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Sviluppo e validazione di un metodo multiresiduo per la determinazione dei pesticidi negli alimenti di
origine animale destinati all’infanzia
Graziella Amendola –ISS [email protected]
IX Convegno Attività dell’Amministrazione Pubblica in materia di controllo dei Residui di Fitofarmaci negli alimenti
- 17 Novembre 2011 -
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Perché sviluppare questo metodo:
Ottimizzare un metodo già disponibile in reparto
Ottenere l’ accreditamento del metodo (attività del NRL-AO)
Programma Comunitario di Controllo
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Reg. 396/2005 Articolo 29
Programma comunitario di controllo 1. La Commissione elabora un programma comunitario coordinato di controllo pluriennale che specifica i campioni da inserire nei programmi nazionali di controllo e tiene conto dei problemi riscontrati in relazione all'osservanza degli LMR stabiliti nel presente regolamento, allo scopo di valutare l'esposizione dei consumatori e l'applicazione dell'attuale legislazione. 2. Il programma comunitario di controllo è adottato e aggiornato ogni anno secondo la procedura di cui all'articolo 45, paragrafo 2. Il progetto di programma comunitario di controllo è presentato al comitato di cui all'articolo 45, paragrafo 1, almeno sei mesi prima della fine di ogni anno civile.
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COMMISSION REGULATION (EU) No 915/2010
of 12 October 2010 concerning a coordinated multiannual control programme of the Union for 2011, 2012 and 2013 to ensure compliance with maximum levels of and to assess the consumer exposure to pesticide residues in and on food
of plant and animal origin
Allegato I: Tabella in cui sono riportate le combinazioni tra principi attivi e matrice che devono essere analizzati Allegato II: Numero di campioni relativi alle combinazioni riportate nella tabella 1 e il numero di campioni di alimenti per l’infanzia, che ciascun Paese Membro deve analizzare.
In dettaglio sono richieste le analisi su:
2012: 10 campioni di alimenti a base di cereali
2013: 10 campioni sugli alimenti per lattanti e per bambini
2014: 10 campioni sugli alimenti per lattanti e sugli alimenti di proseguimento
L’aggiornamento del Programma Comunitario per l’anno in corso non è stato ancora ufficialmente pubblicato, ma esiste già un draft: SANCO/11278/2011 nel quale vengono riconfermati il numero e la tipologia dei campioni che devono essere analizzati per quanto concerne gli alimenti destinati all’infanzia.
In particolare, in questo aggiornamento la tabella 1 dell’Allegato I è stata divisa in due parti, la parte A riguarda i prodotti di origine vegetale, la parte B i prodotti di origine animale. Nella parte B sono stati introdotti altri p.a. he possono essere analizzati su base volontaria a partire dal 2012.
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PERCHE’ L’INFANZIA
VULNERABILITA’ GENERALE
ELEVATO RAPPORTO QUANTITA’ DI CIBO INGERITA/ PESO CORPOREO
DIETA POCO DIVERSIFICATA
IMMATURITA’ DEI SISTEMI METABOLICI
SUSCETTIBILITA’ SPECIFICA
MATURAZIONE DI ORGANI E SISTEMI : NERVOSO, IMMUNITARIO, ENDOCRINO, RIPRODUTTIVO
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DIR. 2006/141/CE ALIMENTI PER LATTANTI E ALIMENTI DI PROSEGUIMENTO
Art.10 e Allegati VIII e IX
DIR. 2006/125/CE ALIMENTI A BASE DI CEREALI E ALTRI ALIMENTI DESTINATI AI BAMBINI
Art.7 e Allegati VI e VII
NORMATIVA SUI FITOFARMACI IN ALIMENTI DESTINATI ALL’INFANZIA
“...GLI ALIMENTI DESTINATI ALL’INFANZIA NON DEVONO CONTENERE RESIDUI DI SINGOLI ANTIPARASSITARI SUPERIORI A 0.01 mg/Kg ... ”
Eccezione per alcuni pesticidi MRLs 0.003-0.006-0.008 mg/Kg
DIRETTIVE COMUNITARIE
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ALLEGATO VI
QUANTITÀ MASSIME SPECIFICHE DEI RESIDUI DI ANTIPARASSITARI O DEI METABOLITI DI
ANTIPARASSITARI NEGLI ALIMENTI A BASE DI CEREALI E NEGLI ALTRI ALIMENTI DESTINATI AI
LATTANTI
Denominazione chimica della sostanza (definizione del residuo) Quantità
massime
dei residui
(mg/kg) Cadusafos 0,006 Demeton-S-metile/demeton-S-metile-solfone/oxidemeton-metile (isolatamente o assieme, espressi in demeton-S-
metile) 0,006
Etoprofos 0,008 Fipronil (somma di fipronil e fipronil-desulfinyl, espressa in fipronil) 0,004 Propineb/propilentiourea (somma di propineb e propilentiourea) 0,006
ALLEGATO VII
ANTIPARASSITARI CHE NON DEVONO ESSERE UTILIZZATI IN PRODOTTI AGRICOLI DESTINATI ALLA
PRODUZIONE DI ALIMENTI A BASE DI CEREALI E DEGLI ALTRI ALIMENTI PER LATTANTI
Tabella 1
Tabella 2
Denominazione chimica della sostanza (definizione del residuo)
Disulfoton (somma di disulfoton, solfossido di disulfoton e solfone di disulfoton, espressa in
disulfoton)
Fensulfothion (somma di fensulfothion, del suo analogo d'ossigeno e dei loro solfoni, espressa
in fensulfothion)
Fentin, espresso in cationi di trifenilstagno
Alossifop (somma di alossifop, dei suoi sali ed esteri, compresi i composti, espressa in
alossifop)
Eptacloro e trans-eptacloro epossido, espressi in eptacloro
Esaclorobenzene
Nitrofen
Ometoato
Terbufos (somma di terbufos, del suo solfosside e solfone, espressa in terbufos)
Denominazione chimica della sostanza (definizione del residuo) Aldrin e dieldrin, espressi in dieldrin Endrin
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Attività svolte dal Reparto inerenti gli alimenti destinati all’infanzia
2000 - 2001: Convenzione progetto 1% “ Valutazione dell’assunzione di residui di pesticidi tramite la dieta, indagini analitiche sui livelli di residui di pesticidi in alimenti per bambini”
2003-2005: Piani triennali per la sorveglianza sanitaria dei fitofarmaci (Art. 17, comma 4, del D.L.vo n. 194/95)
2005: Controllo alimenti per l’infanzia nell’ambito del procedimento N° 9013/04 della Procura della Repubblica
Sviluppo metodi prodotti di origine vegetale: 88 composti
OC/PYR/OP/NMC prodotti di origine animale: 50 composti OC/OP/PYR
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Alimenti di origine animale: confronto metodo vecchio con metodo nuovo
Campione
Estrazione
1° Clean up
2° Clean up
OC/PYR GC-2xECD
OP GC-FPD
Metodo vecchio Metodo nuovo
Campione
Estrazione
1° Clean up 1° Clean up
OP/PYR/OC GC-MS/MS
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Estrazione 25 g campione + 100 ml Esano/Acetone 1:1 2 min UltraTurrex Centrifuga 15 min Si ripete l’estrazione con 2 aliquote da 50
ml di esano (altri 2 steps di centrifugazione da 15 min ciascuno)
Gli estratti si disidratano su colonna sodio solfato anidro (25 g) e lavaggio con 15 ml esano
Evaporazione dell’estratto fino a secchezza
Estrazione
5 g di campione + 35 mL di acetonitrile
2 min UltaTurrex
+ 5 g Solfato di Magnesio anidro
Filtrazione sotto vuoto su Bukner, con lavaggio del filtrato con 15 ml acetonitrile
Evaporazione a circa 1 ml
Metodo vecchio Metodo nuovo
Clean up Clean up
Tempo = 1h/campione Sale = 25g Solvente = 215ml
Tempo = 15min/campione Sale = 5g Solvente = 50ml
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COMPOSIZIONE DEGLI OMOGENEIZZATI DI ORIGINE ANIMALE
CARNE, PESCE, FORMAGGIO
Acqua = 60%
Proteine 3-12%
Carboidrati 4-9%
Grassi 1.5-7.5%
In 25 g di campione Grassi: 0.4 -1.9 g Acqua: 15 g
In 5 g di campione Grassi: 0.1 - 0.6 g Acqua: 5 g
40%
estratto:
Residuo grasso: 0.4 -1.5g
Elevate tracce di acqua
ESTRAZIONE
Metodo vecchio Metodo nuovo
estratto:
Residuo grasso: 0.05g
Scarse tracce di acqua
Esano/Acetone
Acetonitrile
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1° Clean up:
Estratto in esano su cartuccia Extrelut NT3
30 min sotto soffio di azoto
Cartuccia Extrelut 1 modificata contenente C18 (0.36g)
Eluizione con 20 ml acetonitrile
Metodo vecchio Metodo nuovo
Clean up:
Estratto in acetonitrile su cartuccia di C18 (2g)
Eluizione con 20 ml acetonitrile
2°Clean up: Florisil/miscele Suzuki
Analisi OC/PYR GC-2xECD (GC-MS)
Analisi per tutte le classi di composti GC-MS/MS (QQQ) Agilent 7000
(Grasso residuo: 5-15 mg)
(Grasso residuo: 2-4 mg)
(Grasso residuo: 5-12 mg)
(28 p.a.)
(22 p.a.)
(65 p.a.)
Analisi OP GC-FPD (GC-MS)
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GC-MS/MS Agilent 7000 (QQQ)
.
GC- MS/MS: Iniettore Programmed Temperature Vaporizer (PTV) modalità solvent vent Colonna HP 5MS (450°C, 30m x 250 m x 0.25 m); temperatura del forno: 50-
280°C Sistema backflush (0.8m x 180 m x 0 m) MS-MS: triplo quadrupolo (sorgente EI, temp. 280°C) Determinazione in Multiple Reaction Monitoring MRM (alta selettività) Software Muss Hunter
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PTV:
modalità solvent vent permette l’iniezione in acetonitrile, non c’è bisogno di cambiare il solvente. Volume di iniezione: da 2 a 5 L, consente di analizzare concentrazioni molto basse dei composti, come ad esempio richiesto dalla normativa per gli alimenti destinati all’infanzia (MRL=0.003 mg/Kg)
Sistema Backflush: lavaggio della colonna capillare in controcorrente. Determina molti vantaggi: Aumenta la vita della colonna capillare, riducendo il tempo di esposizione ad alte temperature (bake out) riduce il run time Riduce la frequenza della manutenzione della sorgente, poiché previene il deposito di componenti alto bollenti sulla sorgente
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Multiple Reaction Monitoring MRM: La funzione MRM permette di analizzare matrici difficili a bassi limiti di determinazione Velocità di acquisizione fino a 500 transizioni MRM al secondo consente di quantificare e confermare in modo automatico molti composti in un singolo metodo Con una corsa di 42 min sono stati analizzati 65 p.a appartenenti a differenti classe di composti Si può aumentare in numero di composti fino a circa 200
GC-MS/MS: Triplo quadrupolo
Ionizzazione del campione nella sorgente inerte: si forma lo ione precursore
1°quadrupolo: isolamento dello ione precursore cella di collisione: ione precursore viene dissociato con azoto, si generano gli ioni figli 2° quadrupolo: gli ioni figli vengono separati dagli interferenti di matrice analizzati in un rivelatore a triplo asse
Muss Hunter:
un software più sofisticato che permette una rapida elaborazione dei dati, che si traduce in minori possibilità di errore e in un risparmio notevole di tempo.
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Composti di interesse per le matrici di origine animale: organofosforati, organoclorurati, piretroidi (lista EURL-PT-AO)
Composti con valori specifici di MRL indicati in normativa
Composti nuovi inseriti nel piano triennale
Quali pesticidi sono stati considerati:
In totale sono stati studiati e validati 65 principi attivi
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1) Aldrin
2) Bifenthrin
3) Boscalid
4) Cadusafos
5) Chlordane cis
6) Chlordane trans
7) Chlorfenvinphos
8) Chlorobenzilate
9) Chlorpyrifos
10) Chlorpyrifos-methyl
11) Cyfluthrin
12) Cyhalothrin lambda
13) Cypermethrin
14) DDD o,p'
15) DDD p,p'
16) DDE o,p'
17) DDE p,p'
18) Deltamethrin
19) Demeton-S-methyl
20) Demeton-S-methylsulfon(oxy)
21) Diazinon
22) Diclorvos
23) Dieldrin
24) Disulfoton
25) Disulfoton sulfone
26) Endosulfan (alpha isomer)
27) Endosulfan (beta isomer)
28) Endosulfan sulfate
29) Endrin
30) Ethion
31) Ethoprophos
32) Fenamiphos
33) Fenitrothion
34) Fenthion
35) Fenvalerate
36) Fipronil
37) Fluvalinate-tau
38) HCH (alpha isomer)
39) Heptachlor
40) Heptachlor Epoxide cis
41) Heptachlor Epoxide trans
42) Hexachlorobenzene
43) Lindane
44) Malathion
45) Metacrifos
46) Methoxychlor
47) Methyl parathion
48) Nitrofen
49) Oxychlordane
50) Parathion
51) Pendimethalin
52) Permethrin
53) Pirimiphos-methyl
54) Profenofos
55) Pyrazophos
56) Quinalphos
57) Quintozene
58) Resmethrin
59) Tecnazene
60) Terbufos
61) terbufos sulfone
62) Tolclofos-methyl
63) Triazophos
64) Trifluralin
65) Vinclozolin
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GC-MS/MS: ALTA SELETTIVITA’
BIANCO PESCE BIANCO CARNE
BIANCO FORMAGGIO Standard in matrice (65 composti)
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ALTA SENSIBILITA’
TERBUFOS e TERBUFOS SULFONE
Transizioni Terbufos: Quantifier 231.0 128.9 Qualifier 231.0 174.9 Spiking level: 0.003mg/Kg (LOQ=MRL) Rec.= 106% RSD=3%
Transizioni Terbufos sulfone: Quantifier 199.0 143.0 Qualifier 231.0 174.9 Spiking level: 0.003mg/Kg (LOQ=MRL) Rec.= 82% RSD=9%
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Dir. 2006/125/CE
DEFINIZIONE DEL MRL:
TERBUFOS = (Somma di Terbufos, del suo sulfosside e del suo sulfone, espressi come Terbufos)
DEMETON-S-METILE, DEMETON-S-METILE SULFONE, DEMETON-S-METILE SULFOSSIDE (isolatamente o assieme, espresi in Demeton-S-Metile)
DISULFOTON = (Somma di Disulfoton, del suo sulfosside e del suo sulfone, espressi come disulfoton)
SULFOSSIDI
non sono analizzabili in GC-MS/MS, ma possono essere analizzati in LC-MS/MS.
Questa parte di lavoro rientra nei nostri obiettivi futuri
21 (mainlib) Heptachlor epoxide
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 4000
50
100
27
36
53
61 73
81
8597
109
115123
143
151
167183
193 204
217
229
237
253
263
274282 289 317
353
388
Cl
Cl
Cl
Cl
O
Cl
ClCl
(mainlib) 2,5-Methano-2H-indeno[1,2-b]oxirene, 2,3,4,5,6,6a,7,7-octachloro-1a,1b,5,5a,6,6a-hexahydro-, (1aα,1bβ,2α,5α,5aβ,6β,6aα)-
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 4400
50
100
29 36
51
61 7387
97
109
115
121
127
143
149
157167
185
204 217
229
237
253
263
275287
299
310323 351
359
387
422
Cl
Cl
Cl
Cl
O
Cl
ClCl
Cl
OSSICLORDANO (a) O cis-HEPTACLORO EPOSSIDO (b)?
(a)
(b)
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Ossiclordano
(a)
Cis-Eptacloro Epossido (b)
OSSICLORDANO (a) O cis-EPTACLORO EPOSSIDO (b)?
Transizioni OSSICLORDANO: Quantifier 388.6 352.9 Qualifier 388.6 264.7
Transizioni EPTACLORO EPOSSIDO: Quantifier 352.9 262.8 Qualifier 352.9 281.9 Quantifier 81.0 53.1 E.c= 15
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VALIDAZIONE METODO
SANCO 10684/2009
MATRICI RAPPRESENTATIVE: OMOGENEIZZATI DI CARNE, FORMAGGINO E PESCE
PROVE DI RECUPERO: CAMPIONI BIANCHI ADDIZIONATI
2 LIVELLI DI SPIKING: basso= LOQ; alto= 10XLOQ
RIPETIZIONI: n= 5 PER OGNI LIVELLO E PER TUTTI I COMPOSTI STUDIATI
DETERMINAZIONE DEL LOQ
DETERMINAZIONE DELLA LINEARITA’
RISULTATI DELLA VALIDAZIONE:
RIENTRANO NEI CRITERI DI ACETTABILITA’ INDICATI NELLA SANCO 10684/2009
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GRAZIE PER L’ATTENZIONE