Londrina 2017
CARLOS EDUARDO SILVA DA COSTA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM ODONTOLOGIA
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO STRYPHNODENDRON ADSTRINGENS SOBRE STREPTOCOCCUS MUTANS
Londrina 2017
AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU
ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE
QUE CITADA A FONTE.
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO STRYPHNODENDRON ADSTRINGENS SOBRE STREPTOCOCCUS MUTANS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Norte do Paraná - UNOPAR, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Odontologia. Área de Concentração: Dentística Preventiva e Restauradora. Orientadora: Profª. Drª Regina Célia Poli-Frederico
CARLOS EDUARDO SILVA DA COSTA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Norte do Paraná - UNOPAR, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Odontologia. Área de Concentração: Dentística Preventiva e Restauradora.
BANCA EXAMINADORA
____________________________________ Profª. Drª Regina Célia Poli-Frederico
Universidade Norte do Paraná
_____________________________________ Prof. Dr. Ricardo Sergio Couto de Almeida
Universidade Estadual de Londrina
_____________________________________ Profa. Dra. Sandra Kiss Moura
Universidade Nove de Julho
Londrina, 31 de maio de 2017.
CARLOS EDUARDO SILVA DA COSTA
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO STRYPHNODENDRON ADSTRINGENS SOBRE STREPTOCOCCUS MUTANS
AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Dados Internacionais de catalogação na publicação (CIP) Universidade Pitágoras Unopar - UNOPAR
Biblioteca CCBS/CCECA PIZA Setor de Tratamento da Informação
Costa, Carlos Eduardo Silva da C837a Atividade antimicrobiana do stryphnodendron adstringens sobre
streptococcus mutans. / Carlos Eduardo Silva da Costa. Londrina: [s.n], 2017.
44 f. Dissertação (Mestrado em Odontologia). Universidade Pitágoras
Unopar
Orientadora: Profa. Dra. Regina Célia Poli-Frederico.
1- Cárie Dentária - Dissertação - UNOPAR 2- Microbiota 3-
Barbatimão 4- Glicólico de barbatimão 5- Streptococcus mutans I- Poli-Frederico, Regina Célia; orient. II- Universidade Pitágoras Unopar.
CDD 617.67
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a minha família,
meu maior bem.
AGRADECIMENTOS
Minha gratidão a Deus, por ter me guiado até o fim desta jornada.
Sou grato a nossa senhora de Nazaré por toda sua bondade e por ter me
iluminado mais uma vez para alcançar mais um objetivo.
Agradeço aos meu pais pela força, oração e apoio que foram fundamentais
para superar os obstáculos desta jornada.
Gratidão eterna a minha esposa, Anne Santos, por todo apoio, por todo amor
e por ter sido verdadeira companheira, seu apoio foi essencial, te amo.
Agradeço as minhas filhas, Maria luiza e Maria Eduarda, pela paciência e por
ter suportado minha ausência durante este período, a busca de aperfeiçoamento
acadêmico foi por vocês.
A minha irmã Carla Costa meus agradecimentos pela torcida e por sempre
estar ao meu lado.
As minhas tias Madalena e Neni, obrigado pela oração e pedido de proteção
a Deus e Nossa Senhora
Meu muito obrigado a professora Drª. Sandra Kiss Moura, no período que me
orientou demostrou ser a verdadeira educadora, obrigado pelos ensinamentos e
paciência, tenho orgulho de ter sido seu aluno e orientando.
A professora Drª. Regina Poli Frederico, sou grato pela orientação e pelos
ensinamentos passados, pessoa serena e paciente.
Ao professor Dr. Ricardo Almeida, meu muito obrigado pelos ensinamentos e
por ter cedido seu laboratório para que eu pudesse realizar minha pesquisa, grande
pessoa e professor.
Ao professor e amigo Dr. Cláudio Gellis por todo apoio e por todo
conhecimento repassado neste periodo agradeço de coração, sua ajuda foi
essencial para conclusão desse mestrado. Muito obrigado.
Obrigado meu amigo Fábio Bassani pelo companheirismo e parceria durante
esse período, demonstrou mais uma vez ser um amigo de verdade.
Aos meus amigos da turma de mestrado, meu muito obrigado, foi muito bom
ter a oportunidade de troca de conhecimento. Obrigado pelas amizades construídas,
Amauri, Flaviana, Fábio, Fernando, Juliana, Mayara, Jean, Joyce, Thiago Yudd,
Thiago Lemos e Zanelli.
Ao coordenador do Programa de Mestrado, Prof. Dr. Alcides Gonini Júnior,
que nos ajudou e nos auxiliou sempre para uma melhor formação.
Obrigado a todos os professores que fizeram parte do mestrado, seus
conhecimentos foram essenciais para a conclusão com êxito.
Por fim agradeço a todos que contribuíram e torceram para conclusão desta
etapa da vida profissional e acadêmica.
COSTA, Carlos Eduardo Silva da. Atividade antimicrobiana do stryphnodendron
adstringens sobre Streptococcus mutans. 44p. [Dissertação de Mestrado].
Programa de Pós-Graduação em Odontologia – Universidade Norte do Paraná,
Londrina, 2017.
RESUMO
O estudo de plantas medicinais com ação antimicrobiana é um assunto atual,
principalmente devido ao aumento da resistência bacteriana e a necessidade de novos antimicrobianos com igual ou maior eficácia, baixo custo e baixos efeitos colaterais. O objetivo desta pesquisa foi avaliar a eficiência de diferentes concentrações de solução de extrato glicólico de Barbatimão (Stryphnodendron adstringens) na inibição do crescimento de bactérias associadas a cárie dental in vitro. Foram preparadas dezesseis concentrações do extrato glicólico do Barbatimão (0%, 1,56%, 3,12%, 4,68%, 6,25%, 7,81%, 9,37%, 10,93, 12,5%, 25%, 37,5%, 50%, 62,5%, 75%, 87,5%, 100%) e como grupo controle foi utilizada a solução de clorexidina 2%. As soluções preparadas foram testadas sobre a cepa bacteriana de Streptococcus mutans. O crescimento bacteriano foi observado em placas contendo meio de cultura BHI. As concentracões do barbatimão foram colocadas em poços realizados no meio de cultura e cada placa foi incubada em estufa de CO2 (37°C / 24 horas). O teste foi realizado em triplicata, tendo como resultado a ausência de inibição bacteriana para as concentrações do barbatimão testadas, sendo positiva a inibição bacteriana para clorexidina a 2%. Conclui-se que o extrato glicólico de barbatimão, não apresenta ação bactericida sobre o Streptococcus mutans. Palavras-chave: Cárie Dentária, Microbiota, Barbatimão
COSTA, Carlos Eduardo Silva da. Atividade antimicrobiana do stryphnodendron
adstringens sobre Streptococcus mutans. 44p. [Dissertação de Mestrado].
Programa de Pós-Graduação em Odontologia – Universidade Norte do Paraná,
Londrina, 2017.
ABSTRACT
The study of medicinal plants with antimicrobial activity is a current issue, mainly due to the increase of bacterial resistance and the need for new antimicrobials with equal or greater efficacy, low cost and low side effects. The objective of this research was to evaluate the efficiency of different concentrations of Barbatimão glycolic extract solution (Stryphnodendron adstringens) in inhibiting the growth of bacteria associated with dental caries in vitro. Sixteen different concentrations of Barbatimão glycolic extract (0%, 1.56%, 3.12%, 4.68%, 6.25%, 7.81%, 9.37%, 10.93, 12, 5%, 25%, 37.5%, 50%, 62.5%, 75%, 87.5%, 100%) and the 2% chlorhexidine solution was used as the control group. The solutions prepared were tested on the bacterial strain of Streptococcus mutans. Bacterial growth was observed on plates containing BHI culture medium. The barbatimon concentrates were placed in wells made in the culture medium and each plate was incubated in a CO2 oven (37 ° C / 24 hours). The test was performed in triplicate, resulting in the absence of bacterial inhibition at the barbatimon concentrations tested, with bacterial inhibition of 2% chlorhexidine being positive. It is concluded that the barbatimão glycolic extract does not present bactericidal action on Streptococcus mutans.
Keywords: Dental Caries, Microbiota, Barbatimão
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Diagrama de Newbrum, (Adaptado de Branco, 2015)(10) .......................... 16
Figura 2 Casca e folha da planta barbatimão (Stryphnodendron adstringens)(47) ... 26
Figura 3 Tubos de Falcon contendo caldo BHI e cepas de Streptococcus mutans ... 27
Figura 4 Estufa de CO2 para cultivo do Streptococcus mutans ................................ 27
Figura 5 Escala de McFarland 0,5 em tubo de vidro transparente ............................ 28
Figura 6 Representação esquemática da distribuição dos tripletes de placas com
meio de cultura e os controles (meio de cultura e clorexidina) e as concentrações de
extrato glicólico de barbatimão nas placas de petri. .................................................. 29
Figura 7 Demonstração do meio de cultura (BHI) contendo cepa do Streptpcoccus
mutans e o poço para difusão do extrato glicólico barbatimão. ................................. 29
LISTA DE TABELAS Tabela 1 Demonstração dos resultados do teste com extrato glicólico de barbatimão sobre o Streptococcus mutans. ................................................................................. 30
LISTA DE ABREVIATURAS
S Streptococcus
L Lactobacillus
BHI Brain Heart Infusion
PBS Tampão fosfato-salino
ml Milílitro
C Candida
CIM Concentração Inibitória Mínima
mm Milimetros
LISTA DE SÍMBOLOS
% Por cento
°C Graus Celsius
μL Microlitro
µg Micrograma
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 14
2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................. 16
2.1 CÁRIE DENTÁRIA ........................................................................................... 16
2.2 CLOREXIDINA COMO BACTERICIDA ............................................................ 18
2.3 BARBATIMÃO COMO BACTERICIDA ............................................................. 19
3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 22
3.1 OBJETIVO GERAL .......................................................................................... 22
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................ 22
4 ARTIGO ................................................................................................................. 23
4.1 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 24
4.2 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................ 26
4.2.1 Obtenção do Extrato de Barbatimão ..................................................... 26
4.2.2 Cultivo dos Micro-organismos ............................................................... 26
4.2.3 Teste Antimicrobiano: em difusão Ágar ............................................... 27
4.2.4. Análise Estatística .................................................................................. 29
4.3 RESULTADOS ................................................................................................. 30
4.4 DISCUSSÃO .................................................................................................... 31
4.5 CONCLUSÃO .................................................................................................. 33
REFERENCIAS ..................................................................................................... 33
5 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 35
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 36
ANEXO A .................................................................................................................. 40
LAUDO BARBATIMÃO .......................................................................................... 40
ANEXO B .................................................................................................................. 41
LAUDO PROPILENOGLICOL ................................................................................ 41
ANEXO C .................................................................................................................. 42
APÊNDICE A ............................................................................................................ 44
FOTOS ENSAIO “IN VITRO” .................................................................................. 44
14
1 INTRODUÇÃO
A cárie dentária, dentre as patologias que acometem a cavidade oral, é a que
apresenta a maior prevalência mundial, sendo considerada uma doença de caráter
multifatorial, uma vez que sua origem depende da interação de fatores essenciais,
como: hospedeiro (dente), micro-organismo, dieta e tempo (1).
Em relação aos micro-organismos presentes na cavidade oral, existem
espécies que participam de forma importante do processo de formação e progressão
da cárie dentária, sendo o Streptococcus mutans considerado o micro-organismo
que apresenta o maior potencial cariogênico (2).
O controle de placa bacteriana apresenta papel importante na prevenção da
cárie dentária, não apenas na diminuição de bactérias orais, mas também, no
processo de limpeza das cavidades após preparos cavitários, com o objetivo de
evitar nova incidência desta doença. O uso de agentes antimicrobianos nesse
controle é amplamente utilizado e apresenta resultados satisfatórios, sendo a
clorexidina o mais utilizado e que apresenta maior eficácia, principalmente por ser
um potente antimicrobiano e por desempenhar um papel importante na inibição de
metaloproteinases presentes na matriz dentinária (3).
A busca constante de novos produtos com potencial bactericida sobre os
micro-organismos orais, principalmente de origem natural, fez com que surgissem
vários estudos com esse objetivo. Isto se deve pela ineficiência de alguns produtos
sintéticos, pelos seus efeitos colaterais e, também, pela busca de produtos com
menor custo de produção e menores efeitos adversos (4).
Os medicamentos fitoterápicos são preparações farmacêuticas (extratos,
tinturas, pomadas e cápsulas) de ervas medicinais obtidos a partir de uma ou mais
plantas. Apresentam diversas vantagens para uso terapêutico como baixo custo e
efeitos adversos diminuídos, em relação aos medicamentos sintéticos. Dentre esses
produtos fitoterápicos o barabatimão (Stryphonodendron adstringens), planta
medicinal, presente principalmente no cerrado brasileiro, apresenta eficácia
antibacteriana, anti-inflamatória, antisséptica e hemostática (5).
O barbatimão parece apresentar atividade antimicrobiana sobre o
Streptococcus mutans e outras bactérias envolvidas no processo da cárie. Sendo
assim, essa pesquisa buscou avaliar a eficácia de diferentes concentrações de
solução de extrato glicólico de Barbatimão (Stryphnodendron adstringens) na
15
inibição do crescimento do Streptococcus mutans in vitro.
16
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 CÁRIE DENTÁRIA
A cárie é resultado de um processo crônico, que aparece após a presença e a
interação dos seguintes fatores: dente suscetível, microorganismo, dieta e tempo (6).
Melo et al (7) descrevem a cárie dentária como uma doença pós eruptiva,
influenciada pela dieta e caracterizada por uma destruição progressiva dos tecidos
mineralizados dos dentes.
A cárie dentária é uma doença de origem multimicrobiana e de caráter
multifatorial, uma vez que é necessária a interação de vários fatores em condições
críticas, durante determinado período de tempo, para que se expresse clinicamente
(8). É uma doença infecciosa que progride de forma muito lenta na maioria dos
indivíduos. Dificilmente é autolimitante e, caso não ocorra tratamento, pode levar a
destruição total do elemento dental. (1).
A cárie dentária é aceita e estabelecida universalmente como uma doença
multifatorial e dieta dependente, que produz uma perda mineral das estruturas
dentárias. O diagrama de Newbrum (Figura 1), ilustra a interação de fatores, tais
como dente suscetível (hospedeiro), micro-organismo, dieta cariogênica (substrato)
por um determinado tempo, causando a doença cárie (9).
Figura 1 Diagrama de Newbrum, (Adaptado de Branco, 2015)(10)
17
A cárie dentária é resultado de um processo crônico, que aparece após algum
tempo da presença e da interação desses três fatores, sendo assim, julgou-se
conveniente incluir o tempo como outro fator etiológico. Desta maneira, se faz
necessária a compreensão dos fatores etiológicos da cárie dentária, para que se
possam criar medidas efetivas para o controle da doença (6).
Os micro-organismos envolvidos no processo de cárie dentária fazem com
que o biofilme dental, seja formado por uma microbiota anaeróbica, gram positiva e
sacarolítica, sendo a microbiota representada basicamente por Streptococcus,
constituindo cerca de 20% da microbiota oral (11).
O bioflime dentário em cada etapa de desenvolvimento apresenta novas
espécies, dentre estas o Streptococcus mitis, Streptococcus salivarius,
Streptococcus gordonii, Streptococcus oralis, Streptococcus mutans, Streptococcus
sobrinus e Lactobacillus casei, e devido sua patogenicidade, geram danos ao
esmalte (12).
Streptococcus mutans é considerado o principal agente bacteriano causador
da cárie dentária, sendo uma espécie bacteriana comum da microbiota bucal de
humanos envolvida na patologia da cárie e em endocardites infecciosas promovidas
por bacteremias de origem bucal. O maior nicho ecológico de Streptococcus. mutans
em humanos é a superfície dental (13, 14). Outros Streptoccocus tem participação
na adesão à película dentária adquirida, dentre eles podemos citar o Streptococcus
mitis, Streptococcus salivarius, Streptococcus gordonii e Streptococcus oralis (15).
A transmissão de S. mutans ocorre nos primeiros anos de vida, por contato
com indivíduos colonizados, processo que é influenciado por fatores microbianos, do
hospedeiro e ambientais, que modificam a competitividade bacteriana e as defesas
do hospedeiro. Além disso, para serem transmitidos e ocuparem seus nichos, esta
cepa precisa persistir na saliva e se adaptar fisiologicamente a cada fase da
colonização e patogênese bucal. Este processo pode ser controlado por uso de
antimicrobianos (16, 17).
A virulência de S. mutans em doenças bucais e sistêmicas é dependente da
capacidade deste micro-organismo de detectar e se adaptar a condições de estresse
ambiental encontrados durante o processo de colonização e infecção do hospedeiro
(18).
18
2.2 CLOREXIDINA COMO BACTERICIDA
O gluconato de clorexidina é um antisséptico catiônico de largo espectro
antimicrobiano com ação sobre fungos e bactérias (gram positivas e gram
negativas). Atualmente é o agente mais eficaz para reduzir e controlar a placa, a
gengivite e a cárie dentária, agindo de forma eficaz contra os Streptococcus mutans
(19).
Na odontologia a aplicação da clorexidina vem sendo relatada nas diversas
especialidades, como uma alternativa na prevenção e no tratamento de doenças
bucais, é utilizada para desinfetar canais radiculares, inibir a formação da placa,
cáries e gengivite. O Gluconato de clorexidina é estável e não é tóxico aos tecidos.
Pode ser administrado nas seguintes formas: bochechos, irrigações, dentifrícios,
géis e sprays A faixa de concentração da solução de clorexidina empregada é
bastante ampla, em concentrações que ficam entre 0,12 e 2,0% (20, 22).
Hortense et al (21) descrevem a interação entre a molécula catiônica
(positiva) da clorexidina com a bactéria, provavelmente em decorrência da adsorção
à parede celular aniônica (negativa) desta, alterando as estruturas da superfície e
aumentando a permeabilidade da membrana bacteriana, facilitando a entrada do
antibiótico no citoplasma. O equilíbrio osmótico é perdido e, em consequência,
ocorre uma precipitação dos constituintes citoplasmáticos, o que impede a reparação
da membrana celular, causando a morte da bactéria.
A clorexidina, em baixa concentração, é considerada bacteriostática e atua na
membrana celular causando seu rompimento e consequente perda de material
intracelular como potássio. Quando em alta concentração é bactericida, e inibe a
respiração celular, causando perda de ácido nucléico e coagulação citoplasmática. A
atividade biocida de clorexidina é influenciada por fatores ambientais incluindo o pH,
a temperatura, e a presença de material interferente. A clorexidina, também, tem
sido utilizada na odontologia para limpeza de cavidades antes de passar pelo
procedimento restaurador, com o objetivo de eliminar quaisquer micro-organismos
contaminantes que possam gerar a recorrência do processo carioso (23).
Na dentística estudos comprovaram a permanência de bactérias, em especial
Streptococcus mutans, no interior dos túbulos dentinários após procedimento
restaurador, podendo ocasionar na difusão de toxinas para a polpa resultando em
irritação e inflamação do tecido pulpar. Desta forma existe a necessidade de se
19
aplicar um agente de limpeza cavitária, para prevenir a reicidência de cárie e facilitar
a retenção de materiais às estruturas dentárias, prevenindo a ocorrência de
microinfiltrações nas restaurações e a possibilidade de apresentar sensibilidade pós-
operatória. A clorexidina é uma solução de limpeza considerada ideal por remover a
“lama dentinária”, não ser tóxica à polpa e aos tecidos adjacentes ao dente,
combater e eliminar micro-organismos patogênicos existentes nas paredes
cavitárias, sendo indicada como desinfetante (24, 25).
Mesmo apresentando inúmeros efeitos benéficos, tem se observado efeitos
adversos a cerca da sua utilização, tais como: alteração na coloração nos elementos
dentários, restaurações, próteses e língua; formação de cálculo supragengival;
perda do paladar; queimaduras no tecido mole; dor; xerostomia; e gosto residual
desagradável na boca. Em algumas formas comerciais, pode conter em sua
composição a presença de álcool etílico, o que pode agravar a sensibilidade e o
quadro de dor em pacientes debilitados como, por exemplo, pacientes portadores de
mucosite,causando maior severidade na cavidade oral (26).
Os efeitos colaterais da clorexidina incluem ainda reações tardias como
dermatite de contato; fotossensibilidade; toxicidade; e, em casos muito raros,
reações de hipersensibilidade, como choque anafilático (27).
2.3 BARBATIMÃO COMO BACTERICIDA
A fitoterapia, do grego phyton (planta) e terapia (tratamento), é o ramo da
ciência, que utiliza plantas, drogas vegetais e emulsões para tratamento de doenças
(28). No Brasil o reconhecimento do uso das plantas medicinais com finalidades
fitoterápicas ocorreu em 1995 (29) e houve a inclusão dos fitoterápicos na rede de
medicamentos do SUS em 2006 (30). Na odontologia a regulamentação do uso de
plantas medicinais ocorreu em 2008, pela resolução do conselho federal de
odontologia CFO- 82/2008 (31).
Pesquisas realizadas com plantas medicinais confirmam sua importância no
desenvolvimento de produtos terapêuticos, sendo estas pesquisas constantes no
Brasil, o que se explica por ser um dos paises do mundo com maior biodiversidade
(32).
As plantas medicinais produzem um amplo aspectro de ações farmacológicas
de grande valia para medicina e odontologia, tendo como destaque as atividades
20
antiinflamatória e antimicrobiana (33). O estudo de plantas medicinais com ação
antimicrobiana é um assunto atual, principalmente devido ao aumento da resistência
bacteriana e a necessidade de novos antimicrobianos com igual ou maior eficácia,
baixo custo e baixos efeitos colaterais (34).
O barbatimão (Stryphnodendron adstringens) é uma planta medicinal
encontrada no cerrado brasileiro. Sua árvore pode atingir, quando adulta, de quatro
a seis metros de altura, com diâmetro do tronco variando entre 20 a 30 cm.
Apresenta propriedades físico-químicas que lhe garante importantes atividades
farmacológicas tais como: anti-inflamatória, analgésica e protetora da mucosa
gástrica. As cascas são empiricamente usadas de maneira externa e interna por
humanos, supostamente por serem mais adstringentes (35, 37).
As árvores de barbatimão produzem metabólitos químicos primários,
responsáveis pela manutenção das funções orgânicas do vegetal e metabólitos
secundários, que conferem proteção à planta contra herbívoros, micro-organismos e
efeitos externos do ambiente. Dentre os metabólicos químicos secundários
encontrados no barbatimão, citam-se os alcaloides, terpenos, estilibenos, esteroides,
saponinas, inibidores de proteases e taninos. Taninos são os componentes
majoritários do barbatimão. Estes compostos têm sido associados a efeitos
antimicrobianos (38). São compostos fenólicos solúveis em água e precipitadores de
proteínas (39, 40). Segundo Queiroz et al (38) existem três propriedades gerais dos
taninos que são responsáveis pela maior parte das atividades farmacológicas destas
substâncias: a formação de complexos com íons metálicos (ferro, alumínio, cálcio,
cobre, etc); a atividade antioxidante e seqüestradora de radicais livres; e a
habilidade de formar complexos com outras moléculas tais como proteínas e
polissacarídeos.
O barbatimão apresenta propriedades medicinais sendo popularmente
empregado no tratamento de leucorréia, diarréia, hemorragia, hemorróida, feridas,
conjuntivite, inflamação da garganta, corrimento vaginal e úlcera gástrica (41).
Parece possuir ação cicatrizante, antiinflamatória, hemostática, anti-edematogênica,
anti-séptica e anti-diarréica, sendo que, possui como constituintes químicos
alcalóides, flavonóides, terpenos, estilbenos, esteróides, inibidores de proteases
(como a tripsina) e taninos (42).
Orlando (43) observou atividade antimicrobiana in vitro do extrato
hidroalcoólico bruto da casca do barbatimão para Enterococcus faecalis, Kocuria
21
rhizophila, Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa,
Shigella flexneri, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Candida albicans e
Candida krusei.
Soares et al (44) utilizou o extrato hidroalcoólico de barbatimão, como
bactericida e obteve resultado positivo contra Streptococcus mitis e Lactobacillus
casei, concluindo que o extrato hidroalcoólico bruto do barbatimão pode ter potencial
antibacteriano para uso na prevenção da cárie dentária. Contudo, são necessários
estudos que observem estes efeitos variando a concentração de soluções de
barbatimão, e o seu uso com extração glicólica, o que justica a realização desta
pesquisa.
22
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliacão do extrato de barbatimão no Streptococcus mutans.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Testar a eficácia de diferentes concentrações de soluções de extrato glicólico
de Barbatimão (Stryphnodendron adstringens) na inibição do crescimento de
Streptococcus mutans associado a cárie dental in vitro.
Verificar a ação bactericida da extracão glicólica.
23
4 ARTIGO
Atividade Antimicrobiana do Stryphnodendron Adstringens Sobre o Streptococcus mutans
Será submetido ao periódico Brazilian Oral Research (ISSN 1807-3107)
Carlos Eduardo Silva da Costa¹, Claúdio Alberto Gellis de Mattos Dias², Ricardo
Sergio Couto de Almeida³, Sandra Kiss Moura4, Regina Célia Poli-Frederico.5
1. Mestre em Dentística pela Universidade Norte do Paraná, Londrina, PR, Brasil. E-mail:
2. Professor Doutor do Instituto Federal do Amapá. Macapá, AP/Brasil. E-mail:
3. Professor Adjunto do Departamento de Microbiologia da Universidade Estadual de Londrina.
Londrina, PR/Brasil. E-mail: [email protected]
4. Professora Adjunta da Universidade Nove de Julho. São Paulo, SP/Brasil. E-mail:
5. Professora Adjunta do Departamento de Odontologia da Universidade Norte do Paraná, Londrina,
PR/Brasil. E-mail: [email protected]
Endereço para correspondência Profa. Dra. Regina Célia Poli-Frederico Universidade Norte do Paraná, Faculdade de Odontologia Rua Marselha, 183 - Jardim Piza Londrina – PR/Brasil CEP: 86041-120 Telefone: (43) 3371-7820 Fax: (43) 3371-7741 E-mail: [email protected]
24
RESUMO
O estudo de plantas medicinais com ação antimicrobiana é um assunto atual, principalmente devido ao aumento da resistência bacteriana e a necessidade de novos antimicrobianos com igual ou maior eficácia, baixo custo e baixos efeitos colaterais. O objetivo desta pesquisa foi avaliar a eficiência de diferentes concentrações de solução de extrato glicólico de Barbatimão (Stryphnodendron adstringens) na inibição do crescimento de bactérias associadas a cárie dental in vitro. Foram preparadas dezesseis concentrações do extrato glicólico do Barbatimão (0%, 1,56%, 3,12%, 4,68%, 6,25%, 7,81%, 9,37%, 10,93, 12,5%, 25%, 37,5%, 50%, 62,5%, 75%, 87,5%, 100%) e como grupo controle foi utilizada a solução de clorexidina 2%. As soluções preparadas foram testadas sobre a cepa bacteriana de Streptococcus mutans. O crescimento bacteriano foi observado em placas contendo meio de cultura BHI. As concentracões do barbatimão foram colocadas em poços realizados no meio de cultura e cada placa foi incubada em estufa de CO2 (37°C / 24 horas). O teste foi realizado em triplicata, tendo como resultado a ausência de inibição bacteriana para as concentrações do barbatimão testadas, sendo positiva a inibição bacteriana para clorexidina a 2%. Conclui-se que o extrato glicólico de barbatimão, não apresenta ação bactericida sobre o Streptococcus mutans. Palavras-chave: Cárie Dentária, Microbiota, Barbatimão
ABSTRACT The study of medicinal plants with antimicrobial action is a current issue, mainly due to the increase of bacterial resistance and the need for new antimicrobials with equal or greater efficacy, low cost and low side effects. The objective of this research was to evaluate the efficiency of concentrations of Barbatimão glycolic extract solution (Stryphnodendron adstringens) in inhibiting the growth of bacteria associated with dental caries in vitro. Sixteen different concentrations of Barbatimão glycolic extract (0%, 1.56%, 3.12%, 4.68%, 6.25%, 7.81%, 9.37%, 10.93, 12, 5%, 25%, 37.5%, 50%, 62.5%, 75%, 87.5%, 100%) and the 2% chlorhexidine solution was used as the control group. The solutions prepared were tested on the bacterial strain of Streptococcus mutans. Bacterial growth was observed on plates containing BHI culture medium. The barbatimon concentrates were placed in wells made in the culture medium and each plate was incubated in a CO2 oven (37 ° C / 24 hours). The test was performed in triplicate, resulting in the absence of bacterial inhibition at the barbatimon concentrations tested, with bacterial inhibition of 2% chlorhexidine being positive. It is concluded that the barbatimão glycolic extract does not present bactericidal action on Streptococcus mutans. Keywords: Dental Caries, Microbiota, Barbatimão
4.1 INTRODUÇÃO
A cárie dentária, dentre as patologias que acometem a cavidade oral, é a que
apresenta a maior prevalência mundial, sendo considerada uma doença de caráter
25
multifatorial, uma vez que sua origem depende da interação de fatores essenciais,
como: hospedeiro (dente), micro-organismo, dieta e tempo (1).
Em relação aos micro-organismos presentes na cavidade oral, existem
espécies que participam de forma importante do processo de formação e progressão
da cárie dentária, sendo o Streptococcus mutans considerado o micro-organismo
que apresenta o maior potencial cariogênico e que está diretamente ligado ao seu
aparecimento (2).
O controle do biofilme apresenta papel importante na prevenção da cárie
dentária, não apenas na diminuição de bactérias orais, mas também, no processo de
limpeza das cavidades após preparos cavitários, com o objetivo de evitar nova
incidência da cárie dentária. O uso de agentes antimicrobianos nesse controle é
amplamente utilizado e apresenta resultados satisfatórios, sendo a clorexidina o
mais utilizado e que apresenta maior eficácia, principalmente por ser um potente
antimicrobiano e por desempenhar um papel importante na inibição de
metaloproteinases presentes na matriz dentinária (3).
A busca constante de novos produtos com potencial bactericida sobre os
micro-organismos orais, principalmente de origem natural, fez com que surgissem
vários estudos com esse objetivo. Isto se deve pela ineficiência de alguns produtos
sintéticos, pelos seus efeitos colaterais e, também, pela busca de produtos com
menor custo de produção e menores efeitos adversos (4).
Os medicamentos fitoterápicos são preparações farmacêuticas (extratos,
tinturas, pomadas e cápsulas) de ervas medicinais obtidos a partir de uma ou mais
plantas. Apresentam diversas vantagens para uso terapêutico como baixo custo e
efeitos adversos diminuídos, em relação aos medicamentos sintéticos. Dentre esses
produtos fitoterápicos o barabatimão (Stryphonodendron adstringens), planta
medicinal, presente principalmente no cerrado brasileiro, apresenta eficácia
antibacteriana, anti-inflamatória, antisséptica e hemostática (5).
O barbatimão parece apresentar atividade antimicrobiana sobre o
Streptococcus mutans e outras bactérias envolvidas no processo da cárie. Sendo
assim, essa pesquisa buscou avaliar a eficácia de diferentes concentrações de
solução de extrato glicólico de Barbatimão (Stryphnodendron adstringens) na
inibição do crescimento do Streptococcus mutans in vitro.
26
4.2 MATERIAIS E MÉTODOS
Os testes foram conduzidos no laboratório de Microbiologia Oral, na
Universidade Estadual de Londrina (UEL), Londrina- PR.
4.2.1 Obtenção do Extrato de Barbatimão
O extrato glicólico de barbatimão (Stryphnodendron adstringens) (Figura 2) foi
adquirido em sua composição pura, certificada, da empresa Império do Banho – ME
(Anexo A e B). A extração glicólica não apresenta citotoxicidade (45). Foram
adquiridas, da mesma empresa, dezesseis concentrações do extrato, utilizando
como solvente propilenoglicol em água (46), a saber: 0%, 1,56%, 3,12%, 4,68%,
6,25%, 7,81%, 9,37%, 10,93, 12,5%, 25%, 37,5%, 50%, 62,5%, 75%, 87,5%, 100%.
Como grupo controle foi utilizado a solução de clorexidina 2%, adquirida de Maquira
Indústria de Produtos Odontologicos Ltda, São Paulo, São Paulo, Brasil.
Figura 2 Casca e folha da planta barbatimão (Stryphnodendron adstringens)(47)
4.2.2 Cultivo dos Micro-organismos
As bactérias utilizadas para os testes foram da cepa Streptococcus mutans
ATCC 700610. As placas contendo estes micro-organismos foram mantidas a uma
temperatura de 4°C a 8°C em meio BHI-ágar (Brain heart infusion Ágar). Para a
realização dos testes, foram coletadas cinco colônias de cada placa de
27
Streptococcus mutans com alça descartável em ambiente estéril que foram imersas
e dispersas em tubos Falcon contendo 10 mL de caldo BHI (Brain heart infusion
broth) (Figura 3). Em seguida, foram incubados por 16 horas em estufa de CO₂ (5%)
à 37°C, sem agitação (Figura 4).
Figura 3 Tubos de Falcon contendo caldo BHI e cepas de Streptococcus mutans
Figura 4 Estufa de CO2 para cultivo do Streptococcus mutans
4.2.3 Teste Antimicrobiano: em difusão Ágar
Após 16 horas de incubação, os inóculos foram lavados três vezes com
tampão fosfato-salino (PBS) e foi preparada uma suspensão bacteriana diluída em
PBS com turbidez semelhante à da escala de McFarland 0,5 em tubo de vidro
transparente, em ambiente estéril, totalizando 1,5 x 108 UFC/mL (Figura 5).
28
Figura 5 Escala de McFarland 0,5 em tubo de vidro transparente
Em seguida, foi depositada uma fina camada de ágar/água no fundo da placa
(10ml), seguida por uma camada de 20 ml BHI-ágar (1,5%) contendo 200 μl da
suspensão dos micro-organismos, depositados sobre o ágar/-água. Essa mesma
camada de BHI-ágar foi perfurada para a confecção de poços com uma ponteira azul
de 1 ml, após perfurados, foram removidas tampas de cada poço, tendo assim como
fundo a camada de ágar/-água. Em cada poço, 0,2 ml das formulações de
barbatimão contendo respectivamente as concentrações: 0%, 1,56%, 3,12%, 4,68%,
6,25%, 7,81%, 9,37%, 10,93, 12,5%, 25%, 37,5%, 50%, 62,5%, 75%, 87,5%, 100%
foram adicionadas. O grupo controle foi feito com clorexidina a 2%. Após 24 horas,
os halos de inibição foram medidos com o auxílio de um paquímetro eletrônico. Em
seguida, foi realizada a subtração do halo de inibição pelo diâmetro do poço (Figura
7). Os resultados foram expressos em milímetros.
29
Figura 6 Representação esquemática da distribuição dos tripletes de placas com meio de cultura e os controles (meio de cultura e clorexidina) e as concentrações de extrato glicólico de barbatimão nas placas de petri.
Figura 7 Demonstração do meio de cultura (BHI) contendo cepa do Streptpcoccus mutans e o poço para difusão do extrato glicólico barbatimão.
4.2.4. Análise Estatística
Não houve análise estatística. Os resultados demonstraram ausência de
inibição do crescimento bacteriano em todas as concentrações de extrato glicólico
de barbatimão (Stryphnodendron adstringens) utilizadas.
30
4.3 RESULTADOS
Foi observado que nenhuma das concentrações testadas do extrato glicólico do
barbatimão (Stryphnodendron adstringens) mostrou inibição de crescimento
bacteriano do Streptococcus mutans, conforme é demostrado na tabela:
Tabela 1 Demonstração dos resultados do teste com extrato glicólico de barbatimão sobre o Streptococcus mutans.
Substância Halo de inibição (mm) Resultado
Barbatimão 1,56% 0 Não houve inibição bacteriana
Barbatimão 3,12% 0 Não houve inibição bacteriana
Barbatimão 4,68% 0 Não houve inibição bacteriana
Barbatimão 6,25% 0 Não houve inibição bacteriana
Barbatimão 7,81% 0 Não houve inibição bacteriana
Barbatimão 9,37% 0 Não houve inibição bacteriana
Barbatimão 10,93% 0 Não houve inibição bacteriana
Barbatimão 12,5% 0 Não houve inibição bacteriana
Barbatimão 25% 0 Não houve inibição bacteriana
Barbatimão 37,5% 0 Não houve inibição bacteriana
Barbatimão 50% 0 Não houve inibição bacteriana
Barbatimão 62,5% 0 Não houve inibição bacteriana
Barbatimão 75% 0 Não houve inibição bacteriana
Barbatimão 87,5% 0 Não houve inibição bacteriana
Barbatimão 100% 0 Não houve inibição bacteriana
Propilenegricol em água
(controle negativo)
0 Não houve inibição bacteriana
Clorexidina 2% (controle
positivo)
23 Houve inibição
bacteriana
31
4.4 DISCUSSÃO
A transformação de uma planta em um produto tecnicamente elaborado
exige estudos de validação das espécies vegetais visando à comprovação da
segurança e eficácia. Mais de uma centena de compostos derivados de produtos
naturais estão em fase de teste em laboratório, para as mais diversas utilizações em
tratamento de enfermidades. A avaliação da atividade antimicrobiana do extrato
glicólico das cascas do barbatimão (Stryphnodendron adstringens) corrobora com
essa tendência atual de se desenvolver e testar medicamentos produzidos a partir
de plantas naturais, principalmente para controle de micro-organismo (48).
As plantas medicinais produzem um amplo espectro de ações farmacológicas,
tendo como destaque as atividades antiinflamatória e antimicrobiana (34), sendo o
extrato da planta barbatimão, um produto natural bastante utilizado como agente
cicatrizante, antiinflamatória, hemostática, anti-edematogênica, antisséptica (42).
Orlando (43) observou atividade antimicrobiana in vitro do extrato
hidroalcoólico bruto da casca do barbatimão (Stryphnodendron adstringens) para
Enterococcus faecalis, Kocuria rhizophila, Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae,
Pseudomonas aeruginosa, Shigella flexneri, Staphylococcus aureus, Klebsiella
pneumoniae, Candida albicans e Candida krusei.
Soares et al (44) avaliaram a eficácia do extrato bruto de barbatimão
(Stryphnodendron adstringens), obtido por meio da extração hidroalcoólica, frente
aos micro-organismos responsáveis pela cárie dentária. Foram utilizadas cepas dos
micro-organismos: Enterococcus faecalis, Streptococcus salivarius, Streptococcus
sanguinis, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus e
Lactobacillus casei. Foi observada atividade microbiana sobre todos, sendo que os
melhores resultados foram sobre as cepas de S. mitis e L. casei, a concentração
inibitória mínima (CIM) variou de 350 a > 400µg/mL.
Pereira e colaboradores (49) também comprovaram a eficiência do extrato
hidroalcoólico de barbatimão (Stryphnodendron adstringens) frente aos seguintes
microorganismos patogênicos da cavidade oral: Candida albicans, Streptococcus
mutans, Stapylococcus aureus e Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Os
extratos de barbatimão mostraram atividade antibacteriana frente a todos os micro-
organismos testados, exceto para A. actinomycetemcomitans.
Miranda (50), utilizou extrato hidroalcoólico de barbatimão (Stryphnodendron
32
adstringens) como medicação endodôntica. Os testes foram realizados em
microplacas com difusão em poços do extrato, sendo feita a incubação a 35º por 24
a 48 horas, onde verificou-se a ação bactericida para os micro-organismos:
Prevotella nigrescens, Actinomyces naeslundii, Porphyromonas gingivalis,
Enterococcus faecalis e Haemophilus actinomycetemcomitans.
Apesar dos estudos acima demostrarem a ação do barbatimão
(Stryphnodendron adstringens) como antimicrobiano, utilizado a extração
hidroalcoólica, o controle do solvente (álcool) não aparece nos estudos, o que não
esclarece se existiu interferência do solvente utilizado na ação bactericida do
barbatimão(43, 44, 49, 50).
O uso do extrato do barbatimão (Stryphnodendron adstringens), obtido por
meio da extração glicólica, utilizado na presente pesquisa, foi devido a sua não
citotoxicidade conforme observou Guimarães et al(45) que utilizaram extrato glicólico
em mitocôndrias isoladas de fígado de rato para testar citotoxicidade, tendo como
experimentos propostos para caracterizar a proteção dos extratos às
macromoléculas foi lipoperoxidação, reação cujo principal produto são aldeídos os
quais formam espécies reativas ao ácido tiobartitúrico como produto final. Dessa
forma, os extratos glicólicos demostraram ausência de atividade citotóxica.
Conforme estudo citado, demostra não haver interferência da extração glicólica na
ação do barbatimão.
Em relação aos resultados do presente estudo, era esperado haver inibição do
crescimento bacteriano no micro-organismo utilizado, pois conforme estudos já
citados (43, 44, 49, 50) houve ação bactericida do barbatimão (Stryphnodendron
adstringens) na sua apresentação como extrato hidroalcoólico, o que não se
confirmou na sua apresentação como extrato glicólico, o que pode supor haver uma
interferência na forma de extração dos principios ativos do barbatimão (taninos) em
relação ao solvente utilizado.
Cowan (51) resalta que há uma melhor extração dos princípios ativos (taninos
compostos fenólicos, flavonoides e terpenóides) por meio da extração hidroalcoólica.
Já Ardisson et al.(46) verificaram uma melhor caracterização das propriedades do
barbatimão (taninos) na utilização do propileneglicol em água. A concentração de
80% de propilenoglicol se mostrou mais seletiva.Porém, o efeito citotóxico da
extração hidroalcoólica não foi descrito e suas implicações em situações clínicas.
A clorexidina como controle positivo obteve resultado satisfatório para inibição
33
do crescimento do Streptoccocus mutans, confirmando sua grande eficácia como
agente bactericida (19, 20, 21). Foi observado halo de inibição de crescimento acima
de 20 mm o que corrobora com os achados de Festuccia et al.(52).
MOREIRA et al. (53) na avaliação in vitro da atividade antimicrobiana de
antissépticos bucais, obteve halo de inibição com uso da clorexidina acima de 20
mm.
COSTA et al. (54) no seu estudo in vitro da ação antimicrobiana de extratos de
plantas sobre Enterococcus faecalis, utilizou a clorexidina como controle positivo,
obteve halo de inibição de 24,52 mm.
4.5 CONCLUSÃO
A partir dos resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir que, pela
metodologia aplicada, ocorreu ausência de ação bactericida das diferentes
concentrações do extrato glicólico de barbatimão (Stryphnodendron adstrigens)
sobre Streptococcus mutans.
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35
5 CONCLUSÕES
O presente estudo demonstrou, pela metodologia aplicada, a ausência de ação
bactericida de diferentes concentrações do extrato glicólico de barbatimão
(Stryphnodendron adstringens) sobre Streptococcus mutans.
O extrato de barbatimão obtido pela extração glicólica pode ter influenciado na
ineficiência da sua ação bactericida frente ao Streptococcus mutans. Se faz
necessário a realização de novos estudos verificando outros métodos de extração,
diferente da extração hidroalcoólica, que mantenham os princípios ativos do
barbatimão para melhor elucidar a sua ação bactericida e/ou bacteriostática.
36
REFERÊNCIAS
1. Fejerskov O, Kidd RcDadestc, 1. Ed. São Paulo: Santos, 2005. Cárie Dentária - a Doença e Seu Tratamento Clínico. 2ª Ed ed: SAT - SANTOS (GRUPO GEN); 2011. 640 p. 2. Leites ACBR, Pinto MB, Sousa ERS. Aspectos microbiológicos da cárie dental. Salusvita. 2006;25(2):239- 52. 3. Tenuta LMA, Lima JEO, Cardoso CL, Tabchoury CPM, Cury JA. Effect of period of plaque accumulation and salivary factors on enamel demineralization and plaque composition in situ. Pesqui Odontol Brás. 2003;17(4):326-31. 4. Hernandes L, Pereira LMS, Palazzo F, Mello JCPM. Wound-healing evaluation of ointment from Stryphnodendron adstringens (barbatimão) in rat. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 2010;46(3). 5. Eller SC, Feitosa VA, Antunes RM. Avaliação antimicrobiana de extratos vegetais e possível interação farmacológica in vitro. Rev de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada. 2015;36(1):131-6. 6. Lima JEO. Cárie dentária: um novo conceito. R Dental Press Ortodon Ortop Facial 2007;12(6):119-30. 7. Melo P, Teixeira L, Domingues J. A importância do despiste precoce de cárie dentária. Rev Port Clin Geral 2006;22:. 2006;22:357-66. 8. Baratieri LN, Junior SM, Andrada MC, Vieira LCC, Ritter AV, Cardoso AC. Odontologia Restauradora. Fundamentos e Possibilidades. 2ª ed. São Paulo SP: Livraria Santos Editora Comp. Imp. Ltda.; 2015. 9. Braga MM, Mendes FM, Imparato JCP. A doença Cárie Dentária. In: Imparato JCP, Raggio DP, Mendes FM, editors. Selantes de Fossas e Fissuras - Quando, Como e Porque? 1º ed. São Paulo SP: Livraria Santos; 2008. 10. Branco VIS. Cárie Dentária Infatil. Coimbra PT: Universidade de Coimbra; 2015. 11. Jenkinson HF, Lamont RJ. Streptococcal adhesion and colonization. Crit Rev Oral Bio Med. 1997;2:175-200. 12. Peres DHDP. Prevalersidade do Streptococcus do grupo mutans (Egm) em criancas das creches da cidade de Joinville – SC. J Bras Odontopediat Odontol Bebê. 2003;6:36-40. 13. Stinson M, Alder S, Kumar S. Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci. Infect Immun 2003;71(5):2365–72. 14. Alves AC, Nogueira RD, Stipp RN, Pampolini F, Moraes ABA, Gonçalves RB. Prospective study of potential sources of Streptococcus mutans transmission in nursery school children. J Med Microbiol. 2009;58(4):476–81. 15. Ferraro MJ, Swenson JM, Wikler MA, Cockerill FR, Bush K, Dudley MN, et al. Methods for Dilution Antimicrobial Suscceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically. Clinical and Laboratory Standard Institutes; 2009. p. 65. 16. Berkowitz RJ. Mutans streptococci: acquisition and transmission. Pediatr Dent. 2006;28(02):106–9. 17. Smith DJ, Mattos-Graner RO. Secretory immunity following mutans streptococcal infection or immunization. Curr Top Microbiol Immunol. 2008:131–56. 18. Duque C, Stipp RN, Wang B, Smith DJ, Höfling JF, Kuramitsu HK. Downregulation of GbpB, a component of the VicRK regulon, affects biofilm formation and cell surface characteristics of Streptococcus mutans. Infect Immun. 2011;79(2):786–96.
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40
ANEXO A
LAUDO BARBATIMÃO
41
ANEXO B
LAUDO PROPILENOGLICOL
42
ANEXO C
APRESENTAÇÃO DO MANUSCRITO
O texto do manuscrito deverá estar redigido em inglês e fornecido em arquivo digital
compatível com o programa "Microsoft Word" (em formato DOC, DOCX ou RTF).
Cada uma das figuras (inclusive as que compõem esquemas/combos) deverá ser
fornecida em arquivo individual e separado, conforme as recomendações descritas
em tópico específico.
Fotografias, micrografias e radiografias deverão ser fornecidas em formato TIFF,
conforme as recomendações descritas em tópico específico. Gráficos, desenhos,
esquemas e demais ilustrações vetoriais deverão ser fornecidos em formato PDF,
em arquivo individual e separado, conforme as recomendações descritas em tópico
específico. Arquivos de vídeo poderão ser submetidos, respeitando as demais
especificidades, inclusive o anonimato dos autores (para fins de avaliação) e
respeito aos direitos dos pacientes.
As seções do manuscrito devem ser apresentadas observando-se as características
específicas de cada tipo de manuscrito: folha de rosto (Title Page), introdução,
metodologia, resultados, discussão, conclusão, agradecimentos e referências. Folha
de rosto (Title Page; dados obrigatórios) Indicação da especialidade*, ou área de
pesquisa, enfocada no manuscrito.
Título informativo e conciso, limitado a um máximo de 110 caracteres incluindo
espaços.
Nomes completos e por extenso de todos os autores, incluindo os respectivos
números de telefone e endereços eletrônicos (email). Recomenda-se aos autores
confrontar seus nomes anotados na Folha de Rosto (Title Page) com o perfil criado
no ScholarOne™, de modo a evitar incompatibilidades. A participação de cada um
dos autores deverá ser justificada por escrito em folha separada, observando-se os
43
critérios de autoria e coautoria adotados pelo International Committee of Medical
Journal Editors, disponíveis em
http://www.icmje.org/recommendations/browse/rolesandresponsibilities/
definingtheroleofauthorsandcontributors. html
Dados de afiliação institucional/profissional de todos os autores, incluindo
universidade (ou outra instituição), faculdade/curso, departamento, cidade, estado e
país, apresentados de acordo com as normas internas de citação estabelecidas pela
instituição de cada um dos autores. Verificar se as afiliações foram inseridas
corretamente no ScholarOne™.
CARACTERÍSTICAS E FORMATAÇÃO DOS TIPOS DE MANUSCRITOS
Pesquisa Original
Devem ser limitados a 30.000 caracteres incluindo espaços (considerando-se
introdução, metodologia, resultados, discussão, conclusão, agradecimentos, tabelas,
referências e legendas de figuras).
Será aceito um máximo de 8 (oito) figuras e 40 (quarenta) referências. O resumo
deve conter, no máximo, 250 palavras.
Formatação Arquivos de Texto
Folha de rosto (Title Page)
Texto principal (30.000 caracteres incluindo espaços)
Resumo máximo de 250 palavras
Descritores de 3 (três) a 5 (cinco) descritores principais
Introdução
Metodologia
Resultados
Discussão
Conclusão
Agradecimentos
Tabelas
Referências máximo de 40 referências
Legendas de figuras
Formatação Arquivos de figuras
Figuras máximo de 8 (oito) figuras, conforme descrito acima.
44
APÊNDICE A
FOTOS ENSAIO “IN VITRO”