STIMA DELL’INCERTEZZA DI MISURA DA STUDI DI VALIDAZIONE CONDOTTI
IN LABORATORIO.DETERMINAZIONE DI AFLATOSSINA M1 NEL LATTE CON METODICA HPLC
DOPO PURIFICAZIONE CON COLONNE DI IMMUNOAFFINITA’
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6° MEETING DEI RESPONSABILI E TECNICI DI LABORATORIO
DEL SETTORE LATTIERO-CASEARIO
A.Caria, M.Cabiddu, I.Ibba, C.Cicalò
OBIETTIVO DEL METODO
Determinare la quantità di aflatossina M1 nel latte
impiegando un procedimento di estrazione con colonna di
immunoaffinità e misurazione con HPLC con rivelatore a fluorescenza
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UNI CEI ENV 13005:2000§ 3.4 CONSIDERAZIONI PRATICHE
3.4.8”……l’incertezza non può sostituirsi al pensiero critico, all’onestà intellettuale ed alla capacità professionale. La valutazione dell’incertezza non è né un compito di routine né un esercizio puramente matematico, ma dipende dalla conoscenza approfondita della natura del misurando e della misurazione. La qualità e l’utilità dell’incertezza attribuita al risultato di una misurazione dipendono pertanto, in definitiva dall’approfondimento, dall’analisi critica e dall’integrità morale di chi contribuisce ad assegnare il valore “.
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IL PROCEDIMENTO PER LA STIMA DELL’INCERTEZZA
INIZIO 1. SPECIFICARE IL MISURANDO
FINE
2. IDENTIFICARE LE FONTI DINCERTEZZA
3. SEMPLIFICARE RAGGRUPPANDO LE FONTI PER LE QUALI VI SONO DATI ESISTENTI
4. QUANTIFICARE LE COMPONENTIRAGGRUPPATE
5. QUANTIFICARE LE COMPONENTIRESIDUE
6. CONVERTIRE LE COMPONENTI IN SCARTI TIPO
7. CALCOLARE L’ INCERTEZZA TIPO COMPOSTA E L’INCERTEZZA ESTESA
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SGRASSATURA
ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE
ELUIZIONE
CONCENTR.ESTRATTO E DILUIZ.A VOLUME
MISURAZIONE CON HPLC
PREPARAZIONE DEL MATERIALE
PER LA TARATURA
TARATURA HPLC
RISULTATO
FASE 1. SPECIFICARE IL MISURANDO
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IL DIAGRAMMA CAUSA EFFETTO
• Il diagramma causa-effetto è un modo utile per elencare le fonti di incertezza.
• Mostra le loro reciproche relazioni e indica l’influenza del risultato
• Serve a evitare di contare alcune fonti più di una volta
FASE 2- IDENTIFICARE LE FONTI DI INCERTEZZA
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FASE 2- IDENTIFICARE LE FONTI DI INCERTEZZA
IL DIAGRAMMA CAUSA EFFETTOCOME SI COSTRUISCE
1. SCRIVERE L’EQUAZIONE COMPLETA PER IL RISULTATO. I PARAMETRI DELL’EQUAZIONE COSTITUISCONO I RAMI PRINCIPALI DEL DIAGRAMMA. SE APPROPRIATO AGGIUNGERE RAMI CHE RAPPRESENTANO LO SCOSTAMENTO GLOBALE( AD ES. RECUPERO )
2. CONSIDERARE OGNI FASE DEL METODO E AGGIUNGERE I RELATIVI FATTORI AL DIAGRAMMA A PARTIRE DAGLI EFFETTI PRINCIPALI
3. PER OGNI RAMO AGGIUNGERE I FATTORI CHE CONTRIBUISCONO FINCHE’ GLI EFFETTI DIVENTANO TRASCURABILI
4. RIDISEGNARE IL DIAGRAMMA RISOLVENDO LE DUPLICAZIONI, RENDENDO ESPLICITI I CONTRIBUTI E ACCORPANDO LE CAUSE COLLEGATE. METTERE I TERMINI RELATIVI ALLA PRECISIONE IN UN RAMO SEPARATO
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EQUAZIONE DI BASE UTILIZZATA PER IL CALCOLO DEL MISURANDO
• Tutti i parametri dell’equazione possono avere un’incertezza associata con il loro valore e quindi sono potenziali fonti di incertezza.
• Ci possono essere anche altri parametri che pur non comparendo nell’equazione influenzano i risultati ( es tempo di estrazione e temperatura ) e quindi sono fonti potenziali di incertezza.
• La nostra equazione è:
Wm = [mA ( Vf / Vi ) . 1/V]
dove
Wm = misurandomA= quantità di aflatossina M1 in ng corrispondente all’area del
picco di aflatossina M1 del campione Vi = volume di campione iniettato in µlVf= volume di ripresa del campione in µlV = quantità del campione iniziale in ml
FASE 2- IDENTIFICARE LE SORGENTI DI INCERTEZZA
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FASE 2. IDENTIFICARE LE SORGENTI DI INCERTEZZADIAGRAMMA CAUSA EFFETTO
AREA PICCO CAMPIONE
VOLUME INIEZIONE
VOLUMEFINALE
RISULTATO
RECUPEROVOLUME INIZIALE
CAMPIONEMATERIALE
RIFERIMENTO
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FASE 2-IDENTIFICARE LE SORGENTI DI INCERTEZZA DIAGRAMMA CAUSA-EFFETTO
AREA DEL PICCO CAMPIONE mA
Taratura vetr. Taratura
Temperatura
QUANTITÀ DI AFLATOSSIN
A NEL CAMPIONE
Inc. mr
RECUPERO R
AREA PICCO MR
VOLUME INIZ CAMP V
Temperatura
Tarat vetreria
Ripetibilità
Diluizione
Tar.vetr Op.
Ripetib.
Precisione
Precisione
Taratura HPLC Operatore
Operatore
Operatore
MAT.RIFER.
VOLUME FINALE Vf
Precisione
VOL.INIEZ.
Tar.vetr Op.
Ripetib.Tar.vetr Op
.
Ripetib.
Diluizione
Tar.vetr Op.
Ripetib.
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SGRASSATURA
ELUIZIONE CON
ACETONITRILE
CONC.ESTRATTO E DILUIZ.A VOL.
MISURAZIONE CON HPLC
ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE
FASE 2. IDENTIFICARE LE SORGENTI DI INCERTEZZA
-CAPACITÀ OPERATORE- QUALITA’ DELLA COLONNINA
-QUALITA’ VETRERIA -CAPACITÀ OPERATORE-QUALITA’ REAGENTE
-CAPACITA’ OPERATORE - QUALITA’ DELLA VETRERIA
-CAPACITÀ OPERATORE-INTEGRAZIONE-VOLUME INIEZIONE-CALCOLO RISULTATO-TARATURA-QUALITA’ DEI REAGENTI
-CAPACITÀ OPERATORE
PROCESSO ANALITICO
PREPARAZIONE DEL MATERIALE
PER LA TARATURA
TARATURA HPLC
- MATER.RIFERIM- CAPACITA’ OPERAT.- TARATURA PIPETTE- QUALITA’ VETR.- TEMPERATURA
CAPACITA’ OPERAT.
FONTI DI INCERTEZZA
FONTI DI INCERTEZZA
RISULTATO
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FASE 3 : SEMPLIFICARE RAGGRUPPANDO LE FONTI PER LE QUALI VI SONO DATI ESISTENTI
RIPETIBILITA’ AREA PICCO CAMP mA MAT.RIF. VOLUME FINALE
QUANTITÀ DI AFLATOSSIN
A NEL CAMPIONE
RECUPERO R AREA PICCO MR
VOLUME INIZ CAMP
Temper.
Tarat vetreria
Taratura HPLC
Taratura
HPLC
Area picco mr
Vol fin estratto
Vol iniz camp
Volume e dil mr
Area picco campione
diluizione mr
Taratura
Inc. mr
Temper Temper
Tarat vetreria
DIAGRAMMA CAUSA-EFFETTO
VOL. INIEZ
Vol iniezione
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RIPETIBILITA’ (1) AREA PICCO CAMP mA (1) MAT.RIF.(3) VOLUME FINALE (1)
QUANTITÀ DI AFLATOSSIN
A NEL CAMPIONE
RECUPERO R (2)
AREA PICCO MR (1)
VOLUME INIZ CAMP
(1)
Temper.
Tarat vetreria
(2)
Taratura HPLC (3)
Taratura
HPLC (3)
Area picco mr
Vol fin estratto
Vol iniz camp
Volume e dil mr
Area picco campione
diluizione mr (1)
Taratura (2)
Inc. mr (3)
Temper Temper
Tarat vetreria (2)
DIAGRAMMA CAUSA-EFFETTO
VOL. INIEZ
Vol iniezione
FASE 4-5. QUANTIFICARE LE COMPONENTI RAGGRUPPATE
(1) Ripetibilità considerata durante lo studio di variabilità del procedimento analitico
(2) Considerata durante lo studio dello scostamento sistematico
(3) Da considerare durante la valutazione delle altre fonti di incertezza
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Fasi 4 E 5 QUANTIFICAZIONE DELLE COMPONENTI DELL’INCERTEZZA
1. La miglior stima disponibile della variazione globale tra le diverse esecuzioni del processo analitico ( ripetibilità )
2. La miglior stima disponibile dello scostamento sistematico globale (recupero ) e della sua incertezza
3. La quantificazione di qualsiasi incertezza associata con effetti di cui non si sia tenuto conto in modo completo negli studi delle prestazioni globali
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FASE 6-CONVERTIRE LE COMPONENTI IN SCARTI TIPO
STUDIO DI VARIABILITÀ DEL PROCEDIMENTO ANALITICO RIPETIBILITA’
D1 D2 MEDIA DIFFERENZA DIFFERENZA/MEDIA1 53,72 53,69 53,71 0,03 0,00062 36,19 38,9 37,55 -2,71 -0,07223 46,51 45,83 46,17 0,68 0,01474 24,25 26,36 25,31 -2,11 -0,08345 23,7 19,77 21,74 3,93 0,18086 45,49 44,96 45,23 0,53 0,01177 62,77 65,35 64,06 -2,58 -0,04038 34,57 27,45 31,01 7,12 0,22969 13,8 11,8 12,80 2,00 0,156310 44,3 47,6 45,95 -3,30 -0,071811 22,7 20,4 21,55 2,30 0,106712 22,6 19,6 21,10 3,00 0,142213 20,6 20,6 20,60 0,00 0,000014 24,43 22,9 23,67 1,53 0,064715 26,01 21,36 23,69 4,65 0,196316 49,27 41,65 45,46 7,62 0,167617 47,04 48,22 47,63 -1,18 -0,024818 22,3 20,34 21,32 1,96 0,091919 29,7 27,44 28,57 2,26 0,079120 32,3 29,71 31,005 2,59 0,083521 24,11 25,08 24,595 -0,97 -0,039422 61,99 58,68 60,335 3,31 0,0549
u (x) rip 0,0945
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STUDIO DELLO SCOSTAMENTO SISTEMATICO
E’ stato eseguito durante la validazione del metodo mediante prove di recupero ( campioni omogeneizzati divisi in due aliquote, una delle quali addizionata con aflatossina M1 )
L’incertezza tipo è stata calcolata come scarto tipo della media
u (REC)= SCARTO TIPO % DEL RECUPERO
√NUMERO ESPERIMENTI CONDOTTI
Valutazione del recupero: verificare se è significativamente uguale a 1 ( 100% ) ; usando un test di significatività( t-test ) t= 1-REC /u (REC)
FASE 6-CONVERTIRE LE COMPONENTI IN SCARTI TIPO
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FASE 6-CONVERTIRE LE COMPONENTI IN SCARTI TIPOSTUDIO DELLO SCOSTAMENTO SISTEMATICO
VALORE STAND VAL CAMP RAPPORTO RECUPERO%
1 50 48,07 1,0 96,1
2 48,49 40,09 0,8 82,7
3 50 47,47 0,9 94,9
4 100 82,99 0,8 83,0
5 50,1 40,75 0,8 81,3
6 50 41 0,8 82,0
7 48,56 39,37 0,8 81,1
8 34,43 27,4 0,8 79,6
9 68,74 66,86 1,0 97,3
10 56,7 46,4 0,8 81,8
11 100 81,8 0,8 81,8
12 100 85,2 0,9 85,2
13 100 91,89 0,9 91,9
14 54,9 46,6 0,8 84,9
86,0
14 3,7 6,2
Inc. tipo 0,01657
t= (1-0,86)/ 0,01657 8,235294118
>del t tabulato per 10 gl=2,23 e del t a 15 gl =2,13
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ALTRE FONTI DI INCERTEZZA
Incertezza del materiale di riferimento fornita dal produttore
u = 0.0068
FASE 6-CONVERTIRE LE COMPONENTI IN SCARTI TIPO
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già trasformata in distribuzione rettangolare dividendo per √3
FASE 7. CALCOLARE L’ INCERTEZZA TIPO COMPOSTA
uc ( Wm )/ Wm =√ somma delle incertezze tipo relative
uc (Wm) = √ (0.0945)2+ (0.01657)2+ (0,0068)2
Wm
uc (Wm ) = Wm √ (0.0945)2+ (0.01657)2+(0.0068)2
Wm = 34.60 uc =3,33
INCERTEZZA TIPO RELATIVA DEL CAMPIONE =radice della somma delle incertezze di ripetibilità, del recupero e
del materiale di riferimento
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ESPRESSIONE DEL RISULTATOCALCOLARE L’ INCERTEZZA TIPO ESTESA
= 13
Il numero dei gradi di libertà effettivi risulta maggiore di 10 pertanto il fattore di copertura può essere assunto uguale a 2 (v. SINAL DT 0002 ).
Calcolo dei gradi di libertà effettivi:
Formula di Welch Satterthwaite
INCERTEZZA ESTESA U (Wm)
U (Wm) = [uc (Wm ) ] . 2
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FINE ESPRESSIONE DEL RISULTATO
CALCOLARE L’ INCERTEZZA TIPO ESTESA
U (Wm) = [ uc (Wm ) ] . 2
Wm = 34.60 ng/l ± 6,66
k =2 e t = 95%
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Stima dell’incertezza in base ai dati di precedenti studi collaborativi per lo sviluppo e la validazione del metodo
Lo scarto tipo di riproducibilità ottenuto in uno studio collaborativo
può essere assunto come l’incertezza del metodo da riportare nel rapporto
di prova
La riproducibilità del metodo è il parametro completo nella valutazione della precisione; tiene conto di tutte le possibili
variabilità all’interno e all’esterno dei laboratori
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Stima dell’incertezza in base ai dati di precedenti studi collaborativi per lo sviluppo e la validazione del metodo
SI ATTRIBUISCE ALLA RIPRODUCIBILITA’ IL VALORE DELL’INCERTEZZA COMPOSTA E SUCCESSIVAMENTE, TRAMITE
OPPORTUNO FATTORE DI COPERTURA, SI OTTIENE L’INCERTEZZA ESTESA.
Wm ± k . SR
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RIFERIMENTI
• UNI EN ISO/IEC 17025:1999 Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e taratura
• Istituto Superiore di Sanità- Quantificazione dell’incertezza nelle misure analitiche.Seconda Edizione (2000) della Guida EURACHEM/CITAC CG 4-Rapporti ISTISAN 03/30
• SINAL DT-0002 Guida per la dichiarazione dell'incertezza di misura rev 1• UNI CEI ENV 13005 – Luglio 2000- Guida all’espressione dell’incertezza di
misura• De Martin – ARPA-FVG-RGQ Pordenone: Workshop “ Validazione dei metodi
e incertezza di misura nei laboratori di prova: le linee guida delle Agenzie Ambientali-Ottobre 2003”