión de bombas de eliminación activa. Los mecanismos de expulsión
consisten en bombas de flujo, dependientes de energía, que bombean al antimicrobiano
al exterior. Este mecanismo se ha demostrado en ciertos bacilos gramnegativos,
especialmente en P. aeruginosa.
Las infecciones respiratorias agudas, las enfermedades diarreicas, el sarampión, el
sida, el paludismo y la tuberculosis causan más del 85% de la mortalidad por infecciones
en el mundo. La resistencia de los agentes infecciosos respectivos a los medicamentos
de primera línea va desde cero hasta casi 100% y, en algunos casos, la resistencia a los
fármacos de segunda y tercera línea afecta significativamente el resultado del
tratamiento. A esto se agrega la importante carga de enfermedad que representan en todo
el mundo las infecciones nosocomiales resistentes; los nuevos problemas que plantea la
resistencia a los fármacos antivirales, y los problemas crecientes de resistencia a los
medicamentos entre las enfermedades parasitarias, como la tripanosomiasis africana y
33
la leishmaniasis. El aumento masivo del comercio y los movimientos humanos como
consecuencia de la globalización han permitido que los agentes infecciosos, incluidos
los farmacorresistentes, se propaguen rápidamente. Si bien en los países más ricos, en
gran parte, todavía se puede confiar en la eficacia de los medicamentos antimicrobianos
más nuevos para tratar las infecciones resistentes, en muchas otras partes del mundo el
acceso a tales fármacos a menudo es limitado, cuando no se carece de ellos del todo.
La resistencia a los antimicrobianos es un fenómeno biológico natural. Cada vez
que se ha puesto en uso un nuevo agente antimicrobiano en el ámbito clínico, el
laboratorio ha detectado a continuación cepas de microorganismos resistentes al mismo,
es decir, cepas que pueden reproducirse en presencia de concentraciones mayores del
fármaco de las que se administra a las personas en dosis terapéuticas. Este tipo de
resistencia puede resultar de una característica de toda la especie o presentarse entre
cepas de especies que por lo general son sensibles, pero desarrollan resistencia por
mutación o transferencia genética. Los genes resistentes codifican varios mecanismos
por medio de los cuales los microorganismos pueden resistir los efectos inhibitorios de
agentes antimicrobianos específicos. Tales mecanismos también generan resistencia a
otros antimicrobianos de la misma clase y, a veces, a muchos compuestos de diferentes
clases. (13).
La resistencia a antibióticos, sobre todo la resistencia combinada a múltiples
familias, es una prioridad de primer orden para los enfermos, la comunidad, los
profesionales de la salud y la salud pública. En los últimos años la resistencia a los
antimicrobianos ha aumentado considerablemente hasta convertirse en una emergencia
sanitaria según todas las agencias internacionales de salud. Las enterobacterias son una
34
de las familias bacterianas que presentan con mayor frecuencia resistencia a múltiples
antibióticos. El principal mecanismo de resistencia a los antibióticos betalactámicos en
enterobacterias es el enzimático, debido a la producción de Betalactamasas. Las
Betalactamasas que por su perfil hidrolítico y prevalencia han tenido una mayor
relevancia clínica en la primera década del siglo XXI son las que generan resistencia a
las cefalosporinas de tercera generación, como las Betalactamasas de espectro extendido
(BLEE) y las Cefalosporinasas del tipo AmpC; en ambos casos los antibióticos
carbapenémicos, como son el imipenem, el meropenem, el doripenem y el ertapenem,
mantienen su actividad. Sin embargo, durante los últimos años se ha producido la
aparición y dispersión de enterobacterias productoras de enzimas que confieren
resistencia a todos los antibióticos betalactámicos, incluyendo los antibióticos
carbapenémicos, lo cual limita de manera importante el arsenal terapéutico frente a estas
bacterias. Estas enzimas, denominadas genéricamente carbapenemasas, pertenecen en
su mayoría a 3 clases diferentes, según la clasificación molecular de Ambler:
Clase A, principalmente enzimas del tipo KPC.
Clase B Metalobetalactamasas (MBL) dependientes de zinc, principalmente
enzimas del tipo VIM, IMP, SPM y NDM.
Clase D o serin-carbapenemasas (principalmente OXA-48). (4)
La aparición y propagación de bacilos gram-negativos productores de
carbapenemasa es una amenaza emergente para la salud pública. En particular, en los
hospitales y centros de salud, esto supone un mayor problema con los carbapenems ya
que cada vez son más necesarios para tratar las infecciones causadas por bacterias Gram-
negativas que producen Betalactamasas de espectro extendido (BLEE).
35
Para prevenir la propagación de los productores de carbapenemasas, la
detección rápida de estas bacterias se ha convertido en imperativo; ya que la resistencia
a carbapenems se evalúa en ensayos de susceptibilidad fenotípica en platos de agar o en
sistemas automatizados de microbiología. Sin embargo, la concentración de inhibición
mínima o (MIC) no necesariamente reflejan la producción de carbapenemasas, ya que
otros mecanismos tales como pérdida de porinas o aumento de la actividad de la bomba
de eflujo, debido a alteraciones cromosómicas en los genes, también puede causar
resistencia.
Por lo tanto, la distinción entre la resistencia a carbapenems mediada por
carbapenemasas y resistencia mediada por otros mecanismos es importante para el
control de la infección. (3)
Prueba de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
La PCR (del inglés Polymerase Chain Reaction, reacción en cadena de la
polimerasa) es una forma de clonación del ADN, puramente enzimática que se realiza
totalmente in vitro. Representa uno de los avances más importantes y actuales de la
historia de la biotecnología.
Hasta mediados de los años 80 la única estrategia posible para aislar un gen y
disponer de grandes cantidades para su análisis era el clonado celular. En 1986, Kary B.
Mullis descubrió la PCR, técnica que permite sintetizar grandes cantidades de ADN in
vitro de una manera simple y elegante basándose en el procedimiento de replicación del
ADN que la célula emplea in vivo. El descubrimiento le valió a Mullis el Premio Nobel
en 1993.
36
La PCR es un método rápido de amplificación in vitro de secuencias de ADN
específicas dentro de una muestra. Habitualmente la reacción se diseña para permitir la
amplificación selectiva de una o varias secuencias diana de ADN presente en una mezcla
compleja de secuencias (por ejemplo, ADN genómico total). Para que la amplificación
sea posible es absolutamente necesario disponer de un mínimo de información sobre la
secuencia a amplificar. Esta información permite la construcción de dos
oligonucleótidos (oligos), habitualmente de 15 a 30 nucleótidos de longitud,
complementarios de los extremos 3' de la secuencia diana, que actuaran como cebadores
(iniciadores, en ingles primers) en la reacción. Cuando se mezclan con ADN genómico
desnaturalizado, los cebadores se unen específicamente a las secuencias
complementarias de la región genómica que se quiere amplificar, quedando sus
extremos 3' OH enfrentados. Los oligos están diseñados para que puedan iniciar la
reacción de síntesis de ADN en presencia de un ADN polimerasa termoestable adecuada
y de los precursores de ADN (los cuatro desoxinucleótidos trifosfato, dATP, dCTP,
dGTP y dTTP). Cada oligo servirá para iniciar la síntesis de una hebra de ADN
complementaria a una de las hebras del segmento de la diana, y las dos hebras de nueva
síntesis serán complementarias entre sí.
La PCR es una reacción en cadena porque las hebras de ADN de nueva síntesis
sirven a su vez de molde para reacciones de síntesis en ciclos posteriores. Tras unos 30
ciclos, la PCR habrá generado aproximadamente un millón de copias de la secuencia
diana específica. Una vez amplificado el ADN se dispone ya de cantidad suficiente
como para que este pueda ser caracterizado. Como en otros sistemas, se puede utilizar
el método de Souther, con digestión enzimática y análisis de los fragmentos por
37
electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio o gel red y detectarlos
como bandas discretas de un tamaño específico; o bien, detectar directamente una cierta
secuencia en el producto de amplificación si se cuenta con sondas adecuadas. Se utiliza
un ADN polimerasa termoestable debido a que la reacción pasa por ciclos en los que se
cambia la temperatura, de esta manera se evita añadir la enzima manualmente en cada
ciclo. Cada uno de los ciclos consta de las tres etapas siguientes:
Desnaturalización del ADN bicatenario presente en la muestra: típicamente
calentando la muestra a 93-95o C, durante unos 30 segundos, se consigue la separación
de la doble hélice en dos cadenas sencillas por rotura de los enlaces de hidrógeno y
consiguiente desapareamiento de las bases complementarias.
Unión específica de los cebadores a las cadenas sencillas mediante
complementariedad de bases: a temperaturas que varían entre 50 y 70 o C, dependiendo
de la Tm (temperatura de fusión) del duplex esperado y durante un tiempo aproximado
de unos 20 segundos, cada uno de los primers se une a una cadena diferente delimitando
la secuencia diana que se pretende amplificar.
Síntesis de ADN: típicamente a 70-75 o C, comienza a funcionar la
replicación incorporando nucleótidos sobre los primers y haciendo una copia completa
y exacta de la cadena molde. (5)
Principales ventajas de la reacción
Rapidez y sencillez de uso: La PCR permite clonar ADN en pocas horas,
utilizando equipos relativamente poco sofisticados. Una reacción de PCR típica consiste
en 30 ciclos de desnaturalización, síntesis y reasociación. Cada ciclo dura típicamente
38
de 3 a 5 minutos y se utiliza un termociclador que lleva un microprocesador para
programar los cambios de temperaturas y el número de ciclos deseado.
Sensibilidad: La PCR puede amplificar secuencias a partir de cantidades
ínfimas de ADN diana, incluso a partir de ADN contenido en una sola célula. Esta
elevada sensibilidad ha permitido el desarrollo de nuevos métodos para el estudio de la
patogénesis molecular y la aparición de numerosas aplicaciones (ciencia forense,
diagnóstico, estudios de paleontología molecular, etc) donde las muestras pueden
contener muy pocas células. Sin embargo, el hecho de que el método tenga una
sensibilidad tan elevada significa también que se deben extremar las precauciones para
evitar la contaminación de la muestra con ADN extraño.
Robustez: La PCR permite la amplificación de secuencias específicas de
material que contiene ADN muy degradado, o incluido en un medio que hace
problemática su purificación convencional. Esto hace que el método resulte muy
adecuado para estudios de antropología y paleontología molecular, por ejemplo, para el
análisis de ADN recuperado de individuos momificados y para intentar identificar ADN
de muestras fósiles que contienen poquísimas células de criaturas extintas hace ya
mucho tiempo.
Fig.2. PCR punto final
39
Método de inactivación de carbapenems (mIC)
La diferenciación de la resistencia a los antibióticos carbapenémicos mediados
por carbapenemasas y la resistencia mediada por otros mecanismos es de vital
importancia para el control de infecciones. En el año 2012 Patrice Nordmann , Laurent
Poire desarrollaron un método rápido para la detección de enterobacterias productoras
de carbapenemasas llamado Carba NP; basado en la hidrólisis in vitro del antibiótico
Imipenem.
Para realizar la CIM, se inicia con una suspensión en agua destilada del agente
en estudio. Posteriormente, se sumerge un disco de 10 μg de meropenem; se incuba
durante un mínimo de dos horas a 35ºC. Después de la incubación, se retira el disco de
la suspensión usando un asa de inoculación, y se coloca en una placa de agar Mueller-
Hinton inoculada con una cepa indicadora de E. coli susceptible (ATCC 29522) y
posteriormente se incubó a 35ºC. Si el aislamiento bacteriano produce carbapenemasa,
el meropenem en el disco de susceptibilidad será inactivado permitiendo el crecimiento
desinhibido de la cepa indicadora susceptible.
Según Kim Van Der Zwaluw, el método mIC en demuestra que es capaz de
detectar la producción de carbapenemasa en Gram-negativos permitiendo distinguir
entre la resistencia a carbapenems debido a la actividad beta-lactamasa y la
permeabilidad reducida. Con una alta concordancia (100% para Enterobacteriaceae y
98,8% para no fermentadores) entre PCR que detectan los genes que codifican
carbapenems y la actividad carbapenemasa detectada por mIC y que el valor predictivo
positivo y negativo de 100% para Enterobacteriaceae en comparación con PCR. (3).
40
HIPOSTESIS
Ho: el método de inactivación de carbapenems (mIC) no es comparable frente a la
técnica de PCR para la detección de carbapenemasas.
Ha: el método de inactivación de carbapenems (mIC) es comparable frente a la técnica
de PCR para la detección de carbapenemasas.
OBJETIVO GENERAL
Evaluar el método de inactivación de carbapenems (mIC) versus la prueba de referencia
de genes de resistencia por PCR punto final en aislamientos clínicos de Bacilos gram
negativos (BGN) y Bacilos gram negativos no fermentadores (BGNNF) para la
detección de carbapenemasas.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar la sensibilidad y especificidad diagnóstica del Método
Inactivación de Carbapenems (mIC).
Evaluar el valor predictivo positivo y negativo del Método Inactivación de
Carbapenems (mIC).
Obtener el índice Kappa del mIC con respecto a la prueba de referencia.
41
DISEÑO DEL ESTUDIO
Área de Estudio: Sección de Microbiología Clínica del Laboratorio Central de
Referencia en Salud Pública (LCRSP). Resistencia a los antimicrobianos.
Tipo de Estudio: Estudio analítico de evaluación de pruebas diagnósticas.
Población: 160 aislamientos de BGN y BGNNF con y sin mecanismos de resistencia a
los antimicrobianos, recibidas en la sección de microbiología clínica del LCRSP.
Criterios de Inclusión y exclusión:
Inclusión: Todo aislamiento bacteriano identificado como bacilo gram negativo de la
familia de las Enterobacteriaceae (género Enterobacter spp, Morganella spp, Proteus
spp) y de No Fermentadores (género Pseudomonas spp y Acinetobacter spp) con
mecanismo de resistencia a los antimicrobianos y con resultado de Conc. Inhibitoria
Mínima (CIM) de Imipenem>=2ug/mL y Meropenem >=1ug/mL
Exclusión: Todo aislamiento identificado como bacilo o cocos gram positivo.
Tamaño de la Muestra: 114 aislamientos de BGN y BGNNF con y sin mecanismos de
resistencia a los antimicrobianos. El valor se obtuvo de la siguiente manera:
Donde:
n = El tamaño de la muestra que queremos calcular
N = Tamaño del universo (160 aislamientos)
Z = Es el nivel de confianza deseado. (Nivel de confianza 95% / Z=1,96)
σ = desviación estándar (0.5)
e = error máximo (0.05%)
(1.96)2(0.5)2(160)
n = _______________________
(0.05)2(160-1) + (1.96)2(0.5)2
n = 114 aislamientos de BGN y BGNNF con o sin resistencia a los carbapenems.
42
ASPECTOS METODOLÓGICOS
Materiales y métodos
Se procesaron 114 aislamientos clínicos (cepas) del cepario del Laboratorio Central de
Referencia en Salud Pública del Instituto Conmemorativo Gorgas de Estudios de la Salud;
las cuales procedían de diferentes hospitales de la Red Nacional de Vigilancia
Epidemiológica en Microbiología clínica de Panamá.
64 cepas pertenecientes al grupo de Bacilos gram negativos (BGN) del género:
(Enterobacter spp, Morganella spp, Proteus spp) de las cuáles 48, cumplen los criterios de
concentración inhibitoria mínima de (CIM) de Imipenem>=2ug/Ml, Meropenem
>=1ug/mL y positivas por lo genes (KPC-2, NDM-1, VIM, OXA 48), las otras 16 cepas
presentaban una concentración inhibitoria mínima de (CIM) de Imipenem < 2ug/mL,
Meropenem < 1ug/mL y negativa para los genes (KPC-2, NDM-1, VIM, OXA 48).
El otro abordaje fue con 50 cepas del grupo de Bacilos gram negativos no fermentadores
(BGNNF) del género: Pseudomonas spp y Acinetobacter spp de los cuáles 23 aislados
tienen una concentración inhibitoria mínima de (CIM) de Imipenem>=2ug/mL,
Meropenem >=1ug/mL y positivas para los genes (VIM, IMP, SPM, KPC-2, OXA48,
OXA23, OXA51) y las otras 27 cepas presentaban una concentración inhibitoria mínima
de (CIM) de Imipenem < 2ug/mL, Meropenem < 1ug/mL y negativa para los genes (VIM,
IMP, SPM, KPC-2, OXA48, OXA23, OXA51).
Prueba de oro: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) punto final
El proceso de biología molecular inició con la extracción de ADN de los 114 aislamientos
bacterianos por ebullición, donde se hizo una suspensión de 1uL de la bacteria en agua
libre de nucleasas (100uL) se colocó el vial en el Thermomix a 100°C por 10 min; luego
43
se centrifugó a 14,000rpm por 5 min. Se transfirió 40uL del sobrenadante como ADN
bacteriano a un tubo estéril y se congelaron a -20°C hasta su procesamiento (15).
Para la determinación genotípica se utilizó el protocolo de amplificación estandarizado en
el Servicio de Antimicrobianos, Instituto de Salud, “Dr. Carlos Malbrán”, Buenos Aires,
Argentina (Servicio Antimicrobianos, 2008). Los primers utilizados fueron:
Tabla 1. Condiciones de amplificación de la Reacción en Cadena de la Polimerasa
Gen Secuencia 5´- 3´
KPC-2 forward AAC AAG GAA TAT CGT TGA TG
KPC-2 reverse AGA TGA TTT TCA GAG CCT TA
NDM-1 forward AGC ACA CTT CCT ATC TCG AC
NDM-1 reverse GGC GTA GTG CTC AGT GTC
VIM forward AGT GGT GAG TAT CCG ACA G
VIM reverse ATG AAA GTG CGT GGA GAC
IMP forward GGY GTT TWT GTT CAT ACW TCK TTY GA
IMP reverse GGY ARC CAA ACC ACT ASG TTA TCT
OXA 48 forward ATGCGTGTATTAGCCTTATCGG
OXA 48 reverse TGAGCACTTCTTTTGTGATG
SPM forward CCTACAATCAACGGCGACC
SPM reverse TCGCCGTGTCCAGGTATAAC
Tabla 2. Programa de amplificación
Tamaño amplicón Ciclado
VIM: 261pb
IMP: 404 pb
NDM; 512 pb
Desnaturalización inicial = 94ºC por 5min; Ciclado= 30-35 ciclos: 94ºC
30seg -- 50º 30seg -- 72ºC 60seg; Extensión final = 72ºC por 10min
Tamaño amplicón Ciclado
KPC-2: 916pb
OXA-48: 775pb
SPM: 504pb
Desnaturalización inicial= 5 min. a95ºC, 35 ciclos de 30 seg. A 95ºC,
30 seg. a 52ºC y 1 min. a72ºC, Extensión final= 10 min. a72ºC.
44
Corrida Electroforética
Preparación del gel de agarosa:
Para empezar se preparó el gel de agarosa al 2% con buffer TBE (Tris Boratos EDTA) el
cual tiene el pH requerido y los iones necesarios para que fluya la corriente y pueda migrar
el ADN. La agarosa se disolvió en el mismo buffer que se utiliza para la corrida se calentó
hasta ebullición para disolver bien el polvo. La solución se agitó suavemente para evitar la
formación de burbujas, y cuando se enfrío (aprox. 60ºC) se le adicionó 2-3 gotas de gel red
para teñir el ADN, este se vierte de una sola vez en el contenedor de geles al cual
previamente se le colocó el peine para que se formen los pozos en donde se cargan las
muestras.
Cargar las muestras:
En un parafilm colocamos 5uL del buffer de carga para cada muestra, luego adicionamos
1 uL del ADN amplificado y mezclamos suavemente con la micropipeta. La punta de la
pipeta se mete un poco en el pozo y lentamente se vacía la pipeta para cargar el gel. Este
mismo procedimiento se realiza con el control positivo y negativo del gen a testar. Se
utilizó un marcador de peso molecular de Qiagen; se utilizó un voltaje de 100volts/ 1hora.
Para observar los fragmentos de ADN se utilizó un transiluminador de luz UV.
45
Prueba en Evaluación: Método de inactivación de carbapenems (mIC)
Se realizó una suspensión de cada uno de los aislamientos bacterianos con un asa de 10uL
en 400uL de agua libre de nucleasas, seguidamente se les adicionó un disco que contiene
10ug de Meropenem (MastDisc) el mismo fue inmerso en la suspensión, para su posterior
incubación de dos (2) horas a 35°C+/- 2°C.
Después de la incubación los discos fueron removidos de la suspensión con un asa y se
colocaron (4 discos por plato) en un plato de agar Mueller Hinton, el cual previamente
había sido inoculado con Escherichia coli ATCC 25922 al 0.5McF, la misma se estrió en
el plato en tres direcciones cubriendo todo el agar utilizando un hisopo estéril y se incubó
a 35°C+/- 2°C de 18 – 24 horas.
La lectura se basó en que si el aislamiento bacteriano produce carbapenemasa, la
susceptibilidad del disco de Meropenem estará inactivada (sin halo de inhibición) no
permitiendo el crecimiento de la cepa indicadora.
Si el aislamiento bacteriano no produce carbapenemasas, se observará una zona de
inhibición clara.
Fig. 3. Esquema del Método de inactivación de carbapenems
46
ASPECTOS ÉTICOS
Este estudio se realizará con aislamientos clínicos procedentes de la colección de cepas de
la sección de microbiología clínica del Laboratorio Central de Referencia en Salud Pública
del ICGES; de acuerdo al procedimiento de conservación de cepas.
Las cepas serán identificadas con un número secuencial, agrupadas por el género
bacteriano, de acuerdo a la base de datos que se registra en el sistema informático Whonet
5.6, como investigadora de este estudio no tendré ningún contacto con los pacientes o la
institución que envía los aislamientos clínicos ya conservados en el LCRSP/ICGES; por lo
tanto, no existe riesgos adicionales al paciente, ni beneficios directos a la institución que
envía las cepas.
Estás cepas son alícuotas realizadas después que las mismas fueran procesadas como parte
de la vigilancia en antimicrobianos que existe en el LCRP/ICGES. Los beneficios
aportados a la comunidad se enmarcan principalmente a los laboratorios clínicos de
microbiología clínica; ya que de obtenerse resultados satisfactorios de esta prueba en
estudio se podrá implementar la búsqueda de BGN y BGNNF productores de
carbapenemasas con insumos de muy bajo costo y con una prueba fácil de realizar e
interpretar.
47
RESULTADOS
Tabla 3. Resultado de la prueba de evaluación diagnóstica (Método de inactivación de
Carbapenems) frente a la prueba de oro (PCR punto final) en Bacilos gram negativos
Especies de Bacilos gram negativos PCR N° mIC+
Klebsiella pneumoniae (38) KPC-2 20 20 NDM-1 7 7 OXA-48 1 0 Positivos 28 27 Negativos 10 10
Enterobacter cloacae complex (13) NDM-1 6 6 KPC-2 3 3 VIM 2 2 Positivos 11 11 Negativos 2 2
Proteus mirabilis (7) KPC-2 3 3
NDM-1 2 2 Positivos 5 5 Negativos 2 2
Morganella morganii (6) KPC-2 3 3
NDM-1 1 2 Positivos 4 4 Negativos 2 2
48
Tabla 4. Tabla de contingencia del Método de Inactivación de Carbapenems (mIC) en
Bacilos gram Negativos (BGN)
Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR) para detección
de genes de resistencia a los
carbapenems
Método de
inactivación de
Carbapenems (mIC)
Positivo Negativo Total
Positivo 47 0 47
Negativo 1 16 17
Total 48 16 64
Tabla 5. Validez de la prueba diagnóstica: Determinación de la Sensibilidad y especificidad
del Método de inactivación de Carbapenems (mIC) en Bacilos gram Negativos (BGN)
Parámetro Cálculo IC 95%
Inferior-Superior
Sensibilidad 97.92% (89.1, 99.63)
Especificidad 100% (80.64, 100)
Tabla 6. Seguridad de la prueba diagnóstica: Determinación del valor predictivo positivo
y negativo del Método de inactivación de Carbapenems (mIC) en Bacilos gram Negativos
(BGN)
Parámetro Cálculo IC 95%
Inferior-Superior
Valor Predictivo
Positivo
100% (92.44, 100)
Valor Predictivo
Negativo
94.12% (73.02, 98.95)
49
Tabla 7. Determinación del nivel de concordancia (Índice Kappa) del Método de
inactivación de Carbapenems (mIC) en Bacilos gram Negativos (BGN) con respecto a la
prueba de oro.
Parámetro Cálculo IC 95%
Inferior-Superior
Índice Kappa 0.9592 (0.7144 - 1.204)
50
Tabla 8. Resultado de la prueba de evaluación diagnóstica (Método de inactivación de
Carbapenems) frente a la prueba de oro (PCR punto final) en Bacilos gram negativos no
fermentadores.
Especies de Bacilos gram negativos no fermentadores PCR N° mIC+
Pseudomonas aeruginosa (36) VIM 7 7 IMP 7 7 SPM 2 1 KPC-2 2 1 Positivos 18 16 Negativos 18 13
Acinetobacer baumanii complex (14) OXA 48 2 2 OXA 23 1 1 OXA 51 2 1
Positivos 5 4
Negativos 9 7
51
Tabla 9. Tabla de contingencia del Método de Inactivación de Carbapenems (mIC) en
Bacilos gram Negativos no fermentadores (BGNNF)
Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR) para detección
de genes de resistencia a los
Carbapenems
Método de
inactivación de
Carbapenems (mIC)
Positivo Negativo Total
Positivo 20 7 27
Negativo 3 20 23
Total 23 27 50
Tabla 10. Validez de la prueba diagnóstica: Determinación de la Sensibilidad y
especificidad del Método de inactivación de Carbapenems (mIC) en Bacilos gram
Negativos no fermentadores (BGNNF)
Parámetro Cálculo IC 95%
Inferior-Superior
Sensibilidad 86.96% (55.32, 86.83)
Especificidad 74.07% (55.32, 86.83)
52
Tabla 11. Seguridad de la prueba diagnóstica: Determinación del valor predictivo positivo
y negativo del Método de inactivación de Carbapenems (mIC) en Bacilos gram negativos
no fermentadores (BGNNF)
Parámetro Cálculo IC 95%
Inferior-Superior
Valor Predictivo
Positivo
74.07% (67.87, 95.46)
Valor Predictivo
Negativo
86.96% (66.96, 88.76)
Tabla 12. Determinación del nivel de concordancia (Índice Kappa) del Método de
inactivación de Carbapenems (mIC) en Bacilos gram Negativos no fermentadores
(BGNNF) con respecto a la prueba de oro.
Parámetro Cálculo IC 95%
Inferior-Superior
Índice Kappa 0.6025 (0.3289 - 0.8762)
53
DISCUSIÓN
Para la detección fenotípica de las carbapenemasas se debe tener en cuenta el perfil
hidrolítico general que confiere cada una de sus clases y de manera específica cada una
de las enzimas incluidas en estas clases, y la posible inhibición por los diferentes
inhibidores de betalactamasas.
La expresión de las carbapenemasas no es siempre homogénea y se producen fenómenos
de heterorresistencia. Este hecho se ha demostrado claramente con las enterobacterias y
las metalobetalactamasas que hace que los valores de CIM no sean en ocasiones
reproducibles y se sitúen en un amplio rango de concentraciones, incluso por debajo del
punto de corte de sensibilidad. No obstante, estas CIM también pueden ser muy elevadas
por la superposición con otros mecanismos de resistencia.
Desde un punto de vista práctico y una vez observado en el antibiograma la expresión
de un fenotipo compatible con la presencia de una carbapenemasa, generalmente
ilustrado por la sensibilidad disminuida o resistencia a las cefalosporinas de amplio
espectro y a alguno de los carbapenémicos, es importante verificar que existe un
mecanismo de inactivación de los carbapenémicos.
Los resultados presentados por Zwaluw y col. (2015) para la validación del Método de
Inactivación de Carbapenems (mIC), en la detección de carbapenemasas mostró: para
bacilos gram negativos (BGN) una sensibilidad del 100% y especificidad de 98.6% y
en Bacilos gram negativos no fermentadores (BGNNF) una sensibilidad de 96% y una
especificidad de 99.28%.
54
En este estudio los resultados obtenidos fueron: para bacilos gram negativos (BGN) una
sensibilidad del 97.92% y una especificidad del 100% y en Bacilos gram negativos no
fermentadores (BGNNF) una sensibilidad de 86.96 % y una especificidad de 74.07 %.
Los resultados discrepantes en la sensibilidad y especificidad del método para la
detección de carbapenemasas en bacilo gram negativos no fermentadores (BGNNF), los
falsos negativos (3 aislamientos) se puede atribuir a que no se establecieron inicialmente
los puntos de corte o los tamaños de los halos de inhibición; en el estudio de Zwaluw y
col. (2015) no define en la metodología si existe alguna medida del diámetro del halo
que indique si la cepa en estudio está en zona gris (indeterminado), de igual manera se
observaron colonias dentro del halo que dificultaban su interpretación. Es importante
resaltar que los números de muestra positivas para estos genes de resistencia (Spm=2
aislamientos, KPC=2 aislamientos, OXA51=2 aislamientos) no fue significativa; otros
elementos importantes que pudiesen explicar los falsos negativos pueden ser inherentes
al método; como la subjetividad a la hora de interpretar los resultados y las diferencias
técnicas interlaboratorios.
J.A. Reyes Chacón y col. (Feb, 2017), en su publicación utilizaron 179 aislamientos de
Bacilos gram negativos (BGN) para la detección de carbapenemasas (KPC) con el
método de Inactivación de Carbapenems (mIC), obteniendo una sensibilidad y
especificidad mayor o igual al 99% y una concordancia Kappa de 1, estos resultados son
comparables con los obtenidos en este estudio. El estudio de J.A. Reyes Chacón y col.
presentó una interpretación de los resultados en la lectura de los halos de inhibición, los
autores mencionan que aislamientos positivos (con el gen blaKPC) no presentan halos
de inhibición y aislamientos negativos (sin el gen blaKPC) presentan halos superiores a
55
20mm, en su estudio no se evidenciaron resultados con halos entre 6 y 20mm; señalan
que de ocurrir este evento se recomienda el uso de otra técnica disponible. De igual
manera, no se estudiaron aislamientos que incluyeran a los Bacilos gram negativos no
fermentadores.
Gauthier et al. (marzo 2017), su estudio se basó en una evaluación retrospectiva y
prospectiva donde se evaluaron 256 aislamientos de Bacilos gram negativos (BGN)
obteniéndose una sensibilidad de 95.5% y especificidad del 99.2%; estos resultados son
semejantes a los obtenidos. En el estudio de Gauthier et al. no se evaluaron los bacilos
gram negativos no fermentadores (BGNNF).
En abril del 2017, Pierce VM et al. publicó un estudio en donde se hace una
modificación del protocolo original, ellos lo describen como Método de inactivación de
Carbapenems modificado (mCIM), en donde se hizo una sustitución de los reactivos
utilizados en una de las etapas de incubación (Caldo TS en lugar de agua), además se
alargó el tiempo de incubación, pasó de 2horas a 4 horas. Estos cambios en los tiempos
de incubación del aislamiento con el disco de meropenem en caldo de TSB, mejoran la
detección de carbapenemasas con una actividad hidrolítica más débil (usualmente no
afectan a las C3G, ni monobactames), bajos niveles de expresión o para las
metalobetalactamasas que requieres cationes divalentes para su actividad
(VIM_IMP_SPM_NDM).
También definieron en este estudio los diferentes rangos de interpretación: donde halos
de 6 a 15 mm son considerados positivos para la presencia de carbapenemasas; halo
entre 16 y 18mm son aislamiento en zona indeterminada y se sugiere usar otra
metodología para la sospecha de carbapenemasas y aislamiento con halos mayores o
56
iguales a 19mm son considerados negativos. Finalmente, con las modificaciones
realizadas se evidenció que Método de inactivación de Carbapenems modificado
(mCIM) tiene una sensibilidad de 98% y especificidad del 99.5%. Valores muy
similares con los obtenidos en este estudio. Al igual que en los estudios anteriores no
utilizaron aislamientos de bacilos gram negativos no fermentadores (BGNNF).
En este estudio se detectaron 7 falsos positivos en BGNNF, es importante resaltar que
con bacterias como Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumanni es esencial
valorar la posible presencia de otros mecanismos de resistencia que puedan
“enmascarar” el fenotipo que confieren las carbapenemasas, entre ellos la alteración de
la permeabilidad, la presencia de bombas de expulsión, afectación de las PBPs o
presencia simultánea de otras betalactamasas.
J.A. Reyes Chacón y col. (Feb, 2017), en su estudio evidenciaron el rendimiento de las
pruebas fenotípicas en enterobacterias resistentes a los carbapenémicos tipo KPC en
donde el mIC mostró una sensibilidad, especificidad, VPP y VPN mayor o igual al 99%
57
CONCLUSIONES
1. El método de inactivación de Carbapenems (mIC), demostró ser un método de bajo
costo en cuanto reactivos e insumos, de igual manera su metodología es sencilla.
2. El método de inactivación de Carbapenems (mIC) permite la detección de
carbapenemasas en bacilos gram negativos (BGN) con una sensibilidad y
especificidad de 97.92% y 100% respectivamente.
3. Para los bacilos gram negativos no fermentadores (BGNNF) la sensibilidad y
especificidad del método fue de 86.96% y 74.07% respectivamente.
4. El valor predictivo positivo del método para la detección de carbapenemasas en
BGN fue del 100%, mientras que para BGNNG fue de 74.07%.
5. El valor predictivo negativo en BGN fue del 94.12%, mientras que para los BGNNF
86.96%.
6. El grado de concordancia del método de inactivación de carbapenems (mIC) con
respecto a la prueba de oro (PCR punto final) para BGN fue de 0.9592; mientras
que para BGNNF fue de 0.6025.
7. El mIC, permite detectar la presencia de carbapenemasas en BGN, sin embargo, en
este estudio el desempeño en BGNNF no es bueno; aunque estudios recientes ya
describen una modificación más, de este método para mejorar la búsqueda de estas
enzimas en BGNNF.
8. El mIC, aunque permite detectar la presencia de carbapenemasas en BGN no
permite diferenciarlas entre ellas.
9. Los resultados obtenidos son comparables con el método de referencia, permitiendo
detectar estas enzimas a un menor costo y fácil implementación.
58
RECOMENDACIONES
1. El mIC, se recomienda su metodología en Bacilos gram negativos (BGN).
2. Se debe procesar un control positivo (cepa productora de carbapenemas) y un
control negativo (cepa no productora de carbapenemasas) para validar el método.
3. Se recomienda realizar el control de calidad del disco de meropenem, control de
calidad de caldo de tripticasa y soya (TSB), del medio de Mueller Hinton para evitar
errores de lectura, contaminación que puedan causar falsos positivos.
4. Es importante en el desarrollo de la prueba respetar los tiempos de incubación y
sobre todo al sacar el disco de meropenem del caldo de TSB, intentar presionarlo un
poco evitando que el disco se dañe para eliminar el excedente de caldo y ocasione
dudas al momento de la lectura.
5. Realizar otros estudios con el mIC, ya que este año 2018 tiene una variante más que
permite la identificación de carbapenemasas tipo MBL en Pseudomonas
aeruginosa.
6. El laboratorio de microbiología debe conocer la epidemiología de su entorno,
reconocer cambios en los puntos de cortes de agentes bacterianos que pueden ser
productores de estas enzimas carbapenemasas.
59
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