UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
Evaluación bacteriológica de leche cruda, sometida a tres concentraciones de
ozono, mediante su comprobación microbiológica en placas petrifilm.
Trabajo de titulación presentado como requisito previo a la obtención del
Título de Médico Veterinario Zootecnista.
Autor:
Alex Wladimir Soque Díaz
Tutor:
Dr. Jorge Adalberto Mosquera Andrade
Quito, mayo 2019
i
© DERECHOS DE AUTOR
Yo, Alex Wladimir Soque Díaz en calidad de autor y titular de los derechos
morales y patrimoniales del trabajo de titulación “EVALUACIÓN
BACTERIOLÓGICA DE LECHE CRUDA, SOMETIDA A TRES
CONCENTRACIONES DE OZONO, MEDIANTE SU COMPROBACIÓN
MICROBIOLÓGICA EN PLACAS PETRIFILM”, modalidad presencial.
Proyectos de investigación, de conformidad con el Art. 114 del CÓDIGO
ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS,
CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedo a favor de la Universidad Central
del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para el uso no
comercial de la obra, con fines estrictamente académicos. Conservo a mi favor
todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos en la normativa citada.
Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la
digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual,
de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación
Superior.
El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en
su forma de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo
la responsabilidad por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta
causa y liberando a la Universidad de toda responsabilidad.
Firma:
Alex Wladimir Soque Díaz
C.I.: 1723712780 Dirección electrónica: [email protected]
ii
INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR
En mi carácter de Tutor del Trabajo de Grado, presentado por el señor ALEX
WLADIMIR SOQUE DIAZ, para optar por el Título de Médico Veterinario y
Zootecnista, cuyo título es: “EVALUACIÓN BACTERIOLÓGICA DE LECHE
CRUDA, SOMETIDA A TRES CONCENTRACIONES DE OZONO,
MEDIANTE SU COMPROBACIÓN MICROBIOLÓGICA EN PLACAS
PETRIFILM”. Considero que dicho trabajo, reúne los requisitos y méritos
suficientes para ser sometido a la presentación pública y evaluación por parte del
tribunal examinador que se designe.
En la ciudad de Quito, a los 22 días del mes de abril del 2019.
Dr. Jorge Adalberto Mosquera Andrade
C.I.: 1702609197
E-mail: [email protected]
iii
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL
El tribunal constituido por:
Dr. Byron Puga, Dra. María Inés Baquero y Dra. Martha Naranjo.
Luego de aceptar la presentación oral del trabajo de titulación previo a la
obtención del título (o grado académico) de Médico Veterinario Zootecnista
presentado por el señor Alex Wladimir Soque Díaz.
Con título:
“EVALUACIÓN BACTERIOLÓGICA DE LECHE CRUDA, SOMETIDA A TRES
CONCENTRACIONES DE OZONO, MEDIANTE SU COMPROBACIÓN
MICROBIOLÓGICA EN PLACAS PETRIFILM”.
Emiten el siguiente veredicto (aprobado/reprobado)
Fecha
Para constancia de lo actuado firman:
Nombre y Apellido Calificación Firma
Presidente Dr. Byron Puga
Vocal Principal Dra. María Inés Baquero
Vocal Principal Dra. Martha Naranjo
iv
DEDICATORIA
“Te he mandado que seas fuerte y valiente. No tengas, pues, miedo ni te
acobardes, porque el Señor tu Dios estará contigo dondequiera que vayas.” Josué 1:9
Gracias Señor Dios por permitirme cumplir mis sueños y guiar mis pasos bajo tu guía
y protección.
A mis padres Inés y Apolinario por todo el cariño y entrega, además de enseñarme
que la honestidad, la humildad y el amor son las armas más poderosas para enfrentar
las adversidades del mundo.
A mis hermanos Leonardo, Boris, Eduardo; a mi cuñada Flor Catalina y a mi sobrina
Sofía.
A todos ellos, mi familia, mis mejores amigos, el mejor regalo que Dios me dio. Ellos
que siempre han creído en mí. Muchas gracias.
Alex Soque Díaz
v
RECONOCIMIENTO
Quiero iniciar mencionando a la Universidad Central del Ecuador y a la Facultad de
Medicina Veterinaria y Zootecnia por permitirme realizar mis estudios.
Al Laboratorio de Bacteriología y Micología de la Facultad de Medicina Veterinaria y
Zootecnia por haberme prestado las facilidades para realizar la fase experimental de
este estudio.
Un reconocimiento especial al Doctor Jorge Mosquera por concederme la confianza
para realizar este proyecto, por toda su paciencia y la orientación durante el desarrollo
del mismo.
A la Doctora María Inés Baquero un reconocimiento por toda la colaboración, las
enseñanzas y el apoyo brindado durante la realización de mi tesis.
Al Proyecto Semilla “Efecto del ozono en leche en la disminución de carga bacteriana
y el mantenimiento de sus propiedades físico químicas” por permitirme ser parte del
mismo.
Y a todas las personas, amigos, compañeros de estudio, profesores, que de alguna
manera me brindaron su apoyo durante la realización de este proyecto, muchas
gracias a todos.
Alex Soque Díaz
vi
ÍNDICE GENERAL
RESUMEN ................................................................................................................... x
ABSTRACT ................................................................................................................. xi
CAPÍTULO I ................................................................................................................ 1
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 1
CAPÍTULO II ............................................................................................................... 4
OBJETIVOS ............................................................................................................. 4
GENERAL ............................................................................................................. 4
ESPECÍFICOS ...................................................................................................... 4
CAPÍTULO III .............................................................................................................. 5
MARCO TEÓRICO .................................................................................................. 5
Generalidades ...................................................................................................... 5
Ozono ................................................................................................................... 5
Síntesis y Estructura Molecular del Ozono ........................................................... 6
Características físico-químicas del ozono ............................................................. 8
Principios del Tratamiento con Ozono .................................................................. 9
Equipamiento para el tratamiento de ozono de los alimentos ............................... 9
Ozono en Estado Acuoso ..................................................................................... 9
Ozono en Estado Gaseoso ................................................................................... 9
Ventajas y Desventajas de la Ozonoterapia ....................................................... 10
Mecanismo de Acción Antimicrobiana del Ozono ............................................... 11
Uso de petrifilm en el análisis microbiológico de alimentos ................................ 11
CAPÍTULO IV ............................................................................................................ 14
MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................. 14
vii
Materiales ........................................................................................................... 14
Metodología ........................................................................................................... 17
Lugar de Estudio ................................................................................................. 17
Tipo de Investigación .......................................................................................... 17
Ozono y Tratamientos......................................................................................... 17
Muestreo ............................................................................................................. 19
Análisis Microbiológico........................................................................................ 19
Análisis Estadístico ............................................................................................. 19
CAPÍTULO V ............................................................................................................. 20
RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................................. 20
Correlación estadística entre concentración (tiempo-dosis) y reducción del
recuento microbiano ........................................................................................... 25
Discusión ............................................................................................................ 25
ANÁLISIS DE COSTOS PARCIALES .................................................................... 28
CAPÍTULO VI ............................................................................................................ 31
CONCLUSIONES .................................................................................................. 31
CAPÍTULO VII ........................................................................................................... 32
BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 32
ANEXOS ................................................................................................................... 42
viii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Breve reseña de logros y certificaciones alcanzadas por el ozono. .............. 6
Tabla 2.Características físico-químicas del ozono ...................................................... 8
Tabla 3.Materiales biológicos utilizados en la fase de campo. .................................. 14
Tabla 4.Materiales químicos empleados en la fase de campo. ................................. 14
Tabla 5.Materiales físicos utilizados en la fase de campo. ........................................ 14
Tabla 6. Materiales químicos utilizados durante la fase de laboratorio del estudio. .. 15
Tabla 7.Materiales físicos utilizados durante la experimentación en el laboratorio. .. 15
Tabla 8.Implementos y suministros adicionales durante la ejecución del estudio. .... 16
Tabla 9.Lista de equipos empleados durante la realización del estudio. ................... 16
Tabla 10.Tipos de tratamientos según la dosis de ozono y el tiempo de exposición. 18
Tabla 11.Recuentos microbianos (Log10 UFC/ml) observados en leche cruda y leche
tratada con ozono según dosis y tiempo de exposición. ........................................... 22
Tabla 12: Comparación de los resultados de T9 (Log10 UFC/ml) con los parámetros
establecidos en la Norma NTE INEN 10 Leche pasteurizada. Requisitos ................ 23
Tabla 13.Recuentos microbianos (Log10 UFC/ml) observados en leche cruda y leche
tratada con ozono (T9), leche hervida y leche UHT .................................................. 23
Tabla 14.Valores de “p” para cada recuento, tras la comparación de T9 con la leche
hervida, T9 con la leche UHT y T9 con el testigo (leche cruda). ............................... 24
Tabla 15. Análisis de costos parciales del tratamiento testigo. ................................. 28
Tabla 16. Análisis de costos parciales por tratamientos experimentales. ................. 28
Tabla 17. Análisis de costos parciales de la leche pasteurizada UHT. ..................... 29
Tabla 18. Análisis de costos parciales de la leche hervida ....................................... 29
Tabla 19. Comparación de costos entre el testigo, la leche hervida, la leche
pasteurizada UHT y el tratamiento de ozono (T9). .................................................... 29
ix
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. . Reacción química a partir de la molécula de oxígeno para generar ozono. 7
Figura 2. Molécula de ozono. ...................................................................................... 7
Figura 3.Diferencias en la carga bacteriana de la leche tras la aplicación de
ozonización. .............................................................................................................. 20
Figura 4. Diferencias en la carga bacteriana de la leche, donde a la dosis más alta se
llegó a un valor de 0 para coliformes totales. ............................................................ 21
Figura 5. Diferencias en la carga bacteriana de Escherichia coli donde a la dosis más
alta se llegó a un valor de 0....................................................................................... 21
Figura 6. Comparación de resultados de los tres distintos tratamientos en estudio. . 24
x
TEMA: “EVALUACIÓN BACTERIOLÓGICA DE LECHE CRUDA, SOMETIDA A TRES
CONCENTRACIONES DE OZONO, MEDIANTE SU COMPROBACIÓN
MICROBIOLÓGICA EN PLACAS PETRIFILM”.
Autor: Alex Wladimir Soque Díaz
Tutor: Jorge Adalberto Mosquera Andrade
Fecha: Mayo 2019
RESUMEN
La presente investigación tuvo como objetivo determinar el efecto del ozono en la
disminución de la carga bacteriana presente en la leche cruda.
Las distintas muestras de leche cruda recolectadas fueron sometidas a cultivo antes y
después de la aplicación de ozono a dosis de 50, 75 y 100 mg/l durante 10, 20 y 30
minutos. Además, se cultivaron muestras de leche sometida a ebullición y
ultrapasteurizada. La eficacia del ozono fue evaluada al cuantificar la carga microbiana
de mesófilos aerobios totales, coliformes totales, Escherichia coli, Listeria
monocytogenes y Salmonella spp.
En la leche control (sin tratamiento), el conteo de mesófilos aerobios totales fue 3,90
Log10UFC/ml; 3,68 Log10UFC/ml para coliformes totales y 3,67 Log10UFC/ml para
Escherichia coli; no se demostró crecimiento de Listeria monocytogenes y Salmonella
spp. El tratamiento con 100 mg de O3 por 30 minutos redujo la población de mesófilos
aerobios totales a 1,37 Log10UFC/ml y a 0 Log10UFC/ml en coliformes totales y
Escherichia coli. La leche hervida mostró recuentos bacterianos más altos que la leche
UHT y la leche ozonizada (T9). La leche UHT presentó niveles de mesófilos aerobios
totales más altos (p≥ 0.05) en relación a las muestras de leche tratadas con ozono.
En conclusión, la ozonización fue efectiva para disminuir la carga bacteriana en leche
cruda.
PALABRAS CLAVE: LECHE, OZONO, TRATAMIENTO CON OZONO, CALIDAD
MICROBIOLÓGICA
xi
TITLE: “BACTERIOLOGICAL ASSESSMENT OF RAW MILK, AGAINST THREE OZONE CONCETRATION, USING MICROBIOLOGICAL CHECKING ON PETRIFILM PLATES”.
Author: Alex Wladimir Soque Diaz Tutor: Jorge Adalberto Mosquera Andrade
Date: May 2019
ABSTRACT
The present research work has as its main objective to determine the effect
of ozone in the decrease of bacterial burden existing in raw milk.
The different samples of raw milk collected were put into culture before and after of application of
ozone in different dosages: 50, 75 and 100 mg/I during 10, 20 and 30 minutes. In addition,
samples of milk to boiling point and ultra pasteurised were cultured. The efficacy of ozone was
assessed when quantifying microbial burden of total mesophilic aerobic, total coliforms,
Escherichia coli, Listeria monocytogenes and Salmonella spp.
In the control milk (no treatment), a count of total mesophilic aerobic was 3.90 Log10 UFC/ml; 3.68
Log10 UFC/ml for total coliforms and 3.67 Log10 UFC/mI for Escherichia coli; no development of
Listeria monocytogenes and Salmonella spp was shown. The treatment with 100 mg of O3 for 30
minutes reduced population of total mesophilic aerobic to 1.37 Log10 UFC/ml and 0 Log10
UFC/ml in total coliforms and Escherichia coli. Boiled milk showed higher bacterial
count than UHT milk and ozonised milk (T9). UHT milk presented higher levels of
mesophilic aerobic (p>0.05) in comparison with the samples of milk with ozone.
In conclusion, ozonation was efective at diminishing bacterial burden in raw milk.
KEY WORDS: MILK, OZONE, TREATMENT WITH OZONE, MICROBIOLOGICAL QUALITY.
El Centro Educacional de Idiomas y Especializaciones Administrativas CENDIA C.A certifica, mediante firma del traductor y sello de la institución, haber realizado la traducción del presente documento.
1
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
Según la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura
(FAO), la producción mundial de leche alcanzó los 833,5 millones de toneladas para
el año 2017 (FAO, 2017). En Ecuador, de acuerdo a datos de la Encuesta de Superficie
y Producción Agropecuaria Continua, la producción láctea para el año 2017 fue de
5,135 millones de litros/día (INEC- ESPAC, 2017). La Asociación de Ganaderos de la
Sierra y Oriente establece que, a nivel nacional, se consumen de 90 a 100 l/año/per
capita de leche y productos derivados (AGSO, 2019).
La leche es un alimento con alto grado de nutrientes; posee una consistencia líquida y
un pH ligeramente ácido (Moncada, 2011), características que la convierten en un
medio ideal para el crecimiento de microorganismos (Dahmer et al., 2007). La Norma
Técnica Ecuatoriana del Instituto Nacional de Normalización NTE INEN 9 “Leche
Cruda. Requisitos”, define a la leche cruda como aquella que no fue sometida a una
temperatura superior a 40°C, estableciendo como límite máximo un recuento de
microorganismos aerobios mesófilos de 1,5x106 UFC/ml (INEN, 2012). En el caso de
leche pasteurizada, la norma NTE INEN 10 “Leche Pasteurizada. Requisitos”
establece un índice máximo permisible de buena calidad estimado en 3x104 UFC/ml
de microorganismos aerobios mesófilos (INEN, 2012). Y para la leche larga vida, la
normativa NTE INEN 701 “Leche Larga Vida. Requisistos” establece como límite
máximo la presencia de hasta 10 colonias UFC/ml para ser declarada como leche
comercialmente estéril (INEN, 2009).
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA), por lo general, son de tipo
infeccioso o tóxico, ocasionadas por bacterias, virus, parásitos o sustancias químicas
contaminantes que pueden contener los productos finales o las materias primas, como
es la leche cruda (OMS, 2016). En este sentido, y para garantizar el consumo de
productos seguros e inocuos, la industria alimenticia ha investigado diversos procesos
2
que contrarresten a estos agentes microbianos, entre ellos el uso de ozono (Perry &
Yousef, 2011).
El procesamiento de la leche es esencial para asegurar su inocuidad y extender su
vida útil, siendo la pasteurización el tratamiento térmico más usado. Los tratamientos
térmicos han influenciado sobre propiedades nutricionales como la proteína del suero
y el contenido de vitaminas de la leche, debido a que son componentes muy
termolábiles. Además de causar cambios en la viscosidad y sabor de la misma (Lopes
et al., 2016; Mejía-López et al., 2017).
Debido a este impacto negativo sobre la calidad nutricional de la leche, han emergido
nuevas técnicas y procedimientos no térmicos que buscan un producto de calidad
(Lopes et al., 2016)
El ozono es un desinfectante de rápida acción, cuyo efecto se basa en la oxidación
que se produce en ácidos grasos polinsaturados que constituyen parte de la pared
celular, provocando una pérdida de la permeabilidad selectiva y posterior disrupción
celular (Cavalcante et al., 2013), ocasionando la inactivación de bacterias, células
vegetativas y esporuladas, levaduras, mohos y virus (Pretell et al., 2016). En el caso
de micotoxinas (aflatoxinas), el ozono reacciona sobre el enlace C8-C9 del anillo de
furano, produciendo aldehídos, cetonas y CO2 (Diao et al., 2013). Esto, sumado a su
alta capacidad de difusión en la materia orgánica (hasta 3000 veces más rápida que
el cloro), lo convierte en una estrategia a considerar en la obtención de alimentos
inocuos (Patil et al, 2009).
Estudios experimentales previos demuestran la efectividad del ozono aplicado por
burbujeo sobre bacterias psicrófilas, enterobacterias y Staphylococcus (Cavalcante et
al., 2013; Mariaselvam & Muthukumar, 2011; Varga & Szigeti, 2016). No se dispone
información sobre la aplicación directa del ozono en el tanque de leche que será
transportada al centro de acopio. La Food and Drug Administration (FDA) no estipula
una dosis máxima de ozono que pueda ser aplicada a los alimentos, sin embargo
afirma su actividad microbiológica efectiva permitiendo su uso, siempre y cuando no
altere la composición del alimento tratado o ponga en riesgo al medio ambiente o al
3
operario (FDA, 2001). Las dosis establecidas en este estudio se direccionaron al
cumplimiento bacteriológico de la leche pasteurizada, acordes a la normativa técnica
ecuatoriana NTE INEN 10 “Leche Pasteurizada. Requisitos” (INEN, 2012).
La presente investigación se realizó con el objetivo de evaluar bacteriológicamente la
leche cruda antes y después de ser sometida directamente a la acción desinfectante
del ozono, con el antecedente de no existir una investigación similar documentada en
el Ecuador.
4
CAPÍTULO II
OBJETIVOS
GENERAL
Evaluar bacteriológicamente la leche cruda tras ser sometida a tres
concentraciones y tres tiempos de ozono mediante su comprobación
microbiológica.
ESPECÍFICOS
Determinar a qué concentración de ozono le corresponde la mayor acción
antibacteriana en leche cruda.
Determinar cuál periodo de exposición al ozono posee la más alta eficacia
contra las bacterias en la leche cruda.
5
CAPÍTULO III
MARCO TEÓRICO
Generalidades
La leche al ser de naturaleza líquida, con alto grado de contenido de agua, y con un
pH cercano a la neutralidad convierten a la leche en el medio propicio para el
desarrollo de diversos microorganismos que ocasionan su temprana descomposición,
además de ocasionar posibles intoxicaciones en los consumidores (Sarkar, 2016).
Ozono
La contaminación alimentaria se ha constituido en uno de los problemas más latentes
dentro de la industria de alimentos, problema que requiere un continuo control en cada
paso dentro de la cadena de producción. El ozono ha sido usado como agente
descontaminante para controlar y eliminar la presencia de microorganismos en los
alimentos (Brodowska et al., 2018).
El ozono fue descubierto por Schönbein en 1839, quien observó que la electrólisis del
agua producía un gas con olor. El primer uso comercial que se le dio al ozono fue como
desinfectante de agua destinada al consumo humano en Francia a inicios del siglo XX
(Bocci, 2011).
6
Tabla 1. Breve reseña de logros y certificaciones alcanzadas por el ozono.
Año Suceso
1839 Ozono descubierto por Schönbein
1886 Se reconoce la acción desinfectante del ozono sobre agua contaminada en Europa
1891 Pruebas positivas contra bacterias en Alemania
1895 Soret determina la fórmula molecular del ozono
1906 Francia inaugura la primera planta de tratamiento de agua a base de ozono
1909 El ozono es utilizado para preservar carne en Alemania
1939 El ozono previene el crecimiento de mohos y levaduras durante el almacenamiento de frutas
1970 El ozono es usado para el control de algas en Francia
1982 US FDA otorga el estatus de GRAS al ozono
1997 se declara al ozono como seguro para su contacto directo con alimentos
2001 FDA aprueba el uso de ozono en la cadena de procesamiento de alimentos, como agente antimicrobiano o aditivo
2004 La FDA proporciona una guía de recomendaciones para el uso de ozono con propósito de reducción de patógenos en jugo de manzana o cidra
Fuente (Donnell & Cullen, 2012)
Síntesis y Estructura Molecular del Ozono
El ozono es una molécula triatómica de oxígeno, cuya estructura molecular le
proporciona un alto poder oxidativo (Bocci, 2011; Sun et al., 2014) Durante la síntesis
de la molécula de ozono, la molécula de oxígeno se divide en dos átomos no
apareados de oxígeno (radicales libres), cada uno de los cuales ocupa una órbita 2p.
Este átomo de oxígeno que contiene un par no emparejado (radical libre) se combina
con una molécula de oxígeno para conformar la estructura del ozono (Donnell & Cullen,
2012).
7
Figura 1. . Reacción química a partir de la molécula de oxígeno para generar ozono. Fuente: (Manoj Kumar & Sabikhi, 2019)
Figura 2. Molécula de ozono. Fuente: (Donnell & Cullen, 2012)
8
Características físico-químicas del ozono
Tabla 2.Características físico-químicas del ozono
Características
Color o Azul (generado del aire) o Incoloro (generado de oxígeno puro) o Azul oscuro (fase líquida)
Olor Acre
Punto de fusión -192.5 ± 0.4°C
Punto de ebullición -119.9 ± 0.3°C
Temperatura crítica -12.1°C
Presión crítica 54.6 atm
Densidad 2.14 g/L a 0°C
Potencial óxido-reducción 2.07 V
Peso molecular g/mol 47.9982
Solubilidad en agua, ppm a 20°C 3
Calor de formación KJ/mol 144.7
Gravedad específica 1.658
Fuente: (Manoj Kumar & Sabikhi, 2019)
Un gran número de investigadores han llegado a comprobar, a través de la
experimentación, las propiedades y aplicaciones el ozono sobre todo tipo de alimentos
(desde frutas, vegetales, especies, carne cruda, mariscos, bebidas, etc.) (Brodowska
et al., 2018).
El uso de ozono es uno entre muchos procedimientos que contribuyen al mejoramiento
de la inocuidad y la calidad de los alimentos (Freitas-Silva & Souza, 2016).
El tratamiento de ozono u ozonoterapia sobre los alimentos es un método químico en
el cual muestras de alimentos contaminados son expuestas ante el ozono en su fase
acuosa o en su fase gaseosa (Brodowska et al., 2018).
Los efectos bactericidas del ozono han sido demostrados sobre una amplia variedad
de bacterias Gram negativas y Gram positivas, así como esporas bacterianas
(Pandiselvam et al., 2019).
La aplicación de ozono mejora la calidad microbiológica de los productos alimenticios
sin cambios sustanciales en sus propiedades nutricionales, químicas y físicas (Freitas-
Silva & Souza, 2016).
9
Principios del Tratamiento con Ozono
Existen diferentes formas por las que el ozono puede ser producido. Este compuesto
puede ser generado por la exposición de oxígeno a una fuente de energía como un
campo eléctrico de alta energía (método de la corona de descarga), radiación
ultravioleta (método fitoquímico) o la conversión de moléculas de oxígeno O2 a ozono
O3 (método químico) (Srinath.D et al., 2017). Otros métodos de generación de ozono
incluyen la electrolisis, la reacción elemental del fósforo con agua y la producción
radioquímica; pero estos últimos procedimientos se encuentran aún en fases de
desarrollo y su relación costo beneficio es negativa (Fukui et al., 2014)
Equipamiento para el tratamiento de ozono de los alimentos
Para la aplicación de ozono se puede utilizar en su fase gaseosa o en su fase acuosa.
En la práctica, los sistemas de ozonoterapia poseen algunos componentes básicos:
gas (oxígeno puro o aire), un generador de ozono, una fuente de energía eléctrica, un
reactor, una unidad de eliminación de gas y un analizador de ozono (Sharma, 2008).
Ozono en Estado Acuoso
Con el principal objetivo de purificar y desinfectar agua, se ha utilizado soluciones de
ozono a distintas concentraciones (Brodowska et al., 2018).
La degradación del ozono disuelto en agua es mucho más veloz que cuando se
encuentra disuelto en oxígeno o en el aire (Srinath D. et al., 2017).
Los principales factores que afectan la solubilidad del ozono con el agua son el pH, la
temperatura y la calidad del agua (pureza) (Brodowska et al., 2018).
Ozono en Estado Gaseoso
El ozono en estado gaseoso es relativamente más estable que en su estado acuoso.
Esta estabilidad puede verse afectada por factores como la concentración de ozono,
la temperatura, la presión, la presencia de contaminantes y catálisis (Brodowska et al.,
2018). Al contrario con su fase acuosa, el ozono gaseoso posee una vida media más
prolongada (Donnell & Cullen, 2012).
10
Está documentada la eficacia del ozono en su forma gaseosa como agente
antimicrobiano en el empaque y almacenamiento de alimentos (James et al, 2002). Su
acción ha sido comprobada contra Salmonella infatis y Pseudomona aeruginosa en
carcasas de pollo (Al-Haddad et al, 2005). Además, es eficaz contra residuos de
fungicidas en la producción de vino (Karaca et al, 2012) y su acción antimicrobiana en
frutas tales como melón (Marı, 2008), arándanos (Varese et al, 2015), higos secos
(Kırog, 2006) y uvas (Saavedra et al, 2016). La eficiencia antibacteriana del ozono en
solución acuosa fue investigada en productos como el pimiento rojo, berros y fresas
(Alexandre et al, 2011).
Ventajas y Desventajas de la Ozonoterapia
Ventajas
Está libre de residuos químicos. Al contrario de métodos como el uso de cloro, el
cual al reaccionar con material orgánico forma residuos potencialmente peligrosos
(trihalometanos) (Trindade et al., 2012)
Puede ser aplicado en todo tipo de alimentos (vegetales, carne, agua, bebidas,
etc.)
Es efectivo sobre alimentos frescos y conservados (congelados).
No altera el aspecto visual, las propiedades físicas (textura) y la calidad nutricional
de los alimentos.
Es una tecnología amigable con el medio ambiente y en constante mejoramiento.
(Brodowska et al., 2018)
Desventajas
Diversos niveles de sensibilidad de microorganismos ante el ozono.
La efectividad de la terapia depende de la dosis adecuada de ozono.
Al ser inestable en solución acuosa, su acción es inhibida por la presencia de
pesticidas o solventes clorados.
Aún no es económicamente viable.
La percepción del consumidor ante productos tratados con ozono.
11
(Brodowska et al., 2018)
Mecanismo de Acción Antimicrobiana del Ozono
El ozono posee un amplio espectro de actividades antimicrobianas, el cual es el
resultado del poder oxidante de los radicales libres, producto de su degradación. Estos
radicales son hidroxil, hidroperoxi y superóxido; sin embargo, se declara al ozono
molecular como el principal inactivador de microorganismos (Brodowska et al., 2018;
Donnell & Cullen, 2012).
La inactivación bacteriana durante el tratamiento con ozono es un proceso complejo
debido a que el ozono ataca a los constituyentes de la membrana celular (proteínas,
enzimas respiratorias y lípidos insaturados), la pared celular (peptidoglicanos), el
citoplasma (enzimas y ácidos nucleicos), esporas y cápsides víricas (Brodowska et al.,
2018; Manoj Kumar & Sabikhi, 2019).
La mayoría de investigadores han llegado a señalar que existen dos posibles
mecanismos de la acción antimicrobiana del ozono:
Oxidación de los grupos sulfhidrilo y aminoácidos (enzimas y proteínas) para
producir péptidos más pequeños, durante la exposición al ozono.
Oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados en ácidos peróxidos.
La acción sobre las células bacterias constituye un proceso secuencial donde el daño
superficial va seguido de la formación de poros en la pared celular, la membrana
celular expulsa material al exterior y permite el ingreso de agua, ocasionando un
agrandamiento, por lo que se produce una destrucción de los ácidos nucleicos y la
posterior muerte celular (Brodowska et al., 2018; Donnell & Cullen, 2012; Manoj Kumar
& Sabikhi, 2019).
Uso de petrifilm en el análisis microbiológico de alimentos
El aseguramiento de la calidad e inocuidad de los alimentos se ha constituido en un
desafío a nivel mundial, por tanto, el análisis frecuente de alimentos en laboratorios
analíticos juega un papel significante. Analizar los alimentos dentro de parámetros
microbiológicos es de vital importancia para determinar la calidad e higiene de los
productos (IOM & NCR, 2010).
12
Dentro del análisis microbiológico de los alimentos, las técnicas convencionales son
consideradas laboriosas (Spanu et al., 2014) y envuelven una serie de procedimientos
entre los cuales tenemos la rehidratación del medio de cultivo, la esterilización del
equipo, la preparación de la muestra, la inoculación en los medios de cultivo y la
incubación a una temperatura y tiempo determinados (Perkins, 2016).
Los petrifilms son productos que permiten la cuantificación de cepas bacterianas
viables. Los cuales están compuestos de películas recubiertas de nutrientes (medio de
cultivo), agentes gelidificantes solubles en agua fría y un indicador de tetrazolium para
su fácil interpretación (Fritz et al., 2015). La Association of Official Analytical Chemists
(AOAC International) validó el sistema petrifilm dentro de la implementación de
tecnologías alternativas para la cuantificación de bacterias. Además de recomendar su
utilización por fácil uso y su alta eficiencia (Nelson et al., 2013). El sistema petrifilm
suprime la necesidad de preparación de medios tradicionales, anteriormente usados
en técnicas de enumeración de microorganismos (Shen & Zhang, 2017).
La capacidad del sistema petrifilm fue comparada ante los medios tradicionales en un
estudio donde se buscaba aislar colonias de Escherichia coli, coliformes totales y
contaje de aerobios totales, en muestras de leche en polvo, carne de pollo y leche de
fórmula (Lakmini & Madhujith, 2012).
Dentro de la industria láctea, el método petrifilm ha demostrado su efectividad en
aislamiento de microorganismos coliformes en muestras de yogurt griego (Hervert el
al, 2016). De la misma manera, Souza demostró la efectividad del sistema petrifilm
frente a los métodos tradicionales, buscando aislar cepas de Staphylococcus aureus,
Escherichia coli y coliformes totales, en muestras de leche de oveja (Souza et al, 2015).
Viçosa et al (2010) lograron determinar la presencia de Staphylococcus aureus en la
leche cruda de bovinos, tras analizarla a través del sistema petrifilm.
En el año 2014, Bird demostró la capacidad de este sistema al lograr aislar e identificar
cepas de Salmonella spp. en muestras de carne cruda de res, carne cruda de pollo,
carne cruda de cerdo, huevos pasteurizados, nuggets de pollo, camarones, espinacas
13
y alimento balanceado de perro, las que fueron inoculadas experimentalmente con
esta cepa bacteriana (Bird et al., 2014).
En la Universidad de Minnesota, con el sistema petrifilm se logró determinar la
presencia de Staphylococcus aureus y Streptococcus spp., en muestras de leche
mastítica (McCarron et al., 2009)
Además, se demostró la efectividad de este sistema al detectar infecciones
intramamarias en vacas al final del periodo de lactancia (Cameron et al., 2013).
En el 2016, Hervert comparó distintos métodos para la detección de microrganismos
de importancia sanitaria (Escherichia coli y coliformes), dentro de la industria de
procesamiento de alimentos, dando como resultado una alta eficiencia por parte del
sistema petrifilm (Hervert et al., 2016).
También, se ha comprobado su capacidad de aislar cepas de Escherichia coli, tras el
análisis de carcasas de cerdo y cordero luego del faenamiento (Hauge et al., 2017),
así como se ha logrado su eficacia en el análisis de balanceado destinado a la crianza
de pollos broiler (Pinto, 2018).
14
CAPÍTULO IV
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales
De Campo
Tabla 3.Materiales biológicos utilizados en la fase de campo.
Materiales Biológicos
Leche cruda de vaca Agua
Tabla 4.Materiales químicos empleados en la fase de campo.
Materiales Químicos
Alcohol gel Oxígeno (gas)
Tabla 5.Materiales físicos utilizados en la fase de campo.
Materiales Físicos
Mandil Gel Refrigerante
Cubrebocas Recipientes contenedores
Cofias Mangueras
Guantes Frascos estériles para
recolectar muestras de
leche
Botas
Cooler
15
De Laboratorio
Tabla 6. Materiales químicos utilizados durante la fase de laboratorio del estudio.
Materiales Químicos
Placas 3M™ Petrifilm™ para control
de Listeria ambiental
3M™ Suplemento para Enriquecimiento
de Salmonella
Placas 3M™ Petrifilm™ para
Recuento de Aerobios
TSI® (Triple Sugar Iron Agar. BIORAD.
Lote: 1M112. (Francia)
Caldo Urea MERCK
Placas 3M™ Petrifilm™ para
recuento de E. coli y Coliformes
Reactivo de Kovacs
Buffered Peptone Water DIFCO
Placas 3M™ Petrifilm™ Salmonella
Express SALX
Lysine iron agar DIFCO
SIM (Sulfuro Indol Motilidad). DIFCO.
3M™ Base para Enriquecimiento de
Salmonella
Tabla 7.Materiales físicos utilizados durante la experimentación en el laboratorio.
Materiales Físicos
Guantes de Látex M Gradilla plástica
Dispersor 3M™ Petrifilm™ para placas Matraz Erlenmeyer 500 ml
Asa metálica Hisopos estériles
Fundas plásticas estériles Vaso de precipitación
16
Suministros de Oficina
Tabla 8.Implementos y suministros adicionales durante la ejecución del estudio.
Lista de Implementos
Computadora portátil
Cuaderno de 100 hojas empastado
Esferográfico
Internet
Marcador permanente punta fina Faber-Castell
Marcador permanente punta gruesa Faber-Castell
Etiquetas adhesivas
Equipos
Tabla 9.Lista de equipos empleados durante la realización del estudio.
Equipos e Instrumental
Generador de 6 gramos de Ozono (Ozonizador)
Destilador de agua, Modelo Elit-3 Marca Barnstead Water Still
Micropipeta Incubadora de convección forzada 42 °C
Autoclave, Modelo SIM-E. Serie 058592, Markel Forge
Incubadora 37 °C
Balanza electrónica, Boeco Germany BLC 500
Rerigeradora Durex RDE
Cámara de flujo laminar con filtros HEPA: Biological Hazard Biobase Midcis Precision Scientific CO PS. Modelo BSC-15011 A2-X Marca Biobase
Vortex marca Heidolph
17
Metodología
Lugar de Estudio
La fase de campo, donde se obtuvieron las muestras fueron de la hacienda “El
Carmen” ubicada en la provincia de Pichincha, Cantón Quito, Parroquia de Amaguaña,
sector Yanahuayco.
El presente ensayo se llevó a cabo en el Laboratorio de Bacteriología y Micología,
perteneciente a la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad
Central del Ecuador, ubicado en la ciudad de Quito en la calle Jerónimo Leyton s/n y
Gatto Sobral, ciudadela universitaria.
Tipo de Investigación
El estudio fue determinado con un diseño experimental, longitudinal de tipo
cuantitativo.
Ozono y Tratamientos
Para lograr determinar la concentración más efectiva de ozono, en miligramos (mg), y
el tiempo de exposición de las muestras de leche en minutos, se adaptaron los
procedimientos descritos en los estudios de Sung y Cavalcante (Sung et al, 2014)
(Cavalcante et al., 2013), tras lo cual se llegaron a determinar tres concentraciones
(50, 75 y 100 mg/l) durante tres periodos de tiempo (10, 20 y 30 minutos). Los
tratamientos realizados se detallan a continuación.
18
Tabla 10.Tipos de tratamientos según la dosis de ozono y el tiempo de exposición.
Tratamientos Concentración (mg/l) Tiempo (minutos)
T1 50 10
T2 50 20
T3 50 30
T4 75 10
T5 75 20
T6 75 30
T7 100 10
T8 100 20
T9 100 30
T0 Testigo o control (leche cruda)
El ozono fue producido a partir de oxígeno médico a través de un generador (Bioline®)
de 6 gramos. Durante la aplicación de ozono, cada una de las muestras de leche
sometidas a un tratamiento fueron colocadas en bolsas plásticas herméticas estériles
(una por tratamiento) y, a continuación, se realizó la aplicación de ozono de manera
directa en la muestra con agitación constante durante la dispersión del mismo en
función a la concentración y tiempo establecido para cada tratamiento. Concluida la
inoculación y dispersión del ozono, se transportaron las muestras en contenedores
herméticos a 4°C al Laboratorio de Bacteriología y Micología de la Facultad de
Medicina Veterinaria y Zootecnia.
19
Muestreo
Las muestras de leche cruda fueron obtenidas directamente del tanque de recolección
de la hacienda lechera seleccionada. Se recolectaron 10 litros de leche, durante tres
semanas; las muestras fueron tomadas de ordeños aleatorios e independientes.
Además, se recolectó muestras de leche hervida y leche UHT de marca comercial para
los análisis respectivos para comparar con los resultados obtenidos en los
especímenes de leche tratada con ozono.
Análisis Microbiológico
En el laboratorio de Bacteriología y Micología se realizó la cuantificación bacteriológica
de aerobios mesófilos totales, coliformes totales, Escherichia coli, Listeria
monocytogenes spp y Salmonella spp en cada una de las muestras tratadas con
ozono. A cada muestra se realizó diluciones 10-1 y 10-2 en agua peptonada tamponada
(Difco BD Sparks®) y se utilizó el sistema Petrifilm® de la casa 3M® para el cultivo,
aplicando protocolos para mesófilos totales (AOAC 990.12), coliformes totales y
Escherichia coli (AOAC 991.14), Listeria monocytogenes (AOAC-RI 030601) y para
Salmonella spp (AOAC 2014.01).
Análisis Estadístico
Los datos microbiológicos fueron analizados mediante la prueba de varianza de una
vía de Kruskal Wallis y la prueba de U de Mann Whitney, con un intervalo de confianza
del 95%. Además, se realizó un análisis de correlación de Spearman para comparar el
recuento microbiológico de las distintas muestras tratadas a dosis de ozono y tiempo
de tratamiento predeterminados. Para el análisis estadístico, se utilizó el software IBM
SPSS Statistics© versión 23.
20
CAPÍTULO V
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El recuento microbiano de las muestras control y especímenes tratados con ozono
consta en la tabla 11. El mayor recuento de unidades formadoras de colonias (UFC)
correspondió a las muestras control (T0, leche cruda). Los especímenes de leche
tratada con ozono presentaron carga microbiana, sin embargo, los recuentos en UFC
fueron gradualmente disminuyendo en función a la dosis de ozono y tiempo de
administración hasta alcanzar valores bajos a la dosis máxima de O3 (100 mg/l/30
minutos), la cual evidencia mejores resultados (Fig.3, Fig. 4, Fig.5).
Figura 3.Diferencias en la carga bacteriana de la leche tras la aplicación de ozonización.
1,37
1,69
2,52
2,70
2,95
3,04
3,07
3,15
3,16
3,90
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50
T9
T8
T7
T6
T5
T4
T3
T2
T1
Testigo
Carga Bacteriana en la leche (log10 UFC/ml)
Tra
tam
ien
tos
MESÓFILOS AEROBIOS TOTALES
21
Figura 4. Diferencias en la carga bacteriana de la leche, donde a la dosis más alta se llegó a un valor de 0 para coliformes totales.
Figura 5. Diferencias en la carga bacteriana de Escherichia coli donde a la dosis más alta se llegó a un valor de 0.
0,00
1,00
1,92
2,23
2,26
2,31
2,35
2,38
3,03
3,68
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00
T9
T8
T7
T6
T5
T4
T3
T2
T1
Testigo
Carga Bacteriana en la leche (log10 UFC/ml)
Tra
tam
ien
tos
COLIFORMES TOTALES
0,00
0,70
1,18
1,76
2,09
2,23
2,44
2,51
2,59
3,67
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00
T9
T8
T7
T6
T5
T4
T3
T2
T1
Testigo
Carga Bacteriana en la leche (log10 UFC/ml)
Tra
tam
ien
tos
Escherichia coli
22
En promedio, si se compara con las muestras control, la reducción decimal de
microorganismos posteriores al uso de ozono fue de 1,27, 1,73 y 1,89 Log10UFC/ml
para mesófilos aerobios totales, coliformes y Escherichia coli, respectivamente. El
análisis estadístico del recuento microbiano, para cada muestra tratada con ozono
relacionada a dosis y tiempo, evidenció diferencia estadística significativa (p≤ 0,05)
respecto a las muestras control. Resultados que se encuentran dentro de lo estipulado
en la normativa nacional NTE INEN 10 (INEN, 2012), para el tratamiento 9 (Tabla 12).
Se encontró similar recuento de microorganismos (mesófilos aerobios totales,
coliformes totales y Escherichia coli) en los tratamientos T2 (50 mgO3/20 minutos) y
T3 (50 mg O3/30 minutos); similar comportamiento fue observado en los tratamientos
T8 (100 mg O3/20 minutos) y T9 (100 mg O3/30 minutos), sin demostrar diferencias
estadísticamente significativas (p≥ 0,05).
No se reportaron recuentos de Listeria monocytogenes y Salmonella spp. en los
distintos tratamientos.
Tabla 11.Recuentos microbianos (Log10 UFC/ml) observados en leche cruda y leche tratada con ozono según dosis y tiempo de exposición.
Recuentos Microbianos
Tratamientos
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9
Mesófilos aerobios totales 3,90 3,16 3,15 3,07 3,04 2,95 2,70 2,52 1,69 1,37
Coliformes totales 3,68 3,03 2,38 2,35 2,31 2,26 2,23 1,92 1,00 0,00
Escherichia coli 3,67 2,59 2,51 2,44 2,23 2,09 1,76 1,18 0,70 0,00
Listeria monocytogenes A A A A A A A A A A
Salmonella spp. A A A A A A A A A A
A= ausencia. T0 = control T1 a T9 = tratamientos con ozono
Los tratamientos con similar color indican ausencia de diferencia significativa (p≥ 0,05) en los tres parámetros estudiados.
23
Tabla 12. Comparación de los resultados de T9 (Log10 UFC/ml) con los parámetros establecidos en la Norma NTE INEN 10 Leche pasteurizada. Requisitos
Recuentos Microbianos T9 Requisitos NTE INEN 10
Mesófilos aerobios totales 1,37 4,48
Coliformes totales 0 0
Escherichia coli 0 0
Listeria monocytogenes A 0
Salmonella spp. A 0
A= ausencia. T9= Tratamiento 9 (100 mg O3/30 minutos)
El recuento microbiano en leche sometida a los diferentes esquemas de tratamiento
con ozono comparado con leche hervida y UHT, mostró una reducción considerable;
se observó disminución del recuento de mesófilos aerobios totales, coliformes y
Escherichia coli, mientras que la leche hervida exhibió recuentos más altos a
comparación con T9 (leche ozonizada) y leche UHT (tabla 13).
Tabla 13.Recuentos microbianos (Log10 UFC/ml) observados en leche cruda y leche tratada con ozono (T9), leche hervida y leche UHT
Tipo de leche
Recuento Microbianos Leche cruda
Leche hervida
Leche UHT
T9
Mesófilos aerobios totales 3,90 3,71 2,50 1,37
Coliformes totales 3,68 2,77 0,00 0,00
Escherichia coli 3,67 1,44 0,00 0,00
Listeria monocytogenes A A A A
Salmonella spp. A A A A
A= ausencia.
24
Figura 6. Comparación de resultados de los tres distintos tratamientos en estudio.
Estadísticamente se realizó una comparación entre el tratamiento 9 (T9) con los
resultados de la leche hervida y con los resultados de la leche UHT, respectivamente,
a través de la prueba de U de Mann-Whitney, donde se aprecia que no existe una
diferencia significativa entre T9 y leche UHT para los valores de coliformes totales y
Escherichia coli (tabla 14).
Tabla 14.Valores de “p” para cada recuento, tras la comparación de T9 con la leche hervida, T9 con la leche UHT y T9 con el testigo (leche cruda).
Comparación entre tipos de leche
Recuentos Microbianos
Leche hervida - T9 Leche UHT - T9 Leche cruda - T9
Mesófilos aerobios totales
0,00* 0,035* 0,05*
Coliformes totales 0,00* 1 0,03*
Escherichia coli 0,00* 1 0,04*
Listeria monocytogenes
A A A
Salmonella spp. A A A
A= ausencia. * Valores que difieren estadísticamente (p≤ 0,05)
3,9 3,71
2,5
1,37
3,68
2,77
0 0
3,67
1,44
0 00
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
LecheCruda
LecheHervida
LecheUHT
T9
Ca
rga
Ba
cte
ria
na
lo
g1
0 U
FC
/ml
Mesófilos aerobios totales Coliformes totales Escherichia coli
25
Correlación estadística entre concentración (tiempo-dosis) y reducción del
recuento microbiano
Existió alta correlación entre concentración de O3 y reducción del recuento de
mesófilos aerobios totales, coliformes y Escherichia coli. El tiempo de exposición al O3
en relación al recuento bacteriano presentó moderada correlación. En este sentido, se
observó que a medida que se aumentó la concentración de ozono disminuyó la carga
bacteriana en la leche tratada. No se consideraron valores de referencia para Listeria
monocytogenes y Salmonella spp., por no encontrarse en la muestra testigo (cruda) y
en los distintos tratamientos con ozono, leche hervida o UHT.
Discusión
El principal hallazgo del estudio fue el efecto del ozono en la reducción de la carga
bacteriana de las muestras tratadas de leche respecto a las muestras control donde
los recuentos microbiológicos son mayores. Se advierte que fueron detectadas
bacterias en las muestras tratadas con ozono, reduciéndose gradualmente su recuento
en función a la dosis y tiempo de ozono empleado en cada uno de los tratamientos, al
punto que en la muestra T9 el conteo de mesófilos aerobios totales fue 1,37 Log10
UFC/ml), coliformes totales (0 Log10 UFC/ml) y Escherichia coli (0 Log10 UFC/ml),
parámetros aceptados en la normativa ecuatoriana NTE INEN 10 “Leche Pasteurizada.
Requisitos” (INEN, 2012) y europea (European Commission, 2005). Los resultados
concuerdan con otros estudios realizados en alimentos tratados con ozono para
disminuir la carga microbiana y aumentar la vida útil de los productos, por lo que se
colige que se detectarán mayores recuentos microbianos en productos no tratados con
ozono (Al-Haddad et al., 2005; Alexandre et al., 2011).
El recuento de mesófilos aerobios totales presentó valores más altos en leche cruda
(3,9 Log 10 UFC/ml), observándose en las muestras tratadas disminución de la carga
microbiana a medida que se incrementó la concentración y tiempo de aplicación de
ozono (tabla 9). Los resultados concuerdan con el estudio de Cavalcante y
colaboradores (2013) que reportan un efecto similar del ozono para reducir la carga de
mesófilos aerobios totales (1,5 mg O3 por litro durante 15 minutos). El conteo final de
26
coliformes totales en leche cruda fue 3,68 Log10 UFC/ml, siendo este el valor de
recuento más alto; a medida que se trató con ozono las distintas muestras, la carga
bacteriana se redujo hasta 0 Log10 UFC/ml en la muestra T9. La información disponible
no reporta el efecto del tratamiento de la leche cruda con ozono sobre
microorganismos coliformes; un estudio sobre el efecto del ozono en alimentos frescos
(papaya) se traduce en recuentos bajos a una dosis de ozono de 9,2±2 µl/L (Yeoh et
al, 2014).
El contaje total de Escherichia coli en leche cruda fue 3,67 Log10 UFC/ml; en las
muestras tratadas se demostró una disminución gradual en el recuento bacteriano a
medida que se incrementó la dosis de ozono, registrándose un recuento de 0 Log10
UFC/ml en T9, resultado que coincide con el reporte de Sung y colaboradores (2014),
quienes destacan el efecto del ozono en forma gaseosa a dosis de 2-3 gramos
O3/m3/minuto y calor, aplicados a jugo de manzana pasteurizada a la que previamente
se inoculó experimentalmente Escherichia coli.
En leche hervida, se logró las cargas bacterianas iniciales de mesófilos aerobios
totales (3,71 Log10 UFC/ml), coliformes totales (2,77 Log10 UFC/ml) y Escherichia coli
(1,44 Log10 UFC/ml), resultados que concuerdan con el reporte de Agarwal et al.
(2012), donde se señala la reducción del recuento de mesófilos aerobios totales (de
valor inicial a valor final) y coliformes (valor inicial y final).
Difieren los valores iniciales y finales del recuento de Escherichia coli, donde reportan
0 Log10 UFC/ml, atribuyéndose a que el estudio de Agarwal controló las variables
tiempo y temperatura de ebullición de la leche. Con esta aclaración, se destaca la
diferencia estadística significativa (p≤ 0,05) en la reducción del recuento bacteriano al
comparar leche hervida y leche tratada con ozono.
En la leche UHT se demostró la presencia de mesófilos aerobios totales (2,50 Log10
UFC/ml), resultado similar al hallado en Turquía, donde fueron evaluadas muestras de
leche UHT obtenidas de supermercados locales (Tekinsen et al, 2007).
Debido a limitaciones de equipamiento, no se probaron dosis más bajas de ozono.
Además, el estudio no midió la concentración de ozono residual luego de tratar las
27
distintas muestras de leche, por lo que, a mediano plazo, deberá complementarse
nuevos estudios para determinar valores residuales y dosis menores a 50 mg/litro en
10 minutos de exposición. Además, resta estimar el impacto del ozono sobre el medio
ambiente y sobre el personal que labora para el sistema de manejo de la producción
lechera del país.
La presente investigación permitió demostrar la disminución de la carga bacteriana de
la leche cruda a través de la ozonización, proceso que se equipararía a otros
tradicionalmente utilizados. Serían necesarios estudios posteriores para conocer la
factibilidad económica al reemplazar una planta pasteurizadora tradicional por una que
utilice ozono en el proceso.
28
ANÁLISIS DE COSTOS PARCIALES
El análisis económico se detalla a continuación:
Tabla 15. Análisis de costos parciales del tratamiento testigo.
Tratamiento Testigo
Costo del Producto por
litro
Litro
Costo Unitario
Leche Cruda
0,50 $
1
0,50 $
Tabla 16.Análisis de costos parciales por tratamientos experimentales.
Tratamientos Concentración
de Ozono Tiempo de Exposición
Costo del Tratamiento/ 1 L
Costo Unitario
O3 +Leche
Diferencia
T1 50 mg/l 10 minutos
0,10 $ 0,60 $ +0,10 $
T2 50 mg/l 20 minutos
0,15 $ 0,65 $ +0,15 $
T3 50 mg/l 30 minutos
0,20 $ 0,70 $ +0,20 $
T4 75 mg/l 10 minutos
0,25 $ 0,75 $ +0,25 $
T5 75mg/l 20 minutos
0,30 $ 0,80 $ +0,30 $
T6 75mg/l 30 minutos
0,35 $ 0,85 $ +0,35 $
T7 100 mg/l 10 minutos
0,40 $ 0,90 $ +0,40 $
T8 100 mg/l 20 minutos
0,45 $ 0,95 $ +0,45 $
T9 100mg/l 30 minutos
0,50 $ 1,00 $ +0,50 $
29
Tabla 17.Análisis de costos parciales de la leche pasteurizada UHT.
Tabla 18.Análisis de costos parciales de la leche hervida
Tabla 19. Comparación de costos entre el testigo, la leche hervida, la leche pasteurizada UHT y el tratamiento de ozono (T9).
Tratamientos
Costo
Unitario
Costo Tratamiento
Testigo
Diferencia
T9 1,00 $ 0,50 $ +0,50 $
Leche UHT 0,85 $ 0,50 $ +0,35 $
Leche Hervida 0,60 $ 0,50 $ +0,10 $
De acuerdo con lo expuesto, el análisis de todos los tratamientos con ozono resulta en
un costo más elevado con respecto al tratamiento testigo, con una diferencia
económica que oscila desde 0,60 $ hasta 1,00 $.
Cabe señalar que el tratamiento testigo solo correspondía a la leche cruda sin ninguna
intervención o acción adicional, lo que explica el margen de diferencia económica entre
tratamientos.
Tal como se detalla en la tabla 19, se eligió al tratamiento 9 (T9) para su comparación
con los costos de los tratamientos testigo, leche UHT y leche hervida, esto debido a la
efectividad reportada tras el análisis microbiológico.
Leche UHT
Costo del Producto por
litro
Litros utilizados
Costo Unitario
Marca Comercial
0,85 $
1
0,85 $
Leche Hervida
Costo del Producto por
litro
Costo del Tratamiento Proceso
Costo Unitario
Leche cruda +
Ebullición
0,50 $
0,10 $
0,60 $
30
El alto costo de ozonización se debe a que se utilizó apenas 1 litro de leche cruda para
el proceso, debiendo disminuir conforme se incrementa la cantidad a ser procesada.
31
CAPÍTULO VI
CONCLUSIONES
Se lograron obtener resultados de la cuantificación de bacterias de las muestras de
leche cruda (testigo), así como de las muestras de leche correspondientes a los
distintos tratamientos de ozono.
Con una concentración de 100 mg O3/l se logró que la leche tratada con ozono
alcance los parámetros establecidos por la normativa ecuatoriana NTE INEN 10
“Leche Pasteurizada. Requisitos” (INEN, 2012) y europea (European Commission,
2005).
Del mismo modo, con un periodo de acción de 30 minutos del ozono sobre la carga
bacteriana de la leche se cumplieron estos estándares de calidad, que califican al
producto apto para el consumo humano (NTE INEN 10 “Leche Pasteurizada.
Requisitos”, 2012; European Commission, 2005 )
El Tratamiento 9 (100 mg O3/l durante 30 minutos), fue el más efectivo al permitir
una reducción del 64,87% (2,53 Log10 UFC/ml) del conteo inicial de mesófilos
aerobios totales, una reducción del 100% (3,68 Log 10 UFC/ml) para coliformes
totales y una reducción del 100% (3,67 Log10 UFC/ml) para Escherichia coli.
32
CAPÍTULO VII
BIBLIOGRAFÍA
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42
ANEXOS
1. Resultados de la cuantificación de Mesófilos Aerobios Totales.
Tratamientos con Ozono Leche Hervida
Leche UHT Testigo T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9
UFC/ml 7966,67 1439,33 1400 1172,67 1100,0 898 501 328 48,67 23,33 5099,7 313,3
Notación Científica
8 x103 1,4 x10
3 1,4 x10
3 1,2 x10
3 1,1 x10
3 9 x10
2 5 x10
2 3,3 x10
2 5 x10 2 x10 5,10X10
3 3,1310
2
Log10
UFC/ml 3,90 3,16 3,15 3,07 3,04 2,95 2,70 2,52 1,69 1,37 3,71 2,50
2. Resultados de la cuantificación de Coliformes Totales. Tratamientos con Ozono Leche Hervi
da Leche U
HT Testigo
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9
UFC/ml 4787,33
1074,67 238,33
223,67 204 183,33
171,67 82,33 10 0 583,7 0
Notación Científica
4,8x103 1,1 x10
3 2,4 x
102
2,2x
102
2x102 1,8x
102
1,7x
102
8 x 10
1 x 10 0 5,8X102 0
Log10
UFC/ml 3,68 3,03 2,38 2,35 2,31 2,26 2,23 1,92 1,00 0 2,77 0
3. Resultados de la cuantificación de Escherichia coli. Tratamientos con Ozono Leche
Hervida
Leche UHT Testig
o T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9
UFC/ml 4666,33
388 324,33 273,33 170 123 57,33 15 5 0 27,3 0
Notación Científica
4,7x103 3,9x10
2 3,2x10
2 2,7x10
2 1,7x10
2 1,2x10
2 6 x 10 1,5 x 1
0 5 0 2,7X10 0
log10UFC/ml 3,67 2,59 2,51 2,44 2,23 2,09 1,76 1,18 0,70 0 1,44 0
43
4. ANOVA de una vía de Kruskal Wallis por Tratamientos.
5. ANOVA de una vía de Kruskal Wallis en base a la concentración de ozono.
Prueba Aerobios Totales E. coli Coliformes totales
Chi-cuadrado 26,741 27 23,765
gl 3 3 3
Sig. asintótica 0 0 0
6. ANOVA de una vía de Kruskal Wallis en base al tiempo de exposición al ozono.
Prueba Aerobios Totales E. coli Coliformes totales
Chi-cuadrado 9,166 9 8,441
gl 3 3 3
Sig. asintótica 0,027 0,03 0,038
7. Prueba de U de Mann-Whitney analizando los tratamientos por parejas.
Tratamientos
Aerobios Totales
Escherichia coli
Coliformes totales
Sig. Asintótica
Existencia de Dif. Sig.
Sig. Asintótica
Existencia de Dif. Sig.
Sig. Asintótica
Existencia de Dif. Sig.
1 – 2 0,046 Si 0,046 Si 0,05 Si
1 – 3 0,507 No 0,376 No 0,05 Si
1 – 4 0,037 Si 0,046 Si 0,05 Si
1 – 5 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si
1 – 6 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si
1 – 7 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si
1 – 8 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si
1 – 9 0,05 Si 0,046 Si 0,037 Si
1 – 10 0,05 Si 0,046 Si 0,05 Si
2 – 3 0,197 No 0,178 No 0,261 No
2 – 4 0,034 Si 0,043 Si 0,05 Si
2 – 5 0,046 Si 0,046 Si 0,184 No
2 – 6 0,046 Si 0,046 Si 0,376 No
Prueba Aerobios Totales E. coli Coliformes totales
Chi-cuadrado 28,474 28.152 27,75
gl 9 9 9
Sig. asintótica 0,001 0,001 0,001
44
2 – 7 0,046 Si 0,046 Si 0,05 Si
2 – 8 0,046 Si 0,046 Si 0,05 Si
2 – 9 0,046 Si 0,043 Si 0,037 Si
2 – 10 0,046 Si 0,043 Si 0,05 Si
3 – 4 0,034 Si 0,046 Si 0,05 Si
3 – 5 0,046 Si 0,05 Si 0,658 No
3 – 6 0,046 Si 0,05 Si 0,077 No
3 – 7 0,046 Si 0,05 Si 0,05 Si
3 – 8 0,046 Si 0,05 Si 0,05 Si
3 – 9 0,046 Si 0,046 Si 0,037 Si
3 – 10 0,046 Si 0,046 Si 0,05 Si
4 – 5 0,037 Si 0,105 No 0,05 Si
4 – 6 0,037 Si 0,046 Si 0,513 No
4 – 7 0,037 Si 0,046 Si 0,05 Si
4 – 8 0,037 Si 0,046 Si 0,05 Si
4 – 9 0,037 Si 0,043 Si 0,037 Si
4 – 10 0,037 Si 0,043 Si 0,05 Si
5 – 6 0,05 Si 0,127 No 0,05 Si
5 – 7 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si
5 – 8 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si
5 – 9 0,05 Si 0,046 Si 0,037 Si
5 – 10 0,05 Si 0,046 Si 0,05 Si
6 – 7 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si
6 – 8 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si
6 – 9 0,05 Si 0,046 Si 0,037 Si
6 – 10 0,05 Si 0,046 Si 0,05 Si
7 – 8 0,05 Si 0,077 No 0,05 Si
7 – 9 0,05 Si 0,072 No 0,037 Si
7 – 10 0,05 Si 0,046 Si 0,05 Si
8 – 9 0,077 No 0,121 No 0,121 No
8 – 10 0,05 Si 0,046 Si 0,05 Si
9 – 10 0,05 Si 0,043 Si 0,037 Si
45
8. Prueba de Correlación relacionando a la concentración de ozono, tiempo de expos
ición y UFC (crecimiento bacteriano).
Rho de Spearman
Aerobios Totales Escherichia coli Coliformes Totales
Ozono Tiempo Ozono Tiempo Ozono Tiempo
Coeficiente 0,96 0,452 0,961 0,44 0,894 0,399
Sig. 0 0,012 0 0,0115 0 0,03
Correlación Si Si Si Si Si Si
Grado de
Correlación
Muy buena Correlación
Moderada
Correlación
Muy buena Correlación
Moderada
Correlación
Muy buena Correlación
Baja
Correlación
9. ANOVA comparando al tratamiento 9, la leche hervida y la leche UHT.
Tratamientos
Aerobios Totales Escherichia coli Coliformes totales
Sig. Asintóti
ca
Diferencia Significativa
Sig. Asintótica
Diferencia Significativa
Sig. Asintótica
Diferencia Significativa
T9 – Hervida
0 Si 0 Si 0 Si
T9 – UHT
0,035 Si 1 No 1 No
Hervida – UHT
0 Si 0 Si 0 Si
46
10. Registro de Toma de Muestras.
11. Registro de Resultados.
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
REGISTRO DE TOMA DE MUESTRAS
Muestra N° :
Fecha:
Lugar:
Tipo de Muestra:
Cantidad:
Observaciones:
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
REGISTRO DE RESULTADOS
Muestra N° : Fecha:
Código:
Repetición:
Microorganismo Resultado
Total 10
-1 10
-2
Aerobios Totales
Escherichia coli
Coliformes Totales
Salmonella spp.
Listeria spp.
47
12. Procesamiento de Muestras.
48
13. Resultados en las placas petrifilm.