Präzision in der HPLC
Udo Schepers1, Joachim Ermer2,Lutz Preu1, Hermann Wätzig1
1Institut für Pharmazeutische ChemieUniversität Braunschweig
2Aventis, Global Analytical Development
• Akzeptanzkriterien• Abhängigkeit von der Konzentration• Varianzkomponenten
„ ... enthält mindestens 98.5 undhöchstens 101.0 Prozent ..., berechnet aufdie getrocknete Substanz.“
Akzeptanzkriterien des Gehaltes für Wirkstoffe
Miller, J. H. McB., European Directorate for the Quality of Medicines (EDQM),Straßburg; Positionspapier der Fachgruppe Arzneimittelkontrolle/PharmazeutischeAnalytik der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft
unteres Akzeptanzkriterium:
TSDTSILAL ���� 3%%100
oberes Akzeptanzkriterium:
TSDUAL ��� 3%100
0.3%
%TSI: percental total sum of impurities
0.3%
1%
1%
0.5% = 98.5%
= 101.0%
TSD: target standard deviation
Methoden Substanzbeispiele TSDTitrationen- im wässrigen Milieu mitAlkali, Farbindikator
Salicylsäure 0.2 %
- im wässrigen Milieu mitAlkali, potentiometrischeIndikation
Salicylsäure 0.3 %
- im nicht-wässrigen Milieu mitAlkali, Farbindikator
Ephedrinhydrochlorid,racemisch
0.4 %
- im nicht-wässrigen Milieu mitAlkali, potentiometrischeIndikation
Ephedrinhydrochlorid,racemisch
0.4 %
UV-Spektrometrie Prednisolonacetat, u.a.1) 0.6 % - 1.3 %Flüssigchromatographie(HPLC)
Cloxacillin-Natrium 0.6 %2)
1) Cinnarizin, Dienestrol, Albendazol und Methylprednisolon-hemisuccinate2) ev. teilweise höher, vgl. UV-Spektrometrie
Daas, A. G. J., Miller, J. H. McB., Pharmeuropa 10(1), 137-146 (1998)
0.6%
Analyt Sulfonamide, MW ~ 400Drug product Film tablet 4 mgCommentsConditions 25°C/60%RH
Date of analysis Storage LC Assay 0,2mg/ml 10µl 228nminterval prep 1 prep 2 prep 3
23.01.98 0 3,907 3,914 3,90823.01.98 3 3,954 4,121 4,05121.04.98 6 3,902 3,945 3,96531.07.98 9 3,967 3,987 4,08307.10.98 12 4,02 3,998 3,97326.04.99 18 3,895 3,93 3,89
Berechnungen von Präzisionen ausStabilitätsstudien
Individual Repeatability
0,00%
0,50%
1,00%
1,50%
2,00%
2,50%
3,00%
3,50%
4,00%
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Drug Product / Analyte
RSD
1 Aerosol 5 med. Bad 8 Gel 11-16 Lösungen 18-37 Tabletten 2-4 Wirkstoffe (APIs) 6-7 Cremes 9-10 Lyophilisate 17 Suspensionen
TSD = 0.6% führt also zuvernünftigem Ergebnis:3 * TSD = 1.8%, aufgerundet 2%
Akzeptanzkriterien für die Zulassung
EU: 95 und 105% des deklarierten Gehalts
assay
R
nPLAK �̂23.2%100 �
���
J. Ermer, M. Fischer, B. Renger, H. van Lishaut, H. Wätzig,http://www.tu-bs.de/institute/pharmchem/dphg_pospapier.pdf
� 2.5%
� 2.5%
Reproducibility
0,00%
0,50%
1,00%
1,50%
2,00%
2,50%
3,00%
3,50%
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Drug Product / Analyte
RSD
1 Aerosol 5 med. Bad 9 Gel 12 Salbe 13-19 Lösungen 21-44 Tabletten 2-4 Wirkstoffe (APIs) 6-8 Cremes 10-11 Lyophilisate 20 Suspensionen
Ratio Reproducibility / overall Repeatability
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Drug Product / Analyte
Rat
io
1 Aerosol 5 Bad 9 Gel 12 Salbe 13-19 Lösungen 21-44 Tabletten 2-4 APIs 6-8 Cremes 10-11 Lyophilisate 20 Suspensionen
= 100% ± 5.6%
Vergleichspräzision undAkzeptanzkriterien
assay
R
nPLAK �̂23.2%100 �
��� � 2.5% 1.73
2.4%
Die FG Arzneimittelkontrolle der DPhG schlägt vor, imNormalfall höchstens eine Dreifachbestimmungdurchzuführen.
Obere Grenze der Vergleichspräzision in der HPLC: 2.4%
� 1.9% ± 5.0%
Wiederhol-Standardabweichung
Probenaufbereitung Systempräzision
Einwaage Verdünnung Injektion Integration
Varianzkomponenten in der HPLC
1124
, 2,
2212
10,
2,39
1470
, 3,
06
3057
670,
8,3
6
7075
, 10
,08
5600
, 10
,90
SAMP 400N-Meth 0InhibSens 20
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Retention Time (min)
-0,01
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
Intensity (AU)
Beispiel: HPLC, Glibenclamid +Nebenkomponenten
NH
OS
NH
OO
NH
O
OCH3
Cl
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
0% 20% 40% 60% 80% 100% 120%
Einwaage in Prozent
RSD
+ R
SD-S
YS
Präzision bei 10 - 120% des Nominalgehaltes
Verlauf der Wiederholbarkeit und der Systempräzision:
Die restliche Variation ist durch die Probenaufbereitungbedingt. Ca. 0,63%, da 0,702 = 0,312 + 0,632.
1124
, 2,
2212
10,
2,39
1470
, 3,
06
3057
670,
8,3
6
7075
, 10
,08
5600
, 10
,90
SAMP 400N-Meth 0InhibSens 20
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Retention Time (min)
-0,01
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
Intensity (AU)
02468
10121416
0,0% 0,1% 1,0% 10,0%
Einwaage in Prozent
RSD
Der Anteil der Systempräzision an der Gesamtvariabilitätwird stetig größer.
Präzision unterhalb 10% des Nominalgehaltes
Verlauf der Wiederholbarkeit und der Systempräzision:
Integrationsfehler
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Retention Time (min)
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Intensity (AU)
100%
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Retention Time (min)
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
Intensity (AU)
1%
Integrationsfehler
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Retention Time (min)
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
Intensity (AU)
0,1%
Integrationsfehler
Konzentrationsabhängigkeit fürweitere Substanzen
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0,01% 0,10% 1,00%
Concentration
RSD
%
53146
UV-Spektrum von Glibenclamid
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
1,00
200 210 220 230 240 250 260 270 280
Wavelength
Nor
mal
ized
Auswertung bei 210, 228 und 240 nm
Systempräzision bei denverschiedenen Wellenlängen
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
0,01% 0,10% 1,00% 10,00% 100,00%
Concentration
RSD
%
210 nm 228 nm 240 nm
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
1,00
200 210 220 230 240 250 260 270 280
Wavelength
Norm
aliz
ed
Präzision und Integrationssoftware
2.00
1.80
1.60
1.40
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
Absorption
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00
Time [min]
2.85
6.26
B. Schirm, H. Wätzig, Chromatographia 48, 331-346 (1998)
Präzision und Integrationssoftware 2.00
1.80
1.60
1.40
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
Absorption
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00
Time [min]
2.85
6.26
Kommerziell erhältliche Software: 2.9 - 3.5% RSD%
KISS-Software: 0.5 - 0.7% RSD%
B. Schirm, H. Wätzig, Chromatographia 48, 331-346 (1998)
Präzision in der HPLC:Schlussfolgerungen
• TSD von 0.6% berücksichtigt den analytischenFehler zufriedenstellend
• Obere Grenze für die Wiederholbarkeit (RSD%):etwa 2%
• Obere Grenze für die Vergleichbarkeit (RSD%):etwa 2.4%
• Weitere Verbesserung der Präzisionwünschenswert (vgl. Akzeptanzkriterien)
• höhere Konzentrationen (� 10% eines deklariertenWertes): Probenvorbereitung dominiertanalytischen Fehler
• geringere Konzentrationen (< 1% einesdeklarierten Wertes): Peakintegration dominiertanalytischen Fehler
Präzision in der HPLC:Schlussfolgerungen
• höhere Konzentrationen(� 10% eines deklariertenWertes): Probenvorbereitungdominiert analytischenFehler
• geringere Konzentrationen(< 1% eines deklariertenWertes): Peakintegrationdominiert analytischenFehler
Präzision in der HPLC:Schlussfolgerungen
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
0,50 1,50 2,50 3,50 4,50
Wiederholbarkeit RSD%
% A
ntei
l an
Ges
amtv
aria
nz
Integration
Probenvorbereitung
Injektion
• höhere Konzentrationen(� 10% eines deklariertenWertes): Probenvorbereitungdominiert analytischenFehler
• geringere Konzentrationen(< 1% eines deklariertenWertes): Peakintegrationdominiert analytischenFehler
Präzision in der HPLC:Schlussfolgerungen
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
0,50 1,50 2,50 3,50 4,50
Wiederholbarkeit RSD%
% A
ntei
l an
Ges
amtv
aria
nz
Integration
Probenvorbereitung
Injektion