TRABAJO PRCTICO N 1 CICLO LECTIVO 2015PRINCIPIOS DE COLORIMETRAToda medicin fotocolorimtrica consiste en la determinacin de laconcentracin de una sustancia por la cantidad de color que poseenaturalmente o que puede producir luego de una reaccin cromtica,convenientemente elegida.Este procedimientoestbasadoenelhechoquetoda sustancia coloreada absorbe luz de una determinada longitud de onda ().uandountomo, ionomolculaabsorbeunfotn, laenerg!aagregadaproduce una alteracin del estado, " se dice que las especies estn e#citadas. $a e#citacin puede involucrar alguno de los siguientes procesos%&. transicin de un electrn a un nivel ma"or de energ!a.'. cambio en el modo de vibracin de las molculas con enlaces covalentes.(. alteracin de su modo de rotacin alrededor de los enlaces covalentes.$aabsorcindelaenerg!aradianteporunasolucinpuededescribirsepormedio de una grfica de absorbancia en funcin de la longitud de onda. Estagrfica se denomina espectro de absorcin.)or e*emplo para el caso de la o#ihemoglobina%El espectro de absorcin frecuentemente se utiliza para propsitos deidentificacin cualitativa.Espectroscopa de absorcinonsidreseunhazdeenerg!aradianteconunaintensidadinicial, +o, queincidesobre una celda cuadrada " pasa a travs de ella (cu"os lados sonperpendiculares al haz). $a celda contiene una solucin de un compuesto queabsorbe energ!a radiante de una cierta longitud de onda (). $a intensidad de laenerg!a radiante transmitida, +s, ser menor que +o. )arte de la energ!a radianteser refle*ada por la superficie de la celda o absorbida por la pared de la celdaoel solvente. )orlotantoestosfactoresdebensereliminadossi sedeseaconsiderar slo la absorcin del compuesto de inters. Esto se hace usando unblanco que contiene todo menos el compuesto a ser determinado.$a transmtan!a de un compuesto en solucin se define como la proporcinde luz incidente que es transmitida%Transmtan!a " T " Is #I$,sualmente esta razn se describe como un porcenta*e (-T).El concepto de transmitancia es importante porque slo puede medirse la luztransmitida.uando la concentracin de un compuesto en solucin aumenta, ms luz esabsorbida por la solucin " menos es transmitida. El porcenta*e de T var!ainversamente " logar!tmicamente con la concentracin..in embargo, es ms conveniente usar laa%s$r%an!a, /, la cual esdirectamente proporcional a la concentracin. )or lo tanto%A " &$' Is#I$ " &$' T " &$' (1#T)0rficamente, si segrafica/o-Tenfuncindelaconcentracindelasolucinconel compuestoqueabsorbeenerg!a, seobtienenlossiguientesgrficos%Ley de Lambert-Beer$a le" de $ambert12eer o com3nmente conocida como ley de Beer, establecidaen &45' por 2eer, quien postul que 6la reduccin de la energ!a radiante de unhaz de radiacin monocromtica es proporcional a la intensidad del haz " a lacantidad de sustancia absorbente situada en su tra"ectoria7. 8sea queestablece que la concentracin de una sustancia es directamente proporcionalalacantidaddeenerg!aradianteabsorbidaoinversamenteproporcional allogaritmo de la energ!a radiante transmitida. .i la concentracin de unasolucin es constante " la longitud del paso de luz que atraviesa una solucinse duplica, el efecto sobre la absorbancia es igual duplicar la concentracin, "aquehabrdosvecesmsmolculasabsorbentespresentesenel pasodeenerg!a radiante. 9e este modo la absorbancia tambin es directamenteproporcional a la longitud de la tra"ectoria que atraviesa la energ!a radiante atravs delacelda. $arelacinmatemticaentrelaabsorcindeenerg!aradiante, la concentracin de la solucin, " la longitud del paso ptico sedemuestra por la le" de 2eer%A " a*%*!donde A es la absorbancia o densidad ptica: a, absortividad; b, paso de luz dela solucin en cent!metros: " c, concentracin de la sustancia de inters.Esta ecuacin forma las bases del anlisis cuantitativo por fotometr!a deabsorcin o espectroscop!a de absorcin. $os valores de absorbancia no tienenunidades.$aabsortividades una constante de proporcionalidad relacionada con lanaturaleza qu!mica del soluto " tiene unidades que son rec!procas con las deb" c.uandocsee#presaenmolespor litro"bencent!metros, el s!mboloe,llamado absortividad molar(o coeficiente de e#tincin molar), se usa en lugarde a " es una constante para un compuesto dado a una determinada longitudde onda, ba*o condiciones espec!ficas de solvente, p;, temperatura, etc. Tieneunidadesde$R?ICO; CALC:LE EL @M A VMAB DE :NA EN8IMA; MANEJE :NIDADES DE CONCENTRACICN (DE S:STRATO A DEPROD:CTO) AVELOCIDAD DE REACCICN.; INTERPRETE LOS RES:LTADOSINTROD:CCICNEn eltraba*o prctico se determinarn los parmetros cinticos de la enzimaureasa. Esta enzima interviene en el metabolismo de la urea enmicroorganismos, invertebrados " plantas. C8 se encuentra en ninguna clulahumana.$a ureasa se utiliza en los laboratorios de anlisis cl!nicos como herramientapara determinarla concentracin deurea en muestras de sangre (uremia)"orina.$aconcentracindeureacirculanteestdeterminadapor laproduccindeurea a nivel heptico " por la eliminacin de este metabolito a nivel renal. .i lafuncin heptica no est alterada, la uremia es uno de los parmetros utilizadospara evaluar la funcin renal, entre otros 1 creatininemia, clearance decreatinina, etc.PROCEDIMIENTOST$-$s &$s +2,/$s traba*arn para analizar [)roducto] vs. Tiempo.ada lado de mesada traba*ar con una [.ustrato] " calcular una velocidadinicial (Do) que informar al resto de la comisin.T$-$s &$s a&,mn$sharn el grfico de Dovs.[.ustrato] " &, '> " (> =+C,T8.=esada &% urea F solucin stocG en frasco rotulado% 0.2 mM=esada '% urea F solucin stocG en frasco rotulado% 0.E mM=esada (% urea F solucin stocG en frasco rotulado% 0.5 mM=esada ?% urea F solucin stocG en frasco rotulado% 0.F mM=esada 5% urea F solucin stocG en frasco rotulado% 0.G mM=esada @% urea F solucin stocG en frasco rotulado% 1.0 mM=esada A% urea F solucin stocG en frasco rotulado% 1.2 mM=esada 4% urea F solucin stocG en frasco rotulado% 1.5 mMa) argar urea >,5 ml < tubo de la concentracin que corresponda en todos lostubos.b) /gregar & ml de reactivo & al tubo 5 F tiempo de incubacin (> minutos a (AH. /notar tiempo.c))asados&>minutosdel anterior,agregar&ml dereactivo&al tubo?Ftiempo de incubacin '> minutos a (A H. /notar tiempo.d))asados&>minutosdel anterior,agregar&ml dereactivo&al tubo(Ftiempo de incubacin &> minutos a (A H. /notar tiempo.e) )asados 5 minutos del anterior, agregar & ml de reactivo & al tubo ' F tiempode incubacin 5 minutos a (A H. /notar tiempo.f) )asados 5 minutos del anterior, agregar & ml de reactivo & al tubo & F tiempode incubacin > minutos.g) +nmediatamente, agregar & ml de reactivo ' a todos los tubos, empezandopor el tubo & " siguiendo hasta el 5. /notar tiempo.h) +ncubar &> minutos a temperatura ambiente para el desarrollo de color.i) $eer absorbancia de todos los tubos en elfotmetrocon el filtro de 5(> nmcontra tubo & F tiempo > minutos.*) alcular la cantidad de producto (en m=) en cada tubo, utilizando el factor deconversin IF'.&'G) 0raficar[producto] enfuncindel tiempodeincubacin. /tencinenlasunidades.l) alcular la velocidad inicial (Do). /tencin en las unidades.m) /rmar la tabla de velocidad inicial (Do) con cada una de las concentracionesdesustrato, conlosdatosobtenidospor cadaladodemesadascentrales./tencin en las unidades.n) 0raficar velocidad inicial en funcin de [sustrato]. /tencin en las unidades.o) 0raficar dobles rec!procas. /tencin en las unidades.p) alcular Jm " Dm#. /tencin en las unidades.PROTOCOLOT,28CK,EE/(ml)REACTIVO1 (ml)Tiempo+ncubacin(=in)REACTIVO2 (ml)9esarrollode color(=in)5 >,5 & E0 & &>H >,5 & 20 & &>E >,5 & 10 & &>2 >,5 & 5 & &>1 >,5 & 0 & &>IN?ORME>R:PO DE TRABAJO (/C8TE N DE >R:PO L $8. /)E$$+98. L C8=2EE. 9E $8.)/ET++)/CTE. 9E$ EC./L8);;;;RES:LTADOS PROPIOSI >R?ICO [/r$-,!t$] " 6 (t)CONCENTRACICN DE S:STRATO :TILI8ADO[S:STRATO] "(COMPLETAR)T,28 C K Tiempo de +ncubacin(=in)/bsorbancia5(> nm1 02 5E 10H 205 E0alcular la cantidad de producto en cada tubo, utilizando el coeficiente de e#tincin que le proveern los docentes. ompletar la siguiente tabla (indicar las unidades)./bsorbancia5(> nmE*e L(C;()(m=)E*e MTiempo de +ncubacin(minutos)051020E0Eealice ,d. el grfico [/r$-,!t$]+n 6,n!1n -+t+m/$ en papel milimetrado" ad*3ntelo.1 .eg3n el grfico que realiz, calcule la velocidad inicial (Do) de la reaccin en las condiciones de traba*o.COMPLETAR (n-!ar &as ,n-a-+s)[:REA] "V$ "RES:LTADOS DE LA COMISICNI>R?ICOS V$ +n 6,n!1n -+ ([s,strat$]) A 1 # V$ +n 6,n!1n -+(1# [s,strat$])ompletar la siguiente tabla (indicar las unidades).E*e L E*e MV$ [:REA]E*e L E*e M1#V$ 1/[:REA]1 Eealice ,d. el grfico V$ +n 6,n!1n -+ ([s,strat$]) en papel milimetrado " ad*3ntelo.1 Eealice ,d. el grfico 1 # V$ +n 6,n!1n -+ (1 # [s,strat$]) en papel milimetrado " ad*3ntelo.1 alcular Jm " Dm (indicar las unidades)COMPLETAR (indicar las unidades)@m "Vm0J "