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Tema 2:Estructura y Función de las Proteínas
(5/5)
Prof. Vanessa [email protected]@bioquitips
Noviembre 2011
Universidad Central de VenezuelaFacultad de MedicinaEscuela de Medicina Luis RazettiCátedra de Bioquímica
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¿Cómo se estudian las proteínas?
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Aislando fracciones subcelulares
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Purificación de proteínas
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Métodos de purificación
Se basan en las propiedades fisicoquímicas de las proteínas:
Tamaño Solubilidad Carga Adsorción Afinidad
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Característica
Procedimientos
Tamaño Diálisis – ultrafiltración Electroforesis en gel Cromatografía de exclusión molecular Ultracentrifufación
Solubidad Precipitación con Sales “ Solventes orgánicos ‘’ por pH
Polaridad Cromatografia de absorción C. En papel C. En fase reversa C. De interaccion hidrofóbica
Carga Cromatografia de intercambio iónico Electroforesis Isoelectroenfoque
Selectividad Cromatografia de afinidad
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Centrifugación
Utiliza la fuerza centrífuga (fuerza-g) para aislar partículas suspendidas.
Los componentes de la mezcla se separan por: peso, tamaño, densidad y forma.
Se utiliza para la separación de organelos subcelulares y para el aislamiento de macromoléculas, tales como ADN, ARN, proteínas o lípidos
Se separan es su coeficiente de sedimentación(s); medido en Svedbergs (1 S = 10-13 segundos), depende de la forma y el tamaño de la molécula o partícula.
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Centrifugación
Centrifugación en gradientes de densidad
Gradientes continuos de sacarosa→ tubo de centrífuga
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Aplicación de fuerza centrífuga
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Muestra:tres componentes
mezclados
Fase móvil
Faseestacionaria
Se hace fluir una fasemóvil sobre
la estacionaria
Dependiendo de la afinidad
relativa por ambas fases, los
componentes de la mezcla
se separan
Se dispone una mezclasobre una fase estacionaria
Fundamento de la cromatografía
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Cromatografía
Exclusión molecular: Separa según tamaño molecular Fase estacionaria: dextrano o agarosa
entrecruzados Fase móvil: solución buffer Intercambio iónico: Separa según carga eléctrica Fase estacionaria: grupos cargados unidos a
un soporte insoluble Fase móvil: gradiente de sal o de pH
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Exclusión molecular
Separa mezclas de proteínas por tamaño Las columnas rellenas de polímeros
inertes insolubles pero muy hidratados:
Sephadex: polimeros de dextranoSepharose: agarosaSuperose: agarosa entrecruzadaSephacryl: dextrano-bisacrilamida Superdex: agarosa y dextrano
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Exclusión MolecularResina porosa
Fase estacionaria
AmortiguadorFase móvil
Resina
BA
A: Pasa sólo por fuera de las perlasMenos recorrido, sale primero
B: Pasa por dentro y por fuera de las perlasMayor recorrido, Sale después
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Exclusión molecular
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Proteínas de gran tamaño no Proteínas de gran tamaño no penetran los poros permaneciendo penetran los poros permaneciendo en el volumen de exclusión de la en el volumen de exclusión de la columna columna Vo
Volumen de exclusión
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.
1.La columna se equilibra con el buffer de corrida2. Aplicación de la muestra (0.5 - 5% volumen de columna)3. Elución.
Exclusión Molecular
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Cromatografía en columna
La salida de las proteínas se detecta normalmente por absorción de la luz, en una longitud de onda de 280nm.
Los aminoácidos de las proteínas absorben tal luz y se cuantifica utilizando un espectrofotómetro,
Los datos se registran en un diagrama de elución que indica la posición de las proteínas que se han separado.
Después pueden realizarse estudios de actividad biológica, enzimática, etc. de las proteínas fraccionadas
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G l u c a g o n
C i t o c r o m o c
R i b o n u c l e a s a
S e r o a l b ú m i n a
I g GT i r o g l o b u l i n a
V o l u m e n
P e s o m o l e c u l a r
2 8 0
2 4 0
2 0 0
1 6 0
1 2 0
8 0
4 0
1 03
1 04
1 05
1 06
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B o m b a p e r i s t á l t i c a
G e n e r a d o rd e g r a d i e n t e
C o l u m n a
C o l e c t o r d ef r a c c i o n e s
R e s i n a d ei n t e r c a m b i oi ó n i c o
Cromatografía deintercambio iónico
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Un intercambiador iónico consiste en una matriz porosa con grupos cargados unidos covalentemente.
Estos grupos se asocian con iones de la fase móvil (contraiónes), estos pueden intercambiarse por otros iones de las misma carga sin alterar la matriz.
La matriz generalmente es un compuesto inorgánico, resinas sintéticas o polisacáridos.
Matriz Nombre
Dextrano Sephadex
Agarosa Sepharose CL-6B
Celulosa Sephacel
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Intercambio Iónico
Los grupos funcionales cargados son una propiedad fundamental del intercambiador.
Determinan el tipo y la fuerza del intercambiador
El número total y su disponibilidad, determinan la capacidad del intercambiador
Los de carga negativa adsorben cationes (intercambiadores catiónicos) mientras que los de carga positiva adsorben aniones (intercambiadores aniónicos)
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Intercambiadores aniónicos
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Intercambiadores catiónicos
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Mecanismo de separación
• Separa a moléculas por carga neta.
• Grupos cargados unidos a la matriz unen las muestras de carga opuesta(reversible)
• La elución se logra a
través el cambio del pH o aumentando la concentración de sal del eluyente.
Fig 1.1. Charged sample molecules adsorb to ion exchangers of the opposite sign. The interaction is a dynamic equilibrium that can be influenced by pH or salt concentration.
Intercambio iónico
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Resina carga (-)Atrae cationes
A: (+)
B: (-)
Retenidas por la resina
Para separar A de la resina es necesario cambiar el pH por arriba del pI
Cromatografía de intercambio iónico
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+
+
+
+
++
+
+
+
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------
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+
+
++
+
+
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+
++
+
+
+
-
-
--
-
-
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-
- -
--
-
Proteínas adsorbidasal intercambiador
iónico
A baja concentraciónde sal, se desprenden las proteínas menos
electronegativas
A mayor concentraciónde sal se desprenden
las proteínas máselectronegativas
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Electroforesis
Método de separación de sustancias cargadas al aplicar un campo eléctrico, de modo que se diferencian en el diferente comportamiento en un campo eléctrico.
Aquellas partículas cargadas positivamente (cationes) migrarán hacia el cátodo y las cargadas negativamente (aniones) hacia el ánodo.
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1. Se realiza sobre un soportesólido o semisólido, para minimizar
efectos de difusión
2. Se somete el conjunto aun campo eléctrico constante,
a un pH fijo; las proteínas migranconforme a su carga eléctrica
3. Terminada la electroforesis, las proteínas se tiñen con un colorante adecuado (ej., Azul de Coomassie)
Muestra
+-ÁnodoCátodo
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Electroforesis de zona
Papel de filtro o acetato de celulosa Revela la presencia de proteínas con
colorantes específicos No existe interacción con el soporte Resolución muy baja Rápido
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Electroforesis en geles de poliacrilamida
Separa por carga y tamaño El material soporte interacciona con las
proteínas actuando como matriz retardando a las proteínas más grandes
Utiliza geles de poliacrilamidas. Condicion nativa (PAGE) o
desnaturalizante(SDS-PAGE)
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Electroforesis
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SDS-Page
Las proteínas se separan sólo por su PM El SDS interacciona con las proteínas por
interacciones hidrofóbicas Recubre las proteínas con carga negativa
proporcional a su PM Desnaturaliza la estructura nativa de la
proteína β -mercaptoetanol rompe los puentes
disulfuros
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Electroforesis
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Electroforesis bidimensional
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• Separar proteínas de una mezcla
• Determinación de PI y PM
• Fraccionamiento de las hemoglobinas
• Diferenciación de la hemoglobina fetal
• Diagnóstico de talasemias, anemias falciformes, etc
• Proteínas séricas• Proteínas urinarias• Lipoproteínas• Ácidos nucleicos• Enzimas• Inmunoelectroforesis• Etc.
Electroforesis: Aplicaciones
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Solubilidad
Muy utilizados en los primeros pasos de la purificación
Mantiene nativa a la proteina Redisolución sin pérdida de actividad Cada proteína tiene una composición de aa
diferente y diferente solubilidad
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SolubilidadDepende de: pH Fuerza iónica Disolvente Temperatura
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Solubilidad-pHLa carga neta de las proteína depende del
contenido de aa ácidos y de aa básicosCuando el valor del pH donde la carga neta de
la proteína es cero ⇒ pI
Solubilidad es mínina
Ej: ↑contenido de aa ácidos ⇒pI bajo (4-5)
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Solubilidad: disolventes
Adición de disolventes neutros miscibles en agua (ACETONA, ETANOL)
Se usan en distintas proporciones Disminuyen la solvatación de las proteínas
en soluciones acuosas
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Solubilidad-Fuerza iónica
Salting in
Salting out
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Salting in (salado)
Solubilidad a baja fuerza ionica (0.001 – 0.02 M)
aumenta con la [ sales] → Salting in
Al aumentar la [sales]
→proteína se rodea de contraiones
→más soluble por > interacción proteína-solvente
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Salting out (precipitación por salado)
La solubilidad a alta fuerza iónica (mayor a 0,02M) disminuye con la [sales] → Salting out
La alta [sal] remueve la esfera de solvatación de la proteína y éstas precipitan
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Solubilidad- Temperatura
0-40 oC >T > solubilidad. 40-50oC aumenta la inestabilidad y
DESNATURALIZAN (↓ solubilidad)