2018
Juliana Mariotti Guerra Médica Veterinária
Pesquisadora Científica
Patologia Morfológica e Molecular Aplicadas
à Inovação Diagnóstica e Vigilância da
Leishmaniose visceral
INTRODUÇÃO
PATOLOGIA
INTRODUÇÃO
■ SAÚDE ÚNICA
Reconhece a inter-relação
entre a saúde animal,
humana e ambiental.
"Entre a medicina animal e a
medicina humana não
existem linhas divisórias e
nem deve existir.” Rudolph
Virchow (1821-1902).
INTRODUÇÃO
FERRAMENTAS DIAGNÓSTICAS
■ Macroscopia
■ Citologia convencional / parasitológico direto
■ Citologia em meio líquido
■ Emblocado celular
■ Histopatologia
■ Colorações histoquímicas
■ Imunohistoquímica
■ Técnicas moleculares: Hibridização in situ, PCR,
sequenciamento.
MACROSCOPIA
Barbosa et al., 2017; Taniguchi, 2013
Achados clínicos e necroscópicos de cães soropositivos para
LVC
75,1272,10
53,72
42,0137,66
33,78
6,00
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
Espleno
meg
alia
Lesõ
es cutân
eas
Onico
grifo
se
Hep
atom
egalia
Linfon
odom
egalia
Emag
recimen
to
Caq
uexia
Fre
quên
cia
(%
)
■ Parasitológico direto.
■ Pesquisa de formas amastigotas em raspados de lesões
cutâneas e aspirados de medula óssea, linfonodo, baço.
■ Colorações do tipo Romanowsky
■ Sensibilidade: esfregaços esplênicos 93.1 - 98.7%, de medula
óssea 52 – 85%, e de linfonodo 52 – 58% em humanos; 34%
em esfregaços nodais de cães.
■ Especificidade: 100%
CITOLOGIA CONVENCIONAL
Paiva-Cavalcanti et al., 2015; Guerra et al., 2015
Métodos de coleta de amostras:
Punção por agulha fina: com ou sem aspiração
Impressão, escarificação ou esfoliação
[Cowell e Tyler, 2002]
CITOLOGIA CONVENCIONAL
Esfregaço de lâmina-sobre-lâmina (“Squash”)
Lâminas secas ao ar
Identificação do animal no lado oposto ao do material na
lâmina
Armazenar em porta lâminas ou separadas depois de secas
Não conservar na geladeira
Não colocar uma lâmina úmida sobre a outra
CITOLOGIA CONVENCIONAL
CITOLOGIA CONVENCIONAL
Magno, 2014
Fernandes, 2015; Lorente, 2015
• Vantagens
– Detecção rápida e eficaz
– Baixo custo
– Fácil execução
– Segura, pouco invasiva
– Alta especificidade
• Desvantagens
– Baixa sensibilidade
– Profissional capacitado
– Interferentes : • Sangue
• Leucócitos
• Dessecamento
• Sobreposição
CITOLOGIA CONVENCIONAL
■ Transferência imediata de células coletadas para meio preservativo.
■ Objetivos:
■ Minimizar artefatos e uniformizar esfregaços;
■ Automatizar e padronizar a confecção do esfregaço citológico;
■ Reduzir custos de RH
■ Possibilidade de produção de mais de um esfregaço;
■ Permite a realização de exames complementares.
■ Sensibilidade de 20% e especificidade de 100% em esfregaços
nodais em cães.
CITOLOGIA EM MEIO LÍQUIDO
Fernandes et al., 2016
CITOLOGIA EM MEIO LÍQUIDO
CITOLOGIA EM MEIO LÍQUIDO
Arquivo pessoal
• Vantagens – Fixação imediata;
– Padronização;
– Amostra bem distribuída;
– Redução do tempo de leitura;
– Redução de elementos que obscurecem a amostra;
– Redução de insatisfatórios;
– Possibilidade de realização de testes complementares e mais esfregaços.
• Desvantagens – Perda do padrão de
arquitetura por rompimento dos grupamentos
– Perda de coesão entre as células;
– Redução do tamanho celular e nuclear;
– Redução de elementos do fundo
Fernandes et al., 2016; Lorente, 2015
CITOLOGIA EM MEIO LÍQUIDO
Colheita e fixação das células
Agregação e formação de sedimento
Processamento histológico
Múltiplos cortes
Colorações específicas
Imuno-citoquímica
Forma de preparação citológica na qual o precipitado da amostra centrifugada é
incluído em parafina e submetido a processamento histológico habitual.
Fernandes et al., 2016
EMBLOCADO CELULAR
Agente agregador
Fernandes et al., 2016
Agente fixador
EMBLOCADO CELULAR
EMBLOCADO CELULAR
Arquivo pessoal
EMBLOCADO CELULAR
• Vantagens – Simples e reprodutível
– Aumento da celularidade
– Maior representatividade
– Visualização parcial da arquitetura tecidual
– Aplicação de métodos complementares (ICQ, colorações histoquímicas)
– Armazenamento da amostra em temperatura ambiente
• Desvantagens – Maior custo
– Maior tempo de preparo
– Redução do tamanho celular
– Necessidade de maior concentração celular
EMBLOCADO CELULAR
HISTOPATOLOGIA
■ Coleta de amostras:
■ Biópsia incisional, por punch, por agulha grossa, excisional
■ Autópsia / Necrópsia: fragmentos de 2 cm3 dos tecidos,
especialmente, pele (cães), linfonodo, baço, medula óssea, fígado,
pulmão e coração.
HISTOPATOLOGIA
• Fixação adequada do material – Solução de formalina 10%
tamponada.
• Quantidade adequada de fixador – (10 vol. fixador / 1 vol. tecido)
• Tempo de fixação: mínimo de 24 horas.
• Potes adequados: plástico, boca larga, rosqueável.
• Não congelar
HISTOPATOLOGIA
■ Estudo microscópico das células e dos tecidos.
■ Coloração padrão: hematoxilina e eosina.
■ Padrão morfológico das lesões.
■ Associação com possíveis etiologias.
■ Colorações histoquímicas específicas: Giemsa.
■ Permite a realização de exames complementares: imuno-
histoquímica, hibridização in situ, PCR.
■ Conservação do material emblocado em parafina à
temperatura ambiente.
Esquema gentilmente cedido por Cristina Kanamura.
HISTOPATOLOGIA
■ Alterações multissistêmicas.
■ Amastigotas podem ser observadas no interior de macrófagos
(ocasionalmente outros leucócitos, células endoteliais,
fibroblastos e células neoplásicas) em mútiplos tecidos.
■ Infiltrado inflamatório com macrófagos, linfócitos, plasmócitos
e, menos frequentemente, neutrófilos e eosinófilos.
■ Tecidos mais afetados: baço, pele, fígado, linfonodo, rim, MO.
■ Lesões cardíacas, oculares, musculares, vasculares e de
sistema nervoso.
HISTOPATOLOGIA
Arquivo pessoal
HISTOPATOLOGIA
Arquivo pessoal
HISTOPATOLOGIA
Arquivo pessoal
HISTOPATOLOGIA
Guerra et al., 2014
HISTOPATOLOGIA
Réssio; Iglezias, 2018
HISTOPATOLOGIA
• Vantagens – Simples e reprodutível
– Maior representatividade
– Visualização da arquitetura tecidual
– Aplicação de métodos complementares (ICQ, colorações histoquímicas)
– Armazenamento da amostra em temperatura ambiente
• Desvantagens – Maior custo
– Maior tempo de preparo da amostra
– Redução do tamanho celular
– Equipamentos específicos para preparo das lâminas
– Profissional capacitado
HISTOPATOLOGIA
IMUNO-HISTOQUÍMICA
■ Método de identificação de antígenos nos tecidos, utilizando o
princípio da ligação-específica de anticorpos e antígenos.
Imuno-histoquímica IMUNO-HISTOQUÍMICA
Magno, 2014
EMBLOCADO CELULAR CITOLÓGICO
■ Sensibilidade: 70.0%.
■ Especificidade: 100%
IMUNO-HISTOQUÍMICA
■ Sensibilidade: 92.0%.
■ Especificidade: 100% Arquivo pessoal
IMUNO-HISTOQUÍMICA
Réssio; Iglezias, 2018
• Vantagens – Associação da marcação
com arquitetura tecidual
– Aplicação em diferentes tecidos.
– Alta sensibilidade e especificidade
– Distinção das estruturas marcadas
• Desvantagens – Alto custo
– Anticorpos limitados
– Identificação de gênero
– Maior tempo de preparo da amostra
– Equipamentos específicos para preparo das lâminas
– Profissional capacitado para realização e leitura
IMUNO-HISTOQUÍMICA
HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
■ Método de identificação de sequências específicas de
nucleotídeos em células ou cortes histológicos.
HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
Kimura; Nonogaki; Shirata, 2014
■ Sensibilidade: 87,5%.
■ Especificidade: 100%
• Vantagens – Associação da marcação
com arquitetura tecidual
– Aplicação em diferentes tecidos.
– Alta sensibilidade e especificidade
– Identificação de espécie
– Distinção das estruturas marcadas
• Desvantagens – Alto custo
– Maior tempo de preparo da amostra
– Equipamentos específicos para preparo das lâminas
– Profissional capacitado para realização e leitura
HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
TÉCNICAS MOLECULARES
Takahashi; Barrel, 2018
TÉCNICAS MOLECULARES
Paiva-Cavalcanti et al., 2015
FLUXOGRAMA DIAGNÓSTICO Cão sintomático ou assintomático com sorologia reagente (TR-DPP + Elisa) em município indene, sem
histórico de deslocamento para municípios endêmicos
Parasitológico direto (MO, linfonodo, baço e/ou pele) ou imuno-histoquímica
Negativo nos dois testes: realizar novas coletas e
manter vigilância
Positivo em pelo menos um teste
Ausência de Lu. Longipalis(Município não-receptivo e/ou
sem inquérito entomológico)
Presença de Lu. Longipalis(Município receptivo)
Adoção de medidas de controle
Levantamento entomológicoColeta e processamento de amostras para cultura
Negativa
Realizar novas coletas e tentativas
Positiva
Isolamento e caracterização da espécie de Leishmania
Sem isolamento
Realizar novas coletas e
tentativas de isolamento
Isolamento e caracterização de
espécie diferente da L. chagasi
Descartar o caso e rediscutir a
classificação do município e as
ações de controle
Isolamento e caracterização da espécie L. chagasi
Caso confirmado e encerrado. Iniciar ou manter as medidas
de controle
480/2013- CGDT/DEVIT/SVS-MS
AGRADECIMENTOS
SECRETARIA DO ESTADO DA SAÚDE – COORDENADORIA DE CONTROLE DE
DOENÇAS
INSTITUTO ADOLFO LUTZ
Centro de Parastiologia e Micologia
Centro de Patologia
SERVIÇOS DE VIGILÂNCIA DE ÓBITOS
SERVIÇOS MUNICIPAIS DE CONTROLE DE ZOONOSES
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA DA USP
Departamento de Patologia
OBRIGADA !!!!