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7/28/2019 Sea Urchin Article

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B i o c h e m . J . ( 1 9 8 8 ) 2 5 2 , 2 5 7 - 2 6 2 ( P r i n t e d i n G r e a t B r i t a i n )

A c t i v a t i o n o f sea u r c h i n eggs b y i n o s i t o l p h o s p h a t e s i si n d e p e n d e n t o f e x t e r n a l c a l c i u m

Ian CROSSLEY,* SWANN,*

W H I T A K E R * "* D e p a r t m e n t o f P h y s i o l o g y , U n i v e r s i t y C o l l e g e L o n d o n , Gower S t r e e t , London WCIE 6 B T , U . K . , an d t D e p a r t m e n t o f

P h y s i o l o g y a n d B i o p h y s i c s , U n i v e r s i t y o f Miami M e d i c a l S c h o o l , M i a m i , FL 3 3 1 0 1 , U . S . A .

We i n v e s t i g a t e d t h e c o n t r i b u t i o n o f e x t e r n a l c a l c i u m i o n s t o i n o s i t o l p h o s p h a t e - i n d u c e d e x o c y t o s i s i n se a

u r c h i n e g g s . We s h o w t h a t : ( a ) i n o s i t o l p h o s p h a t e s a c t i v a t e eggs o f t h e se a u r c h i n s p e c i e s L y t e c h i n u s p i c t u sa n d L y t e c h i n u s v a r i e g a t u s i n d e p e n d e n t l y o f e x t e r n a l c a l c i u m i o n s ; ( b ) t h e m a g n i t u d e a n d d u r a t i o n o f t h e

i n o s i t o l p h o s p h a t e i n d u c e d c a l c i u m c h a n g e s ar e i n d e p e n d e n t o f e x t e r n a l c a l c i u m ; ( c ) i n c a l c i u m - f r e e sea-

w a t e r , i n c r e a s i n g t h e v o l u m e o f i n o s i t o l t r i s p h o s p h a t e s o l u t i o n i n j e c t e d d e c r e a s e d t h e e x t e n t o f egg

a c t i v a t i o n ; ( d ) eggs i n c a l c i u m - f r e e se a w a t e r ar e more e a s i l y d a m a g e d b y m i c r o i n j e c t i o n ; m i c r o i n j e c t i o n o f

l a r g e r v o l u m e s i n c r e a s e d l e a k a g e f r o m eggs p r e - l o a d e d w i t h f l u o r e s c e n t d y e . We c o n c l u d e t h a t i n o s i t o lp h o s p h a t e s d o n o t r e q u i r e e x t e r n a l c a l c i u m i o n s t o a c t i v a t e se a u r c h i n e g g s . T h i s i s e n t i r e l y c o n s i s t e n t w i t h

t h e i r r o l e as i n t e r n a l messengers a t f e r t i l i z a t i o n . T h e i n c r e a s e d d a m a g e c a u s e d t o eggs i n c a l c i u m - f r e e

s e a w a t e r i n j e c t e d w i t h l a r g e v o l u m e s may a l l o w t h e EGTA p r e s e n t i n t h e s e a w a t e r t o e n t e r t h e egg a n d

c h e l a t e a n y c a l c i u m r e l e a s e d b y t h e i n o s i t o l p h o s p h a t e s . T h i s may e x p l a i n t h e d i s c r e p a n c y b e t w e e n t h i s a n de a r l i e r r e p o r t s .

INTRODUCTION

T h e t r a n s i e n t i n c r e a s e i n t h e c y t o s o l i c f r e e c a l c i u m i o n

c o n c e n t r a t i o n ( C a 2 " 1 ) t h a t occurs a t f e r t i l i z a t i o n i n se a

u r c h i n eggs ( S t e i n h a r d t e t a l . , 1 9 7 7 ) i s t h e t r i g g e r t h a ti n i t i a t e s d e v e l o p m e n t ( W h i t a k e r & S t e i n h a r d t , 1 9 8 5 ) .T h e most o b v i o u s s i g n o f egg a c t i v a t i o n i s t h e e l e v a t i o no f a f e r t i l i z a t i o n e n v e l o p e . T h e f e r t i l i z a t i o n e n v e l o p e

r i s e s as a consequence o f t h e e x o c y t o s i s o f c o r t i c a ls e c r e t o r y g r a n u l e s c a u s e d b y t h e i n c r e a s e i n C a 2 + i ( B a k e r

& W h i t a k e r , 1 9 7 8 ) . F e r t i l i z a t i o n , p a r t h e n o g e n e t i c a c t i v a -t i o n a n d t h e e l e v a t i o n o f t h e f e r t i l i z a t i o n e n v e l o p e ca n

occur i n c a l c i u m - f r e e se a w a t e r , w h i c h s u g g e s t s t h a t t h ei n c r e a s e i n C a 2 " , i s d u e t o r e l e a s e o f c a l c i u m i o n s f r o mi n t e r n a l s t o r e s ( S t e i n h a r d t & E p e l , 1 9 7 4 ; S c h m i d t e t a l . ,1 9 8 2 ) . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e f e r t i l i z a t i o n c a l c i u m

t r a n s i e n t i s t h e r e s u l t o f t h e l i b e r a t i o n o f t h e c a l c i u m -

r e l e a s i n g s e c o n d m e s s e n ge r i n o s i t o l 1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e[ I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 ] . T h i s i d e a r e s t s on t h e d e m o n s t r a t i o n o f a n

i n c r e a s e d t u r n o v e r o f p o l y p h o s p h o i n o s i t i d e p h o s p h o -l i p i d ( T u r n e r e t a l . , 1 9 8 4 ) a n d t h e p r o d u c t i o n o f i n o s i t o lt r i s p h o s p h a t e a t f e r t i l i z a t i o n ( C i a p a & W h i t a k e r , 1 9 8 6 ) .M i c r o i n j e c t i n g I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 i n t o se a u r c h i n eggs causes a n

i n c r e a s e i n C a 2 " i a n d t h e e l e v a t i o n o f a f e r t i l i z a t i o ne n v e l o p e ( W h i t a k e r & I r v i n e , 1 9 8 4 ; Swann & W h i t a k e r ,

1 9 8 6 ) . S e a u r c h i n egg h o m o g e n a t e s c o n t a i n an ATP-d r i v e n , m e m b r a n e - b o u n d c a l c i u m - s e q u e s t e r i n g s y s t e mt h a t i s s e n s i t i v e t o I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 ( C l a p p e r & L e e , 1 9 8 5 ) .

I t h a s r e c e n t l y b e e n r e p o r t e d t h a t m i c r o i n j e c t i o n o f

I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 causes a c t i v a t i o n o f se a u r c h i n eggs ( j u d g e db y f e r t i l i z a t i o n e n v e l o p e e l e v a t i o n ) o n l y i f c a l c i u m i o n s

ar e p r e s e n t e x t e r n a l l y ( S l a c k e t a l . , 1 9 8 6 ; I r v i n e & M o o r ,1 9 8 6 ) . T h e s e f i n d i n g s h a v e b e e n t a k e n as an i n d i c a t i o nt h a t i n o s i t o l p o l y p h o s p h a t e s r e g u l a t e p l a s m a membranec a l c i u m f l u x e s ( I r v i n e & M o o r , 1 9 8 6 ) . Y e t f e r t i l i z a t i o n

a n d d e v e l o p m e n t i n se a u r c h i n s can occur i n se a w a t e r

c o n t a i n i n g l e s s t h a n 1 0 - 8 M - C a 2 " ( C h a m b e r s , 1 9 8 0 ) , t h a ti s , u n d e r c o n d i t i o n s i n w h i c h c a l c i u m i n f l u x c a n n o t occur

( P o e n i e e t a l . , 1 9 8 5 ) . I f I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 a c t i v a t e s eggs o n l yi n c a l c i u m - c o n t a i n i n g se a w a t e r t h e n i t c a n n o t b e t h ec r u c i a l i n t e r n a l m e s s e n g e r a t f e r t i l i z a t i o n .We u n d e r t o o k t h i s s t u d y t o d e t e r m i n e more p r e c i s e l y

t h e c o n t r i b u t i o n o f e x t e r n a l c a l c i u m i o n s d u r i n g I n s P J -i n d u c e d e g g a c t i v a t i o n . We u s e d m i c r o i n j e c t i o n t e c h -n i q u e s t o assess t h e e f f e c t s o f a n u m b e r o f i n o s i t o lp h o s p h a t e s on c o r t i c a l g r a n u l e e x o c y t o s i s b o t h i n t h epresence a n d a b s e n c e o f e x t e r n a l c a l c i u m . We h a v e a l s oa s s e s s e d t h e c o n t r i b u t i o n t h a t c a l c i u m i n f l u x m a k e s t o

t h e i n o s i t o l p h o s p h a t e - i n d u c e d c a l c i u m t r a n s i e n t b ym e a s u r i n g C a 2 " i u s i n g t h e c a l c i u m s e n s i t i v e f l u o r e s c e n td y e , f u r a 2 . We f i n d t h a t a l l t h e i n o s i t o l p h o s p h a t e s t e s t e dcause c o r t i c a l g r a n u l e e x o c y t o s i s i n d e p e n d e n t l y o f e x t e r -

n a l c a l c i u m . M e a s u r e m e n t s o f C a 2 " , i n d i c a t e t h a t c a l c i u mi n f l u x m a k e s no s i g n i f i c a n t c o n t r i b u t i o n t o t h e i n o s i t o lp h o s p h a t e - i n d u c e d c a l c i u m t r a n s i e n t . Our d a t a s u p p o r t

t h e i d e a t h a t I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 i s t h e i n t e r n a l m e s s e n ge r t h a tcauses t h e i n c r e a s e i n C a 2 " 1 a t f e r t i l i z a t i o n a n d d e m o n -s t r a t e t h a t i n o s i t o l p h o s p h a t e s d o n o t cause a s i g n i f i c a n ti n f l u x o f c a l c i u m w h e n t h e y a c t i v a t e se a u r c h i n eggs.

MATERIALS AND METHODS

O b t a i n i n g g a m e t e s

G a m e t e s we re o b t a i n e d b y t h e i n t r a c o e l o m i c i n j e c t i o no f 0 . 5 M - K C I . E g g s o f t h e se a u r c h i n s p e c i e s L y t e c h i n u sp i c t u s ( P a c i f i c B i o m a r i n e L a b o r a t o r i e s I n c . , V e n i c e , C A ,U . S . A . ) a n d L y t e c h i n u s v a r i e g a t u s ( c o l l e c t e d o f f K e yB i s c a y n e , F L , U . S . A . ) w e r e c o l l e c t e d i n a r t i f i c i a l s e a w a t e r

(ASW; f o r c o m p o s i t i o n , se e b e l o w ) . T h e egg j e l l y was

A b b r e v i a t i o n s u s e d : I n s P 3 a n d I n s P 4 , i n o s i t o l t r i s p h o s p h a t e a n d

I n s ( 1 , 2 c y c 4 , 5 ) P 3 i s i n o s i t o l 1 , 2 - c y c l i c 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e ; ASW, a r t i f i c i a l s 4

I To whom c o r r e s p o n d e n c e s h o u l d b e a d d r e s s e d .

t e t r a k i s p h o s p h a t e r e s p e c t i v e l y ; l o c a n t s ar e g i v e n i n p a r e n t h e s e s , e . g .

V o l . 2 5 2

2 5 7



I . C r o s s l e y a n d o t h e r s

r e m o v e d b y t r i p l e p a s s a g e t h r o u g h 1 0 0 ,m N i t e x m e s h

a n d t h e e g g s w e r e w a s h e d t w i c e w i t h , t h e n r e s u s p e n d e d

i n , e i t h e r A S W o r c a l c i u m - f r e e ASW. F o r m i c r o i n j e c t i o nt h e e g g s w e r e a t t a c h e d t o c o v e r s l i p s p r e t r e a t e d w i t h

p o l y ( L - l y s i n e ) ( 0 . 0 2 m g / m l ) . S p e r m w a s c o l l e c t e d i n a

m i n i m a l v o l u m e o f ASW a n d k e p t a t 4 ° C u n t i l u s e .T h e v i a b i l i t y o f e g g s f r o m e a c h f e m a l e w a s a s s e s s e d a t

t h e e n d o f a s e r i e s o f e x p e r i m e n t s o n e g g s f r o m t h a t

f e m a l e . A s a m p l e o f e g g s w a s f e r t i l i z e d a n d d e v e l o p m e n tw a s o b s e r v e d . F o r a l l d a t a r e p o r t e d h e r e > 9 0 0 o f t h es a m p l e e l e v a t e d f e r t i l i z a t i o n e n v e l o p e s a n d > 8 0 0 %d e v e l o p e d t o a t l e a s t t h e f o u r - c e l l s t a g e .

A l l e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d a t 1 6 ' C .

C o m p o s i t i o n o f a r t i f i c i a l s e a w a t e r

ASW: 4 3 5 m M - N a C l , 4 0 m M - M g C l 2 , 1 5 m M - M g S O 4 ,1 1 m M - C a C l 2 , 1 0 m M - K C l , 2 . 5 mM-NaHCO3, 1 mM-EDTA, pH 8 . 0 .

C a l c i u m - f r e e ASW: 4 4 5 m M - N a C l , 5 0 m M - M g C l 2 , 1 0m M - K C l , 2 . 5 mM-NaHCO3, 2 mM-EGTA, 1 mM-EDTA,pH 8 . 0 .

C a l c i u m - f r e e ASW w a s c a l c u l a t e d t o h a v e a f r e ec a l c i u m

i o nc o n c e n t r a t i o n o f l e s s t h a n 1 0 0 nM b y u s i n g

t h e b i n d i n g c o n s t a n t s o f M a r t e l l & S m i t h ( 1 9 7 4 ) . T h i s

w a s c o n f i r m e d b y u s i n g a c a l c i u m - s e n s i t i v e e l e c t r o d e( W o r l d P r e c i s i o n I n s t r u m e n t s , New H a v e n , C T , U S A ) .

M i c r o i n j e c t i o n t e c h n i q u e s

M i c r o p i p e t t e s w e r e p u l l e d f r o m g l a s s c a p i l l a r y t u b e

( 1 . 5 mm i . d . ; C l a r k e E l e c t r o m e d i c a l , P a n g b o u r n e , U . K . )

u s i n g a P a l m e r B i o s c i e n c e M i c r o e l e c t r o d e P u l l e r ( S h e e r -n e s s , U . K . ) . T h e t i p r e s i s t a n c e w a s t y p i c a l l y 5 - 1 0 M oh mw h e n f i l l e d w i t h 3 M - K C I a n d t h e d i a m e t e r w a s s u c h t h a ta 1 0 - 5 0 ms p u l s e o f 4 5 0 k P a p r e s s u r e e j e c t e d a v o l u m e o f1 p l ( S w a n n & W h i t a k e r , 1 9 8 6 ) . P u l s e s w e r e d e l i v e r e d t ot h e p i p e t t e a t a f r e q u e n c y o f 1 Hz d u r i n g p e r i o d s o f

i m m e r s i o n i n s e a w a t e r t o p r e v e n t c o n t a m i n a t i o n o f t h e

p i p e t t e c o n t e n t s . T h e m i c r o p i p e t t e w a s h e l d i n am i c r o m a n i p u l a t o r ( P r i o r I n s t r u m e n t s , C a m b r i d g e ,

U . K . ) m o u n t e d o n t o t h e s t a g e o f a L e i t z D i a v e r t

m i c r o s c o p e .M i c r o i n j e c t i o n s w e r e p e r f o r m e d b y u s i n g b r i g h t f i e l d

m i c r o s c o p y w i t h a 4 0 x , 0 . 6 5 NA a c h r o m a t o b j e c t i v e .T h e i n j e c t e d v o l u m e w a s e s t i m a t e d b y m e a s u r i n g t h ec y t o p l a s m i c d i s p l ac e m e n t o f t h e i n j e c t e d f l u i d w i t h a n

e y e p i e c e g r a t i c u l e . F o r e x p e r i m e n t s t o d e t e r m i n e t h ed a m a g e d o n e t o e g g s b y m i c r o i n j e c t i o n a l o w p r e s s u r ei n j e c t i o n p r o c e e d u r e b a s e d o n t h a t d e s c r i b e d b y T u r n e r

e t a l . ( 1 9 8 6 ) w a s u s e d .

O b s e r v a t i o n o f t h e e g g c o r t i c a l g r a n u l e s

Weu s e d

c o r t i c a lg r a n u l e

e x o c y t o s i s a sa m o r p h o l o g i c a l

m a r k e r t o i n d i c a t e t h a t a n e l e v a t i o n o f C a 2 + 1 h a do c c u r r e d . H o w e v e r , a s w e l l a s l o o k i n g a t f e r t i l i z a t i o ne n v e l o p e e l e v a t i o n a s a n i n d i r e c t a s s a y o f e x o c y t o s i s , weo b s e r v e d t h e c o r t i c a l g r a n u l e s t h e m s e l v e s . T h e c o r t i c a lg r a n u l e s w e r e o b s e r v e d b y u s i n g d i f f e r e n t i a l i n t e r f e r e n c ec o n t r a s t m i c r o s c o p y w i t h a L e i t z 1 0 0 x , 1 . 2 NA o i l -i m m e r s i o n o b j e c t i v e .

F l u o r e s c e n c e m e a s u r e m e n t s o f C a 2 + ; a n d o f d y e e f f l u x

C a 2 + w a s m e a s u r e d b y u s i n g t h e c a l c i u m - s e n s i t i v ef l u o r e s c e n t d y e f u r a 2 . T h e f u r a 2 ( p e n t a p o t a s s i u m s a l t ;M o l e c u l a r P r o b e s , J u n c t i o n C i t y , O R , U . S . A . ; 1 0 mM i n0 . 5 M - K C I / 2 0 m M - P i p e s , pH 6 . 7 ) w a s i n t r o d u c e d i n t o t h ee g g s b y m i c r o i n j e c t i o n t o g i v e a c y t o p l a s m i c c o n c e n t r a -

t i o n o f a b o u t 1 0 0 / I M . T h e f l u o r e s c e n c e f r o m s i n g l e e g g s

w a s m e a s u r e d b y t h e m e t h o d s d e s c r i b e d b y S w a n n &W h i t a k e r ( 1 9 8 6 ) . C a 2 " i w a s c a l c u l a t e d b y u s i n g t h em e t h o d s a n d b i n d i n g c o n s t a n t s o f P o e n i e e t a l . ( 1 9 8 5 ) .On o c c a s i o n , e g g s w e r e l o a d e d w i t h t h e f l u o r e s c e n t d y ef l u o r e s c e i n ( 2 0 1 t M - f l u o r e s c e i n d i a c e t a t e f o r 3 0 m i n ) a n d

t h e l e a k a g e o f t h e d y e f o l l o w i n g i n j e c t i o n w a s m e a s u r e d

u s i n g a N i k o n O p t i p h o t e p i f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e

( e x c i t a t i o n 4 5 0 - 4 9 0 n m , e m i s s i o n 5 1 0 n m ) a n d a S I Tc a m e r a a t t a c h e d t o a v i d e o r e c o r d e r a n d v i d e o a n a l y s e r( C o l o r a d o V i d e o I n c . , B o u l d e r , C O , U . S . A . ) .

I n o s i t o l p h o s p h a t e s

T h e i n o s i t o l p h o s p h a t e s w e r e a g e n e r o u s g i f t f r o m D r .

R . F . I r v i n e o f t h e I n s t i t u t e o f A n i m a l P h y s i o l o g y ,B a b r a h a m , U . K . T h e y w e r e d i s s o l v e d i n a n i n j e c t i o nv e h i c l e c o n t a i n i n g 5 0 0 m M - K C l , 2 0 m M - P i p e s a n d 0 . 1mM-EGTA, pH 6 . 7 .

RESULTS

I n o s i t o l p h o s p h a t e s a n d c o r t i c a l g r a n u l e e x o c y t o s i s

We m i c r o i n j e c t e d I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 , i n o s i t o l 2 , 4 , 5 - t r i s p h o s -p h a t e [ I n s ( 2 , 4 , 5 ) P 3 ] , i n o s i t o l 1 , 2 - c y c l i c 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e[ I n s ( 1 , 2 c y c 4 , 5 ) P 3 ] , i n o s i t o l 1 , 3 , 4 - t r i s p h o s p h a t e[ I n s ( 1 , 3 , 4 ) P 3 ] a n d i n o s i t o l 1 , 3 , 4 , 5 - t e t r a k i s p h o s p h a t e[ I n s ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4 ] t o t e s t t h e i r e f f e c t s o n c o r t i c a l g r a n u l e

e x o c y t o s i s . I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 i n d u c e d t h e e x o c y t o s i s o f c o r t i c a lg r a n u l e s a n d t h e r e s u l t a n t e l e v a t i o n o f a f e r t i l i z a t i o ne n v e l o p e . F i g . 1 s h o w s t w o e g g s , o n e m i c r o i n j e c t e d i na r t i f i c i a l s e a w a t e r (ASW) a n d o n e i n c a l c i u m - f r e e ASW.B o t h e g g s h a v e e l e v a t e d a c o m p l e t e f e r t i l i z a t i o n e n v e l o p e .H o w e v e r , t h e f e r t i l i z a t i o n e n v e l o p e i n c a l c i u m - f r e e ASWi s much l e s s r e f r a c t i l e a n d m o r e d i f f i c u l t t o s e e . F o r t h i sr e a s o n , we d e c i d e d t o o b s e r v e t h e c o r t i c a l g r a n u l e sd i r e c t l y w h e n d e t e r m i n i n g t h e e f f e c t s o f i n o s i t o l p h o s -p h a t e s .

I n e x p e r i m e n t s t o d e t e r m i n e t h e s e n s i t i v i t y o f e g g s t oi n o s i t o l p h o s p h a t e s w e i n j e c t e d a c o n s t a n t v o l u m e o f

i n o s i t o l p h o s p h a t e ( 1 . 5 p l , 0 . 3 0 e g g v o l u m e ) a n d v a r i e dt h e p i p e t t e c o n c e n t r a t i o n . T h e r e a s o n s f o r t h i s w e r et w o f o l d . F i r s t , t h e s e n s i t i v i t y o f t h e e g g s t o i n o s i t o lp h o s p h a t e s may b e a f u n c t i o n o f t h e c o n c e n t r a t i o n

i n j e c t e d a s w e l l a s t h e t o t a l d o s e . S e c o n d , w e w e r ec o n c e r n e d a b o u t p o s s i b l e d a m a g e t o e g g s c a u s e d b ym i c r o i n j e c t i n g l a r g e r v o l u m e s , p a r t i c u l a r l y i n c a l c i u m -

f r e e ASW ( s e e b e l o w ) . T h e r e s u l t s o f m i c r o i n j e c t i n gv a r i o u s i n o s i t o l p h o s p h a t e s i n t o L y t e c h i n u s p i c t u s e g g s

a r e s h o w n i n F i g . 2 . I n ASW t h e m o s t a c t i v e i n o s i t o lp h o s p h a t e t e s t e d w a s I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 : h a l f - m a x i m a l a c t i v a -t i o n o c c u r s a t a n I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 c o n c e n t r a t i o n o f 2 . 5 / M ,s i m i l a r t o t h e c o n c e n t r a t i o n d e t e r m i n e d i n e a r l i e r w o r k( W h i t a k e r & I r v i n e , 1 9 8 4 ; T u r n e r e t a l . , 1 9 8 6 ) . O t h e r

i n o s i t o l p h o s p h a t e s a l s o c a u s e d c o r t i c a l g r a n u l e e x o -

c y t o s i s . I n s ( 1 I , 2 c y c 4 , 5 ) P 3 , I n s ( 2 , 4 , 5 ) P 3 a n d I n s ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4a c t i v a t e d e g g s a t h a l f - m a x i m a l c o n c e n t r a t i o n s o f 1 9 , 5 6

a n d 3 9 0 / M r e s p e c t i v e l y . We a l s o t e s t e d I n s ( 1 , 3 , 4 ) P 3 . I ts h o w e d l i t t l e a c t i v i t y : a - p i p e t t e c o n c e n t ra ti o n o f 1 m Mc a u s e d o n l y 2 0 0 o f t h e e g g s i n j e c t e d t o u n d e r g o c o m p l e t ec o r t i c a l g r a n u l e e x o c y t o s i s . M i c r o i n j e c t i o n o f v e h i c l ea l o n e c a u s e d n o s i g n o f e x o c y t o s i s ( n = 2 8 ) .

F i g . 2 a l s o s h o w s t h a t r e m o v i n g t h e e x t e r n a l c a l c i u m

d id n o t a f f e c t t h e s e n s i t i v i t y o f c o r t i c a l g r a n u l e e x o c y t o s i st o a n y o f t h e i n o s i t o l p h o s p h a t e s t e s t e d . T h i s r e s u l t w a s

v e r y d i f f e r e n t f r o m t h e p r e v i o u s r e p o r t s ( S l a c k e t a l . ,1 9 8 6 ; I r v i n e & M o o r , 1 9 8 6 ) o f a n e x t e r n a l c a l c i u m

1 9 8 8

2 5 8



I n o s i t o l p h o s p h a t e s a n d c a l c i u m i n f l u x i n s e a u r c h i n e g g s

. z - s.:

.5

S . i

l e c l l . S t : . . ..s .___.._ I I > . s a : . . . . . . . . . . . . : ,; . < s P . . ; : : : s . . . . . .

u s: £e: . , , . :: .: , : : : : : :- _ a l t : x . > = . . . . }. : : : . . . . . . . . . : : . . . : . : : . , . ,I N , ; , s . : . . . : . . . . : . ; < > . :. . . . . . . l g f , . : : a : : . : . : . ;

il F s 5 > > t.. . . , s . : : : . :. . . l S o x e E . . . . .: F L ' : . : : : ' : :

.5 : ? t e f ' . : : ' . : . : : . :| b 9 i f D ' : . : : . : .s , a : : : : : . . . . . . . . . : : :. : : : :X . . . . . . . . . X . : S . - : : : : : :E l a t s , ; ; . . . . . . . . . . . , s .: : } . : :

R C t ; r : : : , .i_ f s s 5 . : : : : . : . . { ! S

i iS 2 1 F s s l S P - s s X s ss ::'

l l rl l i i : i s ' : ' . .:rS S i X . # S g > ' . : ' l . :^;

l | g X ' . a 8 : . ' " '| ? s ? S s s e s p i t rXs#@l E f . , r , . M , . . . . . . . . . . , ? W & , . ? .i s. : : w . s w 6 : ^ :| , , , . 5 : , . . . . . . . . . .r . S e . . . . . . . . . .a ? : . . . : . w ? s : e x t .. e A g D S s - . B s . . . ;

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?a. EX'. . . g se . . . . . . . .e e . s g g g S . . . . t . g . . . .55,?, .? W . ; , . ., .:

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. . . . . : 2 0 p r l l

F i g . 1 . T h e I n s P 3 - i n d u c e d e l e v a t i o n o f a f e r t i l i z a t i o n e n v e l o p e i n n o r m a l a n d c a l c i u m - f r e e ASW

Tw o e g g s m i c r o i n j e c t e d w i t h I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 ( 1 . 5 p l , 1 0 # u M p i p e t t e c o n c e n t r a t i o n ) . On t h e l e f t , a n e g g i n o r d i n a r y ASW; o n t h e r i g h t ,a n e g g i n c a l c i u m - f r e e ASW. B o t h h a v e e l e v a t e d f e r t i l i z a t i o n e n v e l o p e s , b u t t h e e n v e l o p e o f t h e e g g i n c a l c i u m - f r e e ASW i s muchl e s s d i s t i n c t

I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 I n s ( 1 , 2 c y c 4 , 5 ) P 3 n s ( 2 , 4 , 5 ) P 3 n s ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4

0 -

0C . ) _

0x

CC u

0 ). 2

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0 )Cc

.

0 )

a)

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0

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w

1 0 0 *

5 0 -

00 . 5 1 1 0 1 0 0

P i p e t t e c o n c en t r at i on o f i n o s i t o l p h o s p h a t e ( p M )

1 0 0 0

F i g . 2 . I n o s i t o l p h o s p h a t e - i n d u c e d c o r t i c a l g r a n u l e e x o c y t o s i s

E g g s w e r e m i c r o i n j e c t e d w i t h a c o n s t a n t v o l u m e o f i n o s i t o l p h o s p h a t e ( 1 . 5 p l ) a n d t h e p i p e t t e c o n c e n t r a t i o n w a s v a r i e d . T h e e g g s

w e r e s c o r e d f o r c o r t i c a l g r a n u l e e x o c y t o s i s b y d i r e c t o b s e r v a t i o n o f t h e c o r t i c a l g r a n u l e s b y u s i n g d i f f e r e n t i a l i n t e r f e r e n c ec o n t r a s t m i c r o s c o p y . C l o s e d s y m b o l s r e f e r t o i n j e c t i o n s p e r f o r m e d i n n o r m a l ASW. O p e n s y m b o l s r e f e r t o i n j e c t i o n s p e r f o r m e di n c a l c i u m - f r e e ASW. E a c h p o i n t o n t h e g r a p h r e p r e s e n t s t h e i n j e c t i o n o f b e t w e e n 1 0 a n d 1 5 e g g s .

r e q u i r e m e n t f o r I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 - i n d u c e d e x o c y t o s i s . Tod e t e r m i n e w h e t h e r a s p e c i e s d i f f e r e n c e m i g h t a c c o u n t f o rt h i s d i s c r e p a n c y , we r e p e a t e d o u r e x p e r i m e n t s u s i n g e g g sf r o m L . v a r i e g a t u s , t h e s p e c i e s u s e d i n t h e f u l l e r o f t h et w o r e p o r t s . We o b t a i n e d v e r y s i m i l a r r e s u l t s i n L .

v a r i e g a t u s a n d L . p i c t u s ( T a b l e 1 ) .We a l s o a t t e m p t e d t o r e p r o d u c e t h e r e p o r t e d s y n e r g i s m

b e t w e e n I n s ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4 a n d I n s ( 2 , 4 , 5 ) P 3 ( I r v i n e & M o o r ,1 9 8 6 ) . We c o - i n j e c t e d s u b m a x i m a l d o s e s : 1 0 / , M -

I n s ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4 w i t h e i t h e r 1 0 / t M - I n s ( 2 , 4 , 5 ) P 3 o r 1 / t M -I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 . We d i d n o t o b s e r v e a n y s y n e r g i s t i c e f f e c t s .

D y e l e a k a g e f r o m m i c r o i n j e c t e d e g g s

O u r o b s er v at i o n s w e r e s o c l e a r l y d i f f e r e n t f r o m t h o s er e p o r t e d b y I r v i n e & M oor ( 1 9 8 6 ) t h a t we madee x p e r i m e n t s i n w h i c h we a t t e m p t e d t o r e p r o d u c e t h e i rm e t h o d s a s c l o s e l y a s we c o u l d . F o r t h e s e e x p e r i m e n t s w ea t t e m p t e d t o u s e t h e i r l o w - p r e s s u r e m i c r o i n j e c t i o n

V o l . 2 5 2

2 5 9

. . .. . . . .. . .

Us,

. . . . .



1 . C r o s s l c y a n d o t h e r s

T a b l e 1 . I n o s i t o l p h o s p h a t e - i n d u c e d c o r t i c a l g r a n u l e e x o c y t o s i s i n e g g s o f t h e s e a u r c h i n s p e c i e s L . v a r i e g a t u s

O n l y c o m p l e t e f e r t i l i z a t i o n e n v e l o p e e l e v a t i o n w a s s c o r e d . N . D . , n o t d e t e r m i n e d .

S c o r e

V o l u m e P i p e t t e N o r m a l C a l c i u m -( p I ) c o n c e n t r a t i o n ASW f r e e ASW

I n s ( l , 4 , 5 ) P 3I n s ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4

I n s ( 2 , 4 , 5 ) P 3

I n s ( l , 2 c y c 4 , 5 ) P I

0 . 5 1 0 I U M0 . 5 1 0 0 I t M0 . 5 1 mM0 . 5 1 0 , U M5 1 0 #M0 . 5 l O / I M

0 . 5 1 0 0 #M

m e t h o d a n d t h e i r l a r g e r i n j e c t i o n v o l u m e s ( 4 e g g

v o l u m e ) . We f o u n d t h a t l a r g e r i n j e c t i o n v o l u m e s (> 2eg g v o l u m e ) c a u s e d more v i s i b l e d a m a g e t o eggs,

p a r t i c u l a r l y i n c a l c i u m - f r e e s e a w a t e r . We d i d n o t f i n d

l o wpressure

i n j e c t i o n t o b e a s a t i s f a c t o r y m e t h o d f o ri n t r o d u c i n g l a r g e v o l u m e s o f s o l u t i o n i n t o t h e egg. Tot e s t t h e i d e a t h a t l a r g e i n j e c t i o n v o l u m e s may d a m a g eeggs we us e h i g h pressure t o m i c r o i n j e c t eggs i n c a l c i u m -f r e e ASW w i t h e i t h e r 1 . 5 p l or 2 0 p l o f 10 U t M -I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 . I n t h e s e e x p e r i m e n t s , t h e i n j e c t i o n o f 1 . 5 p l( 0 O . 3 0 0 egg v o l u m e ) o f 10 / M - I n s ( l , 4 , 5 ) P 3 c a u s e d 8 5 0 %( n = 3 ) eggs t o u n d e r g o c o m p l e t e c o r t i c a l g r a n u l ee x o c y t o s i s i n c a l c i u m - f r e e ASW, w h i l e t h e i n j e c t i o n o f2 0 p l ( 4 egg v o l u m e ) o f 1 0 / t M - I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 c a u s e d

3 8 . 6 0 % ( n = 8 ) o f t h e eggs i n j e c t e d t o u n d e r g o c o m p l e t ec o r t i c a l g r a n u l e e x o c y t o s i s . T h u s m i c r o i n j e c t i n g l a r g e rv o l u m e s o f t h e same c o n c e n t r a t i o n o f I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 c a u s e d

s i g n i f i c a n t l y l e s s a c t i v a t i o n ( P < 0 . 0 0 5 ) .We made a n e s t i m a t e o f t h e l e a k i n e s s o f eggs a f t e r

m i c r o i n j e c t i o n b y p r e - l o a d i n g t h e eggs w i t h a f l u o r e s c e n td y e a n d m e a s u r i n g t h e r a t e o f l e a k a g e o f t h e d y e f r o m t h eeggs a f t e r l a r g e a n d s m a l l v o l u m e m i c r o i n j e c t i o n s u s i n gh i g h pressure p u l s e s ( s e e t h e M a t e r i a l s a n d m e t h o d ss e c t i o n ) . We f o u n d t h a t d y e l e a k a g e was n o t d e t e c t a b l ea f t e r m i c r o i n j e c t i o n i n n o r m a l ASW w i t h i n j e c t e dv o l u m e s o f up t o 1 2 p l ( 2 . 4 % egg v o l u m e ) . I n c a l c i u m -f r e e ASW, l a r g e v o l u m e i n j e c t i o n s ( 1 2 p l , 2 . 4 0 % eg g

v o l u m e ) c a u s e d more r a p i d d y e l e a k a g e t h a n s m a l lv o l u m e i n j e c t i o n s ( 1 . 5 p l , 0 . 3% gg v o l u m e ) : t h e f o r m e rc a u s e d a l o s s o f 14+ 1 . 3 % ( m e a n + S . E . M . , n =3 ) o f t h ed y e 2 m i n a f t e r i n j e c t i o n , t h e l a t t e r o n l y 2 . 7 + 2 . 6 6 %( n = ) . T h i s d i f f e r e n c e i s s i g n i f i c a n t ( P < 0 . 0 2 , o n e t a i l e dt - t e s t ) .

M e a s u r e m e n t o f C a 2 + i a f t e r m i c r o i n j e c t i o n o f i n o s i t o lp h o s p h a t e s

Our o b s e r v a t i o n s t h a t i n o s i t o l p h o s p h a t e - i n d u c e dc o r t i c a l g r a n u l e e x o c y t o s i s i s i n d e p e n d e n t o f e x t e r n a l

c a l c i u m i on s d i d n o t e x c l u d e t h e p o s s i b i l i t y t h a t i n o s i t o lp h o s p h a t e s cause a c a l c i u m i n f l u x t h a t a f f e c t s t h e

d u r a t i o n a n d m a g n i t u d e o f t h e i n o s i t o l p h o s p h a t e -i n d u c e d i n c r e a s e i n C a 2 + i , s i n c e e x o c y t o s i s i s n o t a s t r i c t l yq u a n t i t a t i v e m e a s u r e o f C a 2 ' + . We t h e r e f o r e measured

c h a n g e s i n C a 2 " , f o l l o w i n g t h e i n j e c t i o n o f I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3a n d I n s ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4 b y u s i n g t h e c a l c i u m - s e n s i t i v e f l u o r e s -

c e n t d y e f u r a 2 . The r e s u l t s o f t h e s e e x p e r i m e n t s ar e

shown i n F i g . 3 ( a ) . We f o u n d t h a t t h e i n j e c t i o n o f

I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 ( 1 . 5 p l o f 1 0 , g M ) i n ASW c a u s e d a t r a n s i e n t

i n c r e a s e i n C a 2 " , w i t h a p e a k o f 2 /M a n d a d u r a t i o no f 3 m i n . R e m o v i n g t h e e x t e r n a l c a l c i u m i o n s

a f f e c t e d n e i t h e r t h e m a g n i t u d e n or d u r a t i o n o f t h ec a l c i u m response. We o b t a i n e d s i m i l a r r e s u l t s when

I n s ( l , 3 , 4 , 5 ) P 4 ( 1 p l o f I m M) was m i c r o i n j e c t e d ( F i g . 3 ( b ) ) .

DISCUSSION AND CONCLUSION

We h a v e i n v e s t i g a t e d t h e p a r t h e n o g e n e t i c a c t i v a t i o no f se a u r c h i n eggs b y i n o s i t o l p h o s p h a t e s a n d t h e r e q u i r e -ments f o r e x t e r n a l c a l c i u m . I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 was t h e most

a c t i v e i n o s i t o l p h o s p h a t e t e s t e d , c a u s i n g c o m p l e t ec o r t i c a l g r a n u l e e x o c y t o s i s a t a h a l f - m a x i m a l concen-

t r a t i o n o f 2 . 5 /!M, a v a l u e i n g o o d a g r e e m e n t w i t h e a r l i e rf i n d i n g s ( W h i t a k e r & I r v i n e , 1 9 8 4 ; T u r n e r e t a l . , 1 9 8 6 ) .We h a v e c o n f i r m e d I r v i n e & M o o r ' s ( 1 9 8 6 ) o b s e r v a t i o n

t h a t I n s ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4 h a s l i t t l e c a l c i u m - r e l e a s i n g a c t i v i t y i nse a u r c h i n e g g s . T h e e f f e c t s we o b s e r v e d may b ea c c o u n t e d f o r b y t h e c o n t a m i n a t i o n o f o ur s a m p l e o f

I n s ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4 w i t h I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 . I n c o n t r a s t we f o u n d t h a tI n s ( 2 , 4 , 5 ) P 3 h a d a n a c t i v i t y t wo o r d e r s o f m a g n i t u d eg r e a t e r t h a n t h a t p r e v i o u s l y r e p o r t e d ( I r v i n e & M o o r ,1 9 8 6 ) . Our o b s e r v a t i o n s p o i n t t o a s i m i l a r s e n s i t i v i t y f o rI n s ( 2 , 4 , 5 ) P 3 i n se a u r c h i n eggs as i n o t h e r t i s s u e s ( I r v i n ee t a l . , 1 9 8 4 ) . Our f i n d i n g t h a t t h e two m a i n m e t a b o l i t e so f I n s ( l , 4 , 5 ) P 3 , I n s ( l , 3 , 4 , 5 ) P 4 a n d I n s ( l , 3 , 4 ) P 3 ( B e r r i d g e ,1 9 8 7 ) , h a v e l i t t l e c a l c i u m - m o b i l i z i n g a c t i v i t y i n un -

f e r t i l i z e d se a u r c h i n eggs argues a g a i n s t t h e i r h a v i n g a

s i g n i f i c a n t r o l e as i n t e r n a l messengers c o n t r o l l i n g Ca2+a t f e r t i l i z a t i o n .We f i n d t h a t i n o s i t o l p h o s p h a t e - i n d u c e d c o r t i c a l

g r a n u l e e x o c y t o s i s occurs i n d e p e n d e n t l y o f e x t r a c e l l u l a r -c a l c i u m i o n s . M o r e o v e r , we f i n d t h a t t h e i n o s i t o l

p h o s p h a t e - i n d u c e d c a l c i u m t r a n s i e n t i s n o t m e a s u r a b l ya f f e c t e d b y t h e r e m o v a l o f e x t e r n a l c a l c i u m . T h e s e d a t a

i n d i c a t e t h a t i n o s i t o l p h o s p h a t e s d o n o t i n c r e a s e c a l c i u mi n f l u x i n se a u r c h i n eggs i n a way t h a t s i g n i f i c a n t l y a f f e c t s

C a 2 + . Our f i n d i n g s ar e e n t i r e l y c o n s i s t e n t w i t h t he i d e a

t h a t I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 i s t h e c r u c i a l i n t e r n a l messenger a t

f e r t i l i z a t i o n , w h e r e i t b r i n g s a b o u t r e l e a s e o f c a l c i u m

f r o m an i n t e r n a l s t o r e ( W h i t a k e r & I r v i n e , 1 9 8 4 ; C l a p p e r& L e e , 1 9 8 5 ; Swann & W h i t a k e r , 1 9 8 6 ) . T h e s e r e s u l t s

a n d , i n d e e d , p r e v i o u s work ( C h a m b e r s , 1 9 8 0 ; S c h m i d t e t

a l . , 1 9 8 2 ) make s c h e m e s i n w h i c h c a l c i u m i n f l u x p l a y s a

s i g n i f i c a n t p a r t a t f e r t i l i z a t i o n ( I r v i n e & M o o r , 1 9 8 6 ;M i c h e l l , 1 9 8 6 ; H o u s l a y , 1 9 8 7 ) h i g h l y u n l i k e l y . Ou ro b s e r v a t i o n s c l e a r l y d i f f e r from e a r l i e r f i n d i n g s ( S l a c k e t

a l . , 1 9 8 6 ; I r v i n e & M o o r , 1 9 8 6 ) . On e p o s s i b l e e x p l a n a t i o n

1 9 8 8

2 0 / 2 00 / 1 09 / 1 14 / 1 0

1 0 / 1 00 / 1 0

1 0 / 1 1

2 0 / 2 0N . D .1 2 / 1 9N . D .N . D .N . D .N . D .

2 6 0



I n o s i t o l p h o s p h a t e s a n d c a l c i u m i n f l u x i n s e a u r c h i n e g g s 2 6 1

2 . 5 ( a )

2A

0

0

0

A~~~~~~~

+ - 1 . 5 _0 _

_ 0mo _

A~~~~~~~~.A 1 3

A , ~ ~ ~ ~ ~0 . 5 ~ ~~ L * A z r, o ^

0 5 0 l O 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0

2 . 5 - ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ( b )0~~~~~~~

0 . 5 _ AAJ _A

qc0

o~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0

T i m e ( s )

F i g . 3 . C h a n g e s i n C a 2 + ; i n d u c e d b y m i c r o i n j e c t i o n o f I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 a n d 1 n s ( 1 , 3 , 4 . ) 5 ) P 4

( a ) C a 2 + . was m e a s u r e d w i t h t h e c a l c i u m - s e n s i t i v e d y e f u r a 2 f o l l o w i n g t h e m i c r o i n j e c t i o n o f I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 a t t =0 ( 1 . 5 p l , 1 0 p mp i p e t t e c o n c e n t r a t i o n ) . C l o s e d s y m b o l s ( A , * , * ) r e p r e s e n t i n j e c t i o n s i n o r d i n a r y ASW a n d o p e n s y m b o l s ( E , F 2 , O ) r e p r e s e n t

i n j e c t i o n s p e r f o r m e d i n c a l c i u m - f r e e ASW. T h r e e e x p e r i m e n t s were p e r f o r m e d i n e a c hc a s e

a n d e a c h i n j e c t i o n c a u s e d t h ee l e v a t i o n o f a c o m p l e t e f e r t i l i z a t i o n e n v e l o p e . T h e r e i s no o b v i o u s d i f f e r e n c e i n t h e e x t e n t a n d d u ra ti o n o f t h e I n s P 3 - i n d u c e dc a l c i u m t r a n s i e n t i n n o r m a l a n d c a l c i u m - f r e e ASW. ( b ) C a 2 + i f o l l o w i n g t h e m i c r o i n j e c t i o n o f I n s ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4 a t t = O ( 1 . 5 p l ,I mm p i p e t t e c o n c e n t r a t i o n ) . As i n ( a ) , c l o s e d s y m b o l s r e p r e s e n t i n j e c t i o n s p e r f o r m e d i n o r d i n a r y ASW a n d o p e n s y m b o l si n j e c t i o n s p e r f o r m e d i n c a l c i u m - f r e e ASW. T h r e e e x p e r i m e n t s were p e r f o r m e d i n e a c h c a s e a n d e a c h i n j e c t i o n c a u s e d t h ee l e v a t i o n o f a c o m p l e t e f e r t i l i z a t i o n e n v e l o p e .

f o r t h i s d i f f e r e n c e may l i e i n t h e d a m a g e t h a t t h e r e l e a s e d b y t h e i n o s i t o l p h o s p h a t e s . We c h o s e t o

m i c r o i n j e c t i o n o f l a r g e v o l u m e s c a u s e s t o e g g s i n c a l c i u m - m i c r o i n j e c t s m a l l v o l u m e s t o a v o i d t h i s p r o b l e m .f r e e ASW. I t i s p o s s i b l e t h a t t h e l e a k i n e s s t h a t we We h a v e no e x p l a n a t i o n f o r our f a i l u r e t o o b s e r v e t h em e a s u r e d u s i n g f l u o r e s c e n t d y e s i s s u f f i c i e n t t o a l l o w t h e s y n e r g i s m b e t w e e n I n s ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4 a n d I n s ( 2 , 4 , 5 ) P 3 p r e v i -EGTA p r e s e n t i n t h e c a l c i u m - f r e e ASW t o e n t e r t h e e g g s o u s l y r e p o r t e d ( I r v i n e & M o o r , 1 9 8 6 ) , t h o u g h i t a p p e a r sd u r i n g m i c r o i n j e c t i o n a n d c h e l a t e a n y c a l c i u m i o n s t h a t o t h e r s h a v e h a d s i m i l a r d i f f i c u l t i e s ( I r v i n e & M o o r ,

V o l . 2 5 2



2 6 2 I . C r o s s l e y a n d o t h e r s

1 9 8 7 ; I r v i n e e t a l . , 1 9 8 8 ) . I r v i n e & Moor ( 1 9 8 7 ) h a v es u g g e s t e d t h a t t h e i r i n a b i l i t y t o r e p r o d u c e t h i s c r u c i a lo b s e r v a t i o n s t e m s f r o m a s e a s o n a l v a r i a t i o n i n t h er e s p o n s e o f L . v a r i e g a t u s e g g s t o i n o s i t o l p h o s p h a t e s . Wef i n d n o s u c h v a r i a t i o n i n t h e r e s p o n s e s o f L . p i c t u s e g g s .I t h as b e e n s u g g e s t e d t h a t w h e t h e r o r n o t a c e l l r e q u i r e se x t e r n a l a s w e l l a s i n t e r n a l c a l c i u m f o r a r e s p o n s e

d e p e n d s c r u c i a l l y o n t h e s i z e o f t h e i n t e r n a l s t o r e r e l a t i v et o t h e c y t o s o l i c f r e e c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n c h a n g e

r e q u i r e d t o p r o d u c e t h e r e s p o n s e . T h i s p o s t u l a t e i m p l i e st h a t t h e s y n e r g i s m b e t w e e n I n s ( 2 , 4 , 5 ) P 3 a n d I n s ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4m i g h t b e o b s e r v e d o n l y i n e g g s w i t h a d e p l e t e d i n t r a -c e l l u l a r c a l c i u m s t o r e . T h i s d o e s n o t s e e m t o u s a

s a t i s f a c t o r y e x p l a n a t i o n , s i n c e e g g s t h a t m a n i f e s t e d t h es y n e r g i s m h a d a n o r m a l c e l l u l a r r e s p o n s e t o I n s P 3 . W e l l -

b e h a v e d L . v a r i e g a t u s e g g s h a v e a r o b u s t i n t r a c e l l u l a rs t o r e t h a t c a n n o t b e d e p l e t e d b y l o n g i n c u b a t i o n s i nc a l c i u m - f r e e s e a w a t e r ( A z a r n i a & C h a m b e r s , 1 9 7 6 ) : t h ep o s t u l a t e i s t h e r e f o r e d i f f i c u l t t o t e s t .

T h i s w o r k w a s s u p p o rt e d b y g r a n t s f r o m t h e W e l l c o m eT r u s t , a n d t h e B r o w n e F u n d o f t h e R o y a l S o c i e t y . I . C . h o l d s

a W e l l c o m e R e s e a r c h S t u d e n t s h i p a n d K . S . i s a n SERCs c h o l a r . We t h a n k D r . R . F . I r v i n e f o r p r o v i d i n g t h e i n o s i t o lp h o s p h a t e s , a n d D . M i d d l e m a s s f o r h i s h e l p i n p r e p a r i n g t h ef i g u r e s .

REFERENCES

A z a r n i a , R . & C h a m b e r s , E . L . ( 1 9 7 6 ) J . E x p . Z o o l . 1 9 8 ,6 5 - 7 8

B a k e r , P . F . & W h i t a k e r , M. J . ( 1 9 7 8 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 7 6 ,5 1 3 - 5 1 5

B e r r i d g e , M. J . ( 1 9 8 7 ) A n n u . R e v . B i o c h e m . 5 6 , 1 5 9 - 1 9 3

C h a m b e r s , E . L . ( 1 9 8 0 ) E u r . J . C e l l B i o l . 2 2 , 4 7 6

C i a p a , B . & W h i t a k e r , M . J . ( 1 9 8 6 ) FEBS L e t t . 1 9 5 , 3 4 7 - 3 5 1

C l a p p e r , D . L . & L e e , H . C . ( 1 9 8 5 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 0 ,1 3 9 4 7 - 1 3 9 5 4

H o u s l a y , M . D . ( 1 9 8 7 ) T re n d s B i o c h e m . S c i . 1 2 , 1 - 2

I r v i n e , R . F . , B r o w n , K . D . & B e r r i d g e , M. J . ( 1 9 8 4 ) B i o c h e m .

J . 2 2 1 , 2 6 9 - 2 7 2

I r v i n e , R . F . & M o o r , R . M. ( 1 9 8 6 ) B i o c h e m . J . 2 4 0 , 9 1 7 - 9 2 0

I r v i n e , R . F . & M o o r , R . M. ( 1 9 8 7 ) B i o c h e m . B i o p h y s . R e s .Commun. 1 4 6 , 2 8 4 - 2 9 1

I r v i n e , R . F . , M o o r , R . M . , P o l l o c k , W. K . , S m i t h , P . M. &

W r e g g e t t , K . A . ( 1 9 8 8 ) P h i l o s . T r a n s R . S o c . L o n d o n S e r . B3 2 0 , i n t h e p r e s s

M a r t e l l , A . E . & S m i t h , R . M. ( 1 9 7 4 ) C r i t i c a l S t a b i l i t yC o n s t a n t s , P l e n u m P u b l i s h i n g C o r p . , L o n d o n

M i c h e l l , R . H . ( 1 9 8 6 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 2 4 , 6 1 3P o e n i e , M . , A l d e r t o n , J . , T s i e n , R . Y . & S t e i n h a r d t , R . A .

( 1 9 8 5 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 1 5 , 1 4 7 - 1 4 9

P u t n e y , J . W. ( 1 9 7 7 ) J . P h y s i o l . ( L o n d o n ) 2 6 8 , 1 3 9 - 1 4 9

S c h m i d t , T . , P a t t o n , C . & E p e l , D . ( 1 9 8 2 ) D e v . B i o l . 9 0 ,2 8 4 - 2 9 0

S l a c k , B . E . , B e l l , J . E . & B e n o s , D . J . ( 1 9 8 6 ) Am. J . P h y s i o l .2 5 0 , C 3 4 0 - C 3 4 4

S t e i n h a r d t , R . A . & E p e l , D . ( 1 9 7 4 ) P r o c . N a t l A c a d . S c i .U . S . A . 7 1 , 1 9 1 5 - 1 9 1 9

S t e i n h a r d t , R . A . , Z u c k e r , R . & S c h a t t e n , G . ( 1 9 7 7 ) D e v . B i o l .

5 8 , 1 8 5 - 1 9 6S w a n n , K . A . & W h i t a k e r , M. J . ( 1 9 8 6 ) J . C e l l B i o l . 1 0 3 ,

2 3 3 3 - 2 3 4 2

T u r n e r , P . R . , S h e e t z , M. P . & J a f f e , L . A . ( 1 9 8 4 ) N a t u r e

( L o n d o n ) 3 1 0 , 4 1 4 - 4 1 5

T u r n e r , P . R . , J a f f e , L . A . & F e i n , A . ( 1 9 8 6 ) J . C e l l B i o l . 1 0 2 ,7 0 - 7 6

W h i t a k e r , M. J . & I r v i n e , R . F . ( 1 9 8 4 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 1 2 ,6 3 6 - 6 3 9

W h i t a k e r , M. J . & S t e i n h a r d t , R . A . ( 1 9 8 5 ) B i o l o g y o f

F e r t i l i s a t i o n ( ( M e t z , C . B . & M o n r o y , A . , e d s . ) , v o l . 3 , p p .1 6 8 - 2 2 2 , A c a d e m i c P r e s s , Ne w Y o r k

R e c e i v e d 1 6 N o v e m b e r 1 9 8 7 / 8 J a n u a r y 1 9 8 8 ; a c c e p t e d 2 6 F e b r u a r y 1 9 8 8

1 9 8 8

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