et discipline ou spécialité
Jury :
le
Université Toulouse 3 Paul Sabatier (UT3 Paul Sabatier)
Si vous êtes en cotutelle internationale, remplissez ce champs en notant : Cotutelle internationale avec"nom de l'établissement", sinon effacer ce texte pour qu'il n'apparaisse pas à l'impression
Cécile Gstalder
mercredi 08 juillet 2015
Rôle de la voie sphingosine kinase 1/sphingosine 1-phosphatedans l'adaptation à l'hypoxie intratumorale
des adénocarcinomes rénaux à cellules claires
ED BSB : Biotechnologies, Cancérologie
IPBS, CNRS UMR 5089
Pr Alain RAVAUD - RapporteurDr Fabrice SONCIN - Rapporteur
Dr François VALLETTE - Rapporteur
Dr Olivier CUVILLIER - Directeur de ThèseDr Isabelle ADER - Directrice de Thèse
Dr Olivier CUVILLIERDr Isabelle ADER
1!
2!
3!
Table des matières
TABLE DES MATIERES 3
RESUME DES TRAVAUX DE THESE 8
ABSTRACT 9
ABREVIATIONS 10
INTRODUCTION GENERALE 13
CHAPITRE 1: LES ADENOCARCINOMES RENAUX A CELLULES CLAIRES 15
1. Epidémiologie, pronostic et classification des adénocarcinomes rénaux 15
1.1. Epidémiologie, facteurs de risque et diagnostic des adénocarcinomes rénaux 15
1.2. Stade anatomique et pronostic 16
1.3. Classification des adénocarcinomes rénaux 18
1.3.1. Les adénocarcinomes rénaux à cellules claires 18
1.3.2. Les adénocarcinomes rénaux papillaires ou tubulo-papillaires 19
1.3.3. Les adénocarcinomes rénaux à cellules chromophobes 19
1.3.4. Tumeurs rénales rares 20
2. Caractéristiques des adénocarcinomes rénaux à cellules claires 20
2.1. Anomalies génétiques 20
2.1.1. Inactivation du gène suppresseur de tumeur VHL 20
2.1.2. Autres anomalies génétiques 22
2.2. Hypervascularisation 23
2.2.1. L’angiogenèse physiologique 23
2.2.2. L’angiogenèse tumorale 26
3. Prise en charge thérapeutique des adénocarcinomes rénaux à cellules claires 27
3.1. Approche chirurgicale 28
3.1.1. Néphrectomie partielle ou radicale 28
3.1.2. Traitement local ablatif 28
3.1.3. Prise en charge chirurgicale des ccRCC métastatiques 28
3.2. Traitement par chimiothérapie ou radiothérapie 29
3.3. Immunothérapies 29
3.4. Thérapies ciblées 30
3.4.1. Le bevacizumab 30
3.4.2. Les inhibiteurs de récepteurs tyrosine-kinase (TKI) 31
3.4.3. Les inhibiteurs de mTOR 32
4. Stratégies thérapeutiques émergentes 33
4!
4.1. Inhibition des mécanismes de résistance aux anti-angiogéniques 33
4.1.1. Inhibition de l’axe angiopoïétines/Tie-2 34
4.1.2. Inhibition de l’axe HGF/c-Met 34
4.1.3. Inhibition du récepteur ALK-1 35
4.1.4. Inhibition de l’IL-8 35
4.1.5. Inhibition de HDM2 35
4.1.6. Ciblage de l’imitation vasculaire 36
4.2. Identification de nouvelles cibles thérapeutiques 36
4.2.1. HIF-2α 36
4.2.2. La voie SphK1/S1P 37
4.2.3. La voie NF2/Hippo/Yap 37
4.3. Autres stratégies 37
4.3.1. Développement de nouvelles immunothérapies 37
4.3.2. Utilisation néoadjuvante des thérapies ciblées 38
CHAPITRE 2: L’HYPOXIE INTRATUMORALE ET LES FACTEURS HIF 39
1. Homéostasie de l’oxygène et stress hypoxique. 39
2. Les facteurs HIF, acteurs de l’adaptation au stress hypoxique. 40
2.1. HIF-1α 42
2.2. HIF-2α 42
2.3. HIF-3α 43
2.4. HIF-β 43
3. Mécanismes de régulation des facteurs HIF 44
3.1. Mécanismes de régulation dépendants de l’oxygène 44
3.1.1. Régulation de la stabilité des sous-unités HIF-α 44
3.1.2. Régulation de l’activité transcriptionnelle de HIF 46
3.2. Mécanismes de régulation indépendants de l’oxygène 46
3.2.1. Régulation par les protéines HSP90 et RACK1 46
3.2.2. Régulation par modifications post-traductionnelles 47
3.2.3. Régulation par les hormones et les facteurs de croissance 47
3.2.4. Différences de régulation entre HIF-1α et HIF-2α 48
4. Rôle des facteurs HIF en physiologie et physiopathologie 52
4.1. Les facteurs HIF dans le développement et l’embryogenèse 54
4.2. Les facteurs HIF dans le métabolisme glucidique et lipidique 54
4.2.1. Le métabolisme glucidique 54
4.2.2. Le métabolisme lipidique 56
4.3. Les facteurs HIF dans le système cardiovasculaire 57
4.4. Les facteurs HIF dans les cancers 58
5!
4.4.1. Le maintien d’un phénotype dédifférencié 60
4.4.2. La survie et la prolifération cellulaire 61
4.4.3. La reprogrammation métabolique 62
4.4.4. L’induction d’un microenvironnement immunosuppressif 63
4.4.5. L’angiogenèse tumorale 63
4.4.6. L’invasion et la dissémination métastatique 64
5. L’hypoxie et les facteurs HIF comme cibles thérapeutiques en cancérologie 65
5.1. Ciblage de l’hypoxie intratumorale : les prodrogues cytotoxiques 65
5.2. Normalisation du réseau vasculaire tumoral 66
5.2.1. Concept de normalisation vasculaire 66
5.2.2. Données précliniques et cliniques 67
5.3. Stratégies ciblant les facteurs HIF 69
5.3.1. Molécules déjà sur le marché 69
5.3.2. Molécules faisant l’objet d’études cliniques ou précliniques récentes 70
5.4. Discussion 73
CHAPITRE 3: LA VOIE SPHINGOSINE KINASE / SPHINGOSINE 1-PHOSPHATE 74
1. Le métabolisme sphingolipidique 74
1.1. Bases structurales des sphingolipides 74
1.2. Le métabolisme sphingolipidique 74
1.3. Les sphingolipides : lipides bioactifs 77
1.4. Le biostat sphingolipidique 77
2. La voie SphKs/S1P 78
2.1. Les sphingosine kinases 78
2.1.1. Propriétés structurales 79
2.1.2. Propriétés biochimiques 81
2.1.3. Propriétés biologiques 82
2.1.4. Régulation et localisation des SphKs 82
2.2. La S1P, facteur autocrine et paracrine, et ses S1P-récepteurs 84
2.2.1. Le S1P1 85
2.2.2. Le S1P2 86
2.2.3. Le S1P3 87
2.2.4. Le S1P4 87
2.2.5. Le S1P5 88
2.3. La S1P et ses cibles intracellulaires 88
2.3.1. La S1P, inhibiteur des HDAC1/2 89
2.3.2. La S1P, cofacteur de TRAF2 89
2.3.3. La S1P et la prohibitine 2 89
2.3.4. La S1P et la BACE1 90
6!
3. Physiopathologie de la voie SphK1/S1P 90
3.1. La voie SphK1/S1P dans le système immunitaire 90
3.1.1. La sclérose en plaque et le développement du FTY720 92
3.1.2. La polyarthrite rhumatoïde 95
3.1.3. L’asthme 95
3.1.4. Les maladies inflammatoires de l’intestin 95
3.2. La voie SphK1/S1P dans le système cardiovasculaire et le métabolisme 96
3.2.1. La vasculogenèse et l’angiogenèse 96
3.2.2. L’intégrité vasculaire 97
3.2.3. L’infarctus du myocarde 97
3.2.4. L’athérosclérose 97
3.2.5. Le diabète et l’obésité 98
3.3. La voie SphK1/S1P dans les cancers 98
3.3.1. Le biostat sphingolipidique dans la survie et la prolifération tumorale 99
3.3.2. La voie SphK1/S1P dans l’initiation et la progression tumorale 99
3.3.3. La voie SphK1/S1P dans l’angiogenèse et la dissémination métastatique 101
3.3.4. La voie SphK1/S1P dans la résistance thérapeutique 102
3.3.5. Stratégies thérapeutiques ciblant la voie SphK1/S1P 103
PROBLEMATIQUE 107
MATERIELS ET METHODES 113
1. Lignées cellulaires et conditions de culture 115
2. Modèles animaux et conditions expérimentales 115
3. Anticorps 116
4. Réactifs 117
5. Transfection d’ARN interférent 117
6. Western blot 117
7. Test ELISA 118
8. Dosage de l’activité enzymatique de la sphingosine kinase 1 119
9. Test de prolifération cellulaire 121
10. Extraction d’ARN et RT-PCR quantitative 121
11. Coloration à l‘hémalun-éosine 122
12. Immunohistochimie et immunofluorescence 122
12.1. Immunohistochimie 123
12.2. Immunofluorescence 123
13. Analyse de l’hypoxie intratumorale 123
14. Analyse et quantification des immunomarquages 124
7!
15. Numération formule sanguine 124
16. Analyse statistique 124
RESULTATS EXPERIMENTAUX 125
1. La voie SphK1/S1P, un nouveau régulateur clé de HIF-2α dans les ccRCC 127
1.1. Introduction 127
1.2. Article soumis pour publication 129
1.3. Discussion 157
2. Implication des récepteurs à S1P dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α 159
2.1. Rôle des S1P1-3-4-5 dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α 159
2.2. Le S1P1 contrôle l’expression de HIF-1α et HIF-2α 161
2.3. Rôle du S1P1 dans la régulation de l’expression des gènes cibles de HIF (Résultats préliminaires) 166
3. Etude de l’inhibition de la voie SphK1/S1P sur l’adaptation à l’hypoxie intratumorale et sur la
sensibilisation à la chimiothérapie dans un modèle murin de ccRCC 168
3.1. Le FTY720 diminue transitoirement l’expression intratumorale de HIF-1α et HIF-2α ainsi que la
sécrétion tumorale de VEGF 169
3.2. Le FTY720 entraine un remodelage transitoire du réseau vasculaire tumoral associé à une
oxygénation tumorale 172
3.3. Le FTY720 diminue la prolifération et la survie cellulaire tumorale 176
3.4. Le FTY720 chimiosensibilise un modèle murin de ccRCC 179
DISCUSSION 183
1. La SphK1, régulateur clé de l’adaptation cellulaire à l’hypoxie 185
2. Rôle de la S1P et du S1P1 dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α 187
3. Rôle des autres S1PRs dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α 188
4. Le FTY720, inducteur d’une normalisation vasculaire transitoire 188
5. Le FTY720 permet de chimiosensibiliser un modèle murin de ccRCC 190
6. Evaluation de l’effet du FTY720 dans d’autres modèles de ccRCC 192
7. Conclusion générale 192
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 195
TRAVAIL COLLABORATIF 247
8!
Résumé des travaux de thèse
Les adénocarcinomes rénaux à cellules claires (ccRCC), qui représentent 70% des tumeurs
rénales, sont fortement mais irrégulièrement vascularisés, ce qui les rend hypoxiques et donc
résistants aux chimiothérapies. L’hypoxie favorise l’agressivité tumorale via l’activation des
facteurs de transcription HIF-1α et HIF-2α (Hypoxia-Inducible Factors). Pour cette raison, le
ciblage de l’hypoxie intratumorale et des facteurs HIF dans les ccRCC constitue une stratégie
thérapeutique pertinente. !
Dans ce projet, nous montrons pour la première fois que la voie sphingosine kinase
1/sphingosine 1-phosphate (SphK1/S1P) régule HIF-2α in vitro et in vivo. Nos résultats indiquent
que la SphK1 régule le taux intracellulaire et l’activité transcriptionnelle de HIF-2α dans des
lignées de ccRCC représentatives de certains sous-groupes retrouvés en clinique humaine ; et
impliquent la!S1P extracellulaire, via le récepteur S1P1, dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α.
D’autre part, nous avons évalué l’impact de l’inhibition des récepteurs à S1P et de la SphK1 par le
FTY720 dans un modèle de ccRCC in vivo. Nos résultats indiquent que le FTY720 entraine une
diminution transitoire du taux intratumoral de HIF-1α et HIF-2α ainsi qu’un remodelage du
réseau vasculaire tumoral. En effet, le FTY720 induit une normalisation vasculaire qui aboutit à
une oxygénation tumorale transitoire. Enfin, nous montrons que ce traitement permet de
sensibiliser un modèle murin de ccRCC à la chimiothérapie.
Ces résultats valident le rôle de la voie SphK1/S1P comme régulateur de l'adaptation à l'hypoxie
dans les ccRCC. Ils constituent une étape indispensable à la transposition en clinique humaine du
concept selon lequel la voie SphK1/S1P peut être ciblée afin de diminuer l’hypoxie intratumorale
et de chimiosensibiliser certains cancers, le FTY720 étant déjà sur le marché.
9!
Abstract
Clear cell renal cell carcinomas (ccRCC) represent 70% of renal tumors. Because of their dense
and irregular vascular network, ccRCC become hypoxic and therefore resistant to
chemotherapies. Hypoxia promotes tumor aggressiveness via the activation of!HIF-1α!and HIF-2α!(Hypoxia-Inducible Factors). For this reason, the control of intratumoral hypoxia and HIF in
ccRCC could be a relevant therapeutic strategy to improve the efficacy of current treatments.
In this study, we show for the first time that the sphingosine kinase 1/sphingosine 1-phosphate
(SphK1/S1P) pathway regulates HIF-2α in vitro and in vivo. Our results indicate that SphK1
regulates HIF-2α intracellular level and transcriptional activity in ccRCC cell lines that are
representative of some clinical ccRCC subgroups. Our data also involve extracellular S1P, via its
receptor S1P1, in the regulation of HIF-1α!and HIF-2α.!In addition, in a ccRCC mouse model, we
show that FTY720 – an inhibitor of the SphK1/S1P pathway– transiently decreases HIF-1α and
HIF-2α intratumoral level. This is associated with a transient remodeling of the tumor vascular
network indicating that FTY720 induces a vascular normalization that leads to transient tumor
oxygenation. Finally, we show that this treatment sensitizes a ccRCC mouse model to
chemotherapy.
Overall, these results validate the key role of the SphK1/S1P pathway in the adaptation to
hypoxia in ccRCC cell and animal models. Our results provide a mechanistic basis to target the
SphK1/S1P pathway with FTY720 by increasing the efficacy of chemotherapy in ccRCC. They are
a prerequisite for clinical transposition as FTY720 is a drug approved used in human clinic.
10!
Abréviations
αSMA α Smooth Muscle Actin
ABC ATP Binding Cassette
ADN Acide Désoxyribonucléique
ADP Adénosine Diphosphate
AMPc Adénosine Monophosphate cyclique
ARNm Acide Ribonucléique messager
ATP Adénosine Triphosphate
Bcl-2 B cell lymphoma 2
BH3 Bcl-2 Homology Domain 3
bHLH basic Helix Loop Helix
CBP CREB Binding Protein
CerS Ceramide Synthase
ccRCC clear cell Renal Cell Carcinoma
CD Cluster of Differentiation
C-TAD C-terminal Transactivation Domain
DLL4 Delta-Like Ligand 4
DHS Dihydrosphingosine
DMS Dimethylsphingosine
DMSO Dimethylsulfoxide
EDG Endothelial Differentiation Gene
EGF Epidermal Growth Factor
EGFR Epidermal Growth Factor Receptor
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
EMA European Medicines Agency
eiF eukaryotic initiation Factor
EPAS1 Endothelial PAS domain-containing protein 1
EPO Erythropoïétine
FDA Food and Drug Administration
FGF Fibroblast Growth Factor
FLT3 Fms-Like Tyrosine kinase 3
GLUT Glucose Transporter
GSK3β Glycogen Synthase Kinase 3β
11!
HDAC Histone Deacetylase
HER2 Human Epidermal Growth Factor Receptor 2
HIF Hypoxia-Inducible Factor
HRE Hypoxia Response Element
HRP Horseradish Peroxydase
IL Interleukine
LDL Low Density Lipoprotein
LPS Lipopolysaccharide
MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase
MDR1 Multi-Drug Resistance 1
miR micro Ribonucleic Acid
MMP Matrix Metalloproteinase
mTOR mammalian Target Of Rapamycin
NES Nuclear Export Signal
NLS Nuclear Localization Signal
N-TAD N-terminal Transactivation Domain
ODDD Oxygen-Dependent Degradation Domain
PAI1 Plasminogen Activator Inhibitor 1
PAS Per-ARNT-Sim
PDGF Platelet-Derived Growth Factor
PDGFR Platelet-Derived Growth Factor Receptor
PHD Prolyl Hydroxylase Domain containing protein
PI3K Phosphatidylinositol 3-Kinase
PKC Protein Kinase C
PLC Phospholipase C
PLD Phospholipase D
PP2A Protein Phosphatase 2A
PTEN Phosphatase and Tensin homolog
pVHL protein Von Hippel-Lindau
RCC Renal Cell Carcinoma
RCPG Récepteur Couplé aux Protéines G
ROS Reactive Oxygen Species
S1P Sphingosine 1-Phosphate
S1PR S1P Récepteur
shRNA small hairpin Ribonucleic Acid
12!
siRNA small interfering Ribonucleic Acid
SKi Sphingosine Kinase inhibitor
SphK Sphingosine Kinase
SPL S1P Lyase
Spns2 Spinster homolog 2
SPPase S1P Phosphatase
SPT Serine Palmitoyl Transferase
STAT3 Signal Transducer and Activator of Transcription 3
TGFβ Transforming Growth Factor β
TNFα Tumor Necrosis Factor α
TRAF2 TNF Receptor-Associated Factor 2
TSC Tuberous Sclerosis Complex
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
VEGFR Vascular Endothelial Growth Factor Receptor
VHL Von Hippel-Lindau
13!
Introduction Générale
14!
15!
Chapitre 1 :
Les adénocarcinomes rénaux à cellules claires
1. Epidémiologie, pronostic et classification des adénocarcinomes rénaux
1.1. Epidémiologie, facteurs de risque et diagnostic des adénocarcinomes rénaux
Les adénocarcinomes rénaux, ou RCC (Renal Cell Carcinoma), représentent 95% des cancers du
rein et se développent généralement à partir des tubules rénaux (Figure 1). Les RCC représentent
3% de l’ensemble des cancers et se placent à la neuvième position en terme de fréquence, avec
près de 340.000 nouveaux cas diagnostiqués en 2012 de part le monde, soit une incidence de
5,8/100.000 qui augmente de 2% par an depuis vingt ans (Bhatt and Finelli 2014, DeSantis et al.
2014, Jonasch et al. 2014). Il s’agit du cancer urologique le plus mortel, avant les cancers de la
vessie et de la prostate (Bhatt and Finelli 2014). En 2012, 11.573 nouveaux cas ont été détectés en
France. L’âge moyen de diagnostic des RCC est de 64 ans, et plus de 80% des patients ont 50 ans
ou plus au moment du diagnostic. Alors que la survie globale à 5 ans est de 72%, 20 à 30% des
patients atteints de RCC sont diagnostiqués au stade métastatique, ce qui réduit
considérablement leur espérance de vie (Bhatt and Finelli 2014, DeSantis et al. 2014). Les RCC sont
deux fois plus fréquents chez l’homme que chez la femme, et leur incidence est la plus élevée
dans les régions développées et industrialisées, telles que les pays d’Amérique du Nord et
d’Europe (DeSantis et al. 2014, Jonasch et al. 2014).
Différents facteurs de risque ont été impliqués dans le développement des RCC, tels que la
maladie de von Hippel-Lindau ; mais aussi le tabagisme, l’hypertension artérielle, l’obésité, ou
encore l’exposition au pétrole et à ses dérivés, à l’amiante et à certains métaux lourds (Bhatt and
Finelli 2014, Jonasch et al. 2014). L’augmentation de l’incidence des RCC est sans doute liée à ces
facteurs de risque, ainsi qu’à l’augmentation de l’utilisation des méthodes de diagnostic.
Très souvent, les RCC sont diagnostiqués de manière fortuite lors d’une imagerie abdominale
puisque les premiers symptômes apparaissent tardivement lors du développement de la maladie.
Parmi ces signes cliniques, les plus fréquents sont une hématurie, une douleur lombaire, la
16!
présence d’une masse abdominale, ou encore de la fièvre (Patard et al. 2003). L’examen
indispensable au diagnostic des RCC est le scanner abdominal ou l’IRM (Imagerie par
Résonnance Magnétique) qui permettent de déterminer s’il est nécessaire d’effectuer une biopsie
ou une néphrectomie. Le diagnostic final sera ensuite basé sur l’examen histologique de ces
dernières (Bhatt and Finelli 2014).
Figure 1. Anatomie du rein et du néphron. La principale fonction du rein est d’assurer l’équilibre hydroélectrolytique de l’organisme, en régulant la pression artérielle et en filtrant le plasma pour former l’urine. Le néphron est l’unité structurelle et fonctionnelle du rein. La filtration du plasma a lieu au niveau du glomérule, ce qui aboutit à la formation de l’urine primitive dont la composition sera modifiée suite à son passage dans le néphron, jusqu’au tube collecteur.
1.2. Stade anatomique et pronostic
La détermination du pronostic des RCC est importante à la fois pour le choix de la stratégie
thérapeutique et pour la prise en charge psychologique du patient. Le pronostic est évalué à
l’aide du système TNM (Tumor Node Metastasis) qui tient compte de la taille de la tumeur
primaire et de son degré d’invasion locale (T), de l’invasion des ganglions lymphatiques
régionaux (N) et de la présence de métastases à distance (M) (Tableau 1). La quantification de ces
trois critères détermine le stade anatomique du cancer qui pourra alors être associé à un pronostic
de survie (Figure 2).
17!
Tableau 1. Classification TNM des adénocarcinomes rénaux. D’après Jonasch et al, 2014.
Tumeur primaire (T) TX Estimation impossible T0 Absence de tumeur T1 Tumeur de moins de 7 cm et limitée au rein T1a Tumeur de moins de 4 cm et limitée au rein T1b Tumeur de 4 à 7 cm et limitée au rein T2 Tumeur de plus de 7 cm et limitée au rein T2a Tumeur de 7 à 10 cm et limitée au rein T2b Tumeur de plus de 10 cm et limitée au rein T3 Tumeur étendue aux veines ou aux tissus péri-néphrétiques
Absence d’envahissement de la glande surrénale et au-delà du fascia de Gerota T3a Tumeur étendue à la veine rénale, à ses branches, ou au sinus rénal T3b Tumeur étendue à la veine cave sous-diaphragmatique T3c Tumeur étendue à la veine cave sus-diaphragmatique T4 Tumeur étendue à la glande surrénale ou au-delà du fascia de Gerota Ganglions lymphatiques régionaux (N)
NX Estimation impossible N0 Absence de métastase ganglionnaire N1 Métastase(s) au niveau d’un ou plusieurs ganglion(s) Métastases à distance (M) M0 Absence de métastase(s) à distance M1 Métastase(s) à distance
Figure 2. Stades anatomiques des adénocarcinomes rénaux et pronostic de survie à 5 ans. T : tumeur primaire; N : ganglion lymphatique régional ; M : métastase à distance. Adapté de Cohen & McGovern, 2005.
18!
Ainsi, les patients atteints d’un RCC de stade I ont un pronostic de survie à 5 ans de 80 à 95% et
ceux atteints d’un RCC de stade II ont un pronostic de survie à 5 ans de 80% (Elmore et al. 2003).
Chez l’ensemble de ces patients, l’invasion de la tumeur jusqu’au bassinet, l’uretère, la vessie ou
l’urètre fait chuter la survie à 5 ans à 43% (Verhoest et al. 2009). Les patients atteints d’un RCC de
stade III ont quant à eux un pronostic de survie à 5 ans de 60%. Enfin, les patients atteints d’un
RCC de stade IV ont un pronostic de survie à 5 ans inférieur à 10%, avec une survie globale
médiane qui est passée de 15 mois à plus de deux ans avec le développement des thérapies
ciblées (Motzer et al. 1996, Motzer et al. 1999, Jonasch et al. 2014). Le pronostic des RCC est
également évalué par le grade de Fuhrman, qui varie entre 1 et 4 et qui tient compte des
caractéristiques histologiques de la tumeur, notamment de la taille et de la forme des noyaux des
cellules tumorales. Enfin, le pronostic de survie des patients atteints d’un RCC métastatique peut
être évalué à l’aide de l’algorithme MSKCC (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) qui tient
compte des cinq caractéristiques défavorables suivantes :
- un indice de Karnofsky inférieur ou égal à 20% (sujet malade et perte totale d’autonomie) ;
- une hypercalcémie ;
- une anémie ;
- un taux de lactate déshydrogénase une fois et demi supérieur à la normale
- une période de moins d’un an entre le diagnostic du RCC et l’administration du premier
traitement systémique.
Ainsi, les patients ne présentant aucune de ces caractéristiques ont une survie médiane de 30
mois, alors que ceux qui en présentent trois ou plus ont une survie médiane de 4,8 mois (Motzer
et al. 1999, Heng et al. 2009, Jonasch et al. 2014).
1.3. Classification des adénocarcinomes rénaux
Parmi les tumeurs rénales malignes de l’adulte, on trouve principalement les adénocarcinomes à
cellules claires (≈70% des cas), les adénocarcinomes papillaires ou tubulo-papillaires (≈15% des
cas) et les adénocarcinomes à cellules chromophobes (≈10% des cas).
1.3.1. Les adénocarcinomes rénaux à cellules claires
Ces cancers représentent 70% de l’ensemble des cancers du rein, et se développent à partir du
tubule proximal. Leur caractérisation histologique met en évidence des cellules tumorales
grandes et claires, dont le cytoplasme est chargé de glycogène et de lipides. Ces cellules seraient
19!
regroupées en amas et entourées par un réseau vasculaire très dense. Les adénocarcinomes
rénaux à cellules claires (ccRCC) sont majoritairement caractérisés par l’inactivation du gène
suppresseur de tumeur VHL (Von Hippel-Lindau), causant la perte de la protéine pVHL (protein
Von Hippel-Lindau), et ont un mauvais pronostic (Bhatt and Finelli 2014, Jonasch et al. 2014). La
partie 2 de ce chapitre est dédié aux ccRCC.
1.3.2. Les adénocarcinomes rénaux papillaires ou tubulo-papillaires
Les adénocarcinomes rénaux papillaires ou tubulo-papillaires (pRCC) se développent à partir du
tubule proximal et se classent en deuxième position des tumeurs rénales les plus fréquentes. Il
existe deux sous-types de pRCC, les pRCC de type 1 dont les cellules sont basophiles, et les pRCC
de type 2 dont les cellules sont éosinophiles (Klatte et al. 2009, Bhatt and Finelli 2014). Des
mutations germinales ou somatiques au niveau du domaine tyrosine kinase de l’oncogène c-Met
prédisposeraient au développement d’un pRCC de type 1, dont le pronostic est plutôt bon
(Schmidt et al. 1997). D’autre part, des mutations du gène codant pour la fumarate hydratase sont
à l’origine d’une maladie génétique nommée « léiomyomatose familiale et cancer du rein » ou
HLRCC (Hereditary Leiomyomatosis and Renal Cell Cancer). Les patients atteints de cette pathologie
présentent un risque de développer un pRCC de type 2, dont le pronostic est mauvais (Toro et al.
2003).
1.3.3. Les adénocarcinomes rénaux à cellules chromophobes
Les adénocarcinomes rénaux à cellules chromophobes (chRCC) se développent entre le tubule
contourné distal et le tube collecteur. Ils se caractérisent par des cellules au cytoplasme
transparent et à l’index mitotique faible (Yamazaki et al. 2003). La plupart des cellules des chRCC
présentent des anomalies chromosomiques, ou des pertes chromosomes entiers, dont les
conséquences restent incertaines (Speicher et al. 1994). D’autre part, des mutations au niveau des
gènes codant pour PTEN (Phosphatase and Tensin homolog) et p53 auraient été identifiées dans les
chRCC. Enfin, le syndrome de Birt-Hogg-Dubé, causé par des mutations germinales au niveau du
gène codant pour la folliculine, prédispose à l’apparition d’un chRCC (Schmidt et al. 2005). Ces
tumeurs sont généralement celles qui présentent le moins de risque de développer des
métastases, et ont un bon pronostic (Bhatt and Finelli 2014, Jonasch et al. 2014).
20!
1.3.4. Tumeurs rénales rares
Parmi les tumeurs rénales rares, on trouve les adénocarcinomes des tubes collecteurs, les
adénocarcinomes médullaires et les adénocarcinomes de la sphère urothéliale (calice, bassinet,
uretère, vessie, urètre). Chacun de ces types tumoraux représente moins de 5% des cancers du
rein. Il s’agit de tumeurs qui ressemblent peu aux autres RCC et dont la prise en charge n’est pas
standardisée. Alors que la physiopathologie de ces tumeurs est globalement peu connue, il a
néanmoins été montré que les adénocarcinomes médullaires se développent principalement chez
des patients atteints d’une hémoglobinopathie et qu’ils seraient caractérisés par l’inactivation du
gène suppresseur de tumeur SMARCB1 (SWI/SNF-related Matrix-associated Actin-dependent
Regulator of Chromatin subfamily B member 1) (Liu et al. 2013, Jonasch et al. 2014).
2. Caractéristiques des adénocarcinomes rénaux à cellules claires
2.1. Anomalies génétiques
2.1.1. Inactivation du gène suppresseur de tumeur VHL
L’inactivation somatique biallélique du gène VHL se produit dans la plupart des ccRCC
sporadiques où l’incidence d’une mutation de ce gène peut atteindre 91% selon les études
(Gossage et al. 2015). Ce gène peut également être délété ou méthylé dans les ccRCC (Young et al.
2009). Le gène suppresseur de tumeur VHL a été identifié en 1993 lorsqu’il a été retrouvé muté
chez des familles atteintes de la maladie de von Hippel-Lindau (Latif et al. 1993). Il s’agit d’une
maladie héréditaire rare, autosomale dominante et néoplasique qui se caractérise par l’apparition
de différents types de tumeurs, tels que des hémangioblastomes de la rétine ou du système
nerveux central, des phéochromocytomes, des ccRCC ou des adénocarcinomes pancréatiques,
pouvant être associés à des kystes rénaux ou pancréatiques (v. Hippel 1904, Lindau 1927) (Maher
et al. 2011). La maladie de von Hippel-Lindau est diagnostiquée chez les patients sans antécédents
familiaux qui présentent deux tumeurs parmi celles mentionnées ci-dessus, et chez les patients
avec antécédents familiaux qui présentent une tumeur parmi celles mentionnées ci-dessus
(Gossage et al. 2015). Dans cette pathologie, un allèle du gène VHL est hérité avec une mutation,
et le développement de kystes ou de tumeurs résulte de l’inactivation ou de la perte de l’allèle
21!
wild-type. Le rôle suppresseur de tumeur de VHL a été mis en évidence lorsque des études ont
montré que l’inactivation de ses deux allèles est un événement crucial dans le développement des
tumeurs associées à la maladie de von Hippel-Lindau, mais aussi des ccRCC sporadiques non
héréditaires (Zbar et al. 1987, Tory et al. 1989, Crossey et al. 1994) (Figure 3). Dans le même sens,
une étude a montré que la réintroduction de la protéine pVHL dans la lignée 786-O, une lignée
cellulaire de ccRCC VHL-/-, inhibe la capacité de ces cellules à former des tumeurs chez des souris
nude (Iliopoulos et al. 1995). A ce jour, peu d’études ont évalué le rôle de VHL en tant que
marqueur pronostic des ccRCC et aucun lien n’a été établi entre la présence ou l’absence de
mutation de VHL et l’issue des ccRCC sporadiques (Gossage et al. 2015).
Figure 3. Etapes du développement des ccRCC. Le développement des ccRCC héréditaires liés à la maladie de von Hippel-Lindau (A) est plus rapide et nécessite moins d’étapes que celui des ccRCC sporadiques (B), en raison d’une mutation prédisposant à la maladie. Ainsi, les ccRCC liés à la maladie de Von Hippel-Lindau apparaissent plus tôt et sont souvent multifocaux. Adapté de Cohen & McGovern, 2005.
Dans les années 1990, des études ont montré que les tumeurs associées à l’inactivation de VHL,
dont les ccRCC, étaient hypervascularisées en raison de leur surproduction de VEGF (Vascular
Endothelial Growth Factor), principal facteur pro-angiogénique (Wizigmann-Voos et al. 1995,
Gnarra et al. 1996). Une autre étude a montré que les cellules 786-O (VHL-/-) expriment l’ARNm
du VEGF, de GLUT1 (Glucose Transporter 1) et du PDGFβ (Platelet-Derived Growth Factor β)
quelque soit la concentration en oxygène, alors qu’ils ne sont exprimés qu’à de faibles
concentrations en oxygène (hypoxie) dans les lignées VHL+/+ (Iliopoulos et al. 1996). Cette étude a
22!
ainsi montré qu’en présence d’oxygène, pVHL régule négativement l’expression de protéines
induites en hypoxie, et qu’en absence de pVHL, ces protéines sont surexprimées même en
présence d’oxygène afin de créer un microenvironnement favorable à la croissance tumorale. Par
la suite, une étude a montré que pVHL régule HIF-1α (Hypoxia-Inducible Factor 1α), un facteur de
transcription régulant l’expression de nombreux gènes, tels que le VEGF, GLUT1 et le PDGFβ
(Maxwell et al. 1999). HIF-1α et HIF-2α étant les principaux facteurs d’adaptation à l’hypoxie, ils
sont activés en hypoxie et dégradés par le protéasome en présence d’oxygène suite à leur
interaction avec pVHL (Maxwell et al. 1999, Cockman et al. 2000). Alors que la régulation de HIF-
1α et HIF-2α est la clé du rôle suppresseur de tumeur de pVHL, plusieurs études ont suggéré que
c’est HIF-2α, et non HIF-1α, qui jouerait un rôle crucial dans la progression des ccRCC (Keith et
al. 2012). En effet, une étude effectuée dans un modèle murin établi par xénogreffe hétérotopique
de cellules de ccRCC a montré qu’un variant de HIF-2α ne pouvant pas interagir avec pVHL
empêche ce dernier d’exercer son rôle suppresseur de tumeur, et qu’à l’inverse, l’inhibition de
l’expression de HIF-2α est suffisante pour empêcher la formation de tumeur par des cellules 786-
O (VHL-/-) (Kondo et al. 2003). A l’inverse, des études effectuées dans des modèles murins établis
par xénogreffe de cellules de ccRCC montrent que HIF-1α ne semble pas être indispensable à la
progression tumorale des ccRCC où il fonctionnerait même comme un suppresseur de tumeur
(Raval et al. 2005, Shen et al. 2011). Cependant, à ce jour, seule l’activation constitutive de HIF-1α,
et non de HIF-2α, dans les cellules du tubule proximal de souris – lieu de l’initiation
physiologique des ccRCC – à été décrite comme favorisant le développement d’un ccRCC (Fu et
al. 2011, Fu et al. 2013).
2.1.2. Autres anomalies génétiques
Contrairement à la plupart des autres tumeurs épithéliales, les ccRCC ne présentent que rarement
des mutations au niveau des gènes codant pour p53, B-Raf, pRB (Retinoblastoma-associated protein),
EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) ou HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)
(Gossage et al. 2015). Alors qu’une étude a montré que la seule inactivation de VHL dans le tubule
proximal n’est pas suffisante au développement d’un ccRCC (Rankin et al. 2006) (Figure 3), des
études récentes ont impliqué de nouveaux gènes dans la progression de ces tumeurs. Ainsi, les
gènes BAP1 (BRCA1-associated protein 1), SETD2 (SET domain-containing 2) et PBRM1 (protein
Polybromo 1) sont retrouvés mutés dans respectivement 8 à 11%, 3 à 12% et 41% des ccRCC (Duns
et al. 2010, Varela et al. 2011, Pena-Llopis et al. 2012, Cancer Genome Atlas Research 2013).
D’autres mutations au niveau des gènes KDM5C (lysine-specific demethylase 5C) et KDM6A (lysine-
23!
specific demethylase 6A) ont également été retrouvées respectivement dans 4 à 9% et 1 à 7% des
ccRCC. Ces cinq gènes sont impliqués dans la régulation de l’activation de la chromatine
(Gossage et al. 2015). Dans environ 20% des ccRCC, des mutations ont été décrites au niveau de
gènes codant pour des protéines de la voie mTOR (mammalian Target Of Rapamycin), tels que
MTOR, TSC1 (Tuberous Sclerosis 1), PIK3CA (PI3K catalytic subunit α) et PTEN (Brugarolas 2014).
Alors que des mutations au niveau du gène VHL sont considérées comme étant ubiquitaires dans
les ccRCC, celles au niveau des autres gènes ne sont pas partagées par toutes les tumeurs. De
plus, au sein d’une même tumeur, il existe une hétérogénéité des mutations qui suggère que des
clones tumoraux présentant différentes mutations pourraient répondre différemment aux
thérapies anti-tumorales (Gerlinger et al. 2012).
2.2. Hypervascularisation
L’inactivation de VHL dans les ccRCC et la surproduction de VEGF qui en résulte rendent ces
tumeurs hypervascularisées et favorisent ainsi la progression tumorale (Takahashi et al. 1994).
2.2.1. L’angiogenèse physiologique
Chez l’embryon, la formation de vaisseaux sanguins résulte de la différenciation d’angioblastes,
précurseurs endothéliaux, en cellules endothéliales qui vont s’assembler pour former un réseau
vasculaire, c’est la vasculogenèse (Swift and Weinstein 2009). L’angiogenèse correspond quant à
elle à la formation de nouveaux vaisseaux à partir de ce réseau vasculaire dans le but de
l’expandre. Les vaisseaux ainsi formés seront ensuite remodelés en artères, veines ou capillaires
(Potente et al. 2011). Chez l’adulte, les cellules endothéliales sont généralement quiescentes et ont
une longue durée de vie. Elles sont en effet protégées par des signaux de survie et de
maintenance autocrines et paracrines, comme le VEGF, le FGF (Fibroblast Growth Factor),
l’angiopoïétine-1 et Notch. Les vaisseaux sanguins ayant pour rôle d’approvisionner l’organisme
en oxygène, les cellules endothéliales expriment les facteurs d’adaptation à l’hypoxie HIF-1α et
HIF-2α qui permettent aux vaisseaux de se remodeler afin d’assurer leurs fonctions. Les cellules
endothéliales quiescentes forment une monocouche et sont connectées entre elles par des
molécules d’adhésion telles que la VE-cadhérine (Vascular Endothelial cadherin). Elles sont
recouvertes d’une gaine de péricytes, qui inhibent leur prolifération et libèrent des signaux de
survie tels que le VEGF et l’angiopoïétine-1. Les cellules endothéliales et les péricytes produisent
et partagent une membrane basale commune qui les maintient en place (Eble and Niland 2009,
24!
Carmeliet and Jain 2011a). En présence d’un signal pro-angiogénique, tel que le VEGF,
l’angiopoïétine-2, le FGF ou des cytokines qui peuvent être libérées par des cellules hypoxiques
ou inflammatoires, les vaisseaux sanguins perdent leur quiescence et deviennent activés (Figure
4A). En réponse à l’angiopoïétine-2, les péricytes vont se détacher des cellules endothéliales et se
libérer de la membrane basale par dégradation protéolytique médiée par les MMPs (Matrix
Metalloproteinases) (Augustin et al. 2009, Carmeliet and Jain 2011a). Les cellules endothéliales
desserrent leurs jonctions et le vaisseau se dilate. Sous l’action du VEGF, la perméabilité de la
monocouche formée par les cellules endothéliales va augmenter et la membrane basale va se
dégrader pour faire place à une matrice extracellulaire provisoire et riche en facteurs pro-
angiogéniques. Afin de former un nouveau vaisseau fonctionnel et de prévenir la migration d’un
trop grand nombre de cellules endothéliales en réponse aux signaux pro-angiogéniques, une
seule cellule endothéliale, nommée tip cell, est sélectionnée pour former la pointe du nouveau
vaisseau en formation (Carmeliet and Jain 2011a). Le VEGF stimule la formation de filopodes par
la tip cell, ce qui lui permettra de guider et d’orienter le nouveau vaisseau (De Smet et al. 2009).
Les cellules endothéliales voisines de la tip cell sont nommées stalk cells. Elles établissent des
jonctions adhérentes avec les cellules voisines, produisent une nouvelle membrane basale et
forment la lumière vasculaire (Figure 4B). Elles produisent moins de filopodes mais prolifèrent
plus que la tip cell afin d’allonger le nouveau vaisseau (Potente et al. 2011). L’acquisition des
phénotypes tip cell et stalk cells est transitoire et est régulée par les axes VEGF/VEGFR2 (VEGF
Receptor 2) et DLL4 (Delta Like Ligand 4)/Notch. En effet, en présence de VEGF, l’activation du
VEGFR2 va augmenter l’expression de DDL4 par les cellules endothéliales. La cellule qui exprime
DDL4 le plus fortement et le plus rapidement devient la tip cell, et grâce à DLL4, va activer le
récepteur Notch dans les cellules endothéliales voisines qui deviendront ainsi des stalk cells (Phng
and Gerhardt 2009, Jakobsson et al. 2010). La rencontre entre deux tip cells de deux vaisseaux
naissants aboutit à l’anastomose de ces vaisseaux qui est consolidée par la VE-cadhérine et
favorisée par la présence de macrophages (Fantin et al. 2010) (Figure 4C). Afin d’être fonctionnel,
le nouveau vaisseau formé doit devenir stable et mature. La formation d’une membrane basale
par les TIMPs (Tissue Inhibitors of Metalloproteinases) et PAI-1 (Plasminogen Activator Inhibitor 1), le
recrutement péricytaire par l’axe PDGFβ/PDGFRβ et la formation de jonctions adhérentes entre
les cellules endothéliales contribuent à ce processus (Potente et al. 2011). Le flux sanguin participe
également à la maintenance du nouveau vaisseau qui régressera s’il n’est plus perfusé.
Finalement, l’acheminement d’oxygène et de nutriments aux différents organes inactive les
différents senseurs de l’oxygène et diminue l’expression du VEGF, de façon à ce que les vaisseaux
sanguins acquièrent à nouveau un phénotype quiescent (Potente et al. 2011).
25!
Figure 4. Représentation de l’angiogenèse. ANG : angiopoietin ; DLL4 : delta like ligand 4 ; FGF : fibroblast growth factor ; MEC : extracellular matrix; MMPs : matrix metalloproteinases ; PAI1 : plasminogen activator inhibitor 1 ; PDGF(R)β : platelet-derived growth factor (receptor) β ; TGFβ : transforming growth factor β ; TIMPs : tissue inhibitors of metalloproteinases ; VEGF(R) : vascular endothelial growth factor (receptor) . Adapté de Carmeliet & Jain, 2011.
26!
2.2.2. L’angiogenèse tumorale
Chez l’adulte, les vaisseaux sanguins sont quiescents hormis dans certaines conditions
physiologiques, telles que la cicatrisation, qui vont activer l’angiogenèse de manière transitoire. A
l’inverse, lors de la progression tumorale, un switch angiogénique a lieu, stimulant la formation de
nouveaux vaisseaux pour favoriser l’expansion tumorale. Ce switch perdure dans le temps et est
la conséquence de la rupture de l’équilibre qui existe entre les facteurs anti-angiogéniques et les
facteurs pro-angiogéniques en faveur de ces derniers (Hanahan and Folkman 1996).
En raison de la surproduction de facteurs pro-angiogéniques, le réseau vasculaire tumoral est très
dense, structurellement et fonctionnellement anormal, et son organisation est chaotique, ce qui a
pour conséquence l’acquisition d’un phénotype plus agressif par la tumeur (Carmeliet and Jain
2000). En effet, le réseau vasculaire est dense dans certaines régions de la tumeur, et pauvre à
d’autres endroits. Les vaisseaux sanguins sont irréguliers, tortueux, anormalement larges ou trop
fins avec une lumière vasculaire variable (Eberhard et al. 2000, Potente et al. 2011). Chaque
composant du vaisseau sanguin tumoral est anormal, à commencer par les cellules endothéliales
qui perdent leur apparence pavimenteuse et leur polarité, sont faiblement interconnectées, sont
parfois organisées en multicouche et peuvent se détacher de la membrane basale (Hashizume et
al. 2000, Carmeliet and Jain 2011b, Potente et al. 2011) (Figure 5). Cette dernière a une composition
et une épaisseur irrégulière. Les péricytes y sont souvent mal fixés, sont peu nombreux, et sont
souvent hypocontractiles (Eberhard et al. 2000, Potente et al. 2011). L’ensemble de ces anormalités
structurales rend la perfusion tumorale irrégulière, réduit la délivrance en oxygène et en
nutriments, et altère l’acheminement des cellules du système immunitaire et des agents
thérapeutiques dans la tumeur (Jain 2005). La perméabilité vasculaire et l’augmentation de la
masse tumorale augmentent la pression interstitielle ce qui entrave d’autant plus la distribution
d’oxygène, de nutriments et d’agents thérapeutiques dans la tumeur (Jain 1988). Cette
perméabilité vasculaire facilite également le passage des cellules tumorales dans la circulation
sanguine et donc la dissémination métastatique (Cooke et al. 2012). De plus, la tumeur étant
faiblement approvisionnée par son réseau vasculaire, les cellules tumorales vont continuer à
stimuler l’angiogenèse afin de compenser le mauvais fonctionnement des vaisseaux existants.
Cependant, cet excès de facteurs pro-angiogéniques ne fait qu’amplifier la désorganisation du
réseau vasculaire, aggravant ainsi l’hypoperfusion tumorale. C’est un cercle vicieux qui rend la
tumeur hypoxique et acidifie le milieu extracellulaire. Ceci contribue à la sélection de cellules
tumorales plus agressives, promeut la dissémination métastatique et favorise la résistance aux
thérapies conventionnelles telles que les chimiothérapies et les radiothérapies (Carmeliet and Jain
2011b, Potente et al. 2011). De plus, les ccRCC étant des tumeurs très vascularisées, une étude
27!
effectuée sur des échantillons tumoraux de patients atteints de ccRCC a montré qu’un taux élevé
de VEGF est corrélé avec un grade tumoral plus élevé et qu’une forte densité vasculaire est
corrélée avec une plus courte survie des patients (Iakovlev et al. 2012).
Figure 5. Anormalités structurales et fonctionnelles des vaisseaux sanguins tumoraux. Adapté de Goel et al, 2011.
3. Prise en charge thérapeutique des adénocarcinomes rénaux à cellules claires
Le traitement des ccRCC localisés repose sur la chirurgie. Dans le cas de ccRCC localement
avancés ou métastatiques, une chirurgie complète – incluant la tumeur primaire et les métastases
– est peu fréquemment réalisée, puisque dans la majorité des cas l’approche chirurgicale n’est pas
envisageable. Cependant, la chirurgie constitue à ce jour le seul traitement curatif des ccRCC
localement avancés ou métastatiques. En effet, leur traitement médical ne permet pour l’instant
que de ralentir l’évolution de la maladie.
28!
3.1. Approche chirurgicale
3.1.1. Néphrectomie partielle ou radicale
La néphrectomie partielle ou radicale constitue le traitement de référence des ccRCC localisés.
L’approche chirurgicale est dictée par la taille, la localisation et le stade tumoral, ainsi que par
d’autres caractéristiques anatomiques propres à chaque patient. Alors que la néphrectomie
radicale consiste en l’ablation totale du rein, de la glande surrénale et des ganglions lymphatiques
régionaux, la néphrectomie partielle préserve la fonction rénale. Elle est donc privilégiée lorsque
la tumeur est de petite taille, et lorsque le patient présente des tumeurs sur les deux reins ou une
comorbidité, telle que l’insuffisance rénale, l’hypertension artérielle ou le diabète (Cohen and
McGovern 2005, Campbell et al. 2009, Jonasch et al. 2014). Cependant, des études cliniques ont
montré que le taux de survie est plus élevé et le risque de récidive plus faible chez les patients
ayant subi une néphrectomie radicale par rapport à ceux ayant subi une néphrectomie partielle
(Van Poppel et al. 2007, Van Poppel et al. 2011).
3.1.2. Traitement local ablatif
Ce type d’intervention est réalisé à l’aide d’une aiguille insérée à travers la peau. Les méthodes de
traitements incluent l’ablation par radiofréquence et la cryoablation. Bien que l’ablation par
radiofréquence soit encore en cours d’évaluation, cette méthode semble être bien tolérée et
efficace en terme de contrôle de la croissance tumorale (Siva et al. 2012). A ce jour, aucune étude
clinique n’a comparé les techniques de traitement local ablatif entre elles ni avec la néphrectomie.
Ces méthodes étant très peu invasives, elles pourraient être utilisées pour l’ablation de petites
tumeurs chez des patients ne pouvant pas être opérés (Johnson et al. 2004, Siva et al. 2012, Jonasch
et al. 2014).
3.1.3. Prise en charge chirurgicale des ccRCC métastatiques
Actuellement, 20 à 30% des ccRCC sont diagnostiqués au stade métastatique. Si l’état général des
patients le permet, il est généralement conseillé de réaliser une néphrectomie dite
« cytoréductive », afin de réduire la taille de la tumeur avant de commencer un traitement
médical. Ainsi, deux études cliniques de phase III ont montré une amélioration de la survie des
patients atteints d’un ccRCC métastatique lorsqu’ils subissent une néphrectomie cytoréductive
29!
avant d’être traités par l’interféron α (Flanigan et al. 2001, Mickisch et al. 2001). Une étude clinique
de phase III actuellement en cours évalue l’effet d’une néphrectomie cytoréductive chez des
patients traités au sunitinib (NCT00930033).
3.2. Traitement par chimiothérapie ou radiothérapie
Bien que les chimiothérapies constituent des standards thérapeutiques pour beaucoup de
tumeurs, elles ne font pas partie des stratégies thérapeutiques utilisées pour le traitement des
ccRCC. En effet, ces tumeurs sont historiquement et toujours considérées comme étant résistantes
aux traitements par mono- et polychimiothérapies (Lilleby and Fossa 2005).
La surexpression de la protéine MDR1 (Multidrug Resistance protein 1), ou glycoprotéine P, est l’un
des principaux mécanismes de chimiorésistance des ccRCC (Mickisch et al. 1990). Cette protéine
fait partie de la superfamille des transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette) et est capable
d’exporter les agents chimiothérapeutiques hors de la cellule (Juliano and Ling 1976). D’autres
mécanismes ont été impliqués dans la chimiorésistance des ccRCC, comme la surexpression de la
glutathione-S-transférase, de la protéine anti-apoptotique Bcl-2 (B-cell lymphoma 2), ou comme
l’accumulation de HIF-2α (Mickisch et al. 1990, Kausch et al. 2005, Roberts et al. 2009).
Bien que les ccRCC soient considérés comme étant résistants aux chimiothérapies, il existe un
regain d’intérêt pour cette stratégie thérapeutique puisque plusieurs études cliniques et
précliniques évaluent l’efficacité d’agents chimiothérapeutiques en association avec d’autres
thérapies dans le traitement des ccRCC métastatiques (Richey et al. 2011, Buti et al. 2013, Fisher et
al. 2013).
A l’instar des chimiothérapies, les radiothérapies ne constituent pas des standards thérapeutiques
pour le traitement des ccRCC, puisque ces tumeurs sont historiquement considérées comme y
étant résistantes. Actuellement, dans le traitement des ccRCC, l’utilisation des radiothérapies est
donc limitée au traitement palliatif de certaines métastases, ou encore au traitement de certaines
tumeurs récurrentes ou inopérables dans le but de contrôler le volume tumoral (Escudier et al.
2012).
3.3. Immunothérapies
Des agents immunomodulateurs peuvent être utilisés dans le traitement des ccRCC afin
d’augmenter l’antigénicité de ces tumeurs ou de stimuler l’immunosurveillance de l’hôte.
30!
L’utilisation de l’interféron-α a constitué une stratégie thérapeutique classique avant l’arrivée des
thérapies ciblées, puisque des études ont montré qu’environ 14% des patients atteints d’un ccRCC
métastatique répondent à ce traitement lorsqu’il est administré en monothérapie (Cohen and
McGovern 2005). L’interféron-α s’est ensuite avéré moins efficace que les thérapies ciblées en
terme de survie sans progression, et est globalement mal toléré. Actuellement, il n’est utilisé
qu’en association avec le bevacizumab, un anticorps anti-VEGF, chez des patients dont le
pronostic de survie est moyen ou bon (Jonasch et al. 2014, Ljungberg et al. 2015) (Tableau 2).
Un autre agent immunomodulateur, l’IL-2 (Interleukin 2), a longtemps constitué le traitement
standard des ccRCC localement avancés ou métastatiques. L’utilisation de l’IL-2 n’est
actuellement plus recommandée puisque son potentiel curatif est limité à un faible pourcentage
de patients. De plus, à ce jour, il n’existe pas de biomarqueurs permettant de sélectionner les
patients répondeurs à un traitement à l’IL-2 (Yang et al. 2003b, Jonasch et al. 2014).
3.4. Thérapies ciblées
La forte production de VEGF tumoral due à l’inactivation de VHL dans la plupart des ccRCC
sporadiques et héréditaires a conduit au développement de plusieurs molécules anti-
angiogéniques, ciblant le VEGF circulant ou ses récepteurs. Cinq de ces agents ont été approuvés
par la FDA (Food and Drug Administration) pour le traitement des ccRCC métastatiques (Jonasch et
al. 2014) (Tableau 2). De plus, des mutations au niveau des gènes codants pour les protéines de la
voie PI3K/Akt/mTOR se produisent régulièrement dans les ccRCC, suggérant l’importance de
cette voie dans la carcinogenèse rénale et initiant le développement d’inhibiteurs de mTOR, dont
deux ont été approuvés par la FDA pour le traitement des ccRCC métastatiques (Cancer Genome
Atlas Research 2013) (Tableau 2).
3.4.1. Le bevacizumab
Le bevacizumab est un anticorps monoclonal humanisé dirigé contre le VEGF-A, communément
appelé VEGF, dont l’utilisation a été approuvée par l’EMA (European Medicines Agency) en 2005 et
par la FDA en 2009. En premier lieu, une étude clinique de phase II a montré l’efficacité du
bevacizumab dans le traitement des ccRCC métastatiques (Yang et al. 2003a). Par la suite, deux
études cliniques de phase III ont évalué l’efficacité du bevacizumab en combinaison avec
l’interféron-α (Escudier et al. 2007b, Rini et al. 2008). Ces deux études ont montré une
augmentation de la survie sans progression des patients traités avec cette association par rapport
31!
à ceux traités avec l’interféron-α seul, justifiant l’utilisation de cette bithérapie en première
intention pour le traitement des ccRCC métastatiques de bon et moyen pronostic. Aucune étude
clinique de phase III visant à évaluer l‘efficacité du bevacizumab en monothérapie n’a été publiée
ou planifiée à ce jour (Jonasch et al. 2014).
3.4.2. Les inhibiteurs de récepteurs tyrosine-kinase (TKI)
Le sorafenib est inhibiteur des récepteurs VEGFR2, VEGFR3, PDGFRβ, c-Kit et FLT3 (Fms-Like
Tyrosine kinase 3). Son utilisation a été approuvée par l’EMA en 2006 et par la FDA en 2005 pour le
traitement des ccRCC. Une étude clinique de phase III a montré que le sorafenib, en comparaison
avec un placebo, permet d’augmenter la survie sans progression de patients préalablement traités
par une immunothérapie, puisqu’elle passe de 2,8 mois avec le placebo à 5,5 mois avec le
sorafenib (Escudier et al. 2007a).
Le sunitinib est inhibiteur des récepteurs VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, PDGFRβ, c-Kit et FLT3
dont l’utilisation pour le traitement des ccRCC a été approuvée par l’EMA et par la FDA en 2006.
En effet, une étude clinique randomisée a montré que la survie sans progression est de 11 mois
chez les patients traités avec le sunitinib contre 5 mois chez les patients traités avec l’interféron-α
(Motzer et al. 2007).
Le pazopanib est un inhibiteur des récepteurs VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, PDGFRβ et c-Kit
approuvé par l’EMA en 2010 et par la FDA en 2009 pour le traitement des ccRCC. Une étude
clinique randomisée de phase III a évalué l’efficacité du pazopanib en comparaison avec un
placebo chez des patients ayant déjà été traités par une immunothérapie, et a mis en évidence une
survie sans progression de 7,4 mois chez les patients traités avec le pazopanib contre 4,2 mois
chez les patients traités avec le placebo. Chez les patients n’ayant pas été traités par
immunothérapie, la survie sans progression est de 11,1 mois avec le pazopanib et de 2,8 mois
avec le placebo (Sternberg et al. 2010). Récemment, une étude a mis en évidence une survie
globale similaire chez des patients atteints d’un ccRCC traités au pazopanib ou au sunitinib en
première intention (Motzer et al. 2014).
L’axitinib est un inhibiteur spécifique des récepteurs VEGFR1, VEGFR2 et VEGFR3 approuvé par
l’EMA et par la FDA en 2012 pour le traitement des ccRCC réfractaires à d’autres traitements. En
effet, une étude clinique randomisée de phase III a révélé une survie sans progression de 6,7 mois
chez les patients traités par l’axitinib contre 4,7 mois chez les patients traités par le sorafenib (Rini
et al. 2011).
32!
3.4.3. Les inhibiteurs de mTOR
Le temsirolimus a été approuvé par l’EMA et par la FDA en 2007 pour le traitement des ccRCC. Il
est actuellement utilisé en première intention chez des patients atteints d’un ccRCC de mauvais
pronostic. En effet, une étude clinique randomisée de phase III a mis en évidence une survie
globale de 10,9 mois chez les patients traités avec le temsirolimus contre 7,3 mois chez les patients
traités par l’interféron-α et 8,4 mois chez les patients traités par la combinaison de ces deux
molécules. Cette étude a été effectuée chez des patients atteints d’un ccRCC de très mauvais
pronostic, présentant des métastases dans plusieurs organes, et n’ayant pas forcément subi une
néphrectomie cytoréductive (Hudes et al. 2007).
L’everolimus a été approuvé par l’EMA et par la FDA en 2009 pour le traitement des ccRCC
réfractaires au sunitinib et/ou au sorafenib. En effet, une étude clinique randomisée de phase III a
montré l’efficacité de l’everolimus chez des patients n’ayant pas répondu aux anti-angiogéniques.
Dans cette étude, la survie sans progression des patients traités à l’everolimus était de 4 mois
contre 1,9 mois pour les patients ayant reçu un placebo (Motzer et al. 2008). Aucune donnée ne
supportant l’utilisation de l’everolimus en première intention pour le traitement des ccRCC, cette
molécule est actuellement utilisée en deuxième ou en troisième intention.
Tableau 2. Recommandations de l’Association Européenne d’Urologie et de la Société Européenne d’Oncologie Médicale pour le traitement des ccRCC (2014).
Traitement de 1ère intention Traitement de 2ème intention Traitement de 3ème intention Bon pronostic Après échec d’un TKI: Après échec d’un TKI : Sunitinib Axitinib Everolimus Pazopanib Sorafenib Bevacizumab + Interféron-α Everolimus Après échec de l’interféron : Après échec d’un inhibiteur de mTOR : Axitinib Sorafenib Sorafenib Everolimus Pronostic moyen Après échec d’un TKI : Sunitinib Axitinib Everolimus Pazopanib Sorafenib Après échec d’un inhibiteur de mTOR : Everolimus Sorafenib Mauvais pronostic Temsirolimus N’importe quelle thérapie ciblée Sunitinib Pazopanib
Doses : Interféron-α: 9MU trois fois par semaine en sous-cutané ; Bevacizumab : 10mg/kg deux fois par semaine en intraveineux ; Sunitinib : 50mg/j pendant 4 semaines per os ; Temsirolimus : 25mg une fois par semaine en intraveineux ; Pazopanib : 800mg/j per os ; Axitinib 5 à 7mg deux fois par jour per os; Everolimus : 100mg/j per os. mTOR : mammalian target of rapamycin ; TKI : tyrosine kinase inhibitor. D’après Ljungberg 2015 & Motzer 2014.
33!
4. Stratégies thérapeutiques émergentes
Le pronostic de survie des patients atteints d’un ccRCC métastatique s’est nettement amélioré
avec l’émergence des thérapies ciblées. Cependant, ces tumeurs restent généralement incurables,
avec une survie globale médiane d’environ deux ans et 10% de survie à 5 ans (Jonasch et al. 2014).
En effet, environ 20% des patients atteints d’un ccRCC métastatique montrent une résistance
thérapeutique dès le début du traitement, quel qu’il soit, ce qui conduit à une évolution rapide de
la maladie avec un très mauvais pronostic. La grande majorité des patients, quant à elle, présente
tout d’abord une régression tumorale en réponse aux anti-angiogéniques, suivie d’une courte
période de stabilité de la maladie, pour aboutir à une résistance à ces agents et à une progression
de la maladie (Rini and Flaherty 2008, Fisher et al. 2013). Enfin, certains de ces patients conservent
un bon état général après avoir reçu trois à quatre thérapies ciblées et constituent donc de bons
candidats pour tester d’autres stratégies thérapeutiques qui ne sont pas encore disponibles à ce
jour. Alors que la résistance des ccRCC aux chimiothérapies est généralement définitive, des
études cliniques suggèrent que la résistance de ces tumeurs aux thérapies ciblées serait transitoire.
En effet, la résistance à une thérapie ciblée peut être reversée par la réintroduction de ce même
traitement après un intervalle de temps pendant lequel le patient n’a pas bénéficié de cette
thérapie, c’est le concept de « rechallenge ». Ainsi, des études ont montré que le « rechallenge »
du sunitinib présente un bénéfice clinique pour le traitement des ccRCC, et que ce bénéfice serait
encore plus important lorsque l’intervalle de temps entre les deux séries de traitements est long
(Porta et al. 2014). Il reste néanmoins essentiel de comprendre les mécanismes de résistance aux
anti-angiogéniques et de mettre au point de nouvelles stratégies thérapeutiques (Philips and
Atkins 2014).
4.1. Inhibition des mécanismes de résistance aux anti-angiogéniques
Une des hypothèses expliquant la résistance des tumeurs aux anti-angiogéniques est l’activation
de voies de signalisation alternatives capables de maintenir l’angiogenèse tumorale. Ce
phénomène, appelé « échappement angiogénique », peut ainsi résulter de la surproduction ou de
la surexpression des angiopoïétines, du facteur HGF (Hepatocyte Growth Factor) et de son
récepteur c-Met, du récepteur ALK1 (Activin receptor-Like Kinase 1), ou encore de l’IL-8 (Interleukin
8). Des inhibiteurs de ces protéines pro-angiogéniques font l’objet d’études précliniques et
cliniques pour le traitement des ccRCC, et leur utilisation en association avec des anti-
34!
angiogéniques déjà sur le marché pourrait aboutir à un bénéfice clinique durable (Philips and
Atkins 2014).
4.1.1. Inhibition de l’axe angiopoïétines/Tie-2
Les angiopoïétines 1 et 2 se lient à leurs récepteurs Tie -1/2 (Tyrosine kinase with Immunoglobulin-
like and EGF-like domains 1/2) afin de promouvoir l’intégrité et la maturation vasculaire mais aussi
l’angiogenèse en réponse à l’hypoxie dans les ccRCC (Yamakawa et al. 2004). Ainsi, une étude
clinique de phase II a montré l’efficacité du trepananib, un inhibiteur de l’axe angiopoïétines/Tie-
2, en association avec le sunitinib dans le traitement des ccRCC métastatiques (Atkins 2012,
Philips and Atkins 2014). Ce résultat encourage donc l’utilisation d’inhibiteurs des angiopoïétines
en association avec des anti-angiogéniques déjà sur le marché (Philips and Atkins 2014).
4.1.2. Inhibition de l’axe HGF/c-Met
Dans des échantillons de ccRCC, l’expression de c-Met a été associée avec le stade anatomique et
constitue un marqueur de mauvais pronostic (Gibney 2011). Ainsi, une étude in vivo a montré que
HGF, le ligand de c-Met, est plus fortement exprimé dans les tumeurs résistantes au sunitinib que
dans les tumeurs qui y sont sensibles, et qu’il induit le développement d’une résistance au
sunitinib en favorisant la maintenance de l’angiogenèse tumorale (Shojaei et al. 2010). De plus,
l’association du sunitinib avec un inhibiteur de c-Met exerce un effet anti-tumoral synergique
dans des tumeurs a priori résistantes au sunitinib (Shojaei et al. 2010).
Le cabozantinib est un inhibiteur des récepteurs à activité kinase c-Met, VEGFR2, c-Kit et FLT3
approuvé par la FDA pour le cancer médullaire de la thyroïde. Une étude a mis en évidence une
activité anti-tumorale encourageante du cabozantinib chez des patients atteints d’un ccRCC et
ayant déjà reçu un ou plusieurs traitement(s) (Choueiri 2012). Ces résultats ont conduit à la mise
en place d’études cliniques randomisées afin d’évaluer le bénéfice du cabozantinib en première
intention en comparaison avec le sunitinib (phase II, NCT01835158) et en deuxième intention en
comparaison avec l’everolimus (phase III, NCT01865747). D’autres inhibiteurs de la voie HGF/c-
Met font également l’objet d’études cliniques (Eder et al. 2009).
35!
4.1.3. Inhibition du récepteur ALK-1
ALK-1, un récepteur au TGFβ, et ses ligands BMP-9 et -10 (Bone Morphogenetic Protein) auraient
un rôle pro-angiogénique distinct de celui du VEGF. Alors que ce dernier est essentiel à
l’angiogenèse « précoce », des données suggèrent que ALK-1 joue un rôle majeur dans le
développement de réseaux vasculaires matures et fonctionnels (Philips and Atkins 2014). Le
dalantercept est une protéine de fusion capable de piéger BMP-9 et -10 et d’inhiber ainsi
l’angiogenèse et la croissance tumorale in vivo (Mitchell et al. 2010). Une étude clinique de phase I
a montré que le dalantercept est relativement bien toléré (NCT00996957), et son efficacité en
association avec l’axitinib est actuellement évaluée chez des patients atteints d’un ccRCC résistant
aux anti-angiogéniques (phase II, NCT01727336).
4.1.4. Inhibition de l’IL-8
L’IL-8 est une chimiokine pro-angiogénique dont la sécrétion tumorale est plus élevée dans les
ccRCC résistants au sunitinib que dans les ccRCC répondeurs, suggérant son implication dans la
résistance à cet anti-angiogénique (Huang et al. 2010a). De plus, la neutralisation de l’IL-8 entraine
une diminution de la croissance tumorale chez des souris porteuses de xénogreffes de ccRCC
résistantes au sunitinib (Huang et al. 2010a). D’autre part, une étude clinique de phase III
évaluant l’efficacité du pazopanib chez des patients atteints d’un ccRCC a montré que des taux
élevés d’IL-8 sont associés à une plus courte survie sans progression. Enfin, une étude préclinique
effectuée, entre autres, dans un modèle de ccRCC, a montré que le microARN miR-200 cible l’IL-8
sécrétée par la tumeur réduisant ainsi l’angiogenèse tumorale (Pecot et al. 2013). L’ensemble de
ces résultats souligne l’intérêt de cibler l’IL-8 afin de retarder ou d’empêcher la résistance aux
anti-angiogéniques chez les patients atteints de ccRCC.
4.1.5. Inhibition de HDM2
L’oncogène HDM2 (Human Double Minute 2) induit la dégradation protéasomale de p53 et a
également été impliqué dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α (Carroll and Ashcroft 2008). Une
étude effectuée dans un modèle murin de ccRCC a montré que dans un premier temps, le
sunitinib augmente l’expression de p53 qui décline par la suite, coïncidant avec le développement
de la résistance à cet agent, elle-même associée à la surexpression de HDM2 et HIF-2α (Panka et
al. 2013). Dans ce modèle, l’administration d’un antagoniste de HDM2 permet de maintenir
36!
l’expression de p53 et de retarder l’échappement angiogénique, ainsi que de prévenir
l’accumulation de HIF-2α. Au vu de ces résultats précliniques, il serait intéressant de savoir si
l’inhibition de HDM2 a des effets similaires chez des patients atteints de ccRCC (Philips and
Atkins 2014).
4.1.6. Ciblage de l’imitation vasculaire
L’imitation vasculaire, ou vascular mimicry, décrit la plasticité fonctionnelle de cellules tumorales
agressives capables d’acquérir une structure tubulaire afin de former un nouveau réseau
vasculaire dépourvu de cellules endothéliales. Ces nouveaux vaisseaux font partie du réseau
vasculaire tumoral ; permettent d’approvisionner la tumeur en oxygène et en nutriments ; et
constituent une échappatoire pour la dissémination métastatique (Maniotis et al. 1999).
L’imitation vasculaire a été observée dans différents cancers, dont les ccRCC où elle représente un
facteur de mauvais pronostic (Zhang et al. 2013b). Elle constitue un mécanisme potentiel de
résistance aux anti-angiogéniques puisque des études ont montré que ces agents n’empêchent pas
l’imitation vasculaire mais peuvent, au contraire, la favoriser (Xu et al. 2012). Son ciblage pourrait
donc constituer une stratégie thérapeutique intéressante.
4.2. Identification de nouvelles cibles thérapeutiques
4.2.1. HIF-2α
Le facteur de transcription HIF-2α jouant un rôle crucial dans le développement des ccRCC, son
inhibition constituerait une stratégie thérapeutique pertinente pour le traitement de ces tumeurs
(Kondo et al. 2003). En effet, le ciblage de HIF-2α pourrait s’avérer plus efficace que l’utilisation
d’anti-angiogéniques puisque ce facteur contrôle l’expression de nombreux gènes impliqués non
seulement dans l’angiogenèse tumorale mais aussi dans la prolifération, la survie, la
dédifférenciation et le métabolisme des cellules tumorales (Keith et al. 2012). Des inhibiteurs
spécifiques de HIF-2α démontrant une activité anti-tumorale sont utilisés in vitro et in vivo mais
ne font pas l’objet d’études cliniques à ce jour, ce qui justifie l’utilisation en clinique de molécules
inhibant indirectement HIF-2α, tels que les inhibiteurs de mTOR (Lee et al. 2009b, Scheuermann et
al. 2013, Philips and Atkins 2014).
37!
4.2.2. La voie SphK1/S1P
La SphK1 (Sphingosine Kinase 1), via son produit la S1P (Sphingosine 1-phosphate), favorise la survie
et la prolifération cellulaire, est surexprimée dans de nombreuses tumeurs, dont les ccRCC, et
contribue à l’échec thérapeutique (Cuvillier et al. 1996, French et al. 2003, Johnson et al. 2005). Des
études ont ainsi montré que la SphK1 est surexprimée dans des ccRCC résistants au sunitinib et
que son inhibition permet de sensibiliser ces tumeurs à cet agent anti-angiogénique (Gao and
Deng 2014, Zhang et al. 2015). De plus, un anticorps anti-S1P fait actuellement l’objet d’une étude
clinique de phase II pour le traitement des ccRCC inopérables ou résistants aux thérapies ciblées
(NCT01762033).
4.2.3. La voie NF2/Hippo/Yap
Une étude préclinique a montré que la voie NF2 (Neurofibromin 2)/Hippo/Yap contribuerait au
développement des ccRCC (Morris and McClatchey 2009). En effet, il a été montré que 33% des
ccRCC VHL+/+ présentent des mutations inactivatrices du gène suppresseur de tumeur NF2, et
des données récentes suggèrent l’inactivation de la voie NF2/Hippo dans certains ccRCC VHL-/-
(Dalgliesh et al. 2010, Philips and Atkins 2014). L’inactivation de NF2 entraine l’activation de
l’oncogène Yap qui promeut la transcription de gènes pro-prolifératif et anti-apoptotiques
(Philips and Atkins 2014). Ainsi, le ciblage de cette voie de signalisation pourrait s’avérer
pertinent pour le traitement des ccRCC.
4.3. Autres stratégies
4.3.1. Développement de nouvelles immunothérapies
Des études récentes ont identifié des « checkpoints immunitaires » capables de protéger les
cellules tumorales de leur destruction par un système immunitaire activé, et parmi eux, le
récepteur PD-1 (Programmed Death-1) (Philips and Atkins 2015). Ce récepteur est exprimé par les
lymphocytes T activés dont il diminue les fonctions effectrices lorsqu’il est en présence de son
ligand PD-L1 (PD-Ligand 1). Or, PD-L1 est exprimé par différentes tumeurs, dont les ccRCC dans
lesquels son expression a été associée avec un mauvais pronostic (Philips and Atkins 2014).
Récemment, des études cliniques ont montré que des anticorps bloquants l’interaction entre PD-
L1 et PD-1 présentent une activité anti-tumorale dans plusieurs types de cancers, dont les ccRCC
38!
(Topalian et al. 2012, Philips and Atkins 2014, Philips and Atkins 2015). Ces anticorps sont bien
tolérés et sont actuellement en développement clinique seuls ou en association avec des anti-
angiogéniques tels que le bevacizumab ou avec d’autres inhibiteurs de checkpoints immunitaires
(NCT02210117) (Philips and Atkins 2014, Philips and Atkins 2015).
En parallèle, de nombreux vaccins anti-tumoraux sont testés cliniquement pour le traitement des
ccRCC (Escudier 2012). C’est notamment le cas du vaccin AGS-003, qui a fait l’objet d’une étude
clinique de phase II chez des patients atteints d’un ccRCC métastatique. Les résultats de cette
étude indiquent que la survie sans progression des patients traités par l’AGS-003 en combinaison
avec le sunitinib est de 11,9 mois contre 8 mois chez les patients traités par le sunitinib seul. Une
étude clinique de phase III actuellement en cours évalue l’efficacité de cette association chez des
patients d’un ccRCC avancé ou métastatique (NCT01582672).
4.3.2. Utilisation néoadjuvante des thérapies ciblées
Alors que la néphrectomie cytoréductive précédent l’administration d’une thérapie ciblée est une
stratégie thérapeutique classique pour le traitement des ccRCC métastatiques, l’utilisation néo-
adjuvante des thérapies ciblées est à ce jour moins fréquente. Cette méthode présente pourtant
l’avantage de réduire le volume tumoral pour rendre la chirurgie plus efficace et plus sûre (van
der Veldt et al. 2008, Cowey et al. 2010, Powles et al. 2011, Fisher et al. 2013). Ainsi, une étude a
montré que l’administration de sunitinib à des patients atteints d’un ccRCC avancé et inopérable,
a permis de rendre opérables 21% d’entre eux (Thomas et al. 2009). Des études cliniques de phase
III sont actuellement en cours afin d’évaluer l’efficacité de cette stratégie thérapeutique
(NCT00930033, NCT01099423).
39!
Chapitre 2 :
L’hypoxie intratumorale et les facteurs HIF
1. Homéostasie de l’oxygène et stress hypoxique.
Au cours de l’évolution, les organismes vivants ont dû s’adapter aux changements de la
composition atmosphérique. En effet, il y a 4 milliards d’années, l’atmosphère terrestre était
composée de 98% de dioxyde de carbone, de 1,9% d’azote et de près de 0% d’oxygène.
Aujourd’hui, sa composition est de 0,03% de dioxyde de carbone, de 79% d’azote et de 21%
d’oxygène. Cette modification progressive, d’une atmosphère quasiment dépourvue d’oxygène à
une atmosphère relativement riche en oxygène, s’est accompagnée d’une augmentation
considérable de la complexité des organismes vivants, pour qui l’oxygène est devenu un élément
clé de la survie cellulaire. L’oxygène permet en effet de répondre aux demandes énergétiques de
la cellule en générant de l’ATP via la phosphorylation oxydative. C’est en raison de ce rôle
essentiel que les concentrations en oxygène sont finement régulées dans l’organisme. Au niveau
des voies aériennes supérieures, qui permettent la captation de l’oxygène, le taux d’oxygène est
de 20%. Il est d’environ 14% dans la circulation artérielle qui permet d’acheminer l’oxygène
jusqu’aux organes et de 0,5 à 10% au niveau de ces derniers (Brahimi-Horn and Pouyssegur 2007)
(Figure 6).
Dans certaines conditions physiopathologiques, ce taux d’oxygène diminue, le tissu en question
se trouve alors en condition d’hypoxie. Il existe différents senseurs capables de détecter une telle
variation du taux d’oxygène et d’induire une réponse physiologique de manière à compenser ce
manque d’oxygène. D’une part, lorsque l’hypoxie est systémique et que le taux d’oxygène du
sang artériel est inférieur à 8,5%, les cellules glomérulaires du corps carotidien vont libérer des
neurotransmetteurs tels que l’acétylcholine et la noradrénaline afin d’augmenter le rythme et le
volume respiratoire ainsi que le rythme cardiaque, de manière à réoxygéner l’organisme (Weir et
al. 2005). D’autre part, lorsque l’hypoxie est locale, les cellules concernées y répondent en activant
des facteurs de transcription, et en particulier les facteurs HIF (Hypoxia-Inducible Factor) qui
constituent les acteurs clés de l’adaptation au stress hypoxique (Semenza 2011).
!!
40!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
Figure 6. Différentes concentration en oxygène dans l’organisme humain. !!
2. Les facteurs HIF, acteurs de l’adaptation au stress hypoxique.
Trois facteurs de transcription HIF ont été identifiés à ce jour : HIF-1, HIF-2 et HIF-3 (Figure 7).
Ces facteurs sont des hétérodimères, constitués chacun d’une sous-unité HIF-α, sensible à
l’oxygène et uniquement stabilisée en son absence, et d’une sous-unité HIF-β, exprimée
constitutivement. Ils font partie des facteurs de transcription de type bHLH (basic Helix-Loop-
Helix) à domaine PAS (Per-ARNT-Sim) (Wang et al. 1995, Crews 1998). En effet, chaque sous-unité
est constituée d’un domaine bHLH permettant sa dimérisation avec une autre sous-unité, ainsi
que sa liaison à l’ADN des gènes cibles, au niveau de leurs séquences HRE (Hypoxia Response
Element) 5’-(A/G)CGTG-3’. Le domaine PAS est quant à lui impliqué dans la dimérisation des
sous-unités entre elles ou avec d’autres protéines. Dans leur partie C-terminale, les sous-unités
41!
HIF-α et HIF-β présentent un à deux domaine(s) de transactivation, nommés N-TAD (N-Terminal
TransActivation Domain) et C-TAD (C-Terminal TransActivation Domain), permettant la régulation
de l’activation des gènes cibles de HIF (Ruas et al. 2002, Rankin and Giaccia 2008). Enfin, les sous-
unités HIF-α contiennent un domaine ODDD (Oxygen-Dependent Degradation Domain) nécessaire à
leur dégradation par la voie ubiquitine-protéasome en présence d’oxygène (Huang et al. 1997).
Figure 7. Structure et sites d’hydroxylation des sous-unités HIF. aa : acides aminés ; bHLH : basic helix-loop-helix ; PAS : per-ARNT-sim ; ODDD : oxygen-dependent degradation domain ; N-TAD : N-terminal transactivation domain ; C-TAD : C-terminal transactivation domain. Adapté de Rankin and Giaccia, 2008.
A l’inverse, en conditions d’hypoxie, les sous-unités HIF-α sont stabilisées dans le cytoplasme.
Elles vont ainsi pouvoir s’hétérodimériser avec HIF-β et être transloquées dans le noyau où elles
se lient au niveau des séquences HRE de l’ADN de leurs gènes cibles, dont la transcription pourra
être activée. Ces gènes sont impliqués dans des processus biologiques fondamentaux, tels que la
survie, la prolifération et le métabolisme cellulaire ainsi que l’angiogenèse (Rankin and Giaccia
2008).
42!
2.1. HIF-1α
HIF-1α est le premier membre des facteurs HIF à avoir été caractérisé : il s’agit d’un facteur
nucléaire induit par l’hypoxie capable de se lier à la séquence HRE contenue dans le promoteur
de l’EPO (Erythropoietin) afin d’activer sa transcription (Semenza et al. 1991, Semenza and Wang
1992, Wang and Semenza 1995). HIF-1α présente deux domaines de transactivation N-TAD et C-
TAD. Le domaine N-TAD confère la spécificité de HIF-1 pour ses gènes cibles alors que le
domaine C-TAD est impliqué dans l’activation de la transcription des gènes cibles de part son
interaction avec CBP (CREB Binding Protein) et p300, deux co-activateurs de la transcription
(Lando et al. 2002a, Hu et al. 2007). Le domaine ODDD de HIF-1α contient deux sites
d’hydroxylation sur les résidus proline 402 et 564 impliqués dans la régulation de la stabilité de la
protéine en fonction du taux d’oxygène, et le domaine C-TAD contient un site d’hydroxylation
sur le résidu asparagine 803 impliqué dans la régulation de l’activité transcriptionnelle de HIF-1.
HIF-1α contient d’autres sites de modifications post-traductionnelles comme des sites de
phosphorylation, d’acétylation et de sumoylation. Etant donné son expression ubiquitaire et les
centaines de gènes cibles qu’il régule, HIF-1α a émergé comme étant un régulateur clé de la
réponse cellulaire à l’hypoxie (Wenger et al. 1996, Semenza 2009).
2.2. HIF-2α
HIF-2α est le deuxième membre des facteurs HIF à avoir été identifié, tout d’abord sous le nom
de EPAS1 (Endothelial PAS domain-containing protein 1) dans les cellules endothéliales (Tian et al.
1997). Il a aussi été appelé HFL (HIF-1α-like factor), HRF (HIF-related factor) ou MOP2 (Member Of
PAS superfamily 2) (Ema et al. 1997, Flamme et al. 1997, Hogenesch et al. 1997). Sa séquence en
acides aminés présente 48% d’homologie avec celle de HIF-1α. De même, ses domaines bHLH,
PAS et ODDD présentent respectivement 85%, 70% et 70% d’homologie avec ceux de HIF-1α.
HIF-2α possède deux domaines de transactivation, N-TAD et C-TAD, qui jouent le même rôle
que ceux de HIF-1α (O'Rourke et al. 1999, Lando et al. 2002a, Hu et al. 2007). Enfin, le domaine
ODDD de HIF-2α contient deux sites d’hydroxylation sur les résidus proline 405 et 531 impliqués
dans la régulation de la stabilité de la protéine en fonction du taux d’oxygène. Le domaine C-
TAD en contient un autre sur le résidu asparagine 847 qui est impliqué dans la régulation de
l’activité transcriptionnelle. A l’inverse de HIF-1α, l’expression de HIF-2α est plus
restreinte puisqu’on le retrouve dans les cellules endothéliales, le parenchyme hépatique, les
43!
pneumocytes de type 2, les cardiomyocytes, ou encore les cellules épithéliales rénales (Tian et al.
1997, Wiesener et al. 2003).
2.3. HIF-3α
HIF-3α est le dernier membre des facteurs HIF à avoir été identifié (Gu et al. 1998). Il présente
respectivement 57% et 53% d’homologie de séquence avec HIF-1α et HIF-2α. Cette protéine ne
possède pas de domaine C-TAD, ce qui a longtemps suggéré que sa fonction était différente de
celle de HIF-1α et HIF-2α (Hara et al. 2001). En effet, HIF-3α présente plusieurs variants
d’épissage et certains d’entre eux ont été décrits in vitro comme n’ayant que peu ou pas d’activité
transcriptionnelle (Pasanen et al. 2010), ou bien comme étant capables de se dimériser avec HIF-
1α et HIF-2α inhibant ainsi leur activité transcriptionnelle (Makino et al. 2001, Maynard et al. 2005,
Maynard et al. 2007). Cependant, plus récemment, une étude fonctionnelle in vivo a révélé que
HIF-3 possède une activité transcriptionnelle et régule l’expression de plusieurs gènes, que la
stabilité de HIF-3α est régulée en fonction du taux d’oxygène, et que ces caractéristiques sont
conservées chez l’homme (Zhang et al. 2014b). Concernant l’expression de HIF-3α, son ARNm a
été détecté dans plusieurs organes comme le thymus, les poumons, le cerveau, le cœur et les reins
(Gu et al. 1998).
2.4. HIF-β
Il existe trois sous-unités HIF-β : ARNT1, ARNT2 et ARNT3 (Aryl hydrocarbon Receptor Nuclear
Translocator 1, 2 et 3), à forte homologie de séquence. Ces sous-unités ne contiennent pas de
domaine ODDD et sont donc constitutivement exprimées dans la cellule, indépendamment du
taux d’oxygène (Kallio et al. 1997). Elles peuvent toutes trois s’hétérodimériser avec les sous-
unités HIF-α, bien qu’ARNT1 soit leur partenaire principal puisque son expression est ubiquitaire
alors qu’ARNT2 n’est retrouvée que dans le cerveau et dans le rein (Hirose et al. 1996).
44!
3. Mécanismes de régulation des facteurs HIF
Dans cette partie, nous nous intéressons à HIF-1 et HIF-2 car peu d’informations sont connues à
propos des mécanismes de régulation de HIF-3.
3.1. Mécanismes de régulation dépendants de l’oxygène
Une étude in vitro a montré que la stabilisation et l’activité transcriptionnelle de HIF-1α sont
induites lorsque le taux d’oxygène est inférieur à 6%, et sont maximales lorsqu’il est de 0,5%
(Jiang et al. 1996). C’est donc le taux d’oxygène qui constitue le régulateur principal des sous-
unités HIF-α.
3.1.1. Régulation de la stabilité des sous-unités HIF-α
En présence d’oxygène, les sous-unités HIF-α sont hydroxylées au niveau de deux résidus proline
de leur domaine ODDD – P402 et P564 pour HIF-1α, P405 et P531 pour HIF-2α – par des PHD
(Prolyl Hydroxylase Domain containing protein). HIF-α est ainsi reconnue par pVHL et adressée au
protéasome pour sa dégradation (Ivan et al. 2001, Jaakkola et al. 2001) (Figure 8).
Les PHD existent sous trois isoformes : PHD1, PHD2 et PHD3 (Bruick and McKnight 2001,
Epstein et al. 2001). Leur activité est dépendante de l’oxygène, de l’α-cétoglutarate, du fer Fe(II) et
de l’ascorbate (Schofield and Zhang 1999, Stolze et al. 2006). Lors de la réaction d’hydroxylation,
le fer Fe(II) permet de cliver l’oxygène moléculaire, dont un atome sera inséré sur le résidu
proline pour former une hydroxyproline, et l’autre sur l’α-cétoglutarate pour libérer une
molécule de CO2 (Stolze et al. 2006). L’ascorbate et le CO2 permettent ensuite de réduire le fer
pour réactiver l’enzyme. Les trois isoformes de PHD sont retrouvées dans l’ensemble de
l’organisme, bien que leur niveau d’expression varie en fonction des tissus et de la localisation
intracellulaire (Metzen et al. 2003a). Les trois PHD sont capables d’hydroxyler les sous-unités
HIF-α (Bruick and McKnight 2001, Jaakkola et al. 2001), mais il a été montré in vitro que la PHD2
joue un rôle essentiel dans la régulation de la HIF-1α alors que la PHD3 est plus importante pour
la régulation de HIF-2α (Appelhoff et al. 2004). Plus tard, des expériences in vivo menées chez la
souris ont montré que seul le KO (Knock-Out) de la PHD2 est létal au stade embryonnaire,
mettant ainsi en évidence l’importance majeure de cette isoforme. Les PHD2 et PHD3 sont elles-
mêmes des gènes cibles de HIF. Leur expression est donc augmentée en hypoxie, ce qui garantit
45!
une dégradation rapide et optimale de HIF-α lorsque la cellule se retrouve en normoxie (Berra et
al. 2001, Epstein et al. 2001, Berra et al. 2003).
L’hydroxylation de HIF-α au niveau des résidus proline de leur domaine ODDD permet leur
reconnaissance par pVHL, un composant d’un complexe E3 ubiquitine ligase. Cette interaction
entre HIF-α et pVHL permet le recrutement des autres composants du complexe E3 ubiquitine
ligase, à savoir les protéines élongine C, élongine B, culline 2 et Rbx1 (Ring-box 1). Cette dernière
permet l’ubiquitinylation de HIF-α qui sera ensuite adressée au protéasome pour y être dégradée
(Iliopoulos et al. 1996, Maxwell et al. 1999, Kamura et al. 2000, Ivan and Kaelin 2001) (Figure 8).
Figure 8. Régulation de HIF-α dépendante de l’oxygène. Cul2 : cullin 2 ; HRE : hypoxia-response element ; Ub : ubiquitin. Adapté de Cohen, 2005.
La mitochondrie constitue également un senseur de l’oxygène impliqué dans la régulation de la
stabilité de HIF-α. En effet, des études ont montré qu’en cas d’hypoxie modérée (1,5% O2), la
mitochondrie stimule la production de ROS (Reactive Oxygen Species) par le complexe III de la
chaine respiratoire. Ces ROS vont inhiber l’activité des PHD et ainsi favoriser la stabilisation de
HIF-α (Klimova and Chandel 2008, Majmundar et al. 2010).
Enfin, notre équipe a montré pour la première fois que la SphK1 (Sphingosine Kinase 1), une lipide-
kinase « oncogénique », régule la stabilisation de HIF-1α en hypoxie dans différentes lignées
tumorales humaines (Ader et al. 2008). Dans ces modèles, l’hypoxie stimule la production de ROS,
46!
ce qui active la voie SphK1/S1P qui empêche la dégradation protéasomale de HIF-1α selon un
mécanisme dépendant de pVHL.
3.1.2. Régulation de l’activité transcriptionnelle de HIF
L’oxygène participe également à la régulation de l’activité transcriptionnelle des facteurs HIF. En
effet, le domaine C-TAD, impliqué dans le recrutement des cofacteurs de transcription
permettant l’expression des gènes cibles de HIF, contient un résidu asparagine – N803 pour HIF-
1α et N847 pour HIF-2α – pouvant être hydroxylé par la protéine FIH (Factor Inhibiting HIF).
L’hydroxylation de ce résidu empêche le recrutement des cofacteurs de transcription CBP et p300,
et inhibe donc l’activité transcriptionnelle de HIF (Lando et al. 2002a, Lando et al. 2002b) (Figure
8). L’activité hydroxylase de FIH est dépendante de l’oxygène, du fer Fe(II) et de l’ α-
cétoglutarate. Son affinité pour l’oxygène étant plus forte que celle des PHD, FIH peut être active
à des concentrations plus faibles en oxygène et peut ainsi inhiber l’activité transcriptionnelle de
HIF lorsque HIF-α a échappé au processus de dégradation dépendant des PHD. Cependant, des
études ont montré que le domaine C-TAD de HIF-2α est plus résistant à l’hydroxylation par FIH
que celui de HIF-1α (Bracken et al. 2006, Yan et al. 2007).
3.2. Mécanismes de régulation indépendants de l’oxygène
Bien que l’oxygène soit le principal régulateur de la stabilité et de l’activité des facteurs HIF, leur
régulation peut aussi se faire par des mécanismes indépendants de l’oxygène. Certains d’entre
eux sont développés ici (Tableau 3, Figure 9).
3.2.1. Régulation par les protéines HSP90 et RACK1
HSP90 (Heat Shock Protein 90) est une protéine chaperonne impliquée dans le repliement adéquat
des protéines et dans leur protection vis-à-vis des chocs thermiques. Une étude in vitro a montré
que l’inhibition de HSP90 entraine l’ubiquitinylation de HIF-1α et sa dégradation par le
protéasome indépendamment de pVHL et du taux d’oxygène. De plus, l’inhibition de HSP90
diminuerait l’activité transcriptionnelle de HIF-1 (Isaacs et al. 2002, Majmundar et al. 2010). Par la
suite, une autre étude a montré que RACK1 (Receptor for Activated C-Kinase 1) peut entrer en
compétition avec HSP90 pour interagir avec HIF-1α au niveau de son domaine PAS. Alors que
47!
HSP90 stabilise HIF-1α, son interaction avec RACK1 aboutit à sa dégradation par le protéasome
(Liu and Semenza 2007, Baldewijns et al. 2010).
3.2.2. Régulation par modifications post-traductionnelles
Plusieurs types de modifications post-traductionnelles peuvent réguler les facteurs HIF. Selon les
études, il a été montré que la sumoylation de HIF-α pouvait aboutir à la fois à sa dégradation
protéasomale mais aussi à l’augmentation de sa stabilité et de son activité transcriptionnelle (Bae
et al. 2004, Carbia-Nagashima et al. 2007, Cheng et al. 2007, van Hagen et al. 2010). De même, une
étude a montré que la S-nitrosylation de HIF-1α stimule le recrutement des cofacteurs CBP et
p300 alors qu’une autre indique le contraire (Yasinska and Sumbayev 2003, Baran et al. 2007, Cho
et al. 2007). Enfin, des études ont montré que la phosphorylation de HIF-α par des protéines de la
voie des MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase), dont ERK1/2 (Extracellular signal-Regulated
Kinases 1/2), augmente l’activité des facteurs HIF, en particulier en favorisant le recrutement de
p300 (Richard et al. 1999, Sang et al. 2003).
3.2.3. Régulation par les hormones et les facteurs de croissance
L’héréguline, une hormone capable de se fixer sur son récepteur HER2 pour induire la
prolifération cellulaire, a été impliquée dans la régulation de HIF-1α. En effet, une étude réalisée
dans un modèle de cancer du sein a montré que cette hormone active la voie PI3K/Akt/mTOR ce
qui induit la traduction de HIF-1α (Laughner et al. 2001). Les mécanismes mis en jeu sont les
suivants : une fois activée, mTOR va phosphoryler les protéines 4E-BP1 (eukaryotic Initiation Factor
(eIF) 4E Binding Protein 1) et p70S6K (p70S6-kinase), toutes deux impliquées dans l’initiation de la
traduction cap-dépendante. Ainsi, la phosphorylation de 4E-BP1 entraine sa dissociation de eIF-
4E qui va se lier au complexe eIF-4F pour initier la traduction. De plus, la phosphorylation de
p70S6K entraine l’activation de la protéine ribosomale S6 et de eIF-4A ainsi que la
phosphorylation de eIF-4B et de eIF-4G qui font également partie du complexe eIF-4F (Hara et al.
1997, Hay and Sonenberg 2004, Sonenberg and Hinnebusch 2009, Blagden and Willis 2011).
L’angiotensine II, une hormone aux propriétés vasoconstrictrices, a également été impliquée dans
la régulation de HIF-1α. En effet, une étude a montré que dans des cellules musculaires lisses
vasculaires, l’angiotensine II induit la transcription de HIF-1α via l’activation de la PKC et
stimule la traduction de HIF-1α selon un mécanisme dépendant des ROS et de la voie de la PI3K
(Page et al. 2002).
48!
Enfin, une étude a montré que le FGF, l’EGF (Epidermal Growth Factor), l’insuline et l’IGF1/2
(Insulin-like Growth Factor) induisent l’expression de HIF-1α dans la lignée HEK293 (Feldser et al.
1999). Une étude réalisée dans un modèle de cancer de la prostate a ensuite montré que l’EGF
régule la transcription de HIF-1α en activant la voie PI3K/Akt (Zhong et al. 2000). Par la suite, il a
été montré que l’EGF et l’insuline peuvent stimuler la production de ROS, ce qui induit
l’activation des protéines Akt et p70S6K pour aboutir à la traduction de HIF-1α dans des lignées
tumorales humaines (Liu et al. 2006, Zhou et al. 2007). Plus récemment, une étude a montré que
l’inhibition du FGFR (FGF Receptor) entraine une diminution du taux intracellulaire de HIF-
1α dans une lignée de glioblastome (Ader et al. 2014).
3.2.4. Différences de régulation entre HIF-1α et HIF-2α
Bien que la majorité des mécanismes de régulation soient communs aux sous-unités HIF-α,
certains d’entre eux sont spécifiques à HIF-1α ou HIF-2α (Keith et al. 2012).
En premier lieu, des études effectuées dans plusieurs lignées cellulaires tumorales ont montré que
HIF-2α est stabilisé en conditions d’hypoxie modérée (2-5% O2) alors que HIF-1α s’accumule
lorsque l’hypoxie est plus sévère (0-2% O2) (Nilsson et al. 2005, Holmquist-Mengelbier et al. 2006).
De plus, en cas d’hypoxie prolongée, l’expression de HIF-2α est élevée et maintenue dans le
temps alors que HIF-1α est d’abord fortement exprimée puis son taux décroît après plusieurs
heures, sans doute suite à la dégradation de son ARNm (Uchida et al. 2004, Holmquist-
Mengelbier et al. 2006). D’autre part, l’hypoxie intermittente induit l’expression de HIF-1α mais
diminue celle de HIF-2α (Peng et al. 2006, Nanduri et al. 2009).
La protéine HAF (Hypoxia-Associated Factor) est une E3 ubiquitine ligase uniquement retrouvée
dans les cellules en prolifération. Il a été montré que cette protéine peut se lier à HIF-1α pour
induire son ubiquitinylation et sa dégradation protéasomale indépendamment de pVHL (Koh et
al. 2008a, Koh and Powis 2009). A l’inverse, HAF peut se lier sur la région C-terminale de HIF-
2α et favoriser ainsi son activité transcriptionnelle (Koh et al. 2011).
Enfin, l’activité des facteurs HIF peut être modulée par les sirtuines, des enzymes sensibles au
statut redox de la cellule. Ainsi, SIRT1 (sirtuin 1) peut déacétyler un résidu lysine du domaine N-
TAD de HIF-2α afin d’augmenter son activité transcriptionnelle (Dioum et al. 2009). A l’inverse, la
déacétylation de ce résidu sur HIF-1α entraine une diminution de son activité transcriptionnelle
(Lim et al. 2010). D’autres études ont montré que SIRT6 constitue un répresseur de l’activité
transcriptionnelle de HIF-1α et que SIRT3 diminue sa stabilité (Zhong et al. 2010, Finley et al.
2011).
49!
Figure 9. Principaux mécanismes de régulation des facteurs HIF. Les facteurs HIF sont activés par trois mécanismes majeurs: la liaison des facteurs de croissance et des hormones à leurs récepteurs (1); l’hypoxie (2); l’activation de voies de signalisation oncogéniques et l’inactivation de gènes suppresseurs de tumeur (3). (1) La liaison d’un facteur de croissance ou d’une hormone à son récepteur aboutit à l’activation de différentes voies de signalisation, telles que la voie PI3K/Akt, induisant ainsi l’accumulation de HIF-1α. (2) L’hypoxie inhibe la dégradation protéasomale de HIF-α, via l’inhibition des PHD ou via la production de ROS, capables notamment d’activer la SphK1. L’hypoxie inhibe également FIH, un régulateur négatif de l’activité transcriptionnelle de HIF. HIF-α s’accumule dans le cytoplasme et s’hétérodimérise avec HIF-β. Le complexe ainsi formé migre dans le noyau et se lie au niveau des séquences HRE de l’ADN des gènes cibles de HIF dont la transcription sera activée. (3) L’inactivation de gènes suppresseurs de tumeur, tels que VHL, p53, PTEN, SDH et FH, de même que l’activation des voies des MAPK, de la PI3K, de NFκB ou de la β-caténine, aboutit à l’accumulation de HIF-α. CBP : CREB binding protein ; EGF : epidermal growth factor ; FIH : factor inhibiting HIF ; FGF : fibroblast growth factor ; FH : fumarate hydratase ; GSK3β: glycogen synthase kinase 3β; IGF : insulin-like growth factor ; HIF : hypoxia-inducible factor ; HRE : hypoxia response element ; MAPK : mitogen-activated protein kinase ; mTOR : mammalian target of rapamycin ; NFκB : nuclear factor κB ; PHD : prolyl hydroxylase domain containing protein ; PI3K : phosphatidylinositol 3-kinase ; PTEN : phosphatase and tensin homolog ; pVHL : protein von Hippel-Lindau ; ROS : reactive oxygen species ; S1P: sphingosine 1-phosphate; SDH : succinate dehydrogenase ; SphK1 : sphingosine kinase 1. Adapté de Baldewijns, 2010.
50!
Tableau 3. Principaux régulateurs des facteurs HIF.
Régulateur Cible(s) Effet(s) biologique(s) sur HIF-α Référence(s) Régulateurs dépendants de l’oxygène pVHL HIF-1α /2α Diminution de la stabilité (Iliopoulos et al. 1996) PHD1/2/3 HIF-1α /2α Diminution de la stabilité (Jaakkola et al. 2001)
(Bruick and McKnight 2001)
FIH HIF-1α /2α Diminution de l’activité transcriptionnelle (Lando et al. 2002a, Lando et al. 2002b)
ROS HIF-1α /2α Augmentation de la stabilité (Klimova and Chandel 2008)
SphK1 HIF-1α Augmentation de la stabilité (Ader et al. 2008) SIAH1/2 RhoB
HIF-1α HIF-1α
Augmentation de la stabilité, entraine la dégradation des PHD1/3 Augmentation de la stabilité
(Simon 2004) (Skuli et al. 2006)
Métabolites α-cétoglutarate HIF-1α /2α Diminution de la stabilité (cofacteur des PHD) (Schofield and Zhang 1999,
Stolze et al. 2006) Ascorbate HIF-1α /2α Diminution de la stabilité (cofacteur des PHD) (Stolze et al. 2006) Fe(II) HIF-1α /2α Diminution de la stabilité (cofacteur des PHD) (Schofield and Zhang 1999,
Stolze et al. 2006) IRP HIF-2α Diminution de la traduction en absence de fer (Zimmer et al. 2008) NO HIF-1α /2α Augmentation ou diminution de la stabilité (Sogawa et al. 1998, Metzen
et al. 2003b) Facteurs de croissance EGF, FGF, IGF1/2 HIF-1α Augmentation de l’expression (Feldser et al. 1999) Héréguline HIF-1α Augmentation de la traduction (Laughner et al. 2001) Voies de signalisation oncogéniques PI3K/Akt/mTOR HIF-1α/2α Augmentation de la traduction (Mottet et al. 2003a) MAPK HIF-1α /2α Augmentation de l’expression (Baldewijns et al. 2010) NF-κB HIF-1α Augmentation de la transcription (Rius et al. 2008) β-caténine HIF-1α Augmentation de l’activité transcriptionnelle (Kaidi et al. 2007) Gènes suppresseurs de tumeur p53 HIF-1α /1β Diminution de l’expression (Blagosklonny et al. 1998,
Majmundar et al. 2010) PTEN HIF-1α /1β Diminution de la transcription (Zhong et al. 2000) TSC1/2 HIF-1α /2α Diminution de l’expression (Liu et al. 2003b,
Baldewijns et al. 2010) SDH/FH mutés HIF-1α Augmentation de la stabilité (King et al. 2006) GSK3β HIF-1α Diminution de la stabilité (Mottet et al. 2003a) Hormones Insuline HIF-1α Augmentation de la traduction (Zhou et al. 2007) Angiotensine II HIF-1α Augmentation de la transcription et de la
traduction (Page et al. 2002)
Cytokines IL-4 HIF-1α /2α Diminution de l’expression (Dehne et al. 2014) Interferon-γ HIF-1α /2α Augmentation de l’expression (Majmundar et al. 2010)
51!
CITED2 : CBP/p300-interacting transactivator 2 ; CHIP : carboxyl terminus of HSP70-interacting protein ; COMMD1 : copper metabolism MURR1 domain-containing protein 1 ; FH : fumarate hydratase ; GSK3β : glycogen synthase kinase 3β ; IRP : iron regulatory protein ; NO : nitric oxide ; PARP1 : poly(ADP-ribose) polymérase 1 ; PTEN : phosphatase and tensin homolog ; RSUME : RWD domain-containing protein SUMO enhancer ; S1P : sphingosine 1-phosphate ; SIAH1/2 : seven in absentia homolog 1/2 ; SDH : succinate déshydrogénase ; SENP1 : SUMO1/sentrin specific peptidase 1 ; TSC1/2 : tuberous sclerosis scomplex 1/2.
!
Régulateur Cible(s) Effet(s)(biologique(s)(sur(HIF4α ! Référence(s)!Protéines chaperonnes et partenaires HSP90 HIF-1α Augmentation de la stabilité (Isaacs et al. 2002) RACK1 HIF-1α Diminution de la stabilité (Liu and Semenza 2007) HSP70/CHIP HIF-1α Diminution de la stabilité (Luo et al. 2010) MicroARNs miR-107 miR-17-92, miR-199a, miR-519c
HIF-1β HIF-1α
Diminution de l’expression Diminution de l’expression
(Taguchi et al. 2008, Rane et al. 2009, Yamakuchi et al. 2010) (Cha et al. 2010)
miR-145 HIF-2α Diminution de l’expression (Zhang et al. 2014a) Sirtuines Sirtuine 1 HIF-1α /2α Diminution de l’activité transcriptionnelle de
HIF-1α et augmentation de celle de HIF-2α (Keith et al. 2012), (Dioum et al. 2009)
Sirtuine 3 Sirtuine 6 Sirtuine 7
HIF-1α HIF-1α HIF-1α /2α
Diminution de la stabilité Diminution de l’activité transcriptionnelle Diminution de l’expression
(Finley et al. 2011) (Zhong et al. 2010) (Hubbi et al. 2013)
Autres HAF HIF-1α/2α Diminution de la stabilité de HIF-1α et
augmentation de l’activité transcriptionnelle de HIF-2α
(Koh et al. 2008a)
RSUME SENP1
HIF-1α HIF-1α
Augmentation de la stabilité, favorise la sumoylation Augmentation de la stabilité, élimine les motifs de sumoylation
(Carbia-Nagashima et al. 2007, Cheng et al. 2007)
CITED2 COMMD1
HIF-1α HIF-1α
Diminution de l’activité transcriptionnelle Diminution de la stabilité et inhibition de la liaison avec HIF-1β
(Bakker et al. 2007, van de Sluis et al. 2009, van de Sluis et al. 2010)
PARP1 HIF-1α /2α Augmentation de l’activité transcriptionnelle de HIF-1α, augmentation de la transcription et de la stabilité de HIF-2α
(Elser et al. 2008) (Gonzalez-Flores et al. 2014)
S1P Hypoxie intermittente
HIF-1α HIF-1α /2α
Augmentation de la stabilité de HIF-1α Augmentation de la stabilité de HIF-1α et diminution de celle de HIF-2α
(Michaud et al. 2009, Kalhori et al. 2013) (Peng et al. 2006, Nanduri et al. 2009)
52!
4. Rôle des facteurs HIF en physiologie et physiopathologie
Les facteurs de transcription HIF-1 et HIF-2 régulent plus de 200 gènes cibles impliqués dans des
processus biologiques fondamentaux tels que la survie, la prolifération et le métabolisme
cellulaire ainsi que l’angiogenèse. Par conséquent, ces facteurs sont impliqués dans de
nombreuses conditions physiologiques et pathologiques. Ils jouent ainsi un rôle crucial dans
l’embryogenèse, sont associés à certaines maladies métaboliques, cardiovasculaires et
inflammatoires, et sont impliqués dans la progression tumorale (Majmundar et al. 2010, Semenza
2012a, Semenza 2014b).
Bien que HIF-1 et HIF-2 aient des gènes cibles en commun, de nombreuses études ont mis en
évidence que chacun de ces facteurs régule également des gènes cibles de manière spécifique (Hu
et al. 2003, Patard et al. 2003, Keith et al. 2012) (Tableau 4). Cette spécificité transcriptionnelle
s’expliquerait par les différences qui existent entre les domaines N-TAD de HIF-1α et HIF-2α et
qui leur confèrerait la capacité d’interagir avec différents cofacteurs afin de réguler
spécifiquement l’expression de certains gènes (Hu et al. 2007).
53!
Tableau 4. Principaux gènes cibles communs et spécifiques aux facteurs HIF-1 et HIF-2.
Gène/ Protéine Fonction Modèle(s) Référence(s) Gènes cibles de HIF-1 et HIF-2 SLC2A1/ GLUT1 Transport du glucose RCC, mCSE (Chen et al. 2001, Hu et
al. 2003) PLIN2/ ADRP Métabolisme lipidique RCC (Hu et al. 2003) CA12/CAXII Régulation du pH RCC (Hu et al. 2003) FLG/Filagrin Structure du cytosquelette RCC (Hu et al. 2003) IL6/IL-6 Immunité et inflammation RCC (Hu et al. 2003) ADM/Adrénomédulline Angiogenèse RCC (Hu et al. 2003) VEGFA/VEGF-A Angiogenèse RCC, cellules
Hep3B (Hu et al. 2003, Raval et al. 2005, Hu et al. 2007)
FLT1/VEGFR1 Angiogenèse hCE (Dutta et al. 2008) SERPINE1/PAI-1 Angiogenèse Cellules HepG2 (Geis et al. 2015) Gènes cibles de HIF-1 VEGFA/VEGF-A Angiogenèse mCSE, mCE (Iyer et al. 1998, Ryan et
al. 1998, Tang et al. 2004) BNIP3/BNIP3 Autophagie et apoptose RCC (Raval et al. 2005) HK1/Hexokinase 1 Glycolyse mCSE (Iyer et al. 1998, Ryan et
al. 1998) HK2/Hexokinase 2 Glycolyse RCC, mCSE (Iyer et al. 1998, Ryan et
al. 1998, Hu et al. 2003) PFK/Phosphofructokinase Glycolyse RCC, mCSE (Iyer et al. 1998, Ryan et
al. 1998, Hu et al. 2003) ALDOA/ALDA Glycolyse RCC, mCSE (Iyer et al. 1998, Ryan et
al. 1998, Hu et al. 2003) PGK1/PGK1 Glycolyse RCC, mCSE (Iyer et al. 1998, Ryan et
al. 1998, Hu et al. 2003) LDHA/LDHA Glycolyse RCC, mCSE (Firth et al. 1995) NOS2/(iNOS) Production de NO Macrophages (Takeda et al. 2010) IGF2/IGF2 Facteur de croissance MEF (Feldser et al. 1999) Gènes cibles de HIF-2 ABL2/ARG Inhibition de la production de NO Macrophages (Takeda et al. 2010) EPO/Erythropoïétine Erythropoïèse Rein, foie (Rankin et al. 2007,
Kapitsinou et al. 2010) POU5F1/OCT4 Identité des cellules souches mCSE (Covello et al. 2006) TGFA/TGFα Facteur de croissance RCC (Gunaratnam et al. 2003,
Raval et al. 2005) CCND1/Cycline D1 Progression du cycle cellulaire RCC (Raval et al. 2005) DLL4/DLL4 Voie de signalisation Notch mCE (Skuli et al. 2009) ANGPT2/angiopoïétine 2 SPHK1/SphK1
Remodellage des vaisseaux sanguins Prolifération et survie cellulaire
mCE Gliome
(Skuli et al. 2009) (Anelli et al. 2008)
ADRP : adipose différenciation-related protein ; ALDA : fructose-bisphosphate aldolase A ; ARG : Abelson-related gene protein ; CA : carbonic anhydrase ; DLL4 : delta-like 4 ; GLUT1 : glucose transporter 1 ; IGF2 : insulin growth factor 2 ; iNOS : inducible nitric oxide synthase ; LDHA : lactate déshydrogénase A ; mEC : mouse endothelial cells; mESC : mouse embryonnic stem cells; MEF : mouse embryonic fibroblasts ; NO : nitric oxide ; NOS : nitric oxide synthases ; PAI-1 : plasminogen activator inhibitor 1 ; PGK1 : phosphoglycerate kinase 1 ; PLIN2 : perilipin 2 ; RCC : rénal cell carcinoma ; TGF : transforming growth factor ; VEGF(R) : vascular endothélial growth factor (receptor).
54!
4.1. Les facteurs HIF dans le développement et l’embryogenèse
Chez les mammifères, l’embryogenèse a généralement lieu en condition d’hypoxie (1 à 5%
d’oxygène) (Dunwoodie 2009). De manière précoce lors du développement, la diffusion passive
de l’oxygène va être limitée, entrainant la mise en place d’un gradient de concentration impliqué
dans le bon développement de l’embryon, en particulier de ses systèmes cardiovasculaire et
respiratoire (Semenza 2012a). L’importance cruciale des facteurs HIF dans l’embryogenèse a été
mise en évidence par l’établissement de modèles animaux KO pour Hif-1α ou Hif-2α.
Les souris Hif-1α-/- présentent un arrêt du développement au jour E8,5 et meurent au jour E10,5
en raison de malformations cardiaques, de défauts vasculaires et d’une altération de
l’érythropoïèse. Ainsi, ces trois composants du système cardiovasculaire sont dépendants de HIF-
1α pour leur bon développement (Iyer et al. 1998). Les souris Hif-1α+/-, quant à elles, se
développent normalement mais ne sont pas capables de s’adapter à une hypoxie chronique (Yu et
al. 1999). Enfin, les KO conditionnels de Hif-1α dans différents types cellulaires montrent que
HIF-1α joue un rôle important dans l’adipogenèse, la chondrogenèse, l’ostéogenèse et dans
l’immunité (Schipani et al. 2001, Yun et al. 2002, Wang et al. 2007, Zinkernagel et al. 2007).
En fonction du fond génétique des souris utilisées, les souris Hif-2α-/- meurent au stade
embryonnaire (≈E12,5) en raison de défauts vasculaires ou d’une forte bradychardie liée à une
trop faible production de catécholamines ; meurent rapidement après leur naissance en raison
d’un défaut de maturation des poumons ; ou bien meurent après plusieurs mois suite à une
défaillance de différents organes causée par une production excessive de ROS (Tian et al. 1998,
Peng et al. 2000, Compernolle et al. 2002, Scortegagna et al. 2003).
Ces travaux montrent que HIF-1α et HIF-2α ont des rôles non redondants et cruciaux dans le
développement du système cardiovasculaire.
Concernant la sous-unité HIF-β, une étude a montré que les souris Hif-1β-/- meurent au stade
E10,5 en raison de défauts vasculaires (Maltepe et al. 1997).
4.2. Les facteurs HIF dans le métabolisme glucidique et lipidique
4.2.1. Le métabolisme glucidique
En conditions d’hypoxie, le manque d’oxygène ne permet pas aux cellules de réaliser la
phosphorylation oxydative, principal mécanisme de production de l’énergie cellulaire. Elles
doivent donc réorienter leur métabolisme vers des mécanismes de production d’ATP ne
55!
nécessitant pas d’oxygène, tel que la glycolyse (Goda and Kanai 2012). HIF-1 est un acteur clé de
cette reprogrammation métabolique puisqu’il contrôle l’expression de GLUT1 (Glucose Transporter
1), un transporteur du glucose, ainsi que celle de nombreuses enzymes de la glycolyse (Chen et al.
2001, Wenger 2002) (Figure 10). La PDK1 (pyruvate deshydrogenase kinase 1), dont l’expression est
régulée positivement par HIF-1, intervient à la fin de la glycolyse en inhibant la conversion du
pyruvate en acétyl-CoA (acetyl-Coenzyme A), ce qui limite la consommation d’oxygène par la
mitochondrie (Kim et al. 2006a, Papandreou et al. 2006). A l’inverse, lorsque HIF-1α est inhibé en
hypoxie, des quantités importantes d’acétyl-CoA sont générées entrainant l’activation du cycle de
Krebs malgré l’absence d’oxygène, ce qui aboutit à la production de ROS (Kim et al. 2006a, Zhang
et al. 2008a). La reprogrammation métabolique en faveur de la glycolyse permet donc aussi de
limiter la production de ROS qui résulte du mauvais fonctionnement de le la chaine de transfert
d’électrons de la mitochondrie en absence d’oxygène. Des études ont montré que HIF-1 régule
également la voie des pentoses-phosphates qui convertit des intermédiaires de la glycolyse en
ribose-5-phosphate, un substrat utilisé pour la synthèse des nucléotides (Tong et al. 2009). Ainsi,
HIF-1 facilite la survie et la croissance cellulaire lors du stress hypoxique en favorisant à la fois la
production d’énergie et la synthèse d’acides nucléiques à partir de la glycolyse (Figure 10).
Bien que l’expression de la plupart des protéines impliquées dans le métabolisme du glucose
soient régulées par HIF-1 (Hu et al. 2003, Raval et al. 2005), HIF-2 joue un rôle important dans le
métabolisme glucidique. En effet, une étude a montré que HIF-1 et HIF-2 régulent tout deux
l’expression de la cytochrome c oxydase afin de maximiser l’efficacité de la chaine de transfert
d’électrons de la mitochondrie (Gordan et al. 2007b). De plus, HIF-2 régulerait spécifiquement
l’expression de la SOD2 (superoxide dismutase 2), une enzyme antioxydante, et supprimerait ainsi
l’accumulation aberrante de ROS dans la cellule (Gordan et al. 2007b). Enfin, la PDK4 serait
régulée spécifiquement par HIF-2, qui limiterait ainsi la production d’acétyl-CoA et le
fonctionnement du cycle de Krebs (Huang et al. 2002).
56!
Figure 10. Rôles des facteurs HIF dans la régulation du métabolisme glucidique et lipidique. ATP : adénosine triphosphate ; CTE : chaine de transfert d’électrons; HMOX1 : heme oxygenase decycling 1 ; LDHA : lactate deshydrogenase A ; PDK : pyruvate deshydrogenase kinase ; PPP : pentose phosphate pathway ; R5P : ribose-5-phosphate ; ROS : reactive oxygen species ; SOD : superoxide dismutase 2. Adapté de Majmundar, 2010.
4.2.2. Le métabolisme lipidique
Les lipides constituent une importante source d’énergie dans la cellule, via la β-oxydation,
principale voie de dégradation des acides gras, et la phosphorylation oxydative. Le stress
hypoxique modifie le métabolisme lipidique en inhibant la dégradation des lipides et en
favorisant leur stockage. En effet, une étude a montré que l’activation constitutive de HIF-2 induit
une diminution de la β-oxydation et une augmentation du stockage des lipides au niveau du foie
(Rankin et al. 2009) (Figure 10).
57!
4.3. Les facteurs HIF dans le système cardiovasculaire
Les facteurs HIF jouent un rôle essentiel dans le développement embryonnaire du système
cardiovasculaire (Hu et al. 2003, Covello and Simon 2004, Manalo et al. 2005), mais sont également
impliqués dans l’homéostasie cardiovasculaire chez l’adulte, en particulier lors de l’angiogenèse.
En effet, en réponse à l’hypoxie, HIF-1 et HIF-2 régulent l’expression de nombreux gènes
impliqués dans le transport de l’oxygène, l’angiogenèse, le remodelage et l’intégrité vasculaire.
HIF-1 et HIF-2 contrôlent ainsi l’expression du VEGF, mais aussi de l’EPO, des angiopoïétines 1 et
2, du PDGFβ, ou encore du PlGF (Hu et al. 2003, Kelly et al. 2003, Rankin et al. 2007, Simon et al.
2008, Schito et al. 2012, Semenza 2014a).
Les cellules endothéliales sont particulièrement impliquées dans le processus de néoangiogenèse,
et sont donc sensibles à l’activation des facteurs HIF. Une étude a ainsi montré que l’induction de
HIF-1α en hypoxie entraine la formation de tubes par des cellules endothéliales in vitro
(Yamakawa et al. 2003). De plus, il a été montré in vivo que la délétion spécifique de HIF-1α dans
les cellules endothéliales entraine des défauts de croissance des vaisseaux sanguins en hypoxie.
De telles cellules endothéliales présentent des défauts de production du VEGF et d’activation du
VEGFR2, ainsi qu’une diminution de leur prolifération et de leur migration en hypoxie (Tang et
al. 2004).
HIF-2α est quant à lui fortement exprimé dans les cellules endothéliales lors de l’embryogenèse
(Ema et al. 1997). Une étude in vivo a montré que des souris délétées pour HIF-2α dans les cellules
endothéliales se développent normalement mais présentent une variété de phénotypes aberrants,
tels qu’une augmentation de la perméabilité vasculaire et une diminution de la lumière et de la
perfusion vasculaire (Skuli et al. 2009, Skuli et al. 2012). HIF-2α jouerait donc un rôle
fondamental dans la formation de vaisseaux sanguins fonctionnels par les cellules endothéliales.
Les facteurs HIF sont également impliqués dans de nombreuses pathologies du système
cardiovasculaire dans lesquelles l’homéostasie de l’oxygène est perturbée. HIF-1α a par exemple
été impliqué dans le processus de néoangiogenèse lors de la reperfusion des zones hypoxiques
qui a lieu suite à un événement ischémique. Ainsi, dans un modèle d’ischémie des membres
inférieurs, les souris Hif-1α+/- présentent une diminution de l’induction de HIF-1α, ce qui a pour
conséquences une diminution de l’activation de facteurs pro-angiogéniques et une diminution de
la reperfusion du membre inférieur par rapport aux souris sauvages. A l’inverse, l’expression
d’une forme constitutivement active de HIF-1α améliore la reperfusion (Bosch-Marce et al. 2007).
La surexpression de HIF-1α favorise ainsi la protection tissulaire suite à une ischémie ou à un
58!
infarctus du myocarde, alors que son inhibition entraine une augmentation de la perte tissulaire
suite aux mêmes événements (Shohet and Garcia 2007). Un rôle pro-angiogénique de HIF-1α a
également été décrit dans la cardiomyopathie hypertrophique, la cicatrisation et la
néovascularisation rétinienne (Semenza 2014b).
De nombreuses études cliniques et pré-cliniques ont ainsi mis en évidence un rôle protecteur des
facteurs HIF dans l’ischémie des membres inférieurs et l’infarctus du myocarde, ainsi que dans la
cicatrisation et le rejet de greffe (Botusan et al. 2008, Cai et al. 2008, Bernhardt et al. 2009, Jiang et al.
2011, Wilkes 2011). A l’inverse, les facteurs HIF contribuent au développement de l’hypertension
artérielle pulmonaire, de la néovascularisation rétinienne et de la cardiomyopathie chez les sujets
obèses (Brusselmans et al. 2003, Yoshida et al. 2010a, Lin et al. 2013). Enfin, leur rôle dans
l’insuffisance cardiaque liée à une augmentation de la pression artérielle est moins clair (Semenza
2014b).
4.4. Les facteurs HIF dans les cancers
Les études immunohistochimiques révèlent que dans la grande majorité des cancers, l’expression
de HIF-1α, de HIF-2α, ou de ces deux sous-unités est plus élevée dans le tissu tumoral que dans
le tissu sain (Zhong et al. 1999, Talks et al. 2000). Une telle augmentation de l’expression des
facteurs HIF est très souvent corrélée à un mauvais pronostic (Keith et al. 2012, Semenza 2014b)
(Tableau 5).
59!
Tableau 5. Corrélation entre l’expression intratumorale de HIF-α et le pronostic de survie des patients. Type de cancer Pronostic Référence(s) Expression de HIF-1α Expression de HIF-2α Cancers du système nerveux central Astrocytome Mauvais Mauvais (Korkolopoulou et al. 2004)
(Scrideli et al. 2007) Glioblastome Non déterminé Mauvais (Scrideli et al. 2007) Gliome Non corrélé Mauvais (Li et al. 2009) Oligodendrogliome Mauvais Non déterminé (Birner et al. 2001) Neuroblastome Bon Mauvais (Noguera et al. 2009) Cancers du système disgestif Carcinome oesophagien Mauvais Non déterminé (Tzao et al. 2008, Ping et al.
2014) Adénocarcinome gastrique Mauvais Mauvais (Mizokami et al. 2006,
Griffiths et al. 2007, Lin et al. 2014b, Tong et al. 2015)
GIST Mauvais Non déterminé (Takahashi et al. 2003) Adénocarcinome colorectal Mauvais Mauvais (Yoshimura et al. 2004,
Rasheed et al. 2009) Hépatocarcinome Non déterminé Mauvais (Bangoura et al. 2007) Adénocarcinome pancréatique
Mauvais Non déterminé (Shibaji et al. 2003)
Cancers du système respiratoire Carcinome des voies aériennes supérieures
Mauvais Mauvais (Koukourakis et al. 2002, Winter et al. 2006)
NSCLC Mauvais Mauvais (Giatromanolaki et al. 2001, Kim et al. 2005, Wu et al. 2011)
Cancers du système hématopoïétique Leucémie myéloïde aigüe Mauvais Non déterminé (Deeb et al. 2011) Leucémie lymphoblastique aigüe
Mauvais Non déterminé (Frolova et al. 2012)
Cancers du système urinaire Carcinome vésical Mauvais Non déterminé (Theodoropoulos et al.
2004) Adénocarcinome rénal Mauvais Mauvais (Klatte et al. 2007, Kroeger
et al. 2014, Minardi et al. 2015)
Bon Non déterminé (Lidgren et al. 2005) Cancers du système reproducteur et associés Adénocarcinome mammaire Mauvais Mauvais* (Helczynska et al. 2008,
Yamamoto et al. 2008, Rundqvist and Johnson 2013, Wang et al. 2014b)
Carcinome ovarien Mauvais Mauvais* (Osada et al. 2007, Daponte et al. 2008)
Carcinome utérin Mauvais Mauvais (Birner et al. 2000, Kawanaka et al. 2008, Huang et al. 2014)
Adénocarcinome prostatique Mauvais Mauvais* (Nanni et al. 2009) Cancers de la peau Mélanome Mauvais Mauvais (Giatromanolaki et al. 2003) GIST : gastrointestinal stromal tumor ; NSCLC : non-small-cell lung carcinoma ; *Corrélation avec l’expression cytoplasmique de HIF-2α.
60!
Divers mécanismes contribuent à l’augmentation de l’activité des facteurs HIF dans les cancers,
parmi lesquels l’adaptation à l’hypoxie intratumorale et les altérations génétiques des cellules
cancéreuses. En effet, la multiplication des cellules tumorales qui prolifèrent plus rapidement que
le réseau vasculaire associé, la limite de diffusion de l’oxygène, et l’irrégularité spatiale et
temporelle du flux sanguin dans la tumeur entrainent la formation de zones d’hypoxie
intratumorale qui permettent la stabilisation des facteurs HIF. L’hypoxie intratumorale, qui
constitue un facteur de mauvais pronostic, est une caractéristique de la majorité des tumeurs
localement avancées qui sont toujours plus hypoxiques que le tissu sain dont elles dérivent
(Vaupel and Mayer 2007). D’autres conditions microenvironnementales, telles que les ROS,
peuvent également induire l’expression de HIF-1α dans les tumeurs (Gao et al. 2007). D’autre
part, l’activité des facteurs HIF dans les cellules tumorales peut être induite par des altérations
génétiques, indépendamment de la concentration en oxygène. Ainsi, l’activation d’oncogènes, tels
que la voie PI3K/Akt/mTOR, ou la perte de fonction de gènes suppresseurs de tumeur, tels que
pVHL, p53 et PTEN, favorise l’expression des facteurs HIF dans les tumeurs (Maxwell et al. 1999,
Ravi et al. 2000, Zhong et al. 2000, Zundel et al. 2000, Laughner et al. 2001).
De nombreuses études ont montré que les gènes cibles de HIF jouent des rôles importants dans
tous les aspects du cancer. Cependant, dans une cellule cancéreuse donnée, seulement certains
gènes cibles sont exprimés et vont déterminer les conséquences de l’activation de HIF. C’est ainsi
que ces facteurs régulent la dédifférenciation, la survie, la prolifération et le métabolisme des
cellules tumorales, l’angiogenèse, l’invasion et la dissémination métastatique, tout en favorisant
l’induction d’un microenvironnement immunosuppressif (Semenza 2014b).
4.4.1. Le maintien d’un phénotype dédifférencié
Des études ont montré que de nombreuses tumeurs contiennent des cellules souches cancéreuses
(CSC) responsables de l’initiation et de la maintenance de la croissance tumorale, ainsi que de la
résistance aux traitements (Lapidot et al. 1994, Singh et al. 2004, Ishikawa et al. 2007, Chen et al.
2012, Skuli et al. 2012). De telles cellules présentent une forte capacité d’auto-renouvellement, de
différenciation et d’ancrage, sont pluripotentes, et peuvent facilement migrer à distance pour
former des métastases (Chen et al. 2012). Il a été proposé qu’un environnement hypoxique serait
nécessaire à la fonction des CSC (Keith and Simon 2007). En effet, des études réalisées dans
plusieurs modèles de cancers ont montré que l’hypoxie favorise l’agressivité tumorale en
induisant la dédifférenciation spontanée des cellules tumorales qui acquièrent ainsi des
propriétés de cellules souches (Axelson et al. 2005, Mazumdar et al. 2009). Par la suite, une équipe
61!
a montré que l’induction de HIF-2α en hypoxie, et non celle de HIF-1α, est cruciale pour assurer
la tumorigénicité de cellules souches de gliomes (Li et al. 2009). L’hypoxie, via l’activation de HIF-
2α en particulier, induit en effet l’expression par les CSC de facteurs normalement exprimés par
les cellules souches embryonnaires, tels que OCT4 (Octamer-binding transcription factor 4) et SOX2
((Sex determining region Y)-box 2), ainsi que l’expression d’autres facteurs de pluripotence tels que
Nanog, KLF4 (Kruppel-Like Factor 4) et c-Myc (Koh et al. 2011, Mathieu et al. 2011, Philip et al.
2013).
4.4.2. La survie et la prolifération cellulaire
Les facteurs HIF influencent la survie et la prolifération des cellules tumorales selon plusieurs
mécanismes. Quatre d’entre eux sont détaillés ci-dessous.
D’une part, dans les cellules tumorales, les facteurs HIF activent la transcription de nombreux
gènes codant pour des facteurs de croissance, tels que le VEGF, l’IGF2 ou encore le TGF-α. Ces
facteurs peuvent se lier à leurs récepteurs de manière autocrine ou paracrine afin de favoriser la
prolifération et la survie cellulaire (Forsythe et al. 1996, Feldser et al. 1999, Semenza 2014b).
D’autre part, à l’inverse des cellules saines, les cellules tumorales se divisent de façon illimitée, en
particulier grâce à la maintenance des télomères. Or, une étude effectuée dans un modèle de
cancer de l’utérus a montré que HIF-1 entraine l’activation de TERT (Telomerase Reverse
Transcriptase), une enzyme capable de rallonger les télomères (Yatabe et al. 2004).
Le facteur de transcription c-Myc est surexprimé dans la majorité des tumeurs humaines. En
formant un hétérodimère avec MAX (Myc-Associated factor X), il favorise la prolifération cellulaire
en régulant la transition G1/S du cycle cellulaire. Des études ont montré que HIF-2α, à l’inverse
de HIF-1α, stabilise l’interaction entre c-Myc et MAX ce qui favorise la liaison de c-Myc à l’ADN
de ses gènes cibles et donc son pouvoir oncogénique (Koshiji et al. 2004, Gordan et al. 2007b,
Gordan et al. 2008).
Le gène suppresseur de tumeur p53, impliqué dans la réparation de l’ADN, l’arrêt du cycle
cellulaire ou encore l’apoptose, est muté ou délété dans la plupart des cancers. Alors que
plusieurs études ont montré que HIF-1α induit la stabilisation de p53 dans des modèles
tumoraux, ainsi qu’en réponse à la radiothérapie, d’autres études ont montré que HIF-2α inhibe
la fonction de p53 dans des modèles d’adénocarcinomes rénaux, favorisant ainsi la survie
cellulaire, la radio- et la chimiorésistance (An et al. 1998, Chen et al. 2003, Bertout et al. 2009,
Roberts et al. 2009).
62!
4.4.3. La reprogrammation métabolique
Il existe des différences majeures entre le métabolisme glucidique des cellules saines et celui des
cellules tumorales. De telles modifications métaboliques ont été identifiées en 1956 par Otto
Warburg, qui a montré que les cellules saines utilisent la glycolyse et la phosphorylation
oxydative pour produire respectivement 10% et 90% de l’ATP dont elles ont besoin, alors que
dans les cellules tumorales, 50% de l’énergie est produite par la glycolyse, et 50% par la
phosphorylation oxydative (Warburg 1956). Une telle reprogrammation métabolique a
logiquement lieu lorsque les cellules tumorales sont en conditions hypoxiques. Or, de manière
intéressante, cette reprogrammation a également lieu lorsque les cellules tumorales sont en
présence de suffisamment d’oxygène pour assurer la fonction mitochondriale. Les cellules
tumorales privilégient ainsi la glycolyse aérobie, c’est l’effet Warburg, puisqu’elle leur confère de
nombreux avantages, en favorisant notamment leur survie et leur migration (Warburg 1956,
Denko 2008).
Le facteur HIF-1 a été impliqué dans la régulation de nombreux gènes responsables de la
reprogrammation métabolique (Figure 10). En effet, HIF-1 favorise la glycolyse en augmentant
l’expression des transporteurs de glucose GLUT1 et GLUT3 et des enzymes de la glycolyse (Iyer
et al. 1998, Chen et al. 2001, Wenger 2002). Des quantités accrues de pyruvate sont ainsi générées.
HIF-1 favorise la conversion du pyruvate en lactate en induisant l’expression de la LDHA (Lactate
Dehydrogenase A), ainsi que l’export de ce dernier vers le milieu extracellulaire en favorisant
l’expression de MCT4 (Monocarboxylate Transporter 4) (Firth et al. 1995, Ullah et al. 2006).
L’excrétion de lactate, tout comme l’expression de CAIX (Carbonic Anhydrase IX), un gène cible de
HIF-1, participe à l’acidification du milieu extracellulaire qui favorise la survie des cellules
tumorales et leur confère des capacités migratoires et invasives (Walenta and Mueller-Klieser
2004, Trastour et al. 2007). D’autre part, HIF-1 diminue la fonction mitochondriale, et donc la
phosphorylation oxydative, en induisant l’expression de la PDK1 qui empêche la conversion du
pyruvate en acétyl-CoA dans la mitochondrie (Kim et al. 2006b, Papandreou et al. 2006). HIF-1
diminue également la biogenèse mitochondriale en induisant l’expression de MXI1 (MAX
Interactor 1) qui inactive c-Myc (Zhang et al. 2007). Une telle réduction de l’activité mitochondriale
entraine une diminution de la production de ROS et favorise la préservation de certains substrats
anaboliques, ce qui est favorable pour la cellule tumorale (Denko 2008).
63!
4.4.4. L’induction d’un microenvironnement immunosuppressif
Les cellules tumorales hypoxiques sont capables d’échapper au système immunitaire de l’hôte et
d’induire un microenvironnement immunosuppressif grâce à plusieurs mécanismes. Quatre
d’entre eux sont détaillés ci-dessous.
En premier lieu, HIF-1α favorise l’expression de CD39 et CD73, deux protéines de surface des
lymphocytes T, qui catalysent la formation d’adénosine. Cette dernière se lie à ses récepteurs A2R
(Adenosine 2 Receptors) ce qui a pour conséquences l’augmentation du taux intracellulaire d’AMPc
et l’inhibition des fonctions cytotoxiques des lymphocytes T effecteurs (Synnestvedt et al. 2002,
Sitkovsky and Ohta 2013). D’autre part, une étude a montré que l’expression de HIF-1α par les
macrophages associés à la tumeur inhibe la fonction des lymphocytes T et favorise la croissance
tumorale (Doedens et al. 2010). De même, les MDSC (Myeloid-Derived Suppressor Cell) recrutées
dans les régions hypoxiques des tumeurs inhiberaient la prolifération des lymphocytes T et leur
production d’interferon-γ selon un mécanisme dépendant de HIF-1α (Corzo et al. 2010). Enfin,
dans les cellules tumorales, HIF-1α induit l’expression de la chimiokine CCL28 (C-C motif ligand
28) qui permet le recrutement les lymphocytes T régulateurs, acteurs de la tolérance immunitaire
(Facciabene et al. 2011).
4.4.5. L’angiogenèse tumorale
Afin de subvenir à leurs besoins en oxygène et en nutriments, et de pouvoir croître au-delà d’une
taille microscopique, les tumeurs doivent établir leur propre réseau vasculaire (Folkman and
Hanahan 1991). La néoangiogenèse est en effet essentielle à la progression tumorale et est induite
par les cellules tumorales lors du switch angiogénique (Folkman and Hanahan 1991). Celui-ci a
lieu lorsque les cellules tumorales produisent plus de facteurs pro-angiogéniques que de facteurs
anti-angiogéniques. Les facteurs HIF sont des acteurs cruciaux de ce switch puisqu’ils induisent
l’expression du VEGF, des angiopoïétines 1 et 2, du PDGFβ, du PGF, du SCF (Stem Cell Factor), du
PAI-1, des MMP 2 et 9, et diminuent celle de la thrombospondine (Carmeliet and Jain 2000,
Hickey and Simon 2006). L’ensemble de ces facteurs exerce leur action pro-angiogénique sur les
cellules endothéliales, les péricytes, et les progéniteurs endothéliaux qui expriment les récepteurs
apparentés : VEGFR2, TIE-2, PDGFRβ, etc. Des études ont ainsi montré que l’inhibition de
l’activité transcriptionnelle de HIF-1 entraine une diminution de la vascularisation et de la
croissance tumorale in vivo (Lee et al. 2009a, Lee et al. 2009b). De même, HIF-2α a été impliqué
64!
dans l’angiogenèse tumorale, en particulier dans les adénocarcinomes rénaux où il jouerait un
rôle plus important que HIF-1α (Raval et al. 2005).
Cependant, l’excès de facteurs pro-angiogéniques produits par les cellules tumorales aboutit à la
formation d’un réseau vasculaire tumoral structurellement et fonctionnellement anormal qui ne
permet pas d’oxygéner les cellules tumorales et qui entretient l’hypoxie intratumorale, et donc
l’activation des facteurs HIF, formant ainsi un cercle vicieux (Jain 2001).
4.4.6. L’invasion et la dissémination métastatique
La transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) est une étape clé dans l’acquisition d’un
phénotype invasif par les cellules tumorales qui pourront ensuite migrer à distance pour former
des métastases. La TEM consiste en la perte de l’adhérence entre les cellules et en une
augmentation de leur capacité de migration (Majmundar et al. 2010). Les facteurs HIF jouent un
rôle important dans ce processus en régulant notamment l’expression de la E-cadhérine, des
MMP, de la lysyl oxydase, de TWIST1 (Twist-related protein 1), de Snail1, de CXCR4 (C-X-C motif
Receptor 4) et de SDF1 (Stromal-Derived Factor 1) (Yang and Wu 2008, Majmundar et al. 2010, Mak
et al. 2010).
La E-cadhérine, qui favorise l’adhésion entre les cellules, limite le pouvoir invasif des cellules
tumorales. Une étude a montré que l’expression de HIF-1α suffit à induire la perte de l’expression
de la E-cadhérine et à augmenter la capacité invasive de cellules d’adénocarcinome rénal (Esteban
et al. 2006). A l’inverse, HIF-1α induit l’expression de la lysyl oxidase (LOX), une enzyme
responsable du remodelage de la matrice extracellulaire dont l’activation augmente le pouvoir
invasif des cellules tumorales et dont l’inhibition serait suffisante pour prévenir l’apparition de
métastases induites par l’hypoxie (Erler et al. 2006, Rodriguez et al. 2008). De plus, l’expression de
LOXL2 et LOXL4 (Lysyl Oxydase homolog 2/4) est aussi induite par HIF-1α. Les protéines LOX,
LOXL2 et LOXL4 participent également à la formation de la niche métastatique, en particulier via
le remodelage de la matrice extracellulaire et l’attraction de cellules dérivées de la moelle osseuse
(Wong et al. 2011, Wong et al. 2012). Des études ont mis en évidence que HIF-1 favorise
l’expression du récepteur CXCR4 et de son ligand SDF-1 dans les cellules endothéliales et dans
plusieurs lignées cellulaires tumorales (Staller et al. 2003, Ceradini et al. 2004, Zagzag et al. 2006).
Or, il a été montré que l’interaction entre CXCR4 et SDF-1 joue un rôle important dans la
migration des cellules tumorales vers leur site de métastase, CXCR4 étant exprimé par les cellules
tumorales et SDF-1 par le site métastatique (Arya et al. 2007).
65!
L’invasion des cellules tumorales dans un vaisseau sanguin, ou intravasation, est facilitée par la
perméabilité vasculaire induite par le VEGF et l’angiopoïétine 2, deux gènes cibles de HIF
(Dvorak et al. 1999, Falcon et al. 2009). Une fois dans la circulation sanguine, les cellules doivent
adhérer à la paroi du vaisseau sanguin. HIF-1 induit l’expression de L1CAM (L1 Cell Adhesion
Molecule) qui est impliquée dans ce processus, dit de margination (Zhang et al. 2012). La protéine
ANGPTL4 (Angiopoiétin-like 4) serait ensuite impliquée dans la diminution des interactions entre
les cellules endothéliales et favoriserait ainsi la migration des cellules tumorales vers le site de
métastase (Zhang et al. 2012). La sécrétion de PDGFβ, gène cible de HIF-1, par les cellules
tumorales faciliterait quant à elle la dissémination métastatique via les vaisseaux lymphatiques
(Schito et al. 2012).
5. L’hypoxie et les facteurs HIF comme cibles thérapeutiques en cancérologie
Largement impliqués dans l’initiation et la progression tumorale, l’hypoxie et les facteurs HIF
favorisent également la résistance aux thérapies anticancéreuses, telles que les chimiothérapies,
les radiothérapies et les thérapies ciblées (Comerford et al. 2002, Brown 2007, Zhao et al. 2010,
Wilson and Hay 2011, Samanta et al. 2014, Zhao et al. 2014). Leur importance thérapeutique en a
donc fait des cibles pertinentes pour le traitement des cancers, et a conduit à la mise au point de
nombreuses stratégies ciblant les cellules hypoxiques et les facteurs HIF.
5.1. Ciblage de l’hypoxie intratumorale : les prodrogues cytotoxiques
Les prodrogues cytotoxiques sont des molécules inactives qui sont réduites par des enzymes
endogènes en métabolite actif et cytotoxique. Afin de cibler uniquement les cellules hypoxiques,
ces prodrogues ont été élaborées de façon à être métabolisées uniquement en absence d’oxygène
(Wilson and Hay 2011).
Parmi elles, la tirapazamine (TPZ) est 50 à 200 fois plus toxique vis-à-vis des cellules hypoxiques
par rapport aux cellules « normoxiques » et présente des propriétés antitumorales (Brown 1993).
En hypoxie, la TPZ est réduite par une réductase endogène pour former le radical TPZ!. S’il se
retrouve en présence d’oxygène, l’électron libre de la TPZ! sera rapidement transféré à une
molécule d’oxygène qui formera ainsi un radical superoxide en régénérant la TPZ initiale (Figure
11). A l’inverse, si elle reste en condition d’hypoxie, la TPZ! va générer un radical libre OH! ou
66!
bien un radical benzotriazinyl (BTZ!). Les radicaux TPZ! et BTZ! seraient responsables de la
toxicité de la TPZ via la formation de cassures double brin au niveau de l’ADN et selon un
mécanisme dépendant de la topoisomérase II (Peters and Brown 2002). Une étude a montré que la
combinaison TPZ/cisplatine améliore la survie de patients atteints d’un cancer du poumon, en
comparaison avec le cisplatine seul (von Pawel et al. 2000). De plus, un essai clinique de phase II a
mis en évidence que la combinaison TPZ/cisplatine/radiothérapie, en comparaison avec la
combinaison 5-fluorouracile/cisplatine/radiothérapie, améliore la survie sans récidive de
patients atteints d’un cancer des voies aériennes et digestives supérieures (Rischin et al. 2005).
Cependant, la TPZ entraine des effets indésirables, tels que la neutropénie, et peut être activée
dans des tissus sains faiblement oxygénés, tels que la moelle osseuse. Enfin, un essai clinique de
phase III a montré que l’association TPZ/cisplatine/radiothérapie, en comparaison avec
l’association cisplatine/radiothérapie, n’apporte pas de bénéfice en terme de survie chez des
patientes atteintes d’un cancer de l’utérus localement avancé (DiSilvestro et al. 2014).
Figure 11. Mécanisme d’activation de la tirapazamine (TPZ).
Il existe d’autres prodrogues cytotoxiques, telles que le PR-104, l’AQ4N et le SN30000 qui font
l’objet d’études précliniques mais qui ne sont pas ou plus testées en clinique à ce jour.
5.2. Normalisation du réseau vasculaire tumoral
!5.2.1. Concept de normalisation vasculaire
L’utilisation clinique du bevacizumab en monothérapie n’a pas montré de bénéfice au niveau de
la survie globale des patients atteints de cancers avancés ou métastatiques. Par contre, des études
cliniques de phase III ont montré que l’association du bevacizumab avec une chimio- ou une
67!
immunothérapie confère un bénéfice de survie à ces patients (Browder et al. 2000, Jain 2001). Ces
données cliniques peuvent sembler paradoxales : pourquoi cet agent anti-angiogénique, qui
détruit le réseau vasculaire tumoral, est uniquement bénéfique via l’amélioration de l’efficacité de
thérapies qui dépendent de ce réseau vasculaire pour atteindre les cellules tumorales et exercer
leurs effets ? Afin de répondre à cette question, Rakesh Jain a proposé le concept de normalisation
vasculaire, selon lequel l’utilisation judicieuse des agent anti-angiogéniques, en terme de dose et
de temps de traitement, peut « normaliser » transitoirement le réseau vasculaire tumoral anormal
au lieu de le détruire, de manière à améliorer la perfusion vasculaire (Jain 2001) (Figure 12). Il en
résulterait une diminution de l’hypoxie intratumorale, qui favorise l’échec thérapeutique, et une
augmentation de l’acheminement des thérapies anti-cancéreuses au niveau de la tumeur. Ainsi,
l’administration de ces thérapies pendant la fenêtre d’oxygénation permettrait d’augmenter leur
efficacité (Jain 2001). De plus, l’élimination des cellules tumorales et stromales par des agents
anti-angiogéniques et cytotoxiques diminuerait la pression interstitielle et la compression des
vaisseaux sanguins tumoraux, améliorant encore la perfusion vasculaire. Enfin, le réseau
vasculaire tumoral normalisé limiterait l’échappement de cellules tumorales depuis la tumeur
primaire, diminuant potentiellement la dissémination métastatique (Jain 2005) (Figure 5).
Ce concept de normalisation vasculaire permet donc d’expliquer comment le bevacizumab
améliore l’efficacité des chimio- et immunothérapies, et propose de nouvelles stratégies pour
améliorer l’efficacité de telles associations (Jain et al. 2006).
5.2.2. Données précliniques et cliniques
De nombreuses études précliniques ont impliqué la normalisation vasculaire dans l’efficacité
thérapeutique induite par les anti-angiogéniques (Yuan et al. 1996, Izumi et al. 2002, Tong et al.
2004, Winkler et al. 2004). Par la suite, des études ont montré qu’outre le VEGF et les autres
facteurs pro-angiogéniques, de nombreuses protéines jouant un rôle dans la progression tumorale
peuvent être ciblées au niveau des cellules endothéliales, périvasculaire ou tumorales pour
induire une normalisation vasculaire transitoire ou prolongée (Jain 2014). C’est notamment le cas
des angiopoïétines et de leur récepteur Tie-2, de l’axe PDGF/PDGFR, de Notch, de l’oncogène B-
Raf, de la voie PI3K/Akt/mTOR, du senseur de l’oxygène PHD2 (Prolyl Hydroxylase Domain
containing protein 2) ou de la S1P (di Tomaso et al. 2009, Huang et al. 2010b, Goel et al. 2011, Bottos
et al. 2012, Jain 2014, Ader et al. 2015). Une étude a montré que la chloroquine, une molécule
utilisée en clinique pour ses propriétés antipaludiques, induit une normalisation vasculaire
dépendante de l’activation de Notch dans les cellules endothéliales, améliorant ainsi la perfusion
vasculaire et réduisant l’apparition de métastases (Maes et al. 2014). D’autre part, deux études in
68!
vivo originales effectuées à l’aide de souris génétiquement modifiées ont montré qu’une activité
réduite de la PHD2 dans les cellules endothéliales n’affecte pas l’angiogenèse physiologique mais
induit une normalisation des vaisseaux tumoraux associée à une oxygénation tumorale, à une
diminution de la dissémination métastatique et à une augmentation de l’efficacité de la
chimiothérapie (Mazzone et al. 2009, Leite de Oliveira et al. 2012). Enfin, une étude de notre
équipe a récemment montré que la neutralisation de la S1P chimiosensibilise un modèle murin de
cancer de la prostate en induisant une normalisation vasculaire et une oxygénation tumorale
transitoire, tout en réduisant la dissémination métastatique (Ader et al. 2015).
Une étude clinique effectuée chez des patients atteints d’un carcinome rectal a montré que
l’administration d’une dose unique de bevacizumab permet de diminuer la densité vasculaire
tumorale ainsi que la pression interstitielle et augmente le recouvrement péricytaire (Willett et al.
2004). Par la suite, une étude clinique de phase II effectuée chez des patients atteints d’un
glioblastome récurrent a montré que le cediranib, un inhibiteur des récepteurs VEGFR1, VEGFR2,
VEGFR3, PDGFRβ et c-Kit, normalise les vaisseaux sanguins tumoraux et présente un bénéfice
clinique en réduisant les œdèmes associés à la tumeur (Batchelor et al. 2007). Cette normalisation
vasculaire a lieu très rapidement après le début du traitement, est réversible mais est maintenue
pendant au moins 28 jours, ce qui suggère que l’administration simultanée du cediranib et d’un
cycle de chimiothérapie peut être bénéfique durant cette période (Batchelor et al. 2007). De plus, la
normalisation vasculaire induite par l’administration d’une dose unique de cediranib corrèle avec
une augmentation de la survie globale et de la survie sans progression des patients (Sorensen et
al. 2009). Plus particulièrement, des études effectuées chez des patients atteints d’un glioblastome
récemment diagnostiqué ont montré que seuls les patients répondant au cediranib par une
augmentation de la perfusion vasculaire et de l’oxygénation tumorale survivent plus longtemps
(Sorensen et al. 2012, Batchelor et al. 2013). Des résultats similaires ont été obtenus avec le
bevacizumab chez des patientes atteintes d’un cancer du sein localement avancé (Jain 2014). Ces
données doivent à présent être confirmées par des études cliniques randomisées. L’augmentation
de la perfusion vasculaire et de l’oxygénation tumorale pourrait alors servir de marqueur
prédictif à l’efficacité des anti-angiogéniques.
69!
Figure 12. Concept de normalisation vasculaire en réponse aux anti-angiogéniques. A) A l’inverse de celui des tissus sains, le réseau vasculaire tumoral est anormal. La normalisation vasculaire est un concept selon lequel les anti-angiogéniques peuvent normaliser la structure et la fonction des vaisseaux sanguins tumoraux. Cependant, leur administration prolongée ou l’utilisation d’une dose trop importante aboutit à la destruction des vaisseaux sanguins et empêche la distribution de l’oxygène, des nutriments et des agents thérapeutiques dans la tumeur. B) Dynamique de la normalisation vasculaire induite par l’inhibition du VEGFR2 dans une tumeur en comparaison d’un tissu sain. C) Des modifications de l’équilibre entre les facteurs pro- et anti-angiogéniques sont à l’origine des changements phénotypiques du réseau vasculaire. Adapté de Jain, 2005.
5.3. Stratégies ciblant les facteurs HIF
Les facteurs HIF étant les acteurs de l’adaptation à l’hypoxie intratumorale, leur ciblage
spécifique pourrait s’avérer bénéfique en clinique. Historiquement, les facteurs de transcription
ont été décrits comme étant difficiles à cibler mais il existe aujourd’hui de nombreux composés
capables d’inhiber l’activité des facteurs HIF, de manière directe ou indirecte (Tableau 6). Parmi
eux, certains sont déjà sur le marché et d’autres font l’objet d’études cliniques ou précliniques.
5.3.1. Molécules déjà sur le marché
Quelques molécules utilisées actuellement en chimiothérapie anticancéreuse inhibent l’activité
des facteurs HIF. C’est le cas du topotecan, un analogue de la camptothécine. Cette molécule
inhibe la topoisomérase I et induit ainsi la formation de cassures double brin au niveau de l’ADN,
inhibant donc sa réplication. Une étude a montré que le topotecan inhibe la traduction de HIF-1α
70!
selon un mécanisme dépendant de la topoisomérase I mais indépendant de la réplication de
l’ADN (Rapisarda et al. 2004a). Il a également été montré in vivo que l’administration quotidienne
de topotecan entraine une diminution de l’expression de HIF-1α, de l’angiogenèse et de la
croissance tumorale (Rapisarda et al. 2004b). De plus, un effet antitumoral synergique a été
observé lors d’un traitement combiné avec le bevacizumab (Rapisarda et al. 2009). La
doxorubicine et la daunorubicine, de la famille des anthracyclines, sont des agents intercalants de
l’ADN utilisés en chimiothérapie. Une étude a montré que ces molécules inhibent l’activité
transcriptionnelle de HIF-1 en bloquant sa liaison à l’ADN de ses gènes cibles, ce qui se traduit
par une diminution de l’angiogenèse tumorale in vivo (Lee et al. 2009a).
D’autre part, plusieurs thérapies ciblées actuellement utilisées en clinique ont des effets anti-
angiogéniques qui semblent largement être dus à leur capacité à inhiber l’activité de HIF-1
(Semenza 2010). Cela semble être le cas de l’imatinib, un inhibiteur de la protéine BCR-ABL
(Breakpoint Cluster Region protein - Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1) dont
l’activation constitutive favorise l’expression de l’ARNm de HIF-1α, augmentant ainsi son
activité transcriptionnelle et donc l’expression du VEGF (Mayerhofer et al. 2002). L’effet anti-
angiogénique du trastuzumab, un anticorps anti-HER2, pourrait également s’expliquer par
l’inhibition de HIF-1α puisqu’une étude a montré que le récepteur HER2 stimule la synthèse de
HIF-1α (Laughner et al. 2001). De plus, des études ont montré que l’erlotinib et le gefitinib, des
inhibiteurs de l’EGFR, ainsi que le cetuximab, un anticorps bloquant l’EGFR, diminuent la
synthèse de HIF-1α et donc l’expression du VEGF (Luwor et al. 2005, Pore et al. 2006). Des études
ont également montré que le bortezomib, un inhibiteur du protéasome notamment utilisé pour le
traitement du myélome multiple, inhibe la voie PI3K/Akt/mTOR et donc la traduction de HIF-
1α, et favorise le recrutement de FIH pour inhiber l’activité transcriptionnelle de HIF-1 (Shin et al.
2008, Befani et al. 2012). Enfin, le temsirolimus et l’everolimus, des inhibiteurs de mTOR, sont
indiqués dans le traitement des adénocarcinomes rénaux avancés où ils inhibent la traduction de
HIF-1α (Majumder et al. 2004, Thomas et al. 2006, Hudes et al. 2007, Motzer et al. 2008).
5.3.2. Molécules faisant l’objet d’études cliniques ou précliniques récentes
L’activation des facteurs HIF constituant un mécanisme de résistance au bevacizumab, une étude
clinique de phase I a été mise au point afin d’étudier le bénéfice de la combinaison du
bevacizumab avec le bortezomib, un inhibiteur de l’activité transcriptionnelle de HIF-1 (Falchook
et al. 2014). Cette étude révèle que la combinaison de ces traitements est bien tolérée et qu’elle
71!
présente une efficacité clinique chez des patients présentant une tumeur localement avancée et
réfractaire aux traitements de première intention (Falchook et al. 2014).
Une étude préclinique récente a montré que l’acriflavine, une molécule capable d’inhiber la
dimérisation de HIF-α avec HIF-β, limite la progression tumorale dans un modèle murin de
cancer colorectal induit par l’inflammation (Shay et al. 2014). En effet, l’acriflavine diminue le
nombre de tumeurs, la taille et le grade tumoral, ainsi que l’infiltration de macrophages et la
vascularisation tumorale. Ainsi l’inhibition de HIF dans les cellules tumorales, immunitaires et
endothéliales permettrait de limiter la croissance tumorale (Shay et al. 2014).
Enfin, une étude préclinique effectuée dans un modèle murin de leucémie myéloïde aigüe
récidivante indique que l’administration d’échinomycine, un inhibiteur de HIF-1, permet de
guérir près de 50% des animaux. Dans ce modèle, l’échinomycine cible spécifiquement les cellules
souches leucémiques, responsables de la récidive, tout en épargnant les cellules souches
hématopoïétiques (Wang et al. 2014d).
Tableau 6. Mécanismes d’action des inhibiteurs de HIF.
Molécule Mécanisme(s) d’action Référence Inhibiteurs de l’expression de l’ARNm de HIF-α EZN-2968 Augmentation de la dégradation de l’ARNm de HIF-1α (Greenberger et al. 2008,
Jeong et al. 2014b) Aminoflavone Inhibition de la transcription de l’ARNm de HIF-1α (Terzuoli et al. 2010) Inhibiteurs de la traduction de HIF-α Topotécan Inhibiteur de la topoisomérase I
Inhibition de la traduction de HIF-1α (Rapisarda et al. 2002, Rapisarda et al. 2004a, Rapisarda et al. 2004b, Rapisarda et al. 2009, Kummar et al. 2011)
EZN-2208 Inhibiteur de la topoisomérase I Inhibition de la traduction de HIF-1α
(Pastorino et al. 2010, Sapra et al. 2011, Jeong et al. 2014a)
NSC-644221 Inhibiteur de la topoisomérase II Inhibition de la traduction de HIF-1α
(Creighton-Gutteridge et al. 2007)
Temsirolimus
Inhibition de mTOR Inhibition de la traduction de HIF-1α
(Wan et al. 2006, Hudes et al. 2007)
Everolimus Inhibition de mTOR Inhibition de la traduction de HIF-1α
(Motzer et al. 2008, Baselga et al. 2012)
Rapamycine Inhibition de mTOR Inhibition de la traduction de HIF-1α
(Majumder et al. 2004)
2-methoxyoestradiol Déstabilisation des microtubules Inhibition de la traduction de HIF-1α
(Mabjeesh et al. 2003)
Digoxine Glycoside cardiotonique Inhibition de la traduction de HIF-1α
(Zhang et al. 2008b, Lin et al. 2014a)
PX-478 Inhibition de la transcription et de la traduction de HIF-1α (Koh et al. 2008b, Zhao et al. 2015)
PX-12 Inhibition de la thiorédoxine 1 Inhibition de la traduction de HIF-1α
(Ramanathan et al. 2012)
72!
Molécule Mécanisme(s) d’action Référence Inhibiteurs de la traduction de HIF-α (suite) Pleurotine Inhibition de la thiorédoxine 1
Inhibition de la traduction de HIF-1α (Welsh et al. 2003)
Glycéolline I, II, III Inhibition de la voie PI3K/Akt/mTOR Inhibition de la traduction de HIF-1α
(Lee et al. 2015a)
Cetuximab Blocage de l’EGFR Inhibition de la traduction de HIF-1α
(Luwor et al. 2005)
Erlotinib, Gefitinib Inhibition de l’EGFR Inhibition de la traduction de HIF-1α
(Pore et al. 2006)
Bortezomib Inhibiteur du protéasome Inhibition de la voie PI3K/Akt/mTOR Inhibition de l’expression de HIF-1α
(Befani et al. 2012)
Inhibition de la stabilisation ou de l’accumulation de HIF-α PX-478 Inhibition de la déubiquitinylation de HIF-1α (Koh et al. 2008b, Zhao et al.
2015) Glycéolline I, II, III Inhibition de la HSP90
Inhibition de la stabilité de HIF-1α (Zhao et al. 2015)
YC-1 Inhibition de l’accumulation de HIF-1α (Chun et al. 2001, Sun et al. 2007, Carroll et al. 2013)
Galdanamycine Inhibition de la HSP90 Ubiquitinylation de HIF-1α
(Hur et al. 2002, Isaacs et al. 2002, Koga et al. 2009)
17-AAG (analogue de la galdanamycine)
Inhibition de la HSP90 Ubiquitinylation de HIF-1α
(Neckers and Neckers 2002, Neckers 2006)
LAQ824 Inhibition des HDAC Augmentation de la dégradation protéasomale de HIF-1α
(Qian et al. 2006)
Ascorbate, N-acétylcystéine
Antioxydants Stimulation de l’activité des PHD Augmentation de la dégradation protéasomale de HIF-1α
(Gao et al. 2007)
LY294002 Inhibition de la PI3K Ubiquitinylation de HIF-1α
(Choy et al. 2010)
Inhibition de la dimérisation de HIF-α Acriflavine Interaction avec le domaine PAS de HIF-α et inhibition
de la dimérisation avec HIF-β (Lee et al. 2009b, Wong et al. 2012, Shay et al. 2014)
Inhibition de la liaison de HIF à l’ADN de ces gènes cibles Doxorubicine, Daunorubicine
Anthracyclines, agents intercalants Inhibition de la liaison de HIF à l’ADN des gènes cibles
(Lee et al. 2009a)
Echinomycine Inhibition de la liaison de HIF à l’ADN des gènes cibles (Kong et al. 2005, Wang et al. 2014d)
Polyamides Inhibition de la liaison à l’ADN des gènes cibles (Olenyuk et al. 2004) Inhibition de l’activité transcriptionnelle de HIF YC-1 Inhibition du recrutement de p300 (Li et al. 2008) Galdanamycine Inhibition de l’activité transcriptionnelle de HIF-1 (Isaacs et al. 2002) (Hur et al.
2002, Mabjeesh et al. 2002, Koga et al. 2009)
Amphotéricine B Antifongique Augmentation du recrutement de FIH
(Yeo et al. 2006)
Bortezomib Inhibiteur du protéasome Augmentation du recrutement de FIH
(Shin et al. 2008, Falchook et al. 2014)
Chetomine Antibactérien Inhibition de l’interaction HIF/p300
(Kung et al. 2004)
EGFR : epidermal growth factor receptor ; FIH : factor inhibiting HIF ; HDAC : histone deacetylase ; HSP90 : heat shock protein 90 ; mTOR : mammalian target of rapamycin ; PAS : per-ARNT-sim ; PHD : prolyl hydroxylase ; PI3K : phosphatidylinositol 3 kinase.
73!
5.4. Discussion
Le ciblage des cellules hypoxiques et l’inhibition des facteurs HIF sont les deux principales
stratégies visant à détruire les cellules tumorales hypoxiques. Chacune de ces stratégies a ses
avantages et ses inconvénients. En effet, les prodrogues cytotoxiques sont très sélectives des
cellules hypoxiques in vitro mais le sont généralement moins chez la souris ou chez l’homme.
Ainsi, l’identification et la caractérisation des réductases endogènes humaines qui activent les
prodrogues permettront sans doute d’améliorer la sélectivité de ces prodrogues vis-à-vis des
cellules tumorales hypoxiques. A l’inverse, les inhibiteurs de HIF ont une activité cytotoxique
plus faible au niveau des cellules tumorales mais sont moins toxiques vis-à-vis des cellules saines.
Pour cette raison, ils sont plus facilement utilisés en association avec les thérapies
conventionnelles que les prodrogues cytotoxiques. Leur utilisation en monothérapie ne semble
cependant pas réalisable à ce jour puisque les cellules hypoxiques constituent une sous-
population minoritaire dans la tumeur, bien que leur importance dans la progression de la
maladie soit critique (Wilson and Hay 2011). En effet, une étude effectuée chez des patients
atteints d’un carcinome des voies aériennes et digestives supérieures indique que l’hypoxie
intratumorale compromet la survie des patients seulement lorsqu’elle est très sévère, puisque la
survie à 5 ans tend vers zéro chez les patients présentant les tumeurs les plus hypoxiques
(Nordsmark et al. 2005). Ainsi, il est nécessaire de développer et d’utiliser des biomarqueurs
prédictifs qui reflètent l‘hypoxie intratumorale ou l’activation des facteurs HIF, afin de
personnaliser au maximum les traitements anticancéreux et d’évaluer leur efficacité dans le
temps (Wilson and Hay 2011).
74!
Chapitre 3 :
La voie Sphingosine kinase / Sphingosine 1-
phosphate
1. Le métabolisme sphingolipidique
1.1. Bases structurales des sphingolipides
Les sphingolipides sont une classe de lipides complexes que l’on retrouve chez l’ensemble des
eucaryotes. Leurs premiers représentants ont été identifiés en 1884 par Thudichum qui choisit
alors le préfixe « sphingo » - en référence au Sphinx de la mythologie grecque – en raison des
propriétés énigmatiques de ces lipides. Les sphingolipides dérivent d’un squelette commun, la
sphinganine ou dihydrosphingosine, constituée d’une chaine de 18 atomes de carbone, porteuse
de deux fonctions alcool en positions C1 et C3, et d’une fonction amine en position C2 (Figure 13).
Figure 13. Structure de la sphinganine, squelette commun des sphingolipides.
1.2. Le métabolisme sphingolipidique
Les sphingolipides sont interconnectés afin de former un réseau métabolique que l’on nomme
métabolisme sphingolipidique (Figure 14). Ce réseau possède un unique point d’entrée et un
unique point de sortie. En effet, la synthèse de novo constitue l’entrée du métabolisme
sphingolipidique. Elle se déroule principalement au niveau de la membrane externe du réticulum
endoplasmique et consiste en la condensation du palmitate et de la sérine sous l’action de la
sérine palmitoyltransférase (SPT). Ceci aboutit à la formation de la 3-céto-dihydrosphingosine
75!
dont dérivent tous les autres sphingolipides. La 3-céto-dihydrosphingosine peut être réduite en
dihydrosphingosine puis N-acylée par une (dihydro) céramide synthase (CerS) afin de former le
dihydrocéramide. Chez les mammifères, il existe 6 CerS ayant des spécificités de substrats vis-à-
vis de la longueur de la chaine carbonnée de l’acide gras N-acylé. La désaturation du
dihydrocéramide aboutit à la formation de céramide (Figure 15), molécule centrale du
métabolisme sphingolipidique puisque pouvant générer plusieurs types de sphingolipides tels
que les sphingomyélines, les glycosphingolipides, le céramide 1-phosphate et la sphingosine
(Spiegel and Merrill 1996, Hannun and Obeid 2008, Gault et al. 2010).
Figure 14. Le métabolisme sphingolipidique. CDase : céramidase; CerS : céramide synthase ; CK : céramide kinase; DAG : diacylglycérol; GCase : glucosylcéramidase : GCS : glucosylcéramide synthase; PC : phosphatidylcholine; SK: sphingosine kinase; SMase : sphingomyélinase; SMS : sphingomyéline synthase; SPPase : sphingosine 1-phosphate phosphatase; SPT: sérine palmitoyltransferase. D’après Hannun and Obeid, 2008.
Les sphingomyélines, sphingolipides complexes les plus abondants, sont formées par les
sphingomyéline synthases qui transfèrent sur le céramide un groupement phosphocholine issu
de la phosphatidylcholine. Les sphingomyélines peuvent être reconverties en céramide par
différentes sphingomyélinases (SMases), caractérisées par leur localisation cellulaire et par le pH
qui leur confère une activité optimale. On distingue ainsi les SMases acides, neutres et alcalines
(Gault et al. 2010). Les glycosphingolipides peuvent être synthétisés à partir du céramide par
deux enzymes différentes : la glucosylcéramide synthase qui permet la formation de
glucosylcéramide et la galactosyltransférase qui permet la formation de galactosylcéramide. A
l’inverse, des β-glucosidases et des galactosidases hydrolysent ces lipides afin de régénérer le
céramide (Hannun and Obeid 2008). Le céramide 1-phosphate est issu de la phosphorylation du
76!
céramide par la céramide kinase. Il peut être déphosphorylé par une phosphatase pour régénérer
le céramide (Hannun and Obeid 2008). La sphingosine (Figure 15) est formée lorsque les
céramidases clivent l’acide gras N-acylé du céramide. La sphingosine peut alors être recyclée en
céramide sous l’action d’une CerS, ou bien être phosphorylée par l’une des deux sphingosine
kinases (SphK1 et SphK2) pour former la sphingosine 1-phosphate (S1P, Figure 15). Cette
dernière peut être déphosphorylée de manière réversible par les S1P-phosphatases pour
régénérer la sphingosine. Alternativement, la S1P-lyase (SPL) peut dégrader irréversiblement la
S1P en hexadécénal et phosphoéthanolamine. Longtemps considérées comme étant dépourvues
d’intérêt biologique, ces deux molécules sont aujourd’hui impliquées dans le développement de
certaines pathologies (Bektas et al. 2010, Nakahara et al. 2012). Il s’agit là de l’unique point de
sortie du métabolisme sphingolipidique (Hannun and Obeid 2008).
Figure 15. Structures du céramide, de la sphingosine et de la sphingosine 1-phosphate.
77!
1.3. Les sphingolipides : lipides bioactifs
Initialement connus exclusivement pour leur rôle structural au niveau des membranes cellulaires,
les sphingolipides constituent désormais une classe de lipides bioactifs, c’est-à-dire capables de
réguler des fonctions biologiques. Ainsi, le céramide, la sphingosine et la S1P sont considérés
depuis le début des années 1990 comme des régulateurs majeurs de processus biologiques
fondamentaux tels que la survie, la différentiation, la prolifération et la migration cellulaire, la
progression du cycle cellulaire, l’angiogenèse et la réponse immunitaire (Hannun and Obeid
2008).
1.4. Le biostat sphingolipidique
Parmi les sphingolipides, le céramide et la sphingosine ont des propriétés pro-apoptotiques, à
l’inverse de la S1P qui a des propriétés pro-prolifératives et qui favorise la survie cellulaire. Dans
la cellule, il existe ainsi un équilibre dynamique entre le céramide, la sphingosine et la S1P. Cet
équilibre a conduit au concept de biostat sphingolipidique selon lequel la balance entre le
céramide et la sphingosine d’une part, et la S1P d’autre part, est crucial pour déterminer le
devenir de la cellule, à savoir sa mort ou sa survie (Figure 16) (Cuvillier et al. 1996). Ce biostat est
principalement sous le contrôle des sphingosine kinases qui phosphorylent la sphingosine pour
former de la S1P, induisant ainsi une signalisation anti-apoptotique et pro-proliférative, et qui
constituent les régulateurs clés du métabolisme sphingolipidique.
Figure 16. Le biostat sphingolipidique. La balance entre la mort et la survie cellulaire est finement régulée dans la cellule, en particulier par les SphKs. SphKs : sphingosine kinases ; SPPase : sphingosine 1-phosphate phosphatase.
78!
2. La voie SphKs/S1P
Des variations au niveau des concentrations de céramide, sphingosine et S1P ayant des
conséquences fonctionnelles au niveau cellulaire, il a été montré que ces molécules sont
impliquées dans des processus physiologiques tels que la migration des cellules immunitaires
mais aussi dans des phénomènes pathologiques tels que les maladies cardiovasculaires,
métaboliques ou inflammatoires, comme le diabète et l’obésité, ainsi que dans les cancers
(Maceyka et al. 2012). Ainsi, la dérégulation du biostat sphingolipidique en faveur de la
production de S1P favorise la progression tumorale ainsi que la résistance aux traitements anti-
tumoraux. La compréhension de ce biostat, de sa régulation et des voies de signalisation induites
par la S1P sont donc essentielles afin d’élucider les mécanismes moléculaires mis en jeu dans de
nombreuses pathologies, en particulier dans les cancers, et dans le but d’améliorer l’arsenal
thérapeutique existant (Cuvillier et al. 2010, Maceyka et al. 2012, Giussani et al. 2014).
2.1. Les sphingosine kinases
Les sphingosine kinases (SphKs) sont des lipide-kinases qui, en présence d’ATP, catalysent la
phosphorylation de la sphingosine en S1P. Ces enzymes ubiquitaires sont très conservées au
cours de l’évolution puisque des séquences putatives ont été mises en évidence dans une
trentaine d’espèces réparties dans quatre règnes du vivant. On les retrouve ainsi chez les
microorganismes unicellulaires, les insectes et les végétaux. Chez les mammifères, l’activité
sphingosine kinase a été mise en évidence pour la première fois dans les années 1970 dans le foie
de rat, le cerveau de bœuf et les plaquettes humaines (Keenan and Maxam 1969, Stoffel et al. 1973,
Louie et al. 1976). Deux enzymes, aux origines géniques différentes, sont responsables de cette
activité, il s’agit de la SphK1 et la SphK2, nommées selon leur ordre de découverte et de
caractérisation. La SphK1 a été purifiée pour la première fois par le groupe de Sarah Spiegel à
partir d’un rein de rat puis chez la souris (Kohama et al. 1998, Olivera and Spiegel 1998). Ce même
groupe a découvert la forme humaine de la SphK1 par homologie de séquence avec celle de la
souris, puis a identifié les formes murine et humaine de la SphK2 (Liu et al. 2000a, Nava et al.
2000). La SphK1 et la SphK2 présentent des différences d’expression lors du développement
embryonnaire de la souris, la SphK2 étant exprimée plus tardivement, ainsi que des différences
de distribution tissulaire et de localisation intracellulaire. Ainsi, la SphK1 a une expression
presque ubiquitaire puisque son ARNm est retrouvé dans le poumon, la rate, le cœur, le thymus,
79!
le cerveau et le rein, alors que l’expression de la SphK2 est principalement restreinte au cœur, au
foie et aux reins (Liu et al. 2000a, Melendez et al. 2000). Ceci suggère que ces deux enzymes
peuvent avoir des fonctions physiologiques différentes.
2.1.1. Propriétés structurales
Il existe trois isoformes de la SphK1, nommés SphK1a, SphK1b et SphK1c, générés par épissage
alternatif. L’isoforme SphK1a, majoritaire chez l’homme, est constituée de 384 acides aminés
(environ 42,5 kDa). De même, il existe deux variants d’épissage de la SphK2, nommés SphK2a et
SphK2b. L’isoforme SphK2b, majoritaire chez l’homme, est constitué de 654 acides aminés
(environ 69,2 kDa). Les termes « SphK1 » et « SphK2 » désignent respectivement l’ensemble de
leurs isoformes (Billich et al. 2003, Taha et al. 2006) (Figure 17).
Figure 17. Variants d’épissage et domaines d’homologie des SphKs. La SphK1 et la SphK2 partagent 47% et 43% d’identité de séquence en acides aminés entre leurs régions N-terminale et C-terminale, respectivement. SK : sphingosine kinase. D’après Pitson, 2011.
Bien que différentes de part leur taille, la SphK1 et la SphK2 présentent un haut degré de
similarité au niveau de leurs séquences peptidiques (Figure 17). En effet, la séquence de la SphK1,
plus petite, s’aligne presque intégralement avec des régions de la séquence de la SphK2. Cette
dernière possède une partie N-terminale plus longue ainsi qu’une insertion polypeptidique riche
en proline dans sa région centrale (Pitson 2011).
Cinq domaines hautement conservés au cours de l’évolution, nommés C1 à C5, sont communs
aux SphKs (Kohama et al. 1998, Pitson 2011). Les domaines C1, C2 et C3 constituent leur domaine
catalytique, le site de liaison à l’ATP se situant sur le domaine C2. A ce niveau, la mutation du
résidu glycine 82 en acide aspartique créé un mutant catalytiquement inactif de la SphK1 (Pitson
et al. 2000b). Le domaine C4 contient le site de liaison à la sphingosine, dans lequel le résidu acide
80!
aspartique 178 chez l’homme et 177 chez la souris, est particulièrement impliqué (Yokota et al.
2004). Les domaines C1, C2, C3 et C5 présentent des homologies de séquences avec la céramide
kinase et les diacylglycérol kinases alors que le domaine C4 est plus spécifique des SphKs
(Sugiura et al. 2002, Taha et al. 2006).
La séquence de la SphK1 contient plusieurs autres sites d’intérêt, parmi lesquels :
- Deux séquences d’export nucléaire (NES) permettant la relocalisation de l’enzyme au
cytoplasme (Inagaki et al. 2003) ;
- Quatre motifs de liaison au calcium et à la calmoduline nécessaires à la translocation de
l’enzyme au niveau de la membrane plasmique (Kohama et al. 1998, Pitson et al. 2000a,
Sutherland et al. 2006);
- Plusieurs sites de modifications post-traductionnelles dont des sites de phosphorylation
par la protéine kinase C (PKC) et un site de phosphorylation par ERK1/2 (Extracellular
signal-Regulated Kinases 1/2) sur le résidu sérine 225, crucial pour l’activation de la SphK1
(Pitson et al. 2000a, Pitson et al. 2003);
- Un motif permettant l’interaction de la SphK1 avec TRAF2 (Tumor necrosis factor Receptor-
Associated Factor 2) (Xia et al. 2002).
De même, la séquence de la SphK2 contient d’autres sites d’intérêt, parmi lesquels :
- Une séquence de localisation nucléaire (NLS) et une séquence NES, (Igarashi et al. 2003b,
Neubauer and Pitson 2013) ;
- Une séquence de neuf acides aminés similaire à celles retrouvées dans la séquence des
protéines pro-apoptotiques « BH3-only » (Bcl2 Homology domain 3). Cette séquence
permettrait l’interaction de la SphK2 avec la protéine anti-apoptotique Bcl-xL (B-Cell
Lymphoma extra large) (Liu et al. 2003a) ;
- Plusieurs sites de modifications post-traductionnelles dont des sites de phosphorylation
par la PKC par ERK1/2 (Hait et al. 2007).
En 2013 a été décrite la structure tridimensionnelle de la SphK1. Cette structure a été obtenue par
cristallisation des résidus 9 à 364 de la SphK1a humaine avec une résolution d’environ 2
angströms. Elle procure de nouvelles informations quant à l’interaction entre la SphK1 et son
substrat, la sphingosine, ainsi que sur la réaction catalysée par cette enzyme et sur son interaction
avec des inhibiteurs spécifiques (Wang et al. 2013, Wang et al. 2014c).
La structure de la SphK1 se révèle être proche de celle de la diacyglycérol kinase. La SphK1
présente une poche hydrophobe, localisée en C-terminal, permettant la liaison avec la
81!
sphingosine. La conformation de cette poche assurerait la spécificité du substrat de l’enzyme. La
chaine carbonée de la sphingosine se placerait dans cette poche hydrophobe alors que les
groupements amine et alcools de sa tête polaire formeraient des liaisons hydrogène avec les
résidus acide aspartique 81, sérine 168 et acide aspartique 178 de la SphK1. Ceci confirme
l’implication du résidu 178, situé dans le domaine C4, dans l’interaction avec la sphingosine
(Yokota et al. 2004).
La co-cristallisation de la SphK1 avec l’ADP montre que le groupement polaire de la sphingosine
serait très proche du groupement phosphate de l’ADP et que le résidu acide aspartique 81
catalyserait le transfert d’un groupement phosphate de l’ATP vers la sphingosine. Ainsi, la
mutation du résidu acide aspartique 81 en alanine créé un mutant dénué d’activité de
phosphorylation (Wang et al. 2013).
2.1.2. Propriétés biochimiques !!
Les substrats pouvant être phosphorylés par la SphK1 sont la D-erythro-sphingosine, ou
sphingosine (Km=15,6µM), et la D-erythro-dihydrosphingosine, ou sphinganine (Km=20µM)
(Pitson et al. 2000a, Billich et al. 2003). La D,L-threo-dihydrosphingosine (DHS, Ki=5,9µM) et la
N,N-diméthylsphingosine (DMS, Ki=7,8µM) sont des inhibiteurs compétitifs de la SphK1 (Pitson
et al. 2000a).
L’activité enzymatique de la SphK1 est optimale à 37°C et pH 7,4. Elle requiert la présence d’ions
Mg2+ et peut être stimulée par l’ajout de Triton-X100. A l’inverse, l’activité de la SphK1 diminue
en présence d’ions Ca2+ et Mn2+ et est inhibée en présence d’ions Fe2+, Zn2+ et Cu2+ ainsi qu’en
présence de NaCl et KCl à des concentrations trop élevées (Liu et al. 2000a, Pitson et al. 2000a).
Les substrats de la SphK2 sont plus nombreux. En effet, la SphK2 peut phosphoryler la D-erythro-
sphingosine (Km=13,8µM), la D-erythro-dihydrosphingosine, la phytosphingosine, la DHS et le
FTY720 (Ki=18,2µM), un analogue de la sphingosine (Liu et al. 2000a, Billich et al. 2003). La DMS
(Ki=12µM) est un inhibiteur non compétitif de la SphK2. Contrairement à la SphK1, l’activité de la
SphK2 peut être stimulée par des concentrations élevées en NaCl et KCl mais sera inhibée en
présence de Triton-X100 et d’albumine sérique bovine (Liu et al. 2000a).
82!
2.1.3. Propriétés biologiques
Les souris knock-out (KO) pour la SphK1 ou pour la SphK2 sont viables et ne présentent pas
d’anomalie phénotypique, alors que les souris KO à la fois pour la SphK1 et pour la SphK2
meurent au stade embryonnaire (E13,5) en raison d’une maturation incomplète de leurs systèmes
cardiovasculaire et nerveux (Allende et al. 2004b, Mizugishi et al. 2005). En particulier, la délétion
spécifique de la SphK1 et de la SphK2 dans les érythrocytes est létale au stade embryonnaire
(E11,5-12,5) (Xiong et al. 2014). Ceci suggère que les SphKs possèdent des fonctions biologiques
partiellement redondantes. Cependant, bien qu’il soit clairement établi que la SphK1 soit une
enzyme pro-proliférative et anti-apoptotique, les rôles de la SphK2 sont plus ambigus. En effet,
des études ont montré que la SphK2 pouvait avoir un rôle pro-prolifératif ou pro-apoptotique
selon le modèle utilisé (Maceyka et al. 2005, Van Brocklyn et al. 2005). De même, la SphK1 et la
SphK2 ont des rôles opposés dans la régulation de la biosynthèse du céramide. En effet, la SphK1
diminuerait les taux de céramide en phosphorylant la sphingosine, alors que la SphK2
favoriserait la conversion de sphingosine en céramide (Maceyka et al. 2005). De tels effets pro-
apoptotiques peuvent s’expliquer par la présence d’un domaine « BH3-only » dans la séquence
peptidique de la SphK2 (Maceyka et al. 2005). De plus, la présence de motifs NES et/ou NLS dans
les séquences peptidiques des SphKs suggère que la production de S1P est compartimentalisée
dans la cellule, ce qui pourrait permettre de comprendre les différentes fonctions biologiques des
SphKs.
2.1.4. Régulation et localisation des SphKs
L’activité catalytique de la SphK1 peut être stimulée par de multiples messagers pro-prolifératifs,
tels que des facteurs de croissance, des cytokines ou des hormones (Taha et al. 2006) (Tableau 7).
Bien que la SphK1 soit principalement cytosolique, des études ont montré que son activation
s’accompagne de sa translocation à la membrane plasmique. Ainsi, la majorité des activateurs de
la SphK1 vont induire sa phosphorylation par ERK1/2 sur le résidu sérine 225, cette
phosphorylation étant nécessaire à la translocation de l’enzyme vers la membrane plasmique et à
l’augmentation considérable de son activité (Johnson et al. 2002, Pitson et al. 2003, Taha et al. 2006).
Cette translocation confère à la SphK1 ses propriétés pro-prolifératives et son rôle pro-tumoral
(Xia et al. 2000, Pitson et al. 2005), et est médiée par l’interaction de la SphK1 phosphorylée avec
une phosphatidylsérine, phospholipide présent au niveau de la membrane plasmique (Stahelin et
al. 2005, Taha et al. 2006). L’acide phosphatidique et la protéine CIB1 (Calcium and Integrin-Binding
protein 1) – qui se lie au site de liaison à la calmoduline de la SphK1 – sont également impliqués
83!
dans la relocalisation de la SphK1 à la membrane plasmique (Delon et al. 2004, Jarman et al. 2010).
La SphK1 peut aussi être relocalisée à l’enveloppe nucléaire où elle joue un rôle dans la
progression du cycle cellulaire, ou bien être excrétée dans le milieu extracellulaire en conditions
physiologiques ou de stress (Olivera et al. 1999, Kleuser et al. 2001, Ancellin et al. 2002, Waters et
al. 2003, Venkataraman et al. 2006, Tani et al. 2007).
La régulation de la SphK1 se fait également de part son interaction avec d’autres protéines. Par
exemple, l’interaction de la SphK1 avec TRAF2 ou eiF1A (eukaryotic Initiation Factor 1A) va
stimuler son activité, alors que son interaction avec la PP2A (Protein Phosphatase 2A) va l’inhiber
(Xia et al. 2002, Barr et al. 2008, Leclercq et al. 2008).
Enfin, des stimuli externes comme l’hypoxie peuvent également activer la SphK1. En effet, des
études ont montré que l’hypoxie augmente l’expression de l’ARNm de la SphK1 dans des
cellules musculaires lisses et dans des cellules endothéliales, et stimule son activité dans des
lignées cellulaires tumorales humaines (Ahmad et al. 2006, Ader et al. 2008, Anelli et al. 2008,
Schwalm et al. 2008).
Bien que les mécanismes impliqués dans la régulation de la SphK2 soient moins clairs, il a été
montré que des facteurs de croissance, des cytokines, ainsi que l’hypoxie sont capables de
stimuler la SphK2 (Hait et al. 2005, Schnitzer et al. 2009). A l’instar de la SphK1, il a été montré que
la phosphorylation de la SphK2 par ERK1/2 conduit à son activation (Hait et al. 2007).
La localisation intracellulaire de la SphK2 peut varier en fonction de la densité et du type
cellulaire. La SphK2 possédant des séquences NLS et NES, elle peut donc se trouver dans le
noyau comme dans le cytoplasme. Localisée dans le noyau, la SphK2 inhibe la synthèse d’ADN,
et localisée au niveau du réticulum endoplasmique ou à la mitochondrie, elle pourrait induire
l’apoptose (Maceyka et al. 2005, Taha et al. 2006, Chipuk et al. 2012). Ainsi, la localisation
intracellulaire des SphKs participe largement à la régulation de leurs fonctions biologiques.
Sachant que de nombreux stimuli conduisent à l’activation des SphKs et donc à l‘accumulation de
S1P, des études se sont attachées à élucider les rôles et les mécanismes d’action de la S1P. Il a ainsi
été montré que la S1P peut agir à la fois de façon extracellulaire et de façon intracellulaire (Spiegel
and Milstien 2003, Strub et al. 2010).
84!
Tableau 7. Principaux activateurs de la SphK1.
Activateur Mécanisme(s) d’action Effet(s) biologique(s) Référence(s) Facteurs de croissance EGF Translocation à la membrane
plasmique Augmentation de la mobilité cellulaire
(Meyer zu Heringdorf et al. 1999)
VEGF Non déterminé Augmentation de la synthèse d’ADN
(Olivera and Spiegel 1993, Shu et al. 2002)
PDGF Translocation à la membrane plasmique
Augmentation de la mobilité cellulaire
(Olivera and Spiegel 1993)
IGF Translocation à la membrane plasmique
Activation de ERK1/2 (El-Shewy et al. 2006, Gomez-Brouchet et al. 2007)
Ligands de RCPG S1P Non déterminé Mobilisation de Ca2+
(Meyer zu Heringdorf et al. 2001)
LPA Translocation à la membrane plasmique
Augmentation de la survie cellulaire
(Young et al. 1999)
Acétylcholine Non déterminé Mobilisation de Ca2+
(Meyer zu Heringdorf et al. 1998)
Cytokines TNF-α Interaction avec TRAF2 Activation de NF-κB (Xia et al. 1998, Xia et al.
2002) TNF-α , IL-1β Non déterminé Production de cytokines (Billich et al. 2005,
Mastrandrea et al. 2005) Hormones Oestradiol Translocation à la membrane
plasmique Prolifération cellulaire (Sukocheva et al. 2003)
Prolactine Non déterminé Expression de la SphK1 (Doll et al. 2007) Dihydrotestostérone Activation de la voie PI3K/Akt Prolifération cellulaire (Martin et al. 2010) Esters de phorbol phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)
Translocation à la membrane plasmique, phosphorylation
Sécrétion de S1P (Mazurek et al. 1994)
Autres Vitamine D3 Transcription de la SphK1 Augmentation de la
survie cellulaire (Kleuser et al. 1998)
LPS Translocation à la membrane plasmique
Activation de ERK1/2 et NF-κB
(Wu et al. 2004)
LDL oxydés Non déterminé Prolifération cellulaire (Auge et al. 1999) Stimuli environnementaux Hypoxie Production de ROS et activation
de la PLD ; Expression de l’ARNm de la SphK1
Stabilisation de HIF-1α, Activation de ERK1/2 et p38 MAPK
(Ahmad et al. 2006, Ader et al. 2008)
Hyperglycémie Activation de la PKC et de ERK1/2
Expression de molécules d’adhérence
(Wang et al. 2005a)
2.2. La S1P, facteur autocrine et paracrine, et ses S1P-récepteurs
En raison de l’activité de la SPL, la concentration de S1P dans les tissus est faible, de l’ordre du
nanomolaire (Schwab et al. 2005). On la retrouve en plus grande concentration, environ 100nM,
dans la lymphe où elle est produite par l’endothélium lymphatique (Pham et al. 2010). Enfin, la
85!
S1P est bien plus concentrée dans le sang, entre 200 et 900nM, où elle est essentiellement produite
par les érythrocytes et les plaquettes, dénuées d’activité SPL et SPPase, et par l’endothélium
vasculaire (English et al. 2000, Pappu et al. 2007, Venkataraman et al. 2008). La S1P plasmatique est
majoritairement liée aux lipoprotéines de haute densité et à l’albumine (Murata et al. 2000, Thuy
et al. 2014). Il existe ainsi un gradient de concentrations de S1P dans l’organisme.
Bien que la SphK1 puisse être sécrétée pour produire de la S1P dans le milieu extracellulaire
(Venkataraman et al. 2006), il a été montré que la S1P est principalement produite en
intracellulaire et qu’elle peut ensuite être exportée dans le milieu extracellulaire par différents
transporteurs lipidiques. Plusieurs membres de la famille des transporteurs ABC (ATP Binding
Cassette), notamment ABCA1, ABCC1, ABCG2, ont été impliqués dans ce processus (Mitra et al.
2006, Sato et al. 2007, Takabe et al. 2010). Plus tard, le transporteur Spns2 (Spinster homolog 2) a été
impliqué dans le transport de la S1P, mais aussi du FTY720 sous sa forme phosphorylée, chez le
poisson zèbre puis chez l’homme (Kawahara et al. 2009, Hisano et al. 2011).
La S1P extracellulaire peut se lier, de manière autocrine ou paracrine, à l’un de ses cinq S1P-
récepteurs (S1PRs). Il s’agit de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) appartenant à la
famille des récepteurs EDG (Endothelial Differentiation Gene), nommés S1P1 (EDG-1), S1P2 (EDG-5),
S1P3 (EDG-3), S1P4 (EDG-6), S1P5 (EDG-8). Les RCPG sont des récepteurs à sept domaines
transmembranaires couplés à une ou plusieurs protéine(s) G hétérotrimérique(s) constituée(s) de
deux sous-unités constantes (Gβ et Gγ) et d’une sous-unité variable (Gα), dont il existe plusieurs
classes parmi lesquelles Gαi, Gαs, Gαq et Gα12/13. La liaison d’un ligand sur le RCPG induit le
transfert d’un groupement GTP sur la sous-unité Gα provoquant la dissociation de
l’hétérotrimère. La Gα-GTP et le dimère Gβ-Gγ peuvent ensuite activer différentes voies de
signalisation. La S1P peut donc agir en se liant à l’un de ses cinq RCPG, dont l’expression
tissulaire et le couplage à différentes protéines G influence l’effet biologique de la S1P. En effet,
selon leur couplage, ces cinq RCPG peuvent agir en synergie ou bien de façon contraire (Chun et
al. 2010, Rosen et al. 2013) (Figure 18).
2.2.1. Le S1P1
Initialement identifié comme le récepteur orphelin EDG-1 dans des cellules endothéliales
humaines (Hla and Maciag 1990), le S1P1 est exprimé de manière ubiquitaire dans l’organisme,
avec un gradient d’expression croissant entre le rein, le système cardiovasculaire, la rate, les
poumons et le cerveau (Brinkmann 2007).
86!
La découverte récente de la structure tridimensionelle du S1P1 permet de visualiser la liaison de
ce récepteur avec son ligand. Bien que la structure du S1P1 présente de nombreux points
communs avec celles d’autres RCPG, la fixation du ligand au niveau de la poche de liaison du
S1P1 est particulière. En effet, l’accès à cette poche étant très limité depuis le milieu
extracellulaire, le ligand s’y fixerait en entrant latéralement dans le domaine transmembranaire
du S1P1 par diffusion depuis la bicouche lipidique de la membrane plasmique (Hanson et al.
2012). Ceci expliquerait pourquoi la S1P, même en excès, sature lentement le S1P1 (Kd=8nM).
Ce récepteur est uniquement couplé à Gαi, ses effets biologiques sont ainsi tous sensibles à la
toxine pertussique (Windh et al. 1999). L’activation du S1P1 peut induire une diminution de la
concentration intracellulaire d’AMPc (Adénosine MonoPhosphate Cyclique), la stimulation des
MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases), l’activation de la voie de la PLC (Phospholipase C), la
stimulation de la voie PI3K (Phosphatidylinositol 3-kinase)/Akt et ainsi l’activation de eNOS
(endothelial Nitric Oxyde Synthase) ou de Rac (Lee et al. 1996, Okamoto et al. 1998, Zondag et al.
1998, Morales-Ruiz et al. 2001).
Le KO murin du gène codant pour le S1P1 est létal au stade embryonnaire (E12,5-14,5), en raison
d’une maturation incomplète du système cardiovasculaire due au recrutement insuffisant des
cellules musculaires lisses au niveau de la paroi des vaisseaux néo-synthétisés (Allende et al.
2003). Le S1P1 joue ainsi un rôle dans le maintien de l’intégrité vasculaire. Il a également été
impliqué dans la formation de jonctions adhérentes entre les cellules endothéliales (Lee et al.
1999a, Lee et al. 1999b). Ainsi, son inhibition in vivo entraine une augmentation de la perméabilité
vasculaire (Sanna et al. 2006). Le S1P1 est aussi impliqué dans la mise en place du système
nerveux (Mizugishi et al. 2005) et joue un rôle primordial dans la circulation des cellules
immunitaires. En effet, son inhibition provoque une séquestration des lymphocytes T au niveau
du thymus et des lymphocytes B dans les organes lymphoïdes, induisant ainsi une lymphopénie
(Allende et al. 2004a, Matloubian et al. 2004).
2.2.2. Le S1P2
Le S1P2, ou EDG-5, a une expression ubiquitaire et peut lier la S1P (Kd=16-27nM) comme la
dihydroS1P (MacLennan et al. 1994). Il peut être couplé aux protéines Gαi, Gαq et Gα12/13 et ainsi
activer la voie des MAPK, la voie PI3K/Akt, la PLC et la voie Rho/ROCK (Rho-associated protein
kinase) (Gonda et al. 1999, Okamoto et al. 2000, Lepley et al. 2005). L’activation du S1P2,
contrairement à celle du S1P1, conduit généralement à la diminution de la prolifération et de la
migration cellulaire.
87!
Les souris KO pour le gène codant pour le S1P2 sont viables, mais présentent une prédisposition
aux attaques cérébrales, le S1P2 étant impliqué dans l’excitabilité neuronale (MacLennan et al.
2001). De plus, le S1P2 a été impliqué dans le bon fonctionnement des systèmes auditif et
vestibulaire, et dans la capacité de régénération du foie (Kono et al. 2007, Serriere-Lanneau et al.
2007, Ikeda et al. 2009). Enfin, des études ont montré que le S1P2 favorise la perméabilité et
l’inflammation de l’endothélium vasculaire (Skoura et al. 2007, Zhang et al. 2013a).
2.2.3. Le S1P3
Le S1P3, ou EDG-3, est largement exprimé dans l’organisme et son affinité pour la S1P est proche
de celle du S1P2 (Kd=23-26nM) (Yamaguchi et al. 1996). Comme ce dernier, il est couplé aux
protéines Gαi, Gαq et Gα12/13 (Ancellin and Hla 1999, Windh et al. 1999) et peut donc activer les
voies MAPK, PI3K/Akt, la PLC ainsi que Rho de façon à réguler positivement la prolifération et
la migration cellulaire (An et al. 2000, Okamoto et al. 2000).
Les souris KO pour le gène codant pour le S1P3 sont viables et ne présentent pas d’anomalie
phénotypique, sa perte étant sans doute compensée par les autres S1PRs. Cependant, la triple
déplétion des S1P1, S1P2 et S1P3 induit des défauts vasculaires précoces, indiquant une action
combinée de ces trois récepteurs dans la régulation de l’angiogenèse embryonnaire (Kono et al.
2004). De plus, des études ont montré l’implication du S1P3 dans la régulation du rythme
cardiaque, la vasodilatation et la perméabilité vasculaire (Levkau et al. 2004, Nofer et al. 2004,
Sanna et al. 2004). Le S1P3 joue également un rôle dans la migration des lymphocytes B et des
cellules dendritiques (Spiegel and Milstien 2011).
2.2.4. Le S1P4
Le S1P4, ou EDG-6, est exprimé de manière plus restreinte puisqu’on le trouve dans les systèmes
immunitaire, lymphatique et hématopoïétique (Graler et al. 1998). Ce récepteur est couplé aux
protéines Gαi et Gα12/13 et sa liaison avec la S1P (Kd=12-63nM) peut entrainer l’activation de la
PLC, des MAPK et de Rho (Van Brocklyn et al. 2000, Yamazaki et al. 2000). Une étude indique que
l’activation du S1P4 aurait un effet immunosuppresseur puisqu’elle inhiberait la prolifération des
lymphocytes T et leur sécrétion de cytokines effectrices (Wang et al. 2005b). A l’inverse, sa
déplétion altérerait la fonction des cellules dendritiques et réduirait la différenciation des
lymphocytes Th17 pro-inflammatoires (Schulze et al. 2011, Dillmann et al. 2015). Enfin, une étude
récente a montré que la S1P produite par la SphK2 peut se lier au S1P4 afin de prévenir la
88!
translocation nucléaire du S1P2 ce qui favorise ainsi la prolifération cellulaire dans un modèle de
cancer du sein (Ohotski et al. 2014).
2.2.5. Le S1P5
Le S1P5, ou EDG-8, a une expression restreinte au cerveau, à la rate, aux poumons, au placenta et
aux leucocytes du sang périphérique (Glickman et al. 1999, Im et al. 2001). Ce récepteur est couplé
aux protéines Gαi et Gα12/13 et sa liaison avec la S1P (Kd=2nM) peut entrainer l’activation de la
PLC, de la voie PI3K/Akt et de celle des Rho, ainsi que l’inhibition de l’adénylate cyclase, (Im et
al. 2001, Malek et al. 2001, Jaillard et al. 2005, Novgorodov et al. 2007). Les fonctions du S1P5 ont
été principalement étudiées au niveau du système nerveux central, où il favorise la survie des
oligodendrocytes matures et contribue à la formation et à la quiescence de la barrière hémato-
encéphalique (Jaillard et al. 2005). Au niveau du système immunitaire, il joue un rôle dans la
migration des cellules NK (Natural Killer) (Walzer et al. 2007, van Doorn et al. 2012).
Figure 18. Couplage et voies de signalisation induites par les S1PRs. AC : adenylate cyclase ; AMPc : adénosine monophosphate cyclique; DAG : diacyglycerol ; ERK1/2 : extracellular-signal regulated kinases 1/2; IP3 : inositol triphosphate ; NOS : nitric oxide synthase ; PI3K : phosphatidylinositol-3 kinase ; PKC : protein kinase C ; PLC : phospholipase C ; PTEN : phosphatase and tensin homolog ; ROCK : Rho-associated protein kinase
2.3. La S1P et ses cibles intracellulaires
Des études ont suggéré qu’en parallèle de son action extracellulaire sur les S1PRs, la S1P pouvait
agir sur des cibles intracellulaires. En effet, les végétaux, ainsi que des microorganismes comme
S. cerevisiae, répondent à la S1P alors qu’ils n’expriment pas les S1PRs (Birchwood et al. 2001, Ng
et al. 2001). De même, dans des cellules humaines, la S1P peut induire une mobilisation calcique
89!
indépendamment des S1PRs (Meyer zu Heringdorf et al. 2003). Ainsi, depuis plusieurs années,
différents travaux ont permis d’identifier des cibles intracellulaires de la S1P.
2.3.1. La S1P, inhibiteur des HDAC1/2
La SphK2 pouvant être localisée dans le noyau, une étude a montré que cette enzyme est capable
de s’associer avec les histone-deacétylases 1 et 2 (HDAC1/2), en particulier au niveau des
promoteurs des gènes codant pour p21 et c-fos. A ce niveau, la S1P produite se lie aux HDAC1/2
et inhibe leur activité enzymatique, ce qui empêche la liaison de l’histone H3 à l’ADN des gènes
de p21 et c-fos dont la transcription sera ainsi activée (Hait et al. 2009). La protéine c-fos étant un
régulateur transcriptionnel, et p21 un médiateur de la sénescence et de l’arrêt de la croissance
cellulaire, la SphK2 et la S1P jouent un rôle anti-prolifératif de part l’inhibition des HDAC1/2.
2.3.2. La S1P, cofacteur de TRAF2
La protéine TRAF2 est une ubiquitine ligase nécessaire à la polyubiquitinylation de RIP1
(Receptor-Interacting Protein 1) qui permet l’activation du facteur de transcription NF-κB (Nuclear
Factor-κB) en réponse au TNF-α (Tumor Necrosis Factor α). Alors que l’interaction de la SphK1
avec TRAF2 avait déjà été mise en évidence (cf. 2.2.1 et 2.1.4), une étude datant de 2010 a montré
que la S1P est un cofacteur de TRAF2 et qu’elle est indispensable à l’ubiquitinylation de RIP1
(Alvarez et al. 2010).
2.3.3. La S1P et la prohibitine 2
La Prohibitine 2 (PHB2) est une protéine hautement conservée qui régule l’assemblage et la
fonction de la mitochondrie. Une étude a montré que la S1P, produite au niveau de la
mitochondrie par la SphK2, se lie spécifiquement à la PHB2 et joue un rôle important dans la
régulation de la fonction mitochondriale. Ainsi, chez des souris SphK2-/-, la respiration
mitochondriale est réduite en raison d’un mauvais assemblage et d’une dysfonction du complexe
IV de la chaine respiratoire (Strub et al. 2011).
90!
2.3.4. La S1P et la BACE1
Le peptide β-amyloïde (Aβ) est le principal composant des plaques séniles impliquées dans le
développement de la maladie d’Alzheimer. L’enzyme BACE1 (β-site Amyloid precursor protein
(APP) Cleaving Enzyme 1), ou β-sécrétase, permet la formation du peptide Aβ par clivage de la
protéine APP. Une étude a montré que l’inhibition des SphKs, comme la surexpression de la SPL
ou de la S1P phosphatase, diminue l’activité de BACE1 et donc la production de peptide Aβ.
Ainsi, la S1P se lierait spécifiquement à BACE1 pour augmenter son activité protéolytique. De
plus, la diminution de l’expression de la SphK1, et l’augmentation de l’expression de la SPL et de
l’activité de la SphK2 chez des patients souffrant de la maladie d’Alzheimer suggèrent un lien
entre la production de S1P par la SphK2 et la progression de cette pathologie (Takasugi et al. 2011,
Ceccom et al. 2014).
3. Physiopathologie de la voie SphK1/S1P
La voie SphK1/S1P régule des processus biologiques fondamentaux tels que la prolifération, la
survie et la migration cellulaire ainsi que l’angiogenèse. Elle a donc été impliquée dans des
pathologies des systèmes immunitaire, cardiovasculaire ou encore métabolique, mais aussi dans
les cancers (Figure 19). Dans ce contexte, de nombreuses études se sont intéressées à caractériser
le rôle de la voie SphK1/S1P dans ces pathologies, afin de mieux les comprendre et de mieux les
prendre en charge.
3.1. La voie SphK1/S1P dans le système immunitaire
La voie SphK1/S1P a été largement impliquée dans les processus d’inflammation et d’immunité
ainsi que dans les pathologies qui y sont associées. Au cours de l’inflammation, les cellules de
l’immunité innée et adaptative migrent jusqu’au site d’inflammation afin de la neutraliser. La
réponse immunitaire est ensuite inhibée de façon à éviter les dommages tissulaires collatéraux
dus à une réponse immunitaire exacerbée. De nombreuses études ont montré que la voie
SphK1/S1P/S1PRs joue un rôle crucial dans la régulation de la circulation et de la fonction des
cellules immunitaires. En effet, l’axe S1P/S1PRs régule la migration de la majorité des cellules
immunitaires, c’est le cas des lymphocytes B et T, des progéniteurs hématopoïétiques, des
macrophages, des cellules dendritiques, des neutrophiles, des mastocytes ou des cellules NK
91!
(Spiegel and Milstien 2011, Maceyka and Spiegel 2014).
Le rôle de l’axe S1P/S1PRs a été particulièrement décrit dans la régulation de la circulation des
lymphocytes T et B. En effet, des études ont montré que des lymphocytes B et T qui n’expriment
pas le S1P1 perdent leur capacité de migration (Allende et al. 2004a, Matloubian et al. 2004,
Allende et al. 2010). Ainsi, la circulation des lymphocytes implique deux acteurs : le S1P1 et le
gradient de concentration de S1P qui existe entre le sang et les organes lymphoïdes. Dans le
thymus, l’expression de CD69 par les lymphocytes T immatures les empêche d’exprimer le S1P1,
ce qui favorise leur sélection et leur maturation dans cet organe. Après sélection, les lymphocytes
T immatures réexpriment le S1P1 à leur surface, ce qui les rend sensibles au gradient de S1P. Ils
vont donc quitter le thymus pour rejoindre la circulation sanguine où la concentration en S1P est
plus élevée. A ce niveau, le S1P1 est internalisé en réponse aux fortes concentrations de S1P, et
sera réexprimé lorsque les lymphocytes T entrent dans les ganglions lymphatiques non-
inflammatoires. Cependant, en condition d’inflammation, les lymphocytes T seront activés et
vont exprimer CD69 ce qui va entrainer l’internalisation et la dégradation du S1P1. Les
lymphocytes T activés vont donc rester dans les ganglions lymphatiques où la réponse
immunitaire sera intensifiée : après quelques divisions, les lymphocytes T activés deviendront
des lymphocytes T effecteurs qui expriment le S1P1, ce qui leur permettra de rejoindre
rapidement la circulation sanguine pour migrer jusqu’au site d’inflammation (Matloubian et al.
2004, Bankovich et al. 2010, Spiegel and Milstien 2011). De la même manière, le passage des
lymphocytes B immatures de la moelle osseuse vers la circulation sanguine dépend de
l’expression du S1P1 (Allende et al. 2010). Enfin, des études ont impliqué l’axe S1P/S1P1 dans la
migration des cellules dendritiques, l’axe S1P/S1P4 dans la migration des neutrophiles, et l’axe
S1P/S1P5 dans la migration des cellules NK (Jenne et al. 2009, Rathinasamy et al. 2010, Allende et
al. 2011, Spiegel and Milstien 2011).
92!
Figure 19. Implication de la voie SphK1/S1P en physiopathologie. La voie SphK1/S1P est impliquée dans de nombreuses conditions physiopathologiques qui affectent la quasi-totalité des organes du corps humain. La voie SphK1/S1P joue un rôle dans de nombreux cancers qui ne sont pas représentés ici. Adapté de Maceyka 2012.
3.1.1. La sclérose en plaque et le développement du FTY720
La migration des cellules immunitaires est un phénomène qui est aussi impliqué dans la
progression des maladies auto-immunes, telle que la sclérose en plaques. Le FTY720 est un
analogue de la sphingosine capable de séquestrer les lymphocytes T auto-réactifs dans les
ganglions lymphatiques. En raison de son efficacité clinique et de sa bonne tolérance, cette
molécule a été approuvée dans le traitement de la sclérose en plaques.
La sclérose en plaque (SEP) est une maladie auto-immune chronique du système nerveux central
(SNC) caractérisée par la démyélinisation et la perte de neurones ainsi que par la perte
d’oligodendrocytes. Chez le sujet sain, les cellules dendritiques immatures sont impliquées dans
le maintien de la tolérance périphérique, en favorisant la réponse des lymphocytes T régulateurs.
Or, chez les patients atteints de SEP, des cellules dendritiques anormalement activées entrainent
93!
une perte partielle de la tolérance immunitaire. Ceci favorise l’expansion clonale de lymphocytes
T auto-réactifs dans les ganglions lymphatiques. Ces lymphocytes circulent jusque dans le sang,
puis passent la barrière hémato-encéphalique pour envahir le SNC, où ils sont réactivés,
s’expandent et se différencient pour réagir contre des antigènes du soi présentés par les cellules
dendritiques. La présence de lymphocytes T auto-réactifs dans le SNC, ainsi que l’activation
anormale des astrocytes et de la microglie, entraine la production de cytokines inflammatoires, de
ROS et d’anticorps dirigés contre le soi. Ces processus sont impliqués dans la démyélinisation
neuronale et provoquent les dommages au niveau des nerfs et de la barrière hémato-
encéphalique que l’on retrouve chez les patients atteints de SEP (Brinkmann et al. 2010).
Découvert dans les années 1990, le FTY720, ou fingolimod, est un dérivé d’un métabolique
fongique, la myriocine (Brinkmann et al. 2010). Le FTY720 a initialement été utilisé pour ses
propriétés immunosuppressives afin de prévenir les rejets de greffe (Suzuki et al. 1996). Par la
suite, des études ont montré que ce composé exerce son effet immunosuppresseur en inhibant la
migration des lymphocytes T du thymus vers la périphérie, et que cette altération du trafic
lymphocytaire est dû à la liaison de la forme phosphorylée du FTY720 sur le S1P1 (Yagi et al. 2000,
Brinkmann et al. 2002, Mandala et al. 2002, Matloubian et al. 2004). En effet, le FTY720 est une pro-
drogue analogue de la sphingosine (Figure 20) dont la phosphorylation, qui a lieu
préférentiellement par la SphK2, aboutit à la formation du (S)-FTY720-P (Albert et al. 2005). Le
(S)-FTY720-P fonctionne comme un agoniste des récepteurs S1P1, S1P4, S1P5 (EC50=0,3 à 0,6nM) et
S1P3, (EC50=3nM) et n’a pas d’activité sur le S1P2 (Brinkmann et al. 2002, Mandala et al. 2002). Son
mécanisme d’action a été principalement décrit sur le S1P1 où il agit comme un antagoniste
fonctionnel. Ainsi, tel un agoniste, le (S)-FTY720-P se lie au S1P1 pour induire son internalisation.
Cependant, une fois internalisé, le S1P1 sera ubiquitinylé et dégradé par le protéasome ce qui
conduit à une diminution de son expression à la surface de la cellule (Graler and Goetzl 2004, Oo
et al. 2007, Mullershausen et al. 2009, Pitman et al. 2012). C’est ainsi que les lymphocytes T
deviennent insensibles au gradient de S1P et restent séquestrés dans les ganglions lymphatiques
(Figure 20).
94!
Figure 20. Structure et mécanisme d’action du FTY720 au niveau des organes lymphoïdes. A) Structure du FTY720. La SphK2 est capable de phosphoryler le FTY720 sur un groupement alcool afin de former le (S)-FTY720-P. La queue lipophile du FTY720 est nécessaire à l’interaction de sa forme phosphorylée avec la poche de liaison hydrophobe des S1PRs. Le groupement phényl participe également à l’activité du FTY720. B) Le (S)-FTY720-P inhibe la sortie des lymphocytes T des organes lymphoïdes en entrainant l’internalisation puis la dégradation du S1P1. Adapté de Adachi et Chiba 2007.
L’utilisation en clinique du FTY720 est donc liée à sa capacité de rétention des lymphocytes T
centraux mémoire (TCM) dans les ganglions lymphatiques, empêchant ainsi leur migration
jusqu’au SNC, leur expansion clonale et leur différenciation en cellules effectrices. L’efficacité du
FTY720 chez les patients atteints de SEP ne corrèle pas avec leur degré de lymphopénie. En effet,
le FTY720 a également des effets neuroprotecteurs directs dans le SNC où la diminution de
l’expression du S1P1, en particulier au niveau des astrocytes, réduit leur hyperactivation
(Brinkmann et al. 2010, Choi et al. 2011, Spiegel and Milstien 2011). De plus, le FTY720 cible les
lymphocytes TCM mais épargne les lymphocytes T effecteurs périphériques qui protègent
95!
l’organisme contre les infections (Mehling et al. 2008). Des essais cliniques de phase III ont mis en
évidence une réduction significative du taux annuel de récurrence chez les patients atteints de
SEP récurrente-rémittente, en comparaison avec l’interferon-β1a et un placebo. Le fingolimod
(Gilenya®) a donc été approuvé par les agences américaine FDA et européenne EMA pour le
traitement de la SEP récurrente-rémittente. Ses effets secondaires sur le système cardivasculaire,
notamment la bradycardie, font l’objet de surveillance.
3.1.2. La polyarthrite rhumatoïde
La polyarthrite rhumatoïde est une maladie auto-immune caractérisée par une inflammation des
articulations. Des taux élevés de S1P ont été retrouvés dans le liquide synovial de patients
souffrant de cette pathologie (Kitano et al. 2006). Des études chez la souris ont montré que le
FTY720 inhibe la progression de la polyarthrite rhumatoïde, tout comme l’inhibition de la SPL
qui perturbe le gradient de S1P, empêchant ainsi la migration des lymphocytes et induisant une
lymphopénie (Schwab et al. 2005, Bagdanoff et al. 2010, Tsunemi et al. 2010). Ainsi, un inhibiteur
de la SPL, le LX2931, est actuellement en phase II d’étude clinique.
3.1.3. L’asthme L’asthme, dont la prévalence est en augmentation constante, est une maladie chronique
inflammatoire des voies aériennes inférieures caractérisée par une inflammation de l’épithélium
bronchique, une bronchoconstriction et une hyperactivité bronchique induisant une
augmentation de la sécrétion de mucus. Des taux élevés de S1P sont retrouvés dans les poumons
de patients atteints d’asthme allergique. Dans des modèles murins d’asthme allergique, la S1P
favoriserait la bronchoconstriction ainsi que l’hyperactivité bronchique et régulerait l’activation
des mastocytes. Une telle inflammation pourrait être atténuée par l’inhalation d’inhibiteurs de
SphKs (Nishiuma et al. 2008, Price et al. 2013, Maceyka and Spiegel 2014).
3.1.4. Les maladies inflammatoires de l’intestin
Les maladies inflammatoires de l’intestin (MII) sont des maladies auto-immunes caractérisées par
une inflammation chronique du tractus gastro-intestinal. Les principales MII sont la maladie de
Crohn et la colite ulcéreuse. L’expression de la SphK1, tout comme la production de S1P, serait
augmentée chez les patients atteints de colite ulcéreuse. Dans le même sens, des études in vivo ont
96!
montré que l’inhibition de la SphK1 diminuerait la production de cytokines pro-inflammatoires et
donc la sévérité de la colite, et que le ciblage du S1P1 à l’aide du FTY720 serait efficace dans le
traitement de la colite (Daniel et al. 2007, Snider et al. 2009, Maceyka and Spiegel 2014).
Plusieurs études in vivo ont montré que la voie SphK1/S1P constitue un lien entre l’inflammation
chronique de l’intestin et le développement d’un cancer du côlon induit par l’inflammation, cette
voie étant impliquée à la fois dans le développement du cancer et dans sa progression. En
particulier, une étude a montré que dans un contexte de colite et de cancer associé,
l’augmentation de l’expression de la SphK1 et de la production de S1P entraine une
augmentation de la production d’IL-6 pro-inflammatoire dépendante de NF-κB ainsi qu’une
activation de STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) qui aboutit à l’augmentation
de l’expression du S1P1. Cette même étude a montré que le FTY720 inhibe l’axe SphK1/S1P/S1P1
et supprime la boucle d’amplification induite par l’axe NF-κB/IL-6/STAT3 ainsi que le
développement du cancer. L’utilisation du FTY720 pourrait donc être bénéfique dans le
traitement des cancers liés à l’inflammation (Liang et al. 2013, Maceyka and Spiegel 2014).
3.2. La voie SphK1/S1P dans le système cardiovasculaire et le métabolisme
Les concentrations plasmatiques de S1P sont très élevées, elles varient entre 200 et 900nM. Dans
la circulation sanguine, la S1P peut être liée à l’albumine, qui favorise sa libération des
érythrocytes ainsi que sa solubilité, mais surtout aux lipoprotéines de haute densité (HDL) riches
en apolipoprotéine M (Thuy et al. 2014). Cette forte biodisponibilité confère à la S1P plasmatique
des rôles physiologiques importants au niveau du système cardiovasculaire.
3.2.1. La vasculogenèse et l’angiogenèse
La S1P induit la survie et la migration des cellules endothéliales et régule la contraction et la
relaxation des cellules musculaires lisses au sein des vaisseaux sanguins (Nofer et al. 2004,
Szczepaniak et al. 2010). Il s’agit d’un facteur pro-angiogénique qui stimule la vasculogenèse, en
entrainant la formation par les cellules endothéliales de tubes en Matrigel, ainsi que l’angiogenèse
in vivo (Lee et al. 1999b, Limaye et al. 2005). La S1P peut également interagir avec un autre facteur
pro-angiogénique, le VEGF, afin de stimuler l’angiogenèse. En effet, à l’image du VEGF, la S1P
est capable de transactiver le VEGFR-2, alors que le VEGF peut stimuler l’expression du S1P1
(Tanimoto et al. 2002, Igarashi et al. 2003a).
97!
3.2.2. L’intégrité vasculaire
La S1P joue un rôle important dans le maintien de l’intégrité vasculaire. En effet, l’axe S1P/S1P1 a
été impliqué dans la formation de jonctions adhérentes entre les cellules endothéliales et dans la
diminution de la perméabilité vasculaire, notamment via l’activation de la N-cadhérine et le
recrutement péricytaire autour des cellules endothéliales (Lee et al. 1999a, Liu et al. 2000b,
Rosenfeldt et al. 2001, Paik et al. 2004, Camerer et al. 2009, Wilkerson and Argraves 2014). A
l’inverse, l’activation du S1P2 dans les cellules endothéliales favorise la perméabilité vasculaire
(Sanchez et al. 2007). La balance d’expression entre le S1P1 et le S1P2 au niveau de l’endothélium
déterminerait donc l’effet de la S1P sur la perméabilité vasculaire.
3.2.3. L’infarctus du myocarde
L’infarctus du myocarde correspond à la mort de cardiomyocytes suite à un défaut
d’oxygénation, ou ischémie. Une étude a montré que dans un modèle murin d’ischémie-
reperfusion, la S1P limite l’ampleur de l’infarctus en inhibant l’apoptose des cardiomyocytes. Cet
effet cardioprotecteur impliquerait le S1P3 et le monoxyde d’azote (NO) aux propriétés
vasodilatatrices (Theilmeier et al. 2006). La S1P pourrait également participer à la régénération
tissulaire en recrutant des cellules souches hématopoïétiques au niveau de la zone ischémiée
(Waeber and Walther 2014). Enfin, une étude ex vivo a montré que le FTY720 améliore la
récupération du myocarde après ischémie-reperfusion (Hofmann et al. 2009, Waeber and Walther
2014).
3.2.4. L’athérosclérose
L’athérosclérose est une inflammation chronique caractérisée par une accumulation de lipides et
de cellules immunitaires sous forme de plaques au niveau de l’endothélium vasculaire, ce qui a
pour conséquence la réduction de la lumière artérielle. De plus, la rupture de la plaque
d’athérome constitue un risque de thrombose. Bien que le rôle pro- ou anti-athérogénique de la
S1P ne soit pas clairement élucidé, il a été montré que la S1P régule la migration des monocytes,
la prolifération des cellules musculaires lisses, le tonus vasculaire et la stimulation de la voie NF-
κB impliquée dans la production de cytokines pro-inflammatoires (Daum et al. 2009, Maceyka et
al. 2012). Ainsi, l’activation du S1P3 stimulerait NF-κB, recruterait les monocytes et les
macrophages afin de favoriser l’inflammation et altérerait la fonction des cellules musculaires
98!
lisses (Keul et al. 2011, Maceyka et al. 2012). A l’inverse, la S1P aurait des effets anti-
athérogéniques via le S1P1 qui activerait la eNOS afin d’induire une vasodilatation, et via sa
liaison à l’ApoM, anti-athérogénique (Sato and Okajima 2010, Christoffersen et al. 2011). Dans le
même sens, une étude a montré que le FTY720 inhibe le développement de l’athérosclérose chez
des souris déficientes en LDL-R (Low Density Lipoprotein Receptor) et qui présentent donc un taux
élevé de LDL plasmatique, un transporteur du cholestérol. Le FTY720 exercerait son action en
induisant une lymphopénie et en convertissant les macrophages M1 pro-inflammatoires en
macrophages M2 anti-inflammatoires (Nofer et al. 2007).
3.2.5. Le diabète et l’obésité
Le diabète est une maladie métabolique chronique dans laquelle le métabolisme sphingolipidique
est altéré en faveur du céramide qui favorise la résistance à l’insuline. A l’inverse, l’inhibition de
la synthèse des sphingolipides augmente la sensibilité à l’insuline et prévient le développement
du diabète chez des rongeurs obèses (Summers 2010, Deevska and Nikolova-Karakashian 2011,
Maceyka et al. 2012). La réponse inflammatoire induite par l’obésité exacerbant la résistance à
l’insuline et le développement du diabète, une étude a montré que l’activation du TLR4 (Toll-Like
Receptor 4) stimule la voie NF-κB et ainsi la synthèse de céramide (Holland et al. 2011a). Le
céramide serait donc un médiateur clé de la résistance à l’insuline induite par l’inflammation liée
à l’obésité. De plus, l’adiponectine, une hormone qui favorise la sensibilité à l’insuline, stimule
l’activité des céramidases et donc la production de S1P, induisant ainsi la survie des cellules β des
îlots de Langerhans (Holland et al. 2011b). Toutefois, les mécanismes moléculaires impliqués dans
les propriétés anti-apoptiques et pro-prolifératives de la S1P vis-à-vis de ces cellules
pancréatiques restent à élucider (Maceyka et al. 2012).
En parallèle, une étude récente a impliqué l’axe S1P/S1P1 dans le contrôle hypothalamique de
l’homéostasie énergétique. En effet, l’injection intracérébroventriculaire de S1P diminuerait la
consommation de nourriture et augmenterait la dépense d’énergie chez des rats. De plus,
l’expression du S1P1 serait diminuée dans l’hypothalamus de rats obèses (Silva et al. 2014).
3.3. La voie SphK1/S1P dans les cancers
Les propriétés pro-prolifératives et anti-apoptotiques de la S1P suggèrent l’implication de la voie
SphK1/S1P dans progression tumorale. En effet, une dérégulation du biostat sphingolipidique en
faveur de la S1P est retrouvée dans les cancers. La S1P joue notamment un rôle crucial dans la
99!
survie et la prolifération des cellules tumorales, dans la progression et l’angiogenèse tumorale
ainsi que dans la dissémination métastatique et la résistance aux traitements (Pyne and Pyne
2010, Maceyka et al. 2012).
3.3.1. Le biostat sphingolipidique dans la survie et la prolifération tumorale
Dans les cancers, la surexpression de la SphK1 entraine une dérégulation du biostat
sphingolipidique en faveur de la S1P et au détriment du céramide. Ceci favorise la survie et la
prolifération cellulaire des cellules tumorales, via différents mécanismes. En premier lieu, le
céramide a émergé comme étant un médiateur clé de l’apoptose. En effet, le céramide peut activer
la PP2A qui régule des protéines pro-apoptotiques telles que p53 et anti-apoptotiques telles que
Bcl-2 et Akt. Le céramide peut également activer la PKC-ζ et la cathepsine D qui induit le clivage
de BID et active ainsi la voie intrinsèque de l’apoptose. Au niveau de la membrane externe de la
mitochondrie, le céramide favorise la libération de cytochrome c, ce qui aboutit à l’activation de la
caspase 9 et donc au déclenchement de l’apoptose (Giussani et al. 2014). En second lieu, il a été
montré que le biostat sphingolipidique est impliqué dans le contrôle de l’autophagie, un
processus de recyclage des constituants cellulaires par les cellules eucaryotes, pouvant aboutir à
la survie ou à la mort cellulaire (Li et al. 2014). Des études ont montré que dans des cellules
tumorales, le céramide est capable d’induire la mort cellulaire par autophagie en inhibant la voie
PI3K/Akt, en augmentant l’expression de Beclin1 et en interagissant avec LC3 (Scarlatti et al.
2004, Sentelle et al. 2012, Li et al. 2014). A l’inverse, il a été montré qu’en condition de privation de
nutriments, la S1P induit une autophagie protectrice, aboutissant à la survie de cellules tumorales
mammaires (Lavieu et al. 2006). Enfin, la dérégulation du biostat sphingolipidique en faveur de la
voie SphK1/S1P favorise la croissance et la prolifération cellulaire, d’une part via l’activation des
voies PI3K/Akt et MAPK, et d’autre part en diminuant l’expression de p21 et p27 induites par le
céramide (Morad and Cabot 2013).
!
3.3.2. La voie SphK1/S1P dans l’initiation et la progression tumorale
C’est en 2000 que le caractère « oncogénique » de la SphK1 a été mis en évidence. En effet, une
étude a montré que la surexpression de la SphK1 dans des fibroblastes leur confère des propriétés
transformantes, telles que la capacité à proliférer en absence de sérum, à former des colonies en
agar mou et à former des tumeurs chez des souris immunodéficientes SCID (Severe Combined
ImmunoDeficiency) (Xia et al. 2000). De plus, l’activité de la SphK1 serait nécessaire à la
100!
transformation oncogénique induite par Ras (Xia et al. 2000). Enfin, la localisation de la SphK1 à la
membrane plasmique serait essentielle à cette fonction pro-tumorale (Pitson et al. 2005).
Bien qu’aucune mutation de la SphK1 n’ait été retrouvée dans les cancers, des études ont montré
une augmentation de l’expression de l’ARNm, de la protéine, ou de l’activité de la SphK1 dans de
nombreuses tumeurs humaines en comparaison du tissu sain. C’est le cas dans les cancers du
sein, de l’utérus, de l’ovaire, du poumon, du côlon, du rectum, de la prostate, de l’estomac, du
rein, du foie, des voies aériennes et digestives supérieures, dans les glioblastomes et dans les
lymphomes (French et al. 2003, Johnson et al. 2005, Malavaud et al. 2010, Zhang et al. 2014c). De
plus, cette surexpression de la SphK1 corrèle très souvent avec un grade tumoral élevé, une
résistance aux traitements et une diminution de la survie des patients (Van Brocklyn et al. 2005,
Malavaud et al. 2010, Zhang et al. 2014c).
La SphK2 n’est pas retrouvée surexprimée dans les cancers, et peu d’études y décrivent son
implication. L’une d’entre elles a montré que la déplétion de la SphK2 inhibe la prolifération de
cellules de glioblastome, ceci plus efficacement que le ciblage de la SphK1 (Van Brocklyn et al.
2005). Une autre a montré que l’inhibition de la SphK2 entraine une diminution de la croissance
tumorale dans un modèle murin de myélome multiple (Venkata et al. 2014). Enfin, une troisième
étude montre que la déplétion génétique de la SphK2 inhibe la tumorigenèse dans un modèle de
leucémie lymphoblastique aigüe et que son inhibition pharmacologique augmente la survie de
souris porteuses de tumeurs humaines (Wallington-Beddoe et al. 2014). Ces deux dernières études
mettent en évidence la régulation positive de l’oncogène c-Myc par la SphK2.
Concernant les S1PRs, des études récentes ont montré qu’ils peuvent être mutés ou surexprimés
dans les tumeurs humaines. Ainsi, le S1P2 est retrouvé muté dans des cas de lymphomes, et le
S1P5 serait surexprimé dans certaines leucémies (Kothapalli et al. 2002, Cattoretti et al. 2009). A
l’inverse, une étude a montré que le S1P1 est moins exprimé dans des cas de glioblastome que
dans le tissu sain, et que son expression corrèle avec la survie des patients (Yoshida et al. 2010b).
Par la suite, une étude a montré qu’une forte expression des S1P1 et S1P3 corrèle avec une
diminution de la survie de patientes souffrant de cancer du sein positif pour le récepteur aux
oestrogènes, à l’inverse de l’expression du S1P2 qui corrèle avec une augmentation de leur survie
(Ohotski et al. 2013). La forte expression du S1P4 corrèle quant à elle avec une diminution de la
survie de patientes atteintes d’un cancer du sein triple négatif (Ohotski et al. 2012). Enfin, une
étude effectuée sur 201 échantillons de patients et 183 échantillons contrôles indique que la forme
nucléaire du S1P3 est globalement surexprimée dans les tumeurs en comparaison du tissu sain
101!
(Wang et al. 2014a). Ainsi, en fonction du contexte et de l’expression relative des S1PRs, la S1P
peut exercer divers effets. Généralement, elle stimule la prolifération, la survie et la motilité des
cellules cancéreuses via l’activation des S1P1 et S1P3 et donc des MAPK, d’Akt et de Rac. Ainsi, il a
été montré que l’axe S1P/S1P3 favoriserait l’expansion de cellules souches cancéreuses (Hirata et
al. 2014). De plus, une étude montre que le S1P1 induit l’expression de l’IL-6 et l’activation
persistante de STAT3, qui à son tour va augmenter l’expression du S1P1. Cette boucle de
rétrocontrôle favoriserait la transformation induite par l’inflammation et accélèrerait la
progression tumorale (Lee et al. 2010). A l’inverse, la S1P inhibe la motilité des cellules
cancéreuses en activant la voie S1P2/Rho (Pyne and Pyne 2010, Maceyka et al. 2012).
De nombreuses interactions entre la signalisation induite par la voie SphK1/S1P et celles induites
par des facteurs de croissance ont été impliquées dans les cancers. Les S1PRs peuvent fonctionner
de concert avec des récepteurs aux facteurs de croissance afin de réguler la prolifération
tumorale, la migration et l’angiogenèse. Par exemple, l’EGF stimule l’activité de la SphK1 pour
réguler la migration cellulaire, alors que la S1P peut induire la production d’EGF et la
transactivation de l’EGFR (Meyer zu Heringdorf et al. 1999, Shida et al. 2004, Sukocheva et al.
2006)). De même, la voie de la S1P peut interagir avec celles du FGF, du TGF-β (Transforming
Growth Factor β), du VEGF et du PDGF (Pyne and Pyne 2010).
3.3.3. La voie SphK1/S1P dans l’angiogenèse et la dissémination métastatique
La S1P extracellulaire et les S1PRs jouent un rôle crucial dans le développement et le maintien
l’intégrité du système vasculaire (cf. 2.2. et 3.2.1.). De nombreuses études ont donc caractérisé le
rôle de la voie SphK1/S1P dans la régulation de l’angiogenèse tumorale.
Le S1P1 étant fortement exprimé au niveau des vaisseaux sanguins tumoraux, une étude a montré
que sa déplétion par siRNA inhibe la migration de cellules endothéliales in vitro (Chae et al. 2004).
De plus, l’injection de ce siRNA dans un modèle de tumeur sous-cutanée in vivo déstabilise le
réseau vasculaire tumoral et inhibe l’angiogenèse, ce qui conduit à une diminution de la
croissance tumorale (Chae et al. 2004). A l’inverse, le S1P2 régulerait négativement la migration
cellulaire et l’angiogenèse. En effet, une étude a montré que l’injection de cellules tumorales chez
des souris S1P2-/- entraine une accélération de la croissance tumorale corrélée avec une
augmentation de la densité vasculaire et du recrutement de cellules musculaires lisses et de
péricytes autour des néo-vaisseaux (Du et al. 2010). Le FTY720 étant un antagoniste fonctionnel
du S1P1 qui n’a pas d’effet sur le S1P2, une étude a montré que ce composé inhibe l’angiogenèse
102!
induite par la S1P et le VEGF ainsi que la perméabilité vasculaire induite par ce dernier. Le
FTY720 inhibe ainsi la croissance tumorale et favorise l’apoptose dans un modèle de mélanome in
vivo (LaMontagne et al. 2006).
La mise au point d’un anticorps neutralisant la S1P extracellulaire (Sphingomab®) a permis de
confirmer le rôle crucial de la S1P dans la régulation de l’angiogenèse tumorale. En effet, une
étude a montré que cet anticorps inhibe la migration de cellules endothéliales in vitro ainsi que
leur formation de tubes en Matrigel. Dans différents modèles murins, cette même étude montre
que l’anticorps anti-S1P ralentit la croissance tumorale en inhibant l’angiogenèse induite par le
VEGF, et diminue la sécrétion de VEGF et de cytokines pro-inflammatoires, comme l’IL-6, par les
cellules tumorales (Visentin et al. 2006). En accord avec ces données, une étude récente a montré
que le Sphingomab® diminue le flux sanguin tumoral (Zhang et al. 2015).
Le rôle de la voie SphK1/S1P dans la régulation de la dissémination métastatique est moins clair.
Alors qu’il était généralement admis que la S1P sécrétée par la tumeur est impliquée dans ce
phénomène, une étude a montré que le processus métastatique est régulé par la S1P systémique.
En effet, dans un modèle murin de cancer de la prostate, la déplétion systémique de la SphK1
inhibe la formation de métastases pulmonaires, alors que la déplétion de la SphK1 dans les
cellules tumorales n’a pas cet effet (Ponnusamy et al. 2012).
3.3.4. La voie SphK1/S1P dans la résistance thérapeutique
De nombreuses études ont impliqué la voie SphK1/S1P dans la résistance aux traitements anti-
cancéreux. En effet, afin de résister aux thérapies conventionnelles telles que la chimiothérapie et
la radiothérapie, les cellules tumorales empêchent l’accumulation de céramide, médiateur de
l’action pro-apoptotique de nombreux traitements, et augmentent la production de S1P qui
favorise la survie cellulaire (Giussani et al. 2014). Ainsi, des études ont montré que des lignées
cellulaires tumorales résistantes à la radiothérapie ne montrent pas d’augmentation du taux de
céramide en réponse à ce traitement, à l’inverse de lignées radiosensibles (Chmura et al. 1997,
Michael et al. 1997). De plus, la surexpression de la SphK1 inhibe l’apoptose et favorise la
chimiorésistance dans des modèles de cancers du sein, de la prostate, du pancréas et dans un
modèle de leucémie myéloïde aigüe (Nava et al. 2002, Bonhoure et al. 2006, Pchejetski et al. 2008,
Datta et al. 2014). De la même manière, la surexpression de la SphK1 confère une résistance à
l’imatinib à des cellules de leucémie myéloïde chronique, et son inhibition par le FTY720
sensibilise un modèle murin de cancer de la prostate à la radiothérapie (Baran et al. 2007,
Bonhoure et al. 2008, Pchejetski et al. 2010). Enfin, une étude a montré que l’activation de la SphK1
103!
après déprivation androgénique chronique – qui mime les thérapies anti-androgéniques –
constitue un mécanisme compensatoire qui permet aux cellules tumorales prostatiques de
survivre en absence d’androgènes (Dayon et al. 2009). L’activité de la SphK1 est ainsi corrélée à la
résistance thérapeutique et à l’agressivité tumorale dans de nombreux modèles tumoraux.
Récemment, deux études de notre équipe ont directement impliqué la S1P dans la résistance
thérapeutique à l’aide de l’anticorps anti-S1P. La première a montré que la S1P sécrétée par les
ostéoblastes active le S1P1 à la surface de cellules de métastases osseuses du cancer de la prostate,
afin de les rendre chimio- et radiorésistantes (Brizuela et al. 2014). La seconde étude a montré que
dans un modèle murin de cancer de la prostate, l’anticorps anti-S1P entraine une normalisation
transitoire du réseau vasculaire tumoral, qui favorise l’oxygénation de la tumeur et qui augmente
ainsi l’efficacité de la chimiothérapie (Ader et al. 2015).
3.3.5. Stratégies thérapeutiques ciblant la voie SphK1/S1P
La voie SphK1/S1P étant largement impliquée dans le développement et la progression tumorale
ainsi que dans la dissémination métastatique, elle constitue une cible thérapeutique pertinente en
cancérologie. Par conséquent, de nombreuses molécules dirigées contre les SphKs, la S1P ou les
S1PRs ont été développées dans le but d’améliorer l’efficacité des stratégies anti-tumorales
(Tableau 8).
Historiquement, la DHS et la DMS, des analogues de la sphingosine, ont été utilisés en tant
qu’inhibiteurs des SphKs. Des études ont montré que ces composés inhibent la croissance
tumorale dans de nombreux modèles et peuvent améliorer l’efficacité de radiothérapies et de
chimiothérapies (Cuvillier 2007). Cependant, ces composés manquent de spécificité puisqu’ils
sont capables d’inhiber la PKC et la CerK (Igarashi et al. 1989, Endo et al. 1991, Sugiura et al. 2002).
Par la suite, plusieurs inhibiteurs synthétiques des SphKs ont été identifiés par criblage (French et
al. 2003). Parmi eux, le SKI-II ou SKi, compétitif pour le site de liaison à la sphingosine, inhibe
l’apoptose dans différents modèles de cancer de la prostate et diminue la croissance tumorale in
vivo (Pchejetski et al. 2005, French et al. 2006, Sauer et al. 2009, Wang et al. 2013). Le SK1-I, un
analogue de la sphingosine, a ensuite été le premier inhibiteur considéré comme spécifique de la
SphK1 (Paugh et al. 2008).
Le composé ABC294640 est un inhibiteur compétitif du site de liaison de la sphingosine,
considéré comme spécifique de la SphK2 (French et al. 2010). Il inhibe la prolifération et la
migration in vitro, et diminue la croissance tumorale en induisant l’autophagie dans des modèles
de cancer du sein et du rein in vivo (Beljanski et al. 2010, French et al. 2010).
104!
Des inhibiteurs naturels des SphKs ont été isolés à partir de micro-organismes bactériens ou
fongiques. Il s’agit d’inhibiteurs spécifiques qui ne présentent pas d’activité envers la PI3K et la
PKC (Kono et al. 2000a, Kono et al. 2000b, Kono et al. 2002). Parmi eux, le B-5354c est un inhibiteur
non-compétitif du site de liaison de la sphingosine capable d’induire une chimiosensibilisation in
vitro et in vivo dans un modèle de cancer de la prostate (Pchejetski et al. 2008). Le F-12509A est un
inhibiteur compétitif du site de liaison de la sphingosine qui induit l’apoptose de cellules
leucémiques chimiorésistantes (Bonhoure et al. 2006, Bonhoure et al. 2008).
Deux anticorps anti-S1P, capables de neutraliser la S1P plasmatique et extracellulaire, ont été
produits à ce jour. Il s’agit du Sphingomab®, un anticorps monoclonal murin (cf. 3.3.2.), et de sa
forme humanisée, le Sonepcizumab (Asonep®) actuellement en phase II d’essai clinique pour le
traitement de certains adénocarcinomes rénaux métastatiques.
Il existe de nombreux agonistes et antagonistes des S1PRs dont l’efficacité anti-tumorale n’est pas
avérée, contrairement à celle du FTY720 (cf. 3.1.1. et 3.3.2.). Ce composé induit l’apoptose dans
des cellules de cancer du sein, de la vessie, de la prostate et dans des cellules de mélanome, et
peut inhiber l’angiogenèse et prévenir l’apparition de métastases in vivo (Wang et al. 1999, Azuma
et al. 2002, Azuma et al. 2003a, Azuma et al. 2003b, LaMontagne et al. 2006). En plus de son action
sur les S1PRs, le (S)-FTY720-P inhibe l’autotaxine, ce qui participe à son action anti-angiogénique
(van Meeteren et al. 2008). D’autre part, des études ont montré que le FTY720 inhibe la SphK1, la
SPL, la CerS, la PKC, la phospholipase A2 (PLA2) et active la PP2A (Matsuoka et al. 2003,
Bandhuvula et al. 2005, Payne et al. 2007, Vessey et al. 2007, Sensken and Graler 2010, Pitman et al.
2012).
105!
Tableau 8. Stratégies thérapeutiques ciblant la voie SphK1/S1P.
Molécule Cible(s) Ki /IC50/EC50 Effet(s) biologique(s) Référence(s) Ciblage des SphKs DMS (N,N-diméthylsphingosine), DHS (D,L-thréo-dihydrosphingosine)
SphKs Ki=5-12µM In vitro : IC (SphK1) ou INC (SphK2) du site de liaison de la sphingosine ; inhibition de la PKC et de la CerK ; inhibition de la croissance cellulaire, induction de l’apoptose ; sensibilisation aux radio- et chimio-thérapies In vivo : inhibition de la croissance tumorale Essai clinique de phase I : DHS en combinaison avec le cisplatine pour le traitement de tumeurs solides avancées
(Igarashi et al. 1989, Endo et al. 1991, Sugiura et al. 2002, Dickson et al. 2011)
SK1-I (BML-258 ; (2R,3S,4E)-N-méthyl-5-(4-pentylphényl)-2-aminopent-4ene-1,3-diol)
SphK1 Ki≈10µM In vitro : ICS ; sans effet sur les autres enzymes kinases (PKC, ERK…) ; inhibition de la croissance et de la survie cellulaire In vivo : inhibition de la croissance tumorale et de l’angiogenèse
(Paugh et al. 2008, Kapitonov et al. 2009)
SKi (SKI-II ; 2-(p-hydroxyanilino)-4-(p-chlorophényl)thiazole)
SphKs IC50=0,5µM In vitro : ICS; sans effet sur la PKC, la PI3K et ERK ; inhibition de la dihydrocéramide désaturase ; inhibition de la prolifération cellulaire et induction de l’apoptose ; sensibilisation à la chimiothérapie In vivo : inhibition de la croissance tumorale
(French et al. 2003, Pchejetski et al. 2005, French et al. 2006, Guillermet-Guibert et al. 2009, Wang et al. 2013, Cingolani et al. 2014)
B-5354c SphKs Ki≈3µM In vitro : INCS; sans effet sur la PKC et la PI3K; sensibilisation à la chimiothérapie In vivo : inhibition de la croissance tumorale
(Kono et al. 2000b, Kono et al. 2002, Pchejetski et al. 2008)
F-12509A SphKs Ki≈5µM In vitro : ICS ; sans effet sur la PKC et la PI3K; induction de l’apoptose
(Kono et al. 2000a, Kono et al. 2002, Bonhoure et al. 2006, Bonhoure et al. 2008)
PF-543 SphK1 Ki≈3,6nM In vitro : ICS ; haute spécificité pour la SphK1 ; pas d’effet sur la prolifération et la survie cellulaire
(Schnute et al. 2012, Wang et al. 2014c)
ABC294640 (3-(4-chlorophenyl)-adamantane-1-acide carboxylique (pyridine-4-ylmethyl)amide)
SphK2 Ki≈10µM In vitro : ICS ; inhibition de la prolifération et de la migration cellulaire ; induction de l’autophagie In vivo : inhibition de la croissance tumorale ; induction de l’apoptose et de l’autophagie
(Beljanski et al. 2010, French et al. 2010)
!!!!!!!!!
106!
!!
Molécule
Cible(s)
Ki /IC50/EC50
Effet(s) biologique(s)
Référence(s)
Ciblage de la S1P Sphingomab®, Sonepcizumab (Asonep®, Isonep®)
S1P - In vitro : inhibition de la prolifération et de la migration cellulaire ; induction de l’apoptose ; inhibition de la production de VEGF, IL-6, IL-8 In vivo : inhibition de la croissance tumorale ; inhibition de l’angiogenèse ; diminution de l’hypoxie intratumorale et de la dissémination métastatique Essai clinique de phase I : Isonep® pour le traitement de la dégénérescence maculaire liée à l’âge Essai clinique de phase II : Asonep® pour le traitement des adénocarcinomes rénaux réfractaires
(Visentin et al. 2006, O'Brien et al. 2009, Ader et al. 2015) NCT00767949 NCT01762033
Ciblage des S1PRs FTY720 (Fingolimod Gilenya®), (S)-FTY720-P
S1P1 S1P3 S1P4 S1P5 SphK1 SphK2
EC50=0,3-0,6nM EC50≈3nM EC50=0,3-0,6nM EC50=0,3-0,6nM Ki=2µM Km=18,2µM
In vitro : phosphorylation par la SphK2 ; agoniste des S1P1, S1P3, S1P4, S1P5 ; antagoniste fonctionnel du S1P1 ; inhibition de l’autotaxine, de la SphK1, de la SPL, de la CerS, de la PKC, de la PLA2 ; activation de la PP2A ; inhibition de la prolifération ; induction de l’apoptose In vivo : inhibition de la croissance tumorale ; inhibition de l’angiogenèse ; inhibition de la dissémination métastatique ; lymphopénie
(Wang et al. 1999, Azuma et al. 2002, Brinkmann et al. 2002, Mandala et al. 2002, Azuma et al. 2003a, Azuma et al. 2003b, Billich et al. 2003, Matsuoka et al. 2003, Bandhuvula et al. 2005, LaMontagne et al. 2006, Payne et al. 2007, Vessey et al. 2007, van Meeteren et al. 2008, Sensken and Graler 2010, Lim et al. 2011, Pitman et al. 2012)
Ciblage des S1PRs W146 S1P1 Ki=77nM In vitro : antagoniste du S1P1 (Gonzalez-Cabrera
et al. 2008) VPC23019 S1P1
S1P3 Ki≈30nM In vitro : antagoniste des S1P1 et S1P3
(Davis et al. 2005)
JTE013 S1P2 IC50=17,6nM In vitro : antagoniste du S1P2 ; inhibition de la prolifération et de la migration cellulaire ;
(Osada et al. 2002, Liu et al. 2014)
ICS : inhibition compétitive du site de liaison à la sphingosine ; INCS : inhibition non-compétitive du site de liaison à la sphingosine.
107!
Problématique
108!
109!
Les adénocarcinomes rénaux à cellules claires (ccRCC), qui représentent 70% de l’ensemble
cancers du rein, ont une incidence en augmentation constante. Alors que la survie globale à 5 ans
des patients atteints d’un ccRCC est de 72%, 20 à 30% d’entre eux sont diagnostiqués au stade
métastatique, ce qui réduit considérablement leur espérance de vie. En effet, la survie globale à 5
ans de ces patients chute à 10% (Bhatt and Finelli 2014, DeSantis et al. 2014, Jonasch et al. 2014).
Les ccRCC étant résistants aux traitements conventionnels, tels que la chimiothérapie, la
radiothérapie et les thérapies ciblées, une meilleure connaissance des voies moléculaires
impliquées dans la carcinogenèse des ccRCC est donc essentielle pour élargir l’arsenal
thérapeutique et améliorer le pronostic de survie de ces patients (Fisher et al. 2013).
L’inactivation somatique biallélique du gène VHL se produit dans la plupart des ccRCC
sporadiques où l’incidence d’une mutation de ce gène peut atteindre 91% selon les études
(Gossage et al. 2015). La conséquence majeure de la perte de la protéine pVHL est la stabilisation
des facteurs de transcription HIF qui, via l’activation de la transcription de leurs gènes cibles,
stimulent l’angiogenèse tumorale, faisant ainsi des ccRCC des tumeurs fortement mais
irrégulièrement vascularisées (Iliopoulos et al. 1996, Maxwell et al. 1999). Cette vascularisation
structurellement et fonctionnellement anormale rend les ccRCC hypoxiques, ce qui favorise
l’agressivité tumorale. En effet, les cellules tumorales s’adaptent et survivent à l’hypoxie
intratumorale en activant les facteurs de transcription HIF-1 et HIF-2 qui régulent l’expression de
nombreux gènes impliqués dans des processus cruciaux de la biologie du cancer tels que la
prolifération cellulaire, la reprogrammation métabolique, l’angiogenèse tumorale ou encore la
dissémination métastatique (Semenza 2012b). Des études ont montré que les facteurs HIF sont
surexprimés dans de nombreuses tumeurs humaines, telles que les glioblastomes, les
adénocarcinomes prostatiques et les ccRCC (Zhong et al. 1999, Rankin and Giaccia 2008). Cette
surexpression étant corrélée à un mauvais pronostic et à l'échec thérapeutique, les facteurs HIF
constituent donc des cibles thérapeutiques pertinentes en cancérologie (Melillo 2007).
De nombreuses études ont confirmé l’importance des facteurs HIF dans la progression des
ccRCC. Parmi elles, plusieurs études suggèrent que c’est HIF-2α, et non HIF-1α, qui jouerait un
rôle crucial dans ces cancers où il serait notamment nécessaire et suffisant pour induire la
croissance tumorale (Kondo et al. 2002, Kondo et al. 2003, Keith et al. 2012). Cependant, à ce jour,
seule l’activation constitutive de HIF-1α, et non de HIF-2α, dans les cellules du tubule proximal
de souris a été décrite comme favorisant le développement d’un ccRCC (Fu et al. 2011, Fu et al.
2013). Ainsi, l’inhibition de HIF-1α et HIF-2α dans les ccRCC représente une stratégie
thérapeutique pertinente.
Longtemps considérés comme simples composants structuraux des membranes cellulaires, les
sphingolipides constituent une classe de lipides bioactifs qui régulent de nombreux processus
110!
biologiques fondamentaux tels que la prolifération, la survie et la migration cellulaire ainsi que
l’angiogenèse, la réponse inflammatoire et la progression tumorale (Maceyka et al. 2012). Parmi
ces sphingolipides, le céramide et la S1P ont largement été impliqués dans la progression
tumorale et la résistance thérapeutique. En effet, le céramide induit des réponses pro-
apoptotiques et anti-prolifératives, à l’inverse de la S1P qui a des propriétés pro-prolifératives et
anti-apoptotiques. Les effets opposés de ces deux sphingolipides ont conduit au concept selon
lequel l’équilibre dynamique entre les taux de céramide et de S1P représente un facteur
déterminant pour le devenir de la cellule (Cuvillier et al. 1996). Un des acteurs majeurs de cet
équilibre est la SphK1 qui phosphoryle la sphingosine, catabolite direct du céramide, pour former
la S1P. Une fois générée, la S1P peut agir soit intracellulairement, soit extracellulairement de
manière autocrine ou paracrine en se liant à l’un de ses cinq récepteurs couplés aux protéines G
(S1P1-5) (Maceyka et al. 2012).
Des études ont montré que la dérégulation de la balance sphingolipidique contrôlée par la SphK1
est importante dans l’acquisition du phénotype malin. La preuve en est que la surexpression de la
SphK1 dans des fibroblastes induit leur transformation et leur capacité à former des tumeurs chez
la souris SCID, et que l’expression de la SphK1 est fréquemment augmentée dans de nombreuses
tumeurs solides (Xia et al. 2000, French et al. 2003, Johnson et al. 2005). De plus, cette surexpression
de la SphK1 est corrélée à une plus forte agressivité tumorale et à une diminution de la survie des
patients (Pyne and Pyne 2010). En particulier, notre équipe a montré que la suractivation de la
SphK1 corrèle avec l’agressivité des adénocarcinomes prostatiques et avec leur récidive après
prostatectomie (Malavaud et al. 2010). D’autre part, de nombreuses études ont montré que la
surexpression de la SphK1 favorise la chimio- et la radiorésistance dans différents modèles de
cancers (Pchejetski et al. 2005, Bonhoure et al. 2006, Pchejetski et al. 2008, Guillermet-Guibert et al.
2009, Datta et al. 2014).
Des travaux de notre équipe ont permis de révéler des interconnexions étroites entre le
métabolisme sphingolipidique et la réponse à l'hypoxie. En effet, notre équipe a été à l’origine de
la première démonstration du rôle de la SphK1 comme régulteur de HIF-1α en hypoxie dans de
nombreux types cellulaires tumoraux, dont les ccRCC (Ader et al. 2008). Ce travail a montré que
l’inhibition de la SphK1 induit la dégradation protéasomale de HIF-1α selon un mécanisme
dépendant de pVHL. Plus récemment, nous avons établi que la neutralisation de la S1P
extracellulaire dans un modèle murin de cancer de la prostate entraine une normalisation
transitoire du réseau vasculaire tumoral, qui favorise l’oxygénation de la tumeur et qui augmente
ainsi l’efficacité de la chimiothérapie (Ader et al. 2015). Enfin, nos résultats préliminaires semblent
indiquer qu’en hypoxie, la SphK1 contrôle le taux intracellulaire de HIF-2α dans des lignées de
111!
glioblastomes et d’adénocarcinomes prostatique et pulmonaire, ainsi que dans les ccRCC
(Gstalder et al. 2015).
Au vu de l’ensemble de ces résultats, et en considérant l’importance des facteurs HIF dans la
progression tumorale des ccRCC, mon projet de thèse s’organise autour de trois objectifs :
1) Caractériser in vitro les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de
HIF-2α via la SphK1 ;
2) Caractériser l’implication des S1PRs dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α ;
3) Evaluer in vivo l’effet de l’inhibition de la voie SphK1/S1P sur l’adaptation à
l’hypoxie intratumorale et sur la sensibilisation à la chimiothérapie dans un modèle
murin de ccRCC.
112!
113!
Matériels et Méthodes
114!
115!
Ce chapitre concerne les parties 2 et 3 du chapitre « Résultats expérimentaux »
1. Lignées cellulaires et conditions de culture
La lignée cellulaire CAKI-1 est issue d’une métastase de peau d’un adénocarcinome rénal à
cellules claires. La lignée cellulaire A498 dérive d’une tumeur primaire d’un adénocarcinome
rénal à cellules claires. La lignée cellulaire PC3 a été établie à partir d’une métastase osseuse d’un
adénocarcinome prostatique de grade 4. La lignée cellulaire U87 est issue d’une lignée
astrocytaire dérivant d’un gliome malin. Les lignées CAKI-1-shCtrl et CAKI-1-shS1P1 ont été
établies par le plateau de vectorologie de Rangueil (CRCT, Toulouse) à l’aide du plasmide
pLKO.1-puro-CMV-tGFP contenant une séquence « Non Target Control » correspondant au
shCtrl, ou la séquence GCTGCTCAAGACCGTAATTAT (Clone ID : TRCN0000011360)
correspondant au shS1P1 (Sigma).
L’ensemble de ces lignées sont cultivées dans du milieu RPMI 1640 (Life Technologies) contenant
du Glutamax® supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal décomplémenté. De la puromycine
(20µg/mL) est ajoutée au milieu de culture des lignées CAKI-1-shCtrl et CAKI-1-shS1P1.
Toutes les lignées sont maintenues à 37°C, en atmosphère humide contenant 5% de CO2.
Lorsque les expériences sont réalisées en hypoxie, les cellules sont placées dans une enceinte à
hypoxie (InVivo2 400, Ruskinn), dont l’atmosphère contient 0,1% d’oxygène, 95% d’azote et 5% de
CO2.
2. Modèles animaux et conditions expérimentales
Les souris utilisées sont des femelles NMRI nu/nu âgées de 6 semaines. Elles sont identifiées par
tatouage au niveau des pattes et xénogreffées de manière hétérotopique. Dix millions de cellules
d’adénocarcinome rénal à cellules claires CAKI-1 ou un fragment tumoral de 2mm3 est ainsi
implanté en sous-cutané à chaque souris. Le volume tumoral et le poids des animaux sont suivis
de façon hebdomadaire. La longueur (L) et la largeur (l) des tumeurs sont mesurées à l’aide d’un
pied à coulisse et le volume tumoral est déterminé par la formule «L x l2 x 0,52 ». Lorsque le
volume tumoral atteint 100mm3, les souris sont traitées par injection intra-péritonéale de FTY720
2,5mg/kg/j (contrôle : DMSO) et/ou de gemcitabine 2mg/kg (contrôle : PBS) deux fois par
semaine. Un prélèvement sanguin rétro-orbital est effectué la veille du sacrifice. Après anesthésie
116!
à l’isoflurane (IsoVet) et prélèvement du sang total par ponction cardiaque, les animaux sont
sacrifiés par dislocation cervicale.
3. Anticorps
Le tableau 9 ci-dessous recense les anticorps utilisés ainsi que leurs conditions d’utilisation.
Tableau 9. Anticorps et conditions d’utilisation
Cy3 : cyanine 3 ; FITC : fluorescein isothiocyanate ; HRP : horseradish peroxydase ; IHC : immunohistochimie, IF : immunofluorescence, TA : température ambiante, WB : western blot.
Anticorps Fournisseur Conditions d’utilisation Primaires Caspase-3 clivée CD34 Cycline D1 Desmine HIF-1α HIF-2α KI67 Pimonidazole S1P1 S1P2 S1P3 S1P4 S1P5 αSMA
αtubuline
Cell Signaling (#9661) Abcam (ab8158) Cell Signaling (#2926) Abcam (ab8592) BD (610959) Novus (NB100-122) BD (550609) Hypoxyprobe (4.3.11.3) Novus (NBP1-95120) Sigma (HPA014307) Novus (NBP1-95141) Abcam (ab126392) Abcam (ab92994) Dako (M0851) Santa Cruz (sc-32293)
IHC, 1:300 dans SignalStain Antibody Diluent (Cell Signaling #8112L), 16h à 4°C IF, 1:400 dans PBS, 16h à 4°C WB, 1:1000 dans TBST 5% lait, 16h à 4°C IF, 1:50 dans PBS, 1h30 à TA WB, 1:1000 dans TBST 1% BSA, 16h à 4°C WB, 1:1000 dans TBST 1% BSA, 16h à 4°C IF, 1:50 dans PBS, 16h à 4°C IHC, 1:50 dans TBS, 30minutes à TA WB, 1:10000 dans TBST 1% BSA, 16h à 4°C WB, 1:1000 dans TBST 1% BSA, 16h à 4°C WB, 1:10000 dans TBST 1% BSA, 16h à 4°C WB, 1:1000 dans TBST 1% BSA, 16h à 4°C WB, 1:1000 dans TBST 1% BSA, 16h à 4°C IF, 1:200 dans MOM Protein Concentrate (MOM Kit, Vector), 1h à TA WB, 1:5000 dans TBST 1% BSA, 16h à 4°C
Secondaires AlexaFluor-488 (Souris) Biotine (Rat) Cy3 (Streptavidine et Souris DyLight-488 (Lapin) HRP (FITC) HRP (Lapin) HRP (Lapin et Souris)
Jackson (715-545-150) Jackson (712-065-153) Jackson (016-160-084 et 715-165-150) Jackson (711-485-152) Hypoxyprobe (4.3.11.3) Cell Signaling (#8114S) Bio-Rad (170-6515 et 170-6516)
IF, 1:200 dans PBS, 1h à TA IF, 1:200 dans PBS, 1h à TA IF, 1:200 dans PBS, 1h à TA IF, 1:200 dans PBS, 1h à TA IHC, 1:50 dans TBS, 30 minutes à TA IHC, 30 minutes à TA WB, 1:5000 dans TBST, 1h à TA
Tertiaires Cy3 streptavidine Jackson (715-545-150) IF 1:200
117!
4. Réactifs
Le FTY720 est fourni par Enzo Life Sciences. Il s’agit d’un antagoniste fonctionnel des récepteurs
S1P1, S1P3, S1P4 et S1P5. La solution stock est préparée dans du DMSO puis conservée à -20°C. Le
W146 est fourni par Avanti Polar Lipids. Il s’agit d’un antagoniste du récepteur S1P1. La solution
stock est préparée dans de l’ethanol 100% puis conservée à -20°C. La Gemcitabine (Gemzar®) est
fournie par l’Hôpilal Rangueil (Toulouse). La solution stock est conservée à 4°C puis diluée dans
du PBS avant injection.
5. Transfection d’ARN interférent
Les cellules sont transfectées de façon transitoire avec des siRNA dont les séquences sont
indiquées dans le tableau 10 ci-dessous.
Tableau 10. siRNA et conditions d’utilisation
Les transfections sont réalisées en utilisant la Lipofectamine® 2000 (Invitrogen) selon les
recommandations du fournisseur. Le milieu utilisé pour la transfection est l’Opti-MEM
supplémenté par 5% de glutamine (Life Technologies).
6. Western blot
Après lavage au PBS froid, les cellules sont récupérées par grattage puis centrifugées à 600g
pendant 5 minutes à 4°C avant d’être stockées à -80°C. Les échantillons de tumeurs fraîches sont
récupérés et stockés à -80°C.
Les culots cellulaires sont ensuite lysés, les tumeurs fraiches broyées puis lysées dans les tampons
et les conditions appropriées. Pour l’analyse de l’expression des sous-unités HIF-α et des S1PRs,
les cellules sont lysées dans le tampon suivant : Tris/HCl pH 7,4 50mM, NaCl 120mM, EDTA
1mM, EGTA 6mM, Na4P2O7 15mM, NaF 20mM, NP-40 1%. Ce tampon de lyse est supplémenté en
PMSF 1mM et en cocktail d’inhibiteurs de protéases 1% (Sigma, P3840) extemporanément. Les
siRNA Séquence sens 5’-3’ Fournisseur Conditions d’utilisation siS1P1(a) siS1P1(b) siScramble
CGGUGGUGUUCAUUCUCAU, GCUAUAUCACAAUGCUGAA, GAAGCGCUCUUUACUUGGU GAGUUAGUUCCUGUGAACA Inconnue
Santa Cruz (sc-37086) Sigma Eurogentec
50nM, 72h 40nM, 72h 50nM, 72h
118!
doses de PMSF et de cocktail d’inhibiteurs de protéases sont triplées si l’échantillon est une
tumeur fraîche. Pour l’analyse de l’expression de la cycline D1, les cellules sont lysées dans le
tampon suivant : NaCl 120mM, Tris/HCl pH 7,5 50mM, NP-40 1%, supplémenté en cocktail
d’inhibition de protéases 1%, et en Na3VO4 1mM extemporanément.
La lyse s’effectue dans la glace pendant 20 minutes sous agitation régulière. Dans le cas des
tumeurs fraîches, la lyse s’effectue grâce à cinq cycles de congélation dans l’azote liquide,
décongélation dans de l’eau à température ambiante et agitation. Les lysats sont ensuite
récupérés par centrifugation à 16000g pendant 20 minutes à 4°C. La concentration en protéines
des échantillons est déterminée selon la méthode de Bradford (kit « Bio-Rad Protein Assay », Bio-
Rad). La lecture de l’absorbance à 595nm des échantillons est effectuée en duplicat et les
concentrations en protéines sont déterminées automatiquement par le spectrophotomètre contre
une gamme étalon d’albumine sérique bovine (BSA, Euromedex).
Des échantillons contenant tous la même quantité de protéines sont complétés avec le tampon de
charge approprié. Pour l’analyse de l’expression des facteurs HIF et des S1PRs, les échantillons
sont complétés avec du Laemmli Sample Buffer 2X (Bio-Rad) (1:1, v/v) et du β-mercaptoéthanol
5%. Pour l’analyse de l’expression de la cycline D1, les échantillons sont complétés avec du
tampon de charge Tris/HCl pH 6,8 62,5mM, SDS 2%, glycérol 20%, β-mercaptoéthanol 50mM,
bleu de bromophénol 0,1% (1:5, v/v) et dénaturés à 95°C pendant 5 minutes.
Les protéines sont ensuite séparées sur gel SDS/PAGE à 90V dans un tampon de migration
(Tris/HCl pH 8,5 25mM, glycine 250mM, SDS 0,1%), puis transférées sur des membranes de
nitrocellulose (Amersham) à 250mA pendant 90 minutes dans un tampon de transfert (Tris pH
8,1-8,5 48mM, glycine 39mM, éthanol 20%). Les membranes sont saturées pendant 1 heure en
TBS-Tween 0,1% lait 5% avant d’être incubées avec les anticorps primaires dirigés contre les
protéines d’intérêt (cf. Tableau 9). Après lavages au TBS-Tween 0,1%, les membranes sont
incubées avec les anticorps secondaires couplés à la HRP (HorseRadish Peroxidase). La révélation
est réalisée par chimioluminescence à l’aide du kit Amersham ECL Western Blotting Detection
Reagent (GE Healthcare).
7. Test ELISA
Ce test est réalisé sur des échantillons de plasma murin afin de doser le VEGF humain. Le test est
réalisé selon les recommandations du fournisseur (Invitrogen, #KHG0111). Les échantillons de
plasma murin sont obtenus par centrifugation du sang total des animaux à 1600g pendant 15
minutes à 4°C, puis stockés à -80°C. Tous les échantillons (50µL) sont testés en duplicats. Une fois
les échantillons déposés dans une plaque de 96 puits contenant un anticorps polyclonal anti-
119!
VEGF humain, le VEGF humain de l’échantillon est détecté par l’ajout d’un anticorps monoclonal
anti-VEGF humain biotinylé, puis de streptavidine couplée à la HRP. Après ajout du substrat de
la HRP, la lecture de l’absorbance à 450nm est effectuée à l’aide du spectrophotomètre µQuant®
(Bio-Tek) contre une gamme étalon de VEGF humain standard. L’absorbance mesurée est
proportionnelle à la concentration en VEGF humain présent dans l’échantillon. Une fois les
valeurs d’absorbance corrigées du facteur de dilution, moyennées et imputées de la valeur
d’absorbance du contrôle négatif ou « blanc », on obtient les absorbances « réelles » des
échantillons. Les log10 des concentrations en VEGF humain de chaque échantillon sont alors
obtenus en se référant à la courbe étalon établie à partir des log10 des absorbances « réelles » et
des log10 des concentrations théoriques de la gamme étalon.
8. Dosage de l’activité enzymatique de la sphingosine kinase 1
Le principe du dosage de l’activité enzymatique de la sphingosine kinase 1 repose sur la
quantification de la production de S1P radiomarquée ([γ32P]S1P) produite selon l’équation de
réaction suivante :
sphingosine + ATP + [γ32P] S1P + [γ32P]
La [γ32P]S1P produite est séparée par chromatographie sur couche mince puis révélée par
autoradiographie et quantifiée par un compteur à scintillation (Olivera and Spiegel 1998).
Après lavages au PBS froid, les cellules sont récupérées par grattage. Les cellules sont ensuite
centrifugées à 600g pendant 5 minutes à 4°C. Les culots cellulaires sont lysés dans le tampon
suivant : Tris/HCl pH 7,4 20mM, glycérol 20%, β-mercaptoéthanol 1mM, EDTA 1mM, NaF
15mM, 4-déoxypyrodoxine 0,5mM, β-glycérophosphate 40mM, Na3VO4 1mM. Ce tampon est
supplémenté en PMSF 1mM et en cocktail d’inhibiteurs de protéases 1% extemporanément. La
lyse s’effectue grâce à cinq cycles de congélation dans l’azote liquide, décongélation dans de l’eau
à température ambiante et agitation. Les lysats sont ensuite récupérés par centrifugation à 16000g
pendant 20 minutes à 4°C et les surnageants dosés pour leur concentration en protéines comme
décrit précédemment.
La réaction enzymatique est réalisée en présence de 100µg de protéines dans un volume de
180µL, de 10µl de sphingosine à 50mM (concentration finale : 1mM) et de 10µl d’un mélange
d’ATP 200mM en HEPES, de [γ32P] à 1 µCi (Perkin Elmer) et de MgCl2 400mM. La sphingosine est
€
+SphK1+MgCl2" → " "
120!
préparée de la façon suivante : après prélèvement des 10µL de sphingosine dissoute en éthanol, et
évaporation de l’éthanol sous sorbonne, la sphingosine est reprise en Triton X-100 5% puis
soniquée pendant 5 minutes. Le volume de [γ32P]ATP à prélever dépend de son activité. L’activité
du [γ32P]ATP est déterminée au jour de l’expérience à l’aide de la table de décroissance du 32P
(t1/2(32P)=14,3 jours) fournie par Perkin Elmer. Le volume à est calculé pour obtenir une activité
de 1µCi par condition.
La réaction enzymatique est effectuée à 37°C pendant 30 minutes puis arrêtée par l’ajout de 20µl
d’HCl 1N et de 800µl de CHCl3/CH3OH/HCl (100:200:1). Après centrifugation à 600g pendant 10
minutes, la phase organique inférieure contenant la [γ32P]S1P est récupérée puis lavée par
l’addition de 240µl de CHCl3 et 240µl de KCl 2N. Après une deuxième centrifugation à 600g
pendant 10 minutes, la phase organique inférieure contenant la [γ32P]S1P est récupérée et
évaporée sur la nuit.
Après évaporation, les échantillons sont repris dans 40µl de CHCl3/CH3OH (2:1) et déposés sur
des plaques de silice G60 (VWR). La chromatographie sur couche mince est réalisée en plaçant les
plaques dans une cuve saturée en solution éluante (1-butanol/méthanol/acide acétique/eau
distillée ; 80:20:10:20) pendant 3 heures. Après séchage, les plaques sont autoradiographiées sur la
nuit. L’autoradiographie permet de déterminer la position de la [γ32P]S1P sur la plaque afin de la
récupérer par grattage de la silice. La radioactivité correspondant à chaque échantillon est ensuite
quantifiée par un compteur à scintillation en présence de liquide à scintillation. Un échantillon
dépourvu de [γ32P] est préparé pour servir de blanc, et un aliquot de source de [γ32P]ATP est
compté pour déterminer son activité spécifique comme décrit plus bas.
L’activité enzymatique de la SphK1 correspond à l’activité spécifique de l’enzyme c’est-à-dire à la
quantité de produit formée par unité de temps par milligramme d’enzyme. L’activité
enzymatique de la SphK1 est donc exprimée en picomoles de [γ32P]S1P formées par milligramme
de protéines et par minute de réaction. La quantité de [γ32P]S1P formée correspond à la
radioactivité réelle de l’échantillon (cpm[γ32P]ATP – cpmblanc) normalisée par la quantité de
[γ32P]ATP par rapport à la quantité d’ATP froid (nATP = 200000 pmol).
€
[γ 32P]S1P =cpm
[γ 32P]ATP− cpmblanc
cpm[γ 32P]ATP
/ nATP
121!
L’activité spécifique est ensuite exprimée en picomoles de [γ 32P]S1P générée par milligramme de
protéines (m = 100µg) par minute (t = 30 minutes) grâce à la formule suivante :
9. Test de prolifération cellulaire
Le test utilisé est basé sur la capacité des cellules en prolifération à incorporer la thymidine tritiée
lors de la synthèse de l’ADN. Plus les cellules prolifèrent, plus elles incorporent cet élément
radioactif. La radioactivité est ensuite quantifiée.
Les cellules sont ensemencées à raison de 100.000 cellules par puits dans une plaque 6 puits.
Après 48 heures, la thymidine tritiée (Perkin Elmer) est ajoutée dans le milieu à une concentration
finale de 0,5µCi/ml. L’incubation dure 6 heures à 37 °C. Le milieu est ensuite aspiré et les cellules
rincées au PBS froid. Après deux lavages de 10 minutes par une solution d’acide tricarboxylique
10%, les cellules sont lysées par l’ajout de 1mL d’une solution de NaOH 0,3M 1% SDS. Apres une
incubation de 30 minutes, le lysat est récupéré et placé dans un tube contenant 4ml de liquide à
scintillation, puis la radioactivité est mesurée grâce à un compteur à scintillation.
10. Extraction d’ARN et RT-PCR quantitative
Les ARNs totaux sont extraits à partir de culots cellulaires à l’aide du kit RNeasy (Qiagen) selon
les recommandations du fournisseur. La concentration et la pureté des ARNs sont déterminées
par la mesure de l’absorbance à 260nm et 280nm par un NanoDrop (Thermo). Les cDNA sont
synthétisés par la réaction de transcription inverse à partir d’1µg d’ARN total à l’aide du kit
QuantiTect Primer Assay (Qiagen) selon le protocole du fourniseur. La PCR quantitative est
ensuite réalisée par un thermocycleur ABIPrism 7500 (Applied Biosystems) à l’aide du kit MESA
Green qPCR MasterMix Plus (Eurogentec) selon le protocole du fabricant et à partir des couples
d’amorces spécifiques des gènes ciblés (cf. tableau 11). Les gènes de ménage utilisés sont
ARNPOLII et YWHAZ. La réaction se compose d’une dénaturation initiale de 10 minutes à 95°C,
suivie de 40 cycles de (1) 15 secondes de dénaturation à 95°C, (2) 30 secondes d’hybridation
spécifique à la température adaptée et (3) 30 secondes d’élongation à 72°C. Les résultats sont
analysés par la méthode des ΔCt ou à l’aide de l’algorithme Genorm (Biogazelle).!
€
Activité spécifique =
cpm[γ 32P]ATP
− cpmblanc
cpm[γ 32P]ATP
/ nATP
x1000
m
t
122!
Tableau 11. Séquence des amorces utilisées
Cible Séquence sens 5’—3’ Séquence anti sens 5’—3’ Température d’hybridation
S1P1
S1P2
S1P3
S1P4
S1P5
ARN Pol II YWHAZ
AAATTCCACCGACCCATGTA CACCTGGCGGTACAAAGAAT GCTTCAGGAAATGGAAGCTG CTGCTCTTCACCGCCCTGGC GTGAGGTGGGAGCCATAGAA GCACCACGTCCAATGACAT ACTTTTGGTACATTGTGGCTTCAA
AGTTATTGCTCCCGTTGTGG GTCAAGTGGCAGCTGATGAA TCAGGATGCTGTGAAACTGC GAAGCCGTAGACGCGGCTGG TTGGCTGAGTCTCCCAGAGT GTGCGGCTGCTTCCATAA CCGCCAGGACAAACCAGTAT
60°C 60°C 63°C 63°C 60°C 60°C-63°C 60°C-63°C
11. Coloration à l‘hémalun-éosine
Les tumeurs sont récupérées, fixées pendant 16 heures à 4°C dans une solution de PBS-
paraformaldéhyde 4% puis déshydratées et incluses en paraffine à l’aide de l’automate Excelsior
ES Tissue Processor (Thermo Scientific). Des coupes de tumeur de 5µm d’épaisseur sont réalisées
à l’aide d’un microtome et montées sur des lames Superfrost Plus (EMS). Les coupes de tumeur
sont déparaffinées dans de l’Histoclear (National Diagnostics) puis réhydratées dans des bains
successifs d’éthanol et d’eau. Les coupes sont ensuite incubées dans une solution d’hémalun de
Mayer (Sigma) pendant 3 à 4 minutes, dans une solution bleuissante (H2O-NH3) pendant 1
minute et dans une solution d’éosine-orange pendant 2 minutes. Les coupes sont déshydratées
dans de l’éthanol, incubées dans de l’Histoclear avant d’être recouvertes d’une lamelle en
présence de milieu de montage (CoverSafe, American Master Tech Scientific).
12. Immunohistochimie et immunofluorescence
Les tumeurs sont récupérées, fixées pendant 16 heures à 4°C dans une solution de PBS-
paraformaldéhyde 4% puis déshydratées et incluses en paraffine à l’aide de l’automate Excelsior
ES Tissue Processor. Des coupes de tumeur de 5µm d’épaisseur sont réalisées à l’aide d’un
microtome et montées sur des lames Superfrost Plus. Les coupes sont ensuite déparaffinées dans
un four à 60°C pendant 1 heure puis dans de l’Histoclear (2 fois 5 minutes) avant d’être
réhydratées dans des bains successifs d’éthanol et d’eau.
123!
12.1. Immunohistochimie
Les coupes sont incubées dans une solution de peroxyde d’hydrogène 3% pendant 10 minutes
dans le but d’inhiber l’activité des peroxydases endogènes. Afin de démasquer les épitopes, les
coupes sont incubées pendant 15 minutes à 90°C dans un tampon citrate pH 6 10mM
préalablement chauffé à 90°C, puis laissées à refroidir pendant 30 minutes dans cette même
solution. Les coupes sont saturées pendant 1 heure dans un milieu de blocage (Maxblock
blocking medium, Active Motif) avant d’être incubées avec les anticorps primaires dirigés contre
les protéines d’intérêt (cf. Tableau 9). Après lavages au PBS ou TBS, les coupes sont incubées avec
les anticorps secondaires couplés à la HRP (cf. Tableau 9) avant d’être mises présence du substrat
de la HRP (3,3-diaminobenzidine tablets, Sigma) pendant 5 à 10 minutes. Les coupes sont ensuite
contre-colorées à l’aide d’une solution d’hématoxyline de Mayer (Sigma) avant d’être recouvertes
d’une lamelle en présence de milieu de montage (CoverSafe, American Master Tech Scientific).
12.2. Immunofluorescence
Afin de démasquer les épitopes, les coupes sont incubées pendant 15 minutes à 90°C dans un
tampon citrate pH 6 10mM préalablement chauffé à 90°C, puis laissées à refroidir pendant 30
minutes dans cette même solution. Les coupes sont saturées pendant 1 heure dans un milieu de
blocage (Maxblock blocking medium, Active Motif) avant d’être incubées avec les anticorps
primaires dirigés contre les protéines d’intérêt (cf. Tableau 9). Après lavages au PBS, les coupes
sont incubées avec les anticorps secondaires puis tertiaires (cf. Tableau 9). Les coupes sont ensuite
incubées pendant 3 minutes avec du 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 300nM avant d’être
recouvertes d’une lamelle en présence de milieu de montage (Mowiol).
13. Analyse de l’hypoxie intratumorale
L’hypoxie intratumorale est caractérisée après injection de pimonidazole (Hypoxyprobe®) en
intra-péritonéal à la dose de 60mg/kg, 30 minutes à 1h30 avant le sacrifice des animaux. Les
adduits de pimonidazole, représentatifs des zones d’hypoxie, sont détectés par
immunohistochimie (cf. Tableau 9).
124!
14. Analyse et quantification des immunomarquages
!Les lames sont scannées à l’aide du Nanozoomer 2.0-RS (Hamamatsu). Les conditions
d’acquisition sont optimisées en fonction des marquages. Au moins deux champs de 0,75mm2
représentatifs de chaque coupe de tumeur sont utilisés pour l’analyse et la quantification des
immunomarquages.
15. Numération formule sanguine
Un prélèvement sanguin rétro-orbital est effectué après anesthésie des animaux à l’isoflurane. La
numération formule sanguine est ensuite réalisée à l’aide de l’appareil ABX Micros 60
Haematology Analyzer, à partir d’un échantillon de 20 à 30µL de sang.
16. Analyse statistique
Les analyses statistiques des résultats sont réalisées à l’aide du logiciel Prism 5 (GraphPad
Software). Le test utilisé est le test de Student et le degré de significativité est indiqué (ns : non
significatif : p>0,05 ; * : p<0,05 ; ** : p<0,01 ; *** : p<0,001).
125!
Résultats
Expérimentaux
126!
127!
1. La voie SphK1/S1P, un nouveau régulateur clé de HIF-2α dans les ccRCC
1.1. Introduction
La voie SphK1/S1P est impliquée dans de nombreux processus physiologiques et
physiopathologiques tels que le cancer (Xia et al. 2000, Maceyka et al. 2012). Une fois formée, la
S1P peut agir sur ces cibles intracellulaires (Hait et al. 2009, Alvarez et al. 2010), ou bien, après
avoir été sécrétée dans le milieu extracellulaire par des transporteurs membranaires tels que
Spns2 (Kawahara et al. 2009, Nagahashi et al. 2013), elle peut agir de manière autocrine ou
paracrine en se liant à l’un de ses cinq récepteurs couplés aux protéines G, les S1PRs (Takabe et al.
2008). La surexpression de la SphK1 dans de nombreux cancers, à l’image des ccRCC, étant
souvent corrélée à une diminution de la survie des patients (Zhang et al. 2014c), la voie
SphK1/S1P constitue une cible thérapeutique pertinente en cancérologie (Cuvillier 2008). Ainsi,
plusieurs études précliniques ont établi que l’inhibition de la SphK1 permet de diminuer la
croissance tumorale et de sensibiliser des tumeurs à la chimiothérapie ou à la radiothérapie
(Pchejetski et al. 2008, Kapitonov et al. 2009, Pchejetski et al. 2010). Par ailleurs, des études ont
montré que la neutralisation de la S1P extracellulaire par le Sphingomab®, un anticorps
monoclonal anti-S1P, permet de diminuer la croissance tumorale et la dissémination métastatique
dans plusieurs modèles tumoraux (Visentin et al. 2006, Ponnusamy et al. 2012, Ader et al. 2015),
dont un modèle de ccRCC (Zhang et al. 2015).
L’hypoxie est une caractéristique de la plupart des tumeurs solides et constitue un facteur de
mauvais pronostic (Semenza 2012a). Elle favorise l’agressivité tumorale via l’activation des
facteurs de transcription HIF-1 et HIF-2, chacun constitués d’une sous-unité α stabilisée en
hypoxie et d’une sous-unité β exprimée constitutivement. Ces facteurs régulent l’expression de
nombreux gènes qui favorisent notamment l’angiogenèse, la glycolyse, la croissance tumorale, la
dissémination métastatique et la résistance thérapeutique (Semenza 2012a). Alors que HIF-1α est
exprimée de manière ubiquitaire, HIF-2α a une expression plus réduite qui inclut les tissus
fortement vascularisés, tels que les cellules épithéliales rénales (Wiesener et al. 2003). De plus,
HIF-1α et HIF-2α peuvent avoir des fonctions distinctes dans la progression tumorale (Keith et al.
2012), en particulier dans les ccRCC où HIF-2α promeut l’acquisition d’un phénotype tumoral
plus agressif (Gordan et al. 2008).
Notre équipe a montré pour la première fois que la SphK1 constitue un régulateur clé de HIF-1α
en hypoxie dans différentes lignées cellulaires tumorales humaines (Ader et al. 2008). Dans ces
modèles, la SphK1 inhibe la dégradation protéasomale de HIF-1α via la régulation de la voie
128!
Akt/GSK3β. Plus récemment, nous avons montré que la neutralisation de la S1P extracellulaire
par le Sphingomab® dans un modèle murin de cancer de la prostate inhibe HIF-1α, entraine une
normalisation du réseau vasculaire tumoral qui favorise l’oxygénation de la tumeur et augmente
ainsi l’efficacité du docétaxel, la chimiothérapie de référence pour les cancers de la prostate (Ader
et al. 2015). Sachant que nos résultats préliminaires semblent indiquer qu’en hypoxie, la SphK1
contrôle le taux intracellulaire de HIF-2α dans diférentes lignées tumorales, et au vu de
l’importance de HIF-2α dans les ccRCC, nous avons déterminé les mécanismes moléculaires
impliqués dans la régulation de HIF-2α par la SphK1. Ce travail est actuellement soumis pour
publication.
!
129!
1.2. Article soumis pour publication
!
Essential!role!for!SphK1/S1P!signaling!to!regulate!hypoxia8inducible!factor!2!α!expression!and!activity!
in!cancer!
!
Pierre!Bouquerel!1,2,4,*,!Cécile!Gstalder!1,2,4,*,!Jennifer!Laurent!1,2,4,!Leyre!Brizuela>Madrid!1,2,4,!Roger!A.!
Sabbadini!5,!Bernard!Malavaud!1,2,3,4,!Isabelle!Ader!1,2,4,!#!and!Olivier!Cuvillier!1,2,4,!#!
!1!CNRS,!Institut!de!Pharmacologie!et!de!Biologie!Structurale,!Toulouse,!France!2!Université!de!Toulouse,!UPS,!IPBS,!Toulouse,!France!3!Institut!Universitaire!du!Cancer!Toulouse!Oncopôle,!Toulouse,!France!4!Equipe!Labellisée!Ligue!contre!le!Cancer!5!Lpath!Inc.,!San!Diego,!CA,!USA!
*,#!These!authors!have!contributed!equally!to!this!study!
!
Running!title:!S1P!and!hypoxia>inducible!factor!2α!signaling!
!
Keywords:!sphingosine!1>phosphate,!sphingomab,!phospholipase!D,!HIF>2,!clear!cell! renal!carcinoma,!
VHL,!mTOR!!
!
Address!correspondence!to:!
Olivier!Cuvillier,!PhD!
Sphingolipid!and!Cancer!Research!Lab,!Institut!de!Pharmacologie!et!de!Biologie!Structurale,!CNRS!
UMR!5089,!!
205!route!de!Narbonne,!31077!Toulouse,!France!
E>mail:[email protected][email protected]!
or!
Isabelle!Ader!Perarnau,!PhD!;!STROMALab,!UMR5273!CNRS!UPS!EFS!INSERM!U1031,!Toulouse,!France;!
E>mail:!isabelle.ader>[email protected]!!
!
Conflict!of!interest!statement:!!Authors!would!like!to!disclose!that!Dr.!Roger!A.!Sabbadini!is!a!founder!
of!Lpath,!and!has!stock!in!the!company!and!is!an!inventor.!
!
!
!
130!
ABSTRACT!
!
Here,! we! report! the! first! evidence! that! the! sphingosine! kinase>1/sphingosine! 1>phosphate!
(SphK1/S1P)!signaling!regulates!the!transcription!factor!hypoxia!inducible!HIF>2α!in!diverse!cancer!cell!
lineages!notably!cell!renal!carcinoma!(ccRCC),!where!HIF>2α!has!been!established!as!a!driver!of!a!more!
aggressive!disease.!Under!hypoxic!conditions!or!in!!
ccRCC! lacking! a! functionnal! VHL! gene! and! overexpressing! HIF>2α,! SphK1! activity! controls! HIF>2α!
expression! and! transcriptional! activity! through! a! ROS>dependent! phospholipase! D! (PLD)! driven!
mechanism.!SphK1! silencing!promotes!a!VHL>independent!HIF>2α! loss!of!expression!and!activity! and!
reduces!cell!proliferation!in!ccRCC.!Importantly,!down>regulation!of!SphK1!decreases!the!rate!of!HIF>2α!
protein!synthesis,!and!is!associated!with!impaired!Akt,!mTOR,!p70!S6K!and!4EBP1!phosphorylation!in!
ccRCC.! Taking! advantage! of! a! monoclonal! antibody! neutralizing! extracellular! S1P,! we! show! that!
inhibition! of! S1P! extracellular! signaling! blocks! HIF>2α! accumulation! in! ccRCC! cell! lines,! an! effect!
mimicked!when!the!S1P!transporter!Spns2!is!silenced.!!
These!findings!demonstrate!that!SphK1/S1P!signaling!may!act!as!a!canonical!regulator!of!HIF>2α!
expression!in!ccRCC,!giving!support!to!its!inhibition!as!a!therapeutic!strategy!that!could!contribute!to!
reduce!HIF>2!activity!in!ccRCC.!
!
INTRODUCTION!
!
The!bioactive!sphingolipid!metabolite,!sphingosine!1>phosphate!(S1P),! is!a!critical!regulator!of!
multifarious! physiological! and! pathophysiological! processes! including! cancer! 32,! 43,! 45.! S1P! is! mainly!
formed!by!the!phosphorylation!of!sphingosine,! the!backbone!of!sphingolipids,!by!the!pro>oncogenic!
sphingosine!kinase>1!isoform!62.!S1P!is!a!ligand!for!five!high>affinity!G!protein>coupled!receptors!(S1P1>
5),!with! specific! effects! dictated!by! the! expression!pattern!of! S1P! receptor! subtypes! expressed! in! a!
particular!tissue56.!S1P!is!produced!intracellularly!and!exerts!its!paracrine!or!autocrine!effects!by!being!
secreted! by! specific! transporters! such! as! spinster! 2! (Spns2)! 18,! 29,! 35.! Alternative! GPCR>independent!
signaling!of!S1P!also!exists!59!with!recent!studies!establishing!direct!modulation!of!several!intracellular!
proteins! 3,! 22.! In! cancer,!S1P!metabolism! is!often! found! to!be!dysregulated!directing!attention! to! the!
SphK1/S1P!signaling!pathway!as!a!target!for!anti>cancer!drug!discovery!14,!45,!49.!SphK1!expression!is!up>
regulated! in! a! number! of! solid! tumors,! and! high! SphK1! expression! is! correlated! with! a! significant!
decrease!in!survival!rate!in!patients!with!several!forms!of!cancer!64.!In!some!cases,!as!in!ccRCC,!plasma!
levels!of!S1P!are!substantially!elevated!compared!to!healthy!control! levels!63.!A!number!of!preclinical!
studies!have!established! that!pharmacological! inhibition!of! SphK1! could!be!efficacious! in!decreasing!
tumor! size!or! sensitize! to! therapeutics! 28,! 39,! 41,! 42.! Interestingly,! the!anti>cancer! activity!of! an!anti>S1P!
131!
monoclonal!antibody!(sphingomabTM)! 36,!which!neutralizes!S1P!and! inhibits! its!extracellular!signaling,!
provides! evidence! of! the! importance! of! exogenous! S1P! in!mediating! tumor! growth! and!metastatic!
potential!2,!44,!60,!including!murine!models!of!ccRCC!63.!
Hypoxia! is! a! characteristic! of! solid! tumors! and! the! adaptation! of! cancer! cells! to! hypoxia! is!
instrumental! in! the!development!of! aggressive!phenotype!and!associated!with!a!poor!prognostic! in!
patients!51.!At!the!cellular!level,!the!adaptation!to!hypoxia!is!predominantly!mediated!by!the!hypoxia>
inducible! factors! (HIFs),! consisting!of! an!oxygen>sensitive!α>subunit! and! a! constituvely! expressed!β>
subunit,!that!regulate!the!expression!of!target!genes!promoting!angiogenesis,!glycolysis,!metastasis,!
increased!tumor!growth!and!resistance!to!treatments!51.!HIF>1α!and!HIF>2α!are!the!best!characterized!
HIF>α! subunit! 52.!While!HIF>1α! is! ubiquitously! expressed,!HIF>2α!has! a!more! limited! tissue!expression!
and!is!particularly!detected!in!highly!vascularized!organs!or!hypoxic!tissues!including!kidney!epithelial!
cells!61.!Despite!their!extensive!sequence!similarity!and!co>expression!in!various!cancer!cell!types,!HIF>
1α!and!HIF>2α!play!non>overlapping!roles!in!tumor!progression!30.!The!distinct!roles!of!HIF>1α!and!HIF>
2α! in! promoting! tumor! growth! have! been! mainly! defined! in! von! Hippel>Lindau! (VHL)! disease>
associated!clear!cell!renal!carcinoma!(ccRCC)!26,!which!results!in!a!constitutive!expression!of!either!HIF>
1α!and!HIF>2α!or!HIF>2α!alone,!and!where!the!role!for!HIF>2α!as!a!driver!of!a!more!aggressive!disease!
has!been!firmly!established!21,!46.!
We! previously! identified! SphK1/S1P! signaling! as! a! new! modulator! of! HIF>1α! activity! under! hypoxic!
conditions! owing! to! a! decreased! proteasome! degradation! of! HIF>1α! subunit! mediated! by! the!
Akt/GSK3β!pathway! in!various!cancer!cell!models! 1.!More! recently,!we! reported! in!a!prostate!cancer!
animal! model! that! sphingomab,! a! monoclonal! antibody! neutralizing! extracellular! S1P,! could! reduce!
hypoxia!and!associated!vascular!network!malfunction!by!interfering!with!HIF>1!activity!thus!enhancing!
delivery!and!efficacy!of!docetaxel,!the!standard!chemotherapy!2.!!!
For! the! first! time,! we! report! that! the! SphK1/S1P! signaling! pathway! may! act! as! a! canonical!
regulator! of! HIF>2α! expression! in!multiple! cancer! cell! lineages! (lung,! prostate,! glioma)! as!well! as! in!
ccRCC! cell! lines! (CAKI>1,! A498! and! 786>O)! representing! the! sub>groups! found! in! human! clinic.!
Therefore,! we! suggest! that! targeting! the! SphK1/S1P! signaling! represents! a! strategy! that! could!
potentially! be! exploited! in! therapeutic! approaches! to! decrease! HIF>2! activity! in! cancer! and! more!
particularly! in! ccRCC.! The! humanized! version! of! the! anti>S1P! mAb,! sonepcizumab,! is! currently! in! a!
phase!II!trial!in!RCC!patients!(www.clinicaltrials.gov!Identifier,!NCT00661414).!
!
!
!
!
!
132!
MATERIALS!AND!METHODS!
!
Chemicals!and!reagents!
Culture! medium! and! antibiotics! were! from! Lonza! (Basel,! Switzerland).! Serum! was! from! Perbio!
(Brebières, France).!SKI! II! SphK1! inhibitor! (CAS!Number!312636>16>1)! and!MG132!were!obtained! from!
Merck! Millipore! (Saint>Quentin! en! Yvelines,! France).! The! murine! monoclonal! anti>S1P! antibody,!
sphingomabTM,! was! as! described! previously! 36.! [γ>32P]! ATP! and! [9,10>3H(N)]>palmitic! acid! were! from!
Perkin! (Courtaboeuf,! France).! Silica! gel! 60! high! performance! TLC! plates!were! from! VWR! (Fontenay!
sous!Bois,!France).!All!other!reagents!were!from!Sigma!(Saint>Quentin!Fallavier,!France).!
Cell!lines!!
Human!prostate!PC>3!and! lung!A549!cell! lines!were!obtained! from!DSMZ! (Braunschweig,!Germany).!
Human! U87! glioblastoma! and! clear! cell! renal! carcinoma! (ccRCC)! CAKI>1! cells! were! from! ATCC!
(Molsheim,! France).! ! Human! ccRCC! A498! and! 786>O! were! kindly! supplied! by! Dr! G.! Melillo! (NCI,!
Frederick,! USA).! Cells! were! cultured! in! RPMI! containing! 10%! FBS! at! 37°C! in! 5! %! CO2! humidified!
incubators.!Cell! lines!were!routinely!verified!by!the!following!tests:!morphology!examination,!growth!
analysis! and! mycoplasma! detection! (MycoAlertTM,! Lonza).! All! experiments! were! started! with! low>
passaged!cells!(<15!times).!Hypoxia!(0.1%!O2,!5%!CO2,!94.5%!N2)!was!achieved!using!an!In!Vivo2!hypoxic!
workstation!(Ruskinn,!Bridgend,!UK).!
RNA!interference!experiments!
Transient! interference! was! achieved! by! double>stranded! human! siRNAs! 5’>
GGGCAAGGCCUUGCAGCUCdTdT>3’!(siSphK1)!40;!5’>AAGGAAACCUAGUAACUGAGC>3’!(siPLD1)!and!PLD2!
5’>AAUGGGGCAGGUUACUUUGCU>3‘! (siPLD2)! 37;! and! ! MISSION predesigned siRNAs! from! Sigma! for!
human! Spns2 Spns2 : Spns2 siRNAa : 5’-CGCUCAUGCUCUGCCCUUUdTdT-3’; and Spns2 siRNAb : 5’-
CACUCAUCCUCAUUCUGGUdTdT-3’ 2.!Aleatory!sequence!scrambled!siRNA!(siScr)!was!from!Eurogentec!
(Angers,! France).! Transfections! were! carried! out! using! Lipofectamine! 2000! in! OPTI>MEM! medium!
according!to!the!manufacturer’s!instructions!(Invitrogen,!Villebon>sur>Yvette,!France).!
SphK1!and!Phospholipase!D!enzymatic!assays!
The! protocol! for! the! determination! of! SphK1! enzymatic! activity! has! been! described! in! details!
previously!10.!PLD!activity!was!determined!as!reported!by!9!with!slight!modifications.!Cells!were!treated!
with!the!primary!alcohol,! 1>butanol! (0.3%),! instead!of!ethanol! (1%).!The!TLC!plates!were!developed! in!
this! case! with! the! superior! phase! from! a! mixture! of! ethylacetate/isooctan/acetic! acid/water!
(55/25/10/50).!!
Reporter!Gene!Assay!!!
For! luciferase! assays,! cells! were! plated! in! 24! wells! plates! and! transfected,! using! Lipofectamine!
133!
(Invitrogen),!with!150!ng!of!the!reporter!vector!(pRE>tk>LUC)!containing!three!copies!of!the!HRE!from!
the!erythropoietin!gene!and!50!ng!of!Renilla! luciferase!plasmid!DNA,!as!an! internal!control.!Twenty>
four! hours! after! transfection,! cells! were! incubated! under! normoxic! (20%! O2)! or! hypoxic! conditions!
(0.1%! O2)! for! 16! h.! Cells! were! then! lysed! and! luciferase! activities! were! measured! using! the! Dual!
Luciferase!Assay!Kit! (Promega)! following!manufacturer’s! recommendations.!Results!were!quantified!
with! a!MicroBeta! TRILUX! luminescence! counter! and! normalized! values!were! expressed! as! the! fold!
induction!over!control!cells.!
Western8blot!analysis!and!antibodies!
Rabbit! anti>HIF>2α! (Novus,! Littleton,! CO),! rabbit! anti–GLUT>1! (ThermoScientific,! Villebon>sur>Yvette,!
France),!mouse!cyclin!D1,!rabbit!p70!S6K,!rabbit!anti>phospho>p70!S6K!(Thr389),!rabbit!anti>phospho>
p70!S6K!(Thr421/Ser424),!rabbit!anti>mTOR,!rabbit!anti>phospho>mTOR!(Ser2448),!rabbit!anti>phospho!
4E>BP1! (Ser65),! rabbit! anti>Akt,! rabbit! anti>phopho>Akt! (Ser473)! (Cell! Signaling! Technology,!Danvers,!
MA),! rabbit! anti>Spns2! (Sigma)! were! used! as! primary! antibodies.! Proteins! were! visualized! by! an!
enhanced! chemiluminescence!detection! system! (Perbio)! using! anti>rabbit! or! anti>mouse!horseradish!
peroxidase>conjugated! IgG! (Bio>Rad).! Equal! loading! of! protein! was! confirmed! by! probing! the! blots!
with! anti>α>tubulin! (Santa! Cruz! Biotechnology,! Santa! Cruz,! CA)! antibody.! Densitometry! quantitation!
was!determined!using!Image!J!software!(NIH,!Bethesda,!MD).!
Quantitative!Real!Time!PCR!
Total!RNA!was!isolated!using!the!RNeasy!minikit!(Qiagen,!Courtaboeuf,!France)!and!1!µg!were!reversed!
transcribed!to!cDNA!using!the!SuperScript!Frist!Stand!Synthesis!System!(Invitrogen).!Quantitative!real!
time! PCR! was! performed! using! the! MESA! Blue! PCR! Master! mix! (Eurogentec).! Reactions! were!
performed! using! hSphK1! specific! primers! (forward! primer! 5’>CTGGCAGCTTCCTTGAACCAT>3’;reverse!
primer,! 5’>TGTGCAGAGACAGCAGGTTCA>3’),! hHIF>2>specific! primers! (forward! primer,! 5’>
TCCCACCAGCTTCACTCTCT>3’;reverse! primer,! 5’>TCAGAAAAAGGCCACTGCTT>3’),! and! actin>specific!
primers! (forward! primer,! 5’>ATTGGCAATGAGCGGTTCC>3’;! reverse! primer,! 5’>
GGTAGTTTCGTGGATGCCACA>3’).! For! analysis,! all! genes! were! normalized! to! expression! of! zeta!
polypeptide!(YWHAZ)!gene!as!endogenous!control.!!
Statistical!analysis!
The! statistical! significance! of! differences! between! the! means! of! two! groups! was! evaluated! by!
unpaired!Student’s!t!test.!All!statistical!tests!were!two>sided,!and!the! level!of!significance!was!set!at!
P<0.05.!Calculations!were!done!using!Prism!6!(GraphPad!Software,!San!Diego,!CA).!
!
!
!
!
134!
RESULTS!
!
Sphingosine! kinase81! activity! regulates! HIF82α! expression! under! hypoxia! in! multiple! cancer! cell!
lineages!
To!address!whether!SphK1!has!a! regulatory!role! in!HIF>2α!expression!under!hypoxia,!a!siRNA!
strategy! targeting! SphK1! (siSphK1)!was! used.! As! previously! reported! 1,! SphK1! activity!was!markedly!
decreased! (60>90%! range)! in!all! cancer! cell! lines! (prostate!PC>3,! lung!A549,!glioblastoma!U87,! ccRCC!
CAKI>1!and!A498)!treated!with!siSphK1!compared!to!scrambled!siRNA!(siScr)!(Fig!1A).! In!all!cell! lines,!
hypoxia!was!associated!with!a! remarkable!expression!of! !HIF>2α,!which!was!significantly! reduced!by!
siSphK1!treatment!(Fig!1B8F),!suggesting!that!SphK1!regulates!HIF>2α!in!addition!to!HIF>1α!as!formerly!
published!1,!12,!27.!!Considering! the! critical! role! of! HIF>2α! in! ccRCC! 21,! 26,! the! molecular! mechanisms! of! HIF>2α!
regulation!by!SphK1!were!further! investigated!in!three!ccRCC!cell! lines,!each!representing!one!of!the!
sub>groups! found! in! human! clinic! (expressing! either! HIF>1α! and! HIF>2α! or! HIF>2α! alone).! 786>0! and!
A498!ccRCC!cells!lack!a!functional!VHL!gene!and!express!only!HIF>2α,!whereas!CAKI>1!cells!(pVHL!wild>
type)! can! produce! both! HIF>1α! and! HIF>2α.! Noteworthy,! in! VHL>defective! A498! where! HIF>2α! is!
constitutively! present! under! normoxia! due! to! a! lack! of! degradation,! the! silencing! of! SphK1! also!
inhibited!its!expression!in!normoxic!conditions!(Fig!1F).!
!
Involvement!of!Phospholipase!D!in!regulating!HIF82α!SphK18driven!expression!in!ccRCC!
Because!phospholipase!D!(PLD)!activity!has!been!involved!in!the!control!of!HIF>2α!expression!
in! ccRCC! 57! and! is! an! upstream! regulator! of! SphK1! in! a! different! physiological! context! 9,! we! next!
examined! the! interactions! between! PLD! and! SphK1! signaling! with! regard! to! HIF>2α! expression.! In!
hypoxic!CAKI>1,!A498!cells!(Fig!2A)!and!786>O!cells!(Suppl.!Fig!1A),!an!early!transient! increase! in!PLD!
activity! (peaking! at! 15>30! min)! followed! by! activation! of! SphK1! (peaking! at! 60! min)! was! observed.!
Accordingly,!accumulation!of!HIF>2α!did!not!occur!before!2>3!h!of!hypoxia!in!CAKI>1!cells!(Fig!2A,!inset).!
Confirming!that!SphK1!activation!was!a!consequence!of!PLD!stimulation,!butan>1>ol!(1>ButOH),!a!potent!
inhibitor!of!the!PLD,!markedly!inhibited!SphK1!activity!in!all!ccRCC!cell!lines!(Fig!2B!and!Suppl.!Fig!1B).!
To!rule!out!any!possible!nonspecific!effect!of!the!alcohols!on!SphK1!activity,!cells!were!treated!in!the!
presence! of! t>butanol! (t>ButOH),! a! tertiary! alcohol,! which! is! not! a! substrate! for! PLD! inhibition.! As!
expected,!t>ButOH!did!not!alter!SphK1!activity! in!ccRCC!cell! lines!(Fig!2B!and!Suppl.!Fig!1B).!Unlike!t>
ButOH,!1>ButOH!markedly!inhibited!HIF>2α!expression!in!hypoxic!CAKI>1!cells!(Fig!2C,!left),!as!well!as!in!
normoxic!and!hypoxic!A498!cells!(Fig!2C,!right)!and!in!786>0!cells!(Suppl.!Fig!1C).!To!investigate!which!
PLD! isozyme!could!be! involved! in! the!PLD/SphK1/HIF>2α!signaling!sequence,!siRNAs!directed!to!PLD1!
and!PLD2!isoforms!were!used!37.!A!roughly!50%!PLD!knock>down!in!CAKI>1,!A498!and!in!786>0!cells!was!
135!
achieved! without! additive! effect! when! both! siRNAs! were! combined! (Suppl.! Fig! 2).! Under! hypoxia,!
both!PLD1!and!PLD2!siRNAs!significantly!reduced!>!although!not!to!the!same!extent!>!SphK1!activity!in!
CAKI>1! (Fig! 2D,! left),! A498! (Fig! 2D,! right)! and! 786>0! cells! (Suppl.! Fig! 1D).! Accordingly,! the! down>
regulation!of!SphK1!activity!was!accompanied!by!a!marked!reduction! in!HIF>2α!expression! in!hypoxic!
CAKI>1!cells!(Fig!2E,!left),!as!well!as!in!normoxic!and!hypoxic!A498!cells!(Fig!2E,!right).!Collectively,!this!
data!suggests!that!both!PLD1!and!PLD2! isozymes!are! likely!required!for!regulation!of!HIF>2α!through!
SphK1!signaling!in!ccRCC!cell!lines.!
!
!
Figure!1!8!SphK1!silencing!prevents!HIF82α !accumulation!in!multiple!human!cancer!cell!lines!under!hypoxia!!A,!Prostate!(PC>3),! lung!(A549),!brain!(U87)!and!renal!cancer!(CAKI>1!and!A498)!cells!were!transfected!with!20!nmol/L! of! siSphK1! or! scrambled! (siScr)! for! 72h! and! then! tested! for! SphK1! activity.! Columns,! mean! of! three!independent!experiments;!bars,!SEM.!**,!P<0.01;!***,!P<0.001.!B8F,!PC>3! (B),!A549!(C),!U87!(D),!CAKI>1! (E)!and!A498!(F)!cells!were!untreated!or! treated!with!20!nmol/L!of!siSphK1!or!scrambled!(siScr)! then! incubated!under!normoxia! or! hypoxia! for! an! additional! 6h.! HIF>2α! expression!was! analyzed! by! immunoblotting.! Similar! results!were!obtained!in!at!least!three!independent!experiments,!and!equal!loading!was!monitored!using!antibody!to!α>tubulin.!!
!
!
!
0
50
100
150
Sph
K1
activ
ity(%
of u
ntre
ated
cel
ls)
C.
B.
D.
Bouquerel et al. (Fig 1)
A.
PC-3
siScr siSphK1
A549
***
U87 CAKI-1 A498
E. F.
*** ***
***
**
HIF-2!
Tubulin
PC-3 1 0.2 0.9
HIF-2!
Tubulin
U87 1 0.1 1.1
HIF-2!
Tubulin
A498 1 0.3 1.0
HIF-2!
Tubulin
A549 1 0.2 1.1
hypoxia normoxia
HIF-2!
Tubulin
CAKI-1 1 0.2 0.9
hypoxia normoxia
hypoxia normoxia
hypoxia normoxia hypoxia normoxia
136!
The!PLD/SphK1!signaling!is!activated!under!hypoxia!via!a!ROS8dependent!mechanism!in!ccRCC!
We! previously! reported! that! the! ROS! scavenger,! N>acetylcysteine! (NAC),! could! markedly!
prevent!HIF>1α! accumulation!under! a! SphK1>dependent!manner! in! hypoxic! cancer! cells! 1.! In!order! to!
establish! that! endogenous! ROS! levels! could! affect! the! PLD/SphK1/HIF>2α! signaling! pathway,! ccRCC!
cells!were!treated!with!the!antioxidants!NAC!and!catalase!(CAT).!Both!NAC!and!CAT!markedly!reduced!
the! expression! of!HIF>2α! under! hypoxia! in! CAKI>1! (Fig! 3A),! A498! (Fig! 3C)! and! 786>O! (Suppl.! Fig! 3A)!
cells.! In! line!with!studies!showing!that!ROS!stimulate!PLD!53!and!SphK1!activity! 1,!NAC!and!CAT!could!
abrogate!both!PLD!and!SphK1!activation! in!hypoxic!CAKI>1!(Fig!3B),!A498!(Fig!3D)!and!786>O!(Suppl.!
Fig!3B)!cells.!Taken!together,!these!data!suggest!that!PLD/SphK1!signaling!is!a!downstream!target!of!
ROS!during!hypoxia.!
!
SphK1!silencing!promotes!a!VHL8independent!HIF82α!loss!of!activity!and!reduced!cell!proliferation!in!
ccRCC!!
To!establish!if!SphK1!silencing!was!correlated!with!an!inhibition!of!HIF>2!transcriptional!activity,!
VHL>defective! A498! and! 786>O! cells! ! known! only! to! express! HIF>2α! (vis>à>vis! HIF>1α)! under! either!
normoxic!and!hypoxic!conditions!7,!33!were!used!to!avoid!the!confounding!role!of!HIF>1α!we!previously!
reported!to!be!regulated!by!SphK1!activity!1.!!Accordingly!in!both!VHL>defective!A498!and!786>O!cells,!
SphK1!silencing!was!associated!with!a!decreased!HIF2α!protein!expression!(Fig!4A,!right).!The!role!of!
HIF>2α! transcriptional!activity!was! further! investigated!by!a! transient>transfection!assay!with!an!HRE!
reporter!gene!(pHRE>Luc)!for!HIF>2α.!Accordingly,!HRE>mediated!HIF>2α!!transcription!was!remarkably!
decreased! in!A498!and!786>O!cells! treated!with! siSphK1! (Fig!4A,! left)! in!both!normoxic!and!hypoxic!
conditions.!We! next! analyzed! the! level! of! GLUT>1! and! cyclin!D1,! two!well>established! specific! target!
proteins! of! HIF>2α! in! VHL>defective! ccRCC! 5,! 47.! In! both! normoxic! and! hypoxic! conditions,! SphK1!
silencing!co>occured!with!significantly!reduced!levels!of!glucose!transporter!GLUT>1!(Fig!4B)!and!cyclin!
D1!(Fig!4C)! in!both!cell! lines.!Cyclin!D1! is!an! important!regulator!of!cell!cycle!progression!and! in!vitro!
and! in! vivo! data! have! demonstrated! that! HIF>2α>only>expressing! ccRCC! cells! proliferate! faster! than!
their!HIF>2α!and!HIF>1α!co>expressing!counterparts!8,!20.!Therefore,!we!next!assessed!cell!proliferation!
in! SphK1>silenced! VHL>defective! ccRCC! cells.! [3H]Thymidine! incorporation! assay! clearly! showed! that!
SphK1>silenced!A498!and!786>O!cells!proliferated!much!slower! than! their! siScr>silenced!counterparts!
(Fig! 4D,! left)! and! showed! a! survival! disadvantage! (Fig! 4D,! right)! in! both! normoxic! and! hypoxic!
conditions!in!line!with!the!findings!that!HIF>2α!!likely!contributes!to!tumor!cell!survival!7.!
!
!
!
137!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Figure!2!8!Phospholipase!D!regulates!SphK18dependent!HIF82α!expression!in!CAKI81!and!A498!ccRCC!cells!A,!CAKI>1!(left)!and!A498!(right)!cells!were!incubated!under!hypoxia!for!the!indicated!times!and!then!tested!for!PLD! and! SphK1! enzymatic! activities.! Points,! mean! of! at! least! three! experiments;! bars,! SEM.! **,! P<0.01;! ***,!P<0.001.!Inset,!HIF>2α!expression!in!CAKI>1!cells!exposed!to!hypoxia!for!the!indicated!times.!Similar!results!were!obtained! in! at! least! three! independent! experiments,! and! equal! loading! was! monitored! using! antibody! to! α>tubulin.! B8C,! CAKI>1! (left)! and! A498! (right)! cells! were! untreated! or! treated! with! 1>butanol! (1>ButOH)! or! tert!butanol!(t>ButOH)!as!control!(0.8%).!SphK1!activity!(B)!and!HIF>2α!expression!(C)!were!determined!after!1h!and!6h!of!hypoxia,!respectively.!Similar!results!were!obtained!in!at!least!three!independent!experiments,!and!equal!loading! was! monitored! using! antibody! to! α>tubulin.! Columns,! mean! of! three! independent! experiments;! bars,!SEM. The!two>tailed!P!values!between!the!means!of!hypoxic!cells!are:!ns,!not!significant;!***,!P<0.001. D8E,!CAKI>1!(left)!and!A498!(right)!cells!were!transfected!with!siPLD1!(50!nmol/L),!siPLD2!(50!nmol/L)!or!siPLD1!(50!nmol/L)!and!siPLD2!(50!nmol/L)!or!scrambled!siRNA!(siScr,!50!nmol/L)!for!72h!then!incubated!under!normoxia!or!hypoxia.!SphK1!activity!(D)!and!HIF>2α!expression!(E)! !were!determined!after!1h!and!6h!of!hypoxia,!respectively.!Similar!results! were! obtained! in! at! least! three! independent! experiments,! and! equal! loading! was! monitored! using!antibody! to! α>tubulin.! Columns,! mean! of! three! independent! experiments;! bars,! SEM.! The! two>tailed! P! values!between!the!means!of!normoxic! (A498)!or!hypoxic! (CAKI>1!and!A498)!cells!are:!ns,!not!significant;!**,!P<0.01;!***,!P<0.001.!
0
50
100
150
Sph
K1
activ
ity(%
of u
ntre
ated
cel
ls)
0
50
100
150
Sph
K1
activ
ity(%
of u
ntre
ated
cel
ls)
50
100
150
Sph
K1
activ
ity(%
of u
ntre
ated
cel
ls)
50
100
150
Sph
K1
activ
ity(%
of u
ntre
ated
cel
ls)
A. Bouquerel et al. (Fig 2)
B.
*** ***
ns ns
CAKI-1 A498
!"#
***
CAKI-1 A498
*** ***
*** *** ***
*** ** ns
0
100
200
300
50
100
150
200
PLD
act
ivity
(%
of u
ntre
ated
cel
ls)
SphK
1 activity(%
of untreated cells)
**
**
0
100
200
300
50
100
150
200
PLD
act
ivity
(%
of u
ntre
ated
cel
ls)
SphK
1 activity(%
of untreated cells)
**
*** ***
0 15 30 60 120 min
CAKI-1 A498
0 15 30 60 120 min
SphK1 activity
PLD activityHIF-2!
Tubulin
0 1 2 3 4 5 6 h of hypoxia
E.
1 0.5 0.7 0.4 1 0.9 0.3 0.4 1 0.8 0.2 0.2
HIF-2!
Tubulin
siPLD1 siPLD2
- + - -
- + - -
- + + +
- + + +
- + - -
- + - -
- + + +
- + + +
CAKI-1 A498
hypoxia normoxia hypoxia normoxia
siScr + + - - - - - - + + - - - - - -
C.
1-ButOH - + - - + - - - + - - + t-ButOH
1 0.5 1.1
- + - - + - - - + - - +
1 0.6 1
HIF-2!
Tubulin 1 0.4 1 CAKI-1 A498
hypoxia normoxia hypoxia normoxia
normoxia
hypoxia
normoxia
hypoxia
138!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!Figure! 3! 8! Reactive! Oxygen! Species! (ROS)! regulate! SphK18dependent! HIF82α! expression! in! CAKI81! and! A498!ccRCC!cells!A,!CAKI>1!cells!were!incubated!under!normoxia!or!hypoxia!for!6h!in!presence!or!not!of!10!mM!N>acetyl>cysteine!(NAC)! or! the! indicated! doses! of! catalase! (CAT).! HIF>2α! expression! was! analyzed! by! immunoblotting.! Similar!results! were! obtained! in! at! least! three! independent! experiments,! and! equal! loading! was! monitored! using!antibody!to!α>tubulin.!B,!PLD!(left)!and!SphK1!(right)!enzymatic!activities!were!tested! in!CAKI>1!cells! incubated!under!normoxia!or!hypoxia!for!15!min!and!60!min,!respectively,!in!presence!or!not!of!10!mM!NAC!or!750!units/ml!CAT.!Columns,!mean!of!at!least!four!independent!experiments;!bars,!SEM.!The!two>tailed!P!values!between!the!means!of!hypoxic!cells!are:!**,!P<0.01;!***,!P<0.001.!C,!A498!cells!were!incubated!under!normoxia!or!hypoxia!for!6h! in!presence!or!not!of! 10!mM!NAC!or!750!units/ml!CAT.!HIF>2α!expression!was!analyzed!by! immunoblotting.!Similar!results!were!obtained!in!at!least!three!independent!experiments,!and!equal!loading!was!monitored!using!antibody! to!α>tubulin.!D,! PLD! (left)! and!SphK1! (right)! enzymatic! activities!were! tested! in!A498!cells! incubated!under!normoxia!or!hypoxia!for!15!min!and!60!min,!respectively,!in!presence!or!not!of!10!mM!NAC!or!750!units/ml!CAT.!Columns,!mean!of!at!least!four!independent!experiments;!bars,!SEM.!The!two>tailed!P!values!between!the!means!of!hypoxic!cells!are:!*,!P<0.05;!**,!P<0.01;!***,!P<0.001.!
0
50
100
150
200
250
PLD
act
ivity
(%
of u
ntre
ated
cel
ls)
A.
Bouquerel et al. (Fig 3)
B.
C.
D.
HIF-2!
Tubulin
- - + NAC (10 mM)
1 0.4 CAKI-1
hypoxia Nx
0.6 0 1 0.4 CAKI-1 HIF-2!
Tubulin
CAT(units/ml) 0 0 250 500 750
hypoxia Nx
HIF-2!
Tubulin
- - + NAC (10 mM)
1 0.6 A498
hypoxia Nx
HIF-2!
Tubulin
- - + CAT (750 units/ml)
1 0.2 A498
hypoxia Nx
A498
normoxia
hypoxia
50
100
150
Sph
K1
activ
ity(%
of u
ntre
ated
cel
ls)
**
*
50
100
150
Sph
K1
activ
ity(%
of u
ntre
ated
cel
ls)
CAKI-1
normoxia
hypoxia ** **
0
50
100
150
200
250
PLD
act
ivity
(%
of u
ntre
ated
cel
ls)
CAKI-1
** ***
A498
***
*
139!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Figure!4!8!SphK1!silencing!leads!to!a!decrease!in!HIF82!transcriptionnal!activity!in.A498!and!7868O!VHL8defective!ccRCC!cells!A498!and!786>O!cells!were!treated!with!20!nmol/l!of!siSphK1!or!scrambled!siRNA!(siScr)!for!72h!then!incubated!for! an! additional! 16! h! under! normoxia! or! hypoxia.! A,! HRE! reporter! gene! assay! (left)! and! protein! HIF>2α!expression!(right)!in!transiently!transfected!A498!(upper)!and!786>O!(lower)!cells.!The!y!axis!shows!normalized!Firefly! luciferase!over!Renilla! luciferase! activity! relative! to! the!wild>type!normoxic! response.!HIF>2α!expression!was!analyzed!by!immunoblotting.!Similar!results!were!obtained!in!at!least!three!independent!experiments,!and!equal! loading! was! monitored! using! antibody! to! α>tubulin.! Columns,! mean! of! at! least! four! independent!experiments;!bars,! SEM.! **,! P<0.01;! ***,! P<0.001.! ! Cell! lysates!were! assayed! for! GLUT>1! (B)! and! cyclin! D1! (C)!expression!by!Western!blot!analysis.!Similar!results!were!obtained!in!three!independent!experiments,!and!equal!loading!was!monitored! using! antibody! to! tubulin.!D,! Cell! proliferation! and! viability!was! respectively! assessed!using! [3H]>thymidine! incorporation! assay! and! MTT! assay.! Columns,! mean! of! at! least! four! independent!experiments;!bars,!SEM.!**,!P<0.01;!***,!P<0.001.!
0
25
50
75
100
125
Cel
l Via
bilit
y (%
of u
ntre
ated
cel
ls)
0
25
50
75
100
125
Cel
l pro
lifer
atio
n(%
of u
ntre
ated
cel
ls)
normoxia
hypoxia
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Rel
ativ
e re
porte
r gen
eac
tivity
786-O *** ***
Bouquerel et al. (Fig 4) A.
0.0
0.5
1.0
1.5
Rel
ativ
e re
porte
r gen
eac
tivity
A498 *** ***
B.
1 0.6 0.9 1 0.2 0.8
GLUT-1
Tubulin 1 0.5 0.9 A498 786-O
hypoxia normoxia hypoxia normoxia
1 0.6 1.1
C.
1 0.4 0.8 1 0.8 1.2
Cyclin D1
Tubulin 1 0.5 1 A498 786-O
hypoxia normoxia hypoxia normoxia
1 0.6 1
D.
A498
siScr
siSphK1
786-O
HIF-2!
Tubulin
0.2 0.9 A498
hypoxia
1
HIF-2!
Tubulin
0.4 0.9 786-O
hypoxia
1
*** ***
** **
A498 786-O
** ** *** ***
140!
SphK1!inhibition!decreases!the!rate!of!HIF82α !protein!synthesis!in!ccRCC!
SphK1! signaling! could! regulate! HIF>2α! expression! and! activity! at! the! levels! of! transcription,!
translation! or! protein! stability.! Silencing! of! SphK1! did! not! alter! the! mRNA! level! of! HIF>2α! in! both!
normoxic!and!hypoxic!conditions!in!both!A498!(Fig!5A)!and!786>O!(Suppl.!Fig!4A)!VHL>defective!ccRCC!
cells.!We!next! used! the!proteasome! inhibitor,!MG132,! to! determine!whether! the! regulatory! process!
mediated!by!SphK1!was!related!to!proteasome>dependent!degradation!of!HIF>2α.!Accordingly,!MG132!
treatment!did!not!reverse!the!HIF>2α!decrease!observed!in!SphK1>silenced!VHL>defective!ccRCC!A>498!
(Fig! 5B)! and! 786>O! cells! (Suppl.! Fig! 4B).! Importantly,! similar! findings!were!observed! in!VHL>positive!
CAKI>1! ccRCC! (Suppl.! Fig! 5A)! and! A549! lung! cancer! (Suppl.! Fig! 5B)! suggesting! that! SphK1! activity!
regulates!HIF>2α!content!regardless!of!the!presence!or!absence!of!VHL.!Next,!we!monitored!the!levels!
of! HIF>2α! after! protein! synthesis! blockade! by! cycloheximide! (CHX).! The! apparent! half>life! of! HIF>2α!
protein! in! presence! of! SKI>II,! a! pharmacological! inhibitor! of! SphK1! 1,! did! not! significantly! change! as!
compared! with! that! of! HIF>2α! in! untreated! A498! (Fig! 5C)! and! 786>O! (Suppl.! Fig! 4C)! cells! when!
assessed!over!a!time!course!in!the!presence!of!CHX.!These!data!indicate!that!the!reduction!of!HIF>2α!
protein!levels!by!SphK1!downregulation!is!likely!due!to!the!reduced!synthesis!of!HIF>2α!rather!than!the!
enhanced!degradation!of!the!protein. To!more!directly!estimate!the!effects!of!SphK1!inhibition!on!the!
rate!of!de;novo!synthesis!of!HIF>2α!protein,!A498!and!786>O!cells!were!pretreated!with!CHX!to!inhibit!
new! protein! synthesis! and! then! incubated! with! fresh! medium.! These! CHX>pretreated! cells! were!
exposed! or! not! to! SKI>II,! for! different! periods! of! time,! and! HIF>2α! protein! levels! were! analyzed! by!
western!blotting.!Significantly!more!HIF>2α!protein!accumulated!in!untreated!A498!(Fig!5D)!and!786>O!
(Suppl.! Fig! 4D)! cells! as! compared! to! SKI>II>treated! cells.! This! result! further! confirmed! that! SphK1!
inhibition!decreases!the!rate!of!HIF>2α!protein!synthesis!in!ccRCC!cells.!!
!
SphK1!silencing!is!associated!with!impaired!mTOR,!p70!S6K!and!4EBP1!phosphorylation!in!ccRCC!!
To! further! investigate!a! translational!pathway! in!HIF>2α!protein! regulation,!we!evaluated! the!
contribution!of!mTOR!pathway,!which!is!often!activated!in!cancer!and!plays!a!key!role!in!the!control!of!
HIF>2α!translation!58.!To!explore!whether!the!loss!of!HIF>2α!induced!by!SphK1!silencing!was!correlated!
with!the!suppression!of!mTOR!signaling!pathway,!we!examined!the!effect!of!siSphK1!on!levels!of!total!
or! phosphorylated! forms! of! mTOR! (p>mTOR)! in! A498! and! 786>O! cells.! Under! both! normoxic! and!
hypoxic!conditions,!the! levels!of!p>mTOR!were!clearly!reduced!while!total!mTOR!was!not!affected! in!
presence!of!siSphK1!(Fig!6A).!The!regulation!of!cap>dependent!translation!initiation!by!mTOR!involves!
direct!phosphorylation!of! its!downstream!substrates!eukaryotic! initiation! factor!4E!binding!protein! 1!
(4E>BP1)! and! ribosomal! protein! kinase! S6! (p70S6K)! 19,! 23.! Activated! p70S6K! phosphorylates! the! 40S!
ribosomal! protein! S6! whereas! phosphorylation! of! 4E>BP1! disrupts! its! inhibitory! interaction! with!
eukaryotic! initiation! factor! 4E! (eIF>4E).! Silencing! of! SphK1! is! associated! with! a! decreased!
141!
phosphorylation!of!p70S6K!(Fig!6B)!and!4E>BP1!(Fig!6C)!in!both!in!A498!and!786>O!cells.!!
By! activating! the! tuberous! sclerosis! complex,! TSC1/TSC2! leading! the!activation!of!mTOR,!Akt!
may! represent!a!mechanistic! link!between!S1P!signaling!and!mTOR!signaling!since!S1P! regulates!Akt!
phosphorylation!as!a!ligand!for!five!high>affinity!G>coupled!receptors!(S1P1>5)!48!in!various!physiological!
conditions!32.!The!silencing!of!SphK1!in!both!in!A498!and!786>O!cells!was!accompanied!by!a!significant!
reduction!in!Akt!phosphorylation!(Fig!6D).!
Collectively,!these!findings!provide!a!mechanistic!explanation!for!the!effect!of!SphK1!silencing,!
through!the!canonical!Akt/mTOR!pathway,!on!HIF>2α!protein!synthesis.!
!
Neutralization!of!exogenous!S1P!decreases!HIF82α!content!in!ccRCC!
Owing!to!the!fact!that!recent!studies!suggest!that!exogenous!S1P!could!regulate!adaptation!to!
hypoxia! through! the! content! of! HIF>1α! in! cancer! 2,! 27! and! non>cancer! cells! 34,! we! examined! the!
contribution! of! extracellular! S1P! in! the! regulation! of! HIF>2α! in! our! ccRCC! cell! models.! We! took!
advantage! of! a! murine! monoclonal! antibody! (mAb),! sphingomab,! that! binds! to! and! neutralizes!
extracellular!S1P!2,!11,!36,!44,!60,!which!is!currently!in!Phase!II!clinical!trial!for!metastatic!renal!cell!carcinoma!
(www.clinicaltrials.gov! Identifier,! NCT00661414)..! As! seen! in! Fig! 7A,! sphingomab! inhibited! HIF>2α!
protein!expression! in!a!concentration>dependent!manner! in!CAKI>1,!A498!and!786>O!ccRCC!cell! lines.!
This!finding!is!consistent!with many reports showing that S1P is produced intracellularly by SphK1 and
exerts its paracrine/autocrine effects by being secreted into the tumor microenvironment 11. Spinster!2!
(Spns2)!is!believed!to!be!the!primary!transporter!in!the!release!of!S1P!29.!Thus!when!CAKI>1!and!A498!
cells!were!treated!with!Spns2>specific!siRNAs,!the!expression!of!Spns2!protein!decreased!to!less!than!
20>30%!of! the! control!with! two!different! siRNAs! (Fig!7B).! In! line!with!our! recent!data! suggesting!an!
autocrine!effect!of!S1P!in!regulating!HIF>1α!in!hypoxic!prostate!cancer!cells!2,!the!silencing!of!Spns2!was!
associated!with!a!significant!inhibitory!effect!on!HIF>2α!accumulation!under!hypoxia!in!both!CAKI>1!and!
A498!ccRCC!cell!lines!(Fig!7B).!
These! data! establish! the! exclusive! contribution! of! exogenous! S1P! mediating! the! effect! of!
SphK1>driven!signaling!to!regulate!HIF>2α!content!in!ccRCC!cell!lines.!
!
!
!
!
!
142!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
Figure!5!8!SphK1!signaling!stimulate!translation!of!HIF82α !in.VHL8defective!A498!ccRCC!cells!A,!relative!mRNA!expression!of!HIF>2α!and!SphK1!expression!in!A498!cells!was!measured!after!72h!of!treatment!with! 20! nmol/l! of! siSphK1! or! scrambled! siRNA! (siScr)! followed! by! 6h! under! normoxic! or! hypoxic! condition.!!Columns,!mean!of!at!least!four!independent!experiments;!bars,!SEM.!**,!P<0.01;!***,!P<0.001.!B,!A498!cells!were!untransfected! or! transfected! with! 20! nmol/l! of! siSphK1! or! scrambled! siRNA! (siScr)! for! 72h! before! the!experiments.!Cells!were!then!incubated!for!6h!in!under!normoxic!or!hypoxic!condition!in!presence!or!absence!of!the! proteasome! inhibitor!MG132! (10! µM).! Cell! lysates!were! assayed! for!HIF>2α! expression!by! immunoblotting.!Similar! results! were! obtained! in! three! independent! experiments,! and! equal! loading! was! monitored! using!antibody!to!tubulin.!C,!A498!cells!were!incubated!under!hypoxic!condition!for!4h!and!then!treated!with!50!µg/ml!cycloheximide! in! the!presence!or! absence!of! 5µM!sphingosine!kinase! inhibitor! (SKI>II).!At! the! indicated! times,!total! proteins! were! extracted! and! subjected! to! Western! blot! analysis! to! determine! the! relative! expression!between!HIF>2α!and!tubulin.!Columns,!mean!of! four! independent!experiments;!bars,!SEM.! (D)!A498!cells!were!incubated!under!hypoxic!condition!with!50!µg/ml!cycloheximide!for!2h,!then!medium!was!removed!and!replaced!by!fresh!medium!without!or!with!5µM!sphingosine!kinase!inhibitor!(SKI>II).!At!the!indicated!times,!total!proteins!were! extracted! and! assayed! for! HIF>2α! expression! by! immunoblotting.! Similar! results!were! obtained! in! three!independent!experiments,!and!equal!loading!was!monitored!using!antibody!to!tubulin.!
0.0
0.5
1.0
1.5
Rel
ativ
e m
RN
A
expr
essi
on(%
of u
ntre
ated
cel
ls)
HIF-2! mRNA
SphK1 mRNA
Bouquerel et al. (Fig 5)
A.
C.
30 60
hypoxia normoxia
0 0 15
HIF-2!
Tubulin w/o MG132
hypoxia normoxia
with MG132 HIF-2!
Tubulin *** ***
hypoxia normoxia
B.
HIF-2!
Tubulin
CHX 30 60 min 15
w/o SKI-II with SKI-II
D.
+ + - + +
HIF-2!
Tubulin
CHX + + +
w/o SKI-II with SKI-II
+
60 120 30 240 60 120 30 240 min
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
Rel
ativ
e de
nsity
HIF
-2!
/tubulin
0
Duration (min)
15 30 60
CHX
CHX + SKI-III
hypoxia normoxia
143!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
Figure!6!8!SphK1!silencing!disrupts!the!mTor/p70S6K!critical!for!protein!synthesis!in.VHL8defective!A498!and!7868O!ccRCC!cells!A498!and!786>O!cells!were!untransfected!or!transfected!with!20!nmol/l!of!siSphK1!or!scrambled!siRNA!(siScr)!for!72h!before!the!experiments!followed!by!4h!under!normoxic!or!hypoxic!condition.!Cell! lysates!were!assayed!for!Ser2448!phosphorylated!mTOR!(p>mTOR!Ser2448)!and!mTOR!expression!(A);!Thr389!phosphorylated!p70S6K!(p>p70S6KThr389),!Thr421/Ser424!phosphorylated!p70S6K! (p>p70S6K!Thr421/Ser424)!and! !p70S6K!expression! (B);!Ser65! phosphorylated! 4EBP1! (p>4EBP1! Ser65)! and! 4EBP1! expression! (C);! Ser473! phosphorylated! Akt! (P>AKt!Ser473)! and! Akt! expression! (D)! were! analyzed! by! immunoblotting.! Similar! results! were! obtained! in! three!independent!experiments.!!
!
Bouquerel et al. (Fig 6)
A.
1 0.6 1 1 0.3 0.9
p-mTor (Ser2448)
mTor
1 0.8 1.1 A498 786-O
hypoxia normoxia hypoxia normoxia
1 0.5 1.1
B.
1 0.5 1 1 0.4 1
p-p70S6K (Thr389)
p70S6K
1 0.7 1.1
A498 786-O
hypoxia normoxia hypoxia normoxia
1 0.6 1
1 0.6 1.1 1 0.2 1.2 1 0.6 0.9 1 0.5 1
p-p70S6K (Thr421/Ser424)
C.
1 0.6 0.9 1 0.5 1
p-4E-BP1 (Ser65)
4E-BP1
1 0.6 1 A498 786-O
hypoxia normoxia hypoxia normoxia
1 0.7 1
D.
1 0.2 0.8 1 0,5 0.8
p-Akt (Ser473)
Akt
1 0.7 1 A498 786-O
hypoxia normoxia hypoxia normoxia
1 0.2 1.3
144!
Figure! 7! 8!
Exogenous!S1P!regulates!HIF82α!accumulation!in!CAKI81,!A498!and!7868O!ccRCC!cells!A,! CAKI>1,! A498! and! 786>O! cells!were! treated!with! the! indicated! concentrations! of! anti>S1P!mAb! for! 2h,! then!incubated! under! normoxia! or! hypoxia! for! an! additional! 6h! and! HIF>2α! expression! was! analyzed! by!immunoblotting.!B,!relative!mRNA!expression!of!Spns2!expression!in!CAKI>1!and!A498!cells!was!measured!after!72h! of! treatment!with! 90! nmol/l! of! two! different! siSpns2! (siSpns2a! and! siSpns2b)! or! scrambled! siRNA! (siScr)!followed!by!6h!under!normoxic!or!hypoxic!condition.!!Columns,!mean!of!at!least!four!independent!experiments;!bars,! SEM.! *,! P<0.05;! **,! P<0.01.! C,! CAKI>1! and! A498! cells! were! transfected! with! 90! nmol/l! of! two! different!siSpns2!(siSpns2a!and!siSpns2b)!or!scrambled!siRNA!(siScr)!for!72h,!then!incubated!under!normoxia!or!hypoxia!for! an! additional! 6h.! Cell! lysates! were! assayed! for! Spns2! and! HIF>2α! expression! by! immunoblotting.! For! all!experiments,! similar! results!were! obtained! in! at! least! three! independent! experiments,! and! equal! loading!was!monitored!using!antibody!to!tubulin.!
Bouquerel et al. (Fig 7)
A.
B.
0.6 1 0.4 CAKI-1 HIF-2!
Tubulin
Anti-S1P mAb 0 0 25 50 75
hypoxia Nx
100 ("g/ml)
0.1 0.1
0.1 <0.1 1 <0.1 A498 HIF-2!
Tubulin
Anti-S1P mAb 0 25 50 75 100 ("g/ml)
hypoxia
0.6
786-O HIF-2!
Tubulin
Anti-S1P mAb 0 25 50 75 100 ("g/ml)
hypoxia
0.3 0.2 1 0.3 0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
Rel
ativ
e m
RN
Aex
pres
sion
(% o
f unt
reat
ed c
ells
) normoxia
hypoxia
** *
0.0
0.5
1.0
1.5
Rel
ativ
e m
RN
Aex
pres
sion
(% o
f unt
reat
ed c
ells
)
normoxia
hypoxia
* **
A498 CAKI-1
A498 HIF-2!
Tubulin
Spns2
0.2 1
1
1
<0.1 1
hypoxia Nx hypoxia Nx
0.2 1 1
0.3 1 1
0.3 1 1
0.2 1
hypoxia Nx hypoxia Nx
0.2 1 1
0.2 1
CAKI-1
145!
DISCUSSION!
!
HIF>2α! is! frequently!overexpressed! in! solid! tumors! 38,!but! its! role!has!been!mostly! studied! in!
renal!clear!cell!carcinoma!(ccRCC),!the!most!common!form!of!kidney!cancer,!where!it!has!emerged!as!a!
key!driver!in!the!development!and!progression!of!the!disease!24.!A!majority!of!ccRCC!(50>80%)!exhibit!a!
genetic! inactivation! of! von! Hippel>Lindau! (VHL)! gene! resulting! in! the! loss! of! pVHL,! which! normally!
mediates! ubiquitination! of! HIF>2α! and! its! subsequent! degradation!,! leading! to! a! constitutive!
accumulation!of!HIF>α! ! 25.!HIF>2α! is!both!necessary!and!sufficient! to!support! tumor!growth!of!ccRCC!
cell!lines!31!whereas!the!activity!of!HIF>1α!!has!been!shown!to!be!dispensable!as!its!expression!is!often!
silenced! 6,! 54,! 55.! In!particular,! tumor>promoting!genes!encoding!cyclin!D1,!TGFα,!and!VEGF!have!been!
shown! to! be! driven! specifically! by!HIF>2α! 47,! and!HIF>2α! only! expressing! ccRCC! appears! to! exhibit! a!
more!aggressive!clinical!behavior!21!
The! relationship! between! S1P!metabolism! and!HIF! signaling! has! recently! emerged! in! cancer!
cells! with! studies! 1,! 12,! 27! establishing! that! the! SphK1/S1P! signaling! controls! the! regulation! of! ! HIF>1α!
under! hypoxia! 16.! Herein! we! report! for! the! first! time! that! the! SphK1/S1P! signaling! regulates! HIF>2α!
content! and! activity! in! cancer! cells! from! various! tumor! types! (lung,! prostate,! glioma! and! ccRCC)!
suggesting!a!possible!universal!regulatory!role!in!cancer!cells.!Considering!the!critical!role!of!HIF>2α!in!ccRCC! pathogenesis,! we! further! detailed! the! molecular! mechanisms! HIF>2α! regulation! by! the!
SphK1/S1P!signaling!in!various!models!of!ccRCC!representing!the!sub>groups!found!in!human!clinic!26,!
and!by!taking!advantage!of!the!features!of!A498!and!786>O;VHL>defective!cells!that!only!express!HIF>
2α!7,!33,!and!not!HIF>1α,!we!previously!reported!to!be!regulated!by!SphK1!signaling!1.!
As!previously!published!for!HIF>1α!in!a!variety!of!cancer!cell!models!1,!!a!significant!rise!in!SphK1!
activity! (peaking! at! 60! min)! prior! to! HIF>2α! accumulation! (2>3! h)! was! observed! under! hypoxic!
conditions.! The! stimulation! of! SphK1! activity! relied! on! sequential! steps! involving! ROS! production!
followed! by! stimulation! of! phospholipase! D! activity! (PLD)! (peaking! at! 15>30! min).! Specifically,! PLD!
activity! is! known! to! regulate! HIF>2α! accumulation! in! ccRCC! 58! but! a! novel! finding! is! that! SphK1! is! a!
downstream! target!of!PLD!under!hypoxia!as!described!earlier! in!different!physiological! settings! 9,! 17.!
Using! A498! and! 786>O; VHL>defective! cells! that! only! express! HIF>2α,! we! demonstrate! that! SphK1!
activity!controls!not!only!HIF>2α!protein!content!but!also!its!transcriptional!activity!as!down>regulation!
of! specific! HIF>2>regulated! genes! such! as! the! glucose! transporter! GLUT>1! or! the! cell! cycle! regulator!
cylin!D1!was!observed! in!SphK1>silenced!cells.!Accordingly,! the!proliferation!rate!and!the!cell!viability!
were!significantly! inhibited! in!SphK1>silenced!A498!and!786>O!cells!demonstrating!that!SphK1!activity!
promotes! a! survival! advantage! in! accord! with! the! notion! that! HIF>2α! contributes! to! tumor! cell!!!!
survival!7.!
146!
Importantly,!in!contrast!to!our!previous!studies!on!HIF>1α!1,!we!discovered!that!SphK1!signaling!
does!not! regulate!HIF>2α!protein! content! in! ccRCC!and!non>ccRCC!cells!by!a!proteasome>dependent!
mechanism!suggesting!a!general!mode!of!action!regardless!of!the!origin!of!the!cell!lines!used!and!the!
presence!or!not!of!pVHL.!Rather,!SphK1!activity!regulates!the!protein!synthesis!of!HIF>2α!in!ccRCC!cell!
lines!through!the!canonical!mTOR!signaling!pathway,!which!is!often!dysregulated!in!cancer!and!plays!a!
crucial! role! in! the!control!of!HIF>2α! translation! 58.! Importantly,!we!also!show!that! the!protein!kinase!
Akt!represents!a!mechanistic!link!between!SphK1/S1P!signaling!and!mTOR!signaling!as!SphK1!silencing!
abrogates! the! Akt/mTOR! stimulation.! Because! Akt! signaling! can! be! activated! by! all! Gi>coupled! S1P!
receptor!subtypes! 15,! 56!and!because!S1P!has!been!shown!to!be!released!from!hypoxic!cells! 2,! 4,! 50,!we!
explored! the! effects! of! the! neutralization! of! extracellular! S1P! with! anti>S1P! monoclonal! antibody!
sphingomab!49.!Our!findings!firmly!establish!the!contribution!of!extracellular!S1P! in!the!regulation!of!
HIF>2α!!as!the!silencing!of!S1P!exporter!Spns2!as!well!as!the!use!of!sphingomab!markedly!reduced!HIF>
2α!in!all!ccRCC!subtypes.!These!data!are!consistent!with!our!recent!report!that!SphK1!is!upregulated!in!
mice!xenografts!after!resistance!to!VEGFR2!tyrosine!kinase!inhibition!(TKI)!63.!Moreover,!sphingomab!
retarded! the! growth! of! A498! and! 786>O! xenographs,! particularly! after! resistance! to! TKI! was!
established!63!
In!summary,!the!present!report!demonstrates!that!the!SphK1/S1P!signaling!pathway!is!a!potent!
regulator!of!HIF>2! in!human!cancer!notably! in!ccRCC,! the!most!common! form!of!kidney!cancer.!This!
disease!is!aggressive,!notoriously!resistant!to!conventional!chemotherapy,!and!is!almost!invariably!an!
incurable! condition! 13.! SphK1/S1P! inhibition! might! represent! an! alternative! therapeutic! strategy! to!
current!mTOR>!or!VEGF>targeted!agents! as!S1P! is!widely! appreciated!as! a!general! growth>like! factor!
and! a! potent! protector! against! apoptosis! in! addition! to! its! specific! regulatory! role! on! HIF>2.! The!
targeting! S1P! metabolism! is! now! at! hand! by! the! employ! of! antibody! against! S1P! (sphingomabTM),!
which! is! being! investigated! as! a! treatment! for!metastatic! renal! cell! carcinoma! in! patients! that! have!
failed!up! to! three! targeted! therapies! (www.lpath.com).!Anti>s1P! strategies! could!not!only! provide! a!
beneficial!therapeutic!option!in!ccRCC,!but!also!in!other!cancers!as!the!role!of!HIF>2!as!an!oncoprotein!
might!extend!beyond!renal!carcinomas.!
!GRANT!SUPPORT!
!
This!work!was!supported!by!the!Ligue!Nationale!Contre!le!Cancer!(Equipe!Labellisée!LIGUE!2011!to!OC!
and!Allocation!de!thèse!to!PB),!Fondation!de!France!(to!OC),!the!Comité!Local!Haute!Garonne!of!the!
Ligue!Contre!le!Cancer!(to!IA),!Université!Paul!Sabatier!de!Toulouse!(to!IA),!Allocation!de!thèse!from!
the!Fondation!pour!la!Recherche!Médicale!(to!CG),!and!Bourse!Angiogenèse!from!Roche!(to!OC).!
!
147!
REFERENCES!!!1! Ader! I,! Brizuela! L,! Bouquerel! P,! Malavaud! B,! Cuvillier! O.! Sphingosine! kinase! 1:! a! new! modulator! of!
hypoxia!inducible!factor!1alpha!during!hypoxia!in!human!cancer!cells.!Cancer!Res!2008;!68:!8635>8642.!!
2! Ader! I,! Bouquerel! P,! Gstalder! C,! Golzio! M,! Andrieu! G,! Zalvidea! S! et! al.! Neutralizing! S1P! inhibits!intratumoral!hypoxia,! induces!vascular! remodeling!and!sensitizes!to!chemotherapy! in!prostate!cancer.!Oncotarget!2015;!6:!in!press.!
!3! Alvarez! SE,! Harikumar! KB,! Hait! NC,! Allegood! J,! Strub! GM,! Kim! EY! et! al.! Sphingosine>1>phosphate! is! a!
missing!cofactor!for!the!E3!ubiquitin!ligase!TRAF2.!Nature!2010;!465:!1084>1088.!!
4! Anelli!V,!Gault!CR,!Cheng!AB,!Obeid!LM.!Sphingosine!Kinase!1!Is!Up>regulated!during!Hypoxia!in!U87MG!Glioma!Cells:!ROLE!OF!HYPOXIA>INDUCIBLE!FACTORS!1!AND!2.!J!Biol!Chem!2008;!283:!3365>3375.!
!5! Baba!M,!Hirai!S,!Yamada>Okabe!H,!Hamada!K,!Tabuchi!H,!Kobayashi!K!et!al.!Loss!of!von!Hippel>Lindau!
protein! causes! cell! density! dependent! deregulation! of! CyclinD1! expression! through! hypoxia>inducible!factor.!Oncogene!2003;!22:!2728>2738.!
!6! Beroukhim!R,!Brunet!JP,!Di!Napoli!A,!Mertz!KD,!Seeley!A,!Pires!MM!et!al.!Patterns!of!gene!expression!
and!copy>number!alterations!in!von>hippel!lindau!disease>associated!and!sporadic!clear!cell!carcinoma!of!the!kidney.!Cancer!Res!2009;!69:!4674>4681.!
!7! Bertout!JA,!Majmundar!AJ,!Gordan!JD,!Lam!JC,!Ditsworth!D,!Keith!B!et!al.!HIF2alpha!inhibition!promotes!
p53! pathway! activity,! tumor! cell! death,! and! radiation! responses.! Proc!Natl! Acad! Sci!U! S! A! 2009;! 106:!14391>14396.!
!8! Biswas!S,!Troy!H,!Leek!R,!Chung!YL,!Li!JL,!Raval!RR!et!al.!Effects!of!HIF>1alpha!and!HIF2alpha!on!Growth!
and!Metabolism! of! Clear>Cell! Renal! Cell! Carcinoma! 786>0! Xenografts.! Journal! of! oncology! 2010;! 2010:!757908.!
!9! Brizuela! L,! Dayon! A,! Doumerc! N,! Ader! I,! Golzio! M,! Izard! JC! et! al.! The! sphingosine! kinase>1! survival!
pathway! is!a!molecular!target!for!the!tumor>suppressive!tea!and!wine!polyphenols! in!prostate!cancer.!FASEB!J!2010;!24:!3882>3894.!
!10! Brizuela! L,! Cuvillier! O.! Biochemical! methods! for! quantifying! sphingolipids:! ceramide,! sphingosine,!
sphingosine!kinase>1!activity,!and!sphingosine>1>phosphate.!Methods!Mol!Biol!2012;!874:!1>20.!!
11! Brizuela! L,!Martin! C,! Jeannot! P,! Ader! I,! Gstalder! C,! Andrieu!G! et! al.!Osteoblast>derived! sphingosine! 1>phosphate! to! induce! proliferation! and! confer! resistance! to! therapeutics! to! bone! metastasis>derived!prostate!cancer!cells.!Mol!Oncol!2014;!8:!1181>1195.!
!12! Cho!SY,!Lee!HJ,! Jeong!SJ,!Kim!HS,!Chen!CY,!Lee!EO!et!al.! Sphingosine!kinase! 1!pathway! is! involved! in!
melatonin>induced!HIF>1alpha!inactivation!in!hypoxic!PC>3!prostate!cancer!cells.!J!Pineal!Res!2011;!51:!87>93.!
!13! Costa!LJ,!Drabkin!HA.!Renal! cell! carcinoma:!new!developments! in!molecular!biology!and!potential! for!
targeted!therapies.!Oncologist!2007;!12:!1404>1415.!!
14! Cuvillier!O.!Downregulating!sphingosine!kinase>1!for!cancer!therapy.!Expert!Opin!Ther!Targets!2008;!12:!1009>1020.!
!15! Cuvillier!O.![Sphingosine!1>phosphate!receptors:!from!biology!to!physiopathology].!Med!Sci!(Paris)!2012;!
28:!951>957.!!
148!
16! Cuvillier!O,!Ader!I,!Bouquerel!P,!Brizuela!L,!Gstalder!C,!Malavaud!B.!Hypoxia,!therapeutic!resistance,!and!sphingosine!1>phosphate.!Adv!Cancer!Res!2013;!117:!117>141.!
!17! Delon! C,! Manifava! M,! Wood! E,! Thompson! D,! Krugmann! S,! Pyne! S! et! al.! Sphingosine! kinase! 1! is! an!
intracellular!effector!of!phosphatidic!acid.!J!Biol!Chem!2004;!279:!44763>44774.!!
18! Fukuhara!S,!Simmons!S,!Kawamura!S,!Inoue!A,!Orba!Y,!Tokudome!T!et!al.!The!sphingosine>1>phosphate!transporter!Spns2!expressed!on!endothelial!cells!regulates!lymphocyte!trafficking!in!mice.!J!Clin!Invest!2012;!122:!1416>1426.!
!19! Gingras!AC,!Gygi! SP,!Raught!B,!Polakiewicz!RD,!Abraham!RT,!Hoekstra!MF!et! al.!Regulation!of!4E>BP1!
phosphorylation:!a!novel!two>step!mechanism.!Genes!Dev!1999;!13:!1422>1437.!!
20! Gordan! JD,! Bertout! JA,!Hu! CJ,! Diehl! JA,! Simon!MC.!HIF>2alpha! promotes! hypoxic! cell! proliferation! by!enhancing!c>myc!transcriptional!activity.!Cancer!Cell!2007;!11:!335>347.!
!21! Gordan! JD,! Lal! P,! Dondeti! VR,! Letrero! R,! Parekh! KN,! Oquendo! CE! et! al.! HIF>alpha! effects! on! c>Myc!
distinguish!two!subtypes!of!sporadic!VHL>deficient!clear!cell!renal!carcinoma.!Cancer!Cell!2008;!14:!435>446.!
!22! Hait! NC,! Allegood! J,! Maceyka! M,! Strub! GM,! Harikumar! KB,! Singh! SK! et! al.! Regulation! of! histone!
acetylation!in!the!nucleus!by!sphingosine>1>phosphate.!Science!2009;!325:!1254>1257.!!
23! Hara!K,! Yonezawa!K,! Kozlowski!MT,! Sugimoto! T,! Andrabi! K,!Weng!QP! et! al.! Regulation!of! eIF>4E!BP1!phosphorylation!by!mTOR.!J!Biol!Chem!1997;!272:!26457>26463.!
!24! Jonasch!E,!Futreal!PA,!Davis!IJ,!Bailey!ST,!Kim!WY,!Brugarolas!J!et!al.!State!of!the!science:!an!update!on!
renal!cell!carcinoma.!Mol!Cancer!Res!2012;!10:!859>880.!!
25! Kaelin! WG,! Jr.! The! von! Hippel>Lindau! tumor! suppressor! protein! and! clear! cell! renal! carcinoma.! Clin!Cancer!Res!2007;!13:!680s>684s.!
!26! Kaelin!WG,!Jr.!Kidney!cancer:!now!available!in!a!new!flavor.!Cancer!Cell!2008;!14:!423>424.!!
27! Kalhori!V,!Kemppainen!K,!Asghar!MY,!Bergelin!N,!Jaakkola!P,!Tornquist!K.!Sphingosine>1>Phosphate!as!a!Regulator! of! Hypoxia>Induced! Factor>1alpha! in! Thyroid! Follicular! Carcinoma! Cells.! PLoS! One! 2013;! 8:!e66189.!
!28! Kapitonov! D,! Allegood! JC,! Mitchell! C,! Hait! NC,! Almenara! JA,! Adams! JK! et! al.! Targeting! sphingosine!
kinase! 1! inhibits!Akt! signaling,! induces!apoptosis,! and! suppresses!growth!of!human!glioblastoma!cells!and!xenografts.!Cancer!Res!2009;!69:!6915>6923.!
!29! Kawahara!A,!Nishi!T,!Hisano!Y,!Fukui!H,!Yamaguchi!A,!Mochizuki!N.!The!sphingolipid!transporter!spns2!
functions!in!migration!of!zebrafish!myocardial!precursors.!Science!2009;!323:!524>527.!!
30! Keith!B,!Johnson!RS,!Simon!MC.!HIF1alpha!and!HIF2alpha:!sibling!rivalry!in!hypoxic!tumour!growth!and!progression.!Nat!Rev!Cancer!2012;!12:!9>22.!
!31! Kondo!K,!Kim!WY,!Lechpammer!M,!Kaelin!WG,!Jr.!Inhibition!of!HIF2alpha!is!sufficient!to!suppress!pVHL>
defective!tumor!growth.!PLoS!Biol!2003;!1:!E83.!!
32! Maceyka! M,! Harikumar! KB,! Milstien! S,! Spiegel! S.! Sphingosine>1>phosphate! signaling! and! its! role! in!disease.!Trends!Cell!Biol!2012;!22:!50>60.!
!33! Maxwell!PH,!Wiesener!MS,!Chang!GW,!Clifford!SC,!Vaux!EC,!Cockman!ME!et!al.!The!tumour!suppressor!
protein!VHL!targets!hypoxia>inducible!factors!for!oxygen>dependent!proteolysis.!Nature!1999;!399:!271>275.!
149!
!34! Michaud! MD,! Robitaille! GA,! Gratton! JP,! Richard! DE.! Sphingosine>1>phosphate:! a! novel! nonhypoxic!
activator!of!hypoxia>inducible!factor>1!in!vascular!cells.!Arterioscler!Thromb!Vasc!Biol!2009;!29:!902>908.!!
35! Nagahashi!M,!Kim!EY,!Yamada!A,!Ramachandran!S,!Allegood!JC,!Hait!NC!et!al.!Spns2,!a! transporter!of!phosphorylated! sphingoid! bases,! regulates! their! blood! and! lymph! levels,! and! the! lymphatic! network.!FASEB!J!2013;!27:!1001>1011.!
!36! O'Brien! N,! Jones! ST,! Williams! DG,! Cunningham! HB,! Moreno! K,! Visentin! B! et! al.! Production! and!
characterization!of!monoclonal!anti>sphingosine>1>phosphate!antibodies.!J!Lipid!Res!2009;!50:!2245>2257.!!
37! Padron!D,!Tall!RD,!Roth!MG.!Phospholipase!D2!is!required!for!efficient!endocytic!recycling!of!transferrin!receptors.!Mol!Biol!Cell!2006;!17:!598>606.!
!38! Patel!SA,!Simon!MC.!Biology!of!hypoxia>inducible!factor>2alpha!in!development!and!disease.!Cell!Death!
Differ!2008;!15:!628>634.!!
39! Paugh!SW,!Paugh!BS,!Rahmani!M,!Kapitonov!D,!Almenara! JA,!Kordula!T!et!al.!A! selective! sphingosine!kinase!1!inhibitor!integrates!multiple!molecular!therapeutic!targets!in!human!leukemia.!Blood!2008;!112:!1382>1391.!
!40! Pchejetski! D,! Golzio! M,! Bonhoure! E,! Calvet! C,! Doumerc! N,! Garcia! V! et! al.! Sphingosine! kinase>1! as! a!
chemotherapy!sensor! in!prostate!adenocarcinoma!cell!and!mouse!models.!Cancer!Res!2005;!65:!11667>11675.!
!41! Pchejetski!D,!Doumerc!N,!Golzio!M,!Naymark!M,!Teissie!J,!Kohama!T!et!al.!Chemosensitizing!effects!of!
sphingosine!kinase>1!inhibition!in!prostate!cancer!cell!and!animal!models.!Mol!Cancer!Ther!2008;!7:!1836>1845.!
!42! Pchejetski!D,!Boehler!T,!Brizuela!L,!Sauer!L,!Doumerc!N,!Golzio!M!et!al.!FTY720!(Fingolimod)!sensitizes!
prostate! cancer! cells! to! radiotherapy!by! inhibition!of! sphingosine! kinase>1.! Cancer!Res! 2010;! 70:! 8651>8661.!
!43! Pitson!SM.!Regulation!of!sphingosine!kinase!and!sphingolipid!signaling.!Trends!Biochem!Sci!2011;!36:!97>
107.!!
44! Ponnusamy!S,!Selvam!SP,!Mehrotra!S,!Kawamori!T,!Snider!AJ,!Obeid!LM!et!al.!Communication!between!host!organism!and!cancer!cells!is!transduced!by!systemic!sphingosine!kinase!1/sphingosine!1>phosphate!signalling!to!regulate!tumour!metastasis.!EMBO!Mol!Med!2012;!4:!761>775.!
!45! Pyne!S,!Pyne!NJ.!Translational!aspects!of!sphingosine!1>phosphate!biology.!Trends!Mol!Med!2011;!17:!463>
472.!!
46! Rankin! EB,! Rha! J,!Unger! TL,!Wu! CH,! Shutt!HP,! Johnson!RS! et! al.! Hypoxia>inducible! factor>2! regulates!vascular!tumorigenesis!in!mice.!Oncogene!2008;!27:!5354>5358.!
!47! Raval!RR,! Lau!KW,!Tran!MG,!Sowter!HM,!Mandriota!SJ,! Li! JL!et! al.! Contrasting!properties!of!hypoxia>
inducible! factor! 1! (HIF>1)! and!HIF>2! in! von!Hippel>Lindau>associated! renal! cell! carcinoma.!Mol! Cell! Biol!2005;!25:!5675>5686.!
!48! Rosen!H,!Gonzalez>Cabrera!PJ,!Sanna!MG,!Brown!S.!Sphingosine!1>phosphate!receptor!signaling.!Annu!
Rev!Biochem!2009;!78:!743>768.!!
49! Sabbadini!RA.! Sphingosine>1>phosphate! antibodies! as!potential! agents! in! the! treatment!of! cancer! and!age>related!macular!degeneration.!Br!J!Pharmacol!2011;!162:!1225>1238.!
!
150!
50! Schnitzer!SE,!Weigert!A,!Zhou!J,!Brune!B.!Hypoxia!enhances!sphingosine!kinase!2!activity!and!provokes!sphingosine>1>phosphate>mediated!chemoresistance!in!A549!lung!cancer!cells.!Mol!Cancer!Res!2009;!7:!393>401.!
!51! Semenza!GL.!Hypoxia>inducible!factors!in!physiology!and!medicine.!Cell!2012;!148:!399>408.!!
52! Semenza!GL.!Hypoxia>inducible!factors:!mediators!of!cancer!progression!and!targets!for!cancer!therapy.!Trends!Pharmacol!Sci!2012;!33:!207>214.!
!53! Servitja!JM,!Masgrau!R,!Pardo!R,!Sarri!E,!Picatoste!F.!Effects!of!oxidative!stress!on!phospholipid!signaling!
in!rat!cultured!astrocytes!and!brain!slices.!J!Neurochem!2000;!75:!788>794.!!
54! Shen!C,!Beroukhim!R,!Schumacher!SE,!Zhou!J,!Chang!M,!Signoretti!S!et!al.!Genetic!and!functional!studies!implicate!HIF1alpha!as!a!14q!kidney!cancer!suppressor!gene.!Cancer!discovery!2011;!1:!222>235.!
!55! Shinojima! T,!Oya!M,! Takayanagi! A,!Mizuno!R,! Shimizu!N,!Murai!M.! Renal! cancer! cells! lacking! hypoxia!
inducible!factor!(HIF)>1alpha!expression!maintain!vascular!endothelial!growth!factor!expression!through!HIF>2alpha.!Carcinogenesis!2007;!28:!529>536.!
!56! Takabe! K,! Paugh! SW,! Milstien! S,! Spiegel! S.! "Inside>out"! signaling! of! sphingosine>1>phosphate:!
therapeutic!targets.!Pharmacol!Rev!2008;!60:!181>195.!!
57! Toschi!A,!Edelstein!J,!Rockwell!P,!Ohh!M,!Foster!DA.!HIF!alpha!expression!in!VHL>deficient!renal!cancer!cells!is!dependent!on!phospholipase!D.!Oncogene!2008;!27:!2746>2753.!
!58! Toschi!A,!Lee!E,!Gadir!N,!Ohh!M,!Foster!DA.!Differential!dependence!of!hypoxia>inducible!factors!1!alpha!
and!2!alpha!on!mTORC1!and!mTORC2.!J!Biol!Chem!2008;!283:!34495>34499.!!
59! Van!Brocklyn!JR,!Lee!MJ,!Menzeleev!R,!Olivera!A,!Edsall!L,!Cuvillier!O!et!al.!Dual!actions!of!sphingosine>1>phosphate:!extracellular!through!the!Gi>coupled!receptor!Edg>1!and!intracellular!to!regulate!proliferation!and!survival.!J!Cell!Biol!1998;!142:!229>240.!
!60! Visentin! B,! Vekich! JA,! Sibbald! BJ,! Cavalli! AL,! Moreno! KM,! Matteo! RG! et! al.! Validation! of! an! anti>
sphingosine>1>phosphate! antibody! as! a! potential! therapeutic! in! reducing! growth,! invasion,! and!angiogenesis!in!multiple!tumor!lineages.!Cancer!Cell!2006;!9:!225>238.!
!61! Wiesener!MS,! Jurgensen! JS,! Rosenberger! C,! Scholze! CK,! Horstrup! JH,!Warnecke! C! et! al.!Widespread!
hypoxia>inducible!expression!of!HIF>2alpha!in!distinct!cell!populations!of!different!organs.!FASEB!J!2003;!17:!271>273.!
!62! Xia! P,! Gamble! JR,! Wang! L,! Pitson! SM,! Moretti! PA,! Wattenberg! BW! et! al.! An! oncogenic! role! of!
sphingosine!kinase.!Curr!Biol!2000;!10:!1527>1530.!!
63! Zhang!L,!Wang!X,!Bullock!AJ,!Callea!M,!Shah!H,!Song!J!et!al.!Anti>S1P!antibody!as!a!novel! therapeutic!strategy!for!VEGFR!TKI!resistant!renal!cancer.!Clin!Cancer!Res!2015.!
!64! Zhang!Y,!Wang!Y,!Wan!Z,!Liu!S,!Cao!Y,!Zeng!Z.!Sphingosine!kinase!1!and!cancer:!a!systematic!review!and!
meta>analysis.!PLoS!One!2014;!9:!e90362.!!
!!!!
!
!
151!
!!!!!!!!!!!!
50
100
150
Sph
K1
activ
ity(%
of u
ntre
ated
cel
ls)
50
100
150
Sph
K1
activ
ity(%
of u
ntre
ated
cel
ls)
A. Bouquerel et al. (Suppl. Fig 1)
***
ns normoxia
hypoxia
** *
**
0 15 30 60 120 min
SphK1 activity
PLD activity
1 0.2 0.5 0.2
HIF-2!
Tubulin
siPLD1 siPLD2
- + - -
- + - -
- + + +
- + + +
hypoxia normoxia
siScr + + - - - - - -
C.
1-ButOH - + - - + - - - + - - + t-ButOH
1 0.4 0.7
HIF-2!
Tubulin
hypoxia normoxia
0
100
200
300
75
100
125
150
PLD
act
ivity
(%
of u
ntre
ated
cel
ls)
SphK
1 activity(%
of untreated cells)
**
*
B.
!"#
1 0.7 1
1 0.3 0.5 0.3
$%&'(%&)*(+',#-#.,/0)+1,'#2(%3456,(,76,71#89:5;!#,<(.,''*&7#*7#=>?5@#A,))'"
BC"#$%%&"'$($")*#+,-.$/"+*/$("01234)-"53(".0$")*/)#-.$/"67$&"-*/".0$*".$&.$/"53("89:"-*/";20<="
$*>17-6#"-#6?)6$&@"!"#$%&A"7$-*"35"-."%$-&.".0($$"$42$()7$*.&B"'()&A";CD@""
D5EC"#$%%&"'$($"+*.($-.$/"3(".($-.$/"').0"=E,+.-*3%"F=EG+.HIJ"3(".$(.",+.-*3%"F.EG+.HIJ"-&"#3*.(3%"FK@LMJ@"
;20<="-#6?).1"FDJ"-*/"INOEP!"$42($&&)3*"FEJ"'$($"/$.$(7)*$/"-Q$("=0"-*/"R0"35"01234)-A"($&2$#6?$%1@"
;)7)%-("($&+%.&"'$($"3,.-)*$/")*"-."%$-&.".0($$")*/$2$*/$*."$42$()7$*.&A"-*/"$S+-%"%3-/)*T"'-&"
73*).3($/"+&)*T"-*6,3/1".3"!E.+,+%)*@"*"+,-$&A"7$-*"35".0($$")*/$2$*/$*."$42$()7$*.&B"'()&A";CD@"
-5!C"#$%%&"'$($".(-*&5$#.$/"').0"&)89:="FUK"*73%V9JA"&)89:P"FUK"*73%V9J"3("&)89:="FUK"*73%V9J"-*/"&)89:P"
FUK"*73%V9J"3("&#(-7,%$/"&)WXY"F&);#(UKA"*73%V9J"53("ZP0".0$*")*#+,-.$/"+*/$("*3(734)-"3("01234)-@"
;20<="-#6?).1"F-J"-*/"INOEP!"$42($&&)3*"F!J""'$($"/$.$(7)*$/"-Q$("=0"-*/"R0"35"01234)-A"($&2$#6?$%1@"
;)7)%-("($&+%.&"'$($"3,.-)*$/")*"-."%$-&.".0($$")*/$2$*/$*."$42$()7$*.&A"-*/"$S+-%"%3-/)*T"'-&"
73*).3($/"+&)*T"-*6,3/1".3"!E.+,+%)*@"*"+,-$&A"7$-*"35".0($$")*/$2$*/$*."$42$()7$*.&B"'()&A";CD@"#
normoxia
hypoxia
*
-"#
** *
152!
!!
0
50
100
150
PLD
act
ivity
(%
of u
ntre
ated
cel
ls)
0
50
100
150
PLD
act
ivity
(%
of u
ntre
ated
cel
ls)
Bouquerel et al. (Suppl. Fig 2)
!"#$%"&$'()'*)+$,-.)"/"$(+&)0123)"(%)4)$+'*'56+)!
"#$%&'!(.)*!#+,-!(7)!./0!1-2&3!(8)!45667!8595!:9./7;54:50!8<:=!7<>?@'!
(AB!/CD6E?)*!7<>?@F!(AB!/CD6E?)!D9!7<>?@'!(AB!/CD6E?)!./0!7<>?@F!(AB!/CD6E?)!D9!749.CG650!7<HI#!(7<J49*!
AB!/CD6E?)!;D9!1F=!:=5/!.77.K50!;D9!5/LKC.:<4!>?@!.4:<M<:KN!"#$%&'*!
C5./!D;!:=955!</05O5/05/:!5PO59<C5/:7Q!()*'*!JRSN!)
A.
0
50
100
150P
LD a
ctiv
ity
(% o
f unt
reat
ed c
ells
)
*** *** **
B.
** *** **
C.
**
***
**
153!
0
50
100
150
200
250
PLD
act
ivity
(%
of u
ntre
ated
cel
ls)
50
100
150
Sph
K1
activ
ity(%
of u
ntre
ated
cel
ls)
A.
B.
HIF-2!
Tubulin
- - + NAC (10 mM)
1 0.6 786-O
hypoxia Nx
HIF-2!
Tubulin
- - + CAT (750 units/ml)
1 0.2 786-O
hypoxia Nx
786-O
normoxia
hypoxia * **
786-O
*** **
Bouquerel et al. (Suppl. Fig 3)
!"#$%&"'()*+",'-."$/"0'1!(-2'3"+45#6"'-.789:;".",;",6'<=>:?!'").3"00/@,'/,'ABC:('$"550'
'"
D#"$%&'(")*++,"-*.*"/0)1234*5"105*."06.768/3"6."9:;68/3"<6."&9"/0";.*,*0)*"6."064"6<"=>"7?"
@AB"6."$C>"10/4,D7+"BAEF"GHI'J!"*8;.*,,/60"-3,"303+:K*5"2:"/771062+6L0MF"N/7/+3.".*,1+4,"
-*.*"6243/0*5"/0"34"+*3,4"49.**"/05*;*05*04"*8;*./7*04,#"305"*O13+"+635/0M"-3,"760/46.*5"
1,/0M"30P265:"46"!'4121+/0F""
E#"QRS"T!"#U"305"N;9V="T$%&'(U"*0K:73P)"3)PW/P*,"-*.*"4*,4*5"/0"$%&'(")*++,"/0)1234*5"105*."
06.768/3"6."9:;68/3"<6."=C"7/0"305"&>"7/0#".*,;*)PW*+:#"/0";.*,*0)*"6."064"6<"=>"7?"@AB"6."
$C>"10/4,D7+"BAEF"B6+170,"/05/)34*"7*30,"6<"34"+*3,4"<61."/05*;*05*04"*8;*./7*04,F"X3.,#"
NY?F"E9*"4-6'43/+*5"Q"W3+1*,"2*4-**0"49*"7*30,"6<"9:;68/)")*++,"3.*Z"[#"Q\>F>C]"[[#"Q\>F>=]"
[[[#"Q\>F>>=F"
"
154!
155!
!"##$%&%'()*+,-./"*%,0,1,!#234,5./')$.'/,56&"$)(%,(*)'5$)67',78,9:-1;!,.'!"#$1<%8%=6>%,
?@A1B,=%$$5!
C"!#$%&'($!)*+,!$-.#$//012!13!456789!&2:!;.<=>!$-.#$//012!02!?@A7B!C$%%/!D&/!)$&/E#$:!
&F$#!?8<!13!G#$&G)$2G!D0G<!8H!2)1%I%!13!/0;.<=>!1#!/C#&)J%$:!/0*+,!K/0;C#L!31%%1D$:!JM!A<!
E2:$#!21#)1-0C!1#!<M.1-0C!C12:0'12N!!!"#$%&'"!)$&2!13!&G!%$&/G!31E#!02:$.$2:$2G!
$-.$#0)$2G/O!()*'"!;PQN!RR"!STHNH>O!RRR"!STHNHH>N!D"!?@A7B!C$%%/!D$#$!E2G#&2/3$CG$:!1#!
G#&2/3$CG$:!D0G<!8H!2)1%I%!13!/0;.<=>!1#!/C#&)J%$:!/0*+,!K/0;C#L!31#!?8<!J$31#$!G<$!
$-.$#0)$2G/N!U$%%/!D$#$!G<$2!02CEJ&G$:!31#!A<!02!E2:$#!21#)1-0C!1#!<M.1-0C!C12:0'12!02!
.#$/$2C$!1#!&J/$2C$!13!G<$!.#1G$&/1)$!02<0J0G1#!QV>W8!K>H!XQLN!U$%%!%M/&G$/!D$#$!&//&M$:!
31#!456789!$-.#$//012!JM!Y$/G$#2!J%1G!&2&%M/0/N!;0)0%&#!#$/E%G/!D$#$!1JG&02$:!02!G<#$$!
02:$.$2:$2G!$-.$#0)$2G/"!&2:!$ZE&%!%1&:02[!D&/!)120G1#$:!E/02[!&2'J1:M!G1!GEJE%02N!E"!?@A7
B!C$%%/!D$#$!02CEJ&G$:!E2:$#!<M.1-0C!C12:0'12!31#!\<!&2:!G<$2!G#$&G$:!D0G<!]H!X[I)%!
CMC%1<$-0)0:$!02!G<$!.#$/$2C$!1#!&J/$2C$!13!]XQ!/.<02[1/02$!^02&/$!02<0J0G1#!K;=5755LN!,G!G<$!
02:0C&G$:!')$/"!G1G&%!.#1G$02/!D$#$!$-G#&CG$:!&2:!/EJ_$CG$:!G1!Y$/G$#2!J%1G!&2&%M/0/!G1!
:$G$#)02$!G<$!#$%&'($!$-.#$//012!J$GD$$2!456789!&2:!GEJE%02N!!"#$%&'"!)$&2!13!31E#!
02:$.$2:$2G!$-.$#0)$2G/O!()*'"!;PQN!FGH,?@A7B!C$%%/!D$#$!02CEJ&G$:!E2:$#!<M.1-0C!C12:0'12!
D0G<!]H!X[I)%!CMC%1<$-0)0:$!31#!8<"!G<$2!)$:0E)!D&/!#$)1($:!&2:!#$.%&C$:!JM!3#$/<!
)$:0E)!D0G<1EG!1#!D0G<!]XQ!/.<02[1/02$!^02&/$!02<0J0G1#!K;=5755LN!,G!G<$!02:0C&G$:!')$/"!G1G&%!
.#1G$02/!D$#$!$-G#&CG$:!&2:!&//&M$:!31#!456789!$-.#$//012!JM!Y$/G$#2!J%1G!&2&%M/0/N!;0)0%&#!
#$/E%G/!D$#$!1JG&02$:!02!G<#$$!02:$.$2:$2G!$-.$#0)$2G/"!&2:!$ZE&%!%1&:02[!D&/!)120G1#$:!
E/02[!&2'J1:M!G1!GEJE%02N!
!
156!
Bouquerel et al. (Suppl Fig 5)
!"##$%&%'()*+,-./"*%,0,1,!#234,*%/"$)(%5,#*6(%)56&%1.'7%#%'7%'(,89-1:;,7%/*)7)<6',,
.',#=8>,?.$71(+#%,@A3914,)'7,A0BC,D%$$5,
!"#$%&'(A)'*+,'"-./'(E)'01223'4151'6+75*+381071,'95'75*+381071,'4:7;'<='+>92?2'98'3:@A;#&'95'
305*>B21,'3:CD"'(3:@05)'895'E<;'B18951'7;1'1FA15:>1+73G'!1223'4151'7;1+':+06B*71,'895'H;':+'
6+,15'+95>9F:0'95';IA9F:0'09+,:J9+':+'A5131+01'95'*B31+01'98'7;1'A5971*39>1':+;:B:795'
KL&M<'(&='NK)G'!122'2I3*713'4151'*33*I1,'895'O$P%<Q'1FA5133:9+'BI'R13715+'B297'*+*2I3:3G'
@:>:2*5'5136273'4151'9B7*:+1,':+'7;511':+,1A1+,1+7'1FA15:>1+73S'*+,'1T6*2'29*,:+U'4*3'
>9+:7951,'63:+U'*+JB9,I'79'76B62:+G''
HIF-2!
Tubulin w/o MG132
hypoxia normoxia
with MG132 HIF-2!
Tubulin
A.
CAKI-1
HIF-2!
Tubulin w/o MG132
hypoxia normoxia
with MG132 HIF-2!
Tubulin
B.
A549
157!
1.3. Discussion
HIF-2α est fréquemment surexprimé dans les tumeurs. Son rôle a principalement été étudié dans
les ccRCC où il constitue un facteur clé du développement et de la progression tumorale. En effet,
la plupart des ccRCC présentent une inactivation du gène VHL ce qui entraine l’expression
constitutive des sous-unités HIF-α (Kaelin 2007). De plus, des études ont montré que HIF-2α est
nécessaire et suffisant à la formation de tumeurs par des lignées de ccRCC (Kondo et al. 2003), et
qu’à l’inverse, HIF-1α n’est pas essentiel à ce processus (Shinojima et al. 2007, Shen et al. 2011). En
particulier, l’expression de la cycline D1, du TGFα et du VEGF dans les ccRCC est régulée
spécifiquement par HIF-2 (Raval et al. 2005). Enfin, des données indiquent que les ccRCC
exprimant uniquement HIF-2α semblent être plus agressifs (Gordan et al. 2008).
Différents travaux ont établi que la voie SphK1/S1P contrôle HIF-1α en hypoxie (Ader et al. 2008,
Cho et al. 2011, Cuvillier et al. 2013, Kalhori et al. 2013). Dans cette étude, nous montrons pour la
première fois que la SphK1 régule l’expression de HIF-2α dans plusieurs modèles tumoraux, dont
les ccRCC, suggérant ainsi un rôle canonique de cette enzyme dans la régulation de HIF-2α. Au
vu de l’importance de cette protéine dans les ccRCC, nous avons caractérisé les mécanismes
moléculaires impliqués dans la régulation de HIF-2α par la SphK1 dans plusieurs lignées de
ccRCC représentatives de certains sous-groupes retrouvés en clinique humaine.
En accord avec nos précédents travaux (Ader et al. 2015), une augmentation significative de
l’activité de la SphK1 est observée après 1 heure d’hypoxie. Elle précède ainsi l’accumulation de
HIF-2α qui a lieu après 2 à 3 heures d’hypoxie. Nos résultats indiquent que l’activation de la
SphK1 en hypoxie a lieu selon un mécanisme dépendant des ROS et de la PLD, dont l’activation
est maximale après 15 à 30 minutes d’hypoxie. De manière cohérente avec la littérature (Toschi et
al. 2008a), nous confirmons que la PLD régule l’expression de HIF-2α dans les ccRCC et nous
mettons en évidence le rôle de la PLD dans l’activation de la SphK1 en hypoxie dans ces modèles.
A l’aide des lignées A498 et 786-O déficientes pour pVHL et qui n’expriment pas HIF-1α, nous
montrons que la SphK1 régule non seulement l’expression de HIF-2α mais aussi son activité
transcriptionnelle. En effet, nos résultats indiquent que la déplétion de la SphK1 entraine une
diminution de l’expression de GLUT-1 et de la cycline D1, deux gènes cibles de HIF-2. De plus, la
déplétion de la SphK1 entraine une diminution de la prolifération cellulaire dans les lignées A498
et 786-O, ce qui est en accord avec le fait que HIF-2α favorise la survie des cellules tumorales
(Bertout et al. 2009).
De manière intéressante, et contrairement aux résultats de notre étude sur HIF-1α (Ader et al.
2008), nous montrons que la régulation de HIF-2α par la SphK1 dans les ccRCC a lieu selon un
158!
mécanisme indépendant du protéasome, quelque soit le statut pVHL de ces lignées. En effet, nos
résultats indiquent que la SphK1 régule la synthèse de HIF-2α via la voie mTOR, souvent
dérégulée dans les cancers et impliquée dans la régulation de la traduction de HIF-2α (Toschi et
al. 2008b). De plus, nous montrons que la protéine kinase Akt constitue un lien entre la voie
SphK1/S1P et mTOR puisque la déplétion de la SphK1 inhibe l’activation des protéines Akt et
mTOR. Sachant qu’Akt peut être activée par les S1PRs (Takabe et al. 2008), et que l’hypoxie induit
une surproduction de S1P (Anelli et al. 2008, Schnitzer et al. 2009), nous avons étudié l’effet de la
neutralisation de la S1P extracellulaire sur le taux intracellulaire de HIF-2α. L’utilisation du
Sphingomab®, un anticorps neutralisant la S1P extracellulaire, ainsi que la déplétion du
transporteur Spns2, responsable de l’export de la S1P, établissent l’implication de la S1P
extracellulaire dans la régulation de HIF-2α dans les ccRCC.
En conclusion, notre étude démontre que la voie SphK1/S1P constitue un régulateur clé de HIF-
2α dans différents modèles tumoraux, en particulier dans les ccRCC, tumeurs rénales les plus
fréquentes et dont les formes métastatiques sont agressives, résistantes aux chimiothérapies et
généralement incurables (Jonasch et al. 2014). Une étude ayant montré que la SphK1 est
surexprimée dans des xénogreffes de ccRCC résistantes à l’inhibition du VEGFR2, et que le
Sphingomab® retarde la croissance de ces mêmes tumeurs (Zhang et al. 2015), il apparaît que
l’inhibition de la voie SphK1/S1P représente une stratégie thérapeutique alternative à l’utilisation
des thérapies ciblées dirigées contre mTOR et la voie du VEGF. Le ciblage de la S1P en clinique
est à portée de main, puisque la forme humanisée du Sphingomab® est actuellement évalué dans
une étude clinique de phase II pour le traitement des ccRCC métastatiques inopérables et
résistants aux thérapies ciblées (NCT01762033). Une telle stratégie anti-S1P pourrait procurer un
bénéfice thérapeutique non seulement pour les ccRCC, mais également pour d’autres cancers où
HIF-2α joue un rôle important.
159!
2. Implication des récepteurs à S1P dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α
Les travaux de notre équipe établissent que la SphK1 constitue un régulateur canonique de HIF-
1α et HIF-2α dans différents modèles tumoraux dont les ccRCC, et que cette lipide-kinase exerce
son effet par deux mécanismes distincts. En effet, la SphK1 régule la stabilité de HIF-1α via un
mécanisme dépendant de la voie Akt/GSK3β (Ader et al. 2008), et la synthèse de HIF-2α via un
mécanisme impliquant la voie Akt/mTOR et les protéines p70S6K et 4EBP1 (Gstalder et al. 2015).
Pour aller plus loin, nous avons mis en évidence l’implication de la S1P extracellulaire dans la
régulation de HIF-1α et HIF-2α. En effet, l’inhibition de l’export de la S1P ainsi que la
neutralisation de la S1P extracellulaire entrainent une forte diminution du taux intracellulaire de
HIF-1α et HIF-2α dans différents modèles tumoraux (Ader et al. 2015, Gstalder et al. 2015). Au vu
de ces résultats, et sachant que l’action extracellulaire de la S1P a lieu via son interaction avec l’un
de ses cinq récepteurs couplés aux protéines G, les récepteurs S1PRs (S1P1-5), nous avons voulu
déterminer l’implication de ces S1PRs dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α.
2.1. Rôle des S1P1-3-4-5 dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α
Les effets biologiques de la S1P extracellulaire dépendent des voies de signalisation activées en
aval des S1PRs mais aussi du niveau d’expression de ces récepteurs, qui diffère selon les tissus.
Par conséquent, nous avons déterminé le profil d’expression des S1PRs dans deux lignées de
ccRCC, l’une exprimant pVHL (CAKI-1) et l’autre non (A498), ainsi que dans une lignée
d’adénocarcinome prostatique (PC3) et de glioblastome (U87), afin d’élargir notre étude à
d’autres modèles. Dans ces quatre lignées cellulaires, nous avons évalué l’expression de l’ARNm
et l’expression protéique des S1PRs par qRT-PCR et western blot (Figures 8A et 8B,
respectivement). Nos résultats indiquent que les lignées CAKI-1, A498, PC3 et U87 expriment les
cinq S1PRs en normoxie. Des résultats similaires ont été observés en hypoxie.
160!
Figure 8. Profil d’expression des S1PRs dans les lignées CAKI-1, A498, PC3 et U87. (A) Détermination du profil d’expression de l’ARNm des S1PRs en normoxie par qRT-PCR. Colonnes, moyenne de quatre expériences indépendantes. Barres, SEM. UA : unités arbitraires (B) Détermination du profil d’expression des S1PRs en normoxie par western blot. La normalisation est effectuée par rapport à la tubuline. Les résultats présentés sont représentatifs de trois expériences indépendantes.
Afin d’évaluer l’implication des S1PRs dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α dans nos lignées
cellulaires tumorales, nous avons utilisé le FTY720, un antagoniste des récepteurs S1P1-3-4-5, à la
concentration de 10µM, une dose couramment utilisée dans la littérature (Brinkmann et al. 2010).
Nos résultats indiquent qu’après 24 heures de traitement, le FTY720 diminue d’au moins 80%
l’expression protéique de HIF-1α et HIF-2α induite par l’hypoxie dans les lignées CAKI-1 et PC3
(Figure 9A). La lignée A498, quant à elle, n’exprime pas HIF-1α et est qualifiée de pseudo-
hypoxique puisqu’elle est délétée pour pVHL, et exprime ainsi HIF-2α de manière constitutive en
normoxie. Dans cette lignée, le FTY720 inhibe totalement l’expression de HIF-2α en normoxie
(Figure 9A). Ces résultats suggèrent que les récepteurs S1P1, S1P3, S1P4 et S1P5 sont impliqués
dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α dans les lignées A498, CAKI-1 et PC3. Cependant, cette
expérience n’a pas pu être réalisée dans la lignée U87 en raison d’une trop forte sensibilité de ces
cellules au FTY720 à la dose utilisée. Les proprietés pro-apoptotiques du FTY720 ayant été
décrites (Azuma et al. 2003b), l’observation au microscope des cellules U87 révèle en effet que ce
composé induit la mort de la quasi-totalité d’entre elles.
Le mécanisme d’action du FTY720 a principalement été décrit sur le S1P1 où il agit comme un
161!
antagoniste fonctionnel. En effet, une fois phosphorylé, le FTY720 se lie au S1P1 pour induire son
internalisation puis son ubiquitinylation et sa dégradation par le protéasome. Ceci conduit à une
diminution de son expression à la surface de la cellule (Oo et al. 2007). Nous avons donc
déterminé si la diminution de l’expression de HIF-1α et HIF-2α induite par le FTY720 est corrélée
à une diminution de l’expression du S1P1. Nos résultats de western blot montrent en effet
qu’après 6 à 24 heures de traitement, le FTY720 entraine une diminution de l’expression
protéique du S1P1 dans les lignées A498, CAKI-1 et PC3, ce qui suggère que l’inhibition de HIF-
1α et HIF-2α induite par le FTY720 pourrait s’expliquer par la dégradation du S1P1 (Figure 9B).
D’autre part, des études ont montré qu’en plus de ses propriétés antagonistes des S1P1-3-4-5, le
FTY720 est également un inhibiteur de la SphK1 (Pchejetski et al. 2010, Lim et al. 2011). Nos
résultats de tests d’activité kinase indiquent en effet que le FTY720 entraine une diminution
d’environ 35% à 65% de l’activité enzymatique de la SphK1 en normoxie ou en hypoxie selon les
lignées (Figure 9C). Ces données confirment les propriétés inhibitrices du FTY720 vis-à-vis de la
SphK1.
2.2. Le S1P1 contrôle l’expression de HIF-1α et HIF-2α Le FTY720 induisant une diminution de l’expression protéique du S1P1, ainsi que de HIF-1α et
HIF-2α (Figures 9A et 9B), nous avons voulu déterminer l’implication du S1P1 dans la régulation
de ces deux facteurs en évaluant l’effet de la déplétion de ce récepteur, par différentes stratégies
d’interférence à l’ARN, sur l’expression intracellulaire de HIF-1α et HIF-2α. Dans un premier
temps, nous avons validé l’efficacité et la spécificité de deux siRNA dirigés contre le S1P1 – les
siS1P1(a) et siS1P1(b) – par qRT-PCR. Nos résultats montrent que le siS1P1(a) entraine une
diminution significative de l’expression de l’ARNm du S1P1, de 30% à 60% selon les lignées
cellulaires, et qu’il ne modifie pas l’expression de l’ARNm des autres S1PRs, validant ainsi
l’efficacité et la spécificité de cette séquence (Figure 10). Le siS1P1(b), quant à lui, entraine une
diminution significative de l’expression de l’ARNm du S1P1, de 50% à 70% selon les lignées
cellulaires, mais semble moins spécifique que le siS1P1(a) vis-à-vis des autres S1PRs (Figure 10).
En effet, le siS1P1(b) entraine notamment une diminution respective de 20% et 50% de
l’expression de l’ARNm du S1P2 dans les lignées PC3 et CAKI-1, ainsi qu’une diminution de 60%
de l’expression de l’ARNm du S1P5 dans les lignées A498 et CAKI-1. La déplétion du S1P1
entraine une diminution de 80% à 90% de l’expression de HIF-2α dans la lignée A498 en
normoxie (Figures 11A et 11B), et une diminution d’environ 90% de l’expression de HIF-1α et
HIF-2α dans les lignées CAKI-1 et U87 en hypoxie (Figures 11A et 11B). Dans ces trois lignées
162!
cellulaires, le siS1P1(a) et le siS1P1(b) ont des effets similaires sur l’expression de HIF-1α et HIF-
2α, démontrant que les effets observés sont uniquement dus à la déplétion du S1P1, et non pas à
celle d’un autre S1PR. Dans la lignée PC3, le siS1P1(a) entraine une diminution respective de 50%
et 60% de l’expression de HIF-1α et HIF-2α en hypoxie. Le siS1P1(b) entraine quant à lui une
diminution de 90% de l’expression de ces facteurs (Figures 11A et 11B). Une telle différence entre
les effets de ces deux siRNA pourrait s’expliquer par le fait que le siS1P1(b) entraine une
diminution de l’expression de l’ARNm des S1P2 et S1P3 (Figure 10). Ces récepteurs pourraient en
effet être impliqués dans la régulation des facteurs HIF en hypoxie dans la lignée PC3.
L’implication du S1P1 dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α a été confirmée par l’utilisation
d’un antagoniste spécifique du S1P1, le W146 (Gonzalez-Cabrera et al. 2008) (Figure 11C), ainsi
qu’à l’aide deux lignées stables transduites par des shRNA, les lignées CAKI-1-shCtrl et CAKI-1-
shS1P1. En effet, la lignée CAKI-1-shS1P1, qui exprime dix fois moins l’ARNm du S1P1 que la
lignée CAKI-1-shCtrl (Figure 11D), présente un taux intracellulaire de HIF-1α et de HIF-2α dix
fois inférieur à celui de la lignée CAKI-1-shCtrl (Figure 11E). Dans leur ensemble, ces résultats
montrent que le S1P1 contrôle l’expression intracellulaire de HIF-1α et HIF-2α en hypoxie dans
des lignées de ccRCC, d’adénocarcinome prostatique et de glioblastome ; ainsi que celle de HIF-
2α en normoxie dans une lignée de ccRCC déficiente pour pVHL.
163!
Figure 9. Effet du FTY720 sur le taux intracellulaire de HIF-1α , de HIF-2α , du S1P1 et sur l’activité de la SphK1. (A) Effet du FTY720 sur le taux intracellulaire de HIF-1α et de HIF-2α. Les cellules A498, CAKI-1 et PC3 sont traitées au FTY720 (10µM) ou au DMSO (contrôle) pendant 24h, les 6 dernières heures de traitement ayant lieu ou non en hypoxie (0,1% O2). L’expression de HIF-1α et de HIF-2α est ensuite évaluée par western blot. La normalisation est effectuée par rapport à la tubuline. Les résultats présentés sont représentatifs de trois expériences indépendantes. (B) Effet du FTY720 sur l’expression du S1P1. Les cellules A498, CAKI-1 et PC3 sont traitées au FTY720 (10µM) ou au DMSO (contrôle) pendant 6h ou 24h. L’expression du S1P1 est ensuite évaluée par western blot. La normalisation est effectuée par rapport à la tubuline. Les résultats présentés sont représentatifs de trois expériences indépendantes. (C) Effet du FTY720 sur l’activité de la SphK1. Les cellules A498, CAKI-1 et PC3 sont traitées au FTY720 (10µM) ou au DMSO (contrôle) pendant 24h, les 2 dernières heures de traitement ayant lieu ou non en hypoxie (0,1% O2). L’activité enzymatique de la SphK1 est ensuite mesurée. Colonnes, moyenne de six (A498, CAKI-1) ou deux (PC3) expériences indépendantes. Barres, SEM. *, p<0,05. **, p<0,01. ***, p<0,001.
164!
Figure 10. Validation de deux siRNA dirigés contre le S1P1. Les cellules A498, CAKI-1, PC3 et U87 sont transfectées pendant 72h avec un siRNA dirigé contre le récepteur S1P1 (siS1P1(a) à 50nM, siS1P1(b) à 40nM) ou avec un siScramble (50nM, contrôle). L’expression de l’ARNm des S1PRs est ensuite déterminée par qRT-PCR. Colonnes, moyenne de trois expériences indépendantes. Barres, SEM. *, p<0,05. **, p<0,01. ***, p<0,001. UA : unités arbitraires.
165!
Figure 11. Implication du S1P1 dans la régulation du taux intracellulaire de HIF-1α et HIF-2α . (Légende page suivante)
166!
2.3. Rôle du S1P1 dans la régulation de l’expression des gènes cibles de HIF (Résultats préliminaires)
Par la suite, nous avons voulu déterminer si l’inhibition de HIF-1α et HIF-2α induite par la
déplétion du S1P1 est corrélée à une diminution de l’activité transcriptionnelle de ces facteurs.
Pour cela, nous avons évalué l’expression de la cycline D1, un gène cible de HIF-2 impliqué dans
la progression du cycle cellulaire, ayant ainsi des propriétés pro-prolifératives (Raval et al. 2005).
Nos résultats montrent que la déplétion du S1P1 en hypoxie entraine une diminution de 50% à
80% de l’expression de la cycline D1 en fonction des lignées cellulaires (Figure 12A). De plus, des
tests de prolifération par incorporation de thymidine tritiée indiquent que la déplétion du S1P1 en
hypoxie est également associée à une diminution de la prolifération cellulaire, allant de 30% à
70% selon les lignées (Figure 12B). Ces résultats préliminaires suggèrent d’une part que le S1P1
pourrait être impliqué dans la régulation des gènes cibles de HIF ; et d’autre part que les
propriétés pro-prolifératives du S1P1 pourraient s’expliquer par son rôle dans la régulation de
l’expression de HIF-2α et donc de la cycline D1. Des expériences sont en cours au laboratoire afin
de compléter l’étude de l’implication du S1P1 dans la régulation de l’expression des gènes cibles
de HIF.
Figure 11. Implication du S1P1 dans la régulation du taux intracellulaire de HIF-1α et HIF-2α . (Page précédente) (A, B) Effet de la déplétion transitoire du S1P1 sur le taux intracellulaire de HIF-1α et de HIF-2α. Les cellules A498, CAKI-1, PC3 et U87 sont transfectées pendant 72h avec le siS1P1(a) (50nM, A) ou le siS1P1(b) (40nM, B), en comparaison avec un siScramble (50nM, contrôle), puis sont incubées en hypoxie (0,1% O2) ou en normoxie (21% O2) pendant 6h. L’expression de HIF-1α et de HIF-2α est ensuite évaluée par western blot. La normalisation est effectuée par rapport à la tubuline. Les résultats présentés sont représentatifs de trois expériences indépendantes. (C) Effet du W146 sur le taux intracellulaire de HIF-1α et de HIF-2α. Les cellules A498, CAKI-1, PC3 et U87 sont cultivées en absence de sérum pendant 16h puis sont traitées au W146 (5µM) ou à l’éthanol (contrôle) et incubées en hypoxie (0,1% O2) ou en normoxie (21% O2) pendant 6h. L’expression de HIF-1α et de HIF-2α est ensuite évaluée par western blot. La normalisation est effectuée par rapport à la tubuline. Les résultats présentés sont représentatifs de trois expériences indépendantes. (D) Validation des lignées CAKI-1-shCtrl et CAKI-1-shS1P1 par qRT-PCR. Colonnes, moyenne de trois expériences indépendantes. Barres, SEM. ***, p<0,001. UA : unités arbitraires. (E) Effet de la déplétion permanente du S1P1 sur le taux intracellulaire de HIF-1α et de HIF-2α. Les cellules CAKI-1-shCtrl et CAKI-1-shS1P1 sont incubées en hypoxie (0,1% O2) ou en normoxie (21% O2) pendant 6h. L’expression de HIF-1α et de HIF-2α est ensuite évaluée par western blot. La normalisation est effectuée par rapport à la tubuline. Les résultats présentés sont représentatifs de trois expériences indépendantes.
167!
Figure 12. Effet de la déplétion du S1P1 sur l’expression de la cycline D1 et sur la prolifération des cellules tumorales in vitro. (A) Effet de la déplétion transitoire du S1P1 sur l’expression intracellulaire de la cycline D1.!Les cellules A498, CAKI-1, PC3 et U87 sont transfectées pendant 72h avec le siS1P1(a) (50nM), en comparaison avec un siScramble (50nM, contrôle), puis sont incubées en hypoxie (0,1% O2) ou en normoxie (21% O2) pendant 18h. L’expression de la cycline D1 est ensuite évaluée par western blot. La normalisation est effectuée par rapport à la tubuline. Les résultats présentés sont représentatifs de deux expériences indépendantes. (B) Effet de la déplétion transitoire du S1P1 sur la prolifération cellulaire. Les cellules A498, CAKI-1, PC3 et U87 sont transfectées pendant 72h avec le siS1P1(a) (50nM), en comparaison avec un siScramble (50nM, contrôle); puis sont placées ou non en hypoxie (0,1% O2) pendant les dernières 24h. La prolifération cellulaire est ensuite évaluée par test d’incorporation de thymidine tritiée. Colonnes, moyenne de trois expériences indépendantes. Barres, SEM. *, p<0,05. **, p<0,01. ***, p<0,001.
168!
3. Etude de l’inhibition de la voie SphK1/S1P sur l’adaptation à l’hypoxie intratumorale et sur la sensibilisation à la chimiothérapie dans un modèle murin de ccRCC
Les ccRCC sont connus pour être résistants à la chimiothérapie. Dans ces tumeurs, comme dans la
majorité des cancers, la surexpression de la SphK1 aboutit à la dérégulation du biostat
sphingolipidique en faveur de la S1P, qui favorise l’angiogenèse et protège les cellules tumorales
de l’apoptose induite par la chimiothérapie (Chae et al. 2004, Maceyka et al. 2012, Giussani et al.
2014). De plus, la surexpression de la SphK1 est généralement corrélée à une diminution de la
survie des patients (Zhang et al. 2014c), faisant de la voie SphK1/S1P une cible thérapeutique
d’intérêt en cancérologie (Cuvillier 2008). L’hypoxie intratumorale constitue également un facteur
de mauvais pronostic (Vaupel and Mayer 2007) et favorise l’agressivité tumorale via l’activation
des facteurs HIF. Ces derniers sont à l’origine de la surproduction de VEGF par les cellules
tumorales, et promeuvent ainsi la formation d’un réseau vasculaire tumoral dense et immature
qui renforce l’hypoxie intratumorale pour former un cercle vicieux et favoriser la résistance
thérapeutique, notamment la chimiorésistance (Jain 2005, Carmeliet and Jain 2011b, Semenza
2012a). Le ciblage de ce réseau vasculaire tumoral anormal induit par les facteurs HIF et le VEGF
constitue ainsi une stratégie thérapeutique pertinente. Alors que l’inhibition directe des facteurs
de transcription HIF est une tâche difficile (Melillo 2006), le ciblage d’une voie en amont de ces
facteurs s’avère plus pragmatique.
Notre équipe ayant démontré que la voie SphK1/S1P constitue un régulateur canonique de HIF-
1α et HIF-2α dans différents modèles tumoraux dont les ccRCC (Ader et al. 2008, Ader et al. 2015,
Gstalder et al. 2015), et au vu de l’importance de ces facteurs dans le développement et la
progression de ces tumeurs (Kondo et al. 2003, Fu et al. 2011), nous avons voulu évaluer in vivo
l’impact de l’inhibition de la voie SphK1/S1P sur l’hypoxie intratumorale, l’angiogenèse et la
chimiosensibilité d’un modèle murin de ccRCC. Pour cela, nous avons utilisé le FTY720,
inhibiteur de la SphK1, antagoniste fonctionnel du S1P1 (Brinkmann et al. 2002, Pchejetski et al.
2010, Tonelli et al. 2010), et dont nous avons démontré les propriétés inhibitrices de HIF-1α et
HIF-2α in vitro. Le FTY720 étant déjà utilisé en clinique humaine, il constitue un outil
thérapeutique de choix pour notre étude. Nous avons ainsi étudié l’effet de l’inhibition de la voie
SphK1/S1P par le FTY720 dans un modèle murin de ccRCC établi par xénogreffe hétérotopique
de cellules CAKI-1 dans des souris nude (Figure 13). Dans ce modèle, les animaux sont traités au
FTY720 à la dose de 2,5mg/kg/j, une dose couramment utilisée dans la littérature, ou au DMSO,
utilisé comme contrôle, pendant 3 à 9 jours. Au jour de l’initiation du traitement (J0), ou après 3,
169!
5, 7 ou 9 jours de traitement au FTY720 ou au DMSO, les souris sont sacrifiées afin de prélever
leurs tumeurs et leur sang total qui nous ont permis, en premier lieu, de caractériser dans le
temps l’effet de l’inhibition de la voie SphK1/S1P sur l’adaptation à l’hypoxie intratumorale, sur
l’angiogenèse ainsi que sur la prolifération et la survie des cellules tumorales.
Figure 13. Protocole in vivo n°1. Dix millions de cellules CAKI-1 ont été implantées en sous-cutané dans le flanc droit de souris nude afin de former des xénogreffes hétérotopiques. Quinze jours après implantation, alors que les tumeurs atteignent un volume de 100mm3 environ, les souris sont traitées chaque jour au FTY720 (2,5mg/kg), ou au DMSO (contrôle) jusqu’à neuf jours. Après 0, 3, 5, 7 ou 9 jours de traitement, les souris sont sacrifiées afin de prélever leurs tumeurs et leur sang total. Chaque groupe est constitué de 8 animaux, à l’exception du groupe J0 qui en contient 4. IF : immunofluorescence, IHC : immunohistochimie ; ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay WB : western blot.
3.1. Le FTY720 diminue transitoirement l’expression intratumorale de HIF-1α et HIF-2α ainsi que la sécrétion tumorale de VEGF
Notre équipe ayant montré que la voie SphK1/S1P régule HIF-1α et HIF-2α, (Ader et al. 2008,
Gstalder et al. 2015), et sachant que le blocage de cette voie par le FTY720 inhibe HIF-1α et HIF-2α
in vitro (cf. partie 2), nous avons dans un premier temps étudié l’effet du FTY720 sur l’expression
intratumorale de HIF-1α et HIF-2α dans notre modèle murin de ccRCC. Pour cela, nous avons
réalisé un western blot sur des lysats de tumeurs fraiches prélevées à J0 ou après 3 à 9 jours de
traitement au FTY720 ou au DMSO (Figures 14A et 14B). Alors que HIF-1α et HIF-2α sont
exprimés par les tumeurs contrôles tout au long du protocole, nos résultats indiquent qu’après 3
jours de traitement, le taux intratumoral de HIF-1α est diminué de 40 à 70% chez les souris
170!
traitées au FTY720 par rapport aux souris contrôles. L’inhibition de l’expression de HIF-1α est
maximale dans les tumeurs traitées 5 à 7 jours au FTY720, puisque le taux intratumoral de HIF-1α
y est diminué jusqu’à 90% par rapport aux tumeurs contrôles. Enfin, après 9 jours de traitement,
le taux intratumoral de HIF-1α chez les souris traitées au FTY720 devient équivalent à celui des
souris contrôles (Figure 14A). Un profil similaire est observé pour l’expression intratumorale de
HIF-2α (Figure 14B). En effet, après 5 jours de traitement, le FTY720 entraine une diminution de
90% du taux intratumoral de HIF-2α par rapport au traitement contrôle. Cette forte inhibition de
HIF-2α se poursuit jusqu’au 7ème jour de traitement où elle est de 70% en moyenne. Enfin, HIF-2α
est réexprimé après 9 jours de traitement au FTY720.
L’ensemble de ces résultats indique que chez les souris contrôles, l’expression intratumorale de
HIF-1α et HIF-2α est dynamique et variable dans le temps ainsi que d’une tumeur à une autre à
un temps donné ; et montre qu’en comparaison du traitement contrôle, le FTY720 entraine une
diminution forte et transitoire de l’expression intratumorale de HIF-1α et HIF-2α entre le 5ème et le
7ème jour de traitement.
Par la suite, nous avons souhaité déterminer si cette inhibition transitoire de l’expression
intratumorale de HIF-1α et HIF-2α est corrélée à une diminution de l’activité transcriptionnelle
de ces facteurs, et donc à une diminution de l’expression de leurs gènes cibles. Nous nous
sommes particulièrement intéressés au VEGF, principal facteur pro-angiogénique, dont la
surproduction par les cellules tumorales entraine une vascularisation forte mais structurellement
et fonctionnellement anormale, ce qui renforce l’hypoxie intratumorale et contribue à l’échec
thérapeutique (Carmeliet and Jain 2000, Jain 2005). Ainsi, afin d’évaluer l’effet du FTY720 sur la
sécrétion tumorale de VEGF, nous avons réalisé un test ELISA sur des échantillons de plasma de
nos animaux. Nos résultats indiquent, qu’en comparaison du traitement contrôle, le FTY720
entraine une diminution significative de 30% de la sécrétion tumorale de VEGF au 5ème jour de
traitement (Figure 14C).
Ces résultats indiquent que la diminution transitoire du taux intratumoral de HIF-1α et HIF-2α
induite par le FTY720 in vivo est associée à une diminution de la sécrétion tumorale de VEGF,
dont l’expression est contrôlée par l’activité transcriptionnelle de ces facteurs.
171!
Figure 14. Effet du FTY720 sur le taux intratumoral de HIF-1α et HIF-2α et sur la sécrétion tumorale de VEGF. Analyse de l’expression intratumorale de HIF-1α (A) et HIF-2α (B) par western blot sur 22 tumeurs fraiches prélevées après 0, 3, 5, 7 ou 9 jours de traitement au FTY720 2,5mg/kg/jour ou au DMSO. La normalisation est effectuée par rapport à la tubuline. (C) Détermination de la sécrétion tumorale de VEGF (pg/mL) par test ELISA après 0, 3, 5, 7 ou 9 jours de traitement au FTY720 2,5mg/kg/jour (noir) ou au DMSO (blanc). Colonnes, moyenne de 2 (jour 0) ou 4 (jour 3, 5, 7, 9) souris par groupe. Barres, SEM. *, p<0,05.
172!
3.2. Le FTY720 entraine un remodelage transitoire du réseau vasculaire tumoral associé à une oxygénation tumorale
Les facteurs HIF induisant l’expression de nombreux facteurs pro-angiogéniques, dont le VEGF,
nous avons ensuite évalué l’effet du FTY720 sur la densité vasculaire tumorale de notre modèle
murin de ccRCC. Ainsi, à partir des tumeurs prélevées et incluses en paraffine, nous avons réalisé
par immunofluorescence un marquage des cellules endothéliales à l’aide d’un anticorps anti-
CD34. Nos résultats montrent une diminution de la densité vasculaire tumorale chez les animaux
traités au FTY720 en comparaison des animaux contrôles, et ceci dès le 5ème jour de traitement
(Figures 15A et 15B). Ces données confirment les propriétés anti-angiogéniques du FTY720
précédemment mises en évidence dans d’autres modèles (LaMontagne et al. 2006). Au vu de ces
résultats, nous avons voulu déterminer l’impact du FTY720 sur l’oxygénation tumorale. Dans ce
but, nous avons marqué les zones d’hypoxie intratumorale par immunohistochimie à l’aide d’un
anticorps anti-pimonidazole. Le pimonidazole est injecté aux animaux 30 à 90 minutes avant leur
sacrifice. En absence d’oxygène, ce composé est réduit et peut alors former des adduits stables
avec des groupements thiol de molécules endogènes qui pourront ainsi être détectées. Alors que
les tumeurs contrôles présentent de nombreuses zones d’hypoxie (Figure 15C), nos résultats
indiquent que le FTY720 entraine une diminution forte, de plus de 50%, et transitoire de l’hypoxie
intratumorale du 5ème au 7ème jour de traitement (Figures 15C et 15D).
Afin de déterminer comment le FTY720 peut à la fois diminuer la densité vasculaire tumorale et
augmenter l’oxygénation tumorale, nous nous sommes intéressés à la structure et à la
fonctionnalité des vaisseaux sanguins tumoraux. En premier lieu, nos résultats montrent que les
vaisseaux sanguins des tumeurs traitées au FTY720 semblent plus ouverts que ceux des tumeurs
contrôles (Figure 15A). Afin de caractériser la fonctionnalité des vaisseaux sanguins tumoraux,
nous avons étudié leur structure. Pour cela, nous avons évalué l’effet du FTY720 sur le
recouvrement péricytaire. Nous avons donc réalisé, par immunofluorescence, un double
marquage des cellules endothéliales (CD34) et des péricytes (αSMA, Figure 16A ; et desmine,
Figure 16C). Généralement, les vaisseaux sanguins tumoraux sont dépourvus de péricytes, ce qui
les rend immatures et perméables, diminuant ainsi leur fonctionnalité (Eberhard et al. 2000,
Potente et al. 2011). Une telle absence de péricytes au niveau des vaisseaux sanguins est observée
dans les tumeurs contrôles (Figures 16A et 16C). En revanche, nos résultats indiquent que le
FTY720 entraine une augmentation significative et transitoire du recouvrement péricytaire, au
5ème et au 7ème jour de traitement, en comparaison avec le traitement contrôle (Figure 16). Ces
données montrent que le FTY720 permet d’augmenter transitoirement la proportion de vaisseaux
sanguins tumoraux matures, et donc potentiellement fonctionnels.
173!
L’ensemble de nos résultats indique que dans notre modèle murin de ccRCC, le FTY720 entraine
une diminution transitoire du taux intratumoral de HIF-1α et HIF-2α, qui corrèle dans le temps
avec une diminution de la sécrétion tumorale de VEGF, facteur pro-angiogénique favorisant la
perméabilité vasculaire. Ceci est associé à un remodelage du réseau vasculaire tumoral qui
consiste en une diminution de la densité vasculaire et en une augmentation de la maturation des
vaisseaux sanguins tumoraux, suggérant que le FTY720 induit une normalisation vasculaire
transitoire qui aboutit à une oxygénation tumorale et qui pourrait sensibiliser ce modèle murin de
ccRCC à la chimiothérapie (Jain 2001, Goel et al. 2011).
174!
Figure 15. Effet du FTY720 sur la densité vasculaire et l’hypoxie intratumorale. (A) Caractérisation de la densité vasculaire par marquage des cellules endothéliales (CD34, rouge) et des noyaux (DAPI, bleu) en immunofluorescence. Les images sont représentatives de coupes tumorales de souris traitées pendant 5 jours au FTY720 2,5mg/kg/jour ou au DMSO. Echelle, 200µm. (B) Nombre de vaisseaux sanguins (structures CD34+) par zone de 0,75mm2 après 0, 3, 5, 7 ou 9 jour(s) de traitement au FTY720 2,5mg/kg/j (noir) ou au DMSO (blanc). Colonnes, moyenne de 4 (jour 0) ou 8 (jour 3, 5, 7, 9) souris par groupe. Barres, SEM. *, p<0,05. **, p<0,01. (C) Détection des zones d’hypoxie intratumorale par marquage immunohistochimique du pimonidazole (brun) et contre-coloration à l’hématoxyline (bleu). Les images sont représentatives de coupes tumorales de souris traitées pendant 5 jours au FTY720 2,5mg/kg/jour ou au DMSO. Echelle, 250µm. (D) Intensité relative du pimonidazole par zone de 0,75mm2 après 0, 3, 5, 7 ou 9 jour(s) de traitement au FTY720 2,5mg/kg/jour (noir) ou au DMSO (blanc). Colonnes, moyenne de 4 (jour 0) ou 8 (jour 3, 5, 7, 9) souris par groupe. Barres, SEM. *, p<0,05.
175!
Figure 16. Effet du FTY720 sur le recouvrement péricytaire. (A, C) Caractérisation de la présence de péricytes au niveau des vaisseaux sanguins par marquage des cellules endothéliales (CD34, rouge), des péricytes à l’aide de deux marqueurs (A, αSMA, vert ; C, desmine, vert) et des noyaux (DAPI, bleu) en immunofluorescence. Les images sont représentatives de coupes tumorales de souris traitées pendant 5 jours (A) ou 7 jours (C) au FTY720 2,5mg/kg/jour ou au DMSO. Echelle, 200µm. (B, D) Quantification du recouvrement péricytaire par zone de 0,75mm2 après 0, 3, 5, 7 ou 9 jours de traitement au FTY720 2,5mg/kg/jour (noir) ou au DMSO (blanc). Colonnes, moyenne de 4 (jour 0) ou 8 (jour 3, 5, 7, 9) souris par groupe. Barres, SEM. *, p<0,05.
176!
3.3. Le FTY720 diminue la prolifération et la survie cellulaire tumorale
Les propriétés pro-prolifératives et anti-apoptotiques de la voie SphK1/S1P/S1P1 ont largement
été décrites, tout comme les propriétés anti-prolifératives et pro-apoptotiques du FTY720 in vitro
et in vivo (Cuvillier et al. 1996, Xia et al. 2000, Azuma et al. 2003b, LaMontagne et al. 2006,
Pchejetski et al. 2010). Ainsi, après avoir évalué l’impact du traitement au FTY720 sur le
compartiment endothélial des tumeurs, nous nous sommes intéressés à son effet direct sur la
prolifération et la survie des cellules tumorales.
Afin d’évaluer la prolifération des cellules tumorales de notre modèle murin de ccRCC, nous
avons déterminé la proportion de cellules positives au Ki67, un marqueur de prolifération, par
immunofluorescence. Nos résultats indiquent que le FTY720 entraine une diminution
significative de la prolifération cellulaire tumorale dès le 3ème jour de traitement pour l’inhiber
jusqu’à près de 50% au 9ème jour de traitement (Figure 17). Ces données mettent en évidence les
propriétés anti-prolifératives du FTY720 dans notre modèle murin de ccRCC.
Afin de compléter cette étude, nous avons caractérisé la mort cellulaire au sein des tumeurs. Pour
cela, nous avons tout d’abord évalué la présence de zones de nécrose dans notre modèle murin de
ccRCC. A ce jour, seules des études réalisées in vitro ont montré que le FTY720 peut induire la
mort cellulaire par nécrose et nécroptose (Zhang et al. 2010, Saddoughi et al. 2013). Afin de
détecter les zones de nécrose tumorale, nous avons réalisé une coloration à l’hémalun-éosine de
nos coupes tumorales de ccRCC. Nos résultats montrent qu’en comparaison du traitement
contrôle, le FTY720 entraine une augmentation significative de la nécrose tumorale au 5ème jour de
traitement (Figures 18A et 18B). Nous avons ensuite évalué la mort cellulaire par apoptose au
sein des tumeurs. Pour cela, nous avons réalisé un marquage immunohistochimique de la
caspase-3 clivée, cette forme activée de la caspase-3 étant impliquée dans le déclenchement de
l’apoptose. Alors que l’induction de l’expression de la caspase-3 clivée par le FTY720 a
uniquement été montrée dans des modèles tumoraux in vitro (Wang et al. 1999, Nagahara et al.
2000, Pchejetski et al. 2010), nos résultats indiquent que le FTY720 induit une augmentation de
l’expression de la caspase-3 clivée dans notre modèle murin de ccRCC au 5ème jour de traitement,
démontrant une augmentation de l’apoptose à ce jour (Figures 18C et 18D).
Ces données indiquent que le FTY720 favorise la mort des cellules tumorales, qui corrèle dans le
temps avec la diminution du taux intratumoral de HIF-1α et HIF-2α. Ces deux facteurs régulant
l’expression de protéines impliquées dans l’apoptose et la necroptose, telles que BNIP3
(BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3) ou TNFα, la diminution de leur taux
intratumoral pourrait être à l’origine de la diminution de la survie cellulaire induite par le
FTY720.
177!
Figure 17. Effet du FTY720 sur la prolifération des cellules tumorales in vivo. (A) Caractérisation de la prolifération tumorale par marquage des cellules positives pour Ki67 (rouge) et des noyaux (DAPI, bleu) en immunofluorescence. Les images sont représentatives de coupes tumorales de souris traitées pendant 5 jours au FTY720 2,5mg/kg/jour ou au DMSO. Echelle, 200µm. (B) Pourcentage de cellules positives pour Ki67 par zone de 0,75mm2 après 0, 3, 5, 7 ou 9 jour(s) de traitement au FTY720 2,5mg/kg/jour (noir) ou au DMSO (blanc). Colonnes, moyenne de 4 (jour 0) ou 8 (jour 3, 5, 7, 9) souris par groupe. Barres, SEM. *, p<0,05. **, p<0,01. ***, p<0,001.
178!
Figure 18 Effet du FTY720 sur la mort cellulaire in vivo. (A) Détection des zones de nécrose tumorale par coloration à l’hémalun-éosine. Les images sont représentatives de coupes tumorales de souris traitées pendant 5 jours au FTY720 2,5mg/kg/jour ou au DMSO. Echelle, 250µm. (B) Quantification des zones de nécrose tumorale, déterminée par le rapport des aires de nécrose sur l’aire de la coupe tumorale après 0, 3, 5, 7 ou 9 jour(s) de traitement au FTY720 2,5mg/kg/jour (noir) or DMSO (blanc). Colonnes, moyenne de 4 (jour 0) ou 8 (jour 3, 5, 7, 9) souris par groupe. Barres, SEM. *, p<0,05. (C) Détection de la mort cellulaire par apoptose par marquage immunohistochimique de la caspase-3 clivée (brun) et contre-coloration à l’hématoxyline (bleu). Les images sont représentatives de coupes tumorales de souris traitées pendant 5 jours au FTY720 2,5mg/kg/jour ou au DMSO. Echelle, 200µm. (D) Quantification des cellules positives pour la caspase-3 clivée par zone de 0,75mm2 après 0, 3, 5, 7 ou 9 jours de traitement au FTY720 2,5mg/kg/jour (noir) ou DMSO (blanc). Colonnes, moyenne de 2 (jour 0) ou 4 (jour 3, 5, 7, 9) souris par groupe. Barres, SEM. *, p<0,05.
179!
3.4. Le FTY720 chimiosensibilise un modèle murin de ccRCC
De nombreuses études précliniques ont montré qu’une utilisation judicieuse des agents anti-
angiogéniques permet de normaliser le réseau vasculaire tumoral et d’oxygéner la tumeur afin
d’améliorer la délivrance des thérapies anti-cancéreuses (Matsuoka et al. 2003, Tong et al. 2004).
Ainsi, nous avons voulu savoir si la normalisation vasculaire et l’oxygénation tumorale induites
par le FTY720 entre le 5ème et le 7ème jour de traitement, permettent de chimiosensibiliser un
modèle murin de ccRCC établi par xénogreffe hétérotopique d’un fragment tumoral, issu de
cellules CAKI-1, dans des souris nude (Figure 19). Dans ce modèle, nous avons combiné le FTY720
à la gemcitabine, une chimiothérapie largement testée lors d’essais cliniques pour le traitement
des ccRCC qui s’y sont finalement avérés résistants (Lilleby and Fossa 2005). Les souris ont été
réparties en cinq groupes, dont un groupe contrôle (groupe 1), un groupe traité au FTY720 dès J0
(groupe 2) et un groupe traité à la gemcitabine dès J0 (groupe 3). Un autre groupe de souris
(groupe 4) a été traité par le FTY720 et la gemcitabine dès J0, et un dernier (groupe 5) a été traité
par le FTY720 à partir de J0 puis par la gemcitabine à partir de J5 (Figure 19). Dans ce dernier
groupe, la gemcitabine a donc été administrée au moment qui correspond au début de la fenêtre
d’oxygénation induite par le FTY720 dans le précédent protocole. L’efficacité de ces traitements a
été évaluée par mesure du volume tumoral ; leur toxicité et leur tolérance par numération
formule sanguine (NFS) à la fin du protocole et par suivi du poids des animaux.
En accord avec la littérature, nos résultats indiquent que notre modèle murin de ccRCC est
insensible à la gemcitabine (Lilleby and Fossa 2005), et que le FTY720 administré seul tend à
diminuer la croissance tumorale (LaMontagne et al. 2006) (Figures 20A et 20B). De manière
intéressante, nos résultats montrent que le FTY720 associé à la gemcitabine permet de ralentir la
croissance tumorale. En effet, à J14, ce sont les souris traitées à la fois au FTY720 et à la
gemcitabine (groupes 4 et 5) qui présentent les tumeurs de plus petites tailles. A J14, le FTY720, la
gemcitabine, la combinaison « FTY720 et gemcitabine » et la combinaison « FTY720 puis
gemcitabine » entrainent respectivement une diminution du volume tumoral de 30%, 21%, 55% et
52% en comparaison du traitement contrôle. Il existe donc un effet additif entre la gemcitabine et
le FTY720, ce dernier permettant donc de sensibiliser notre modèle murin de ccRCC à la
chimiothérapie.
En revanche, il n’existe pas de différence de volume tumoral entre les souris traitées par la
combinaison « FTY720 et gemcitabine » (groupe 4) et les souris traitées par la combinaison
« FTY720 puis gemcitabine » (groupe 5). Ce résultat ne nous permet pas d’expliquer par quel(s)
mécanisme(s) le FTY720 exerce son effet chimiosensibilisant. Cet effet peut être associé à une
180!
normalisation vasculaire et à une oxygénation tumorale mais peut également être dû à un autre
mécanisme.
Figure 19. Protocole in vivo n°2. Des fragments tumoraux de 2mm3 – issus de tumeurs obtenues par implantation sous-cutanée de 10 millions de cellules CAKI-1 - ont été implantés en sous-cutané dans le flanc droit de souris nude afin de former des xénogreffes hétérotopiques. Quinze jours après implantation, alors que les tumeurs atteignent un volume de 100mm3 environ, les souris sont réparties dans cinq groupes composés chacun de cinq à sept souris. Les animaux sont traités au DMSO ou au PBS à partir de J0 (contrôle, groupe 1, n=6) ; au FTY720 2,5mg/kg/j à partir de J0 (groupe 2, n=6) ; à la gemcitabine 2mg/kg deux fois par semaine à partir de J0 (groupe 3, n=5) ; au FTY720 2,5mg/kg/j et à la gemcitabine 2mg/kg deux fois par semaine à partir de J0 (groupe 4, n=7) ; au FTY720 2,5mg/kg/j à partir de J0 et à la gemcitabine 2mg/kg deux fois par semaine à partir de J5 (groupe 5, n=6). A J13, un prélèvement sanguin est effectué afin de réaliser une numération formule sanguine. Les animaux sont sacrifiés à J14. La tolérance des traitements a été évaluée par le suivi du poids des animaux (Figure 20C). Nos
données indiquent que les souris contrôles et les souris traitées par la gemcitabine seule ont un
poids en augmentation légère et constante entre J0 et J14. A l’inverse, les souris traitées par le
FTY720 seul ou par la combinaison « FTY720 puis gemcitabine » présentent une baisse de poids
significative après sept jours de traitement. En effet, à J7, le poids de ces souris est respectivement
diminué de 7% et 5% par rapport au jour de l’initiation du traitement (J0). Les souris semblent
ensuite s’adapter à ces traitements pour mieux les tolérer puisqu’on observe un gain de poids
entre J7 et J14, où les valeurs de poids des animaux tendent vers celles mesurées à J0. L’ensemble
de ces résultats suggère que les différents traitements administrés aux animaux sont finalement
bien tolérés.
L’analyse de la NFS, réalisée sur des échantillons sanguin des animaux à J13, indique que la
combinaison « FTY720 et gemcitabine » entraine une forte lymphopénie. En effet, à J13, les
animaux traités par cette association présentent environ deux fois moins de lymphocytes
circulants que les animaux contrôles (Figure 21A). Cependant, une étude que nous avons réalisée
à l’aide du même modèle murin de ccRCC indique que la lymphopénie induite par le FTY720 est
181!
réversible après l’arrêt du traitement (Figure 21B). Par ailleurs, les résultats de la NFS indiquent
que les différents traitements administrés ne présentent aucune autre toxicité envers les cellules
sanguines (Figure 21A).
L’ensemble de ces données montre que les deux combinaisons « FTY720 et gembitabine » et
« FTY720 puis gemcitabine » ont une efficacité anti-tumorale similaire, mais ne permettent pas
d’expliquer comment le FTY720 exerce son effet chimiosensibilisant. Parmi ces deux stratégies, la
combinaison « FTY720 puis gemcitabine » est la mieux tolérée.
Figure 20. Effet du FTY720 sur la chimiosensibilité d’un modèle murin de ccRCC. (A, B) Evolution de la croissance tumorale depuis le jour de l’implantation jusqu’à J14 (A) et mesure du volume tumoral à J14 (B) des animaux traités au PBS ou au DMSO (groupe 1), au FTY720 (groupe 2), à la gemcitabine (groupe 3), au FTY720 et à la gemcitabine (groupe 4), ou au FTY720 puis à la gemcitabine (groupe 5). Symboles, colonnes, moyenne de cinq à sept souris par groupe. Barres, SEM. *, p<0,05. (C) Evolution du poids des animaux depuis le jour de l’implantation jusqu’à J14. Les animaux sont traités au PBS ou au DMSO (groupe 1), au FTY720 (groupe 2), à la gemcitabine (groupe 3), au FTY720 et à la gemcitabine (groupe 4), ou au FTY720 puis à la gemcitabine (groupe 5). Symboles, moyenne de cinq à sept souris par groupe. Barres, SEM. *, p<0,05.
182!
Figure 21. Effet des traitements sur la numération formule sanguine. (A) Quantification plasmatique des érythrocytes, de l’hémoglobine, des plaquettes, des leucocytes, des lymphocytes, des monocytes et des granulocytes à J13 chez les animaux traités au PBS ou au DMSO (groupe 1), au FTY720 (groupe 2), à la gemcitabine (groupe 3), au FTY720 et à la gemcitabine (groupe 4), ou au FTY720 puis à la gemcitabine (groupe 5). Colonnes, moyenne de cinq à sept souris par groupe. Barres, SEM. **, p<0,01. Les échantillons sanguins ont été analysés à l’aide de l’appareil ABX Micros 60 Haematology Analyzer. (B) Quantification plasmatique des lymphocytes à J14 et à J28 chez des animaux traités au DMSO ou au FTY720. Colonnes, moyenne de trois souris par groupe. Barres, SEM. *, p<0,05. Les échantillons sanguins ont été analysés à l’aide de l’appareil ABX Micros 60 Haematology Analyzer. !!!!!!!!
183!
Discussion
184!
185!
La voie SphK1/S1P joue un rôle majeur dans la progression tumorale. En effet, elle a notamment
été impliquée dans la prolifération et la survie cellulaire, l’angiogenèse et la résistance
thérapeutique (Maceyka et al. 2012). Les facteurs HIF, quant à eux, ont une importance
particulière dans le développement et la progression des ccRCC, où ils favorisent l’agressivité
tumorale et l’échec thérapeutique, notamment via l’induction d’un réseau vasculaire
structurellement et fonctionnellement anormal qui renforce l’hypoxie intratumorale (Semenza
2012b). Des travaux in vitro de notre équipe ont permis de révéler des interconnexions étroites
entre le métabolisme sphingolipidique et la réponse à l'hypoxie. En effet, notre équipe a mis en
évidence pour la première fois que la SphK1 régule le taux intracellulaire de HIF-1α en hypoxie
dans plusieurs lignées cellulaires tumorales humaines, dont une lignée de ccRCC (Ader et al.
2008). Par la suite, notre équipe a montré que la SphK1 contrôle le taux intracellulaire de HIF-2α
en hypoxie dans des! lignées de ccRCC, de glioblastome et d’adénocarcinomes prostatique et
pulmonaire; ainsi qu’en normoxie dans deux lignées de ccRCC déficientes pour pVHL (Gstalder
et al. 2015).
1. La SphK1, régulateur clé de l’adaptation cellulaire à l’hypoxie
Dans un premier temps, nous nous sommes donc intéressés aux mécanismes moléculaires mis en
jeu dans la régulation de HIF-2α par la SphK1 dans les ccRCC. L’étude des mécanismes en amont
de la SphK1 révèle qu’en hypoxie, l’activation de cette enzyme a lieu selon un mécanisme
dépendant des ROS et de la PLD et confirment leur implication dans la régulation des facteurs
HIF (Ader et al. 2008, Toschi et al. 2008a). Par ailleurs, nos résultats indiquent que la SphK1 régule
non seulement le taux intracellulaire de HIF-2α mais également son activité transcriptionnelle et
l’expression de ses gènes cibles, tels que GLUT-1 et la cycline D1. De plus, la déplétion de la
SphK1 se traduit par une diminution de la prolifération cellulaire. La SphK1 confère donc un
avantage prolifératif aux cellules, ce qui est en accord avec le fait que HIF-2α favorise la survie et
la prolifération des cellules tumorales (Gordan et al. 2007a). Cette diminution de la survie et de la
prolifération cellulaire induite par la déplétion de la SphK1 pourrait s’expliquer par un arrêt du
cycle cellulaire médié par la diminution de l’expression de la cycline D1, par une diminution de
l’activité transcriptionnelle de c-Myc (Gordan et al. 2007a), ou encore par une augmentation de
l’induction de l’apoptose étant donné les propriétés anti-apoptotiques de la SphK1 et pro-
apoptotiques de p53 dont l’expression et l’activité peuvent être régulées par HIF-2α (Bertout et al.
2009, Roberts et al. 2009). D’autre part, nos résultats mettent en évidence que la régulation de HIF-
1α et HIF-2α par la SphK1 passe par deux mécanismes distincts. En effet, cette enzyme régule la
186!
stabilité de HIF-1α via un mécanisme dépendant de la voie Akt/GSK3β et de pVHL (Ader et al.
2008), et contrôle la synthèse de HIF-2α via un mécanisme impliquant la voie Akt/mTOR et les
protéines p70S6K et 4EBP1 (Gstalder et al. 2015) (Figure 22). Nos résultats indiquent également
que la SphK1 régule HIF-2α dans des lignées cellulaires de ccRCC indépendamment de leur
statut pVHL. Associés aux précédents résultats de l’équipe (Ader et al. 2008), ces travaux
permettent d’établir que la SphK1 constitue un régulateur clé de l’adaptation cellulaire à
l’hypoxie. Ainsi, la SphK1, qui régule HIF-1α et HIF-2α selon deux mécanismes distincts, devient
une cible thérapeutique de choix pour le contrôle de l’adaptation à l’hypoxie intratumorale. Cette
stratégie pourrait s’avérer pertinente pour le traitement des ccRCC, ciblés indépendamment de
leur statut d’expression de pVHL et de HIF-1α, ainsi que pour le traitement d’autres cancers dans
lesquels les facteurs HIF jouent un rôle important.
Figure 22. Mécanismes de régulation de HIF-1α et HIF-2α par la voie SphK1/S1P. En hypoxie, la SphK1 est activée via un mécanisme dépendant des ROS et de la PLD. La SphK1 régule la stabilité de HIF-1α via un mécanisme dépendant de la voie Akt/GSK3β et de pVHL dans les lignées PC3 et U87 en hypoxie. Elle régule également la synthèse de HIF-2α via un mécanisme impliquant la voie Akt/mTOR et les protéines p70S6K et 4EBP1 en normoxie et en hypoxie dans deux lignées de ccRCC déficientes pour pVHL, les lignées A498 et 786-O. Le S1P1 a quant à lui été impliqué dans la régulation du taux intracellulaire de HIF-1α et HIF-2α dans la lignée A498 en normoxie et dans les lignées CAKI-1, PC3 et U87 en hypoxie. Les mécanismes mis en jeu dans ce processus restent à élucider.
187!
2. Rôle de la S1P et du S1P1 dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α
La suite de notre étude a permis d’impliquer la S1P extracellulaire dans la régulation de HIF-1α et
HIF-2α. En effet, nos résultats indiquent que l’inhibition de l’export de la S1P ainsi que la
neutralisation de la S1P extracellulaire entrainent une forte diminution du taux intracellulaire de
HIF-1α et HIF-2α dans différents modèles cellulaires (Ader et al. 2015, Gstalder et al. 2015). La S1P
extracellulaire exerçant son action via les récepteurs S1P1-5, nous avons mis en évidence
l’expression de ces cinq récepteurs dans les lignées CAKI-1, A498, PC3 et U87. Nous avons
ensuite montré que le FTY720, un antagoniste des récepteurs S1P1-3-4-5, entraine une forte
diminution du taux intracellulaire de HIF-1α et HIF-2α dans les lignées CAKI-1, A498 et PC3. Ce
résultat est corrélé à une diminution de l’expression du S1P1, au niveau duquel le mécanisme
d’action du FTY720 a principalement été décrit (Oo et al. 2007). Afin de déterminer si l’inhibition
de HIF-1α et HIF-2α est la conséquence de la diminution de l’expression du S1P1, nous avons
inhibé l’expression de ce récepteur par l’utilisation d’un antagoniste spécifique ou de différentes
stratégies d’interférence à l’ARN. Nos résultats indiquent que l’inhibition du S1P1 entraine une
forte diminution du taux intracellulaire de HIF-1α et HIF-2α, impliquant ainsi ce récepteur dans
le contrôle des facteurs HIF.
Nos résultats préliminaires suggèrent que le S1P1 régule également l’expression de la cycline D1,
un gène cible de HIF-2, et favorise la prolifération cellulaire dans nos modèles. Les propriétés
pro-prolifératives du S1P1 pourraient ainsi s’expliquer par son rôle dans la régulation de
l’expression de HIF-2α et donc de la cycline D1. L’implication du S1P1 dans la régulation de
l’activité transcriptionnelle des facteurs HIF doit cependant être confirmée par l’étude de l’effet
de la déplétion du S1P1 sur l’expression d’autres gènes cibles de HIF.
Nos travaux ne fournissent pas d’information quant aux voies de signalisation activées en aval du
S1P1 qui seraient impliquées dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α. Sachant que la voie
PI3K/Akt peut être activée en aval du S1P1, ce dernier étant couplé à Gi, et que nous avons
montré que la SphK1 régule la phosphorylation d’Akt, il serait intéressant de déterminer si dans
nos modèles cellulaires, le S1P1 contrôle le taux intracellulaire de HIF-1α et HIF-2α via la voie
PI3K/Akt. Plus particulièrement, nous pourrions déterminer si le S1P1 régule d’une part la
stabilisation de HIF-1α via la voie PI3K/Akt/GSK3β, qui a déjà été impliquée dans la régulation
de ce facteur (Mottet et al. 2003a, Ader et al. 2008) ; et d’autre part la synthèse de HIF-2α via la
voie Akt/mTOR et les protéines p70S6K et 4E-BP1 (Figure 22). En effet, la S1P a déjà été
impliquée dans la régulation de mTOR, p70S6K et 4E-BP1 (Maeurer et al. 2009). De plus, une
étude a montré que la S1P extracellulaire régule le développement et la fonction des lymphocytes
188!
T régulateurs via le S1P1 et la voie mTOR (Liu et al. 2009). La voie de la PLC et des MAPK
pouvant également être activées en aval du S1P1, il serait intéressant de déterminer si ce récepteur
régule les facteurs HIF via l’activation de ERK. En effet, une étude a montré que le calcium agit en
amont de ERK afin de réguler positivement l’activité transcriptionnelle de HIF-1 (Mottet et al.
2003b).
3. Rôle des autres S1PRs dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α
Dans nos modèles cellulaires, nous avons mis en évidence le rôle du S1P1 dans la régulation de
HIF-1α et HIF-2α. Or nous avons également montré que nos lignées expriment les cinq S1PRs.
Par conséquent, il serait intéressant d’évaluer l’implication des récepteurs S1P2-3-4-5 dans la
régulation de HIF-1α et HIF-2α. L’ensemble de ces récepteurs étant couplés à Gi, leur éventuelle
implication dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α pourrait passer par l’activation des voies
PI3K/Akt/mTOR et MAPK.
Une étude a montré que la S1P, via le S1P3, régule positivement le taux intracellulaire de HIF-1α
dans des cellules de carcinome folliculaire de la thyroïde (Kalhori et al. 2013). Ces expériences
ayant été effectuées en normoxie, il apparaît que la S1P puisse constituer une alternative à
l’hypoxie pour induire l’expression de HIF-1α. L’expression des facteurs HIF en normoxie
constitue en effet un avantage sélectif pour les cellules tumorales (Cao et al. 2013, Lee et al. 2015b).
Ces données renforcent donc la pertinence du ciblage de la voie SphK1/S1P en cancérologie,
puisque cette stratégie thérapeutique permettrait d’inhiber HIF-1α et HIF-2α à la fois en
normoxie et en hypoxie et donc de cibler l’ensemble des cellules tumorales.
4. Le FTY720, inducteur d’une normalisation vasculaire transitoire
L’hypoxie intratumorale favorise l’agressivité tumorale et l’échec thérapeutique. C’est
notamment le cas dans les ccRCC, connus pour être résistants à la chimiothérapie. Dans ces
tumeurs, comme dans la majorité des cancers, la SphK1 est surexprimée par rapport au tissu sain
(French et al. 2003). Ceci aboutit à une production accrue de S1P, qui favorise, entre autres,
l’angiogenèse et la chimiorésistance (Chae et al. 2004, Maceyka et al. 2012, Giussani et al. 2014).
Après avoir montré que la voie SphK1/S1P constitue un régulateur clé de HIF-1α et HIF-2α dans
différents modèles tumoraux dont les ccRCC (Ader et al. 2008, Ader et al. 2015, Gstalder et al.
2015), et au vu de l’importance de ces facteurs dans le développement et la progression de ces
tumeurs (Kondo et al. 2003, Fu et al. 2011), nous avons voulu évaluer in vivo l’impact de
189!
l’inhibition de la voie SphK1/S1P sur l’hypoxie intratumorale, l’angiogenèse et la
chimiosensibilité d’un modèle murin de ccRCC. Nos résultats in vitro indiquant que le FTY720
entraine une forte diminution de l’activité enzymatique de la SphK1, du taux intracellulaire du
S1P1, de HIF-1α et HIF-2α, nous avons choisi d’utiliser ce composé pour inhiber la voie
SphK1/S1P dans notre modèle murin de ccRCC. De plus, le FTY720 étant déjà utilisé en clinique
humaine, il constitue un outil thérapeutique de choix pour notre étude. Par ailleurs, l’hypoxie
intratumorale et l’expression de HIF-1α et HIF-2α étant des phénomènes dynamiques qui
fluctuent dans le temps, nous avons caractérisé l’effet de l’inhibition de la voie SphK1/S1P en
fonction du temps.
De manière cohérente avec les résultats obtenus précédemment dans l’équipe (Ader et al. 2015),
nos résultats indiquent que l’inhibition de la voie SphK1/S1P par le FTY720 induit une
diminution forte et transitoire du taux intratumoral de HIF-1α et HIF-2α, qui est associée à une
légère diminution de la sécrétion tumorale de VEGF, un gène cible de HIF. Nous montrons
également que le FTY720 entraine un remodelage vasculaire, qui corrèle dans le temps avec la
diminution du taux intratumoral de HIF-1α et HIF-2α et de la sécrétion tumorale de VEGF. En
effet, le FTY720 entraine une diminution de la densité vasculaire, ce qui confirme ses propriétés
anti-angiogéniques déjà décrites dans la littérature (LaMontagne et al. 2006), et induit des
modifications morphologiques au niveau de la structure des vaisseaux sanguins tumoraux. Nous
démontrons ainsi que le FTY720 entraine une augmentation transitoire du recouvrement
péricytaire. Ceci suggère que le FTY720 permet d’augmenter transitoirement la proportion de
vaisseaux sanguins tumoraux matures, et donc potentiellement fonctionnels. Nos résultats
suggèrent donc pour la première fois que le FTY720 induit une normalisation vasculaire
transitoire. En parallèle, nous montrons que le FTY720 favorise transitoirement l’oxygénation
tumorale. Sachant qu’au sein des tumeurs, il existe un cercle vicieux entre l’activation des facteurs
HIF, l’angiogenèse tumorale et l’hypoxie intratumorale, on peut légitimement émettre
l’hypothèse que dans notre modèle, la diminution du taux intratumoral de HIF-1α et HIF-2α
induite par le FTY720 est à l’origine d’une normalisation vasculaire qui permet d’oxygéner la
tumeur.
Alors que notre étude décrit un phénomène de normalisation vasculaire induit par le FTY720
dans un modèle murin de ccRCC, il serait intéressant de déterminer par quels mécanismes a lieu
ce processus. Nos résultats indiquent que le FTY720 diminue la densité vasculaire et augmente le
recouvrement péricytaire. Ceci peut s’expliquer de plusieurs manières différentes. Une première
hypothèse serait que le FTY720 élimine en première intention les vaisseaux immatures et donc
190!
dépourvus de péricytes, à l’image des anti-angiogéniques dirigés contre les récepteurs du VEGF
(Potente et al. 2011), pour épargner préférentiellement les vaisseaux sanguins matures. Le FTY720
pourrait également induire le recrutement des péricytes au niveau des vaisseaux sanguins, via
l’axe PDGFβ/PDGFRβ. Une troisième hypothèse serait que le FTY720 empêche le détachement
péricytaire induit par le VEGF au niveau des vaisseaux sanguins en formation. En effet, des
études ont montré que le FTY720 inhibe la perméabilité vasculaire et l’angiogenèse induites par le
VEGF (Sanchez et al. 2003, LaMontagne et al. 2006), et que dans un contexte d’angiogenèse médiée
par le PDGF, le VEGF favorise le retrait des péricytes au niveau des vaisseaux sanguins
émergents, ce qui aboutit à leur déstabilisation (Greenberg et al. 2008).
La S1P, aux propriétés pro-angiogéniques, a été décrite pour son rôle dans le maintien de
l’intégrité vasculaire, via son interaction avec le récepteur S1P1. En effet, des études ont montré
que l’axe S1P/S1P1 favorise la maturation vasculaire ainsi que la formation de jonctions
adhérentes, médiées par la VE-cadhérine, entre les cellules endothéliales (Allende et al. 2003,
Gaengel et al. 2012). Dans le même sens, une étude a montré que la dégradation du S1P1 in vivo
entraine une augmentation de la perméabilité vasculaire (Oo et al. 2011). Nos résultats, qui
indiquent que le FTY720 entraine une normalisation vasculaire, peuvent ainsi paraître
contradictoires avec les données de la littérature. Ils s’expliquent néanmoins par le fait que dans
notre étude, la normalisation vasculaire est observée lorsque le FTY720 est utilisé à faible dose –
2,5mg/kg/j – et pendant un temps court – 5 à 7 jours. Il semblerait en effet qu’au 9ème jour de
traitement, le FTY720 exerce son effet anti-angiogénique sans favoriser le recouvrement
péricytaire. Ainsi, lors d’une utilisation prolongée, le FTY720, à l’image des autres anti-
angiogéniques, ne normalise plus le réseau vasculaire tumoral mais se contente de le détruire,
ceci étant cohérant avec le concept de normalisation vasculaire (Jain 2005), ainsi qu’avec les
données de la littérature établissant le rôle de la S1P dans l’intégrité et la maturation vasculaire.
De plus, de part sa capacité à inhiber la SphK1, le FTY720 entraine une diminution de la
production de S1P. Celle-ci pouvant transactiver le récepteur VEGFR2 (Spiegel and Milstien
2003), il est possible que la normalisation vasculaire induite par le FTY720 dans notre modèle soit
due à l’inhibition de la signalisation induite par le VEGFR2.
5. Le FTY720 permet de chimiosensibiliser un modèle murin de ccRCC
La normalisation vasculaire et l’oxygénation tumorale qui en découle étant connues pour
améliorer la réponse à la chimiothérapie (Jain 2014), nous avons voulu vérifier cette hypothèse
dans notre modèle. Nous avons donc évalué dans quelle mesure la normalisation vasculaire et
l’oxygénation tumorale transitoires induites par le FTY720 permettent de sensibiliser un modèle
191!
murin de ccRCC à la gemcitabine. Nos résultats indiquent que le FTY720 a bien un effet
chimiosensibilisant dans notre modèle, mais ne permettent pas d’expliquer par quel(s)
mécanismes le FTY720 exerce cet effet. Alors que nos données indiquent que le FTY720 induit une
normalisation vasculaire après 5 à 7 jours de traitement, nous pouvons émettre l’hypothèse que le
FTY720 associé à la gemcitabine pourrait induire une normalisation vasculaire après 14 jours de
traitement. Il serait donc intéressant de caractériser l’angiogenèse tumorale après 14 jours de
traitement afin de confirmer ou non cette hypothèse et de déterminer si l’effet chimiosensibilisant
du FTY720 est dû ou non à un phénomène de normalisation vasculaire.
L’effet chimiosensibilisant du FTY720 pourrait également s’expliquer par des mécanismes
distincts de la normalisation vasculaire. Plusieurs études ont déjà montré le rôle de la SphK1 dans
la chimiorésistance de différents modèles de cancer (Bonhoure et al. 2006, Pchejetski et al. 2008,
Datta et al. 2014). Dans notre modèle, une hypothèse expliquant l’effet chimiosensibilisant du
FTY720 serait que ce composé, via l’inhibition de l’expression de HIF-1α, entraine une diminution
de l’expression de la glycoprotéine P, ou MDR-1 (Multidrug resistance protein 1), à la surface des
cellules tumorales, pour les rendre sensibles à la gemcitabine. En effet, une étude a montré que
HIF-1α régule positivement l’expression de la glycoprotéine P, un transporteur de la membrane
plasmique capable d’exporter hors de la cellule des agents chimiothérapeutiques, tels que la
gemcitabine (Chen et al. 2014). De plus, une étude in vitro a montré que le FTY720 diminue
l’expression de la glycoprotéine P permettant ainsi de sensibiliser des cellules de cancer du colon
à la doxorubicine et à l’étoposide (Xing et al. 2014). Afin de compléter notre étude, il donc serait
intéressant de valider in vitro le concept selon lequel le FTY720 permet de sensibiliser les cellules
CAKI-1 à la gemcitabine, afin d’étudier par la suite l’implication de la glycoprotéine P dans cette
chimiosensibilisation. Une autre hypothèse permettant d’expliquer la chimiosensibilisation
induite par le FTY720 dans notre modèle serait que ce traitement, via l’inhibition de l’expression
de HIF-2α, restaure l’expression de p53. En effet, une étude in vitro réalisée dans des cellules de
ccRCC a montré que l’accumulation de HIF-2α entraine une perte d’expression de p53 médiée
par Hdm2 (Roberts et al. 2009). Dans cette même étude, la déplétion de HIF-2α par une stratégie
d’interférence à l’ARN restaure l’expression de p53 et réverse ainsi la résistance de ces cellules de
ccRCC à la doxorubicine et à l’étoposide. Il serait donc intéressant de caractériser l’expression de
p53 et des facteurs HIF dans notre modèle.
Par ailleurs, nous devons garder à l’esprit que le modèle murin de ccRCC nous ayant permis
d’établir que le FTY720 induit une normalisation vasculaire est différent de celui utilisé pour
étudier l’effet chimiosensibilisant du FTY720. En effet, le premier modèle a été établi par injection
d’une suspension cellulaire dans le flanc d’une souris nude (protocole n°1), et le second par
implantation d’un fragment tumoral (protocole n°2), issu lui-même d’une tumeur obtenue par
192!
injection d’une suspension cellulaire. Bien que les animaux des deux protocoles présentent un
volume tumoral moyen d’environ 100mm3 à J0 (Figures 13 et 19), la croissance tumorale s’est
ensuite avérée plus rapide chez les animaux du protocole n°2, implantés par des fragments
tumoraux. Il est donc probable que les tumeurs issues d’une suspension cellulaire et celles issues
d’un fragment tumoral présentent également des réseaux vasculaires différents. Alors qu’une
normalisation vasculaire a été observée après 5 et 7 jours de traitement au FTY720 lors du
protocole n°1, il est possible qu’elle soit décalée dans le temps pour le protocole n°2.
6. Evaluation de l’effet du FTY720 dans d’autres modèles de ccRCC
Une étude réalisée dans un modèle murin de cancer du sein a montré que le FTY720 permet de
prévenir l’apparition de métastases et de prolonger ainsi la survie des animaux (Azuma et al.
2002). Une autre, réalisée dans un modèle murin de cancer de la prostate, a montré que le
FTY720, administré en association avec une radiothérapie, permet de diminuer la dissémination
métastatique (Pchejetski et al. 2010). Un challenge actuel dans la prise en charge des ccRCC étant
la mise au point de stratégies thérapeutiques ciblant les formes métastatiques, la suite de notre
projet de recherche pourrait permettre d’étudier l’impact d’un traitement au FTY720, seul et en
association avec la gemcitabine, dans un modèle murin de métastases spontanées. Pour cela, des
cellules CAKI-1 exprimant la luciférase de manière stable seront injectées en intraveineux chez
des souris nude. L’efficacité des différents traitements pourra ensuite être évaluée par
dénombrement des métastases, par mesure de leur volume, ainsi que par l’impact des traitements
sur la survie des animaux.
Nos travaux pourraient également être complétés par l’étude de l’inhibition de la voie
SphK1/S1P dans un modèle murin de ccRCC établi à partir de cellules A498, une lignée
déficiente pour pVHL et qui n’exprime pas HIF-1α. Ceci nous permettrait notamment d’évaluer
l’impact de l’absence de ces deux protéines sur la réponse au FTY720, et d’étendre notre étude à
un deuxième sous-groupe de ccRCC retrouvé en clinique humaine.
7. Conclusion générale
Ces travaux démontrent pour la première fois le rôle clé de la SphK1 dans la régulation de HIF-
2α dans des lignées de ccRCC, indépendamment de leur statut pVHL. Ils mettent également en
évidence le rôle du récepteur S1P1 dans la régulation de HIF-1α et HIF-2α dans plusieurs lignées
193!
tumorales humaines. Associés aux précédents résultats de l’équipe, ces résultats in vitro
impliquent la voie SphK1/S1P/S1P1 dans la réponse à l’hypoxie via la régulation de HIF-1α et
HIF-2α dans plusieurs modèles tumoraux, dont les ccRCC. Ils valident ainsi le rôle crucial de
cette voie comme senseur de l’hypoxie intratumorale et régulateur clé de l’adaptation cellulaire à
l’hypoxie.
Par ailleurs, l’étude de l’inhibition de la voie SphK1/S1P par le FTY720 dans un modèle murin de
ccRCC révèle que ce composé entraine une diminution transitoire du taux intratumoral de HIF-
1α et HIF-2α et de la sécrétion tumorale de VEGF, associées à un remodelage du réseau
vasculaire tumoral. Le FTY720 entraine en effet une normalisation vasculaire ainsi qu’une
oxygénation tumorale transitoire, et permet de sensibiliser un modèle murin de ccRCC à la
gemcitabine. Nos travaux précliniques valident ainsi la pertinence de l’utilisation du FTY720 en
association avec la gemcitabine pour le traitement des ccRCC, et constituent une étape
indispensable à la transposition en clinique du concept selon lequel la voie SphK1/S1P peut être
ciblée dans les ccRCC afin d’y augmenter l’efficacité des chimiothérapies, le FTY720 étant bien
toléré et déjà sur le marché.
Finalement, le ciblage de la voie SphK1/S1P est une stratégie qui pourrait notamment constituer
une alternative pertinente pour le traitement des ccRCC résistants à d’autres thérapies ciblées. En
effet, une étude effectuée dans un modèle murin de ccRCC a montré que la neutralisation de la
S1P extracellulaire par le Sphingomab® ralentit considérablement la croissance de tumeurs
résistantes au sunitinib (Zhang et al. 2015). Par ailleurs, le sonepcizumab (Asonep®), la forme
humanisée du Sphingomab®, fait actuellement l’objet d’une étude clinique de phase II dans le
traitement des ccRCC inopérables et réfractaires à plusieurs traitements incluant les stratégies
anti-VEGF/VEGFR, les inhibiteurs de mTOR et l’interleukine 2 (NCT01762033).
!!!!!!!!!!!!!!!!!!
194!
195!
Références
Bibliographiques
196!
Ader, I., Brizuela, L., Bouquerel, P., Malavaud, B. and Cuvillier, O. (2008). "Sphingosine kinase 1: a new modulator of hypoxia inducible factor 1alpha during hypoxia in human cancer cells." Cancer Res 68(20): 8635-8642.
Ader, I., Delmas, C., Skuli, N., Bonnet, J., Schaeffer, P., Bono, F., Cohen-Jonathan-Moyal, E. and Toulas, C. (2014). "Preclinical evidence that SSR128129E--a novel small-molecule multi-fibroblast growth factor receptor blocker--radiosensitises human glioblastoma." Eur J Cancer 50(13): 2351-2359.
Ader, I., Gstalder, C., Bouquerel, P., Golzio, M., Andrieu, G., Zalvidea, S., Richard, S., Sabbadini, R. A., Malavaud, B. and Cuvillier, O. (2015). "Neutralizing S1P inhibits intratumoral hypoxia, induces vascular remodelling and sensitizes to chemotherapy in prostate cancer." Oncotarget, In Press.
Ahmad, M., Long, J. S., Pyne, N. J. and Pyne, S. (2006). "The effect of hypoxia on lipid phosphate receptor and sphingosine kinase expression and mitogen-activated protein kinase signaling in human pulmonary smooth muscle cells." Prostaglandins Other Lipid Mediat 79(3-4): 278-286.
Albert, R., Hinterding, K., Brinkmann, V., Guerini, D., Muller-Hartwieg, C., Knecht, H., Simeon, C., Streiff, M., Wagner, T., Welzenbach, K., Zecri, F., Zollinger, M., Cooke, N. and Francotte, E. (2005). "Novel immunomodulator FTY720 is phosphorylated in rats and humans to form a single stereoisomer. Identification, chemical proof, and biological characterization of the biologically active species and its enantiomer." J Med Chem 48(16): 5373-5377.
Allende, M. L., Bektas, M., Lee, B. G., Bonifacino, E., Kang, J., Tuymetova, G., Chen, W., Saba, J. D. and Proia, R. L. (2011). "Sphingosine-1-phosphate lyase deficiency produces a pro-inflammatory response while impairing neutrophil trafficking." J Biol Chem 286(9): 7348-7358.
Allende, M. L., Dreier, J. L., Mandala, S. and Proia, R. L. (2004a). "Expression of the sphingosine 1-phosphate receptor, S1P1, on T-cells controls thymic emigration." J Biol Chem 279(15): 15396-15401.
Allende, M. L., Sasaki, T., Kawai, H., Olivera, A., Mi, Y., van Echten-Deckert, G., Hajdu, R., Rosenbach, M., Keohane, C. A., Mandala, S., Spiegel, S. and Proia, R. L. (2004b). "Mice deficient in sphingosine kinase 1 are rendered lymphopenic by FTY720." J Biol Chem 279(50): 52487-52492.
Allende, M. L., Tuymetova, G., Lee, B. G., Bonifacino, E., Wu, Y. P. and Proia, R. L. (2010). "S1P1 receptor directs the release of immature B cells from bone marrow into blood." J Exp Med 207(5): 1113-1124.
Allende, M. L., Yamashita, T. and Proia, R. L. (2003). "G-protein-coupled receptor S1P1 acts within endothelial cells to regulate vascular maturation." Blood 102(10): 3665-3667.
Alvarez, S. E., Harikumar, K. B., Hait, N. C., Allegood, J., Strub, G. M., Kim, E. Y., Maceyka, M., Jiang, H., Luo, C., Kordula, T., Milstien, S. and Spiegel, S. (2010). "Sphingosine-1-phosphate is a missing cofactor for the E3 ubiquitin ligase TRAF2." Nature 465(7301): 1084-1088.
An, S., Zheng, Y. and Bleu, T. (2000). "Sphingosine 1-phosphate-induced cell proliferation, survival, and related signaling events mediated by G protein-coupled receptors Edg3 and Edg5." J Biol Chem 275(1): 288-296.
An, W. G., Kanekal, M., Simon, M. C., Maltepe, E., Blagosklonny, M. V. and Neckers, L. M. (1998). "Stabilization of wild-type p53 by hypoxia-inducible factor 1alpha." Nature 392(6674): 405-408.
Ancellin, N., Colmont, C., Su, J., Li, Q., Mittereder, N., Chae, S. S., Stefansson, S., Liau, G. and Hla, T. (2002). "Extracellular export of sphingosine kinase-1 enzyme. Sphingosine 1-phosphate generation and the induction of angiogenic vascular maturation." J Biol Chem 277(8): 6667-6675.
Ancellin, N. and Hla, T. (1999). "Differential pharmacological properties and signal transduction of the sphingosine 1-phosphate receptors EDG-1, EDG-3, and EDG-5." J Biol Chem 274(27): 18997-19002.
197!
Anelli, V., Gault, C. R., Cheng, A. B. and Obeid, L. M. (2008). "Sphingosine kinase 1 is up-regulated during hypoxia in U87MG glioma cells. Role of hypoxia-inducible factors 1 and 2." J Biol Chem 283(6): 3365-3375.
Appelhoff, R. J., Tian, Y. M., Raval, R. R., Turley, H., Harris, A. L., Pugh, C. W., Ratcliffe, P. J. and Gleadle, J. M. (2004). "Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor." J Biol Chem 279(37): 38458-38465.
Arya, M., Ahmed, H., Silhi, N., Williamson, M. and Patel, H. R. (2007). "Clinical importance and therapeutic implications of the pivotal CXCL12-CXCR4 (chemokine ligand-receptor) interaction in cancer cell migration." Tumour Biol 28(3): 123-131.
Atkins, M. B. R., A.; Gravis, G. (2012). "Safety and efficacy of AMG 386 in combination with sunitinib in patients with metastatic renal cell carcinoma (mRCC) in an open-label multicenter phase II study." J Clin Oncol 30 (suppl; abstr 4606).
Auge, N., Nikolova-Karakashian, M., Carpentier, S., Parthasarathy, S., Negre-Salvayre, A., Salvayre, R., Merrill, A. H., Jr. and Levade, T. (1999). "Role of sphingosine 1-phosphate in the mitogenesis induced by oxidized low density lipoprotein in smooth muscle cells via activation of sphingomyelinase, ceramidase, and sphingosine kinase." J Biol Chem 274(31): 21533-21538.
Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G. and Alitalo, K. (2009). "Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system." Nat Rev Mol Cell Biol 10(3): 165-177.
Axelson, H., Fredlund, E., Ovenberger, M., Landberg, G. and Pahlman, S. (2005). "Hypoxia-induced dedifferentiation of tumor cells--a mechanism behind heterogeneity and aggressiveness of solid tumors." Semin Cell Dev Biol 16(4-5): 554-563.
Azuma, H., Horie, S., Muto, S., Otsuki, Y., Matsumoto, K., Morimoto, J., Gotoh, R., Okuyama, A., Suzuki, S., Katsuoka, Y. and Takahara, S. (2003a). "Selective cancer cell apoptosis induced by FTY720; evidence for a Bcl-dependent pathway and impairment in ERK activity." Anticancer Res 23(4): 3183-3193.
Azuma, H., Takahara, S., Horie, S., Muto, S., Otsuki, Y. and Katsuoka, Y. (2003b). "Induction of apoptosis in human bladder cancer cells in vitro and in vivo caused by FTY720 treatment." J Urol 169(6): 2372-2377.
Azuma, H., Takahara, S., Ichimaru, N., Wang, J. D., Itoh, Y., Otsuki, Y., Morimoto, J., Fukui, R., Hoshiga, M., Ishihara, T., Nonomura, N., Suzuki, S., Okuyama, A. and Katsuoka, Y. (2002). "Marked prevention of tumor growth and metastasis by a novel immunosuppressive agent, FTY720, in mouse breast cancer models." Cancer Res 62(5): 1410-1419.
Bae, S. H., Jeong, J. W., Park, J. A., Kim, S. H., Bae, M. K., Choi, S. J. and Kim, K. W. (2004). "Sumoylation increases HIF-1alpha stability and its transcriptional activity." Biochem Biophys Res Commun 324(1): 394-400.
Bagdanoff, J. T., Donoviel, M. S., Nouraldeen, A., Carlsen, M., Jessop, T. C., Tarver, J., Aleem, S., Dong, L., Zhang, H., Boteju, L., Hazelwood, J., Yan, J., Bednarz, M., Layek, S., Owusu, I. B., Gopinathan, S., Moran, L., Lai, Z., Kramer, J., Kimball, S. D., Yalamanchili, P., Heydorn, W. E., Frazier, K. S., Brooks, B., Brown, P., Wilson, A., Sonnenburg, W. K., Main, A., Carson, K. G., Oravecz, T. and Augeri, D. J. (2010). "Inhibition of sphingosine 1-phosphate lyase for the treatment of rheumatoid arthritis: discovery of (E)-1-(4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetrahydroxybutyl)-1H-imidazol-2-yl)ethanone oxime (LX2931) and (1R,2S,3R)-1-(2-(isoxazol-3-yl)-1H-imidazol-4-yl)butane-1,2,3,4-tetraol (LX2932)." J Med Chem 53(24): 8650-8662.
Bakker, W. J., Harris, I. S. and Mak, T. W. (2007). "FOXO3a is activated in response to hypoxic stress and inhibits HIF1-induced apoptosis via regulation of CITED2." Mol Cell 28(6): 941-953.
Baldewijns, M. M., van Vlodrop, I. J., Vermeulen, P. B., Soetekouw, P. M., van Engeland, M. and de Bruine, A. P. (2010). "VHL and HIF signalling in renal cell carcinogenesis." J Pathol 221(2): 125-138.
198!
Bandhuvula, P., Tam, Y. Y., Oskouian, B. and Saba, J. D. (2005). "The immune modulator FTY720 inhibits sphingosine-1-phosphate lyase activity." J Biol Chem 280(40): 33697-33700.
Bangoura, G., Liu, Z. S., Qian, Q., Jiang, C. Q., Yang, G. F. and Jing, S. (2007). "Prognostic significance of HIF-2alpha/EPAS1 expression in hepatocellular carcinoma." World J Gastroenterol 13(23): 3176-3182.
Bankovich, A. J., Shiow, L. R. and Cyster, J. G. (2010). "CD69 suppresses sphingosine 1-phosophate receptor-1 (S1P1) function through interaction with membrane helix 4." J Biol Chem 285(29): 22328-22337.
Baran, Y., Salas, A., Senkal, C. E., Gunduz, U., Bielawski, J., Obeid, L. M. and Ogretmen, B. (2007). "Alterations of ceramide/sphingosine 1-phosphate rheostat involved in the regulation of resistance to imatinib-induced apoptosis in K562 human chronic myeloid leukemia cells." J Biol Chem 282(15): 10922-10934.
Barr, R. K., Lynn, H. E., Moretti, P. A., Khew-Goodall, Y. and Pitson, S. M. (2008). "Deactivation of sphingosine kinase 1 by protein phosphatase 2A." J Biol Chem 283(50): 34994-35002.
Baselga, J., Campone, M., Piccart, M., Burris, H. A., 3rd, Rugo, H. S., Sahmoud, T., Noguchi, S., Gnant, M., Pritchard, K. I., Lebrun, F., Beck, J. T., Ito, Y., Yardley, D., Deleu, I., Perez, A., Bachelot, T., Vittori, L., Xu, Z., Mukhopadhyay, P., Lebwohl, D. and Hortobagyi, G. N. (2012). "Everolimus in postmenopausal hormone-receptor-positive advanced breast cancer." N Engl J Med 366(6): 520-529.
Batchelor, T. T., Gerstner, E. R., Emblem, K. E., Duda, D. G., Kalpathy-Cramer, J., Snuderl, M., Ancukiewicz, M., Polaskova, P., Pinho, M. C., Jennings, D., Plotkin, S. R., Chi, A. S., Eichler, A. F., Dietrich, J., Hochberg, F. H., Lu-Emerson, C., Iafrate, A. J., Ivy, S. P., Rosen, B. R., Loeffler, J. S., Wen, P. Y., Sorensen, A. G. and Jain, R. K. (2013). "Improved tumor oxygenation and survival in glioblastoma patients who show increased blood perfusion after cediranib and chemoradiation." Proc Natl Acad Sci U S A 110(47): 19059-19064.
Batchelor, T. T., Sorensen, A. G., di Tomaso, E., Zhang, W. T., Duda, D. G., Cohen, K. S., Kozak, K. R., Cahill, D. P., Chen, P. J., Zhu, M., Ancukiewicz, M., Mrugala, M. M., Plotkin, S., Drappatz, J., Louis, D. N., Ivy, P., Scadden, D. T., Benner, T., Loeffler, J. S., Wen, P. Y. and Jain, R. K. (2007). "AZD2171, a pan-VEGF receptor tyrosine kinase inhibitor, normalizes tumor vasculature and alleviates edema in glioblastoma patients." Cancer Cell 11(1): 83-95.
Befani, C. D., Vlachostergios, P. J., Hatzidaki, E., Patrikidou, A., Bonanou, S., Simos, G., Papandreou, C. N. and Liakos, P. (2012). "Bortezomib represses HIF-1alpha protein expression and nuclear accumulation by inhibiting both PI3K/Akt/TOR and MAPK pathways in prostate cancer cells." J Mol Med (Berl) 90(1): 45-54.
Bektas, M., Allende, M. L., Lee, B. G., Chen, W., Amar, M. J., Remaley, A. T., Saba, J. D. and Proia, R. L. (2010). "Sphingosine 1-phosphate lyase deficiency disrupts lipid homeostasis in liver." J Biol Chem 285(14): 10880-10889.
Beljanski, V., Knaak, C. and Smith, C. D. (2010). "A novel sphingosine kinase inhibitor induces autophagy in tumor cells." J Pharmacol Exp Ther 333(2): 454-464.
Bernhardt, W. M., Gottmann, U., Doyon, F., Buchholz, B., Campean, V., Schodel, J., Reisenbuechler, A., Klaus, S., Arend, M., Flippin, L., Willam, C., Wiesener, M. S., Yard, B., Warnecke, C. and Eckardt, K. U. (2009). "Donor treatment with a PHD-inhibitor activating HIFs prevents graft injury and prolongs survival in an allogenic kidney transplant model." Proc Natl Acad Sci U S A 106(50): 21276-21281.
Berra, E., Benizri, E., Ginouves, A., Volmat, V., Roux, D. and Pouyssegur, J. (2003). "HIF prolyl-hydroxylase 2 is the key oxygen sensor setting low steady-state levels of HIF-1alpha in normoxia." EMBO J 22(16): 4082-4090.
Berra, E., Richard, D. E., Gothie, E. and Pouyssegur, J. (2001). "HIF-1-dependent transcriptional activity is required for oxygen-mediated HIF-1alpha degradation." FEBS Lett 491(1-2): 85-90.
199!
Bertout, J. A., Majmundar, A. J., Gordan, J. D., Lam, J. C., Ditsworth, D., Keith, B., Brown, E. J., Nathanson, K. L. and Simon, M. C. (2009). "HIF2alpha inhibition promotes p53 pathway activity, tumor cell death, and radiation responses." Proc Natl Acad Sci U S A 106(34): 14391-14396.
Bhatt, J. R. and Finelli, A. (2014). "Landmarks in the diagnosis and treatment of renal cell carcinoma." Nat Rev Urol 11(9): 517-525.
Billich, A., Bornancin, F., Devay, P., Mechtcheriakova, D., Urtz, N. and Baumruker, T. (2003). "Phosphorylation of the immunomodulatory drug FTY720 by sphingosine kinases." J Biol Chem 278(48): 47408-47415.
Billich, A., Bornancin, F., Mechtcheriakova, D., Natt, F., Huesken, D. and Baumruker, T. (2005). "Basal and induced sphingosine kinase 1 activity in A549 carcinoma cells: function in cell survival and IL-1beta and TNF-alpha induced production of inflammatory mediators." Cell Signal 17(10): 1203-1217.
Birchwood, C. J., Saba, J. D., Dickson, R. C. and Cunningham, K. W. (2001). "Calcium influx and signaling in yeast stimulated by intracellular sphingosine 1-phosphate accumulation." J Biol Chem 276(15): 11712-11718.
Birner, P., Gatterbauer, B., Oberhuber, G., Schindl, M., Rossler, K., Prodinger, A., Budka, H. and Hainfellner, J. A. (2001). "Expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha in oligodendrogliomas: its impact on prognosis and on neoangiogenesis." Cancer 92(1): 165-171.
Birner, P., Schindl, M., Obermair, A., Plank, C., Breitenecker, G. and Oberhuber, G. (2000). "Overexpression of hypoxia-inducible factor 1alpha is a marker for an unfavorable prognosis in early-stage invasive cervical cancer." Cancer Res 60(17): 4693-4696.
Blagden, S. P. and Willis, A. E. (2011). "The biological and therapeutic relevance of mRNA translation in cancer." Nat Rev Clin Oncol 8(5): 280-291.
Blagosklonny, M. V., An, W. G., Romanova, L. Y., Trepel, J., Fojo, T. and Neckers, L. (1998). "p53 inhibits hypoxia-inducible factor-stimulated transcription." J Biol Chem 273(20): 11995-11998.
Bonhoure, E., Lauret, A., Barnes, D. J., Martin, C., Malavaud, B., Kohama, T., Melo, J. V. and Cuvillier, O. (2008). "Sphingosine kinase-1 is a downstream regulator of imatinib-induced apoptosis in chronic myeloid leukemia cells." Leukemia 22(5): 971-979.
Bonhoure, E., Pchejetski, D., Aouali, N., Morjani, H., Levade, T., Kohama, T. and Cuvillier, O. (2006). "Overcoming MDR-associated chemoresistance in HL-60 acute myeloid leukemia cells by targeting sphingosine kinase-1." Leukemia 20(1): 95-102.
Bosch-Marce, M., Okuyama, H., Wesley, J. B., Sarkar, K., Kimura, H., Liu, Y. V., Zhang, H., Strazza, M., Rey, S., Savino, L., Zhou, Y. F., McDonald, K. R., Na, Y., Vandiver, S., Rabi, A., Shaked, Y., Kerbel, R., Lavallee, T. and Semenza, G. L. (2007). "Effects of aging and hypoxia-inducible factor-1 activity on angiogenic cell mobilization and recovery of perfusion after limb ischemia." Circ Res 101(12): 1310-1318.
Bottos, A., Martini, M., Di Nicolantonio, F., Comunanza, V., Maione, F., Minassi, A., Appendino, G., Bussolino, F. and Bardelli, A. (2012). "Targeting oncogenic serine/threonine-protein kinase BRAF in cancer cells inhibits angiogenesis and abrogates hypoxia." Proc Natl Acad Sci U S A 109(6): E353-359.
Botusan, I. R., Sunkari, V. G., Savu, O., Catrina, A. I., Grunler, J., Lindberg, S., Pereira, T., Yla-Herttuala, S., Poellinger, L., Brismar, K. and Catrina, S. B. (2008). "Stabilization of HIF-1alpha is critical to improve wound healing in diabetic mice." Proc Natl Acad Sci U S A 105(49): 19426-19431.
Bracken, C. P., Fedele, A. O., Linke, S., Balrak, W., Lisy, K., Whitelaw, M. L. and Peet, D. J. (2006). "Cell-specific regulation of hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha and HIF-2alpha stabilization and transactivation in a graded oxygen environment." J Biol Chem 281(32): 22575-22585.
200!
Brahimi-Horn, M. C. and Pouyssegur, J. (2007). "Oxygen, a source of life and stress." FEBS Lett 581(19): 3582-3591.
Brinkmann, V. (2007). "Sphingosine 1-phosphate receptors in health and disease: mechanistic insights from gene deletion studies and reverse pharmacology." Pharmacol Ther 115(1): 84-105.
Brinkmann, V., Billich, A., Baumruker, T., Heining, P., Schmouder, R., Francis, G., Aradhye, S. and Burtin, P. (2010). "Fingolimod (FTY720): discovery and development of an oral drug to treat multiple sclerosis." Nat Rev Drug Discov 9(11): 883-897.
Brinkmann, V., Davis, M. D., Heise, C. E., Albert, R., Cottens, S., Hof, R., Bruns, C., Prieschl, E., Baumruker, T., Hiestand, P., Foster, C. A., Zollinger, M. and Lynch, K. R. (2002). "The immune modulator FTY720 targets sphingosine 1-phosphate receptors." J Biol Chem 277(24): 21453-21457.
Brizuela, L., Martin, C., Jeannot, P., Ader, I., Gstalder, C., Andrieu, G., Bocquet, M., Laffosse, J. M., Gomez-Brouchet, A., Malavaud, B., Sabbadini, R. A. and Cuvillier, O. (2014). "Osteoblast-derived sphingosine 1-phosphate to induce proliferation and confer resistance to therapeutics to bone metastasis-derived prostate cancer cells." Mol Oncol 8(7): 1181-1195.
Browder, T., Butterfield, C. E., Kraling, B. M., Shi, B., Marshall, B., O'Reilly, M. S. and Folkman, J. (2000). "Antiangiogenic scheduling of chemotherapy improves efficacy against experimental drug-resistant cancer." Cancer Res 60(7): 1878-1886.
Brown, J. M. (1993). "SR 4233 (tirapazamine): a new anticancer drug exploiting hypoxia in solid tumours." Br J Cancer 67(6): 1163-1170.
Brown, J. M. (2007). "Tumor hypoxia in cancer therapy." Methods Enzymol 435: 297-321.
Brugarolas, J. (2014). "Molecular genetics of clear-cell renal cell carcinoma." J Clin Oncol 32(18): 1968-1976.
Bruick, R. K. and McKnight, S. L. (2001). "A conserved family of prolyl-4-hydroxylases that modify HIF." Science 294(5545): 1337-1340.
Brusselmans, K., Compernolle, V., Tjwa, M., Wiesener, M. S., Maxwell, P. H., Collen, D. and Carmeliet, P. (2003). "Heterozygous deficiency of hypoxia-inducible factor-2alpha protects mice against pulmonary hypertension and right ventricular dysfunction during prolonged hypoxia." J Clin Invest 111(10): 1519-1527.
Buti, S., Bersanelli, M., Sikokis, A., Maines, F., Facchinetti, F., Bria, E., Ardizzoni, A., Tortora, G. and Massari, F. (2013). "Chemotherapy in metastatic renal cell carcinoma today? A systematic review." Anticancer Drugs 24(6): 535-554.
Cai, Z., Zhong, H., Bosch-Marce, M., Fox-Talbot, K., Wang, L., Wei, C., Trush, M. A. and Semenza, G. L. (2008). "Complete loss of ischaemic preconditioning-induced cardioprotection in mice with partial deficiency of HIF-1 alpha." Cardiovasc Res 77(3): 463-470.
Camerer, E., Regard, J. B., Cornelissen, I., Srinivasan, Y., Duong, D. N., Palmer, D., Pham, T. H., Wong, J. S., Pappu, R. and Coughlin, S. R. (2009). "Sphingosine-1-phosphate in the plasma compartment regulates basal and inflammation-induced vascular leak in mice." J Clin Invest 119(7): 1871-1879.
Campbell, S. C., Novick, A. C., Belldegrun, A., Blute, M. L., Chow, G. K., Derweesh, I. H., Faraday, M. M., Kaouk, J. H., Leveillee, R. J., Matin, S. F., Russo, P., Uzzo, R. G. and Practice Guidelines Committee of the American Urological, A. (2009). "Guideline for management of the clinical T1 renal mass." J Urol 182(4): 1271-1279.
Cancer Genome Atlas Research, N. (2013). "Comprehensive molecular characterization of clear cell renal cell carcinoma." Nature 499(7456): 43-49.
201!
Cao, Y., Eble, J. M., Moon, E., Yuan, H., Weitzel, D. H., Landon, C. D., Nien, C. Y., Hanna, G., Rich, J. N., Provenzale, J. M. and Dewhirst, M. W. (2013). "Tumor cells upregulate normoxic HIF-1alpha in response to doxorubicin." Cancer Res 73(20): 6230-6242.
Carbia-Nagashima, A., Gerez, J., Perez-Castro, C., Paez-Pereda, M., Silberstein, S., Stalla, G. K., Holsboer, F. and Arzt, E. (2007). "RSUME, a small RWD-containing protein, enhances SUMO conjugation and stabilizes HIF-1alpha during hypoxia." Cell 131(2): 309-323.
Carmeliet, P. and Jain, R. K. (2000). "Angiogenesis in cancer and other diseases." Nature 407(6801): 249-257.
Carmeliet, P. and Jain, R. K. (2011a). "Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis." Nature 473(7347): 298-307.
Carmeliet, P. and Jain, R. K. (2011b). "Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases." Nat Rev Drug Discov 10(6): 417-427.
Carroll, C. E., Liang, Y., Benakanakere, I., Besch-Williford, C. and Hyder, S. M. (2013). "The anticancer agent YC-1 suppresses progestin-stimulated VEGF in breast cancer cells and arrests breast tumor development." Int J Oncol 42(1): 179-187.
Carroll, V. A. and Ashcroft, M. (2008). "Regulation of angiogenic factors by HDM2 in renal cell carcinoma." Cancer Res 68(2): 545-552.
Cattoretti, G., Mandelbaum, J., Lee, N., Chaves, A. H., Mahler, A. M., Chadburn, A., Dalla-Favera, R., Pasqualucci, L. and MacLennan, A. J. (2009). "Targeted disruption of the S1P2 sphingosine 1-phosphate receptor gene leads to diffuse large B-cell lymphoma formation." Cancer Res 69(22): 8686-8692.
Ceccom, J., Loukh, N., Lauwers-Cances, V., Touriol, C., Nicaise, Y., Gentil, C., Uro-Coste, E., Pitson, S., Maurage, C. A., Duyckaerts, C., Cuvillier, O. and Delisle, M. B. (2014). "Reduced sphingosine kinase-1 and enhanced sphingosine 1-phosphate lyase expression demonstrate deregulated sphingosine 1-phosphate signaling in Alzheimer's disease." Acta Neuropathol Commun 2: 12.
Ceradini, D. J., Kulkarni, A. R., Callaghan, M. J., Tepper, O. M., Bastidas, N., Kleinman, M. E., Capla, J. M., Galiano, R. D., Levine, J. P. and Gurtner, G. C. (2004). "Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1." Nat Med 10(8): 858-864.
Cha, S. T., Chen, P. S., Johansson, G., Chu, C. Y., Wang, M. Y., Jeng, Y. M., Yu, S. L., Chen, J. S., Chang, K. J., Jee, S. H., Tan, C. T., Lin, M. T. and Kuo, M. L. (2010). "MicroRNA-519c suppresses hypoxia-inducible factor-1alpha expression and tumor angiogenesis." Cancer Res 70(7): 2675-2685.
Chae, S. S., Paik, J. H., Furneaux, H. and Hla, T. (2004). "Requirement for sphingosine 1-phosphate receptor-1 in tumor angiogenesis demonstrated by in vivo RNA interference." J Clin Invest 114(8): 1082-1089.
Chen, C., Pore, N., Behrooz, A., Ismail-Beigi, F. and Maity, A. (2001). "Regulation of glut1 mRNA by hypoxia-inducible factor-1. Interaction between H-ras and hypoxia." J Biol Chem 276(12): 9519-9525.
Chen, D., Li, M., Luo, J. and Gu, W. (2003). "Direct interactions between HIF-1 alpha and Mdm2 modulate p53 function." J Biol Chem 278(16): 13595-13598.
Chen, J., Ding, Z., Peng, Y., Pan, F., Li, J., Zou, L., Zhang, Y. and Liang, H. (2014). "HIF-1alpha inhibition reverses multidrug resistance in colon cancer cells via downregulation of MDR1/P-glycoprotein." PLoS One 9(6): e98882.
Chen, J., Li, Y., Yu, T. S., McKay, R. M., Burns, D. K., Kernie, S. G. and Parada, L. F. (2012). "A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy." Nature 488(7412): 522-526.
Cheng, J., Kang, X., Zhang, S. and Yeh, E. T. (2007). "SUMO-specific protease 1 is essential for stabilization of HIF1alpha during hypoxia." Cell 131(3): 584-595.
202!
Chipuk, J. E., McStay, G. P., Bharti, A., Kuwana, T., Clarke, C. J., Siskind, L. J., Obeid, L. M. and Green, D. R. (2012). "Sphingolipid metabolism cooperates with BAK and BAX to promote the mitochondrial pathway of apoptosis." Cell 148(5): 988-1000.
Chmura, S. J., Nodzenski, E., Beckett, M. A., Kufe, D. W., Quintans, J. and Weichselbaum, R. R. (1997). "Loss of ceramide production confers resistance to radiation-induced apoptosis." Cancer Res 57(7): 1270-1275.
Cho, H., Ahn, D. R., Park, H. and Yang, E. G. (2007). "Modulation of p300 binding by posttranslational modifications of the C-terminal activation domain of hypoxia-inducible factor-1alpha." FEBS Lett 581(8): 1542-1548.
Cho, S. Y., Lee, H. J., Jeong, S. J., Lee, H. J., Kim, H. S., Chen, C. Y., Lee, E. O. and Kim, S. H. (2011). "Sphingosine kinase 1 pathway is involved in melatonin-induced HIF-1alpha inactivation in hypoxic PC-3 prostate cancer cells." J Pineal Res 51(1): 87-93.
Choi, J. W., Gardell, S. E., Herr, D. R., Rivera, R., Lee, C. W., Noguchi, K., Teo, S. T., Yung, Y. C., Lu, M., Kennedy, G. and Chun, J. (2011). "FTY720 (fingolimod) efficacy in an animal model of multiple sclerosis requires astrocyte sphingosine 1-phosphate receptor 1 (S1P1) modulation." Proc Natl Acad Sci U S A 108(2): 751-756.
Choueiri, T. K. P., S.K.; McDermott, D.F. (2012). "Efficacy of cabozantinib in patients with metastatic refractory renal carcinoma (RCC)." J Clin Oncol 30 (suppl; abstr 4504).
Choy, M. K., Movassagh, M., Bennett, M. R. and Foo, R. S. (2010). "PKB/Akt activation inhibits p53-mediated HIF1A degradation that is independent of MDM2." J Cell Physiol 222(3): 635-639.
Christoffersen, C., Obinata, H., Kumaraswamy, S. B., Galvani, S., Ahnstrom, J., Sevvana, M., Egerer-Sieber, C., Muller, Y. A., Hla, T., Nielsen, L. B. and Dahlback, B. (2011). "Endothelium-protective sphingosine-1-phosphate provided by HDL-associated apolipoprotein M." Proc Natl Acad Sci U S A 108(23): 9613-9618.
Chun, J., Hla, T., Lynch, K. R., Spiegel, S. and Moolenaar, W. H. (2010). "International Union of Basic and Clinical Pharmacology. LXXVIII. Lysophospholipid receptor nomenclature." Pharmacol Rev 62(4): 579-587.
Chun, Y. S., Yeo, E. J., Choi, E., Teng, C. M., Bae, J. M., Kim, M. S. and Park, J. W. (2001). "Inhibitory effect of YC-1 on the hypoxic induction of erythropoietin and vascular endothelial growth factor in Hep3B cells." Biochem Pharmacol 61(8): 947-954.
Cingolani, F., Casasampere, M., Sanllehi, P., Casas, J., Bujons, J. and Fabrias, G. (2014). "Inhibition of dihydroceramide desaturase activity by the sphingosine kinase inhibitor SKI II." J Lipid Res 55(8): 1711-1720.
Cockman, M. E., Masson, N., Mole, D. R., Jaakkola, P., Chang, G. W., Clifford, S. C., Maher, E. R., Pugh, C. W., Ratcliffe, P. J. and Maxwell, P. H. (2000). "Hypoxia inducible factor-alpha binding and ubiquitylation by the von Hippel-Lindau tumor suppressor protein." J Biol Chem 275(33): 25733-25741.
Cohen, H. T. and McGovern, F. J. (2005). "Renal-cell carcinoma." N Engl J Med 353(23): 2477-2490.
Comerford, K. M., Wallace, T. J., Karhausen, J., Louis, N. A., Montalto, M. C. and Colgan, S. P. (2002). "Hypoxia-inducible factor-1-dependent regulation of the multidrug resistance (MDR1) gene." Cancer Res 62(12): 3387-3394.
Compernolle, V., Brusselmans, K., Acker, T., Hoet, P., Tjwa, M., Beck, H., Plaisance, S., Dor, Y., Keshet, E., Lupu, F., Nemery, B., Dewerchin, M., Van Veldhoven, P., Plate, K., Moons, L., Collen, D. and Carmeliet, P. (2002). "Loss of HIF-2alpha and inhibition of VEGF impair fetal lung maturation, whereas treatment with VEGF prevents fatal respiratory distress in premature mice." Nat Med 8(7): 702-710.
203!
Cooke, V. G., LeBleu, V. S., Keskin, D., Khan, Z., O'Connell, J. T., Teng, Y., Duncan, M. B., Xie, L., Maeda, G., Vong, S., Sugimoto, H., Rocha, R. M., Damascena, A., Brentani, R. R. and Kalluri, R. (2012). "Pericyte depletion results in hypoxia-associated epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis mediated by met signaling pathway." Cancer Cell 21(1): 66-81.
Corzo, C. A., Condamine, T., Lu, L., Cotter, M. J., Youn, J. I., Cheng, P., Cho, H. I., Celis, E., Quiceno, D. G., Padhya, T., McCaffrey, T. V., McCaffrey, J. C. and Gabrilovich, D. I. (2010). "HIF-1alpha regulates function and differentiation of myeloid-derived suppressor cells in the tumor microenvironment." J Exp Med 207(11): 2439-2453.
Covello, K. L., Kehler, J., Yu, H., Gordan, J. D., Arsham, A. M., Hu, C. J., Labosky, P. A., Simon, M. C. and Keith, B. (2006). "HIF-2alpha regulates Oct-4: effects of hypoxia on stem cell function, embryonic development, and tumor growth." Genes Dev 20(5): 557-570.
Covello, K. L. and Simon, M. C. (2004). "HIFs, hypoxia, and vascular development." Curr Top Dev Biol 62: 37-54.
Cowey, C. L., Amin, C., Pruthi, R. S., Wallen, E. M., Nielsen, M. E., Grigson, G., Watkins, C., Nance, K. V., Crane, J., Jalkut, M., Moore, D. T., Kim, W. Y., Godley, P. A., Whang, Y. E., Fielding, J. R. and Rathmell, W. K. (2010). "Neoadjuvant clinical trial with sorafenib for patients with stage II or higher renal cell carcinoma." J Clin Oncol 28(9): 1502-1507.
Creighton-Gutteridge, M., Cardellina, J. H., 2nd, Stephen, A. G., Rapisarda, A., Uranchimeg, B., Hite, K., Denny, W. A., Shoemaker, R. H. and Melillo, G. (2007). "Cell type-specific, topoisomerase II-dependent inhibition of hypoxia-inducible factor-1alpha protein accumulation by NSC 644221." Clin Cancer Res 13(3): 1010-1018.
Crews, S. T. (1998). "Control of cell lineage-specific development and transcription by bHLH-PAS proteins." Genes Dev 12(5): 607-620.
Crossey, P. A., Foster, K., Richards, F. M., Phipps, M. E., Latif, F., Tory, K., Jones, M. H., Bentley, E., Kumar, R., Lerman, M. I. and et al. (1994). "Molecular genetic investigations of the mechanism of tumourigenesis in von Hippel-Lindau disease: analysis of allele loss in VHL tumours." Hum Genet 93(1): 53-58.
Cuvillier, O. (2007). "Sphingosine kinase-1--a potential therapeutic target in cancer." Anticancer Drugs 18(2): 105-110.
Cuvillier, O. (2008). "Downregulating sphingosine kinase-1 for cancer therapy." Expert Opin Ther Targets 12(8): 1009-1020.
Cuvillier, O., Ader, I., Bouquerel, P., Brizuela, L., Gstalder, C. and Malavaud, B. (2013). "Hypoxia, therapeutic resistance, and sphingosine 1-phosphate." Adv Cancer Res 117: 117-141.
Cuvillier, O., Ader, I., Bouquerel, P., Brizuela, L., Malavaud, B., Mazerolles, C. and Rischmann, P. (2010). "Activation of sphingosine kinase-1 in cancer: implications for therapeutic targeting." Curr Mol Pharmacol 3(2): 53-65.
Cuvillier, O., Pirianov, G., Kleuser, B., Vanek, P. G., Coso, O. A., Gutkind, S. and Spiegel, S. (1996). "Suppression of ceramide-mediated programmed cell death by sphingosine-1-phosphate." Nature 381(6585): 800-803.
Dalgliesh, G. L., Furge, K., Greenman, C., Chen, L., Bignell, G., Butler, A., Davies, H., Edkins, S., Hardy, C., Latimer, C., Teague, J., Andrews, J., Barthorpe, S., Beare, D., Buck, G., Campbell, P. J., Forbes, S., Jia, M., Jones, D., Knott, H., Kok, C. Y., Lau, K. W., Leroy, C., Lin, M. L., McBride, D. J., Maddison, M., Maguire, S., McLay, K., Menzies, A., Mironenko, T., Mulderrig, L., Mudie, L., O'Meara, S., Pleasance, E., Rajasingham, A., Shepherd, R., Smith, R., Stebbings, L., Stephens, P., Tang, G., Tarpey, P. S., Turrell, K., Dykema, K. J., Khoo, S. K., Petillo, D., Wondergem, B., Anema, J., Kahnoski, R. J., Teh, B. T., Stratton, M. R. and Futreal, P.
204!
A. (2010). "Systematic sequencing of renal carcinoma reveals inactivation of histone modifying genes." Nature 463(7279): 360-363.
Daniel, C., Sartory, N., Zahn, N., Geisslinger, G., Radeke, H. H. and Stein, J. M. (2007). "FTY720 ameliorates Th1-mediated colitis in mice by directly affecting the functional activity of CD4+CD25+ regulatory T cells." J Immunol 178(4): 2458-2468.
Daponte, A., Ioannou, M., Mylonis, I., Simos, G., Minas, M., Messinis, I. E. and Koukoulis, G. (2008). "Prognostic significance of Hypoxia-Inducible Factor 1 alpha(HIF-1 alpha) expression in serous ovarian cancer: an immunohistochemical study." BMC Cancer 8: 335.
Datta, A., Loo, S. Y., Huang, B., Wong, L., Tan, S. S., Tan, T. Z., Lee, S. C., Thiery, J. P., Lim, Y. C., Yong, W. P., Lam, Y., Kumar, A. P. and Yap, C. T. (2014). "SPHK1 regulates proliferation and survival responses in triple-negative breast cancer." Oncotarget 5(15): 5920-5933.
Daum, G., Grabski, A. and Reidy, M. A. (2009). "Sphingosine 1-phosphate: a regulator of arterial lesions." Arterioscler Thromb Vasc Biol 29(10): 1439-1443.
Davis, M. D., Clemens, J. J., Macdonald, T. L. and Lynch, K. R. (2005). "Sphingosine 1-phosphate analogs as receptor antagonists." J Biol Chem 280(11): 9833-9841.
Dayon, A., Brizuela, L., Martin, C., Mazerolles, C., Pirot, N., Doumerc, N., Nogueira, L., Golzio, M., Teissie, J., Serre, G., Rischmann, P., Malavaud, B. and Cuvillier, O. (2009). "Sphingosine kinase-1 is central to androgen-regulated prostate cancer growth and survival." PLoS One 4(11): e8048.
De Smet, F., Segura, I., De Bock, K., Hohensinner, P. J. and Carmeliet, P. (2009). "Mechanisms of vessel branching: filopodia on endothelial tip cells lead the way." Arterioscler Thromb Vasc Biol 29(5): 639-649.
Deeb, G., Vaughan, M. M., McInnis, I., Ford, L. A., Sait, S. N., Starostik, P., Wetzler, M., Mashtare, T. and Wang, E. S. (2011). "Hypoxia-inducible factor-1alpha protein expression is associated with poor survival in normal karyotype adult acute myeloid leukemia." Leuk Res 35(5): 579-584.
Deevska, G. M. and Nikolova-Karakashian, M. N. (2011). "The twists and turns of sphingolipid pathway in glucose regulation." Biochimie 93(1): 32-38.
Dehne, N., Tausendschon, M., Essler, S., Geis, T., Schmid, T. and Brune, B. (2014). "IL-4 reduces the proangiogenic capacity of macrophages by down-regulating HIF-1alpha translation." J Leukoc Biol 95(1): 129-137.
Delon, C., Manifava, M., Wood, E., Thompson, D., Krugmann, S., Pyne, S. and Ktistakis, N. T. (2004). "Sphingosine kinase 1 is an intracellular effector of phosphatidic acid." J Biol Chem 279(43): 44763-44774.
Denko, N. C. (2008). "Hypoxia, HIF1 and glucose metabolism in the solid tumour." Nat Rev Cancer 8(9): 705-713.
DeSantis, C. E., Lin, C. C., Mariotto, A. B., Siegel, R. L., Stein, K. D., Kramer, J. L., Alteri, R., Robbins, A. S. and Jemal, A. (2014). "Cancer treatment and survivorship statistics, 2014." CA Cancer J Clin 64(4): 252-271.
di Tomaso, E., London, N., Fuja, D., Logie, J., Tyrrell, J. A., Kamoun, W., Munn, L. L. and Jain, R. K. (2009). "PDGF-C induces maturation of blood vessels in a model of glioblastoma and attenuates the response to anti-VEGF treatment." PLoS One 4(4): e5123.
Dickson, M. A., Carvajal, R. D., Merrill, A. H., Jr., Gonen, M., Cane, L. M. and Schwartz, G. K. (2011). "A phase I clinical trial of safingol in combination with cisplatin in advanced solid tumors." Clin Cancer Res 17(8): 2484-2492.
Dillmann, C., Mora, J., Olesch, C., Brune, B. and Weigert, A. (2015). "S1PR4 is required for plasmacytoid dendritic cell differentiation." Biol Chem.
205!
Dioum, E. M., Chen, R., Alexander, M. S., Zhang, Q., Hogg, R. T., Gerard, R. D. and Garcia, J. A. (2009). "Regulation of hypoxia-inducible factor 2alpha signaling by the stress-responsive deacetylase sirtuin 1." Science 324(5932): 1289-1293.
DiSilvestro, P. A., Ali, S., Craighead, P. S., Lucci, J. A., Lee, Y. C., Cohn, D. E., Spirtos, N. M., Tewari, K. S., Muller, C., Gajewski, W. H., Steinhoff, M. M. and Monk, B. J. (2014). "Phase III randomized trial of weekly cisplatin and irradiation versus cisplatin and tirapazamine and irradiation in stages IB2, IIA, IIB, IIIB, and IVA cervical carcinoma limited to the pelvis: a Gynecologic Oncology Group study." J Clin Oncol 32(5): 458-464.
Doedens, A. L., Stockmann, C., Rubinstein, M. P., Liao, D., Zhang, N., DeNardo, D. G., Coussens, L. M., Karin, M., Goldrath, A. W. and Johnson, R. S. (2010). "Macrophage expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha suppresses T-cell function and promotes tumor progression." Cancer Res 70(19): 7465-7475.
Doll, F., Pfeilschifter, J. and Huwiler, A. (2007). "Prolactin upregulates sphingosine kinase-1 expression and activity in the human breast cancer cell line MCF7 and triggers enhanced proliferation and migration." Endocr Relat Cancer 14(2): 325-335.
Du, W., Takuwa, N., Yoshioka, K., Okamoto, Y., Gonda, K., Sugihara, K., Fukamizu, A., Asano, M. and Takuwa, Y. (2010). "S1P(2), the G protein-coupled receptor for sphingosine-1-phosphate, negatively regulates tumor angiogenesis and tumor growth in vivo in mice." Cancer Res 70(2): 772-781.
Duns, G., van den Berg, E., van Duivenbode, I., Osinga, J., Hollema, H., Hofstra, R. M. and Kok, K. (2010). "Histone methyltransferase gene SETD2 is a novel tumor suppressor gene in clear cell renal cell carcinoma." Cancer Res 70(11): 4287-4291.
Dunwoodie, S. L. (2009). "The role of hypoxia in development of the Mammalian embryo." Dev Cell 17(6): 755-773.
Dutta, D., Ray, S., Vivian, J. L. and Paul, S. (2008). "Activation of the VEGFR1 chromatin domain: an angiogenic signal-ETS1/HIF-2alpha regulatory axis." J Biol Chem 283(37): 25404-25413.
Dvorak, H. F., Nagy, J. A., Feng, D., Brown, L. F. and Dvorak, A. M. (1999). "Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor and the significance of microvascular hyperpermeability in angiogenesis." Curr Top Microbiol Immunol 237: 97-132.
Eberhard, A., Kahlert, S., Goede, V., Hemmerlein, B., Plate, K. H. and Augustin, H. G. (2000). "Heterogeneity of angiogenesis and blood vessel maturation in human tumors: implications for antiangiogenic tumor therapies." Cancer Res 60(5): 1388-1393.
Eble, J. A. and Niland, S. (2009). "The extracellular matrix of blood vessels." Curr Pharm Des 15(12): 1385-1400.
Eder, J. P., Vande Woude, G. F., Boerner, S. A. and LoRusso, P. M. (2009). "Novel therapeutic inhibitors of the c-Met signaling pathway in cancer." Clin Cancer Res 15(7): 2207-2214.
El-Shewy, H. M., Johnson, K. R., Lee, M. H., Jaffa, A. A., Obeid, L. M. and Luttrell, L. M. (2006). "Insulin-like growth factors mediate heterotrimeric G protein-dependent ERK1/2 activation by transactivating sphingosine 1-phosphate receptors." J Biol Chem 281(42): 31399-31407.
Elmore, J. M., Kadesky, K. T., Koeneman, K. S. and Sagalowsky, A. I. (2003). "Reassessment of the 1997 TNM classification system for renal cell carcinoma." Cancer 98(11): 2329-2334.
Elser, M., Borsig, L., Hassa, P. O., Erener, S., Messner, S., Valovka, T., Keller, S., Gassmann, M. and Hottiger, M. O. (2008). "Poly(ADP-ribose) polymerase 1 promotes tumor cell survival by coactivating hypoxia-inducible factor-1-dependent gene expression." Mol Cancer Res 6(2): 282-290.
206!
Ema, M., Taya, S., Yokotani, N., Sogawa, K., Matsuda, Y. and Fujii-Kuriyama, Y. (1997). "A novel bHLH-PAS factor with close sequence similarity to hypoxia-inducible factor 1alpha regulates the VEGF expression and is potentially involved in lung and vascular development." Proc Natl Acad Sci U S A 94(9): 4273-4278.
Endo, K., Igarashi, Y., Nisar, M., Zhou, Q. H. and Hakomori, S. (1991). "Cell membrane signaling as target in cancer therapy: inhibitory effect of N,N-dimethyl and N,N,N-trimethyl sphingosine derivatives on in vitro and in vivo growth of human tumor cells in nude mice." Cancer Res 51(6): 1613-1618.
English, D., Welch, Z., Kovala, A. T., Harvey, K., Volpert, O. V., Brindley, D. N. and Garcia, J. G. (2000). "Sphingosine 1-phosphate released from platelets during clotting accounts for the potent endothelial cell chemotactic activity of blood serum and provides a novel link between hemostasis and angiogenesis." FASEB J 14(14): 2255-2265.
Epstein, A. C., Gleadle, J. M., McNeill, L. A., Hewitson, K. S., O'Rourke, J., Mole, D. R., Mukherji, M., Metzen, E., Wilson, M. I., Dhanda, A., Tian, Y. M., Masson, N., Hamilton, D. L., Jaakkola, P., Barstead, R., Hodgkin, J., Maxwell, P. H., Pugh, C. W., Schofield, C. J. and Ratcliffe, P. J. (2001). "C. elegans EGL-9 and mammalian homologs define a family of dioxygenases that regulate HIF by prolyl hydroxylation." Cell 107(1): 43-54.
Erler, J. T., Bennewith, K. L., Nicolau, M., Dornhofer, N., Kong, C., Le, Q. T., Chi, J. T., Jeffrey, S. S. and Giaccia, A. J. (2006). "Lysyl oxidase is essential for hypoxia-induced metastasis." Nature 440(7088): 1222-1226.
Escudier, B. (2012). "Emerging immunotherapies for renal cell carcinoma." Ann Oncol 23 Suppl 8: viii35-40.
Escudier, B., Eisen, T., Porta, C., Patard, J. J., Khoo, V., Algaba, F., Mulders, P., Kataja, V. and Group, E. G. W. (2012). "Renal cell carcinoma: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up." Ann Oncol 23 Suppl 7: vii65-71.
Escudier, B., Eisen, T., Stadler, W. M., Szczylik, C., Oudard, S., Siebels, M., Negrier, S., Chevreau, C., Solska, E., Desai, A. A., Rolland, F., Demkow, T., Hutson, T. E., Gore, M., Freeman, S., Schwartz, B., Shan, M., Simantov, R., Bukowski, R. M. and Group, T. S. (2007a). "Sorafenib in advanced clear-cell renal-cell carcinoma." N Engl J Med 356(2): 125-134.
Escudier, B., Pluzanska, A., Koralewski, P., Ravaud, A., Bracarda, S., Szczylik, C., Chevreau, C., Filipek, M., Melichar, B., Bajetta, E., Gorbunova, V., Bay, J. O., Bodrogi, I., Jagiello-Gruszfeld, A., Moore, N. and investigators, A. T. (2007b). "Bevacizumab plus interferon alfa-2a for treatment of metastatic renal cell carcinoma: a randomised, double-blind phase III trial." Lancet 370(9605): 2103-2111.
Esteban, M. A., Tran, M. G., Harten, S. K., Hill, P., Castellanos, M. C., Chandra, A., Raval, R., O'Brien T, S. and Maxwell, P. H. (2006). "Regulation of E-cadherin expression by VHL and hypoxia-inducible factor." Cancer Res 66(7): 3567-3575.
Facciabene, A., Peng, X., Hagemann, I. S., Balint, K., Barchetti, A., Wang, L. P., Gimotty, P. A., Gilks, C. B., Lal, P., Zhang, L. and Coukos, G. (2011). "Tumour hypoxia promotes tolerance and angiogenesis via CCL28 and T(reg) cells." Nature 475(7355): 226-230.
Falchook, G. S., Wheler, J. J., Naing, A., Jackson, E. F., Janku, F., Hong, D., Ng, C. S., Tannir, N. M., Lawhorn, K. N., Huang, M., Angelo, L. S., Vishwamitra, D., Hess, K., Howard, A. N., Parkhurst, K. L., Amin, H. M. and Kurzrock, R. (2014). "Targeting hypoxia-inducible factor-1alpha (HIF-1alpha) in combination with antiangiogenic therapy: a phase I trial of bortezomib plus bevacizumab." Oncotarget 5(21): 10280-10292.
Falcon, B. L., Hashizume, H., Koumoutsakos, P., Chou, J., Bready, J. V., Coxon, A., Oliner, J. D. and McDonald, D. M. (2009). "Contrasting actions of selective inhibitors of angiopoietin-1 and angiopoietin-2 on the normalization of tumor blood vessels." Am J Pathol 175(5): 2159-2170.
207!
Fantin, A., Vieira, J. M., Gestri, G., Denti, L., Schwarz, Q., Prykhozhij, S., Peri, F., Wilson, S. W. and Ruhrberg, C. (2010). "Tissue macrophages act as cellular chaperones for vascular anastomosis downstream of VEGF-mediated endothelial tip cell induction." Blood 116(5): 829-840.
Feldser, D., Agani, F., Iyer, N. V., Pak, B., Ferreira, G. and Semenza, G. L. (1999). "Reciprocal positive regulation of hypoxia-inducible factor 1alpha and insulin-like growth factor 2." Cancer Res 59(16): 3915-3918.
Finley, L. W., Carracedo, A., Lee, J., Souza, A., Egia, A., Zhang, J., Teruya-Feldstein, J., Moreira, P. I., Cardoso, S. M., Clish, C. B., Pandolfi, P. P. and Haigis, M. C. (2011). "SIRT3 opposes reprogramming of cancer cell metabolism through HIF1alpha destabilization." Cancer Cell 19(3): 416-428.
Firth, J. D., Ebert, B. L. and Ratcliffe, P. J. (1995). "Hypoxic regulation of lactate dehydrogenase A. Interaction between hypoxia-inducible factor 1 and cAMP response elements." J Biol Chem 270(36): 21021-21027.
Fisher, R., Gore, M. and Larkin, J. (2013). "Current and future systemic treatments for renal cell carcinoma." Semin Cancer Biol 23(1): 38-45.
Flamme, I., Frohlich, T., von Reutern, M., Kappel, A., Damert, A. and Risau, W. (1997). "HRF, a putative basic helix-loop-helix-PAS-domain transcription factor is closely related to hypoxia-inducible factor-1 alpha and developmentally expressed in blood vessels." Mech Dev 63(1): 51-60.
Flanigan, R. C., Salmon, S. E., Blumenstein, B. A., Bearman, S. I., Roy, V., McGrath, P. C., Caton, J. R., Jr., Munshi, N. and Crawford, E. D. (2001). "Nephrectomy followed by interferon alfa-2b compared with interferon alfa-2b alone for metastatic renal-cell cancer." N Engl J Med 345(23): 1655-1659.
Folkman, J. and Hanahan, D. (1991). "Switch to the angiogenic phenotype during tumorigenesis." Princess Takamatsu Symp 22: 339-347.
Forsythe, J. A., Jiang, B. H., Iyer, N. V., Agani, F., Leung, S. W., Koos, R. D. and Semenza, G. L. (1996). "Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia-inducible factor 1." Mol Cell Biol 16(9): 4604-4613.
French, K. J., Schrecengost, R. S., Lee, B. D., Zhuang, Y., Smith, S. N., Eberly, J. L., Yun, J. K. and Smith, C. D. (2003). "Discovery and evaluation of inhibitors of human sphingosine kinase." Cancer Res 63(18): 5962-5969.
French, K. J., Upson, J. J., Keller, S. N., Zhuang, Y., Yun, J. K. and Smith, C. D. (2006). "Antitumor activity of sphingosine kinase inhibitors." J Pharmacol Exp Ther 318(2): 596-603.
French, K. J., Zhuang, Y., Maines, L. W., Gao, P., Wang, W., Beljanski, V., Upson, J. J., Green, C. L., Keller, S. N. and Smith, C. D. (2010). "Pharmacology and antitumor activity of ABC294640, a selective inhibitor of sphingosine kinase-2." J Pharmacol Exp Ther 333(1): 129-139.
Frolova, O., Samudio, I., Benito, J. M., Jacamo, R., Kornblau, S. M., Markovic, A., Schober, W., Lu, H., Qiu, Y. H., Buglio, D., McQueen, T., Pierce, S., Shpall, E., Konoplev, S., Thomas, D., Kantarjian, H., Lock, R., Andreeff, M. and Konopleva, M. (2012). "Regulation of HIF-1alpha signaling and chemoresistance in acute lymphocytic leukemia under hypoxic conditions of the bone marrow microenvironment." Cancer Biol Ther 13(10): 858-870.
Fu, L., Wang, G., Shevchuk, M. M., Nanus, D. M. and Gudas, L. J. (2011). "Generation of a mouse model of Von Hippel-Lindau kidney disease leading to renal cancers by expression of a constitutively active mutant of HIF1alpha." Cancer Res 71(21): 6848-6856.
Fu, L., Wang, G., Shevchuk, M. M., Nanus, D. M. and Gudas, L. J. (2013). "Activation of HIF2alpha in kidney proximal tubule cells causes abnormal glycogen deposition but not tumorigenesis." Cancer Res 73(9): 2916-2925.
208!
Gaengel, K., Niaudet, C., Hagikura, K., Lavina, B., Muhl, L., Hofmann, J. J., Ebarasi, L., Nystrom, S., Rymo, S., Chen, L. L., Pang, M. F., Jin, Y., Raschperger, E., Roswall, P., Schulte, D., Benedito, R., Larsson, J., Hellstrom, M., Fuxe, J., Uhlen, P., Adams, R., Jakobsson, L., Majumdar, A., Vestweber, D., Uv, A. and Betsholtz, C. (2012). "The sphingosine-1-phosphate receptor S1PR1 restricts sprouting angiogenesis by regulating the interplay between VE-cadherin and VEGFR2." Dev Cell 23(3): 587-599.
Gao, H. and Deng, L. (2014). "Sphingosine kinase-1 activation causes acquired resistance against Sunitinib in renal cell carcinoma cells." Cell Biochem Biophys 68(2): 419-425.
Gao, P., Zhang, H., Dinavahi, R., Li, F., Xiang, Y., Raman, V., Bhujwalla, Z. M., Felsher, D. W., Cheng, L., Pevsner, J., Lee, L. A., Semenza, G. L. and Dang, C. V. (2007). "HIF-dependent antitumorigenic effect of antioxidants in vivo." Cancer Cell 12(3): 230-238.
Gault, C. R., Obeid, L. M. and Hannun, Y. A. (2010). "An overview of sphingolipid metabolism: from synthesis to breakdown." Adv Exp Med Biol 688: 1-23.
Geis, T., Doring, C., Popp, R., Grossmann, N., Fleming, I., Hansmann, M. L., Dehne, N. and Brune, B. (2015). "HIF-2alpha-dependent PAI-1 induction contributes to angiogenesis in hepatocellular carcinoma." Exp Cell Res 331(1): 46-57.
Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., Gronroos, E., Martinez, P., Matthews, N., Stewart, A., Tarpey, P., Varela, I., Phillimore, B., Begum, S., McDonald, N. Q., Butler, A., Jones, D., Raine, K., Latimer, C., Santos, C. R., Nohadani, M., Eklund, A. C., Spencer-Dene, B., Clark, G., Pickering, L., Stamp, G., Gore, M., Szallasi, Z., Downward, J., Futreal, P. A. and Swanton, C. (2012). "Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing." N Engl J Med 366(10): 883-892.
Giatromanolaki, A., Koukourakis, M. I., Sivridis, E., Turley, H., Talks, K., Pezzella, F., Gatter, K. C. and Harris, A. L. (2001). "Relation of hypoxia inducible factor 1 alpha and 2 alpha in operable non-small cell lung cancer to angiogenic/molecular profile of tumours and survival." Br J Cancer 85(6): 881-890.
Giatromanolaki, A., Sivridis, E., Kouskoukis, C., Gatter, K. C., Harris, A. L. and Koukourakis, M. I. (2003). "Hypoxia-inducible factors 1alpha and 2alpha are related to vascular endothelial growth factor expression and a poorer prognosis in nodular malignant melanomas of the skin." Melanoma Res 13(5): 493-501.
Gibney, G. C., P.; Aziz, S.A.; Camp R.L. (2011). "C-met as a therapeutic target using ARQ 197 in renal cell carcinoma." J Clin Oncol 29 (suppl 7; abstr 360).
Giussani, P., Tringali, C., Riboni, L., Viani, P. and Venerando, B. (2014). "Sphingolipids: key regulators of apoptosis and pivotal players in cancer drug resistance." Int J Mol Sci 15(3): 4356-4392.
Glickman, M., Malek, R. L., Kwitek-Black, A. E., Jacob, H. J. and Lee, N. H. (1999). "Molecular cloning, tissue-specific expression, and chromosomal localization of a novel nerve growth factor-regulated G-protein- coupled receptor, nrg-1." Mol Cell Neurosci 14(2): 141-152.
Gnarra, J. R., Zhou, S., Merrill, M. J., Wagner, J. R., Krumm, A., Papavassiliou, E., Oldfield, E. H., Klausner, R. D. and Linehan, W. M. (1996). "Post-transcriptional regulation of vascular endothelial growth factor mRNA by the product of the VHL tumor suppressor gene." Proc Natl Acad Sci U S A 93(20): 10589-10594.
Goda, N. and Kanai, M. (2012). "Hypoxia-inducible factors and their roles in energy metabolism." Int J Hematol 95(5): 457-463.
Goel, S., Duda, D. G., Xu, L., Munn, L. L., Boucher, Y., Fukumura, D. and Jain, R. K. (2011). "Normalization of the vasculature for treatment of cancer and other diseases." Physiol Rev 91(3): 1071-1121.
Gomez-Brouchet, A., Pchejetski, D., Brizuela, L., Garcia, V., Altie, M. F., Maddelein, M. L., Delisle, M. B. and Cuvillier, O. (2007). "Critical role for sphingosine kinase-1 in regulating survival of neuroblastoma cells exposed to amyloid-beta peptide." Mol Pharmacol 72(2): 341-349.
209!
Gonda, K., Okamoto, H., Takuwa, N., Yatomi, Y., Okazaki, H., Sakurai, T., Kimura, S., Sillard, R., Harii, K. and Takuwa, Y. (1999). "The novel sphingosine 1-phosphate receptor AGR16 is coupled via pertussis toxin-sensitive and -insensitive G-proteins to multiple signalling pathways." Biochem J 337 ( Pt 1): 67-75.
Gonzalez-Cabrera, P. J., Jo, E., Sanna, M. G., Brown, S., Leaf, N., Marsolais, D., Schaeffer, M. T., Chapman, J., Cameron, M., Guerrero, M., Roberts, E. and Rosen, H. (2008). "Full pharmacological efficacy of a novel S1P1 agonist that does not require S1P-like headgroup interactions." Mol Pharmacol 74(5): 1308-1318.
Gonzalez-Flores, A., Aguilar-Quesada, R., Siles, E., Pozo, S., Rodriguez-Lara, M. I., Lopez-Jimenez, L., Lopez-Rodriguez, M., Peralta-Leal, A., Villar, D., Martin-Oliva, D., del Peso, L., Berra, E. and Oliver, F. J. (2014). "Interaction between PARP-1 and HIF-2alpha in the hypoxic response." Oncogene 33(7): 891-898.
Gordan, J. D., Bertout, J. A., Hu, C. J., Diehl, J. A. and Simon, M. C. (2007a). "HIF-2alpha promotes hypoxic cell proliferation by enhancing c-myc transcriptional activity." Cancer Cell 11(4): 335-347.
Gordan, J. D., Lal, P., Dondeti, V. R., Letrero, R., Parekh, K. N., Oquendo, C. E., Greenberg, R. A., Flaherty, K. T., Rathmell, W. K., Keith, B., Simon, M. C. and Nathanson, K. L. (2008). "HIF-alpha effects on c-Myc distinguish two subtypes of sporadic VHL-deficient clear cell renal carcinoma." Cancer Cell 14(6): 435-446.
Gordan, J. D., Thompson, C. B. and Simon, M. C. (2007b). "HIF and c-Myc: sibling rivals for control of cancer cell metabolism and proliferation." Cancer Cell 12(2): 108-113.
Gossage, L., Eisen, T. and Maher, E. R. (2015). "VHL, the story of a tumour suppressor gene." Nat Rev Cancer 15(1): 55-64.
Graler, M. H., Bernhardt, G. and Lipp, M. (1998). "EDG6, a novel G-protein-coupled receptor related to receptors for bioactive lysophospholipids, is specifically expressed in lymphoid tissue." Genomics 53(2): 164-169.
Graler, M. H. and Goetzl, E. J. (2004). "The immunosuppressant FTY720 down-regulates sphingosine 1-phosphate G-protein-coupled receptors." FASEB J 18(3): 551-553.
Greenberg, J. I., Shields, D. J., Barillas, S. G., Acevedo, L. M., Murphy, E., Huang, J., Scheppke, L., Stockmann, C., Johnson, R. S., Angle, N. and Cheresh, D. A. (2008). "A role for VEGF as a negative regulator of pericyte function and vessel maturation." Nature 456(7223): 809-813.
Greenberger, L. M., Horak, I. D., Filpula, D., Sapra, P., Westergaard, M., Frydenlund, H. F., Albaek, C., Schroder, H. and Orum, H. (2008). "A RNA antagonist of hypoxia-inducible factor-1alpha, EZN-2968, inhibits tumor cell growth." Mol Cancer Ther 7(11): 3598-3608.
Griffiths, E. A., Pritchard, S. A., Valentine, H. R., Whitchelo, N., Bishop, P. W., Ebert, M. P., Price, P. M., Welch, I. M. and West, C. M. (2007). "Hypoxia-inducible factor-1alpha expression in the gastric carcinogenesis sequence and its prognostic role in gastric and gastro-oesophageal adenocarcinomas." Br J Cancer 96(1): 95-103.
Gstalder, C., Bouquerel, P., Laurent, J., Brizuela, L., Sabbadini, R. A., Malavaud, B., Ader, I. and Cuvillier, O. (2015). "Essential role for SphK1/S1P signalling to regulate HIF-2α expression and activity in cancer." Submitted.
Gu, Y. Z., Moran, S. M., Hogenesch, J. B., Wartman, L. and Bradfield, C. A. (1998). "Molecular characterization and chromosomal localization of a third alpha-class hypoxia inducible factor subunit, HIF3alpha." Gene Expr 7(3): 205-213.
Guillermet-Guibert, J., Davenne, L., Pchejetski, D., Saint-Laurent, N., Brizuela, L., Guilbeau-Frugier, C., Delisle, M. B., Cuvillier, O., Susini, C. and Bousquet, C. (2009). "Targeting the sphingolipid metabolism to defeat pancreatic cancer cell resistance to the chemotherapeutic gemcitabine drug." Mol Cancer Ther 8(4): 809-820.
210!
Gunaratnam, L., Morley, M., Franovic, A., de Paulsen, N., Mekhail, K., Parolin, D. A., Nakamura, E., Lorimer, I. A. and Lee, S. (2003). "Hypoxia inducible factor activates the transforming growth factor-alpha/epidermal growth factor receptor growth stimulatory pathway in VHL(-/-) renal cell carcinoma cells." J Biol Chem 278(45): 44966-44974.
Hait, N. C., Allegood, J., Maceyka, M., Strub, G. M., Harikumar, K. B., Singh, S. K., Luo, C., Marmorstein, R., Kordula, T., Milstien, S. and Spiegel, S. (2009). "Regulation of histone acetylation in the nucleus by sphingosine-1-phosphate." Science 325(5945): 1254-1257.
Hait, N. C., Bellamy, A., Milstien, S., Kordula, T. and Spiegel, S. (2007). "Sphingosine kinase type 2 activation by ERK-mediated phosphorylation." J Biol Chem 282(16): 12058-12065.
Hait, N. C., Sarkar, S., Le Stunff, H., Mikami, A., Maceyka, M., Milstien, S. and Spiegel, S. (2005). "Role of sphingosine kinase 2 in cell migration toward epidermal growth factor." J Biol Chem 280(33): 29462-29469.
Hanahan, D. and Folkman, J. (1996). "Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis." Cell 86(3): 353-364.
Hannun, Y. A. and Obeid, L. M. (2008). "Principles of bioactive lipid signalling: lessons from sphingolipids." Nat Rev Mol Cell Biol 9(2): 139-150.
Hanson, M. A., Roth, C. B., Jo, E., Griffith, M. T., Scott, F. L., Reinhart, G., Desale, H., Clemons, B., Cahalan, S. M., Schuerer, S. C., Sanna, M. G., Han, G. W., Kuhn, P., Rosen, H. and Stevens, R. C. (2012). "Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor." Science 335(6070): 851-855.
Hara, K., Yonezawa, K., Kozlowski, M. T., Sugimoto, T., Andrabi, K., Weng, Q. P., Kasuga, M., Nishimoto, I. and Avruch, J. (1997). "Regulation of eIF-4E BP1 phosphorylation by mTOR." J Biol Chem 272(42): 26457-26463.
Hara, S., Hamada, J., Kobayashi, C., Kondo, Y. and Imura, N. (2001). "Expression and characterization of hypoxia-inducible factor (HIF)-3alpha in human kidney: suppression of HIF-mediated gene expression by HIF-3alpha." Biochem Biophys Res Commun 287(4): 808-813.
Hashizume, H., Baluk, P., Morikawa, S., McLean, J. W., Thurston, G., Roberge, S., Jain, R. K. and McDonald, D. M. (2000). "Openings between defective endothelial cells explain tumor vessel leakiness." Am J Pathol 156(4): 1363-1380.
Hay, N. and Sonenberg, N. (2004). "Upstream and downstream of mTOR." Genes Dev 18(16): 1926-1945.
Helczynska, K., Larsson, A. M., Holmquist Mengelbier, L., Bridges, E., Fredlund, E., Borgquist, S., Landberg, G., Pahlman, S. and Jirstrom, K. (2008). "Hypoxia-inducible factor-2alpha correlates to distant recurrence and poor outcome in invasive breast cancer." Cancer Res 68(22): 9212-9220.
Heng, D. Y., Chi, K. N., Murray, N., Jin, T., Garcia, J. A., Bukowski, R. M., Rini, B. I. and Kollmannsberger, C. (2009). "A population-based study evaluating the impact of sunitinib on overall survival in the treatment of patients with metastatic renal cell cancer." Cancer 115(4): 776-783.
Hickey, M. M. and Simon, M. C. (2006). "Regulation of angiogenesis by hypoxia and hypoxia-inducible factors." Curr Top Dev Biol 76: 217-257.
Hirata, N., Yamada, S., Shoda, T., Kurihara, M., Sekino, Y. and Kanda, Y. (2014). "Sphingosine-1-phosphate promotes expansion of cancer stem cells via S1PR3 by a ligand-independent Notch activation." Nat Commun 5: 4806.
Hirose, K., Morita, M., Ema, M., Mimura, J., Hamada, H., Fujii, H., Saijo, Y., Gotoh, O., Sogawa, K. and Fujii-Kuriyama, Y. (1996). "cDNA cloning and tissue-specific expression of a novel basic helix-loop-helix/PAS factor (Arnt2) with close sequence similarity to the aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (Arnt)." Mol Cell Biol 16(4): 1706-1713.
211!
Hisano, Y., Kobayashi, N., Kawahara, A., Yamaguchi, A. and Nishi, T. (2011). "The sphingosine 1-phosphate transporter, SPNS2, functions as a transporter of the phosphorylated form of the immunomodulating agent FTY720." J Biol Chem 286(3): 1758-1766.
Hla, T. and Maciag, T. (1990). "An abundant transcript induced in differentiating human endothelial cells encodes a polypeptide with structural similarities to G-protein-coupled receptors." J Biol Chem 265(16): 9308-9313.
Hofmann, U., Burkard, N., Vogt, C., Thoma, A., Frantz, S., Ertl, G., Ritter, O. and Bonz, A. (2009). "Protective effects of sphingosine-1-phosphate receptor agonist treatment after myocardial ischaemia-reperfusion." Cardiovasc Res 83(2): 285-293.
Hogenesch, J. B., Chan, W. K., Jackiw, V. H., Brown, R. C., Gu, Y. Z., Pray-Grant, M., Perdew, G. H. and Bradfield, C. A. (1997). "Characterization of a subset of the basic-helix-loop-helix-PAS superfamily that interacts with components of the dioxin signaling pathway." J Biol Chem 272(13): 8581-8593.
Holland, W. L., Bikman, B. T., Wang, L. P., Yuguang, G., Sargent, K. M., Bulchand, S., Knotts, T. A., Shui, G., Clegg, D. J., Wenk, M. R., Pagliassotti, M. J., Scherer, P. E. and Summers, S. A. (2011a). "Lipid-induced insulin resistance mediated by the proinflammatory receptor TLR4 requires saturated fatty acid-induced ceramide biosynthesis in mice." J Clin Invest 121(5): 1858-1870.
Holland, W. L., Miller, R. A., Wang, Z. V., Sun, K., Barth, B. M., Bui, H. H., Davis, K. E., Bikman, B. T., Halberg, N., Rutkowski, J. M., Wade, M. R., Tenorio, V. M., Kuo, M. S., Brozinick, J. T., Zhang, B. B., Birnbaum, M. J., Summers, S. A. and Scherer, P. E. (2011b). "Receptor-mediated activation of ceramidase activity initiates the pleiotropic actions of adiponectin." Nat Med 17(1): 55-63.
Holmquist-Mengelbier, L., Fredlund, E., Lofstedt, T., Noguera, R., Navarro, S., Nilsson, H., Pietras, A., Vallon-Christersson, J., Borg, A., Gradin, K., Poellinger, L. and Pahlman, S. (2006). "Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype." Cancer Cell 10(5): 413-423.
Hu, C. J., Sataur, A., Wang, L., Chen, H. and Simon, M. C. (2007). "The N-terminal transactivation domain confers target gene specificity of hypoxia-inducible factors HIF-1alpha and HIF-2alpha." Mol Biol Cell 18(11): 4528-4542.
Hu, C. J., Wang, L. Y., Chodosh, L. A., Keith, B. and Simon, M. C. (2003). "Differential roles of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1alpha) and HIF-2alpha in hypoxic gene regulation." Mol Cell Biol 23(24): 9361-9374.
Huang, B., Wu, P., Bowker-Kinley, M. M. and Harris, R. A. (2002). "Regulation of pyruvate dehydrogenase kinase expression by peroxisome proliferator-activated receptor-alpha ligands, glucocorticoids, and insulin." Diabetes 51(2): 276-283.
Huang, D., Ding, Y., Zhou, M., Rini, B. I., Petillo, D., Qian, C. N., Kahnoski, R., Futreal, P. A., Furge, K. A. and Teh, B. T. (2010a). "Interleukin-8 mediates resistance to antiangiogenic agent sunitinib in renal cell carcinoma." Cancer Res 70(3): 1063-1071.
Huang, H., Bhat, A., Woodnutt, G. and Lappe, R. (2010b). "Targeting the ANGPT-TIE2 pathway in malignancy." Nat Rev Cancer 10(8): 575-585.
Huang, L. E., Ho, V., Arany, Z., Krainc, D., Galson, D., Tendler, D., Livingston, D. M. and Bunn, H. F. (1997). "Erythropoietin gene regulation depends on heme-dependent oxygen sensing and assembly of interacting transcription factors." Kidney Int 51(2): 548-552.
Huang, M., Chen, Q., Xiao, J., Yao, T., Bian, L., Liu, C. and Lin, Z. (2014). "Overexpression of hypoxia-inducible factor-1alpha is a predictor of poor prognosis in cervical cancer: a clinicopathologic study and a meta-analysis." Int J Gynecol Cancer 24(6): 1054-1064.
212!
Hubbi, M. E., Hu, H., Kshitiz, Gilkes, D. M. and Semenza, G. L. (2013). "Sirtuin-7 inhibits the activity of hypoxia-inducible factors." J Biol Chem 288(29): 20768-20775.
Hudes, G., Carducci, M., Tomczak, P., Dutcher, J., Figlin, R., Kapoor, A., Staroslawska, E., Sosman, J., McDermott, D., Bodrogi, I., Kovacevic, Z., Lesovoy, V., Schmidt-Wolf, I. G., Barbarash, O., Gokmen, E., O'Toole, T., Lustgarten, S., Moore, L., Motzer, R. J. and Global, A. T. (2007). "Temsirolimus, interferon alfa, or both for advanced renal-cell carcinoma." N Engl J Med 356(22): 2271-2281.
Hur, E., Kim, H. H., Choi, S. M., Kim, J. H., Yim, S., Kwon, H. J., Choi, Y., Kim, D. K., Lee, M. O. and Park, H. (2002). "Reduction of hypoxia-induced transcription through the repression of hypoxia-inducible factor-1alpha/aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator DNA binding by the 90-kDa heat-shock protein inhibitor radicicol." Mol Pharmacol 62(5): 975-982.
Iakovlev, V. V., Gabril, M., Dubinski, W., Scorilas, A., Youssef, Y. M., Faragalla, H., Kovacs, K., Rotondo, F., Metias, S., Arsanious, A., Plotkin, A., Girgis, A. H., Streutker, C. J. and Yousef, G. M. (2012). "Microvascular density as an independent predictor of clinical outcome in renal cell carcinoma: an automated image analysis study." Lab Invest 92(1): 46-56.
Igarashi, J., Erwin, P. A., Dantas, A. P., Chen, H. and Michel, T. (2003a). "VEGF induces S1P1 receptors in endothelial cells: Implications for cross-talk between sphingolipid and growth factor receptors." Proc Natl Acad Sci U S A 100(19): 10664-10669.
Igarashi, N., Okada, T., Hayashi, S., Fujita, T., Jahangeer, S. and Nakamura, S. (2003b). "Sphingosine kinase 2 is a nuclear protein and inhibits DNA synthesis." J Biol Chem 278(47): 46832-46839.
Igarashi, Y., Hakomori, S., Toyokuni, T., Dean, B., Fujita, S., Sugimoto, M., Ogawa, T., el-Ghendy, K. and Racker, E. (1989). "Effect of chemically well-defined sphingosine and its N-methyl derivatives on protein kinase C and src kinase activities." Biochemistry 28(17): 6796-6800.
Ikeda, H., Watanabe, N., Ishii, I., Shimosawa, T., Kume, Y., Tomiya, T., Inoue, Y., Nishikawa, T., Ohtomo, N., Tanoue, Y., Iitsuka, S., Fujita, R., Omata, M., Chun, J. and Yatomi, Y. (2009). "Sphingosine 1-phosphate regulates regeneration and fibrosis after liver injury via sphingosine 1-phosphate receptor 2." J Lipid Res 50(3): 556-564.
Iliopoulos, O., Kibel, A., Gray, S. and Kaelin, W. G., Jr. (1995). "Tumour suppression by the human von Hippel-Lindau gene product." Nat Med 1(8): 822-826.
Iliopoulos, O., Levy, A. P., Jiang, C., Kaelin, W. G., Jr. and Goldberg, M. A. (1996). "Negative regulation of hypoxia-inducible genes by the von Hippel-Lindau protein." Proc Natl Acad Sci U S A 93(20): 10595-10599.
Im, D. S., Clemens, J., Macdonald, T. L. and Lynch, K. R. (2001). "Characterization of the human and mouse sphingosine 1-phosphate receptor, S1P5 (Edg-8): structure-activity relationship of sphingosine1-phosphate receptors." Biochemistry 40(46): 14053-14060.
Inagaki, Y., Li, P. Y., Wada, A., Mitsutake, S. and Igarashi, Y. (2003). "Identification of functional nuclear export sequences in human sphingosine kinase 1." Biochem Biophys Res Commun 311(1): 168-173.
Isaacs, J. S., Jung, Y. J., Mimnaugh, E. G., Martinez, A., Cuttitta, F. and Neckers, L. M. (2002). "Hsp90 regulates a von Hippel Lindau-independent hypoxia-inducible factor-1 alpha-degradative pathway." J Biol Chem 277(33): 29936-29944.
Ishikawa, F., Yoshida, S., Saito, Y., Hijikata, A., Kitamura, H., Tanaka, S., Nakamura, R., Tanaka, T., Tomiyama, H., Saito, N., Fukata, M., Miyamoto, T., Lyons, B., Ohshima, K., Uchida, N., Taniguchi, S., Ohara, O., Akashi, K., Harada, M. and Shultz, L. D. (2007). "Chemotherapy-resistant human AML stem cells home to and engraft within the bone-marrow endosteal region." Nat Biotechnol 25(11): 1315-1321.
Ivan, M. and Kaelin, W. G., Jr. (2001). "The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein." Curr Opin Genet Dev 11(1): 27-34.
213!
Ivan, M., Kondo, K., Yang, H., Kim, W., Valiando, J., Ohh, M., Salic, A., Asara, J. M., Lane, W. S. and Kaelin, W. G., Jr. (2001). "HIFalpha targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: implications for O2 sensing." Science 292(5516): 464-468.
Iyer, N. V., Kotch, L. E., Agani, F., Leung, S. W., Laughner, E., Wenger, R. H., Gassmann, M., Gearhart, J. D., Lawler, A. M., Yu, A. Y. and Semenza, G. L. (1998). "Cellular and developmental control of O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1 alpha." Genes Dev 12(2): 149-162.
Izumi, Y., Xu, L., di Tomaso, E., Fukumura, D. and Jain, R. K. (2002). "Tumour biology: herceptin acts as an anti-angiogenic cocktail." Nature 416(6878): 279-280.
Jaakkola, P., Mole, D. R., Tian, Y. M., Wilson, M. I., Gielbert, J., Gaskell, S. J., von Kriegsheim, A., Hebestreit, H. F., Mukherji, M., Schofield, C. J., Maxwell, P. H., Pugh, C. W. and Ratcliffe, P. J. (2001). "Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation." Science 292(5516): 468-472.
Jaillard, C., Harrison, S., Stankoff, B., Aigrot, M. S., Calver, A. R., Duddy, G., Walsh, F. S., Pangalos, M. N., Arimura, N., Kaibuchi, K., Zalc, B. and Lubetzki, C. (2005). "Edg8/S1P5: an oligodendroglial receptor with dual function on process retraction and cell survival." J Neurosci 25(6): 1459-1469.
Jain, R. K. (1988). "Determinants of tumor blood flow: a review." Cancer Res 48(10): 2641-2658.
Jain, R. K. (2001). "Normalizing tumor vasculature with anti-angiogenic therapy: a new paradigm for combination therapy." Nat Med 7(9): 987-989.
Jain, R. K. (2005). "Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy." Science 307(5706): 58-62.
Jain, R. K. (2014). "Antiangiogenesis strategies revisited: from starving tumors to alleviating hypoxia." Cancer Cell 26(5): 605-622.
Jain, R. K., Duda, D. G., Clark, J. W. and Loeffler, J. S. (2006). "Lessons from phase III clinical trials on anti-VEGF therapy for cancer." Nat Clin Pract Oncol 3(1): 24-40.
Jakobsson, L., Franco, C. A., Bentley, K., Collins, R. T., Ponsioen, B., Aspalter, I. M., Rosewell, I., Busse, M., Thurston, G., Medvinsky, A., Schulte-Merker, S. and Gerhardt, H. (2010). "Endothelial cells dynamically compete for the tip cell position during angiogenic sprouting." Nat Cell Biol 12(10): 943-953.
Jarman, K. E., Moretti, P. A., Zebol, J. R. and Pitson, S. M. (2010). "Translocation of sphingosine kinase 1 to the plasma membrane is mediated by calcium- and integrin-binding protein 1." J Biol Chem 285(1): 483-492.
Jenne, C. N., Enders, A., Rivera, R., Watson, S. R., Bankovich, A. J., Pereira, J. P., Xu, Y., Roots, C. M., Beilke, J. N., Banerjee, A., Reiner, S. L., Miller, S. A., Weinmann, A. S., Goodnow, C. C., Lanier, L. L., Cyster, J. G. and Chun, J. (2009). "T-bet-dependent S1P5 expression in NK cells promotes egress from lymph nodes and bone marrow." J Exp Med 206(11): 2469-2481.
Jeong, W., Park, S. R., Rapisarda, A., Fer, N., Kinders, R. J., Chen, A., Melillo, G., Turkbey, B., Steinberg, S. M., Choyke, P., Doroshow, J. H. and Kummar, S. (2014a). "Weekly EZN-2208 (PEGylated SN-38) in combination with bevacizumab in patients with refractory solid tumors." Invest New Drugs 32(2): 340-346.
Jeong, W., Rapisarda, A., Park, S. R., Kinders, R. J., Chen, A., Melillo, G., Turkbey, B., Steinberg, S. M., Choyke, P., Doroshow, J. H. and Kummar, S. (2014b). "Pilot trial of EZN-2968, an antisense oligonucleotide inhibitor of hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1alpha), in patients with refractory solid tumors." Cancer Chemother Pharmacol 73(2): 343-348.
Jiang, B. H., Semenza, G. L., Bauer, C. and Marti, H. H. (1996). "Hypoxia-inducible factor 1 levels vary exponentially over a physiologically relevant range of O2 tension." Am J Physiol 271(4 Pt 1): C1172-1180.
214!
Jiang, X., Khan, M. A., Tian, W., Beilke, J., Natarajan, R., Kosek, J., Yoder, M. C., Semenza, G. L. and Nicolls, M. R. (2011). "Adenovirus-mediated HIF-1alpha gene transfer promotes repair of mouse airway allograft microvasculature and attenuates chronic rejection." J Clin Invest 121(6): 2336-2349.
Johnson, D. B., Solomon, S. B., Su, L. M., Matsumoto, E. D., Kavoussi, L. R., Nakada, S. Y., Moon, T. D., Shingleton, W. B. and Cadeddu, J. A. (2004). "Defining the complications of cryoablation and radio frequency ablation of small renal tumors: a multi-institutional review." J Urol 172(3): 874-877.
Johnson, K. R., Becker, K. P., Facchinetti, M. M., Hannun, Y. A. and Obeid, L. M. (2002). "PKC-dependent activation of sphingosine kinase 1 and translocation to the plasma membrane. Extracellular release of sphingosine-1-phosphate induced by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)." J Biol Chem 277(38): 35257-35262.
Johnson, K. R., Johnson, K. Y., Crellin, H. G., Ogretmen, B., Boylan, A. M., Harley, R. A. and Obeid, L. M. (2005). "Immunohistochemical distribution of sphingosine kinase 1 in normal and tumor lung tissue." J Histochem Cytochem 53(9): 1159-1166.
Jonasch, E., Gao, J. and Rathmell, W. K. (2014). "Renal cell carcinoma." BMJ 349: g4797.
Juliano, R. L. and Ling, V. (1976). "A surface glycoprotein modulating drug permeability in Chinese hamster ovary cell mutants." Biochim Biophys Acta 455(1): 152-162.
Kaelin, W. G., Jr. (2007). "The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein and clear cell renal carcinoma." Clin Cancer Res 13(2 Pt 2): 680s-684s.
Kaidi, A., Williams, A. C. and Paraskeva, C. (2007). "Interaction between beta-catenin and HIF-1 promotes cellular adaptation to hypoxia." Nat Cell Biol 9(2): 210-217.
Kalhori, V., Kemppainen, K., Asghar, M. Y., Bergelin, N., Jaakkola, P. and Tornquist, K. (2013). "Sphingosine-1-Phosphate as a Regulator of Hypoxia-Induced Factor-1alpha in Thyroid Follicular Carcinoma Cells." PLoS One 8(6): e66189.
Kallio, P. J., Pongratz, I., Gradin, K., McGuire, J. and Poellinger, L. (1997). "Activation of hypoxia-inducible factor 1alpha: posttranscriptional regulation and conformational change by recruitment of the Arnt transcription factor." Proc Natl Acad Sci U S A 94(11): 5667-5672.
Kamura, T., Sato, S., Iwai, K., Czyzyk-Krzeska, M., Conaway, R. C. and Conaway, J. W. (2000). "Activation of HIF1alpha ubiquitination by a reconstituted von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor complex." Proc Natl Acad Sci U S A 97(19): 10430-10435.
Kapitonov, D., Allegood, J. C., Mitchell, C., Hait, N. C., Almenara, J. A., Adams, J. K., Zipkin, R. E., Dent, P., Kordula, T., Milstien, S. and Spiegel, S. (2009). "Targeting sphingosine kinase 1 inhibits Akt signaling, induces apoptosis, and suppresses growth of human glioblastoma cells and xenografts." Cancer Res 69(17): 6915-6923.
Kapitsinou, P. P., Liu, Q., Unger, T. L., Rha, J., Davidoff, O., Keith, B., Epstein, J. A., Moores, S. L., Erickson-Miller, C. L. and Haase, V. H. (2010). "Hepatic HIF-2 regulates erythropoietic responses to hypoxia in renal anemia." Blood 116(16): 3039-3048.
Kausch, I., Jiang, H., Thode, B., Doehn, C., Kruger, S. and Jocham, D. (2005). "Inhibition of bcl-2 enhances the efficacy of chemotherapy in renal cell carcinoma." Eur Urol 47(5): 703-709.
Kawahara, A., Nishi, T., Hisano, Y., Fukui, H., Yamaguchi, A. and Mochizuki, N. (2009). "The sphingolipid transporter spns2 functions in migration of zebrafish myocardial precursors." Science 323(5913): 524-527.
Kawanaka, T., Kubo, A., Ikushima, H., Sano, T., Takegawa, Y. and Nishitani, H. (2008). "Prognostic significance of HIF-2alpha expression on tumor infiltrating macrophages in patients with uterine cervical cancer undergoing radiotherapy." J Med Invest 55(1-2): 78-86.
215!
Keenan, R. W. and Maxam, A. (1969). "The in vitro degradation of dihydrosphingosine." Biochim Biophys Acta 176(2): 348-356.
Keith, B., Johnson, R. S. and Simon, M. C. (2012). "HIF1alpha and HIF2alpha: sibling rivalry in hypoxic tumour growth and progression." Nat Rev Cancer 12(1): 9-22.
Keith, B. and Simon, M. C. (2007). "Hypoxia-inducible factors, stem cells, and cancer." Cell 129(3): 465-472.
Kelly, B. D., Hackett, S. F., Hirota, K., Oshima, Y., Cai, Z., Berg-Dixon, S., Rowan, A., Yan, Z., Campochiaro, P. A. and Semenza, G. L. (2003). "Cell type-specific regulation of angiogenic growth factor gene expression and induction of angiogenesis in nonischemic tissue by a constitutively active form of hypoxia-inducible factor 1." Circ Res 93(11): 1074-1081.
Keul, P., Lucke, S., von Wnuck Lipinski, K., Bode, C., Graler, M., Heusch, G. and Levkau, B. (2011). "Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes recruitment of monocyte/macrophages in inflammation and atherosclerosis." Circ Res 108(3): 314-323.
Kim, J. W., Tchernyshyov, I., Semenza, G. L. and Dang, C. V. (2006a). "HIF-1-mediated expression of pyruvate dehydrogenase kinase: a metabolic switch required for cellular adaptation to hypoxia." Cell Metab 3(3): 177-185.
Kim, S. J., Rabbani, Z. N., Dewhirst, M. W., Vujaskovic, Z., Vollmer, R. T., Schreiber, E. G., Oosterwijk, E. and Kelley, M. J. (2005). "Expression of HIF-1alpha, CA IX, VEGF, and MMP-9 in surgically resected non-small cell lung cancer." Lung Cancer 49(3): 325-335.
Kim, W. Y., Safran, M., Buckley, M. R., Ebert, B. L., Glickman, J., Bosenberg, M., Regan, M. and Kaelin, W. G., Jr. (2006b). "Failure to prolyl hydroxylate hypoxia-inducible factor alpha phenocopies VHL inactivation in vivo." EMBO J 25(19): 4650-4662.
King, A., Selak, M. A. and Gottlieb, E. (2006). "Succinate dehydrogenase and fumarate hydratase: linking mitochondrial dysfunction and cancer." Oncogene 25(34): 4675-4682.
Kitano, M., Hla, T., Sekiguchi, M., Kawahito, Y., Yoshimura, R., Miyazawa, K., Iwasaki, T., Sano, H., Saba, J. D. and Tam, Y. Y. (2006). "Sphingosine 1-phosphate/sphingosine 1-phosphate receptor 1 signaling in rheumatoid synovium: regulation of synovial proliferation and inflammatory gene expression." Arthritis Rheum 54(3): 742-753.
Klatte, T., Pantuck, A. J., Said, J. W., Seligson, D. B., Rao, N. P., LaRochelle, J. C., Shuch, B., Zisman, A., Kabbinavar, F. F. and Belldegrun, A. S. (2009). "Cytogenetic and molecular tumor profiling for type 1 and type 2 papillary renal cell carcinoma." Clin Cancer Res 15(4): 1162-1169.
Klatte, T., Seligson, D. B., Riggs, S. B., Leppert, J. T., Berkman, M. K., Kleid, M. D., Yu, H., Kabbinavar, F. F., Pantuck, A. J. and Belldegrun, A. S. (2007). "Hypoxia-inducible factor 1 alpha in clear cell renal cell carcinoma." Clin Cancer Res 13(24): 7388-7393.
Kleuser, B., Cuvillier, O. and Spiegel, S. (1998). "1Alpha,25-dihydroxyvitamin D3 inhibits programmed cell death in HL-60 cells by activation of sphingosine kinase." Cancer Res 58(9): 1817-1824.
Kleuser, B., Maceyka, M., Milstien, S. and Spiegel, S. (2001). "Stimulation of nuclear sphingosine kinase activity by platelet-derived growth factor." FEBS Lett 503(1): 85-90.
Klimova, T. and Chandel, N. S. (2008). "Mitochondrial complex III regulates hypoxic activation of HIF." Cell Death Differ 15(4): 660-666.
Koga, F., Kihara, K. and Neckers, L. (2009). "Inhibition of cancer invasion and metastasis by targeting the molecular chaperone heat-shock protein 90." Anticancer Res 29(3): 797-807.
216!
Koh, M. Y., Darnay, B. G. and Powis, G. (2008a). "Hypoxia-associated factor, a novel E3-ubiquitin ligase, binds and ubiquitinates hypoxia-inducible factor 1alpha, leading to its oxygen-independent degradation." Mol Cell Biol 28(23): 7081-7095.
Koh, M. Y., Lemos, R., Jr., Liu, X. and Powis, G. (2011). "The hypoxia-associated factor switches cells from HIF-1alpha- to HIF-2alpha-dependent signaling promoting stem cell characteristics, aggressive tumor growth and invasion." Cancer Res 71(11): 4015-4027.
Koh, M. Y. and Powis, G. (2009). "HAF : the new player in oxygen-independent HIF-1alpha degradation." Cell Cycle 8(9): 1359-1366.
Koh, M. Y., Spivak-Kroizman, T., Venturini, S., Welsh, S., Williams, R. R., Kirkpatrick, D. L. and Powis, G. (2008b). "Molecular mechanisms for the activity of PX-478, an antitumor inhibitor of the hypoxia-inducible factor-1alpha." Mol Cancer Ther 7(1): 90-100.
Kohama, T., Olivera, A., Edsall, L., Nagiec, M. M., Dickson, R. and Spiegel, S. (1998). "Molecular cloning and functional characterization of murine sphingosine kinase." J Biol Chem 273(37): 23722-23728.
Kondo, K., Kim, W. Y., Lechpammer, M. and Kaelin, W. G., Jr. (2003). "Inhibition of HIF2alpha is sufficient to suppress pVHL-defective tumor growth." PLoS Biol 1(3): E83.
Kondo, K., Klco, J., Nakamura, E., Lechpammer, M. and Kaelin, W. G., Jr. (2002). "Inhibition of HIF is necessary for tumor suppression by the von Hippel-Lindau protein." Cancer Cell 1(3): 237-246.
Kong, D., Park, E. J., Stephen, A. G., Calvani, M., Cardellina, J. H., Monks, A., Fisher, R. J., Shoemaker, R. H. and Melillo, G. (2005). "Echinomycin, a small-molecule inhibitor of hypoxia-inducible factor-1 DNA-binding activity." Cancer Res 65(19): 9047-9055.
Kono, K., Sugiura, M. and Kohama, T. (2002). "Inhibition of recombinant sphingosine kinases by novel inhibitors of microbial origin, F-12509A and B-5354c." J Antibiot (Tokyo) 55(1): 99-103.
Kono, K., Tanaka, M., Ogita, T., Hosoya, T. and Kohama, T. (2000a). "F-12509A, a new sphingosine kinase inhibitor, produced by a discomycete." J Antibiot (Tokyo) 53(5): 459-466.
Kono, K., Tanaka, M., Ogita, T. and Kohama, T. (2000b). "Characterization of B-5354c, a new sphingosine kinase inhibitor, produced by a marine bacterium." J Antibiot (Tokyo) 53(8): 759-764.
Kono, M., Belyantseva, I. A., Skoura, A., Frolenkov, G. I., Starost, M. F., Dreier, J. L., Lidington, D., Bolz, S. S., Friedman, T. B., Hla, T. and Proia, R. L. (2007). "Deafness and stria vascularis defects in S1P2 receptor-null mice." J Biol Chem 282(14): 10690-10696.
Kono, M., Mi, Y., Liu, Y., Sasaki, T., Allende, M. L., Wu, Y. P., Yamashita, T. and Proia, R. L. (2004). "The sphingosine-1-phosphate receptors S1P1, S1P2, and S1P3 function coordinately during embryonic angiogenesis." J Biol Chem 279(28): 29367-29373.
Korkolopoulou, P., Patsouris, E., Konstantinidou, A. E., Pavlopoulos, P. M., Kavantzas, N., Boviatsis, E., Thymara, I., Perdiki, M., Thomas-Tsagli, E., Angelidakis, D., Rologis, D. and Sakkas, D. (2004). "Hypoxia-inducible factor 1alpha/vascular endothelial growth factor axis in astrocytomas. Associations with microvessel morphometry, proliferation and prognosis." Neuropathol Appl Neurobiol 30(3): 267-278.
Koshiji, M., Kageyama, Y., Pete, E. A., Horikawa, I., Barrett, J. C. and Huang, L. E. (2004). "HIF-1alpha induces cell cycle arrest by functionally counteracting Myc." EMBO J 23(9): 1949-1956.
Kothapalli, R., Kusmartseva, I. and Loughran, T. P. (2002). "Characterization of a human sphingosine-1-phosphate receptor gene (S1P5) and its differential expression in LGL leukemia." Biochim Biophys Acta 1579(2-3): 117-123.
217!
Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Sivridis, E., Simopoulos, C., Turley, H., Talks, K., Gatter, K. C. and Harris, A. L. (2002). "Hypoxia-inducible factor (HIF1A and HIF2A), angiogenesis, and chemoradiotherapy outcome of squamous cell head-and-neck cancer." Int J Radiat Oncol Biol Phys 53(5): 1192-1202.
Kroeger, N., Seligson, D. B., Signoretti, S., Yu, H., Magyar, C. E., Huang, J., Belldegrun, A. S. and Pantuck, A. J. (2014). "Poor prognosis and advanced clinicopathological features of clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) are associated with cytoplasmic subcellular localisation of Hypoxia inducible factor-2alpha." Eur J Cancer 50(8): 1531-1540.
Kummar, S., Raffeld, M., Juwara, L., Horneffer, Y., Strassberger, A., Allen, D., Steinberg, S. M., Rapisarda, A., Spencer, S. D., Figg, W. D., Chen, X., Turkbey, I. B., Choyke, P., Murgo, A. J., Doroshow, J. H. and Melillo, G. (2011). "Multihistology, target-driven pilot trial of oral topotecan as an inhibitor of hypoxia-inducible factor-1alpha in advanced solid tumors." Clin Cancer Res 17(15): 5123-5131.
Kung, A. L., Zabludoff, S. D., France, D. S., Freedman, S. J., Tanner, E. A., Vieira, A., Cornell-Kennon, S., Lee, J., Wang, B., Wang, J., Memmert, K., Naegeli, H. U., Petersen, F., Eck, M. J., Bair, K. W., Wood, A. W. and Livingston, D. M. (2004). "Small molecule blockade of transcriptional coactivation of the hypoxia-inducible factor pathway." Cancer Cell 6(1): 33-43.
LaMontagne, K., Littlewood-Evans, A., Schnell, C., O'Reilly, T., Wyder, L., Sanchez, T., Probst, B., Butler, J., Wood, A., Liau, G., Billy, E., Theuer, A., Hla, T. and Wood, J. (2006). "Antagonism of sphingosine-1-phosphate receptors by FTY720 inhibits angiogenesis and tumor vascularization." Cancer Res 66(1): 221-231.
Lando, D., Peet, D. J., Gorman, J. J., Whelan, D. A., Whitelaw, M. L. and Bruick, R. K. (2002a). "FIH-1 is an asparaginyl hydroxylase enzyme that regulates the transcriptional activity of hypoxia-inducible factor." Genes Dev 16(12): 1466-1471.
Lando, D., Peet, D. J., Whelan, D. A., Gorman, J. J. and Whitelaw, M. L. (2002b). "Asparagine hydroxylation of the HIF transactivation domain a hypoxic switch." Science 295(5556): 858-861.
Lapidot, T., Sirard, C., Vormoor, J., Murdoch, B., Hoang, T., Caceres-Cortes, J., Minden, M., Paterson, B., Caligiuri, M. A. and Dick, J. E. (1994). "A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice." Nature 367(6464): 645-648.
Latif, F., Tory, K., Gnarra, J., Yao, M., Duh, F. M., Orcutt, M. L., Stackhouse, T., Kuzmin, I., Modi, W., Geil, L. and et al. (1993). "Identification of the von Hippel-Lindau disease tumor suppressor gene." Science 260(5112): 1317-1320.
Laughner, E., Taghavi, P., Chiles, K., Mahon, P. C. and Semenza, G. L. (2001). "HER2 (neu) signaling increases the rate of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1alpha) synthesis: novel mechanism for HIF-1-mediated vascular endothelial growth factor expression." Mol Cell Biol 21(12): 3995-4004.
Lavieu, G., Scarlatti, F., Sala, G., Carpentier, S., Levade, T., Ghidoni, R., Botti, J. and Codogno, P. (2006). "Regulation of autophagy by sphingosine kinase 1 and its role in cell survival during nutrient starvation." J Biol Chem 281(13): 8518-8527.
Leclercq, T. M., Moretti, P. A., Vadas, M. A. and Pitson, S. M. (2008). "Eukaryotic elongation factor 1A interacts with sphingosine kinase and directly enhances its catalytic activity." J Biol Chem 283(15): 9606-9614.
Lee, H., Deng, J., Kujawski, M., Yang, C., Liu, Y., Herrmann, A., Kortylewski, M., Horne, D., Somlo, G., Forman, S., Jove, R. and Yu, H. (2010). "STAT3-induced S1PR1 expression is crucial for persistent STAT3 activation in tumors." Nat Med 16(12): 1421-1428.
Lee, K., Qian, D. Z., Rey, S., Wei, H., Liu, J. O. and Semenza, G. L. (2009a). "Anthracycline chemotherapy inhibits HIF-1 transcriptional activity and tumor-induced mobilization of circulating angiogenic cells." Proc Natl Acad Sci U S A 106(7): 2353-2358.
218!
Lee, K., Zhang, H., Qian, D. Z., Rey, S., Liu, J. O. and Semenza, G. L. (2009b). "Acriflavine inhibits HIF-1 dimerization, tumor growth, and vascularization." Proc Natl Acad Sci U S A 106(42): 17910-17915.
Lee, M. J., Evans, M. and Hla, T. (1996). "The inducible G protein-coupled receptor edg-1 signals via the G(i)/mitogen-activated protein kinase pathway." J Biol Chem 271(19): 11272-11279.
Lee, M. J., Thangada, S., Claffey, K. P., Ancellin, N., Liu, C. H., Kluk, M., Volpi, M., Sha'afi, R. I. and Hla, T. (1999a). "Vascular endothelial cell adherens junction assembly and morphogenesis induced by sphingosine-1-phosphate." Cell 99(3): 301-312.
Lee, O. H., Kim, Y. M., Lee, Y. M., Moon, E. J., Lee, D. J., Kim, J. H., Kim, K. W. and Kwon, Y. G. (1999b). "Sphingosine 1-phosphate induces angiogenesis: its angiogenic action and signaling mechanism in human umbilical vein endothelial cells." Biochem Biophys Res Commun 264(3): 743-750.
Lee, S. H., Jee, J. G., Bae, J. S., Liu, K. H. and Lee, Y. M. (2015a). "A group of novel HIF-1alpha inhibitors, glyceollins, blocks HIF-1alpha synthesis and decreases its stability via inhibition of the PI3K/AKT/mTOR pathway and Hsp90 binding." J Cell Physiol 230(4): 853-862.
Lee, Y. H., Bae, H. C., Noh, K. H., Song, K. H., Ye, S. K., Mao, C. P., Lee, K. M., Wu, T. C. and Kim, T. W. (2015b). "Gain of HIF-1alpha under Normoxia in Cancer Mediates Immune Adaptation through the AKT/ERK and VEGFA Axes." Clin Cancer Res 21(6): 1438-1446.
Leite de Oliveira, R., Deschoemaeker, S., Henze, A. T., Debackere, K., Finisguerra, V., Takeda, Y., Roncal, C., Dettori, D., Tack, E., Jonsson, Y., Veschini, L., Peeters, A., Anisimov, A., Hofmann, M., Alitalo, K., Baes, M., D'Hooge, J., Carmeliet, P. and Mazzone, M. (2012). "Gene-targeting of Phd2 improves tumor response to chemotherapy and prevents side-toxicity." Cancer Cell 22(2): 263-277.
Lepley, D., Paik, J. H., Hla, T. and Ferrer, F. (2005). "The G protein-coupled receptor S1P2 regulates Rho/Rho kinase pathway to inhibit tumor cell migration." Cancer Res 65(9): 3788-3795.
Levkau, B., Hermann, S., Theilmeier, G., van der Giet, M., Chun, J., Schober, O. and Schafers, M. (2004). "High-density lipoprotein stimulates myocardial perfusion in vivo." Circulation 110(21): 3355-3359.
Li, S. H., Shin, D. H., Chun, Y. S., Lee, M. K., Kim, M. S. and Park, J. W. (2008). "A novel mode of action of YC-1 in HIF inhibition: stimulation of FIH-dependent p300 dissociation from HIF-1{alpha}." Mol Cancer Ther 7(12): 3729-3738.
Li, Y., Li, S., Qin, X., Hou, W., Dong, H., Yao, L. and Xiong, L. (2014). "The pleiotropic roles of sphingolipid signaling in autophagy." Cell Death Dis 5: e1245.
Li, Z., Bao, S., Wu, Q., Wang, H., Eyler, C., Sathornsumetee, S., Shi, Q., Cao, Y., Lathia, J., McLendon, R. E., Hjelmeland, A. B. and Rich, J. N. (2009). "Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells." Cancer Cell 15(6): 501-513.
Liang, J., Nagahashi, M., Kim, E. Y., Harikumar, K. B., Yamada, A., Huang, W. C., Hait, N. C., Allegood, J. C., Price, M. M., Avni, D., Takabe, K., Kordula, T., Milstien, S. and Spiegel, S. (2013). "Sphingosine-1-phosphate links persistent STAT3 activation, chronic intestinal inflammation, and development of colitis-associated cancer." Cancer Cell 23(1): 107-120.
Lidgren, A., Hedberg, Y., Grankvist, K., Rasmuson, T., Vasko, J. and Ljungberg, B. (2005). "The expression of hypoxia-inducible factor 1alpha is a favorable independent prognostic factor in renal cell carcinoma." Clin Cancer Res 11(3): 1129-1135.
Lilleby, W. and Fossa, S. D. (2005). "Chemotherapy in metastatic renal cell cancer." World J Urol 23(3): 175-179.
Lim, J. H., Lee, Y. M., Chun, Y. S., Chen, J., Kim, J. E. and Park, J. W. (2010). "Sirtuin 1 modulates cellular responses to hypoxia by deacetylating hypoxia-inducible factor 1alpha." Mol Cell 38(6): 864-878.
219!
Lim, K. G., Tonelli, F., Li, Z., Lu, X., Bittman, R., Pyne, S. and Pyne, N. J. (2011). "FTY720 analogues as sphingosine kinase 1 inhibitors: enzyme inhibition kinetics, allosterism, proteasomal degradation, and actin rearrangement in MCF-7 breast cancer cells." J Biol Chem 286(21): 18633-18640.
Limaye, V., Li, X., Hahn, C., Xia, P., Berndt, M. C., Vadas, M. A. and Gamble, J. R. (2005). "Sphingosine kinase-1 enhances endothelial cell survival through a PECAM-1-dependent activation of PI-3K/Akt and regulation of Bcl-2 family members." Blood 105(8): 3169-3177.
Lin, J., Zhan, T., Duffy, D., Hoffman-Censits, J., Kilpatrick, D., Trabulsi, E. J., Lallas, C. D., Chervoneva, I., Limentani, K., Kennedy, B., Kessler, S., Gomella, L., Antonarakis, E. S., Carducci, M. A., Force, T. and Kelly, W. K. (2014a). "A pilot phase II Study of digoxin in patients with recurrent prostate cancer as evident by a rising PSA." Am J Cancer Ther Pharmacol 2(1): 21-32.
Lin, Q., Huang, Y., Booth, C. J., Haase, V. H., Johnson, R. S., Celeste Simon, M., Giordano, F. J. and Yun, Z. (2013). "Activation of hypoxia-inducible factor-2 in adipocytes results in pathological cardiac hypertrophy." J Am Heart Assoc 2(6): e000548.
Lin, S., Ma, R., Zheng, X. Y., Yu, H., Liang, X., Lin, H. and Cai, X. J. (2014b). "Meta-analysis of immunohistochemical expression of hypoxia inducible factor-1alpha as a prognostic role in gastric cancer." World J Gastroenterol 20(4): 1107-1113.
Lindau, A. (1927). "Zur frage der angiomatosis retinae und ihrer hirncomplikation." Acta Ophthalmol. Scand. 4: 193-226.
Liu, G., Burns, S., Huang, G., Boyd, K., Proia, R. L., Flavell, R. A. and Chi, H. (2009). "The receptor S1P1 overrides regulatory T cell-mediated immune suppression through Akt-mTOR." Nat Immunol 10(7): 769-777.
Liu, H., Sugiura, M., Nava, V. E., Edsall, L. C., Kono, K., Poulton, S., Milstien, S., Kohama, T. and Spiegel, S. (2000a). "Molecular cloning and functional characterization of a novel mammalian sphingosine kinase type 2 isoform." J Biol Chem 275(26): 19513-19520.
Liu, H., Toman, R. E., Goparaju, S. K., Maceyka, M., Nava, V. E., Sankala, H., Payne, S. G., Bektas, M., Ishii, I., Chun, J., Milstien, S. and Spiegel, S. (2003a). "Sphingosine kinase type 2 is a putative BH3-only protein that induces apoptosis." J Biol Chem 278(41): 40330-40336.
Liu, L. Z., Hu, X. W., Xia, C., He, J., Zhou, Q., Shi, X., Fang, J. and Jiang, B. H. (2006). "Reactive oxygen species regulate epidermal growth factor-induced vascular endothelial growth factor and hypoxia-inducible factor-1alpha expression through activation of AKT and P70S6K1 in human ovarian cancer cells." Free Radic Biol Med 41(10): 1521-1533.
Liu, M. Y., Poellinger, L. and Walker, C. L. (2003b). "Up-regulation of hypoxia-inducible factor 2alpha in renal cell carcinoma associated with loss of Tsc-2 tumor suppressor gene." Cancer Res 63(10): 2675-2680.
Liu, Q., Galli, S., Srinivasan, R., Linehan, W. M., Tsokos, M. and Merino, M. J. (2013). "Renal medullary carcinoma: molecular, immunohistochemistry, and morphologic correlation." Am J Surg Pathol 37(3): 368-374.
Liu, R., Zhao, R., Zhou, X., Liang, X., Campbell, D. J., Zhang, X., Zhang, L., Shi, R., Wang, G., Pandak, W. M., Sirica, A. E., Hylemon, P. B. and Zhou, H. (2014). "Conjugated bile acids promote cholangiocarcinoma cell invasive growth through activation of sphingosine 1-phosphate receptor 2." Hepatology 60(3): 908-918.
Liu, Y., Wada, R., Yamashita, T., Mi, Y., Deng, C. X., Hobson, J. P., Rosenfeldt, H. M., Nava, V. E., Chae, S. S., Lee, M. J., Liu, C. H., Hla, T., Spiegel, S. and Proia, R. L. (2000b). "Edg-1, the G protein-coupled receptor for sphingosine-1-phosphate, is essential for vascular maturation." J Clin Invest 106(8): 951-961.
Liu, Y. V. and Semenza, G. L. (2007). "RACK1 vs. HSP90: competition for HIF-1 alpha degradation vs. stabilization." Cell Cycle 6(6): 656-659.
220!
Ljungberg, B., Bensalah, K., Canfield, S., Dabestani, S., Hofmann, F., Hora, M., Kuczyk, M. A., Lam, T., Marconi, L., Merseburger, A. S., Mulders, P., Powles, T., Staehler, M., Volpe, A. and Bex, A. (2015). "EAU Guidelines on Renal Cell Carcinoma: 2014 Update." Eur Urol.
Louie, D. D., Kisic, A. and Schroefer, G. J., Jr. (1976). "Sphingolipid base metabolism. Partial purification and properties of sphinganine kinase of brain." J Biol Chem 251(15): 4557-4564.
Luo, W., Zhong, J., Chang, R., Hu, H., Pandey, A. and Semenza, G. L. (2010). "Hsp70 and CHIP selectively mediate ubiquitination and degradation of hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha but Not HIF-2alpha." J Biol Chem 285(6): 3651-3663.
Luwor, R. B., Lu, Y., Li, X., Mendelsohn, J. and Fan, Z. (2005). "The antiepidermal growth factor receptor monoclonal antibody cetuximab/C225 reduces hypoxia-inducible factor-1 alpha, leading to transcriptional inhibition of vascular endothelial growth factor expression." Oncogene 24(27): 4433-4441.
Mabjeesh, N. J., Escuin, D., LaVallee, T. M., Pribluda, V. S., Swartz, G. M., Johnson, M. S., Willard, M. T., Zhong, H., Simons, J. W. and Giannakakou, P. (2003). "2ME2 inhibits tumor growth and angiogenesis by disrupting microtubules and dysregulating HIF." Cancer Cell 3(4): 363-375.
Mabjeesh, N. J., Post, D. E., Willard, M. T., Kaur, B., Van Meir, E. G., Simons, J. W. and Zhong, H. (2002). "Geldanamycin induces degradation of hypoxia-inducible factor 1alpha protein via the proteosome pathway in prostate cancer cells." Cancer Res 62(9): 2478-2482.
Maceyka, M., Harikumar, K. B., Milstien, S. and Spiegel, S. (2012). "Sphingosine-1-phosphate signaling and its role in disease." Trends Cell Biol 22(1): 50-60.
Maceyka, M., Sankala, H., Hait, N. C., Le Stunff, H., Liu, H., Toman, R., Collier, C., Zhang, M., Satin, L. S., Merrill, A. H., Jr., Milstien, S. and Spiegel, S. (2005). "SphK1 and SphK2, sphingosine kinase isoenzymes with opposing functions in sphingolipid metabolism." J Biol Chem 280(44): 37118-37129.
Maceyka, M. and Spiegel, S. (2014). "Sphingolipid metabolites in inflammatory disease." Nature 510(7503): 58-67.
MacLennan, A. J., Browe, C. S., Gaskin, A. A., Lado, D. C. and Shaw, G. (1994). "Cloning and characterization of a putative G-protein coupled receptor potentially involved in development." Mol Cell Neurosci 5(3): 201-209.
MacLennan, A. J., Carney, P. R., Zhu, W. J., Chaves, A. H., Garcia, J., Grimes, J. R., Anderson, K. J., Roper, S. N. and Lee, N. (2001). "An essential role for the H218/AGR16/Edg-5/LP(B2) sphingosine 1-phosphate receptor in neuronal excitability." Eur J Neurosci 14(2): 203-209.
Maes, H., Kuchnio, A., Peric, A., Moens, S., Nys, K., De Bock, K., Quaegebeur, A., Schoors, S., Georgiadou, M., Wouters, J., Vinckier, S., Vankelecom, H., Garmyn, M., Vion, A. C., Radtke, F., Boulanger, C., Gerhardt, H., Dejana, E., Dewerchin, M., Ghesquiere, B., Annaert, W., Agostinis, P. and Carmeliet, P. (2014). "Tumor vessel normalization by chloroquine independent of autophagy." Cancer Cell 26(2): 190-206.
Maeurer, C., Holland, S., Pierre, S., Potstada, W. and Scholich, K. (2009). "Sphingosine-1-phosphate induced mTOR-activation is mediated by the E3-ubiquitin ligase PAM." Cell Signal 21(2): 293-300.
Maher, E. R., Neumann, H. P. and Richard, S. (2011). "von Hippel-Lindau disease: a clinical and scientific review." Eur J Hum Genet 19(6): 617-623.
Majmundar, A. J., Wong, W. J. and Simon, M. C. (2010). "Hypoxia-inducible factors and the response to hypoxic stress." Mol Cell 40(2): 294-309.
Majumder, P. K., Febbo, P. G., Bikoff, R., Berger, R., Xue, Q., McMahon, L. M., Manola, J., Brugarolas, J., McDonnell, T. J., Golub, T. R., Loda, M., Lane, H. A. and Sellers, W. R. (2004). "mTOR inhibition reverses
221!
Akt-dependent prostate intraepithelial neoplasia through regulation of apoptotic and HIF-1-dependent pathways." Nat Med 10(6): 594-601.
Mak, P., Leav, I., Pursell, B., Bae, D., Yang, X., Taglienti, C. A., Gouvin, L. M., Sharma, V. M. and Mercurio, A. M. (2010). "ERbeta impedes prostate cancer EMT by destabilizing HIF-1alpha and inhibiting VEGF-mediated snail nuclear localization: implications for Gleason grading." Cancer Cell 17(4): 319-332.
Makino, Y., Cao, R., Svensson, K., Bertilsson, G., Asman, M., Tanaka, H., Cao, Y., Berkenstam, A. and Poellinger, L. (2001). "Inhibitory PAS domain protein is a negative regulator of hypoxia-inducible gene expression." Nature 414(6863): 550-554.
Malavaud, B., Pchejetski, D., Mazerolles, C., de Paiva, G. R., Calvet, C., Doumerc, N., Pitson, S., Rischmann, P. and Cuvillier, O. (2010). "Sphingosine kinase-1 activity and expression in human prostate cancer resection specimens." Eur J Cancer 46(18): 3417-3424.
Malek, R. L., Toman, R. E., Edsall, L. C., Wong, S., Chiu, J., Letterle, C. A., Van Brocklyn, J. R., Milstien, S., Spiegel, S. and Lee, N. H. (2001). "Nrg-1 belongs to the endothelial differentiation gene family of G protein-coupled sphingosine-1-phosphate receptors." J Biol Chem 276(8): 5692-5699.
Maltepe, E., Schmidt, J. V., Baunoch, D., Bradfield, C. A. and Simon, M. C. (1997). "Abnormal angiogenesis and responses to glucose and oxygen deprivation in mice lacking the protein ARNT." Nature 386(6623): 403-407.
Manalo, D. J., Rowan, A., Lavoie, T., Natarajan, L., Kelly, B. D., Ye, S. Q., Garcia, J. G. and Semenza, G. L. (2005). "Transcriptional regulation of vascular endothelial cell responses to hypoxia by HIF-1." Blood 105(2): 659-669.
Mandala, S., Hajdu, R., Bergstrom, J., Quackenbush, E., Xie, J., Milligan, J., Thornton, R., Shei, G. J., Card, D., Keohane, C., Rosenbach, M., Hale, J., Lynch, C. L., Rupprecht, K., Parsons, W. and Rosen, H. (2002). "Alteration of lymphocyte trafficking by sphingosine-1-phosphate receptor agonists." Science 296(5566): 346-349.
Maniotis, A. J., Folberg, R., Hess, A., Seftor, E. A., Gardner, L. M., Pe'er, J., Trent, J. M., Meltzer, P. S. and Hendrix, M. J. (1999). "Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicry." Am J Pathol 155(3): 739-752.
Martin, C., Lafosse, J. M., Malavaud, B. and Cuvillier, O. (2010). "Sphingosine kinase-1 mediates androgen-induced osteoblast cell growth." Biochem Biophys Res Commun 391(1): 669-673.
Mastrandrea, L. D., Sessanna, S. M. and Laychock, S. G. (2005). "Sphingosine kinase activity and sphingosine-1 phosphate production in rat pancreatic islets and INS-1 cells: response to cytokines." Diabetes 54(5): 1429-1436.
Mathieu, J., Zhang, Z., Zhou, W., Wang, A. J., Heddleston, J. M., Pinna, C. M., Hubaud, A., Stadler, B., Choi, M., Bar, M., Tewari, M., Liu, A., Vessella, R., Rostomily, R., Born, D., Horwitz, M., Ware, C., Blau, C. A., Cleary, M. A., Rich, J. N. and Ruohola-Baker, H. (2011). "HIF induces human embryonic stem cell markers in cancer cells." Cancer Res 71(13): 4640-4652.
Matloubian, M., Lo, C. G., Cinamon, G., Lesneski, M. J., Xu, Y., Brinkmann, V., Allende, M. L., Proia, R. L. and Cyster, J. G. (2004). "Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1." Nature 427(6972): 355-360.
Matsuoka, Y., Nagahara, Y., Ikekita, M. and Shinomiya, T. (2003). "A novel immunosuppressive agent FTY720 induced Akt dephosphorylation in leukemia cells." Br J Pharmacol 138(7): 1303-1312.
Maxwell, P. H., Wiesener, M. S., Chang, G. W., Clifford, S. C., Vaux, E. C., Cockman, M. E., Wykoff, C. C., Pugh, C. W., Maher, E. R. and Ratcliffe, P. J. (1999). "The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis." Nature 399(6733): 271-275.
222!
Mayerhofer, M., Valent, P., Sperr, W. R., Griffin, J. D. and Sillaber, C. (2002). "BCR/ABL induces expression of vascular endothelial growth factor and its transcriptional activator, hypoxia inducible factor-1alpha, through a pathway involving phosphoinositide 3-kinase and the mammalian target of rapamycin." Blood 100(10): 3767-3775.
Maynard, M. A., Evans, A. J., Hosomi, T., Hara, S., Jewett, M. A. and Ohh, M. (2005). "Human HIF-3alpha4 is a dominant-negative regulator of HIF-1 and is down-regulated in renal cell carcinoma." FASEB J 19(11): 1396-1406.
Maynard, M. A., Evans, A. J., Shi, W., Kim, W. Y., Liu, F. F. and Ohh, M. (2007). "Dominant-negative HIF-3 alpha 4 suppresses VHL-null renal cell carcinoma progression." Cell Cycle 6(22): 2810-2816.
Mazumdar, J., Dondeti, V. and Simon, M. C. (2009). "Hypoxia-inducible factors in stem cells and cancer." J Cell Mol Med 13(11-12): 4319-4328.
Mazurek, N., Megidish, T., Hakomori, S. and Igarashi, Y. (1994). "Regulatory effect of phorbol esters on sphingosine kinase in BALB/C 3T3 fibroblasts (variant A31): demonstration of cell type-specific response--a preliminary note." Biochem Biophys Res Commun 198(1): 1-9.
Mazzone, M., Dettori, D., Leite de Oliveira, R., Loges, S., Schmidt, T., Jonckx, B., Tian, Y. M., Lanahan, A. A., Pollard, P., Ruiz de Almodovar, C., De Smet, F., Vinckier, S., Aragones, J., Debackere, K., Luttun, A., Wyns, S., Jordan, B., Pisacane, A., Gallez, B., Lampugnani, M. G., Dejana, E., Simons, M., Ratcliffe, P., Maxwell, P. and Carmeliet, P. (2009). "Heterozygous deficiency of PHD2 restores tumor oxygenation and inhibits metastasis via endothelial normalization." Cell 136(5): 839-851.
Mehling, M., Brinkmann, V., Antel, J., Bar-Or, A., Goebels, N., Vedrine, C., Kristofic, C., Kuhle, J., Lindberg, R. L. and Kappos, L. (2008). "FTY720 therapy exerts differential effects on T cell subsets in multiple sclerosis." Neurology 71(16): 1261-1267.
Melendez, A. J., Carlos-Dias, E., Gosink, M., Allen, J. M. and Takacs, L. (2000). "Human sphingosine kinase: molecular cloning, functional characterization and tissue distribution." Gene 251(1): 19-26.
Melillo, G. (2006). "Inhibiting hypoxia-inducible factor 1 for cancer therapy." Mol Cancer Res 4(9): 601-605.
Melillo, G. (2007). "Targeting hypoxia cell signaling for cancer therapy." Cancer Metastasis Rev 26(2): 341-352.
Metzen, E., Berchner-Pfannschmidt, U., Stengel, P., Marxsen, J. H., Stolze, I., Klinger, M., Huang, W. Q., Wotzlaw, C., Hellwig-Burgel, T., Jelkmann, W., Acker, H. and Fandrey, J. (2003a). "Intracellular localisation of human HIF-1 alpha hydroxylases: implications for oxygen sensing." J Cell Sci 116(Pt 7): 1319-1326.
Metzen, E., Zhou, J., Jelkmann, W., Fandrey, J. and Brune, B. (2003b). "Nitric oxide impairs normoxic degradation of HIF-1alpha by inhibition of prolyl hydroxylases." Mol Biol Cell 14(8): 3470-3481.
Meyer zu Heringdorf, D., Lass, H., Alemany, R., Laser, K. T., Neumann, E., Zhang, C., Schmidt, M., Rauen, U., Jakobs, K. H. and van Koppen, C. J. (1998). "Sphingosine kinase-mediated Ca2+ signalling by G-protein-coupled receptors." EMBO J 17(10): 2830-2837.
Meyer zu Heringdorf, D., Lass, H., Kuchar, I., Alemany, R., Guo, Y., Schmidt, M. and Jakobs, K. H. (1999). "Role of sphingosine kinase in Ca(2+) signalling by epidermal growth factor receptor." FEBS Lett 461(3): 217-222.
Meyer zu Heringdorf, D., Lass, H., Kuchar, I., Lipinski, M., Alemany, R., Rumenapp, U. and Jakobs, K. H. (2001). "Stimulation of intracellular sphingosine-1-phosphate production by G-protein-coupled sphingosine-1-phosphate receptors." Eur J Pharmacol 414(2-3): 145-154.
223!
Meyer zu Heringdorf, D., Liliom, K., Schaefer, M., Danneberg, K., Jaggar, J. H., Tigyi, G. and Jakobs, K. H. (2003). "Photolysis of intracellular caged sphingosine-1-phosphate causes Ca2+ mobilization independently of G-protein-coupled receptors." FEBS Lett 554(3): 443-449.
Michael, J. M., Lavin, M. F. and Watters, D. J. (1997). "Resistance to radiation-induced apoptosis in Burkitt's lymphoma cells is associated with defective ceramide signaling." Cancer Res 57(16): 3600-3605.
Michaud, M. D., Robitaille, G. A., Gratton, J. P. and Richard, D. E. (2009). "Sphingosine-1-phosphate: a novel nonhypoxic activator of hypoxia-inducible factor-1 in vascular cells." Arterioscler Thromb Vasc Biol 29(6): 902-908.
Mickisch, G., Bier, H., Bergler, W., Bak, M., Tschada, R. and Alken, P. (1990). "P-170 glycoprotein, glutathione and associated enzymes in relation to chemoresistance of primary human renal cell carcinomas." Urol Int 45(3): 170-176.
Mickisch, G. H., Garin, A., van Poppel, H., de Prijck, L., Sylvester, R., European Organisation for, R. and Treatment of Cancer Genitourinary, G. (2001). "Radical nephrectomy plus interferon-alfa-based immunotherapy compared with interferon alfa alone in metastatic renal-cell carcinoma: a randomised trial." Lancet 358(9286): 966-970.
Minardi, D., Lucarini, G., Santoni, M., Mazzucchelli, R., Burattini, L., Conti, A., Principi, E., Bianconi, M., Scartozzi, M., Milanese, G., Di Primio, R., Montironi, R., Cascinu, S. and Muzzonigro, G. (2015). "Survival in patients with clear cell renal cell carcinoma is predicted by HIF-1alpha expression." Anticancer Res 35(1): 433-438.
Mitchell, D., Pobre, E. G., Mulivor, A. W., Grinberg, A. V., Castonguay, R., Monnell, T. E., Solban, N., Ucran, J. A., Pearsall, R. S., Underwood, K. W., Seehra, J. and Kumar, R. (2010). "ALK1-Fc inhibits multiple mediators of angiogenesis and suppresses tumor growth." Mol Cancer Ther 9(2): 379-388.
Mitra, P., Oskeritzian, C. A., Payne, S. G., Beaven, M. A., Milstien, S. and Spiegel, S. (2006). "Role of ABCC1 in export of sphingosine-1-phosphate from mast cells." Proc Natl Acad Sci U S A 103(44): 16394-16399.
Mizokami, K., Kakeji, Y., Oda, S., Irie, K., Yonemura, T., Konishi, F. and Maehara, Y. (2006). "Clinicopathologic significance of hypoxia-inducible factor 1alpha overexpression in gastric carcinomas." J Surg Oncol 94(2): 149-154.
Mizugishi, K., Yamashita, T., Olivera, A., Miller, G. F., Spiegel, S. and Proia, R. L. (2005). "Essential role for sphingosine kinases in neural and vascular development." Mol Cell Biol 25(24): 11113-11121.
Morad, S. A. and Cabot, M. C. (2013). "Ceramide-orchestrated signalling in cancer cells." Nat Rev Cancer 13(1): 51-65.
Morales-Ruiz, M., Lee, M. J., Zollner, S., Gratton, J. P., Scotland, R., Shiojima, I., Walsh, K., Hla, T. and Sessa, W. C. (2001). "Sphingosine 1-phosphate activates Akt, nitric oxide production, and chemotaxis through a Gi protein/phosphoinositide 3-kinase pathway in endothelial cells." J Biol Chem 276(22): 19672-19677.
Morris, Z. S. and McClatchey, A. I. (2009). "Aberrant epithelial morphology and persistent epidermal growth factor receptor signaling in a mouse model of renal carcinoma." Proc Natl Acad Sci U S A 106(24): 9767-9772.
Mottet, D., Dumont, V., Deccache, Y., Demazy, C., Ninane, N., Raes, M. and Michiels, C. (2003a). "Regulation of hypoxia-inducible factor-1alpha protein level during hypoxic conditions by the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase 3beta pathway in HepG2 cells." J Biol Chem 278(33): 31277-31285.
Mottet, D., Michel, G., Renard, P., Ninane, N., Raes, M. and Michiels, C. (2003b). "Role of ERK and calcium in the hypoxia-induced activation of HIF-1." J Cell Physiol 194(1): 30-44.
224!
Motzer, R. J., Bander, N. H. and Nanus, D. M. (1996). "Renal-cell carcinoma." N Engl J Med 335(12): 865-875.
Motzer, R. J., Escudier, B., Oudard, S., Hutson, T. E., Porta, C., Bracarda, S., Grunwald, V., Thompson, J. A., Figlin, R. A., Hollaender, N., Urbanowitz, G., Berg, W. J., Kay, A., Lebwohl, D., Ravaud, A. and Group, R.-S. (2008). "Efficacy of everolimus in advanced renal cell carcinoma: a double-blind, randomised, placebo-controlled phase III trial." Lancet 372(9637): 449-456.
Motzer, R. J., Hutson, T. E., McCann, L., Deen, K. and Choueiri, T. K. (2014). "Overall survival in renal-cell carcinoma with pazopanib versus sunitinib." N Engl J Med 370(18): 1769-1770.
Motzer, R. J., Hutson, T. E., Tomczak, P., Michaelson, M. D., Bukowski, R. M., Rixe, O., Oudard, S., Negrier, S., Szczylik, C., Kim, S. T., Chen, I., Bycott, P. W., Baum, C. M. and Figlin, R. A. (2007). "Sunitinib versus interferon alfa in metastatic renal-cell carcinoma." N Engl J Med 356(2): 115-124.
Motzer, R. J., Mazumdar, M., Bacik, J., Berg, W., Amsterdam, A. and Ferrara, J. (1999). "Survival and prognostic stratification of 670 patients with advanced renal cell carcinoma." J Clin Oncol 17(8): 2530-2540.
Mullershausen, F., Zecri, F., Cetin, C., Billich, A., Guerini, D. and Seuwen, K. (2009). "Persistent signaling induced by FTY720-phosphate is mediated by internalized S1P1 receptors." Nat Chem Biol 5(6): 428-434.
Murata, N., Sato, K., Kon, J., Tomura, H., Yanagita, M., Kuwabara, A., Ui, M. and Okajima, F. (2000). "Interaction of sphingosine 1-phosphate with plasma components, including lipoproteins, regulates the lipid receptor-mediated actions." Biochem J 352 Pt 3: 809-815.
Nagahara, Y., Ikekita, M. and Shinomiya, T. (2000). "Immunosuppressant FTY720 induces apoptosis by direct induction of permeability transition and release of cytochrome c from mitochondria." J Immunol 165(6): 3250-3259.
Nagahashi, M., Kim, E. Y., Yamada, A., Ramachandran, S., Allegood, J. C., Hait, N. C., Maceyka, M., Milstien, S., Takabe, K. and Spiegel, S. (2013). "Spns2, a transporter of phosphorylated sphingoid bases, regulates their blood and lymph levels, and the lymphatic network." FASEB J 27(3): 1001-1011.
Nakahara, K., Ohkuni, A., Kitamura, T., Abe, K., Naganuma, T., Ohno, Y., Zoeller, R. A. and Kihara, A. (2012). "The Sjogren-Larsson syndrome gene encodes a hexadecenal dehydrogenase of the sphingosine 1-phosphate degradation pathway." Mol Cell 46(4): 461-471.
Nanduri, J., Wang, N., Yuan, G., Khan, S. A., Souvannakitti, D., Peng, Y. J., Kumar, G. K., Garcia, J. A. and Prabhakar, N. R. (2009). "Intermittent hypoxia degrades HIF-2alpha via calpains resulting in oxidative stress: implications for recurrent apnea-induced morbidities." Proc Natl Acad Sci U S A 106(4): 1199-1204.
Nanni, S., Benvenuti, V., Grasselli, A., Priolo, C., Aiello, A., Mattiussi, S., Colussi, C., Lirangi, V., Illi, B., D'Eletto, M., Cianciulli, A. M., Gallucci, M., De Carli, P., Sentinelli, S., Mottolese, M., Carlini, P., Strigari, L., Finn, S., Mueller, E., Arcangeli, G., Gaetano, C., Capogrossi, M. C., Donnorso, R. P., Bacchetti, S., Sacchi, A., Pontecorvi, A., Loda, M. and Farsetti, A. (2009). "Endothelial NOS, estrogen receptor beta, and HIFs cooperate in the activation of a prognostic transcriptional pattern in aggressive human prostate cancer." J Clin Invest 119(5): 1093-1108.
Nava, V. E., Hobson, J. P., Murthy, S., Milstien, S. and Spiegel, S. (2002). "Sphingosine kinase type 1 promotes estrogen-dependent tumorigenesis of breast cancer MCF-7 cells." Exp Cell Res 281(1): 115-127.
Nava, V. E., Lacana, E., Poulton, S., Liu, H., Sugiura, M., Kono, K., Milstien, S., Kohama, T. and Spiegel, S. (2000). "Functional characterization of human sphingosine kinase-1." FEBS Lett 473(1): 81-84.
Neckers, L. (2006). "Chaperoning oncogenes: Hsp90 as a target of geldanamycin." Handb Exp Pharmacol(172): 259-277.
Neckers, L. and Neckers, K. (2002). "Heat-shock protein 90 inhibitors as novel cancer chemotherapeutic agents." Expert Opin Emerg Drugs 7(2): 277-288.
225!
Neubauer, H. A. and Pitson, S. M. (2013). "Roles, regulation and inhibitors of sphingosine kinase 2." FEBS J 280(21): 5317-5336.
Ng, C. K., Carr, K., McAinsh, M. R., Powell, B. and Hetherington, A. M. (2001). "Drought-induced guard cell signal transduction involves sphingosine-1-phosphate." Nature 410(6828): 596-599.
Nilsson, H., Jogi, A., Beckman, S., Harris, A. L., Poellinger, L. and Pahlman, S. (2005). "HIF-2alpha expression in human fetal paraganglia and neuroblastoma: relation to sympathetic differentiation, glucose deficiency, and hypoxia." Exp Cell Res 303(2): 447-456.
Nishiuma, T., Nishimura, Y., Okada, T., Kuramoto, E., Kotani, Y., Jahangeer, S. and Nakamura, S. (2008). "Inhalation of sphingosine kinase inhibitor attenuates airway inflammation in asthmatic mouse model." Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 294(6): L1085-1093.
Nofer, J. R., Bot, M., Brodde, M., Taylor, P. J., Salm, P., Brinkmann, V., van Berkel, T., Assmann, G. and Biessen, E. A. (2007). "FTY720, a synthetic sphingosine 1 phosphate analogue, inhibits development of atherosclerosis in low-density lipoprotein receptor-deficient mice." Circulation 115(4): 501-508.
Nofer, J. R., van der Giet, M., Tolle, M., Wolinska, I., von Wnuck Lipinski, K., Baba, H. A., Tietge, U. J., Godecke, A., Ishii, I., Kleuser, B., Schafers, M., Fobker, M., Zidek, W., Assmann, G., Chun, J. and Levkau, B. (2004). "HDL induces NO-dependent vasorelaxation via the lysophospholipid receptor S1P3." J Clin Invest 113(4): 569-581.
Noguera, R., Fredlund, E., Piqueras, M., Pietras, A., Beckman, S., Navarro, S. and Pahlman, S. (2009). "HIF-1alpha and HIF-2alpha are differentially regulated in vivo in neuroblastoma: high HIF-1alpha correlates negatively to advanced clinical stage and tumor vascularization." Clin Cancer Res 15(23): 7130-7136.
Nordsmark, M., Bentzen, S. M., Rudat, V., Brizel, D., Lartigau, E., Stadler, P., Becker, A., Adam, M., Molls, M., Dunst, J., Terris, D. J. and Overgaard, J. (2005). "Prognostic value of tumor oxygenation in 397 head and neck tumors after primary radiation therapy. An international multi-center study." Radiother Oncol 77(1): 18-24.
Novgorodov, A. S., El-Alwani, M., Bielawski, J., Obeid, L. M. and Gudz, T. I. (2007). "Activation of sphingosine-1-phosphate receptor S1P5 inhibits oligodendrocyte progenitor migration." FASEB J 21(7): 1503-1514.
O'Brien, N., Jones, S. T., Williams, D. G., Cunningham, H. B., Moreno, K., Visentin, B., Gentile, A., Vekich, J., Shestowsky, W., Hiraiwa, M., Matteo, R., Cavalli, A., Grotjahn, D., Grant, M., Hansen, G., Campbell, M. A. and Sabbadini, R. (2009). "Production and characterization of monoclonal anti-sphingosine-1-phosphate antibodies." J Lipid Res 50(11): 2245-2257.
O'Rourke, J. F., Tian, Y. M., Ratcliffe, P. J. and Pugh, C. W. (1999). "Oxygen-regulated and transactivating domains in endothelial PAS protein 1: comparison with hypoxia-inducible factor-1alpha." J Biol Chem 274(4): 2060-2071.
Ohotski, J., Edwards, J., Elsberger, B., Watson, C., Orange, C., Mallon, E., Pyne, S. and Pyne, N. J. (2013). "Identification of novel functional and spatial associations between sphingosine kinase 1, sphingosine 1-phosphate receptors and other signaling proteins that affect prognostic outcome in estrogen receptor-positive breast cancer." Int J Cancer 132(3): 605-616.
Ohotski, J., Long, J. S., Orange, C., Elsberger, B., Mallon, E., Doughty, J., Pyne, S., Pyne, N. J. and Edwards, J. (2012). "Expression of sphingosine 1-phosphate receptor 4 and sphingosine kinase 1 is associated with outcome in oestrogen receptor-negative breast cancer." Br J Cancer 106(8): 1453-1459.
Ohotski, J., Rosen, H., Bittman, R., Pyne, S. and Pyne, N. J. (2014). "Sphingosine kinase 2 prevents the nuclear translocation of sphingosine 1-phosphate receptor-2 and tyrosine 416 phosphorylated c-Src and increases estrogen receptor negative MDA-MB-231 breast cancer cell growth: The role of sphingosine 1-phosphate receptor-4." Cell Signal 26(5): 1040-1047.
226!
Okamoto, H., Takuwa, N., Gonda, K., Okazaki, H., Chang, K., Yatomi, Y., Shigematsu, H. and Takuwa, Y. (1998). "EDG1 is a functional sphingosine-1-phosphate receptor that is linked via a Gi/o to multiple signaling pathways, including phospholipase C activation, Ca2+ mobilization, Ras-mitogen-activated protein kinase activation, and adenylate cyclase inhibition." J Biol Chem 273(42): 27104-27110.
Okamoto, H., Yatomi, Y., Ohmori, T., Satoh, K., Matsumoto, Y. and Ozaki, Y. (2000). "Sphingosine 1-phosphate stimulates G(i)- and Rho-mediated vascular endothelial cell spreading and migration." Thromb Res 99(3): 259-265.
Olenyuk, B. Z., Zhang, G. J., Klco, J. M., Nickols, N. G., Kaelin, W. G., Jr. and Dervan, P. B. (2004). "Inhibition of vascular endothelial growth factor with a sequence-specific hypoxia response element antagonist." Proc Natl Acad Sci U S A 101(48): 16768-16773.
Olivera, A., Kohama, T., Edsall, L., Nava, V., Cuvillier, O., Poulton, S. and Spiegel, S. (1999). "Sphingosine kinase expression increases intracellular sphingosine-1-phosphate and promotes cell growth and survival." J Cell Biol 147(3): 545-558.
Olivera, A. and Spiegel, S. (1993). "Sphingosine-1-phosphate as second messenger in cell proliferation induced by PDGF and FCS mitogens." Nature 365(6446): 557-560.
Olivera, A. and Spiegel, S. (1998). "Sphingosine kinase. Assay and product analysis." Methods Mol Biol 105: 233-242.
Oo, M. L., Chang, S. H., Thangada, S., Wu, M. T., Rezaul, K., Blaho, V., Hwang, S. I., Han, D. K. and Hla, T. (2011). "Engagement of S1P(1)-degradative mechanisms leads to vascular leak in mice." J Clin Invest 121(6): 2290-2300.
Oo, M. L., Thangada, S., Wu, M. T., Liu, C. H., Macdonald, T. L., Lynch, K. R., Lin, C. Y. and Hla, T. (2007). "Immunosuppressive and anti-angiogenic sphingosine 1-phosphate receptor-1 agonists induce ubiquitinylation and proteasomal degradation of the receptor." J Biol Chem 282(12): 9082-9089.
Osada, M., Yatomi, Y., Ohmori, T., Ikeda, H. and Ozaki, Y. (2002). "Enhancement of sphingosine 1-phosphate-induced migration of vascular endothelial cells and smooth muscle cells by an EDG-5 antagonist." Biochem Biophys Res Commun 299(3): 483-487.
Osada, R., Horiuchi, A., Kikuchi, N., Yoshida, J., Hayashi, A., Ota, M., Katsuyama, Y., Melillo, G. and Konishi, I. (2007). "Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha, hypoxia-inducible factor 2alpha, and von Hippel-Lindau protein in epithelial ovarian neoplasms and allelic loss of von Hippel-Lindau gene: nuclear expression of hypoxia-inducible factor 1alpha is an independent prognostic factor in ovarian carcinoma." Hum Pathol 38(9): 1310-1320.
Page, E. L., Robitaille, G. A., Pouyssegur, J. and Richard, D. E. (2002). "Induction of hypoxia-inducible factor-1alpha by transcriptional and translational mechanisms." J Biol Chem 277(50): 48403-48409.
Paik, J. H., Skoura, A., Chae, S. S., Cowan, A. E., Han, D. K., Proia, R. L. and Hla, T. (2004). "Sphingosine 1-phosphate receptor regulation of N-cadherin mediates vascular stabilization." Genes Dev 18(19): 2392-2403.
Panka, D. J., Liu, Q., Geissler, A. K. and Mier, J. W. (2013). "Effects of HDM2 antagonism on sunitinib resistance, p53 activation, SDF-1 induction, and tumor infiltration by CD11b+/Gr-1+ myeloid derived suppressor cells." Mol Cancer 12: 17.
Papandreou, I., Cairns, R. A., Fontana, L., Lim, A. L. and Denko, N. C. (2006). "HIF-1 mediates adaptation to hypoxia by actively downregulating mitochondrial oxygen consumption." Cell Metab 3(3): 187-197.
Pappu, R., Schwab, S. R., Cornelissen, I., Pereira, J. P., Regard, J. B., Xu, Y., Camerer, E., Zheng, Y. W., Huang, Y., Cyster, J. G. and Coughlin, S. R. (2007). "Promotion of lymphocyte egress into blood and lymph by distinct sources of sphingosine-1-phosphate." Science 316(5822): 295-298.
227!
Pasanen, A., Heikkila, M., Rautavuoma, K., Hirsila, M., Kivirikko, K. I. and Myllyharju, J. (2010). "Hypoxia-inducible factor (HIF)-3alpha is subject to extensive alternative splicing in human tissues and cancer cells and is regulated by HIF-1 but not HIF-2." Int J Biochem Cell Biol 42(7): 1189-1200.
Pastorino, F., Loi, M., Sapra, P., Becherini, P., Cilli, M., Emionite, L., Ribatti, D., Greenberger, L. M., Horak, I. D. and Ponzoni, M. (2010). "Tumor regression and curability of preclinical neuroblastoma models by PEGylated SN38 (EZN-2208), a novel topoisomerase I inhibitor." Clin Cancer Res 16(19): 4809-4821.
Patard, J. J., Leray, E., Rodriguez, A., Rioux-Leclercq, N., Guille, F. and Lobel, B. (2003). "Correlation between symptom graduation, tumor characteristics and survival in renal cell carcinoma." Eur Urol 44(2): 226-232.
Paugh, S. W., Paugh, B. S., Rahmani, M., Kapitonov, D., Almenara, J. A., Kordula, T., Milstien, S., Adams, J. K., Zipkin, R. E., Grant, S. and Spiegel, S. (2008). "A selective sphingosine kinase 1 inhibitor integrates multiple molecular therapeutic targets in human leukemia." Blood 112(4): 1382-1391.
Payne, S. G., Oskeritzian, C. A., Griffiths, R., Subramanian, P., Barbour, S. E., Chalfant, C. E., Milstien, S. and Spiegel, S. (2007). "The immunosuppressant drug FTY720 inhibits cytosolic phospholipase A2 independently of sphingosine-1-phosphate receptors." Blood 109(3): 1077-1085.
Pchejetski, D., Bohler, T., Brizuela, L., Sauer, L., Doumerc, N., Golzio, M., Salunkhe, V., Teissie, J., Malavaud, B., Waxman, J. and Cuvillier, O. (2010). "FTY720 (fingolimod) sensitizes prostate cancer cells to radiotherapy by inhibition of sphingosine kinase-1." Cancer Res 70(21): 8651-8661.
Pchejetski, D., Doumerc, N., Golzio, M., Naymark, M., Teissie, J., Kohama, T., Waxman, J., Malavaud, B. and Cuvillier, O. (2008). "Chemosensitizing effects of sphingosine kinase-1 inhibition in prostate cancer cell and animal models." Mol Cancer Ther 7(7): 1836-1845.
Pchejetski, D., Golzio, M., Bonhoure, E., Calvet, C., Doumerc, N., Garcia, V., Mazerolles, C., Rischmann, P., Teissie, J., Malavaud, B. and Cuvillier, O. (2005). "Sphingosine kinase-1 as a chemotherapy sensor in prostate adenocarcinoma cell and mouse models." Cancer Res 65(24): 11667-11675.
Pecot, C. V., Rupaimoole, R., Yang, D., Akbani, R., Ivan, C., Lu, C., Wu, S., Han, H. D., Shah, M. Y., Rodriguez-Aguayo, C., Bottsford-Miller, J., Liu, Y., Kim, S. B., Unruh, A., Gonzalez-Villasana, V., Huang, L., Zand, B., Moreno-Smith, M., Mangala, L. S., Taylor, M., Dalton, H. J., Sehgal, V., Wen, Y., Kang, Y., Baggerly, K. A., Lee, J. S., Ram, P. T., Ravoori, M. K., Kundra, V., Zhang, X., Ali-Fehmi, R., Gonzalez-Angulo, A. M., Massion, P. P., Calin, G. A., Lopez-Berestein, G., Zhang, W. and Sood, A. K. (2013). "Tumour angiogenesis regulation by the miR-200 family." Nat Commun 4: 2427.
Pena-Llopis, S., Vega-Rubin-de-Celis, S., Liao, A., Leng, N., Pavia-Jimenez, A., Wang, S., Yamasaki, T., Zhrebker, L., Sivanand, S., Spence, P., Kinch, L., Hambuch, T., Jain, S., Lotan, Y., Margulis, V., Sagalowsky, A. I., Summerour, P. B., Kabbani, W., Wong, S. W., Grishin, N., Laurent, M., Xie, X. J., Haudenschild, C. D., Ross, M. T., Bentley, D. R., Kapur, P. and Brugarolas, J. (2012). "BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma." Nat Genet 44(7): 751-759.
Peng, J., Zhang, L., Drysdale, L. and Fong, G. H. (2000). "The transcription factor EPAS-1/hypoxia-inducible factor 2alpha plays an important role in vascular remodeling." Proc Natl Acad Sci U S A 97(15): 8386-8391.
Peng, Y. J., Yuan, G., Ramakrishnan, D., Sharma, S. D., Bosch-Marce, M., Kumar, G. K., Semenza, G. L. and Prabhakar, N. R. (2006). "Heterozygous HIF-1alpha deficiency impairs carotid body-mediated systemic responses and reactive oxygen species generation in mice exposed to intermittent hypoxia." J Physiol 577(Pt 2): 705-716.
Peters, K. B. and Brown, J. M. (2002). "Tirapazamine: a hypoxia-activated topoisomerase II poison." Cancer Res 62(18): 5248-5253.
228!
Pham, T. H., Baluk, P., Xu, Y., Grigorova, I., Bankovich, A. J., Pappu, R., Coughlin, S. R., McDonald, D. M., Schwab, S. R. and Cyster, J. G. (2010). "Lymphatic endothelial cell sphingosine kinase activity is required for lymphocyte egress and lymphatic patterning." J Exp Med 207(1): 17-27.
Philip, B., Ito, K., Moreno-Sanchez, R. and Ralph, S. J. (2013). "HIF expression and the role of hypoxic microenvironments within primary tumours as protective sites driving cancer stem cell renewal and metastatic progression." Carcinogenesis 34(8): 1699-1707.
Philips, G. K. and Atkins, M. (2015). "Therapeutic uses of anti-PD-1 and anti-PD-L1 antibodies." Int Immunol 27(1): 39-46.
Philips, G. K. and Atkins, M. B. (2014). "New agents and new targets for renal cell carcinoma." Am Soc Clin Oncol Educ Book: e222-227.
Phng, L. K. and Gerhardt, H. (2009). "Angiogenesis: a team effort coordinated by notch." Dev Cell 16(2): 196-208.
Ping, W., Sun, W., Zu, Y., Chen, W. and Fu, X. (2014). "Clinicopathological and prognostic significance of hypoxia-inducible factor-1alpha in esophageal squamous cell carcinoma: a meta-analysis." Tumour Biol 35(5): 4401-4409.
Pitman, M. R., Woodcock, J. M., Lopez, A. F. and Pitson, S. M. (2012). "Molecular targets of FTY720 (fingolimod)." Curr Mol Med 12(10): 1207-1219.
Pitson, S. M. (2011). "Regulation of sphingosine kinase and sphingolipid signaling." Trends Biochem Sci 36(2): 97-107.
Pitson, S. M., D'Andrea R, J., Vandeleur, L., Moretti, P. A., Xia, P., Gamble, J. R., Vadas, M. A. and Wattenberg, B. W. (2000a). "Human sphingosine kinase: purification, molecular cloning and characterization of the native and recombinant enzymes." Biochem J 350 Pt 2: 429-441.
Pitson, S. M., Moretti, P. A., Zebol, J. R., Lynn, H. E., Xia, P., Vadas, M. A. and Wattenberg, B. W. (2003). "Activation of sphingosine kinase 1 by ERK1/2-mediated phosphorylation." EMBO J 22(20): 5491-5500.
Pitson, S. M., Moretti, P. A., Zebol, J. R., Xia, P., Gamble, J. R., Vadas, M. A., D'Andrea, R. J. and Wattenberg, B. W. (2000b). "Expression of a catalytically inactive sphingosine kinase mutant blocks agonist-induced sphingosine kinase activation. A dominant-negative sphingosine kinase." J Biol Chem 275(43): 33945-33950.
Pitson, S. M., Xia, P., Leclercq, T. M., Moretti, P. A., Zebol, J. R., Lynn, H. E., Wattenberg, B. W. and Vadas, M. A. (2005). "Phosphorylation-dependent translocation of sphingosine kinase to the plasma membrane drives its oncogenic signalling." J Exp Med 201(1): 49-54.
Ponnusamy, S., Selvam, S. P., Mehrotra, S., Kawamori, T., Snider, A. J., Obeid, L. M., Shao, Y., Sabbadini, R. and Ogretmen, B. (2012). "Communication between host organism and cancer cells is transduced by systemic sphingosine kinase 1/sphingosine 1-phosphate signalling to regulate tumour metastasis." EMBO Mol Med 4(8): 761-775.
Pore, N., Jiang, Z., Gupta, A., Cerniglia, G., Kao, G. D. and Maity, A. (2006). "EGFR tyrosine kinase inhibitors decrease VEGF expression by both hypoxia-inducible factor (HIF)-1-independent and HIF-1-dependent mechanisms." Cancer Res 66(6): 3197-3204.
Porta, C., Paglino, C. and Grunwald, V. (2014). "Sunitinib re-challenge in advanced renal-cell carcinoma." Br J Cancer 111(6): 1047-1053.
Potente, M., Gerhardt, H. and Carmeliet, P. (2011). "Basic and therapeutic aspects of angiogenesis." Cell 146(6): 873-887.
229!
Powles, T., Kayani, I., Blank, C., Chowdhury, S., Horenblas, S., Peters, J., Shamash, J., Sarwar, N., Boletti, K., Sadev, A., O'Brien, T., Berney, D., Beltran, L., Haanen, J. and Bex, A. (2011). "The safety and efficacy of sunitinib before planned nephrectomy in metastatic clear cell renal cancer." Ann Oncol 22(5): 1041-1047.
Price, M. M., Oskeritzian, C. A., Falanga, Y. T., Harikumar, K. B., Allegood, J. C., Alvarez, S. E., Conrad, D., Ryan, J. J., Milstien, S. and Spiegel, S. (2013). "A specific sphingosine kinase 1 inhibitor attenuates airway hyperresponsiveness and inflammation in a mast cell-dependent murine model of allergic asthma." J Allergy Clin Immunol 131(2): 501-511 e501.
Pyne, N. J. and Pyne, S. (2010). "Sphingosine 1-phosphate and cancer." Nat Rev Cancer 10(7): 489-503.
Qian, D. Z., Kachhap, S. K., Collis, S. J., Verheul, H. M., Carducci, M. A., Atadja, P. and Pili, R. (2006). "Class II histone deacetylases are associated with VHL-independent regulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha." Cancer Res 66(17): 8814-8821.
Ramanathan, R. K., Stephenson, J. J., Weiss, G. J., Pestano, L. A., Lowe, A., Hiscox, A., Leos, R. A., Martin, J. C., Kirkpatrick, L. and Richards, D. A. (2012). "A phase I trial of PX-12, a small-molecule inhibitor of thioredoxin-1, administered as a 72-hour infusion every 21 days in patients with advanced cancers refractory to standard therapy." Invest New Drugs 30(4): 1591-1596.
Rane, S., He, M., Sayed, D., Vashistha, H., Malhotra, A., Sadoshima, J., Vatner, D. E., Vatner, S. F. and Abdellatif, M. (2009). "Downregulation of miR-199a derepresses hypoxia-inducible factor-1alpha and Sirtuin 1 and recapitulates hypoxia preconditioning in cardiac myocytes." Circ Res 104(7): 879-886.
Rankin, E. B., Biju, M. P., Liu, Q., Unger, T. L., Rha, J., Johnson, R. S., Simon, M. C., Keith, B. and Haase, V. H. (2007). "Hypoxia-inducible factor-2 (HIF-2) regulates hepatic erythropoietin in vivo." J Clin Invest 117(4): 1068-1077.
Rankin, E. B. and Giaccia, A. J. (2008). "The role of hypoxia-inducible factors in tumorigenesis." Cell Death Differ 15(4): 678-685.
Rankin, E. B., Rha, J., Selak, M. A., Unger, T. L., Keith, B., Liu, Q. and Haase, V. H. (2009). "Hypoxia-inducible factor 2 regulates hepatic lipid metabolism." Mol Cell Biol 29(16): 4527-4538.
Rankin, E. B., Tomaszewski, J. E. and Haase, V. H. (2006). "Renal cyst development in mice with conditional inactivation of the von Hippel-Lindau tumor suppressor." Cancer Res 66(5): 2576-2583.
Rapisarda, A., Shoemaker, R. H. and Melillo, G. (2009). "Antiangiogenic agents and HIF-1 inhibitors meet at the crossroads." Cell Cycle 8(24): 4040-4043.
Rapisarda, A., Uranchimeg, B., Scudiero, D. A., Selby, M., Sausville, E. A., Shoemaker, R. H. and Melillo, G. (2002). "Identification of small molecule inhibitors of hypoxia-inducible factor 1 transcriptional activation pathway." Cancer Res 62(15): 4316-4324.
Rapisarda, A., Uranchimeg, B., Sordet, O., Pommier, Y., Shoemaker, R. H. and Melillo, G. (2004a). "Topoisomerase I-mediated inhibition of hypoxia-inducible factor 1: mechanism and therapeutic implications." Cancer Res 64(4): 1475-1482.
Rapisarda, A., Zalek, J., Hollingshead, M., Braunschweig, T., Uranchimeg, B., Bonomi, C. A., Borgel, S. D., Carter, J. P., Hewitt, S. M., Shoemaker, R. H. and Melillo, G. (2004b). "Schedule-dependent inhibition of hypoxia-inducible factor-1alpha protein accumulation, angiogenesis, and tumor growth by topotecan in U251-HRE glioblastoma xenografts." Cancer Res 64(19): 6845-6848.
Rasheed, S., Harris, A. L., Tekkis, P. P., Turley, H., Silver, A., McDonald, P. J., Talbot, I. C., Glynne-Jones, R., Northover, J. M. and Guenther, T. (2009). "Hypoxia-inducible factor-1alpha and -2alpha are expressed in most rectal cancers but only hypoxia-inducible factor-1alpha is associated with prognosis." Br J Cancer 100(10): 1666-1673.
230!
Rathinasamy, A., Czeloth, N., Pabst, O., Forster, R. and Bernhardt, G. (2010). "The origin and maturity of dendritic cells determine the pattern of sphingosine 1-phosphate receptors expressed and required for efficient migration." J Immunol 185(7): 4072-4081.
Raval, R. R., Lau, K. W., Tran, M. G., Sowter, H. M., Mandriota, S. J., Li, J. L., Pugh, C. W., Maxwell, P. H., Harris, A. L. and Ratcliffe, P. J. (2005). "Contrasting properties of hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) and HIF-2 in von Hippel-Lindau-associated renal cell carcinoma." Mol Cell Biol 25(13): 5675-5686.
Ravi, R., Mookerjee, B., Bhujwalla, Z. M., Sutter, C. H., Artemov, D., Zeng, Q., Dillehay, L. E., Madan, A., Semenza, G. L. and Bedi, A. (2000). "Regulation of tumor angiogenesis by p53-induced degradation of hypoxia-inducible factor 1alpha." Genes Dev 14(1): 34-44.
Richard, D. E., Berra, E., Gothie, E., Roux, D. and Pouyssegur, J. (1999). "p42/p44 mitogen-activated protein kinases phosphorylate hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1alpha) and enhance the transcriptional activity of HIF-1." J Biol Chem 274(46): 32631-32637.
Richey, S. L., Ng, C., Lim, Z. D., Jonasch, E. and Tannir, N. M. (2011). "Durable remission of metastatic renal cell carcinoma with gemcitabine and capecitabine after failure of targeted therapy." J Clin Oncol 29(8): e203-205.
Rini, B. I., Escudier, B., Tomczak, P., Kaprin, A., Szczylik, C., Hutson, T. E., Michaelson, M. D., Gorbunova, V. A., Gore, M. E., Rusakov, I. G., Negrier, S., Ou, Y. C., Castellano, D., Lim, H. Y., Uemura, H., Tarazi, J., Cella, D., Chen, C., Rosbrook, B., Kim, S. and Motzer, R. J. (2011). "Comparative effectiveness of axitinib versus sorafenib in advanced renal cell carcinoma (AXIS): a randomised phase 3 trial." Lancet 378(9807): 1931-1939.
Rini, B. I. and Flaherty, K. (2008). "Clinical effect and future considerations for molecularly-targeted therapy in renal cell carcinoma." Urol Oncol 26(5): 543-549.
Rini, B. I., Halabi, S., Rosenberg, J. E., Stadler, W. M., Vaena, D. A., Ou, S. S., Archer, L., Atkins, J. N., Picus, J., Czaykowski, P., Dutcher, J. and Small, E. J. (2008). "Bevacizumab plus interferon alfa compared with interferon alfa monotherapy in patients with metastatic renal cell carcinoma: CALGB 90206." J Clin Oncol 26(33): 5422-5428.
Rischin, D., Peters, L., Fisher, R., Macann, A., Denham, J., Poulsen, M., Jackson, M., Kenny, L., Penniment, M., Corry, J., Lamb, D. and McClure, B. (2005). "Tirapazamine, Cisplatin, and Radiation versus Fluorouracil, Cisplatin, and Radiation in patients with locally advanced head and neck cancer: a randomized phase II trial of the Trans-Tasman Radiation Oncology Group (TROG 98.02)." J Clin Oncol 23(1): 79-87.
Rius, J., Guma, M., Schachtrup, C., Akassoglou, K., Zinkernagel, A. S., Nizet, V., Johnson, R. S., Haddad, G. G. and Karin, M. (2008). "NF-kappaB links innate immunity to the hypoxic response through transcriptional regulation of HIF-1alpha." Nature 453(7196): 807-811.
Roberts, A. M., Watson, I. R., Evans, A. J., Foster, D. A., Irwin, M. S. and Ohh, M. (2009). "Suppression of hypoxia-inducible factor 2alpha restores p53 activity via Hdm2 and reverses chemoresistance of renal carcinoma cells." Cancer Res 69(23): 9056-9064.
Rodriguez, C., Rodriguez-Sinovas, A. and Martinez-Gonzalez, J. (2008). "Lysyl oxidase as a potential therapeutic target." Drug News Perspect 21(4): 218-224.
Rosen, H., Stevens, R. C., Hanson, M., Roberts, E. and Oldstone, M. B. (2013). "Sphingosine-1-phosphate and its receptors: structure, signaling, and influence." Annu Rev Biochem 82: 637-662.
Rosenfeldt, H. M., Hobson, J. P., Maceyka, M., Olivera, A., Nava, V. E., Milstien, S. and Spiegel, S. (2001). "EDG-1 links the PDGF receptor to Src and focal adhesion kinase activation leading to lamellipodia formation and cell migration." FASEB J 15(14): 2649-2659.
231!
Ruas, J. L., Poellinger, L. and Pereira, T. (2002). "Functional analysis of hypoxia-inducible factor-1 alpha-mediated transactivation. Identification of amino acid residues critical for transcriptional activation and/or interaction with CREB-binding protein." J Biol Chem 277(41): 38723-38730.
Rundqvist, H. and Johnson, R. S. (2013). "Tumour oxygenation: implications for breast cancer prognosis." J Intern Med 274(2): 105-112.
Ryan, H. E., Lo, J. and Johnson, R. S. (1998). "HIF-1 alpha is required for solid tumor formation and embryonic vascularization." EMBO J 17(11): 3005-3015.
Saddoughi, S. A., Gencer, S., Peterson, Y. K., Ward, K. E., Mukhopadhyay, A., Oaks, J., Bielawski, J., Szulc, Z. M., Thomas, R. J., Selvam, S. P., Senkal, C. E., Garrett-Mayer, E., De Palma, R. M., Fedarovich, D., Liu, A., Habib, A. A., Stahelin, R. V., Perrotti, D. and Ogretmen, B. (2013). "Sphingosine analogue drug FTY720 targets I2PP2A/SET and mediates lung tumour suppression via activation of PP2A-RIPK1-dependent necroptosis." EMBO Mol Med 5(1): 105-121.
Samanta, D., Gilkes, D. M., Chaturvedi, P., Xiang, L. and Semenza, G. L. (2014). "Hypoxia-inducible factors are required for chemotherapy resistance of breast cancer stem cells." Proc Natl Acad Sci U S A 111(50): E5429-5438.
Sanchez, T., Estrada-Hernandez, T., Paik, J. H., Wu, M. T., Venkataraman, K., Brinkmann, V., Claffey, K. and Hla, T. (2003). "Phosphorylation and action of the immunomodulator FTY720 inhibits vascular endothelial cell growth factor-induced vascular permeability." J Biol Chem 278(47): 47281-47290.
Sanchez, T., Skoura, A., Wu, M. T., Casserly, B., Harrington, E. O. and Hla, T. (2007). "Induction of vascular permeability by the sphingosine-1-phosphate receptor-2 (S1P2R) and its downstream effectors ROCK and PTEN." Arterioscler Thromb Vasc Biol 27(6): 1312-1318.
Sang, N., Stiehl, D. P., Bohensky, J., Leshchinsky, I., Srinivas, V. and Caro, J. (2003). "MAPK signaling up-regulates the activity of hypoxia-inducible factors by its effects on p300." J Biol Chem 278(16): 14013-14019.
Sanna, M. G., Liao, J., Jo, E., Alfonso, C., Ahn, M. Y., Peterson, M. S., Webb, B., Lefebvre, S., Chun, J., Gray, N. and Rosen, H. (2004). "Sphingosine 1-phosphate (S1P) receptor subtypes S1P1 and S1P3, respectively, regulate lymphocyte recirculation and heart rate." J Biol Chem 279(14): 13839-13848.
Sanna, M. G., Wang, S. K., Gonzalez-Cabrera, P. J., Don, A., Marsolais, D., Matheu, M. P., Wei, S. H., Parker, I., Jo, E., Cheng, W. C., Cahalan, M. D., Wong, C. H. and Rosen, H. (2006). "Enhancement of capillary leakage and restoration of lymphocyte egress by a chiral S1P1 antagonist in vivo." Nat Chem Biol 2(8): 434-441.
Sapra, P., Kraft, P., Pastorino, F., Ribatti, D., Dumble, M., Mehlig, M., Wang, M., Ponzoni, M., Greenberger, L. M. and Horak, I. D. (2011). "Potent and sustained inhibition of HIF-1alpha and downstream genes by a polyethyleneglycol-SN38 conjugate, EZN-2208, results in anti-angiogenic effects." Angiogenesis 14(3): 245-253.
Sato, K., Malchinkhuu, E., Horiuchi, Y., Mogi, C., Tomura, H., Tosaka, M., Yoshimoto, Y., Kuwabara, A. and Okajima, F. (2007). "Critical role of ABCA1 transporter in sphingosine 1-phosphate release from astrocytes." J Neurochem 103(6): 2610-2619.
Sato, K. and Okajima, F. (2010). "Role of sphingosine 1-phosphate in anti-atherogenic actions of high-density lipoprotein." World J Biol Chem 1(11): 327-337.
Sauer, L., Nunes, J., Salunkhe, V., Skalska, L., Kohama, T., Cuvillier, O., Waxman, J. and Pchejetski, D. (2009). "Sphingosine kinase 1 inhibition sensitizes hormone-resistant prostate cancer to docetaxel." Int J Cancer 125(11): 2728-2736.
232!
Scarlatti, F., Bauvy, C., Ventruti, A., Sala, G., Cluzeaud, F., Vandewalle, A., Ghidoni, R. and Codogno, P. (2004). "Ceramide-mediated macroautophagy involves inhibition of protein kinase B and up-regulation of beclin 1." J Biol Chem 279(18): 18384-18391.
Scheuermann, T. H., Li, Q., Ma, H. W., Key, J., Zhang, L., Chen, R., Garcia, J. A., Naidoo, J., Longgood, J., Frantz, D. E., Tambar, U. K., Gardner, K. H. and Bruick, R. K. (2013). "Allosteric inhibition of hypoxia inducible factor-2 with small molecules." Nat Chem Biol 9(4): 271-276.
Schipani, E., Ryan, H. E., Didrickson, S., Kobayashi, T., Knight, M. and Johnson, R. S. (2001). "Hypoxia in cartilage: HIF-1alpha is essential for chondrocyte growth arrest and survival." Genes Dev 15(21): 2865-2876.
Schito, L., Rey, S., Tafani, M., Zhang, H., Wong, C. C., Russo, A., Russo, M. A. and Semenza, G. L. (2012). "Hypoxia-inducible factor 1-dependent expression of platelet-derived growth factor B promotes lymphatic metastasis of hypoxic breast cancer cells." Proc Natl Acad Sci U S A 109(40): E2707-2716.
Schmidt, L., Duh, F. M., Chen, F., Kishida, T., Glenn, G., Choyke, P., Scherer, S. W., Zhuang, Z., Lubensky, I., Dean, M., Allikmets, R., Chidambaram, A., Bergerheim, U. R., Feltis, J. T., Casadevall, C., Zamarron, A., Bernues, M., Richard, S., Lips, C. J., Walther, M. M., Tsui, L. C., Geil, L., Orcutt, M. L., Stackhouse, T., Lipan, J., Slife, L., Brauch, H., Decker, J., Niehans, G., Hughson, M. D., Moch, H., Storkel, S., Lerman, M. I., Linehan, W. M. and Zbar, B. (1997). "Germline and somatic mutations in the tyrosine kinase domain of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas." Nat Genet 16(1): 68-73.
Schmidt, L. S., Nickerson, M. L., Warren, M. B., Glenn, G. M., Toro, J. R., Merino, M. J., Turner, M. L., Choyke, P. L., Sharma, N., Peterson, J., Morrison, P., Maher, E. R., Walther, M. M., Zbar, B. and Linehan, W. M. (2005). "Germline BHD-mutation spectrum and phenotype analysis of a large cohort of families with Birt-Hogg-Dube syndrome." Am J Hum Genet 76(6): 1023-1033.
Schnitzer, S. E., Weigert, A., Zhou, J. and Brune, B. (2009). "Hypoxia enhances sphingosine kinase 2 activity and provokes sphingosine-1-phosphate-mediated chemoresistance in A549 lung cancer cells." Mol Cancer Res 7(3): 393-401.
Schnute, M. E., McReynolds, M. D., Kasten, T., Yates, M., Jerome, G., Rains, J. W., Hall, T., Chrencik, J., Kraus, M., Cronin, C. N., Saabye, M., Highkin, M. K., Broadus, R., Ogawa, S., Cukyne, K., Zawadzke, L. E., Peterkin, V., Iyanar, K., Scholten, J. A., Wendling, J., Fujiwara, H., Nemirovskiy, O., Wittwer, A. J. and Nagiec, M. M. (2012). "Modulation of cellular S1P levels with a novel, potent and specific inhibitor of sphingosine kinase-1." Biochem J 444(1): 79-88.
Schofield, C. J. and Zhang, Z. (1999). "Structural and mechanistic studies on 2-oxoglutarate-dependent oxygenases and related enzymes." Curr Opin Struct Biol 9(6): 722-731.
Schulze, T., Golfier, S., Tabeling, C., Rabel, K., Graler, M. H., Witzenrath, M. and Lipp, M. (2011). "Sphingosine-1-phospate receptor 4 (S1P(4)) deficiency profoundly affects dendritic cell function and TH17-cell differentiation in a murine model." FASEB J 25(11): 4024-4036.
Schwab, S. R., Pereira, J. P., Matloubian, M., Xu, Y., Huang, Y. and Cyster, J. G. (2005). "Lymphocyte sequestration through S1P lyase inhibition and disruption of S1P gradients." Science 309(5741): 1735-1739.
Schwalm, S., Doll, F., Romer, I., Bubnova, S., Pfeilschifter, J. and Huwiler, A. (2008). "Sphingosine kinase-1 is a hypoxia-regulated gene that stimulates migration of human endothelial cells." Biochem Biophys Res Commun 368(4): 1020-1025.
Scortegagna, M., Ding, K., Oktay, Y., Gaur, A., Thurmond, F., Yan, L. J., Marck, B. T., Matsumoto, A. M., Shelton, J. M., Richardson, J. A., Bennett, M. J. and Garcia, J. A. (2003). "Multiple organ pathology, metabolic abnormalities and impaired homeostasis of reactive oxygen species in Epas1-/- mice." Nat Genet 35(4): 331-340.
233!
Scrideli, C. A., Carlotti, C. G., Jr., Mata, J. F., Neder, L., Machado, H. R., Oba-Sinjo, S. M., Rosemberg, S., Marie, S. K. and Tone, L. G. (2007). "Prognostic significance of co-overexpression of the EGFR/IGFBP-2/HIF-2A genes in astrocytomas." J Neurooncol 83(3): 233-239.
Semenza, G. L. (2009). "Regulation of oxygen homeostasis by hypoxia-inducible factor 1." Physiology (Bethesda) 24: 97-106.
Semenza, G. L. (2010). "Defining the role of hypoxia-inducible factor 1 in cancer biology and therapeutics." Oncogene 29(5): 625-634.
Semenza, G. L. (2011). "Oxygen sensing, homeostasis, and disease." N Engl J Med 365(6): 537-547.
Semenza, G. L. (2012a). "Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine." Cell 148(3): 399-408.
Semenza, G. L. (2012b). "Hypoxia-inducible factors: mediators of cancer progression and targets for cancer therapy." Trends Pharmacol Sci 33(4): 207-214.
Semenza, G. L. (2014a). "Hypoxia-inducible factor 1 and cardiovascular disease." Annu Rev Physiol 76: 39-56.
Semenza, G. L. (2014b). "Oxygen sensing, hypoxia-inducible factors, and disease pathophysiology." Annu Rev Pathol 9: 47-71.
Semenza, G. L., Nejfelt, M. K., Chi, S. M. and Antonarakis, S. E. (1991). "Hypoxia-inducible nuclear factors bind to an enhancer element located 3' to the human erythropoietin gene." Proc Natl Acad Sci U S A 88(13): 5680-5684.
Semenza, G. L. and Wang, G. L. (1992). "A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation." Mol Cell Biol 12(12): 5447-5454.
Sensken, S. C. and Graler, M. H. (2010). "Down-regulation of S1P1 receptor surface expression by protein kinase C inhibition." J Biol Chem 285(9): 6298-6307.
Sentelle, R. D., Senkal, C. E., Jiang, W., Ponnusamy, S., Gencer, S., Selvam, S. P., Ramshesh, V. K., Peterson, Y. K., Lemasters, J. J., Szulc, Z. M., Bielawski, J. and Ogretmen, B. (2012). "Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy." Nat Chem Biol 8(10): 831-838.
Serriere-Lanneau, V., Teixeira-Clerc, F., Li, L., Schippers, M., de Wries, W., Julien, B., Tran-Van-Nhieu, J., Manin, S., Poelstra, K., Chun, J., Carpentier, S., Levade, T., Mallat, A. and Lotersztajn, S. (2007). "The sphingosine 1-phosphate receptor S1P2 triggers hepatic wound healing." FASEB J 21(9): 2005-2013.
Shay, J. E., Imtiyaz, H. Z., Sivanand, S., Durham, A. C., Skuli, N., Hsu, S., Mucaj, V., Eisinger-Mathason, T. S., Krock, B. L., Giannoukos, D. N. and Simon, M. C. (2014). "Inhibition of hypoxia-inducible factors limits tumor progression in a mouse model of colorectal cancer." Carcinogenesis 35(5): 1067-1077.
Shen, C., Beroukhim, R., Schumacher, S. E., Zhou, J., Chang, M., Signoretti, S. and Kaelin, W. G., Jr. (2011). "Genetic and functional studies implicate HIF1alpha as a 14q kidney cancer suppressor gene." Cancer Discov 1(3): 222-235.
Shibaji, T., Nagao, M., Ikeda, N., Kanehiro, H., Hisanaga, M., Ko, S., Fukumoto, A. and Nakajima, Y. (2003). "Prognostic significance of HIF-1 alpha overexpression in human pancreatic cancer." Anticancer Res 23(6C): 4721-4727.
Shida, D., Kitayama, J., Yamaguchi, H., Yamashita, H., Mori, K., Watanabe, T., Yatomi, Y. and Nagawa, H. (2004). "Sphingosine 1-phosphate transactivates c-Met as well as epidermal growth factor receptor (EGFR) in human gastric cancer cells." FEBS Lett 577(3): 333-338.
234!
Shin, D. H., Chun, Y. S., Lee, D. S., Huang, L. E. and Park, J. W. (2008). "Bortezomib inhibits tumor adaptation to hypoxia by stimulating the FIH-mediated repression of hypoxia-inducible factor-1." Blood 111(6): 3131-3136.
Shinojima, T., Oya, M., Takayanagi, A., Mizuno, R., Shimizu, N. and Murai, M. (2007). "Renal cancer cells lacking hypoxia inducible factor (HIF)-1alpha expression maintain vascular endothelial growth factor expression through HIF-2alpha." Carcinogenesis 28(3): 529-536.
Shohet, R. V. and Garcia, J. A. (2007). "Keeping the engine primed: HIF factors as key regulators of cardiac metabolism and angiogenesis during ischemia." J Mol Med (Berl) 85(12): 1309-1315.
Shojaei, F., Lee, J. H., Simmons, B. H., Wong, A., Esparza, C. O., Plumlee, P. A., Feng, J., Stewart, A. E., Hu-Lowe, D. D. and Christensen, J. G. (2010). "HGF/c-Met acts as an alternative angiogenic pathway in sunitinib-resistant tumors." Cancer Res 70(24): 10090-10100.
Shu, X., Wu, W., Mosteller, R. D. and Broek, D. (2002). "Sphingosine kinase mediates vascular endothelial growth factor-induced activation of ras and mitogen-activated protein kinases." Mol Cell Biol 22(22): 7758-7768.
Silva, V. R., Micheletti, T. O., Pimentel, G. D., Katashima, C. K., Lenhare, L., Morari, J., Mendes, M. C., Razolli, D. S., Rocha, G. Z., de Souza, C. T., Ryu, D., Prada, P. O., Velloso, L. A., Carvalheira, J. B., Pauli, J. R., Cintra, D. E. and Ropelle, E. R. (2014). "Hypothalamic S1P/S1PR1 axis controls energy homeostasis." Nat Commun 5: 4859.
Simon, M. C. (2004). "Siah proteins, HIF prolyl hydroxylases, and the physiological response to hypoxia." Cell 117(7): 851-853.
Simon, M. P., Tournaire, R. and Pouyssegur, J. (2008). "The angiopoietin-2 gene of endothelial cells is up-regulated in hypoxia by a HIF binding site located in its first intron and by the central factors GATA-2 and Ets-1." J Cell Physiol 217(3): 809-818.
Singh, S. K., Hawkins, C., Clarke, I. D., Squire, J. A., Bayani, J., Hide, T., Henkelman, R. M., Cusimano, M. D. and Dirks, P. B. (2004). "Identification of human brain tumour initiating cells." Nature 432(7015): 396-401.
Sitkovsky, M. and Ohta, A. (2013). "Targeting the hypoxia-adenosinergic signaling pathway to improve the adoptive immunotherapy of cancer." J Mol Med (Berl) 91(2): 147-155.
Siva, S., Pham, D., Gill, S., Corcoran, N. M. and Foroudi, F. (2012). "A systematic review of stereotactic radiotherapy ablation for primary renal cell carcinoma." BJU Int 110(11 Pt B): E737-743.
Skoura, A., Sanchez, T., Claffey, K., Mandala, S. M., Proia, R. L. and Hla, T. (2007). "Essential role of sphingosine 1-phosphate receptor 2 in pathological angiogenesis of the mouse retina." J Clin Invest 117(9): 2506-2516.
Skuli, N., Liu, L., Runge, A., Wang, T., Yuan, L., Patel, S., Iruela-Arispe, L., Simon, M. C. and Keith, B. (2009). "Endothelial deletion of hypoxia-inducible factor-2alpha (HIF-2alpha) alters vascular function and tumor angiogenesis." Blood 114(2): 469-477.
Skuli, N., Majmundar, A. J., Krock, B. L., Mesquita, R. C., Mathew, L. K., Quinn, Z. L., Runge, A., Liu, L., Kim, M. N., Liang, J., Schenkel, S., Yodh, A. G., Keith, B. and Simon, M. C. (2012). "Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes." J Clin Invest 122(4): 1427-1443.
Skuli, N., Monferran, S., Delmas, C., Lajoie-Mazenc, I., Favre, G., Toulas, C. and Cohen-Jonathan-Moyal, E. (2006). "Activation of RhoB by hypoxia controls hypoxia-inducible factor-1alpha stabilization through glycogen synthase kinase-3 in U87 glioblastoma cells." Cancer Res 66(1): 482-489.
235!
Snider, A. J., Kawamori, T., Bradshaw, S. G., Orr, K. A., Gilkeson, G. S., Hannun, Y. A. and Obeid, L. M. (2009). "A role for sphingosine kinase 1 in dextran sulfate sodium-induced colitis." FASEB J 23(1): 143-152.
Sogawa, K., Numayama-Tsuruta, K., Ema, M., Abe, M., Abe, H. and Fujii-Kuriyama, Y. (1998). "Inhibition of hypoxia-inducible factor 1 activity by nitric oxide donors in hypoxia." Proc Natl Acad Sci U S A 95(13): 7368-7373.
Sonenberg, N. and Hinnebusch, A. G. (2009). "Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets." Cell 136(4): 731-745.
Sorensen, A. G., Batchelor, T. T., Zhang, W. T., Chen, P. J., Yeo, P., Wang, M., Jennings, D., Wen, P. Y., Lahdenranta, J., Ancukiewicz, M., di Tomaso, E., Duda, D. G. and Jain, R. K. (2009). "A "vascular normalization index" as potential mechanistic biomarker to predict survival after a single dose of cediranib in recurrent glioblastoma patients." Cancer Res 69(13): 5296-5300.
Sorensen, A. G., Emblem, K. E., Polaskova, P., Jennings, D., Kim, H., Ancukiewicz, M., Wang, M., Wen, P. Y., Ivy, P., Batchelor, T. T. and Jain, R. K. (2012). "Increased survival of glioblastoma patients who respond to antiangiogenic therapy with elevated blood perfusion." Cancer Res 72(2): 402-407.
Speicher, M. R., Schoell, B., du Manoir, S., Schrock, E., Ried, T., Cremer, T., Storkel, S., Kovacs, A. and Kovacs, G. (1994). "Specific loss of chromosomes 1, 2, 6, 10, 13, 17, and 21 in chromophobe renal cell carcinomas revealed by comparative genomic hybridization." Am J Pathol 145(2): 356-364.
Spiegel, S. and Merrill, A. H., Jr. (1996). "Sphingolipid metabolism and cell growth regulation." FASEB J 10(12): 1388-1397.
Spiegel, S. and Milstien, S. (2003). "Sphingosine-1-phosphate: an enigmatic signalling lipid." Nat Rev Mol Cell Biol 4(5): 397-407.
Spiegel, S. and Milstien, S. (2011). "The outs and the ins of sphingosine-1-phosphate in immunity." Nat Rev Immunol 11(6): 403-415.
Stahelin, R. V., Hwang, J. H., Kim, J. H., Park, Z. Y., Johnson, K. R., Obeid, L. M. and Cho, W. (2005). "The mechanism of membrane targeting of human sphingosine kinase 1." J Biol Chem 280(52): 43030-43038.
Staller, P., Sulitkova, J., Lisztwan, J., Moch, H., Oakeley, E. J. and Krek, W. (2003). "Chemokine receptor CXCR4 downregulated by von Hippel-Lindau tumour suppressor pVHL." Nature 425(6955): 307-311.
Sternberg, C. N., Davis, I. D., Mardiak, J., Szczylik, C., Lee, E., Wagstaff, J., Barrios, C. H., Salman, P., Gladkov, O. A., Kavina, A., Zarba, J. J., Chen, M., McCann, L., Pandite, L., Roychowdhury, D. F. and Hawkins, R. E. (2010). "Pazopanib in locally advanced or metastatic renal cell carcinoma: results of a randomized phase III trial." J Clin Oncol 28(6): 1061-1068.
Stoffel, W., Heimann, G. and Hellenbroich, B. (1973). "Sphingosine kinase in blood platelets." Hoppe Seylers Z Physiol Chem 354(5): 562-566.
Stolze, I. P., Mole, D. R. and Ratcliffe, P. J. (2006). "Regulation of HIF: prolyl hydroxylases." Novartis Found Symp 272: 15-25; discussion 25-36.
Strub, G. M., Maceyka, M., Hait, N. C., Milstien, S. and Spiegel, S. (2010). "Extracellular and intracellular actions of sphingosine-1-phosphate." Adv Exp Med Biol 688: 141-155.
Strub, G. M., Paillard, M., Liang, J., Gomez, L., Allegood, J. C., Hait, N. C., Maceyka, M., Price, M. M., Chen, Q., Simpson, D. C., Kordula, T., Milstien, S., Lesnefsky, E. J. and Spiegel, S. (2011). "Sphingosine-1-phosphate produced by sphingosine kinase 2 in mitochondria interacts with prohibitin 2 to regulate complex IV assembly and respiration." FASEB J 25(2): 600-612.
236!
Sugiura, M., Kono, K., Liu, H., Shimizugawa, T., Minekura, H., Spiegel, S. and Kohama, T. (2002). "Ceramide kinase, a novel lipid kinase. Molecular cloning and functional characterization." J Biol Chem 277(26): 23294-23300.
Sukocheva, O., Wadham, C., Holmes, A., Albanese, N., Verrier, E., Feng, F., Bernal, A., Derian, C. K., Ullrich, A., Vadas, M. A. and Xia, P. (2006). "Estrogen transactivates EGFR via the sphingosine 1-phosphate receptor Edg-3: the role of sphingosine kinase-1." J Cell Biol 173(2): 301-310.
Summers, S. A. (2010). "Sphingolipids and insulin resistance: the five Ws." Curr Opin Lipidol 21(2): 128-135.
Sun, H. L., Liu, Y. N., Huang, Y. T., Pan, S. L., Huang, D. Y., Guh, J. H., Lee, F. Y., Kuo, S. C. and Teng, C. M. (2007). "YC-1 inhibits HIF-1 expression in prostate cancer cells: contribution of Akt/NF-kappaB signaling to HIF-1alpha accumulation during hypoxia." Oncogene 26(27): 3941-3951.
Sutherland, C. M., Moretti, P. A., Hewitt, N. M., Bagley, C. J., Vadas, M. A. and Pitson, S. M. (2006). "The calmodulin-binding site of sphingosine kinase and its role in agonist-dependent translocation of sphingosine kinase 1 to the plasma membrane." J Biol Chem 281(17): 11693-11701.
Suzuki, S., Enosawa, S., Kakefuda, T., Amemiya, H., Hoshino, Y. and Chiba, K. (1996). "Long-term graft acceptance in allografted rats and dogs by treatment with a novel immunosuppressant, FTY720." Transplant Proc 28(3): 1375-1376.
Swift, M. R. and Weinstein, B. M. (2009). "Arterial-venous specification during development." Circ Res 104(5): 576-588.
Synnestvedt, K., Furuta, G. T., Comerford, K. M., Louis, N., Karhausen, J., Eltzschig, H. K., Hansen, K. R., Thompson, L. F. and Colgan, S. P. (2002). "Ecto-5'-nucleotidase (CD73) regulation by hypoxia-inducible factor-1 mediates permeability changes in intestinal epithelia." J Clin Invest 110(7): 993-1002.
Szczepaniak, W. S., Pitt, B. R. and McVerry, B. J. (2010). "S1P2 receptor-dependent Rho-kinase activation mediates vasoconstriction in the murine pulmonary circulation induced by sphingosine 1-phosphate." Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 299(1): L137-145.
Taguchi, A., Yanagisawa, K., Tanaka, M., Cao, K., Matsuyama, Y., Goto, H. and Takahashi, T. (2008). "Identification of hypoxia-inducible factor-1 alpha as a novel target for miR-17-92 microRNA cluster." Cancer Res 68(14): 5540-5545.
Taha, T. A., Hannun, Y. A. and Obeid, L. M. (2006). "Sphingosine kinase: biochemical and cellular regulation and role in disease." J Biochem Mol Biol 39(2): 113-131.
Takabe, K., Kim, R. H., Allegood, J. C., Mitra, P., Ramachandran, S., Nagahashi, M., Harikumar, K. B., Hait, N. C., Milstien, S. and Spiegel, S. (2010). "Estradiol induces export of sphingosine 1-phosphate from breast cancer cells via ABCC1 and ABCG2." J Biol Chem 285(14): 10477-10486.
Takabe, K., Paugh, S. W., Milstien, S. and Spiegel, S. (2008). ""Inside-out" signaling of sphingosine-1-phosphate: therapeutic targets." Pharmacol Rev 60(2): 181-195.
Takahashi, A., Sasaki, H., Kim, S. J., Tobisu, K., Kakizoe, T., Tsukamoto, T., Kumamoto, Y., Sugimura, T. and Terada, M. (1994). "Markedly increased amounts of messenger RNAs for vascular endothelial growth factor and placenta growth factor in renal cell carcinoma associated with angiogenesis." Cancer Res 54(15): 4233-4237.
Takahashi, R., Tanaka, S., Hiyama, T., Ito, M., Kitadai, Y., Sumii, M., Haruma, K. and Chayama, K. (2003). "Hypoxia-inducible factor-1alpha expression and angiogenesis in gastrointestinal stromal tumor of the stomach." Oncol Rep 10(4): 797-802.
237!
Takasugi, N., Sasaki, T., Suzuki, K., Osawa, S., Isshiki, H., Hori, Y., Shimada, N., Higo, T., Yokoshima, S., Fukuyama, T., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Tomita, T. and Iwatsubo, T. (2011). "BACE1 activity is modulated by cell-associated sphingosine-1-phosphate." J Neurosci 31(18): 6850-6857.
Takeda, N., O'Dea, E. L., Doedens, A., Kim, J. W., Weidemann, A., Stockmann, C., Asagiri, M., Simon, M. C., Hoffmann, A. and Johnson, R. S. (2010). "Differential activation and antagonistic function of HIF-{alpha} isoforms in macrophages are essential for NO homeostasis." Genes Dev 24(5): 491-501.
Talks, K. L., Turley, H., Gatter, K. C., Maxwell, P. H., Pugh, C. W., Ratcliffe, P. J. and Harris, A. L. (2000). "The expression and distribution of the hypoxia-inducible factors HIF-1alpha and HIF-2alpha in normal human tissues, cancers, and tumor-associated macrophages." Am J Pathol 157(2): 411-421.
Tang, N., Wang, L., Esko, J., Giordano, F. J., Huang, Y., Gerber, H. P., Ferrara, N. and Johnson, R. S. (2004). "Loss of HIF-1alpha in endothelial cells disrupts a hypoxia-driven VEGF autocrine loop necessary for tumorigenesis." Cancer Cell 6(5): 485-495.
Tani, M., Ito, M. and Igarashi, Y. (2007). "Ceramide/sphingosine/sphingosine 1-phosphate metabolism on the cell surface and in the extracellular space." Cell Signal 19(2): 229-237.
Tanimoto, T., Jin, Z. G. and Berk, B. C. (2002). "Transactivation of vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor Flk-1/KDR is involved in sphingosine 1-phosphate-stimulated phosphorylation of Akt and endothelial nitric-oxide synthase (eNOS)." J Biol Chem 277(45): 42997-43001.
Terzuoli, E., Puppo, M., Rapisarda, A., Uranchimeg, B., Cao, L., Burger, A. M., Ziche, M. and Melillo, G. (2010). "Aminoflavone, a ligand of the aryl hydrocarbon receptor, inhibits HIF-1alpha expression in an AhR-independent fashion." Cancer Res 70(17): 6837-6848.
Theilmeier, G., Schmidt, C., Herrmann, J., Keul, P., Schafers, M., Herrgott, I., Mersmann, J., Larmann, J., Hermann, S., Stypmann, J., Schober, O., Hildebrand, R., Schulz, R., Heusch, G., Haude, M., von Wnuck Lipinski, K., Herzog, C., Schmitz, M., Erbel, R., Chun, J. and Levkau, B. (2006). "High-density lipoproteins and their constituent, sphingosine-1-phosphate, directly protect the heart against ischemia/reperfusion injury in vivo via the S1P3 lysophospholipid receptor." Circulation 114(13): 1403-1409.
Theodoropoulos, V. E., Lazaris, A., Sofras, F., Gerzelis, I., Tsoukala, V., Ghikonti, I., Manikas, K. and Kastriotis, I. (2004). "Hypoxia-inducible factor 1 alpha expression correlates with angiogenesis and unfavorable prognosis in bladder cancer." Eur Urol 46(2): 200-208.
Thomas, A. A., Rini, B. I., Lane, B. R., Garcia, J., Dreicer, R., Klein, E. A., Novick, A. C. and Campbell, S. C. (2009). "Response of the primary tumor to neoadjuvant sunitinib in patients with advanced renal cell carcinoma." J Urol 181(2): 518-523; discussion 523.
Thomas, G. V., Tran, C., Mellinghoff, I. K., Welsbie, D. S., Chan, E., Fueger, B., Czernin, J. and Sawyers, C. L. (2006). "Hypoxia-inducible factor determines sensitivity to inhibitors of mTOR in kidney cancer." Nat Med 12(1): 122-127.
Thuy, A. V., Reimann, C. M., Hemdan, N. Y. and Graler, M. H. (2014). "Sphingosine 1-phosphate in blood: function, metabolism, and fate." Cell Physiol Biochem 34(1): 158-171.
Tian, H., Hammer, R. E., Matsumoto, A. M., Russell, D. W. and McKnight, S. L. (1998). "The hypoxia-responsive transcription factor EPAS1 is essential for catecholamine homeostasis and protection against heart failure during embryonic development." Genes Dev 12(21): 3320-3324.
Tian, H., McKnight, S. L. and Russell, D. W. (1997). "Endothelial PAS domain protein 1 (EPAS1), a transcription factor selectively expressed in endothelial cells." Genes Dev 11(1): 72-82.
Tonelli, F., Lim, K. G., Loveridge, C., Long, J., Pitson, S. M., Tigyi, G., Bittman, R., Pyne, S. and Pyne, N. J. (2010). "FTY720 and (S)-FTY720 vinylphosphonate inhibit sphingosine kinase 1 and promote its
238!
proteasomal degradation in human pulmonary artery smooth muscle, breast cancer and androgen-independent prostate cancer cells." Cell Signal 22(10): 1536-1542.
Tong, R. T., Boucher, Y., Kozin, S. V., Winkler, F., Hicklin, D. J. and Jain, R. K. (2004). "Vascular normalization by vascular endothelial growth factor receptor 2 blockade induces a pressure gradient across the vasculature and improves drug penetration in tumors." Cancer Res 64(11): 3731-3736.
Tong, W. W., Tong, G. H., Chen, X. X., Zheng, H. C. and Wang, Y. Z. (2015). "HIF2alpha is associated with poor prognosis and affects the expression levels of survivin and cyclin D1 in gastric carcinoma." Int J Oncol 46(1): 233-242.
Tong, X., Zhao, F. and Thompson, C. B. (2009). "The molecular determinants of de novo nucleotide biosynthesis in cancer cells." Curr Opin Genet Dev 19(1): 32-37.
Topalian, S. L., Hodi, F. S., Brahmer, J. R., Gettinger, S. N., Smith, D. C., McDermott, D. F., Powderly, J. D., Carvajal, R. D., Sosman, J. A., Atkins, M. B., Leming, P. D., Spigel, D. R., Antonia, S. J., Horn, L., Drake, C. G., Pardoll, D. M., Chen, L., Sharfman, W. H., Anders, R. A., Taube, J. M., McMiller, T. L., Xu, H., Korman, A. J., Jure-Kunkel, M., Agrawal, S., McDonald, D., Kollia, G. D., Gupta, A., Wigginton, J. M. and Sznol, M. (2012). "Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer." N Engl J Med 366(26): 2443-2454.
Toro, J. R., Nickerson, M. L., Wei, M. H., Warren, M. B., Glenn, G. M., Turner, M. L., Stewart, L., Duray, P., Tourre, O., Sharma, N., Choyke, P., Stratton, P., Merino, M., Walther, M. M., Linehan, W. M., Schmidt, L. S. and Zbar, B. (2003). "Mutations in the fumarate hydratase gene cause hereditary leiomyomatosis and renal cell cancer in families in North America." Am J Hum Genet 73(1): 95-106.
Tory, K., Brauch, H., Linehan, M., Barba, D., Oldfield, E., Filling-Katz, M., Seizinger, B., Nakamura, Y., White, R., Marshall, F. F. and et al. (1989). "Specific genetic change in tumors associated with von Hippel-Lindau disease." J Natl Cancer Inst 81(14): 1097-1101.
Toschi, A., Edelstein, J., Rockwell, P., Ohh, M. and Foster, D. A. (2008a). "HIF alpha expression in VHL-deficient renal cancer cells is dependent on phospholipase D." Oncogene 27(19): 2746-2753.
Toschi, A., Lee, E., Gadir, N., Ohh, M. and Foster, D. A. (2008b). "Differential dependence of hypoxia-inducible factors 1 alpha and 2 alpha on mTORC1 and mTORC2." J Biol Chem 283(50): 34495-34499.
Trastour, C., Benizri, E., Ettore, F., Ramaioli, A., Chamorey, E., Pouyssegur, J. and Berra, E. (2007). "HIF-1alpha and CA IX staining in invasive breast carcinomas: prognosis and treatment outcome." Int J Cancer 120(7): 1451-1458.
Tsunemi, S., Iwasaki, T., Kitano, S., Imado, T., Miyazawa, K. and Sano, H. (2010). "Effects of the novel immunosuppressant FTY720 in a murine rheumatoid arthritis model." Clin Immunol 136(2): 197-204.
Tzao, C., Lee, S. C., Tung, H. J., Hsu, H. S., Hsu, W. H., Sun, G. H., Yu, C. P., Jin, J. S. and Cheng, Y. L. (2008). "Expression of hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha and vascular endothelial growth factor (VEGF)-D as outcome predictors in resected esophageal squamous cell carcinoma." Dis Markers 25(3): 141-148.
Uchida, T., Rossignol, F., Matthay, M. A., Mounier, R., Couette, S., Clottes, E. and Clerici, C. (2004). "Prolonged hypoxia differentially regulates hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha and HIF-2alpha expression in lung epithelial cells: implication of natural antisense HIF-1alpha." J Biol Chem 279(15): 14871-14878.
Ullah, M. S., Davies, A. J. and Halestrap, A. P. (2006). "The plasma membrane lactate transporter MCT4, but not MCT1, is up-regulated by hypoxia through a HIF-1alpha-dependent mechanism." J Biol Chem 281(14): 9030-9037.
239!
v. Hippel, E. (1904). "Über eine sehr seltene Erkrankung der Netzhaut." Albrecht von Graefes Archiv für Ophthalmologie 59(1): 83-106.
Van Brocklyn, J. R., Graler, M. H., Bernhardt, G., Hobson, J. P., Lipp, M. and Spiegel, S. (2000). "Sphingosine-1-phosphate is a ligand for the G protein-coupled receptor EDG-6." Blood 95(8): 2624-2629.
Van Brocklyn, J. R., Jackson, C. A., Pearl, D. K., Kotur, M. S., Snyder, P. J. and Prior, T. W. (2005). "Sphingosine kinase-1 expression correlates with poor survival of patients with glioblastoma multiforme: roles of sphingosine kinase isoforms in growth of glioblastoma cell lines." J Neuropathol Exp Neurol 64(8): 695-705.
van de Sluis, B., Groot, A. J., Vermeulen, J., van der Wall, E., van Diest, P. J., Wijmenga, C., Klomp, L. W. and Vooijs, M. (2009). "COMMD1 Promotes pVHL and O2-Independent Proteolysis of HIF-1alpha via HSP90/70." PLoS One 4(10): e7332.
van de Sluis, B., Mao, X., Zhai, Y., Groot, A. J., Vermeulen, J. F., van der Wall, E., van Diest, P. J., Hofker, M. H., Wijmenga, C., Klomp, L. W., Cho, K. R., Fearon, E. R., Vooijs, M. and Burstein, E. (2010). "COMMD1 disrupts HIF-1alpha/beta dimerization and inhibits human tumor cell invasion." J Clin Invest 120(6): 2119-2130.
van der Veldt, A. A., Meijerink, M. R., van den Eertwegh, A. J., Bex, A., de Gast, G., Haanen, J. B. and Boven, E. (2008). "Sunitinib for treatment of advanced renal cell cancer: primary tumor response." Clin Cancer Res 14(8): 2431-2436.
van Doorn, R., Lopes Pinheiro, M. A., Kooij, G., Lakeman, K., van het Hof, B., van der Pol, S. M., Geerts, D., van Horssen, J., van der Valk, P., van der Kam, E., Ronken, E., Reijerkerk, A. and de Vries, H. E. (2012). "Sphingosine 1-phosphate receptor 5 mediates the immune quiescence of the human brain endothelial barrier." J Neuroinflammation 9: 133.
van Hagen, M., Overmeer, R. M., Abolvardi, S. S. and Vertegaal, A. C. (2010). "RNF4 and VHL regulate the proteasomal degradation of SUMO-conjugated Hypoxia-Inducible Factor-2alpha." Nucleic Acids Res 38(6): 1922-1931.
van Meeteren, L. A., Brinkmann, V., Saulnier-Blache, J. S., Lynch, K. R. and Moolenaar, W. H. (2008). "Anticancer activity of FTY720: phosphorylated FTY720 inhibits autotaxin, a metastasis-enhancing and angiogenic lysophospholipase D." Cancer Lett 266(2): 203-208.
Van Poppel, H., Da Pozzo, L., Albrecht, W., Matveev, V., Bono, A., Borkowski, A., Colombel, M., Klotz, L., Skinner, E., Keane, T., Marreaud, S., Collette, S. and Sylvester, R. (2011). "A prospective, randomised EORTC intergroup phase 3 study comparing the oncologic outcome of elective nephron-sparing surgery and radical nephrectomy for low-stage renal cell carcinoma." Eur Urol 59(4): 543-552.
Van Poppel, H., Da Pozzo, L., Albrecht, W., Matveev, V., Bono, A., Borkowski, A., Marechal, J. M., Klotz, L., Skinner, E., Keane, T., Claessens, I., Sylvester, R., European Organization for, R., Treatment of, C., National Cancer Institute of Canada Clinical Trials, G., Southwest Oncology, G. and Eastern Cooperative Oncology, G. (2007). "A prospective randomized EORTC intergroup phase 3 study comparing the complications of elective nephron-sparing surgery and radical nephrectomy for low-stage renal cell carcinoma." Eur Urol 51(6): 1606-1615.
Varela, I., Tarpey, P., Raine, K., Huang, D., Ong, C. K., Stephens, P., Davies, H., Jones, D., Lin, M. L., Teague, J., Bignell, G., Butler, A., Cho, J., Dalgliesh, G. L., Galappaththige, D., Greenman, C., Hardy, C., Jia, M., Latimer, C., Lau, K. W., Marshall, J., McLaren, S., Menzies, A., Mudie, L., Stebbings, L., Largaespada, D. A., Wessels, L. F., Richard, S., Kahnoski, R. J., Anema, J., Tuveson, D. A., Perez-Mancera, P. A., Mustonen, V., Fischer, A., Adams, D. J., Rust, A., Chan-on, W., Subimerb, C., Dykema, K., Furge, K., Campbell, P. J., Teh, B. T., Stratton, M. R. and Futreal, P. A. (2011). "Exome sequencing identifies frequent mutation of the SWI/SNF complex gene PBRM1 in renal carcinoma." Nature 469(7331): 539-542.
240!
Vaupel, P. and Mayer, A. (2007). "Hypoxia in cancer: significance and impact on clinical outcome." Cancer Metastasis Rev 26(2): 225-239.
Venkata, J. K., An, N., Stuart, R., Costa, L. J., Cai, H., Coker, W., Song, J. H., Gibbs, K., Matson, T., Garrett-Mayer, E., Wan, Z., Ogretmen, B., Smith, C. and Kang, Y. (2014). "Inhibition of sphingosine kinase 2 downregulates the expression of c-Myc and Mcl-1 and induces apoptosis in multiple myeloma." Blood 124(12): 1915-1925.
Venkataraman, K., Lee, Y. M., Michaud, J., Thangada, S., Ai, Y., Bonkovsky, H. L., Parikh, N. S., Habrukowich, C. and Hla, T. (2008). "Vascular endothelium as a contributor of plasma sphingosine 1-phosphate." Circ Res 102(6): 669-676.
Venkataraman, K., Thangada, S., Michaud, J., Oo, M. L., Ai, Y., Lee, Y. M., Wu, M., Parikh, N. S., Khan, F., Proia, R. L. and Hla, T. (2006). "Extracellular export of sphingosine kinase-1a contributes to the vascular S1P gradient." Biochem J 397(3): 461-471.
Verhoest, G., Avakian, R., Bensalah, K., Thuret, R., Ficarra, V., Artibani, W., Tostain, J., Guille, F., Cindolo, L., De La Taille, A., Abbou, C. C., Salomon, L., Rioux-Leclercq, N. and Patard, J. J. (2009). "Urinary collecting system invasion is an independent prognostic factor of organ confined renal cell carcinoma." J Urol 182(3): 854-859.
Vessey, D. A., Kelley, M., Zhang, J., Li, L., Tao, R. and Karliner, J. S. (2007). "Dimethylsphingosine and FTY720 inhibit the SK1 form but activate the SK2 form of sphingosine kinase from rat heart." J Biochem Mol Toxicol 21(5): 273-279.
Visentin, B., Vekich, J. A., Sibbald, B. J., Cavalli, A. L., Moreno, K. M., Matteo, R. G., Garland, W. A., Lu, Y., Yu, S., Hall, H. S., Kundra, V., Mills, G. B. and Sabbadini, R. A. (2006). "Validation of an anti-sphingosine-1-phosphate antibody as a potential therapeutic in reducing growth, invasion, and angiogenesis in multiple tumor lineages." Cancer Cell 9(3): 225-238.
von Pawel, J., von Roemeling, R., Gatzemeier, U., Boyer, M., Elisson, L. O., Clark, P., Talbot, D., Rey, A., Butler, T. W., Hirsh, V., Olver, I., Bergman, B., Ayoub, J., Richardson, G., Dunlop, D., Arcenas, A., Vescio, R., Viallet, J. and Treat, J. (2000). "Tirapazamine plus cisplatin versus cisplatin in advanced non-small-cell lung cancer: A report of the international CATAPULT I study group. Cisplatin and Tirapazamine in Subjects with Advanced Previously Untreated Non-Small-Cell Lung Tumors." J Clin Oncol 18(6): 1351-1359.
Waeber, C. and Walther, T. (2014). "Sphingosine-1-phosphate as a potential target for the treatment of myocardial infarction." Circ J 78(4): 795-802.
Walenta, S. and Mueller-Klieser, W. F. (2004). "Lactate: mirror and motor of tumor malignancy." Semin Radiat Oncol 14(3): 267-274.
Wallington-Beddoe, C. T., Powell, J. A., Tong, D., Pitson, S. M., Bradstock, K. F. and Bendall, L. J. (2014). "Sphingosine kinase 2 promotes acute lymphoblastic leukemia by enhancing MYC expression." Cancer Res 74(10): 2803-2815.
Walzer, T., Chiossone, L., Chaix, J., Calver, A., Carozzo, C., Garrigue-Antar, L., Jacques, Y., Baratin, M., Tomasello, E. and Vivier, E. (2007). "Natural killer cell trafficking in vivo requires a dedicated sphingosine 1-phosphate receptor." Nat Immunol 8(12): 1337-1344.
Wan, X., Shen, N., Mendoza, A., Khanna, C. and Helman, L. J. (2006). "CCI-779 inhibits rhabdomyosarcoma xenograft growth by an antiangiogenic mechanism linked to the targeting of mTOR/Hif-1alpha/VEGF signaling." Neoplasia 8(5): 394-401.
Wang, C., Mao, J., Redfield, S., Mo, Y., Lage, J. M. and Zhou, X. (2014a). "Systemic distribution, subcellular localization and differential expression of sphingosine-1-phosphate receptors in benign and malignant human tissues." Exp Mol Pathol 97(2): 259-265.
241!
Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A. and Semenza, G. L. (1995). "Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension." Proc Natl Acad Sci U S A 92(12): 5510-5514.
Wang, G. L. and Semenza, G. L. (1995). "Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1." J Biol Chem 270(3): 1230-1237.
Wang, H. X., Qin, C., Han, F. Y., Wang, X. H. and Li, N. (2014b). "HIF-2alpha as a prognostic marker for breast cancer progression and patient survival." Genet Mol Res 13(2): 2817-2826.
Wang, J., Knapp, S., Pyne, N. J., Pyne, S. and Elkins, J. M. (2014c). "Crystal Structure of Sphingosine Kinase 1 with PF-543." ACS Med Chem Lett 5(12): 1329-1333.
Wang, J. D., Takahara, S., Nonomura, N., Ichimaru, N., Toki, K., Azuma, H., Matsumiya, K., Okuyama, A. and Suzuki, S. (1999). "Early induction of apoptosis in androgen-independent prostate cancer cell line by FTY720 requires caspase-3 activation." Prostate 40(1): 50-55.
Wang, L., Xing, X. P., Holmes, A., Wadham, C., Gamble, J. R., Vadas, M. A. and Xia, P. (2005a). "Activation of the sphingosine kinase-signaling pathway by high glucose mediates the proinflammatory phenotype of endothelial cells." Circ Res 97(9): 891-899.
Wang, W., Graeler, M. H. and Goetzl, E. J. (2005b). "Type 4 sphingosine 1-phosphate G protein-coupled receptor (S1P4) transduces S1P effects on T cell proliferation and cytokine secretion without signaling migration." FASEB J 19(12): 1731-1733.
Wang, Y., Liu, Y., Tang, F., Bernot, K. M., Schore, R., Marcucci, G., Caligiuri, M. A., Zheng, P. and Liu, Y. (2014d). "Echinomycin protects mice against relapsed acute myeloid leukemia without adverse effect on hematopoietic stem cells." Blood 124(7): 1127-1135.
Wang, Y., Wan, C., Deng, L., Liu, X., Cao, X., Gilbert, S. R., Bouxsein, M. L., Faugere, M. C., Guldberg, R. E., Gerstenfeld, L. C., Haase, V. H., Johnson, R. S., Schipani, E. and Clemens, T. L. (2007). "The hypoxia-inducible factor alpha pathway couples angiogenesis to osteogenesis during skeletal development." J Clin Invest 117(6): 1616-1626.
Wang, Z., Min, X., Xiao, S. H., Johnstone, S., Romanow, W., Meininger, D., Xu, H., Liu, J., Dai, J., An, S., Thibault, S. and Walker, N. (2013). "Molecular basis of sphingosine kinase 1 substrate recognition and catalysis." Structure 21(5): 798-809.
Warburg, O. (1956). "On respiratory impairment in cancer cells." Science 124(3215): 269-270.
Waters, C., Sambi, B., Kong, K. C., Thompson, D., Pitson, S. M., Pyne, S. and Pyne, N. J. (2003). "Sphingosine 1-phosphate and platelet-derived growth factor (PDGF) act via PDGF beta receptor-sphingosine 1-phosphate receptor complexes in airway smooth muscle cells." J Biol Chem 278(8): 6282-6290.
Weir, E. K., Lopez-Barneo, J., Buckler, K. J. and Archer, S. L. (2005). "Acute oxygen-sensing mechanisms." N Engl J Med 353(19): 2042-2055.
Welsh, S. J., Williams, R. R., Birmingham, A., Newman, D. J., Kirkpatrick, D. L. and Powis, G. (2003). "The thioredoxin redox inhibitors 1-methylpropyl 2-imidazolyl disulfide and pleurotin inhibit hypoxia-induced factor 1alpha and vascular endothelial growth factor formation." Mol Cancer Ther 2(3): 235-243.
Wenger, R. H. (2002). "Cellular adaptation to hypoxia: O2-sensing protein hydroxylases, hypoxia-inducible transcription factors, and O2-regulated gene expression." FASEB J 16(10): 1151-1162.
Wenger, R. H., Rolfs, A., Marti, H. H., Guenet, J. L. and Gassmann, M. (1996). "Nucleotide sequence, chromosomal assignment and mRNA expression of mouse hypoxia-inducible factor-1 alpha." Biochem Biophys Res Commun 223(1): 54-59.
242!
Wiesener, M. S., Jurgensen, J. S., Rosenberger, C., Scholze, C. K., Horstrup, J. H., Warnecke, C., Mandriota, S., Bechmann, I., Frei, U. A., Pugh, C. W., Ratcliffe, P. J., Bachmann, S., Maxwell, P. H. and Eckardt, K. U. (2003). "Widespread hypoxia-inducible expression of HIF-2alpha in distinct cell populations of different organs." FASEB J 17(2): 271-273.
Wilkerson, B. A. and Argraves, K. M. (2014). "The role of sphingosine-1-phosphate in endothelial barrier function." Biochim Biophys Acta 1841(10): 1403-1412.
Wilkes, D. S. (2011). "Chronic lung allograft rejection and airway microvasculature: is HIF-1 the missing link?" J Clin Invest 121(6): 2155-2157.
Willett, C. G., Boucher, Y., di Tomaso, E., Duda, D. G., Munn, L. L., Tong, R. T., Chung, D. C., Sahani, D. V., Kalva, S. P., Kozin, S. V., Mino, M., Cohen, K. S., Scadden, D. T., Hartford, A. C., Fischman, A. J., Clark, J. W., Ryan, D. P., Zhu, A. X., Blaszkowsky, L. S., Chen, H. X., Shellito, P. C., Lauwers, G. Y. and Jain, R. K. (2004). "Direct evidence that the VEGF-specific antibody bevacizumab has antivascular effects in human rectal cancer." Nat Med 10(2): 145-147.
Wilson, W. R. and Hay, M. P. (2011). "Targeting hypoxia in cancer therapy." Nat Rev Cancer 11(6): 393-410.
Windh, R. T., Lee, M. J., Hla, T., An, S., Barr, A. J. and Manning, D. R. (1999). "Differential coupling of the sphingosine 1-phosphate receptors Edg-1, Edg-3, and H218/Edg-5 to the G(i), G(q), and G(12) families of heterotrimeric G proteins." J Biol Chem 274(39): 27351-27358.
Winkler, F., Kozin, S. V., Tong, R. T., Chae, S. S., Booth, M. F., Garkavtsev, I., Xu, L., Hicklin, D. J., Fukumura, D., di Tomaso, E., Munn, L. L. and Jain, R. K. (2004). "Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radiation: role of oxygenation, angiopoietin-1, and matrix metalloproteinases." Cancer Cell 6(6): 553-563.
Winter, S. C., Shah, K. A., Han, C., Campo, L., Turley, H., Leek, R., Corbridge, R. J., Cox, G. J. and Harris, A. L. (2006). "The relation between hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha and HIF-2alpha expression with anemia and outcome in surgically treated head and neck cancer." Cancer 107(4): 757-766.
Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W. and Plate, K. H. (1995). "Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas." Cancer Res 55(6): 1358-1364.
Wong, C. C., Gilkes, D. M., Zhang, H., Chen, J., Wei, H., Chaturvedi, P., Fraley, S. I., Wong, C. M., Khoo, U. S., Ng, I. O., Wirtz, D. and Semenza, G. L. (2011). "Hypoxia-inducible factor 1 is a master regulator of breast cancer metastatic niche formation." Proc Natl Acad Sci U S A 108(39): 16369-16374.
Wong, C. C., Zhang, H., Gilkes, D. M., Chen, J., Wei, H., Chaturvedi, P., Hubbi, M. E. and Semenza, G. L. (2012). "Inhibitors of hypoxia-inducible factor 1 block breast cancer metastatic niche formation and lung metastasis." J Mol Med (Berl) 90(7): 803-815.
Wu, W., Mosteller, R. D. and Broek, D. (2004). "Sphingosine kinase protects lipopolysaccharide-activated macrophages from apoptosis." Mol Cell Biol 24(17): 7359-7369.
Wu, X. H., Qian, C. and Yuan, K. (2011). "Correlations of hypoxia-inducible factor-1alpha/hypoxia-inducible factor-2alpha expression with angiogenesis factors expression and prognosis in non-small cell lung cancer." Chin Med J (Engl) 124(1): 11-18.
Xia, P., Gamble, J. R., Rye, K. A., Wang, L., Hii, C. S., Cockerill, P., Khew-Goodall, Y., Bert, A. G., Barter, P. J. and Vadas, M. A. (1998). "Tumor necrosis factor-alpha induces adhesion molecule expression through the sphingosine kinase pathway." Proc Natl Acad Sci U S A 95(24): 14196-14201.
Xia, P., Gamble, J. R., Wang, L., Pitson, S. M., Moretti, P. A., Wattenberg, B. W., D'Andrea, R. J. and Vadas, M. A. (2000). "An oncogenic role of sphingosine kinase." Curr Biol 10(23): 1527-1530.
243!
Xia, P., Wang, L., Moretti, P. A., Albanese, N., Chai, F., Pitson, S. M., D'Andrea, R. J., Gamble, J. R. and Vadas, M. A. (2002). "Sphingosine kinase interacts with TRAF2 and dissects tumor necrosis factor-alpha signaling." J Biol Chem 277(10): 7996-8003.
Xing, Y., Wang, Z. H., Ma, D. H. and Han, Y. (2014). "FTY720 enhances chemosensitivity of colon cancer cells to doxorubicin and etoposide via the modulation of P-glycoprotein and multidrug resistance protein 1." J Dig Dis 15(5): 246-259.
Xiong, Y., Yang, P., Proia, R. L. and Hla, T. (2014). "Erythrocyte-derived sphingosine 1-phosphate is essential for vascular development." J Clin Invest 124(11): 4823-4828.
Xu, Y., Li, Q., Li, X. Y., Yang, Q. Y., Xu, W. W. and Liu, G. L. (2012). "Short-term anti-vascular endothelial growth factor treatment elicits vasculogenic mimicry formation of tumors to accelerate metastasis." J Exp Clin Cancer Res 31: 16.
Yagi, H., Kamba, R., Chiba, K., Soga, H., Yaguchi, K., Nakamura, M. and Itoh, T. (2000). "Immunosuppressant FTY720 inhibits thymocyte emigration." Eur J Immunol 30(5): 1435-1444.
Yamaguchi, F., Tokuda, M., Hatase, O. and Brenner, S. (1996). "Molecular cloning of the novel human G protein-coupled receptor (GPCR) gene mapped on chromosome 9." Biochem Biophys Res Commun 227(2): 608-614.
Yamakawa, M., Liu, L. X., Belanger, A. J., Date, T., Kuriyama, T., Goldberg, M. A., Cheng, S. H., Gregory, R. J. and Jiang, C. (2004). "Expression of angiopoietins in renal epithelial and clear cell carcinoma cells: regulation by hypoxia and participation in angiogenesis." Am J Physiol Renal Physiol 287(4): F649-657.
Yamakawa, M., Liu, L. X., Date, T., Belanger, A. J., Vincent, K. A., Akita, G. Y., Kuriyama, T., Cheng, S. H., Gregory, R. J. and Jiang, C. (2003). "Hypoxia-inducible factor-1 mediates activation of cultured vascular endothelial cells by inducing multiple angiogenic factors." Circ Res 93(7): 664-673.
Yamakuchi, M., Lotterman, C. D., Bao, C., Hruban, R. H., Karim, B., Mendell, J. T., Huso, D. and Lowenstein, C. J. (2010). "P53-induced microRNA-107 inhibits HIF-1 and tumor angiogenesis." Proc Natl Acad Sci U S A 107(14): 6334-6339.
Yamamoto, Y., Ibusuki, M., Okumura, Y., Kawasoe, T., Kai, K., Iyama, K. and Iwase, H. (2008). "Hypoxia-inducible factor 1alpha is closely linked to an aggressive phenotype in breast cancer." Breast Cancer Res Treat 110(3): 465-475.
Yamazaki, K., Sakamoto, M., Ohta, T., Kanai, Y., Ohki, M. and Hirohashi, S. (2003). "Overexpression of KIT in chromophobe renal cell carcinoma." Oncogene 22(6): 847-852.
Yamazaki, Y., Kon, J., Sato, K., Tomura, H., Sato, M., Yoneya, T., Okazaki, H., Okajima, F. and Ohta, H. (2000). "Edg-6 as a putative sphingosine 1-phosphate receptor coupling to Ca(2+) signaling pathway." Biochem Biophys Res Commun 268(2): 583-589.
Yan, Q., Bartz, S., Mao, M., Li, L. and Kaelin, W. G., Jr. (2007). "The hypoxia-inducible factor 2alpha N-terminal and C-terminal transactivation domains cooperate to promote renal tumorigenesis in vivo." Mol Cell Biol 27(6): 2092-2102.
Yang, J. C., Haworth, L., Sherry, R. M., Hwu, P., Schwartzentruber, D. J., Topalian, S. L., Steinberg, S. M., Chen, H. X. and Rosenberg, S. A. (2003a). "A randomized trial of bevacizumab, an anti-vascular endothelial growth factor antibody, for metastatic renal cancer." N Engl J Med 349(5): 427-434.
Yang, J. C., Sherry, R. M., Steinberg, S. M., Topalian, S. L., Schwartzentruber, D. J., Hwu, P., Seipp, C. A., Rogers-Freezer, L., Morton, K. E., White, D. E., Liewehr, D. J., Merino, M. J. and Rosenberg, S. A. (2003b). "Randomized study of high-dose and low-dose interleukin-2 in patients with metastatic renal cancer." J Clin Oncol 21(16): 3127-3132.
244!
Yang, M. H. and Wu, K. J. (2008). "TWIST activation by hypoxia inducible factor-1 (HIF-1): implications in metastasis and development." Cell Cycle 7(14): 2090-2096.
Yasinska, I. M. and Sumbayev, V. V. (2003). "S-nitrosation of Cys-800 of HIF-1alpha protein activates its interaction with p300 and stimulates its transcriptional activity." FEBS Lett 549(1-3): 105-109.
Yatabe, N., Kyo, S., Maida, Y., Nishi, H., Nakamura, M., Kanaya, T., Tanaka, M., Isaka, K., Ogawa, S. and Inoue, M. (2004). "HIF-1-mediated activation of telomerase in cervical cancer cells." Oncogene 23(20): 3708-3715.
Yeo, E. J., Ryu, J. H., Cho, Y. S., Chun, Y. S., Huang, L. E., Kim, M. S. and Park, J. W. (2006). "Amphotericin B blunts erythropoietin response to hypoxia by reinforcing FIH-mediated repression of HIF-1." Blood 107(3): 916-923.
Yokota, S., Taniguchi, Y., Kihara, A., Mitsutake, S. and Igarashi, Y. (2004). "Asp177 in C4 domain of mouse sphingosine kinase 1a is important for the sphingosine recognition." FEBS Lett 578(1-2): 106-110.
Yoshida, T., Zhang, H., Iwase, T., Shen, J., Semenza, G. L. and Campochiaro, P. A. (2010a). "Digoxin inhibits retinal ischemia-induced HIF-1alpha expression and ocular neovascularization." FASEB J 24(6): 1759-1767.
Yoshida, Y., Nakada, M., Sugimoto, N., Harada, T., Hayashi, Y., Kita, D., Uchiyama, N., Hayashi, Y., Yachie, A., Takuwa, Y. and Hamada, J. (2010b). "Sphingosine-1-phosphate receptor type 1 regulates glioma cell proliferation and correlates with patient survival." Int J Cancer 126(10): 2341-2352.
Yoshimura, H., Dhar, D. K., Kohno, H., Kubota, H., Fujii, T., Ueda, S., Kinugasa, S., Tachibana, M. and Nagasue, N. (2004). "Prognostic impact of hypoxia-inducible factors 1alpha and 2alpha in colorectal cancer patients: correlation with tumor angiogenesis and cyclooxygenase-2 expression." Clin Cancer Res 10(24): 8554-8560.
Young, A. C., Craven, R. A., Cohen, D., Taylor, C., Booth, C., Harnden, P., Cairns, D. A., Astuti, D., Gregory, W., Maher, E. R., Knowles, M. A., Joyce, A., Selby, P. J. and Banks, R. E. (2009). "Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma." Clin Cancer Res 15(24): 7582-7592.
Young, K. W., Challiss, R. A., Nahorski, S. R. and MacKrill, J. J. (1999). "Lysophosphatidic acid-mediated Ca2+ mobilization in human SH-SY5Y neuroblastoma cells is independent of phosphoinositide signalling, but dependent on sphingosine kinase activation." Biochem J 343 Pt 1: 45-52.
Yu, A. Y., Shimoda, L. A., Iyer, N. V., Huso, D. L., Sun, X., McWilliams, R., Beaty, T., Sham, J. S., Wiener, C. M., Sylvester, J. T. and Semenza, G. L. (1999). "Impaired physiological responses to chronic hypoxia in mice partially deficient for hypoxia-inducible factor 1alpha." J Clin Invest 103(5): 691-696.
Yuan, F., Chen, Y., Dellian, M., Safabakhsh, N., Ferrara, N. and Jain, R. K. (1996). "Time-dependent vascular regression and permeability changes in established human tumor xenografts induced by an anti-vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor antibody." Proc Natl Acad Sci U S A 93(25): 14765-14770.
Yun, Z., Maecker, H. L., Johnson, R. S. and Giaccia, A. J. (2002). "Inhibition of PPAR gamma 2 gene expression by the HIF-1-regulated gene DEC1/Stra13: a mechanism for regulation of adipogenesis by hypoxia." Dev Cell 2(3): 331-341.
Zagzag, D., Lukyanov, Y., Lan, L., Ali, M. A., Esencay, M., Mendez, O., Yee, H., Voura, E. B. and Newcomb, E. W. (2006). "Hypoxia-inducible factor 1 and VEGF upregulate CXCR4 in glioblastoma: implications for angiogenesis and glioma cell invasion." Lab Invest 86(12): 1221-1232.
Zbar, B., Brauch, H., Talmadge, C. and Linehan, M. (1987). "Loss of alleles of loci on the short arm of chromosome 3 in renal cell carcinoma." Nature 327(6124): 721-724.
245!
Zhang, G., Yang, L., Kim, G. S., Ryan, K., Lu, S., O'Donnell, R. K., Spokes, K., Shapiro, N., Aird, W. C., Kluk, M. J., Yano, K. and Sanchez, T. (2013a). "Critical role of sphingosine-1-phosphate receptor 2 (S1PR2) in acute vascular inflammation." Blood 122(3): 443-455.
Zhang, H., Bosch-Marce, M., Shimoda, L. A., Tan, Y. S., Baek, J. H., Wesley, J. B., Gonzalez, F. J. and Semenza, G. L. (2008a). "Mitochondrial autophagy is an HIF-1-dependent adaptive metabolic response to hypoxia." J Biol Chem 283(16): 10892-10903.
Zhang, H., Gao, P., Fukuda, R., Kumar, G., Krishnamachary, B., Zeller, K. I., Dang, C. V. and Semenza, G. L. (2007). "HIF-1 inhibits mitochondrial biogenesis and cellular respiration in VHL-deficient renal cell carcinoma by repression of C-MYC activity." Cancer Cell 11(5): 407-420.
Zhang, H., Pu, J., Qi, T., Qi, M., Yang, C., Li, S., Huang, K., Zheng, L. and Tong, Q. (2014a). "MicroRNA-145 inhibits the growth, invasion, metastasis and angiogenesis of neuroblastoma cells through targeting hypoxia-inducible factor 2 alpha." Oncogene 33(3): 387-397.
Zhang, H., Qian, D. Z., Tan, Y. S., Lee, K., Gao, P., Ren, Y. R., Rey, S., Hammers, H., Chang, D., Pili, R., Dang, C. V., Liu, J. O. and Semenza, G. L. (2008b). "Digoxin and other cardiac glycosides inhibit HIF-1alpha synthesis and block tumor growth." Proc Natl Acad Sci U S A 105(50): 19579-19586.
Zhang, H., Wong, C. C., Wei, H., Gilkes, D. M., Korangath, P., Chaturvedi, P., Schito, L., Chen, J., Krishnamachary, B., Winnard, P. T., Jr., Raman, V., Zhen, L., Mitzner, W. A., Sukumar, S. and Semenza, G. L. (2012). "HIF-1-dependent expression of angiopoietin-like 4 and L1CAM mediates vascular metastasis of hypoxic breast cancer cells to the lungs." Oncogene 31(14): 1757-1770.
Zhang, L., Wang, X., Bullock, A. J., Callea, M., Shah, H., Song, J., Moreno, K., Visentin, B., Deutschman, D., Alsop, D. C., Atkins, M. B., Mier, J. W., Signoretti, S., Bhasin, M., Sabbadini, R. A. and Bhatt, R. S. (2015). "Anti-S1P Antibody as a Novel Therapeutic Strategy for VEGFR TKI-Resistant Renal Cancer." Clin Cancer Res.
Zhang, N., Qi, Y., Wadham, C., Wang, L., Warren, A., Di, W. and Xia, P. (2010). "FTY720 induces necrotic cell death and autophagy in ovarian cancer cells: a protective role of autophagy." Autophagy 6(8): 1157-1167.
Zhang, P., Yao, Q., Lu, L., Li, Y., Chen, P. J. and Duan, C. (2014b). "Hypoxia-inducible factor 3 is an oxygen-dependent transcription activator and regulates a distinct transcriptional response to hypoxia." Cell Rep 6(6): 1110-1121.
Zhang, Y., Sun, B., Zhao, X., Liu, Z., Wang, X., Yao, X., Dong, X. and Chi, J. (2013b). "Clinical significances and prognostic value of cancer stem-like cells markers and vasculogenic mimicry in renal cell carcinoma." J Surg Oncol 108(6): 414-419.
Zhang, Y., Wang, Y., Wan, Z., Liu, S., Cao, Y. and Zeng, Z. (2014c). "Sphingosine kinase 1 and cancer: a systematic review and meta-analysis." PLoS One 9(2): e90362.
Zhao, D., Zhai, B., He, C., Tan, G., Jiang, X., Pan, S., Dong, X., Wei, Z., Ma, L., Qiao, H., Jiang, H. and Sun, X. (2014). "Upregulation of HIF-2alpha induced by sorafenib contributes to the resistance by activating the TGF-alpha/EGFR pathway in hepatocellular carcinoma cells." Cell Signal 26(5): 1030-1039.
Zhao, F., Mancuso, A., Bui, T. V., Tong, X., Gruber, J. J., Swider, C. R., Sanchez, P. V., Lum, J. J., Sayed, N., Melo, J. V., Perl, A. E., Carroll, M., Tuttle, S. W. and Thompson, C. B. (2010). "Imatinib resistance associated with BCR-ABL upregulation is dependent on HIF-1alpha-induced metabolic reprograming." Oncogene 29(20): 2962-2972.
Zhao, T., Ren, H., Jia, L., Chen, J., Xin, W., Yan, F., Li, J., Wang, X., Gao, S., Qian, D., Huang, C. and Hao, J. (2015). "Inhibition of HIF-1alpha by PX-478 enhances the anti-tumor effect of gemcitabine by inducing immunogenic cell death in pancreatic ductal adenocarcinoma." Oncotarget 6(4): 2250-2262.
246!
Zhong, H., Chiles, K., Feldser, D., Laughner, E., Hanrahan, C., Georgescu, M. M., Simons, J. W. and Semenza, G. L. (2000). "Modulation of hypoxia-inducible factor 1alpha expression by the epidermal growth factor/phosphatidylinositol 3-kinase/PTEN/AKT/FRAP pathway in human prostate cancer cells: implications for tumor angiogenesis and therapeutics." Cancer Res 60(6): 1541-1545.
Zhong, H., De Marzo, A. M., Laughner, E., Lim, M., Hilton, D. A., Zagzag, D., Buechler, P., Isaacs, W. B., Semenza, G. L. and Simons, J. W. (1999). "Overexpression of hypoxia-inducible factor 1alpha in common human cancers and their metastases." Cancer Res 59(22): 5830-5835.
Zhong, L., D'Urso, A., Toiber, D., Sebastian, C., Henry, R. E., Vadysirisack, D. D., Guimaraes, A., Marinelli, B., Wikstrom, J. D., Nir, T., Clish, C. B., Vaitheesvaran, B., Iliopoulos, O., Kurland, I., Dor, Y., Weissleder, R., Shirihai, O. S., Ellisen, L. W., Espinosa, J. M. and Mostoslavsky, R. (2010). "The histone deacetylase Sirt6 regulates glucose homeostasis via Hif1alpha." Cell 140(2): 280-293.
Zhou, Q., Liu, L. Z., Fu, B., Hu, X., Shi, X., Fang, J. and Jiang, B. H. (2007). "Reactive oxygen species regulate insulin-induced VEGF and HIF-1alpha expression through the activation of p70S6K1 in human prostate cancer cells." Carcinogenesis 28(1): 28-37.
Zimmer, M., Ebert, B. L., Neil, C., Brenner, K., Papaioannou, I., Melas, A., Tolliday, N., Lamb, J., Pantopoulos, K., Golub, T. and Iliopoulos, O. (2008). "Small-molecule inhibitors of HIF-2a translation link its 5'UTR iron-responsive element to oxygen sensing." Mol Cell 32(6): 838-848.
Zinkernagel, A. S., Johnson, R. S. and Nizet, V. (2007). "Hypoxia inducible factor (HIF) function in innate immunity and infection." J Mol Med (Berl) 85(12): 1339-1346.
Zondag, G. C., Postma, F. R., Etten, I. V., Verlaan, I. and Moolenaar, W. H. (1998). "Sphingosine 1-phosphate signalling through the G-protein-coupled receptor Edg-1." Biochem J 330 ( Pt 2): 605-609.
Zundel, W., Schindler, C., Haas-Kogan, D., Koong, A., Kaper, F., Chen, E., Gottschalk, A. R., Ryan, H. E., Johnson, R. S., Jefferson, A. B., Stokoe, D. and Giaccia, A. J. (2000). "Loss of PTEN facilitates HIF-1-mediated gene expression." Genes Dev 14(4): 391-396.
247!
Travail Collaboratif
Oncotarget1www.impactjournals.com/oncotarget
www.impactjournals.com/oncotarget/ Oncotarget, Advance Publications 2015
Neutralizing S1P inhibits intratumoral hypoxia, induces vascular remodelling and sensitizes to chemotherapy in prostate cancer
Isabelle Ader1,2,3, Cécile Gstalder1,2,3,*, Pierre Bouquerel1,2,3,*, Muriel Golzio1,2, Guillaume Andrieu1,2,3, Santiago Zalvidea5, Sylvain Richard5, Roger A. Sabbadini6, Bernard Malavaud1,2,3,4, Olivier Cuvillier1,2,3
1CNRS, Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, Toulouse, France2Université de Toulouse, UPS, IPBS, Toulouse, France3Equipe Labellisée Ligue contre le Cancer4Hôpital Rangueil, Service d’Urologie et de Transplantation Rénale, Toulouse, France5INSERM U1046, Université Montpellier 1, Université Montpellier 2, CHU Arnaud de Villeneuve, Montpellier, France6Lpath Inc., San Diego, CA, USA*These authors have contributed equally to this work
Correspondence to:Olivier Cuvillier, e-mail: [email protected] or [email protected]: angiogenesis, hypoxia, sphingolipid, vessel normalization
Received: December 01, 2014 Accepted: January 12, 2015 Published: January 29, 2015
ABSTRACTHypoxia promotes neovascularization, increased tumor growth, and therapeutic
resistance. The transcription factor, hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α), has been reported as the master driver of adaptation to hypoxia. We previously identified the sphingosine kinase 1/sphingosine 1-phosphate (SphK1/S1P) pathway as a new modulator of HIF-1α under hypoxia. Taking advantage of a monoclonal antibody neutralizing extracellular S1P (sphingomab), we report that inhibition of S1P extracellular signaling blocks HIF-1α accumulation and activity in several cancer cell models exposed to hypoxia. In an orthotopic xenograft model of prostate cancer, we show that sphingomab reduces hypoxia and modifies vessel architecture within 5 days of treatment, leading to increased intratumoral blood perfusion. Supporting the notion that a transient vascular normalization of tumor vessels is the mechanism by which sphingomab exerts its effects, we demonstrate that administration of the antibody for 5 days before chemotherapy is more effective at local tumor control and metastatic dissemination than any other treatment scheduling. These findings validate sphingomab as a potential new normalization agent that could contribute to successful sensitization of hypoxic tumors to chemotherapy.
INTRODUCTION
Sphingosine 1-phosphate (S1P) is a bioactive sphingolipid metabolite regulating pleiotropic activities such as proliferation, survival, migration, inflammation or angiogenesis [1–4]. The S1P content in cells is low and is kept under control through a delicately regulated balance between its synthesis and its degradation. The balance between the intracellular levels of S1P and its metabolic precursors, ceramide and sphingosine, has been suggested to be a switch determining whether a cell proliferates or dies [5]. The predominant regulator of this ceramide/S1P balance is the sphingosine kinase-1 (SphK1)
isoform, which produces S1P from sphingosine [6]. Once generated, S1P is exported by specific transporters such as spinster 2 (Spns2) [7–9], to exert paracrine or autocrine effects as a ligand for five high-affinity G protein-coupled receptors (S1P1–5), with specific effects dictated by the predominance of S1P receptor subtypes expressed [10]. Alternative GPCR-independent signaling of S1P also exist [11] with recent findings demonstrating direct modulation of several intracellular proteins [12, 13].
In cancer, S1P metabolism is often found to be dysregulated directing attention to the SphK1/S1P signaling pathway as a target for anti-cancer drug discovery [14–16]. In a number of solid tumors, high
Oncotarget2www.impactjournals.com/oncotarget
SphK1 expression correlates with a significant decrease in survival rate in patients [17–20]. The S1P produced by SphK1 is widely appreciated as a general growth-like factor and a potent protector against apoptosis induced by cytotoxic agents and other therapies in various cancer cell and animal models [14]. S1P is also thought to be as pro-angiogenic as basic fibroblast growth factor and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in promoting the development of vascular networks in vivo [21–24]. A number of preclinical studies have shown that pharmacological inhibition of SphK1 could be efficacious in decreasing tumor size or sensitize to chemo- or radiotherapy [25–28]. Interestingly, the anti-cancer activity of an anti-S1P monoclonal antibody (sphingomabTM) [29], which neutralizes S1P and inhibits its extracellular signaling, provides evidence of the importance of exogenous S1P in mediating tumor growth and metastatic potential [23, 30, 31].
Hypoxia is a reduction in the normal level of tissue oxygen tension and occurs in many pathological conditions including cancer [32] where it contributes to the development of an aggressive phenotype and a poor prognostic in patients [33]. As a tumor develops, the diffusion distance from the existing vasculature increases resulting in hypoxia, which in turn drives the overexpression of angiogenic factors such as VEGF, leading to the formation of a new vasculature in an attempt to provide adequate supply of oxygen and nutriments [34, 35]. Somewhat paradoxically, such unleashed angiogenesis generates a highly disorganized and immature vascular network with impaired transport characteristics resulting in spatial and temporal inadequacies in delivery of oxygen, thereby exacerbating tumor hypoxia and fuelling a self-reinforcing vicious cycle [36, 37]. As a result of the leakiness of tumor vessels, impaired blood flow and interstitial hypertension interfere with the delivery of therapeutics reducing their efficacy while promoting the escape of cancer cells [37–41]. At the cellular level, the activation of the transcription factor hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) [42], has been identified as a master regulator of the response of cancer cells to hypoxia, triggering the expression of multiple target genes contributing to angiogenesis, treatment failure, invasion/metastasis, altered metabolism and genomic instability [32, 43].
Given its central role in tumor progression and resistance to therapy, targeting hypoxia-induced angiogenesis represent an attractive strategy in cancer centered on two molecular targets, HIF-1 and VEGF [44–46]. As the direct inhibition of a transcription factor is a challenging task [47], targeting upstream signaling pathways leading to HIF-1 activation or downstream effectors regulated by HIF-1 such as VEGF may represent a more practical strategy and a wide range of pharmacological approaches have been proposed including the targeting of the SphK1/S1P signaling [48, 49]. Indeed,
we previously identified SphK1/S1P signaling as a new canonical modulator of HIF-1 activity under hypoxic conditions owing to a decreased proteasome degradation of HIF-1α subunit mediated by the Akt/GSK3β pathway in various cancer cell models [50]. Because Akt signaling can be activated by Gi-coupling of all subtypes of S1P receptors [10] and because S1P has been shown to be released from hypoxic cells [51, 52], we have explored the effects of the neutralization of extracellular S1P with anti-S1P monoclonal antibody sphingomab, currently under clinical development [15]. The goal of this study was to demonstrate preclinical proof of concept in mice bearing orthotopic prostate tumors that sphingomab could reduce intratumoral hypoxia and associated vascular network malfunction by enhancing blood perfusion to significantly improve delivery and efficacy of docetaxel, the standard chemotherapy for prostate cancer.
RESULTS
Extracellular S1P regulates HIF-1α level under hypoxia in several cancer cell lineages
We previously identified SphK1 as a modulator of HIF-1α as a key mediator of the adaptive response to hypoxia in multiple cancer cell models [50]. These studies led us to propose a strategy for controlling tumor hypoxia and its biological consequences [48]. To substantiate that inhibition of the SphK1/S1P pathway could represent a pertinent idea, we evaluated the relevance of inhibiting the extracellular S1P signaling with regard to HIF-1α accumulation under hypoxia in cancer cells. We took advantage of a monoclonal antibody (mAb), sphingomab, that binds to and neutralizes extracellular S1P [23, 29]. As shown in Figure 1A, sphingomab inhibited accumulation of HIF-1α in a concentration-dependent manner in human PC-3 prostate cancer cells. The ability of the anti-S1P mAb to inhibit HIF-1α accumulation was tested in two other models, including the lung adenocarcinoma cell line A549, and the glioblastoma cell line U87. A similar dose- dependent action of the anti-S1P mAb on HIF-1α content was observed in these models (Figure 1A). S1P is mainly produced intracellularly by SphK1 and exerts its paracrine/autocrine effects by being secreted into the tumor microenvironment. Spinster 2 (Spns2) has been recently suggested to be the primary transporter in the release of S1P [7–9, 53, 54]. When PC-3, A549 and U87 cells were treated with Spns2-specific siRNAs, the expression of Spns2 protein decreased to less than 10–20% of the control with two different siRNAs tested (siSpns2a and siSpns2b) (Figure 1B). The transient knockdown of Spns2 using these two different siRNAs was associated with a significant inhibitory effect on HIF-1α accumulation under hypoxia (Figure 1C). Importantly, the decrease of HIF-1α protein content by Spns2 targeting was markedly reversed when cells were exposed to S1P (Figure 1D). These results
Oncotarget3www.impactjournals.com/oncotarget
agree with the data in Figure 1A and demonstrate that extracellular S1P released from cancer cells is critical to regulate HIF-1α accumulation under hypoxia, regardless of the experimental conditions (10% FBS in Figure 1A versus serum free conditions in Figure 1D).
Neutralization of extracellular S1P downregulates HIF-1α expression and activity in vivo
To extend our in vitro findings, and because the anti-S1P mAb we used is under clinical development, the antibody’s ability to inhibit HIF-1α accumulation and transcriptional activity in vivo was tested in an orthotopic model of prostate cancer using the PC-3 cell line, because hypoxic response is largely dependent on the vascular microenvironment and very poorly replicated in subcutaneous models [55]. As previously reported [25, 56],
21 days after implantation of human GFP-overexpressing PC-3 in nude mice, the histology of the tumor was consistent with poorly differentiated prostate cancer (data not shown) and animals were treated every other day for up to 9 days with 50 mg/kg sphingomab or the isotype-matched IgG control by i.p. administration. Blood and primary tumors were collected from animals sacrificed at Day 0 or after 3, 5, 7 and 9 days of treatment with anti-S1P or IgG control antibodies. The excised tumors were first evaluated for immunohistochemical analysis of HIF-1α expression. As shown in Figure 2A, anti-HIF-1α-labeled sections showed a marked decrease in staining of tumor cells in mice treated for 5 days with the anti-S1P mAb. A highly significant reduction of the number of HIF-1α-positive cells in tumor sections was observed from 5 to 7 days of treatment (P < 0.0001) but returned to the control value at 9 days suggesting a transient effect of the anti-S1P mAb (Figure 2B). Western blot analysis on tumor
Figure 1: Extracellular S1P regulates HIF-1α level under hypoxia. (A) Human PC-3, A549 and U87 cells were treated with the indicated concentrations of anti-S1P mAb (anti-S1P) for 2 h, then incubated under normoxia (20% O2) or hypoxia (0.1% O2) for an additional 6 h. HIF-1α expression was analyzed by immunoblotting using an anti-HIF-1α antibody. (B) PC-3, A549 and U87 cells were untransfected or transfected with 90 nmol/L of two different siSpns2 (siSpns2a and siSpns2b) or scrambled siRNA (siScr) for 72 h. Cell lysates were assayed for Spns2 expression by Western blot. (C) PC-3, A549 and U87 cells were untransfected or transfected with 90 nmol/L of two different siSpns2 (siSpns2a) and siSpns2b) or scrambled siRNA (siScr) for 72 h, then incubated under normoxia or hypoxia for an additional 6 h. Cell lysates were assayed for HIF-1α expression by Western blot. (D) PC-3, A549 and U87 cells were untransfected or transfected with 90 nmol/L of siSpns2a for 72 h. The cells were then washed and left in DMEM without serum for 12 h before the incubation under normoxia or hypoxia without or with 1 μM S1P for an additional 6 h. Cells were lysed and HIF-1α expression was analyzed by immunoblotting with an anti-HIF-1α antibody. For all experiments, similar results were obtained in at least three independent experiments, and equal loading was monitored using antibody to α-tubulin.
Oncotarget4www.impactjournals.com/oncotarget
Figure 2: Effect of S1P neutralization on HIF-1α expression and activity in vivo. Nude mice were injected in prostate with PC-3/GFP cells to form orthotopic xenografts. 21 days after injection, mice were treated every odd day with 50 mg/kg anti-S1P mAb or IgG control. After 3, 5, 7 and 9 days of treatment, mice were sacrificed and the primary tumors and blood were collected. (A) HIF-1α staining of representative regions of tumor sections from animals treated for 5 days with 50 mg/kg anti-S1P antibody or IgG control. Scale bar, 100 μM. (B) Graph represents percentage of HIF-1α positive cells per 0.8 mm2 area after 3, 5, 7 and 9 days of treatment. Columns, mean of four mice per group; bars, SEM. (C) Analysis of HIF-1α protein expression by Western blotting in tumor lysates harvested from three mice per group after 5 days of treatment with IgG control (lane 1–3) or anti-S1P (lane 4–6). α-tubulin was used as loading control. (D) GLUT-1 staining of representative regions of tumor sections from animals treated for 5 days with 50 mg/kg anti-S1P mAb or IgG control. Scale bar, 250 μM. (E) Graph represents relative GLUT-1 intensity per 1.5 mm2 area after 3, 5, 7 and 9 days of treatment. Columns, mean of four mice per group; bars, SEM. (F) Plasma hVEGF concentrations in tumor-bearing mice after 3, 5, 7 and 9 days of treatment with 50 mg/kg anti-S1P antibody or IgG control. Columns, mean of four mice per group; bars, SEM.
Oncotarget5www.impactjournals.com/oncotarget
lysates collected at Day 5 confirmed the marked decrease of HIF-1α protein expression when animals were treated with anti-S1P mAb in all samples examined (Figure 2C).
GLUT-1-stained sections revealed that inhibitory effect of the anti-S1P mAb was not restricted to HIF-1α protein accumulation but was also correlated with an inhibition of its transcriptional activity (Figure 2D). The treatment with anti-S1P mAb led to more than 50% inhibition of GLUT-1 expression as early as 5 days of treatment up to 9 days with a maximal effect seen at Day 7 (Figure 2E). In addition, animals treated with the anti-S1P mAb had significantly reduced levels of circulating proangiogenic human VEGF (hVEGF) produced by the PC-3 xenografts (Figure 2F). Collectively these in vivo data demonstrate that S1P neutralization not only downregulates HIF-1α content but also decreases the expression of GLUT-1 and the secretion of VEGF, two main factors depending on HIF-1α transcriptional activity.
Neutralization of S1P is associated with decreased intratumoral hypoxia, vascular remodelling and increased blood flow
We previously observed that neutralization of S1P was associated with a reduction in the release of the potent vascular permeability factor VEGF from tumors, validating the sphingomab as an antiangiogenic agent [23]. We therefore analyzed effects of the antibody on the vasculature of orthotopic PC-3 tumor using immunohistochemical expression of CD34 as biological marker of angiogenesis. In agreement with the in vivo effect formerly reported in a subcutaneous A549 model [23], immunohistochemical analysis indicated a marked decrease in microvessel density in mice treated with the anti-S1P mAb throughout all the experiment time course (Figure 3A and 3B). The remaining vessels seemed to be opened indicating that “immature” vessels were likely preferentially eliminated (Figure 3A). The treatment with the anti-S1P mAb was accompanied by a marked reduction of intratumoral hypoxia as measured by pimonidazole staining, an effect that was significant as early as 5 days of treatment with a persisting effect that peaked at Day 7 (Figure 3C and 3D).
We next determined how hypoxia and neoan-giogenesis were antagonized by the anti-S1P mAb. We first evaluated the architecture and the functional status of tumor vasculature. Because perivascular pericytes play a critical role in vessel maturation and stabilization [37], a double staining for pericytes (α-smooth muscle actin or α-SMA) and endothelial cells (CD34) was performed to quantify the extent of pericyte coverage. A significant increase of the number of α-SMA-positive intratumoral blood vessels was found in tumor-bearing animals treated with anti-S1P mAb, demonstrating the characteristic development of more mature vessels (Figure 4A and 4B).
As noticed for VEGF level and intratumoral hypoxia markers, the effect of sphingomab was evident after 5 days of treatment and maintained overtime (up to 9 days). To examine whether the morphological vessel normalization obtained by neutralizing S1P could translate into a functional vasculature, blood perfusion was assessed by a non-invasive real-time imaging using high frequency ultrasound to allow for longitudinal study on the same animal [57, 58]. At different times after administration of anti-S1P mAb or control IgG, the slope and magnitude of microbubble contrast agent influx was measured to quantify the blood flow in vessels (Figure 4C and 4D). In anti-S1P mAb-treated mice, tumor perfusion significantly augmented as early as 5 days of administration, peaked at Day 7 (over 3-fold increase), then returned to basal level by Day 13 (Figure 4C and 4D). Collectively, these results showing the reduction in tumor hypoxia and enhanced vascular flow when S1P is neutralized support the notion that a transient “vascular normalization” [41] is the mechanism by which anti-S1P mAb exerts its effects, an effect which could enhance the efficacy of cytotoxic agents (see below).
Anti-S1P mAb’s direct effects on tumor cell proliferation and apoptosis
S1P is a well-established proliferative and anti-apoptotic mediator [5, 59], the ability of anti-S1P antibody to alter cell proliferation and death of PC-3 xenograft was also evaluated. The Ki67 proliferation marker was used to estimate the fraction of viable cells undergoing active proliferation within the tumor. Anti-S1P mAb-treated tumors exhibited a notable decrease in cell proliferation rate that was evident after 5 days of administration (Figure 5A and 5B). Tumor cell death was assessed by the activation of the apoptotic executioner caspase-3. In agreement with previous reports showing that S1P inhibits activation of caspase-3 [23, 60], the treatment with anti-S1P mAb was associated with increased apoptosis as reflected by the increased level of cleaved caspase-3 (Figure 5C and 5D). These data suggest that the proliferative and protective antiapoptotic effects of S1P are mitigated when extracellular S1P is neutralized by the anti-S1P antibody.
Anti-S1P mAb-induced vascular normalization sensitizes to chemotherapy in established orthotopic PC-3/GFP tumors in mice
Hypoxia plays a central role in tumor resistance to therapy including chemotherapy [45] and preclinical and clinical data support and offer a rationale of why a therapy aimed at increasing blood flow should result in improved drug delivery [39, 40]. We hypothesized that the vascular normalization period we observed with the anti-S1P
Oncotarget6www.impactjournals.com/oncotarget
Figure 3: Effect of S1P neutralization on tumor vasculature and hypoxia in PC-3 tumor-bearing mice. (A) Representative images of blood vessel quantity and morphology in tumors after 5 days of treatment with 50 mg/kg anti-S1P mAb or IgG control. Tissue sections were stained with anti-CD34 (endothelial cell marker) antibody to visualize tumor blood vessel and were counterstained with DAPI. Scale bar, 200 μM. (B) Data are shown as number of CD34+ structures per 1.5 mm2. Columns, mean of four mice per group; bars, SEM. (C) Hypoxia staining of representative regions of tumor sections from animals treated for 5 days with 50 mg/kg anti-S1P antibody or IgG control. Hypoxia was detected by immunohistochemistry staining of pimonidazole adducts in PC-3 tumor sections. Nuclear counterstain: hematoxylin staining. Scale bar, 250 μM. (D) Graph represents relative HypoxiaProbe intensity after 3, 5, 7 and 9 days of treatment with anti-S1P mAb or IgG control. Columns, mean of four mice per group; bars, SEM.
Oncotarget7www.impactjournals.com/oncotarget
mAb (optimal time of 5 to 9 days) offers an opportunity for enhanced response to docetaxel, the standard of care for the treatment of metastatic prostate cancer [61, 62]. To this end, we relied on an orthotopic model of PC-3 cells overexpressing GFP, growing in their native milieu and leading to a local regional growth and spontaneous distant metastasis dissemination within five weeks that could be monitored by fluorescence imaging [56]. The therapeutic relevance of anti-S1P mAb-induced increase in transient vascular normalization (or oxygenation window) to docetaxel was investigated by varying the sequence of anti-S1P administration and chemotherapy (Figure 6A).
In the first therapeutic approach, tumor-bearing mice were treated with anti-S1P mAb (50 mg/kg every other day) for a 5-day oxygenation window prior to 5 mg/kg docetaxel (Arm 2) or with a classical combination of
anti-S1P mAb and docetaxel administered at the same time (Arm 3). Significantly smaller tumors (mean = 455 mm3) were seen in animals treated with 5 mg/kg docetaxel alone (Arm 5) (Figure 6B and 6C). Interestingly, administration of anti-S1P mAb alone (Arm 4) was not accompanied with a statistical reduction of primary tumor volume (mean = 724 mm3) as compared to IgG-treated control animal (Arm 1, mean = 1010 mm3) and the combination of S1P mAb with docetaxel administered at the same time (Arm 3, mean = 373 mm3) did not significantly sensitize to docetaxel alone (Arm 5) (Figure 6B and 6C). Clearly, the greater effect on primary tumor growth occurred when anti-S1P mAb was administered 5 days before docetaxel treatment (Arm 2, mean = 144 mm3). Supporting the notion that chemotherapy response could be optimum when docetaxel is given when after vascular
Figure 4: Effect of S1P neutralization on vessel functionality. (A) Representative images of immunofluorescence double staining for endothelial cells (CD34) and pericytes (αSMA) in paraffin sections obtained from tumors of animals treated with 50 mg/kg anti-S1P mAb or IgG control. Red, CD34+ staining; green, αSMA+ staining. Counterstaining was done with DAPI. Images were obtained from mice 7 days after beginning of the treatment. Scale bar, 200 μM. (B) Graph represents quantification of vessel coverage per 0.76 mm2 area, calculated as the percentage of αSMA-positive cells compared with the number of CD34-positive cells after 3, 5, 7 and 9 days of treatment with 50 mg/kg anti-S1P mAb or IgG control. Columns, mean of four mice per group; bars, SEM. (C) Study of tumor vessel perfusion by contrast-enhanced ultrasound imaging. Examples of raw contrast kinetics acquired after bolus i.v. injection of microbubble contrast agent in animals treated with 50 mg/kg IgG control or anti-S1P mAb for 7 days. (D) Quantification of microbubble velocity within o.t PC-3 tumors, after 3, 5, 7, 9 and 13 days of treatment with anti-S1P mAb or IgG control. Columns, mean of four mice per group; bars, SEM.
Oncotarget8www.impactjournals.com/oncotarget
Figure 5: Effect of S1P neutralization on tumor cell proliferation and apoptosis of established orthotopic PC-3/GFP tumors in mice. (A) Ki67 staining of representative tumor sections after 7 days of treatment with 50 mg/kg anti-S1P mAb or IgG control. Red, Ki-67 positive staining. Counterstaining was done with DAPI. (B) Data are shown as number of Ki67-positive cells per 1.5 mm2 area after 3, 5, 7 and 9 days of treatment with anti-S1P mAb or IgG control. Columns, mean of four mice per group; bars, SEM. (C) Cleaved caspase-3 (CASP-3) staining of representative tumor sections after 7 days of treatment with 50 mg/kg anti-S1P mAb or IgG control. Red, cleaved caspase-3-positive staining. Counterstaining was done with DAPI. (D) Data are shown as number of cleaved caspase-3-positive cells per 0.76 mm2 area after 3, 5, 7 and 9 days of treatment with anti-S1P mAb or IgG control. Columns, mean of four mice per group; bars, SEM.
Oncotarget9www.impactjournals.com/oncotarget
Figure 6: Docetaxel treatment enhancement by rational scheduling of S1P neutralization on established orthotopic PC-3/GFP tumors in mice. (A) Three weeks after surgical orthotopic implantation of PC-3/GFP cells, mice were randomized into five arms of three to seven animals each. These animals were then subjected to 50 mg/kg IgG control every odd day (arm 1, n = 4); 50 mg/kg anti-S1P mAb every odd day prior to weekly 5mg/kg docetaxel starting at day 26 (arm 2, n = 6); combination of 50 mg/kg anti-S1P mAb every odd day and weekly 5mg/kg docetaxel starting at day 26 (arm 3, n = 5); 50 mg/kg anti-S1P mAb every odd day starting at day 26 (arm 4, n = 7); weekly 5 mg/kg docetaxel starting at day 26 (arm 5, n = 3). At day 42, mice were anesthetized and tumor volume, metastatic dissemination were determined by fluorescence imaging and blood was taken for complete blood count (CBC) and plasma chemistry. (B) Representative fluorescent primary PC-3/GFP tumors from animals treated with IgG control, docetaxel, anti-S1P mAb, anti-S1P mAb prior to docetaxel and combination of docetaxel and anti-S1P mAb, at the time of autopsy. Yellow asterisk indicates bladder. Numbers represent tumor volume as quantified in materials and methods. (C) Quantification of tumor volume of primary tumors. Columns, mean of three to seven mice per group; bars, SEM. (D) Representative fluorescent periaortic lymph nodes from animals treated with IgG control, docetaxel, anti-S1P mAb, anti-S1P mAb prior to docetaxel and combination of docetaxel and anti-S1P mAb, at the time of autopsy. Green arrows indicate prostate. Numbers represent periaortic lymph node volume as quantified in materials and methods. (E) Quantification of periaortic lymph nodes. Columns, mean of three to seven mice per group; bars, SEM.
Oncotarget10www.impactjournals.com/oncotarget
normalization is achieved by anti-S1P mAb treatment, we demonstrated in Figure 6 that a significant difference (P = 0.0156) was observed between Arm 2 (anti-S1P mAb prior to docetaxel) and Arm 3 (anti-S1P mAb coincident with docetaxel) (Figure 6B and 6C). In addition to demonstrating an effect of antibody treatment on tumor volume, our fluorescent model allowed us to monitor metastatic dissemination in order to determine effects of the anti-S1P mAb on metastatic potential (Table 1). Although no treatment was able to significantly prevent lymph node tumor involvement (Table 1), we found a marked decreased in the volume of periaortic lymph nodes when anti-S1P mAb was combined to docetaxel (Figure 6D and 6E). As shown in Table 1, the anti-S1P mAb administration given before chemotherapy markedly reduced the total number of metastases (average per animal: 3.8) by comparison with isotype antibody control-treated Arm 1 (average per animal: 7.8). The effect of on primary tumor growth was thus consequently paralleled by a significant limitation of metastasis dissemination when anti-S1P mAb was given for 5 days before initiating chemotherapy.
To rule out that improved therapeutic outcome caused by the sequential dosing (Arm 2) was not a mere reflection of the longer administration of anti-S1P mAb when compared to the classical combination treatment without pre-treatment (Arm 3), a second therapeutic approach was conducted with additional scheduling conditions (Supplementary Figure 1A). Treatments were initiated at Day 21 rather than Day 26 and compared to the sequential normalization treatment (Arm 2). Surprisingly, starting docetaxel treatment earlier did not improve the efficacy with regard to tumor growth (Arm 6 versus Arm 5) (Supplementary Figure 1B). When docetaxel was given as early as 21 days post-implantation in combination with anti-S1P mAb (Arm 8), there was no significant difference in terms of therapeutic efficacy compared to the 26-day conditions (Arm 3), implying that an extra 5-day duration of treatment did not matter (Supplementary Figure 1B). Importantly, the sequential scheduling (Arm 2) was always superior to all the others (Arm 3 or Arm 8) in terms of therapeutic efficacy (Supplementary Figure 1B).
In sum, these data suggest mechanistically that the anti-S1P mAb treatment leads to improved chemotherapy
Table 1: Pattern of metastatic disseminationIgG control Docetaxel anti-S1P anti-S1P &
Docetaxelanti-S1P before
Docetaxel
No. of micewith metastases/total No. of mice
4/4 (100%) 3/3 (100%) 7/7 (100%) 5/5 (100%) 5/6 (83%)
Retroperitoneal lymph nodes
Periaortic lymph nodes 2, 2, 2, 2 2, 2, 1 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2 1, 2, 2, 2, 2 0, 2, 2, 2, 2, 2
Periadrenal 2, 2, 2, 1 2, 2, 2 2, 2, 2, 2, 1, 1, 1 1, 2, 1, 2, 2 0, 1, 1, 2, 1, 1
No. of metastases 15/16(3.8 per animal)
11/12(3.7 per animal)
25/28(3.6 per animal)
17/20(3.4 per animal)
16/24(2.6 per animal)
Solid organs
Lung 1, 1, 1, 1 1, 1, 1 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1 1, 1, 1, 1, 1 0, 1, 1, 1, 1, 1
Liver 1, 1, 1, 1 0, 1, 1 1, 1, 1, 1, 1, 0, 1 1, 1, 1, 0, 1 0, 0, 0, 1, 0, 0
Pancreas 1, 1, 1, 1 1, 1, 1 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1 1, 1, 1, 0, 0 0, 0, 0, 0, 0, 0
Mesentery 1, 1, 1, 1 0, 1, 1 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1 1, 1, 1, 0, 0 0, 0, 0, 1, 0, 0
No. of metastases 16/16(4.0 per animal)
10/12(3.3 per animal)
27/28(3.9 per animal)
15/20(3.0 per animal)
7/24(1.2 per animal)
Total No. of metastases
31(7.8 per animal)
21(7.0 per animal)
52(7.4 per animal)
32(6.4 per animal)
23(3.8 per animal)*
For retroperitoneal lymph nodes, the numbers 0, 1, or 2 represent the quantity of invaded lymph nodes. For solid organs, 0 means no presence of metastasis; 1 means a metastatic organ (regardless of the intensity of metastasis dissemination in this organ). The frequencies of metastases between two groups are not significant.Differences in the number of metastases per mouse: *P = 0.0139 compared with IgG control-treated animals (Wilcoxon - Mann Whitney).
Oncotarget11www.impactjournals.com/oncotarget
response when administered for a short period of time before the commencement of chemotherapy, as a consequence of antibody-induced vascular normalization.
In addition to efficacy studies described above, we conducted a toxicology study at the end of the experiment described in Figure 6 designed to evaluate how well the antibody was tolerated in mice. All biochemical and complete blood count (CBC) and serum chemistry markers were within normal range (Supplementary Figures 2 and 3). A statistically significant leukopenia was noted only in mice treated with the combination of anti-S1P mAb and docetaxel, which was mainly the consequence of a significant reduction in total circulating lymphocytes as reported previously [23, 29, 63].
DISCUSSION
Hypoxia is a hallmark of solid tumors driving the production of angiogenic factors to establish a new vascular network [35, 37]. In contrast to healthy tissues, hypoxia-triggered overexpression of VEGF and other pro-angiogenic factors in tumors leads to a structurally and functionally abnormal vasculature, which further aggravates hypoxia setting up a vicious cycle promoting tumorigenesis and metastatic potential [36, 37]. Anatomically, tumor vessels are dilated, tortuous, and saccular with chaotic patterns of interconnection and branching [64]. Unlike a normal vasculature where stable endothelial cells are connected by adherens junctions including vascular endothelial (VE)-cadherin [65], VEGF causes VE-cadherin destabilization hence a loosening of endothelial cell association [66]. Moreover, pericytes, normally positioned around and interacting with endothelial cells to prevent vessel leakage are absent or loosely attached [67, 68]. The mechanisms for abnormal pericyte behavior in tumors are manifold, but include VEGF as a negative regulator [69, 70]. Taken as a whole, the structural weaknesses of tumor vessels, by contributing to a porousness vasculature phenotype, have adverse consequences notably dissemination of tumor cells [71, 72] and impaired drug delivery and efficacy [39, 40]. For these reasons, strategies aimed at restoring tumor vasculature to a more normal state are a matter of the utmost importance as the improvement of vessel structure and function may delay progression and improve delivery and efficacy of chemotherapeutics [41]. Because VEGF is primarily accountable for this haphazard vasculature, it was hypothesized by Rakesh Jain that mopping up excess of VEGF, rather than destroying vessels, would prune away some abnormal vessels and remodel the remaining ones resulting in a more mature vasculature [73, 74]. Over the years, a wide array of preclinical [75–77] and clinical [78–81] studies have provided evidence to support this postulate, showing that judicious treatment with anti-VEGF agents results in transient enhancement of vascular function termed “vascular normalization”
characterized by improved connection between adjacent endothelial cells, increased ratio of pericyte-covered vessels, improved association between endothelial cells and pericytes, and reduced hypoxia [41]. Importantly, the accompanying period of enhanced oxygenation known as the “normalization window”, ranging in general from few days in mice models [41] to several weeks in some patients [81], corresponds to a period of enhanced chemo or radiosensitivity in treated tumors [40, 41, 75, 80]. Lastly, the most compelling support for the benefit of vascular normalization is its benefit on progression-free and overall survival rates in patients [81–84].
We recently identified the SphK1/S1P signaling as a new modulator of HIF-1α accumulation and increased activity under hypoxia, through activation of the Akt/GSK3β pathway [50, 85]. It was recently reported that direct addition of S1P to thyroid cancer cells stimulate Akt signaling under normoxic conditions [86]. Because Akt is activated by Gi-coupling of all subtypes of GPCR S1P receptors [10], and because S1P is secreted by hypoxic cells [51, 52], we analyzed the effects of the neutralization of extracellular S1P with the anti-S1P mAb, sphingomab [15]. Here we report for the first time that sphingomab inhibits HIF-1α accumulation and activity under hypoxia in various cell models (prostate, lung, glioma). This was a consequence of the secretion of S1P by hypoxic cells since knock-down of the S1P transporter Spns2 blocked the activation of HIF-1α, an effect that was reversed by the addition of S1P.
In an orthotopic prostate cancer animal model, we characterized the time course of morphological and functional changes in the vasculature of the tumor as well as intratumoral hypoxia in response to treatment with sphingomab. We demonstrated that S1P neutralization created a less hypoxic environment as shown by the marked decreased in HIF-1α expression and activity (concomitant decrease in GLUT-1 expression), and secretion of VEGF from the tumor. As a result, vascular remodelling occurred as demonstrated by decreased microvessel density and vessel morphological changes namely increased coverage of pericytes. As previously reported for anti-VEGF strategies in other preclinical models [75–77], the anti-S1P mAb was able to normalize intratumoral vasculature after a period (from 5 to 9 days) of treatment. Measurements of tumor blood flow and perfusion assessed by high resolution 3-dimensional power Doppler ultrasound [57, 58] demonstrated a transient improvement in tumor perfusion. Finally and most importantly, we established that the transient vascular normalization window induced by sphingomab created an optimal time frame for the administration of docetaxel-based chemotherapy with enhanced efficacy. Indeed, the therapeutic relevance of sphingomab-induced increases in tumor oxygenation to chemotherapy was investigated by varying the schedules of sphingomab and chemotherapy. Clearly, a greater benefit on both primary tumor and metastasis dissemination took place when sphingomab was administered 5 days prior docetaxel treatment.
Oncotarget12www.impactjournals.com/oncotarget
Interestingly S1P has originally been shown to stabilize blood vessels in development and homeostasis through S1P receptor subtype 1 (S1P1) by promoting the formation of VE-cadherin-containing adherens junctions in endothelial cells [21, 87, 88]. Supporting this notion, the loss S1P1 in retinal endothelial cells results in vessels displaying poor blood flow and vascular leakage [89]. In addition, vessel coverage by pericytes is also directed by the activity of S1P1 receptor in endothelial cells [90, 91] by trafficking and activating N-cadherin involved in endothelial cell/pericyte interactions [92]. Our findings that neutralization of exogenous S1P with sphingomab leads to vascular maturation in hypoxic tumors are somehow counterintuitive to the undisputed role of S1P1, one of its main cognate receptor. Surprisingly it has been reported that S1P could increase vascular permeability similar to VEGF, the canonical vascular permeability factor [93]. The mechanism of action would involve the activation of the S1P2 subtype S1P receptor. This observation was extended to in vivo model of vascular permeability in the rat lung, in which the S1P2 antagonist JTE013 significantly inhibited H2O2-induced permeability [93]. In vitro and in vivo models of inflammation-induced vascular permeability confirmed the role of S1P2 [94]. These studies indicate that the relative expression of S1P1 and S1P2 receptors in a specific vascular bed would determine the response to S1P. Noteworthy, in vivo studies have shown that S1P2 expression is markedly enhanced under hypoxic stress in pathological angiogenesis of the mouse retina, establishing its essential role in pathological neovascularization [95]. Further supporting a critical role for S1P2 signaling in mediating vascular permeability, the addition of exogenous S1P to normoxic endothelial cells also induce the activation of HIF-1α and subsequent rise in VEGF release, suggesting a potential amplification of VEGF signaling [96]. Lastly, S1P2-deficient (S1p2-/-) mice implanted with lung or melanoma cells displayed increased number of maturated and functional tumor vessels, showing increased pericyte coverage [97]. In summary, one might speculate that the balance between S1P1 and S1P2 receptors in the endothelium could be modified by hypoxia, with a shift toward higher S1P2 expression hence increasing vascular permeability. Neutralization of S1P produced by hypoxic tumor cells by sphingomab could have a direct impact on vessels by switching off S1P2-mediated vascular leakage, a mechanism reminiscent of the effect of bevacizumab on VEGF. In addition, neutralization of S1P through inhibition of HIF-1α could impact the cancer cell compartment by reducing intratumoral hypoxia and its undesirable consequences (including VEGF overproduction), while sensitizing tumor cells to cytotoxic agents as S1P is a well-establish anti-apoptotic agent [5].
The extent of intratumoral hypoxia seen in the prostate cancer context is comparable to that seen in other cancers [98]. Since the seminal study conducted by Folkman’s group showing that angiogenesis correlates
with metastasis in invasive prostate cancer [99], numerous reports have confirmed an association between prostate cancer aggressiveness and increased microvessel density, greater irregularity of the vessel lumen and smaller vessels [100]. In a prostatectomy cohort of patients (n = 572) with clinically localized prostate cancer with 20 years of follow-up, men with the most irregularly shaped vessels were 17.1 times more likely to develop lethal disease several years after diagnosis [101]. These data clearly suggest that the morphologic characteristics that reflect the pattern and maturity of the growing vascular network could represent valid indicators of neoangiogenesis, cancer aggressiveness, and metastatic potential in prostate. In patients with metastatic castration-resistant prostate cancer, VEGF levels are independent predictors of overall survival [102]. These data supported the hypothesis that VEGF inhibition may enhance current therapies in metastatic prostate cancer. However, the failure of two recently published phase III trials [103, 104] based on combination regimens associating docetaxel with anti-VEGF strategies (bevacizumab or aflibercept) underline our limited understanding of the therapeutic targets being explored and poor preclinical investigation. No preclinical data to lend support to the combination of docetaxel and anti-VEGF approaches have been reported in the literature, and the vast majority of phase II trials have used non-randomized designs [105]. Despite the fact that these large trials have produced disappointing results with docetaxel-based combined anti-VEGF therapies, the notion that reduction of hypoxia and improvement of functional vascularization could sensitize to a therapeutic regimen has been successfully suggested in prostate cancer. Evidence exists that diminution of intratumoral hypoxia [106, 107], reduction of VEGF production [108] and improved functional vascularization [109] during androgen deprivation (ADT) would be accountable for the improved clinical outcome and patient survival observed in phase III clinical trials of short-term neoadjuvant ADT before radiotherapy [110, 111].
In view of these data supporting that only a neoadjuvant approach (ADT) could successfully sensitize to a therapy in prostate cancer, our preclinical findings may have clinical implications. Improvement in blood perfusion leading to better drug delivery or increased tumor oxygenation offers a rationale as to why S1P neutralization might perhaps be started prior to cytotoxic therapy (chemo- or radiotherapy) and continued through this therapy. Non-invasive imaging techniques are currently available in the clinic that could be used to assess tumor vascularity (i.e. DCE MRI) and/or oxygenation such as PET scanning with hypoxia sensitive tracers [79, 81, 82, 84, 109]. Hence, our findings encourage further clinical studies to assess whether optimized scheduling of anti-S1P treatment provide evidence for vessel normalization in cancer patients to identify those who might be benefit from a combination therapy with cytotoxic agents or radiotherapy.
Oncotarget13www.impactjournals.com/oncotarget
MATERIALS AND METHODS
Chemicals, reagents and kits
Culture medium and serum were from Invitrogen (Villebon sur Yvette, France). The murine monoclonal anti-S1P antibody, Sphingomab, and its isotype-matched mAb control, LT1017, were generated as described previously [29]. S1P was from Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Docetaxel was purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). hVEGF plasma levels were quantified using a human VEGF Quantikine ELISA kit (RαD systems, Lille, France) according to manufacturer’s instructions, respectively.
Cell lines
Human prostate cancer PC-3 and lung carcinoma A549 cell lines were obtained from DSMZ (Braunschweig, Germany). Human U87 glioblastoma cells were from ATCC-LGC Standards (Molsheim, France). Cells were cultured in RPMI 1640 containing 10% fetal bovine serum at 37°C in 5% CO2 humidified incubators. Cell lines were routinely verified by the following tests: morphology microscopic examination, growth curve analysis and mycoplasma detection (MycoAlertTM, Lonza, Basel, Switzerland). All experiments were started with low-passaged cells (<15 times). Hypoxia (0.1% O2, 5% CO2, 94.5% N2) was achieved using an In Vivo2 hypoxic workstation (Ruskinn Technologies, Bridgend, UK).
siRNA-mediated knockdown of Spns2
Cancer cells were transfected with 90nM of each specific MISSION predesigned small interfering RNA (siRNA, Sigma-Aldrich) using Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen) according to the manufacturer’s instructions. Aleatory sequence scrambled siRNA was from Eurogentec (Angers, France). Details of each specific MISSION predesigned siRNAs are provided below: human Spns2 siRNAa: 5′-CGCUCAUGCUCUGCCCU UUdTdT-3′; and human Spns2 siRNAb: 5′-CACUCAUC CUCAUUCUGGUdTdT-3′.
Western-blot analysis and antibodies
Mouse HIF-1α (BD Biosciences, Le Pont de Claix, France), rabbit anti-Spns2 (Sigma-Aldrich) were used as primary antibodies. Western blot assays were conducted according to the manufacturer’s instructions. Proteins were visualized by enhanced chemiluminescence detection system (Pierce, Brebières, France) using antirabbit or antimouse horseradish peroxidase–conjugated IgG (Bio-Rad, Hercules, CA). Equal loading was confirmed by probing the blots with the mouse anti-tubulin antibody (Sigma-Aldrich, clone DM1A). Densitometry quantitation was determined using Image J software (NIH, Bethesda, MD).
Animals
Male NMRI/Nu (nu/nu) 6-wk-old mice were obtained from Elevage Janvier (Le Genest Saint Isle, France). Mice were housed in a barrier facility of high-efficiency particulate air-filtered racks. At 7–8 wk of age, the animals were used in accordance with the principles and procedures outlined in Council Directive 86/809/EEC. The Institut Fédératif de Recherche Bio-médicale de Toulouse Animal Care and Use Committee approved all animal studies.
Blood and plasma samples
Blood samples were analysed using the ABX Micros 60 Hematology Analyzer and analytical parameters were determined in plasma by routine laboratory methods using an autoanalyzer (Cobas Mira+), Plateforme phenotypage ANEXPLO (Toulouse, France).
Immunohistochemistry and immunofluorescence
Staining was conducted on paraformaldehyde (PFA)-fixed and paraffin-embedded tissue using 5 μm sections. Intratumoral hypoxia was assessed using a commercially available HypoxyprobeTM-1 kit for the detection of tissue hypoxia (Hypoxyprobe Inc., Burlington, MA). Pimonidazole hydrochloride was given at a dose of 60 mg/kg in 0.9% saline via intraperitoneal injection one hour before euthanasia, and orthotopic tumors were harvested and fixed in 4% PFA. Details regarding antibodies, dilutions, and antigen-retrieval methods used are provided in Supplementary Table S1.
Orthotopic implantation of PC-3/GFP prostate cancer cells, and in vivo fluorescence imaging
Intraprostatic human prostate cancer xenografts were established in nude mice by surgical orthotopic implantation. Mice were anesthetized by isoflurane inhalation and placed in the supine position. A lower midline abdominal incision was made, and a 20 μL tumor cell suspension (1 x 106 cells) was injected into the dorsal lobe of the prostate using a 30-gauge needle and glass syringe. The surgical wound was closed in 2 layers with 4–0 Dexon interrupted sutures. All procedures were performed with a dissecting microscope. Autopsy and in vivo fluorescence imaging were conducted as previously detailed [56].
Tumor vessel perfusion by contrast-enhanced ultrasound imaging
Optical and ultrasound/power Doppler were carried out under anaesthesia (2% isofluorane in oxygen). Microbubble contrast agents were used to enhance in vivo visualization of microvascular perfusion of the tumors.
Oncotarget14www.impactjournals.com/oncotarget
This was operated with a Vevo 2100 linear array based high-frequency ultrasound imaging system (VisualSonics, Amsterdam, The Netherlands) and subsequent release of Nonlinear Contrast Imaging Mode. This allowed to assess the tumoral responses to anti-angiogenic drugs, even in absence of change in tumor size. The Micromarker Contrast Agent was delivered as a bolus injection intravenously (tail), and a time versus intensity curve is generated. The perfusion curve kinetics is an exponential limited by a maximum. The initial slope is proportional to the flow velocity and the maximum value of the plateau is proportional to the vascular fractional volume. The product of these two values gives a measure of the true perfusion. The perfusion model is defined as:
f(t) = O + A 1
st!2πe
( ln(t)−m)2
2s2, t > 0
O, A, m and s are fitting parameters; O is the offset, A is an amplitude parameter and m and s are the mean and standard deviation of the normally distributed natural logarithm of t, respectively. Amplitude is expressed relative to echo power, time is expressed in seconds and both are combined to produce quantities relating to blood flow kinetics.
After infusion and steady-state perfusion, a destructive pulse could also be applied and a replenishment curve was generated.
The perfusion model is defined as:
f(t) = O + A2c1 + erf a
ln(t) − ms!2
b d , t > 0
where O, A, m and s are fitting parameters, as defined for equation 1.
Image acquisition and processing and quantification
For bright-field and fluorescence, slides were scanned with Nanozoomer 2.0 RS Hamamatsu (with the fluorescence imaging module for tumor slides stained with anti-CD34, anti-αSMA, anti-cleaved-caspase-3, or anti-Ki67). Absolute numbers of CD34-positive vessels present within 1.5 mm2 of the tumor area and percent of αSMA/CD34-positive staining per 0.76 mm2 area and number of HIF-1α-positive cells per 0.8 mm2 area for each tumor slide were quantified by optical counting. Automatic cell counts of Ki67-positive and cleaved caspase-3-positive cells and automatic GLUT-1 and pimonidazole intensity were determined per 1.5 mm2 of the tumor area with Image J Software (NIH, Bethesda, MD).
Statistical analysis
The statistical significance of differences between the means of two groups was evaluated by unpaired
Student’s t test. The frequencies of metastases between two groups were compared using Fisher’s exact test. Differences in the number of metastases per mouse were examined using a nonparametric Wilcoxon - Mann Whitney test. All statistical tests were two-sided and the level of significance was set at P < 0.05. Calcula-tions were done using Instat (GraphPad Software, San Diego, CA).
AcknowledgmentS
We are grateful to Dr Nathalie Ortega and Dr Leonor Nogueira for their technical help. We thank the Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale histology facilities.
This work was supported by the Institut National du Cancer (Sphingoxia project to OC), the Ligue Nationale Contre le Cancer (Equipe Labellisée LIGUE 2011 to OC), the Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC Grant 1029 to OC), the Equipment ARC Grant (ECL2010R00650 to OC), the Association pour la Recherche sur les Tumeurs de la Prostate (to OC), the Comité Haute-Garonne of the Ligue Contre le Cancer (to IA), Université Paul Sabatier de Toulouse (to IA), the Association Française d’Urologie (to BM). This work was also supported by the National Cancer Institute (5R44CA110298–06 to RAS).
Conflict of interest
Authors would like to disclose that Dr. Roger A. Sabbadini is a founder of Lpath, and has stock in the company and is an inventor.
ReFeRenceS
1. Pyne NJ, Pyne S. Sphingosine 1-phosphate and cancer. Nat Rev Cancer. 2010; 10:489–503.
2. Pitson SM. Regulation of sphingosine kinase and sphingo-lipid signaling. Trends Biochem Sci. 2011; 36:97–107.
3. Maceyka M, Harikumar KB, Milstien S, Spiegel S. Sphingosine-1-phosphate signaling and its role in disease. Trends Cell Biol. 2012; 22:50–60.
4. Mendelson K, Evans T, Hla T. Sphingosine 1-phosphate signalling. Development. 2014; 141:5–9.
5. Cuvillier O, Pirianov G, Kleuser B, Vanek PG, Coso OA, Gutkind S, Spiegel S. Suppression of ceramide-mediated programmed cell death by sphingosine-1-phosphate. Nature. 1996; 381:800–803.
6. Olivera A, Kohama T, Edsall L, Nava V, Cuvillier O, Poulton S, Spiegel S. Sphingosine kinase expression increases intracellular sphingosine-1-phosphate and promotes cell growth and survival. J Cell Biol. 1999; 147:545–558.
Oncotarget15www.impactjournals.com/oncotarget
7. Kawahara A, Nishi T, Hisano Y, Fukui H, Yamaguchi A, Mochizuki N. The sphingolipid transporter spns2 functions in migration of zebrafish myocardial precursors. Science. 2009; 323:524–527.
8. Fukuhara S, Simmons S, Kawamura S, Inoue A, Orba Y, Tokudome T, Sunden Y, Arai Y, Moriwaki K, Ishida J, Uemura A, Kiyonari H, Abe T, et al. The sphingosine-1-phosphate transporter Spns2 expressed on endothelial cells regulates lymphocyte trafficking in mice. J Clin Invest. 2012; 122:1416–1426.
9. Nagahashi M, Kim EY, Yamada A, Ramachandran S, Allegood JC, Hait NC, Maceyka M, Milstien S, Takabe K, Spiegel S. Spns2, a transporter of phosphorylated sphingoid bases, regulates their blood and lymph levels, and the lym-phatic network. FASEB J. 2013; 27:1001–1011.
10. Takabe K, Paugh SW, Milstien S, Spiegel S. “Inside-out” signaling of sphingosine-1-phosphate: therapeutic targets. Pharmacol Rev. 2008; 60:181–195.
11. Van Brocklyn JR, Lee MJ, Menzeleev R, Olivera A, Edsall L, Cuvillier O, Thomas DM, Coopman PJ, Thangada S, Liu CH, Hla T, Spiegel S. Dual actions of sphingosine-1-phosphate: extracellular through the Gi-coupled receptor Edg-1 and intracellular to regulate proliferation and survival.J Cell Biol. 1998; 142:229–240.
12. Hait NC, Allegood J, Maceyka M, Strub GM, Harikumar KB, Singh SK, Luo C, Marmorstein R, Kordula T, Milstien S, Spiegel S. Regulation of histone acetylation in the nucleus by sphingosine-1-phosphate. Science. 2009; 325:1254–1257.
13. Alvarez SE, Harikumar KB, Hait NC, Allegood J, Strub GM, Kim EY, Maceyka M, Jiang H, Luo C, Kordula T, Milstien S, Spiegel S. Sphingosine-1-phosphate is a missing cofactor for the E3 ubiquitin ligase TRAF2. Nature. 2010; 465:1084–1088.
14. Cuvillier O. Downregulating sphingosine kinase-1 for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 2008; 12:1009–1020.
15. Sabbadini RA. Sphingosine-1-phosphate antibodies as potential agents in the treatment of cancer and age-related macular degeneration. Br J Pharmacol. 2011; 162:1225–1238.
16. Pyne S, Pyne NJ. Translational aspects of sphingosine 1-phosphate biology. Trends Mol Med. 2011; 17:463–472.
17. Van Brocklyn JR, Jackson CA, Pearl DK, Kotur MS, Snyder PJ, Prior TW. Sphingosine kinase-1 expression correlates with poor survival of patients with glioblastoma multiforme: roles of sphingosine kinase isoforms in growth of glioblastoma cell lines. J Neuropathol Exp Neurol. 2005; 64:695–705.
18. Ruckhaberle E, Rody A, Engels K, Gaetje R, von Minckwitz G, Schiffmann S, Grosch S, Geisslinger G, Holtrich U, Karn T, Kaufmann M. Microarray analysis of altered sphingolipid metabolism reveals prognostic sig-nificance of sphingosine kinase 1 in breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 2008; 112:41–52.
19. Li J, Guan HY, Gong LY, Song LB, Zhang N, Wu J, Yuan J, Zheng YJ, Huang ZS, Li M. Clinical significance of sphingosine kinase-1 expression in human astrocytomas progression and overall patient survival. Clin Cancer Res. 2008; 14:6996–7003.
20. Li W, Yu CP, Xia JT, Zhang L, Weng GX, Zheng HQ, Kong QL, Hu LJ, Zeng MS, Zeng YX, Li M, Li J, Song LB. Sphingosine kinase 1 is associated with gastric cancer progression and poor survival of patients. Clin Cancer Res. 2009; 15:1393–1399.
21. Lee MJ, Thangada S, Claffey KP, Ancellin N, Liu CH, Kluk M, Volpi M, Sha’afi RI, Hla T. Vascular endothelial cell adherens junction assembly and morphogenesis induced by sphingosine-1-phosphate. Cell. 1999; 99:301–312.
22. Chae SS, Paik JH, Furneaux H, Hla T. Requirement for sphingosine 1-phosphate receptor-1 in tumor angiogenesis demonstrated by in vivo RNA interference. J Clin Invest. 2004; 114:1082–1089.
23. Visentin B, Vekich JA, Sibbald BJ, Cavalli AL, Moreno KM, Matteo RG, Garland WA, Lu Y, Yu S, Hall HS, Kundra V, Mills GB, Sabbadini RA. Validation of an anti-sphingosine-1-phosphate antibody as a potential therapeutic in reducing growth, invasion, and angiogenesis in multiple tumor lineages. Cancer Cell. 2006; 9:225–238.
24. Anelli V, Gault CR, Snider AJ, Obeid LM. Role of sphingosine kinase-1 in paracrine/transcellular angio-genesis and lymphangiogenesis in vitro. FASEB J. 2010; 24:2727–2738.
25. Pchejetski D, Doumerc N, Golzio M, Naymark M, Teissie J, Kohama T, Waxman J, Malavaud B, Cuvillier O. Chemosensitizing effects of sphingosine kinase-1 inhibition in prostate cancer cell and animal models. Mol Cancer Ther. 2008; 7:1836–1845.
26. Paugh SW, Paugh BS, Rahmani M, Kapitonov D, Almenara JA, Kordula T, Milstien S, Adams JK, Zipkin RE, Grant S, Spiegel S. A selective sphingosine kinase 1 inhibi-tor integrates multiple molecular therapeutic targets in human leukemia. Blood. 2008; 112:1382–1391.
27. Kapitonov D, Allegood JC, Mitchell C, Hait NC, Almenara JA, Adams JK, Zipkin RE, Dent P, Kordula T, Milstien S, Spiegel S. Targeting sphingosine kinase 1 inhib-its Akt signaling, induces apoptosis, and suppresses growth of human glioblastoma cells and xenografts. Cancer Res. 2009; 69:6915–6923.
28. Pchejetski D, Boehler T, Brizuela L, Sauer L, Doumerc N, Golzio M, Salunkhe V, Teissie J, Malavaud B, Waxman J, Cuvillier O. FTY720 (Fingolimod) sensitizes prostate cancer cells to radiotherapy by inhibition of sphingosine kinase-1. Cancer Res. 2010; 70:8651–8661.
29. O’Brien N, Jones ST, Williams DG, Cunningham HB, Moreno K, Visentin B, Gentile A, Vekich J, Shestowsky W, Hiraiwa M, Matteo R, Cavalli A, Grotjahn D, et al. Production and characterization of monoclonal anti-sphingosine-1-phosphate antibodies. J Lipid Res. 2009; 50:2245–2257.
Oncotarget16www.impactjournals.com/oncotarget
30. Ponnusamy S, Selvam SP, Mehrotra S, Kawamori T, Snider AJ, Obeid LM, Shao Y, Sabbadini R, Ogretmen B. Communication between host organism and cancer cells is transduced by systemic sphingosine kinase 1/sphingo-sine 1-phosphate signalling to regulate tumour metastasis. EMBO Mol Med. 2012; 4:761–775.
31. Brizuela L, Martin C, Jeannot P, Ader I, Gstalder C, Andrieu G, Bocquet M, Laffosse JM, Gomez-Brouchet A, Malavaud B, Sabbadini RA, Cuvillier O. Osteoblast-derived sphingosine 1-phosphate to induce proliferation and confer resistance to therapeutics to bone metastasis-derived prostate cancer cells. Mol Oncol. 2014; 8:1181–1195.
32. Semenza GL. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 2012; 148:399–408.
33. Vaupel P, Mayer A. Hypoxia in cancer: significance and impact on clinical outcome. Cancer Metastasis Rev. 2007; 26:225–239.
34. Carmeliet P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 2005; 438:932–936.
35. Semenza GL. Hypoxia-inducible factor 1 and cancer patho-genesis. IUBMB Life. 2008; 60:591–597.
36. Jain RK. Normalization of tumor vasculature: an emerg-ing concept in antiangiogenic therapy. Science. 2005; 307:58–62.
37. Carmeliet P, Jain RK. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nat Rev Drug Discov. 2011; 10:417–427.
38. Padera TP, Stoll BR, Tooredman JB, Capen D, di Tomaso E, Jain RK. Pathology: cancer cells compress intra-tumour vessels. Nature. 2004; 427:695.
39. Tredan O, Galmarini CM, Patel K, Tannock IF. Drug resis-tance and the solid tumor microenvironment. J Natl Cancer Inst. 2007; 99:1441–1454.
40. Maity A, Bernhard EJ. Modulating tumor vasculature through signaling inhibition to improve cytotoxic therapy. Cancer Res. 2010; 70:2141–2145.
41. Goel S, Duda DG, Xu L, Munn LL, Boucher Y, Fukumura D, Jain RK. Normalization of the vasculature for treatment of cancer and other diseases. Physiol Rev. 2011; 91:1071–1121.
42. Wang GL, Jiang BH, Rue EA, Semenza GL. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodi-mer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995; 92:5510–5514.
43. Majmundar AJ, Wong WJ, Simon MC. Hypoxia-inducible factors and the response to hypoxic stress. Mol Cell. 2010; 40:294–309.
44. Wilson WR, Hay MP. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 2011; 11:393–410.
45. Semenza GL. Hypoxia-inducible factors: mediators of cancer progression and targets for cancer therapy. Trends Pharmacol Sci. 2012; 33:207–214.
46. Rapisarda A, Melillo G. Overcoming disappointing results with antiangiogenic therapy by targeting hypoxia. Nat Rev Clin Oncol. 2012; 9:378–390.
47. Melillo G. Inhibiting hypoxia-inducible factor 1 for cancer therapy. Mol Cancer Res. 2006; 4:601–605.
48. Ader I, Malavaud B, Cuvillier O. When the sphingosine kinase-1/sphingosine 1-phosphate pathway meets hypoxia signaling: new targets for cancer therapy. Cancer Res. 2009; 69:3723–3726.
49. Cuvillier O, Ader I, Bouquerel P, Brizuela L, Gstalder C, Malavaud B. Hypoxia, therapeutic resistance, and sphingo-sine 1-phosphate. Adv Cancer Res. 2013; 117:117–141.
50. Ader I, Brizuela L, Bouquerel P, Malavaud B, Cuvillier O. Sphingosine kinase 1: a new modulator of hypoxia induc-ible factor 1alpha during hypoxia in human cancer cells. Cancer Res. 2008; 68:8635–8642.
51. Anelli V, Gault CR, Cheng AB, Obeid LM. Sphingosine Kinase 1 Is Up-regulated during Hypoxia in U87MG Glioma Cells: role of hypoxia-inducible factors 1 and 2. J Biol Chem. 2008; 283:3365–3375.
52. Schnitzer SE, Weigert A, Zhou J, Brune B. Hypoxia enhances sphingosine kinase 2 activity and provokes sphin-gosine-1-phosphate-mediated chemoresistance in A549 lung cancer cells. Mol Cancer Res. 2009; 7:393–401.
53. Hisano Y, Kobayashi N, Yamaguchi A, Nishi T. Mouse SPNS2 functions as a sphingosine-1-phosphate transporter in vascular endothelial cells. PLoS One. 2012; 7:e38941.
54. Mendoza A, Breart B, Ramos-Perez WD, Pitt LA, Gobert M, Sunkara M, Lafaille JJ, Morris AJ, Schwab SR. The transporter spns2 is required for secretion of lymph but not plasma sphingosine-1-phosphate. Cell Rep. 2012; 2:1104–1110.
55. Blouw B, Song H, Tihan T, Bosze J, Ferrara N, Gerber HP, Johnson RS, Bergers G. The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell. 2003; 4:133–146.
56. Pchejetski D, Golzio M, Bonhoure E, Calvet C, Doumerc N, Garcia V, Mazerolles C, Rischmann P, Teissie J, Malavaud B, Cuvillier O. Sphingosine kinase-1 as a chemo-therapy sensor in prostate adenocarcinoma cell and mouse models. Cancer Res. 2005; 65:11667–11675.
57. Goertz DE, Yu JL, Kerbel RS, Burns PN, Foster FS. High-frequency Doppler ultrasound monitors the effects of antivascular therapy on tumor blood flow. Cancer Res. 2002; 62:6371–6375.
58. Wong CS, Sceneay J, House CM, Halse HM, Liu MC, George J, Hunnam TC, Parker BS, Haviv I, Ronai Z, Cullinane C, Bowtell DD, Moller A. Vascular normaliza-tion by loss of Siah2 results in increased chemotherapeutic efficacy. Cancer Res. 2012; 72:1694–1704.
59. Olivera A, Spiegel S. Sphingosine-1-phosphate as second messenger in cell proliferation induced by PDGF and FCS mitogens. Nature. 1993; 365:557–560.
Oncotarget17www.impactjournals.com/oncotarget
60. Cuvillier O, Rosenthal DS, Smulson ME, Spiegel S. Sphingosine 1-phosphate inhibits activation of caspases that cleave poly(ADP-ribose) polymerase and lamins during Fas- and ceramide-mediated apoptosis in Jurkat T lympho-cytes. J Biol Chem. 1998; 273:2910–2916.
61. Petrylak DP, Tangen CM, Hussain MH, Lara PN Jr., Jones JA, Taplin ME, Burch PA, Berry D, Moinpour C, Kohli M, Benson MC, Small EJ, Raghavan D, et al. Docetaxel and estramustine compared with mitoxantrone and prednisone for advanced refractory prostate cancer. N Engl J Med. 2004; 351:1513–1520.
62. Tannock IF, de Wit R, Berry WR, Horti J, Pluzanska A, Chi KN, Oudard S, Theodore C, James ND, Turesson I, Rosenthal MA, Eisenberger MA. Docetaxel plus predni-sone or mitoxantrone plus prednisone for advanced prostate cancer. N Engl J Med. 2004; 351:1502–1512.
63. Sensken SC, Nagarajan M, Bode C, Graler MH. Local inac-tivation of sphingosine 1-phosphate in lymph nodes induces lymphopenia. J Immunol. 2011; 186:3432–3440.
64. Jain RK. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 2003; 9:685–693.
65. Dejana E, Tournier-Lasserve E, Weinstein BM. The control of vascular integrity by endothelial cell junctions: molecu-lar basis and pathological implications. Dev Cell. 2009; 16:209–221.
66. Gavard J, Gutkind JS. VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Nature cell biology. 2006; 8:1223–1234.
67. Morikawa S, Baluk P, Kaidoh T, Haskell A, Jain RK, McDonald DM. Abnormalities in pericytes on blood ves-sels and endothelial sprouts in tumors. Am J Pathol. 2002; 160:985–1000.
68. Raza A, Franklin MJ, Dudek AZ. Pericytes and vessel maturation during tumor angiogenesis and metastasis. American journal of hematology. 2010; 85:593–598.
69. Chen RR, Silva EA, Yuen WW, Mooney DJ. Spatio-temporal VEGF, and PDGF delivery patterns blood vessel formation and maturation. Pharm Res. 2007; 24:258–264.
70. Greenberg JI, Shields DJ, Barillas SG, Acevedo LM, Murphy E, Huang J, Scheppke L, Stockmann C, Johnson RS, Angle N, Cheresh DA. A role for VEGF as a negative regulator of pericyte function and vessel matura-tion. Nature. 2008; 456:809–813.
71. Xian X, Hakansson J, Stahlberg A, Lindblom P, Betsholtz C, Gerhardt H, Semb H. Pericytes limit tumor cell metastasis. J Clin Invest. 2006; 116:642–651.
72. Cooke VG, LeBleu VS, Keskin D, Khan Z, O’Connell JT, Teng Y, Duncan MB, Xie L, Maeda G, Vong S, Sugimoto H, Rocha RM, Damascena A, et al. Pericyte depletion results in hypoxia-associated epithelial-to-mesen-chymal transition and metastasis mediated by met signaling pathway. Cancer Cell. 2012; 21:66–81.
73. Yuan F, Chen Y, Dellian M, Safabakhsh N, Ferrara N, Jain RK. Time-dependent vascular regression and perme-ability changes in established human tumor xenografts induced by an anti-vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996; 93:14765–14770.
74. Jain RK. Normalizing tumor vasculature with anti- angiogenic therapy: a new paradigm for combination therapy. Nat Med. 2001; 7:987–989.
75. Winkler F, Kozin SV, Tong RT, Chae SS, Booth MF, Garkavtsev I, Xu L, Hicklin DJ, Fukumura D, di Tomaso E, Munn LL, Jain RK. Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radia-tion: role of oxygenation, angiopoietin-1, and matrix metal-loproteinases. Cancer Cell. 2004; 6:553–563.
76. Dings RP, Loren M, Heun H, McNiel E, Griffioen AW, Mayo KH, Griffin RJ. Scheduling of radiation with angio-genesis inhibitors anginex and Avastin improves therapeutic outcome via vessel normalization. Clin Cancer Res. 2007; 13:3395–3402.
77. Matsumoto S, Batra S, Saito K, Yasui H, Choudhuri R, Gadisetti C, Subramanian S, Devasahayam N, Munasinghe JP, Mitchell JB, Krishna MC. Antiangiogenic agent sunitinib transiently increases tumor oxygenation and suppresses cycling hypoxia. Cancer Res. 2011; 71:6350–6359.
78. Willett CG, Boucher Y, di Tomaso E, Duda DG, Munn LL, Tong RT, Chung DC, Sahani DV, Kalva SP, Kozin SV, Mino M, Cohen KS, Scadden DT, et al. Direct evidence that the VEGF-specific antibody bevacizumab has antivascular effects in human rectal cancer. Nat Med. 2004; 10:145–147.
79. Batchelor TT, Sorensen AG, di Tomaso E, Zhang WT, Duda DG, Cohen KS, Kozak KR, Cahill DP, Chen PJ, Zhu M, Ancukiewicz M, Mrugala MM, Plotkin S, et al. AZD2171, a pan-VEGF receptor tyrosine kinase inhibitor, normalizes tumor vasculature and alleviates edema in glio-blastoma patients. Cancer Cell. 2007; 11:83–95.
80. Willett CG, Duda DG, di Tomaso E, Boucher Y, Ancukiewicz M, Sahani DV, Lahdenranta J, Chung DC, Fischman AJ, Lauwers GY, Shellito P, Czito BG, Wong TZ, et al. Efficacy, safety, and biomarkers of neo-adjuvant bevacizumab, radiation therapy, and fluorouracil in rectal cancer: a multidisciplinary phase II study. J Clin Oncol. 2009; 27:3020–3026.
81. Emblem KE, Mouridsen K, Bjornerud A, Farrar CT, Jennings D, Borra RJ, Wen PY, Ivy P, Batchelor TT, Rosen BR, Jain RK, Sorensen AG. Vessel architectural imaging identifies cancer patient responders to anti- angiogenic therapy. Nat Med. 2013; 19:1178–1183.
82. Sorensen AG, Batchelor TT, Zhang WT, Chen PJ, Yeo P, Wang M, Jennings D, Wen PY, Lahdenranta J, Ancukiewicz M, di Tomaso E, Duda DG, Jain RK. A “vascu-lar normalization index” as potential mechanistic biomarker to predict survival after a single dose of cediranib in recurrent glioblastoma patients. Cancer Res. 2009; 69:5296–5300.
Oncotarget18www.impactjournals.com/oncotarget
83. Batchelor TT, Duda DG, di Tomaso E, Ancukiewicz M, Plotkin SR, Gerstner E, Eichler AF, Drappatz J, Hochberg FH, Benner T, Louis DN, Cohen KS, Chea H, et al. Phase II study of cediranib, an oral pan-vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, in patients with recurrent glioblastoma. J Clin Oncol. 2010; 28:2817–2823.
84. Sorensen AG, Emblem KE, Polaskova P, Jennings D, Kim H, Ancukiewicz M, Wang M, Wen PY, Ivy P, Batchelor TT, Jain RK. Increased survival of glioblastoma patients who respond to antiangiogenic therapy with ele-vated blood perfusion. Cancer Res. 2012; 72:402–407.
85. Cho SY, Lee HJ, Jeong SJ, Kim HS, Chen CY, Lee EO, Kim SH. Sphingosine kinase 1 pathway is involved in melatonin-induced HIF-1alpha inactivation in hypoxic PC-3 prostate cancer cells. J Pineal Res. 2011; 51:87–93.
86. Kalhori V, Kemppainen K, Asghar MY, Bergelin N, Jaakkola P, Tornquist K. Sphingosine-1-Phosphate as a Regulator of Hypoxia-Induced Factor-1alpha in Thyroid Follicular Carcinoma Cells. PLoS One. 2013; 8:e66189.
87. Garcia JG, Liu F, Verin AD, Birukova A, Dechert MA, Gerthoffer WT, Bamberg JR, English D. Sphingosine 1-phosphate promotes endothelial cell barrier integrity by Edg-dependent cytoskeletal rearrangement. J Clin Invest. 2001; 108:689–701.
88. Gaengel K, Niaudet C, Hagikura K, Lavina B, Muhl L, Hofmann JJ, Ebarasi L, Nystrom S, Rymo S, Chen LL, Pang MF, Jin Y, Raschperger E, et al. The sphingosine-1-phosphate receptor S1PR1 restricts sprouting angiogen-esis by regulating the interplay between VE-cadherin and VEGFR2. Dev Cell. 2012; 23:587–599.
89. Jung B, Obinata H, Galvani S, Mendelson K, Ding BS, Skoura A, Kinzel B, Brinkmann V, Rafii S, Evans T, Hla T. Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sus-tains vascular development. Dev Cell. 2012; 23:600–610.
90. Liu Y, Wada R, Yamashita T, Mi Y, Deng CX, Hobson JP, Rosenfeldt HM, Nava VE, Chae SS, Lee MJ, Liu CH, Hla T, Spiegel S, et al. Edg-1, the G protein-coupled recep-tor for sphingosine-1-phosphate, is essential for vascular maturation. J Clin Invest. 2000; 106:951–961.
91. Allende ML, Yamashita T, Proia RL. G-protein-coupled receptor S1P1 acts within endothelial cells to regulate vas-cular maturation. Blood. 2003; 102:3665–3667.
92. Paik JH, Skoura A, Chae SS, Cowan AE, Han DK, Proia RL, Hla T. Sphingosine 1-phosphate receptor regula-tion of N-cadherin mediates vascular stabilization. Genes Dev. 2004; 18:2392–2403.
93. Sanchez T, Skoura A, Wu MT, Casserly B, Harrington EO, Hla T. Induction of vascular permeability by the sphingo-sine-1-phosphate receptor-2 (S1P2R) and its downstream effectors ROCK and PTEN. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007; 27:1312–1318.
94. Zhang G, Yang L, Kim GS, Ryan K, Lu S, O’Donnell RK, Spokes K, Shapiro N, Aird WC, Kluk MJ, Yano K, Sanchez T. Critical role of sphingosine-1-phosphate receptor 2 (S1PR2) in acute vascular inflammation. Blood. 2013; 122:443–455.
95. Skoura A, Sanchez T, Claffey K, Mandala SM, Proia RL, Hla T. Essential role of sphingosine 1-phosphate receptor 2 in pathological angiogenesis of the mouse retina. J Clin Invest. 2007; 117:2506–2516.
96. Michaud MD, Robitaille GA, Gratton JP, Richard DE. Sphingosine-1-phosphate: a novel nonhypoxic activator of hypoxia-inducible factor-1 in vascular cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2009; 29:902–908.
97. Du W, Takuwa N, Yoshioka K, Okamoto Y, Gonda K, Sugihara K, Fukamizu A, Asano M, Takuwa Y. S1P(2), the G protein-coupled receptor for sphingosine-1-phosphate, negatively regulates tumor angiogenesis and tumor growth in vivo in mice. Cancer Res. 2010; 70:772–781.
98. Lawrence YR, Dicker AP. Hypoxia in prostate cancer: obser-vation to intervention. The lancet oncology. 2008; 9:308–309.
99. Weidner N, Carroll PR, Flax J, Blumenfeld W, Folkman J. Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma. Am J Pathol. 1993; 143:401–409.
100. Russo G, Mischi M, Scheepens W, De la Rosette JJ, Wijkstra H. Angiogenesis in prostate cancer: onset, progres-sion and imaging. BJU Int. 2012; 110:E794–808.
101. Mucci LA, Powolny A, Giovannucci E, Liao Z, Kenfield SA, Shen R, Stampfer MJ, Clinton SK. Prospective study of prostate tumor angiogenesis and cancer-specific mortality in the health professionals follow-up study. J Clin Oncol. 2009; 27:5627–5633.
102. George DJ, Halabi S, Shepard TF, Vogelzang NJ, Hayes DF, Small EJ, Kantoff PW, Cancer Leukemia Group. Prognostic significance of plasma vascular endothelial growth factor levels in patients with hormone-refractory prostate cancer treated on Cancer and Leukemia Group B 9480. Clin Cancer Res. 2001; 7:1932–1936.
103. Kelly WK, Halabi S, Carducci M, George D, Mahoney JF, Stadler WM, Morris M, Kantoff P, Monk JP, Kaplan E, Vogelzang NJ, Small EJ. Randomized, double-blind, placebo-controlled phase III trial comparing docetaxel and prednisone with or without bevacizumab in men with metastatic castration-resistant prostate cancer: CALGB 90401. J Clin Oncol. 2012; 30:1534–1540.
104. Tannock IF, Fizazi K, Ivanov S, Karlsson CT, Flechon A, Skoneczna I, Orlandi F, Gravis G, Matveev V, Bavbek S, Gil T, Viana L, Aren O, et al. Aflibercept versus placebo in combination with docetaxel and prednisone for treat-ment of men with metastatic castration-resistant prostate cancer (VENICE): a phase 3, double-blind randomised trial. The lancet oncology. 2013; 14:760–768.
105. Galsky MD, Oh WK. Tumour angiogenesis: an elusive target in castration-resistant prostate cancer. The lancet oncology. 2013; 14:681–682.
106. Milosevic M, Chung P, Parker C, Bristow R, Toi A, Panzarella T, Warde P, Catton C, Menard C, Bayley A, Gospodarowicz M, Hill R. Androgen withdrawal in patients reduces prostate cancer hypoxia: implications for disease progression and radiation response. Cancer Res. 2007; 67:6022–6025.
Oncotarget19www.impactjournals.com/oncotarget
107. Milosevic M, Warde P, Menard C, Chung P, Toi A, Ishkanian A, McLean M, Pintilie M, Sykes J, Gospodarowicz M, Catton C, Hill RP, Bristow R. Tumor Hypoxia Predicts Biochemical Failure following Radiotherapy for Clinically Localized Prostate Cancer. Clin Cancer Res. 2012; 18:2108–2114.
108. Benjamin LE, Golijanin D, Itin A, Pode D, Keshet E. Selective ablation of immature blood vessels in established human tumors follows vascular endothelial growth factor withdrawal. J Clin Invest. 1999; 103:159–165.
109. Roe K, Mikalsen LT, van der Kogel AJ, Bussink J, Lyng H, Ree AH, Marignol L, Olsen DR. Vascular responses to radiotherapy and androgen-deprivation therapy in experi-mental prostate cancer. Radiat Oncol. 2012; 7:75.
110. Widmark A, Klepp O, Solberg A, Damber JE, Angelsen A, Fransson P, Lund JA, Tasdemir I, Hoyer M, Wiklund F, Fossa SD Scandinavian Prostate Cancer Group S, Swedish Association for Urological O. Endocrine treatment, with or without radiotherapy, in locally advanced prostate cancer (SPCG-7/SFUO-3): an open randomised phase III trial. Lancet. 2009; 373:301–308.
111. Denham JW, Steigler A, Lamb DS, Joseph D, Turner S, Matthews J, Atkinson C, North J, Christie D, Spry NA, Tai KH, Wynne C, D’Este C. Short-term neoadju-vant androgen deprivation and radiotherapy for locally advanced prostate cancer: 10-year data from the TROG 96.01 randomised trial. The lancet oncology. 2011; 12:451–459.
AUTEUR : Cécile GSTALDER
TITRE : Rôle de la voie sphingosine kinase 1/sphingosine 1-phosphate dans l'adaptation à l'hypoxie
intratumorale des adénocarcinomes rénaux à cellules claires
DIRECTEURS DE THÈSE : Dr Isabelle ADER, Dr Olivier CUVILLIER
DATE ET LIEU DE SOUTENANCE : Mercredi 08 Juillet 2015, Toulouse
RÉSUMÉ :
Les adénocarcinomes rénaux à cellules claires (ccRCC), qui représentent 70% des tumeurs rénales, sont fortement mais irrégulièrement vascularisés, ce qui les rend hypoxiques et donc résistants aux chimiothérapies. L’hypoxie favorise l’agressivité tumorale via l’activation des facteurs de transcription HIF-
1α et HIF-2α (Hypoxia-Inducible Factors). Pour cette raison, le ciblage de l’hypoxie intratumorale et des facteurs HIF dans les ccRCC constitue une stratégie thérapeutique pertinente. Dans ce projet, nous montrons pour la première fois que la voie sphingosine kinase 1/sphingosine 1-phosphate (SphK1/S1P)
régule HIF-2α in vitro et in vivo. Nos résultats indiquent que la SphK1 régule le taux intracellulaire et
l’activité transcriptionnelle de HIF-2α dans des lignées de ccRCC représentatives de certains sous-groupes retrouvés en clinique humaine ; et impliquent la S1P extracellulaire, via le récepteur S1P1, dans la régulation
de HIF-1α et HIF-2α. D’autre part, nous avons évalué l’impact de l’inhibition des récepteurs à S1P et de la SphK1 par le FTY720 dans un modèle de ccRCC in vivo. Nos résultats indiquent que le FTY720 entraine une
diminution transitoire du taux intratumoral de HIF-1α et HIF-2α ainsi qu’un remodelage du réseau vasculaire tumoral. En effet, le FTY720 induit une normalisation vasculaire qui aboutit à une oxygénation tumorale transitoire. Enfin, nous montrons que ce traitement permet de sensibiliser un modèle murin de ccRCC à la chimiothérapie. Ces résultats valident le rôle de la voie SphK1/S1P comme régulateur de l'adaptation à l'hypoxie dans les ccRCC. Ils constituent une étape indispensable à la transposition en clinique humaine du concept selon lequel la voie SphK1/S1P peut être ciblée afin de diminuer l’hypoxie intratumorale et de chimiosensibiliser certains cancers, le FTY720 étant déjà sur le marché.
MOTS CLÉS : Hypoxie, HIF, Voie sphingosine kinase 1/sphingosine 1-phosphate, Adénocarcinomes rénaux à cellules claires, Angiogenèse, Chimiorésistance
TITLE : Role of the Sphingosine kinase 1/Sphingosine 1-phosphate pathway in the adaptation to intratumoral hypoxia in clear cell renal cell carcinoma
ABSTRACT:
Clear cell renal cell carcinomas (ccRCC) represent 70% of renal tumors. Because of their dense and irregular vascular network, ccRCC become hypoxic and therefore resistant to chemotherapies. Hypoxia promotes
tumor aggressiveness via the activation of HIF-1α and HIF-2α (Hypoxia-Inducible Factors). For this reason, the control of intratumoral hypoxia and HIF in ccRCC could be a relevant therapeutic strategy to improve the efficacy of current treatments. In this study, we show for the first time that the sphingosine kinase
1/sphingosine 1-phosphate (SphK1/S1P) pathway regulates HIF-2α in vitro and in vivo. Our results indicate
that SphK1 regulates HIF-2α intracellular level and transcriptional activity in ccRCC cell lines that are representative of some clinical ccRCC subgroups. Our data also involve extracellular S1P, via its receptor
S1P1, in the regulation of HIF-1α and HIF-2α. In addition, in a ccRCC mouse model, we show that FTY720 –
an inhibitor of the SphK1/S1P pathway– transiently decreases HIF-1α and HIF-2α intratumoral level. This is associated with a transient remodeling of the tumor vascular network indicating that FTY720 induces a vascular normalization that leads to transient tumor oxygenation. Finally, we show that this treatment sensitizes a ccRCC mouse model to chemotherapy. Overall, these results validate the key role of the SphK1/S1P pathway in the adaptation to hypoxia in ccRCC cell and animal models. Our results provide a mechanistic basis to target the SphK1/S1P pathway with FTY720 by increasing the efficacy of chemotherapy in ccRCC. They are a prerequisite for clinical transposition as FTY720 is a drug approved used in human clinic.
KEY WORDS : Hypoxia, HIF, Sphingosine kinase 1/sphingosine 1-phosphate pathway, Clear cell renal cell
carcinoma, Angiogenesis, Chemoresistance
DISCIPLINE ADMINISTRATIVE : Cancérologie
LABORATOIRE : Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), CNRS UMR5089, 205 route
de Narbonne, 31077 TOULOUSE CEDEX 04