Amino ácidos
• Término generalmente aplicado a los amino-alcano-ácidos
• Su formula general es H3N+-(CR1R2)n-COO-
• Si n = 1 obtengo la serie alfa, si es igual a 2, la beta, etc.
• En general se puede aplicar a sustancias que tengan aminos y ácidos
(aproximadamente 700 en organismos)
Ac antranilico
Características generales de AA “proteicos”
• Todos los AA son alfa aminoácidos
• Las propiedades físico-químicas de un AA dependen en gran medida de
su grupo R
• Existen 20 aminoácidos codificados en el código genético
• Por tener un centro quiral, existen dos estereoisómeros D y L
• Tienen actividad óptica (levógiros o dextrógiros)
• Son anfolítos
• solidos cristalinos de alto punto de fusión
• pueden sufrir modificaciones covalentes post-traduccionales
Modificaciones postraduccionales de aa
Estabilizan la fibra de
colágeno (escorbuto)
Fosforilacion activada por insulina (regulacion de la
proliferacion celular)
Fosforilacion activada por
adrenalina (altera la actividad de
enzimas)
Ala ArgAsnAspCysGln Glu Gly His Ile LeuLysMetPhePro Ser Thr Trp Tyr Val
Vo
lum
en
40
60
80
100
120
140
160
180
Algunas propiedades fisicoquímicas del R
Ala ArgAsnAspCysGlnGlu Gly His Ile LeuLysMetPhePro Ser Thr Trp Tyr Val
Hid
rofo
bic
ida
d
-3
-2
-1
0
1
2
Propiedades ácido-base
Porque estudiarlas?
• del estado ácido-base de una molécula se deduce su carga neta
• de la carga de una molécula dependerá su energía y así su
conformación
• la actividad biológica depende de la conformación y (en algunos casos)
de la presencia de cargas en el sitio activo
• permite la cuantificación (titulación), identificación y purificación
+ pKa: efecto del entorno
25
Interacciones carga-carga 1
McIntosh, L. P. et al. Biochemistry 1997, 36, 14985-91.
Glu
pKa = 4.4
-
pKa = 6.7
Interacciones carga-dipolo 2
+ pKa: efecto del entorno
26
Solvatacion 3
Dwyer, J. J. et al. Biophys J. 2000, 79, 1610-20.
Glu
pKa = 4.4 pKa = 8.8
+ pKa: efecto del entorno
27 Modified from Grimsley, G. R. et al. Prot. Sci. 2009, 18, 247-51.
Num
ber
of M
easure
ments
pKas alterados se suelen
encontrar en sitios
activos para aumentrar
la reactividad
Cambios sutiles del
entorno del aa alteran el
pKa para obtener:
sensibilidad a cambios
de pH pKa
Punto isoiónico e isoeléctrico
El punto isoiónico (PI) es el pH en el cual el número de
cargas positivas es igual al número de cargas negativas
El punto isoeléctrico (PE) es el pH en el cual una molécula
puesta en un campo eléctrico no presenta movilidad (ya que
tiene carga neta igual a cero)
Para moléculas pequeñas (aminoácidos y péptidos) el PI=PE
Sistemas Buffer
• Son sistemas formados por una ácido y una base conjugadas que
mantienen constante el ph dentro de ciertos límites
• La capacidad buffer es la variación del ph con respecto al agregado
de H+ u OH-
• La capacidad buffer es máxima cuando la actividad del ácido sea
igual al de la base conjugada (pka)
• Para obtener un buffer efectivo en un determinado pH debemos
elegir un par acido/base conjugada con un pka cercano al pH deseado
(1) Equilibrio fuertemente desplazado a la hidrolisis
(2) La mayoría del N de las proteínas está unido como amina/imina
(3) Las proteínas son hidrolizadas en ácidos fuertes (enlace amida) y por
“fermentos”
Enlace peptídico
KOH + (CuSO4) + tartrato de sodio y potasio (KNaC4H4O6·4H2O).
Biuret
Condensacion de
dos ureas
En presencia de peptidos:
Azul -> violeta (540 nm)
• Determinar el mecanismo de reacción (mecanismo catalítico
asociado a su función biológica)
• Establecer la relación secuencia-estructura (leyes que rigen el
plegamiento)
• detección de patologías moleculares (por mutaciones)
• historia evolutiva
A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V
A
R
N
D
C
Q
E
G
H
I
L
K
M
F
P
S
T
W
Y
V
Matriz de sustitución
• Reacciones del enlace peptídico
• Reacciones del grupo amino terminal
• Reacciones del grupo carboxilo terminal
I Análisis químico
Composición? Detección? Secuencia?
Determinación de la composición de una proteína
1 Hidrólisis
• Ácida
• Muy usada. HCl 6M 24hs a ebullición.
Inconvenientes: destruye Trp, Tyr, Cisteina
Asn y Gln Asp y Glu (se determinan por el NH2 liberado)
•Alcalina
•Inconvenientes: destruye Ser y Thr.
•Enzimática
Es conservativa
Inconvenientes: no es posible una hidrólisis completa, costos
1 Espectroscopía UV
Ley de Lambert - Beer: A = E b c
(E es una función de lambda y del número de
aa que absorben en esa lambda)
Aminoácidos aromáticos: Phe (260nm), Tyr
(275)
y Trp(280) = en general 280 nm
OJO: AN 260nm
Todos los AA = 210 nm (enlace peptídico) Phenylalanine
Cuantificacion Química
3. Absorbancia Visible
• Reacción de Biuret ( SO4Cu/tartrato alcalino 540nm).
Formación de complejo. Reducción del Cu++. Baja sensibilidad (1mg) pero alta
especificidad
• Reacción de Lowry et al. (Reactivo de Folin-Ciocalteau = mezcla de
óxidos de tungsteno y molibdeno 720-750 nm)
Alta sensibilidad(2-100ug). Problemas con interferencias. Color varía con la composición
de la proteína.
• Ninhidrina(570 nm)
Muy sensible pero poco específico. Destruye muestra (deaminación oxidativa del NH2)
• Coomassie Brillant Blue (Bradford)
No hay reacción química. Grupos polares. Se usa para geles o para soluciones. 10-7gr
• Reactivos Fluorescentes
Fluorescamina, o-ftalaldehído. Picomolar. No son específicos.
•Plata
Muy sensible (1 10-9 gr). Para geles.
• Reacción de Lowry et al. (Reactivo de Folin-Ciocalteau = mezcla de
óxidos de tungsteno y molibdeno 720-750 nm)
Coomassie Brillant Blue (Bradford)
No hay reacción química. Grupos polares. Se usa para geles o para soluciones. 10-7gr
Abs. A 595 nm
Método Sensibilidad Tiempo Principio Interferencias Comentarios
Biuret Baja (1-20mg) 20-30min Enlaces
peptídicos
Algunos buffers, Tris Rápido pero no
sensible. Color similar
a distintas proteínas
Lowry Alta (5 ug) 1hs Biuret +
Reactivo de
Folin
Sulfato de amonio,
buffers, mercaptanos
Lento. El color varia
con las proteínas. Se
debe ajustar muy bien
el tiempo
Bradford Alta (1ug) 15 min Interacción
no-polar
Buffers básicos,
Triton X-100, SDS
Excelente. Color
estable en el tiempo.
Color varía con las
proteínas
Espectrofo
tométrico Moderada (50-
100ug)
5-10min Absorción a
280 (Tyr y
Trp)
Purinas, pirimidinas,
AN, AR
Adecuado para
monitorear. AN se
puede corregir
Comparación de métodos
Reacciones del grupo amino (terminal)
• Ninhidrina (570 nm) Pro a 440nm
• Fluorescamina (producto fluorescente). Alta sensibilidad
• 1-Fluoro-2,4 dinitrobenceno (FDNB, reactivo de Sanger) (específico
alfa-amino)
• Cloruro de dansilo (específico alfa-amino)
• Reactivo de Edman (Fenilisotiocianato) (específico alfa-amino)
• o-ftalaldehído (en sn con mercaptoetanol, producto fluorescente).
Alta sensibilidad
• Cianato (específico alfa-amino)
Caracterización de Cys y Cistinas
• Oxidación de las Cistinas a Ac. Cisteico
Ac perfórmico HC=O
OOH
• Reducción y posterior identificación
Ditiotreitol (1,4 ditio 2,3 butanodiol) + Acetilacion con Iodoacetato
+ Cianometilacion con Acrilonitrilo (CH=CH-CN)
Secuenciación
1. Purificación de la proteína o péptido
2. Ruptura de los puentes disulfuro
3. Determinación de los extremos amino-terminales y carboxilo-
terminales
4. Corte específico de la secuencia principal en fragmentos
menores, al menos en dos formas distintas
5. Purificación de cada segmento y secuenciación
6. Determinación de la secuencia total
1. Purificación de la proteína o péptido
2. Determinación de la composición y PM
3. Determinación del número de cadenas (ruptura de los puentes
disulfuro)
4. Determinación de los extremos amino-terminales y carboxilo-
terminales
5. Corte específico de la secuencia principal en fragmentos
menores, al menos en dos formas distintas
6. Purificación de cada segmento y secuenciación
7. Determinación de la secuencia total
Resumen
1,2,4 fluorodinitrobenceno
• La reacción se lleva a cabo a temperatura ambiente
• Los DNP derivados tienen color (amarillo)
• Los DNP derivados se pueden separar e identificar por cromatografía
Edman, P., 1950 Method for determination of the amino acid sequence
in peptides. Acta Chem. Scand. 4: 283–293.
Phenylthiocarbamyl (PTC) Phenylthiohedantoin (PTH)