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Secuenciación de ARN
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Secuenciación de ARN
EST
RNA-Seq
Helicos
Por métodos enzimáticos y
químicos
A partir del ADNc
Directamente a partir del ARN
Métodos para secuenciar el ARN
Transcripción conceptual
A partir del ADNg
Secuenciación del ARN
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Secuenciación de ARN
Science, 147 (1965):1462-1465
Los primeros
n = 77
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Secuenciación de ARN
Luego vino Fred Sanger
Ribonucleasa T1
n = 120
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Secuenciación de ARN
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Secuenciación de ARN
Síntesis del ARN por la ARN polimerasa
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Secuenciación de ARN
1.- Se extrae el ARN de la célula
2.- La transcriptasa inversa genera el ADNc
3.- Se somete el cDNA a una electroforesis y se seleccionan los fragmentos que
tienen el tamaño adecuado para insertarlos en el vector de clonación.
5.- A partir de un clon se purifica el plásmido y se secuencia el inserto por ambos extremos
4.- Se transforman bacterias con los vectores recombinantes y se genera una genoteca de ADNc
Secuenciación del ARN a partir del ADNc
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Secuenciación de ARN
Síntesis de ADNc a partir del ARNm
Los cDNA obtenidos a partir de RNAm, que
se caracterizan por tener la cola poli(A),
representan una instantánea de los genes que se están expresando en un
momento dado y en unas condiciones
determinadas, o sea, el transcriptoma.
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Secuenciación de ARN
Purificación del ARNm y síntesis del ADNc
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Secuenciación de ARN
Expressed sequence tags (EST)
Un EST es la secuencia parcial de un inserto clonado procedente de una genoteca de
cDNA obtenida a partir del RNAm.
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Secuenciación de ARN
Expressed sequence tags (EST)
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Secuenciación de ARN
3.- La mayoría son “nativas”, ya que la frecuencia de los clones refleja la abundancia de los distintos ARNm.
4.- Las genotecas “normalizadas” se han modificado para reducir la presencia de los mRNA más abundantes y aumentar
la probabilidad de detectar los mRNA menos frecuentes.
5.- La mayoría se han generado con un cebador poli(T), de modo que los extremos 3’ están sobrerrepresentados.
2.- La complejidad y la calidad de las genotecas varía mucho de una a otra.
1.- Se preparan a partir de varios organismos, tejidos, tipos
celulares, condiciones patológicas o condiciones experimentales.
Características de las genotecas de ADNc
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Secuenciación de ARN
Características de los EST
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Secuenciación de ARN
Limitaciones de los EST
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Secuenciación de ARN
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Secuenciación de ARN
RNA-Seq
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Secuenciación de ARN
Esquema general de la RNA-Seq
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Secuenciación de ARN
Generación de una biblioteca de ADNc
3.- Se añaden adaptadores a los extremos de los ADNc para
obtener una librería de fragmentos de ADNc. No es necesario clonarlos en un
vector y transformar bacterias.
4.- La amplificación de los fragmentos de ADNc se lleva a cabo mediante variantes de la PCR (en emulsión o puenteada).
1.- Se extrae el ARN de las células. Se puede eliminar
el ARNr y el ARNt o seleccionar únicamente el
ARN con cola de poliA.
2.- La transcriptasa inversa sintetiza los ADNc (de doble
hebra). Se fragmenta el ADNc y se seleccionan los fragmentos
del tamaño apropiado.
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Secuenciación de ARN
Secuenciación masiva en paralelo (NGS)
5.- La secuenciación masiva en paralelo de los fragmentos de
ADNc mediante las técnicas de nueva generación (Roche 454, Illumina Solexa o ABI SOLID) .
6.- Las lecturas obtenidas en el apartado anterior se
ensamblan para generar el transcriptoma. Este proceso puede utilizar un genoma de
referencia o hacerse totalmente de novo.
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Secuenciación de ARN
Single-Molecule Sequencing (Helicos)
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Secuenciación de ARN
Evita los problemas asociados a la síntesis del ADNc
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Secuenciación de ARN
El artículo que describe el método
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Secuenciación de ARN
Terminador virtual
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Secuenciación de ARN
El secuenciador HeliScope y la celda de flujo
108 moléculas por cm2
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Secuenciación de ARN
El ARN poliadenilado (de forma natural o mediante
la enzima poli(A)-polimerasa) y bloqueado en el extremo 3’ con un residuo de dA se une a la superficie de la celda
de flujo, que está recubierta de poli(dT).
Unión del ARN a la celda de flujo
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Secuenciación de ARN
Rellenado con T (fill) y adición de 3 TV (lock)
Fill: Se añade desoxitimidina natural y una ADN-polimerasa especial (con actividad transcriptasa inversa) para que todas las A de la cola de poliA estén emparejadas con una T. Así
nos aseguramos de que la secuenciación comienza
directamente en el ARN molde.
Lock: Se añade polimerasa y 3 terminadores virtuales (TV): A, C y
G. Los TV contienen un fluoróforo y están bloqueados en 3’ de forma
reversible. Cada molécula de ARN incorpora el TV correspondiente. El proceso se detiene porque los TV tienen el extremo 3’ bloqueado.
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Secuenciación de ARN
Se toma una imagen y se elimina el fluoróforo
Se lavan los TV no unidos. Se excitan los fluoróforos y se toma una imagen. Cada señal
fluorescente corresponde a un ARN distinto y nos indica la posición que ocupa en la celda de flujo.
Se rompe el enlace que une el fluoróforo al TV y se desbloquea el extremo 3’ para un nuevo ciclo de incorporación de nucleótidos. Los fluoróforos
liberados se eliminan con un lavado.
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Secuenciación de ARN
Síntesis
Lavado + imagen
Escisión del fluoróforo y
desbloqueo en 3’
En cada ciclo se añade un TV distinto, siempre en el mismo orden: C, T, A, G
Lavado y nuevo ciclo
En cada ciclo se añade un nucleótido distinto, siempre en el mismo orden
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Secuenciación de ARN
120 ciclos de reacción y toma de imágenes
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Secuenciación de ARN
La longitud media de las lecturas es de 33 nucleótidos
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Secuenciación de ARN
La plataforma Helicos también puede secuenciar el ADN
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Secuenciación de ARN
Helicos cierra por bancarrota
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Secuenciación de ARN
SeqLL utiliza su tecnología