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Purificación de proteínas 2
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Fraccionamiento basado en el coeficiente de reparto
El coeficiente de reparto caracteriza la distribución de una sustancia entre dos fases: la fase móvil y la fase estacionaria
K = Cs/Cm
Fases: liquido-liquido, liquido-solido
Fase estacionaria:
•Partículas de sólidos
•Partículas de sólidos con líquido
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Equipamiento de una cromatografía
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Contínua
Batch
Gradiente
Elución
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Fases sólidas y estacionarias
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Tipos de cromatografías
Intercambio iónico
•Técnica independiente de la forma, tamaño y PM
•Soportes: Celulosa, agarosa, vinilbenceno
•Antes hacer un deslado (diálisis, filtración en gel)
•En general elución por gradiente (de PH o con agentes caotrópicos)
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Filtración molecular o Exclusión molecular
• Separa por distinto tamaño molecular (cutoff o limite de exclusion)
• Se puede usar para desalado
• Se puede usar para estimar PM
• Para purificación se usa generalmente hacia el final
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Cromatografía de fase reversa
•Se basa en “interacciones hidrofóbicas”
•La fase estacionaria son generalmente compuestos alifáticos de distinta longitud de cadena (C4, C8, C16 etc)
•Elución por gradiente (usando mezclas de agua y solventes orgánicos)
•Muy alta capacidad resolutiva (mezclando distintas propiedades fisicoquimicas)
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Cromatografía de Afinidad
•Reconocimiento de ligandos
•Alta resolución y especificidad ( disminuye mucho el numero de pasos en la purificación)
•Alto tiempo de preparación
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Fraccionamiento basado en propiedades dinámicas
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Sedimentación
La unidad Svedverg se refiere a 1 10-13 segundos
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Tipos de protocolos en sedimentación
Centrifugación en un gradiente de densidad
zonal centrifugation: glicerol, sacarosa
Equilibrium centrigugation (isopycnic centrifugation) Cl2Cs. DNA, lipoproteinas. Tambien Ficoll, Percoll para celulas
Centrifugación por velocidad
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Determinación de S
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Otras técnicas basadas en parámetros hidrodinámicos
Difusión
Viscocidad
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Técnicas de desalado
•Ultracentrifugación
•Diálisis
•Columnas de desalado