Download - Parameter Validasi
04/12/23
Parameter Validasi Unjuk Kerja Metode
• Konfirmasi identitas, selektifitas, spesifisitas
• Sensitivitas
• Limit deteksi dan Limit kuantitasi
• Daerah linier pengukuran (linieritas)
• Daerah kerja
• Repeatability dan Reproducibility
• Akurasi (ketepatan, accuracy) dan Kebenaran (trueness); Perolehan kembali (recovery)
• Ruggedness/Robust-ness metode
• Ketidakpastian (uncertainty)
04/12/23
1. Konfirmasi Identitas :
• Meyakinkan bahwa isyarat yang dihasilkan pada pengukuran hanya berasal dari analit bukan berasal dari senyawa lain atau
• bukan merupakan campuran isyarat dari analit + senyawa lain yang mempunyai sifat fisika/kimia serupa dengan analit yang ditetapkan
04/12/23
Spesifisitas & Selektivitas
• Metode yang spesifik adalah metode yang memberikan respon terhadap satu komponen tunggal
• Metode selektif adalah metode yang memberikan respon untuk sejumlah komponen yang dapat atau tidak dapat dibedakan satu sama lain
04/12/23
Spesifisitas dan selektivitas :
• Spesifisitas berarti prosedur mampu mengukur analit yang dinginkan dengan akurat tanpa terganggu oleh komponen matriks dalam sampel
• Selektivitas; yang mengukur sejauh mana zat lain bisa mengganggu pengujian analit x atau sejauh mana metode mampu menguji analit x dalam campuran tanpa mengalami gangguan zat lain dalam campuran
04/12/23
Senyawa pengganggu dapat menghambat konfirmasi melalui cara :
• Mendistorsi isyarat yang timbul dari analit• Memperbesar konsentrasi analit karena turut
memberikan kontribusinya pada isyarat analit• Memperkecil konsentrasi analit karena
memberikan kontribusinya berupa isyarat negatif• Mempengaruhi kemiringan kurva kalibrasi• Tidak efektifnya tahap isolasi (pemurnian analit
dalam sampel)
04/12/23
Spesifisitas (spesificity) :
• Kemampuan metode itu dalam mendeteksi hanya satu senyawa dalam contoh yang dianalisis, meskipun matriks contoh tersebut sangat kompleks
• Lakukan analisis blanko dan contoh yang telah diketahui kandungan analitnya.
04/12/23
04/12/23
Selektivitas :• Metode dapat memberikan respon terhadap beberapa
kandungan kimia yang bisa atau tidak bisa dibedakan satu sama lain atau;
• Menunjukkan derajat bebasnya metode analisis dari spesies atau konstituen lain dalam matriks contoh, karena tidak ada metode analisis yang betul-betul bebas dari pengaruh spesies atau konstituen lain, maka perlu diambil langkah-langkah untuk memperkecil pengaruh dari pengganggu tersebut.
• Jika respon dapat dibedakan dari respon yang lain, maka metode dikatakan selektif.
• Kemampuan metode untuk mengukur secara tepat analit dengan adanya interferensi
Ilustrasi Selektivitas :Dalam contoh/sampel terdapat analit A, spesies B dan C yang
perpotensi mengganggu pengukuran A.. Bila cA ; cB ; dan cC menyatakan konsentrasi masing-masing spesies, serta mA; mAB ; mC adalah slope (sensitivitas kalibrasi), maka respon (signal)- total yang diberikan instrumen sebagai berikut :Y = S Total = mAcA + mBcB + mCcC + Sblanko
Koefisien selektifitas (k) dinyatakan dengan persamaan sbb ;Spesies B : kB.A = mB/mA ; mB = kB..A .mA
Spesies C : kC.A = mC/mA ; mC = kC.A .mA
S Total = mAcA + kB..A .mA cB + kC.A .mA cC + Sblanko
STotal = mA(cA + kB..A .cB + kC.A .cC )+ Sblanko
jika k = 0 , maka spesies lain tidak mengganggujika k ≥ 1 , maka spesies lain mengganggukoefisien selektifitas harganya negatif, bila gangguan spesies lain menyebabkan pengurangan dalam intensitas signal yang berasal dari analit.
04/12/23
2. Sensitivitas /kepekaan Metode Analisis:• Menunjukkan kemampuan dari metode atau instrumen
dalam membedakan konsentrasi-konsentrasi suatu anali yang perbedaannya kecil.
• Ukuran kualitas metode yang menggambarkan kemampuannya untuk mendeteksi adanya suatu komponen (analit) dalam contoh yang dianalisis
• Ratio antara perubahan respons alat ukur terhadap perubahan konsentrasi analit yang diukur.
• Sensitivitas dibedakan menjadi :
- sensitivitas kalibrasi (IUPAC) adalah Slope = m dari kurva kalibrasi pada konsentrasi yang diinginkan.
- sensitivitas analitik; merupakan nilai yang tergantung pada simpangan baku hasil analisis tidak
tergantung pada satuan signal atau respon alat.
Sensitivitas Kalibrasi :• Sensitivitas kalibrasi (IUPAC) adalah Slope = m dari
kurva kalibrasi pada konsentrasi yang diinginkan
S = mc + Sbl
• Bila grafiknya linier dan memiliki persamaan y = bx + a, maka sensitivitasnya adalah b = (y-a)/x
• Bila a = 0 (grafik melewati titik nol, maka sensitivitasnya b = y/x atau respons alat ukur dibagi dengan konsentrasi analit
04/12/23
Ilustrasi :
04/12/23
Sensitivitas Analitik :• Sensitivitas analitik ; nilainya tergantung pada simpangan
baku hasil-hasil analisis, tetapi tidak tergantung pada satuan signal atau respon alat dan tidak peka terhadap faktor-faktor pembesaran.
• Sensitivitas analitik : ժժ = m/SD(Signal)
Keterangan :
m = slope = sensitivitas kalibrasi
SD(Signal) = simpangan baku signal
04/12/23
Ilustrasi : Sensitivitas analitik tidak peka terhadap faktor pembesar dapat ditunjukkan dengan hasil berikut ini :
04/12/23
Karena peningkatan nilai Sensitivitas kalibrasi (m), diikuti dengan peningkatan nilai simpangan baku signal dengan faktor 2x, maka nilai sensitivitas analitik tetap.
Ilustrasi : Penetapan analit – A dalam air dengan instrumen diperoleh data sebagai berikut :
04/12/23
Prosedur Kerja SensitivitasLangkah – langkah:
• Pilih larutan standar yang nilai konsentrasinya berada di daerah tengah kurva kalibrasi (daerah linier pengukuran)
• ukur serapan-masuknya (absorbans) sebanyak 10 kali
• Hitung absorbansi rata-rata dan menghitung nilai sensitifitasnya dengan menggunakan rumus berikut:
• Bandingkan dengan sensitivitas yang ada pada manual book batas keberterimaan sensitifitas adalah sensitifitas hasil percobaan harus lebih kecil sama dengan 1,25 sensitivitas yang ada pada manual book
04/12/23
3. LIMIT DETEKSI• Limit deteksi (LD) menurut Greenberg, A.E dkk adalah
konsentrasi terendah dari analit yang dapat dideteksi diatas noise atau blangko dalam suatu prosedur analisis untuk confidence limit tertentu. Confidence limit perlu ditentukan agar kesalahan deteksi dan tidak terdeteksi peluangnya kecil yaitu maksimum 5%.
• Menurut Greenberg, A.E dkk , beberapa istilah yang digunakan untuk menyatakan Limit deteksi khusus sbb :- IDL (Instrument Detection Limit)- LLD (Lower Limit of Detection)- MDL (Method Detection Limit)- LOQ (Limit of Quantitation)
Seringkali IDL digunakan sebagai pedoman untuk menetapkan MDL. Hubungan antara Limit-Limit tersebut seperti berikut :
IDL : LLD : MDL : LOQ = 1 : 2 : 4 : 10
04/12/23
Limit deteksi analisis untuk analisis kualitatif :
• Ukur blanko yang ditambahi analit dengan berbagai konsentrasi yang berbeda, dimana untuk masing-masing konsentrasi 10 buah, semua diukur @ 1 kali
• Tentukan tingkat konsentrasi di bawah mana identifikasi analit menjadi kurang andal
04/12/23
LOD untuk analisis kualitatif
• Kons analit Replikasi Hasil +/- (mg/L) analisis
200 10 10/0 100 10 10/0 75 10 5/5 50 10 1/9 25 10 0/10
Di bawah konsentrasi 100 mg/L identifikasi yang positif menjadi kurang andal
04/12/23
Instrument Detection Limit
• Sinyal terkecil yang dapat diukur secara kuantitatif
• Ditentukan untuk setiap analit dengan analisis replikat
• Konsentrasi analit yang menghasilkan signal yang setara dengan 3 kali standar deviasi (n=10) dari pengukuran blanko pereaksi
• Jika blanko menghasilkan signal : IDL = μ + 3SD• μ = nilai rata-rata pembacaan dari blanko pereaksi
yang sama
04/12/23
0.25 ppb mix 15.1
7.00 8.00 9.00Time50
100
%
010115_19 Sm (SG, 2x2) 2: MRM of 5 Channels ES+ 262.12 > 160.02
654Area
8.1129
0.25 ppb mix 15.1
1.50 2.00 2.50 3.00 3.50Time67
100
%
010115_19 Sm (SG, 2x2) 1: MRM of 6 Channels ES+ 358.08 > 95.91
523Area
2.1014
3.2911
0.25 ng/mL std
0.5 ng/mL std0.5 ppb mix 15.1
1.50 2.00 2.50 3.00 3.50Time61
100
%
010115_16 Sm (SG, 2x3) 1: MRM of 6 Channels ES+ 358.08 > 95.91
541Area
2.1426
DanofloxacinOxolinic Acid
Instrument Detection Limit
IDL 0.24 ng/mL) IDL 0.30 ng/mL)
0.5 ppb mix 15.1
7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50Time37
100
%
010115_16 Sm (SG, 2x2) 2: MRM of 5 Channels ES+ 262.12 > 160.02
845Area
8.1137
04/12/23
• Jika blanko tidak menghasilkan signal dan standar deviasi 10 kali pengukuran blanko yang sama nol, maka IDL diukur menggunakan suatu standar
• Konentrasi analit yang menghasilkan signal yang setara dengan 3 kali standar deviasi dari signal terendah yang dapat diukur dari analit
04/12/23
Cara Pengukuran :
• Yang diuji : 10 blanko contoh yang berbeda diukur @ 1 kali 10 blanko contoh ditambah (spiked) analit
berkonsentrasi rendah diukur @ 1 kali
• Yang dihitung : Standar deviasi
LOD = (konsentrasi analit yang sesuai dengan nilai rata-rata) + 3 SD
04/12/23
Limit Kuantitasi/perhitungan (LOQ), Limit of determination, Limit of Reporting/pelaporan (LOR) :• Konsentrasi terendah analit yang dapat ditentukan dengan
akurasi yang bisa diterima• Ada konvensi yang menyatakan bahwa LOQ = blanko
contoh + 5 sd (atau 6 sd atau 10 sd)• Batas terendah dari working range metode• Nilai SD juga menyatakan ripitabilatas untuk konsentrasi
analit yang bersangkutan analit• 10 blanko contoh yang berbeda diukur @ 1 kali• Hitung standar deviasi blanko contoh• LOD = konsentrasi analit yang sesuai dengan nilai rata-
rata blanko contoh + 5 SD (atau 6SD atau 10 SD)
04/12/23
Method Detection Limit (MDL) Konsentrasi terkecil analit yang diinginkan setelah melalui metode
analisis secara lengkap. Nilainya akan lebih besar dari limit deteksi terendah
Konsentrasi terbaik dari analit yang dapat dideteksi atau dapat menghasilkan respon yang nyata dibanding blanko
Tergantung matriks Dinyatakan untuk masing-masing matrik Analisis replikat dari 7 sampel yang dispike pada satu konsentrasi
tertentu. Konsentrasi standar spike kira-kira sama dengan 5 kali IDL dibagi faktor konsentrasi metode
MDL = rata-rata konsentrasi blanko + (t x SDsampel)
04/12/23
Linieritas
• Kemampuan suatu metode analisis untuk menghasilkan hasil yang proposional dengan konsentrai analit dalam contoh pada kisaran yang ada.
• Mengetahui kemampuan standar dalam mendeteksi analit dalam contoh
04/12/23
• Uji ini dilakukan dengan suatu seri larutan baku yang terdiri dari minimal 5 konsentrasi yang menaik dengan rentang 50 – 100% dari rentang komponen uji
• Diharapkan respon liner terhadap konsentrasi larutan baku dengan nilai koefisien korelasi mendekati 1,00
04/12/23
Working range dan linear range
• Rentang kerja suatu metode analisis adalah interval antara konsentrasi tinggi dan rendah yang telah dianalisis/diuji dengan presisi, akurasi dan linieritas dengan menggunakan kondisi metode yang dievaluasi
• Dalam analisis kuantitatif dimulai dari LOQ (batas terbawah) dan batass respon alat (batas tertinggi)
• Di dalam batas rentang kerja ini ada linear range : bagian yang linier dapat diamati secara visual
04/12/23
• Distribusi yang random dari garis lurus merupakan konfirmasi linieritas
• Trend yang sistematik menunjukkan non linearitas
04/12/23
Analisis 1
• Blanko + bahan acuan atau blanko contoh yang kedalamnya ditambahkan analit dengan berbagai konsentrasi berbeda. Diperlukan sedikitnya 6 konsentrasi + blanko
• Pengulangan 1 x
• Plot respon pengukuran (sumbu y) terhadap konsentrasi yang diukur (sumbu x)
• Amati secara visual dan identifikasi daerah pengukuran yang linier batas atas bawah dari daerah kerja
• Dari pengerjaan ini akan didapat konfirmasi visual apakah daerah kerja itu linier atau tidak
04/12/23
Analisis 2
• Bahan acuan atau blanko contoh yang kedalamnya ditambahkan analit pada sekurang-kurangnya 6 konsentrasi berbeda pada daerah kerja yang linier
• Pengulangan 3X
• Plot respon pengukuran (sumbu y) terhadap konsentrasi (sumbu x). Secara visual amati outlier yang tidak tergambarkan pada regresi
• Hitung koefisien regresi. Hitung dan plot reside value (perbedaan antara nilai yang sebenarnya dengan nilai yang diprediksi oleh garis lurus untuk setiap harga x
• Tahap ini diperlukan untuk menguji daerah kerja yang linier dan pada daerah mana dapat digunakan kalibrasi titik tunggal
04/12/23
Presisi :
• Kedekatan atau kesesuaian antara hasil uji dengan lainnya pada serangkaian pengujian
• Teliti ----- perbedaan hasil uji satu dengan yang lainnya sangat kecil
• Mengukur sebaran serangkaian hasil uji• Menerangkan bagaimana anggota kelompok
menyebar diantara nilai yang benar• Dipengaruhi oleh kesalahan acak: ketidakstabilan
instrumen, variasi suhu/pereaksi, keragaman teknik, operator yang berbeda
04/12/23
Presisi :
• Kedekatan beberapa nilai pengukuran dari sampel yang homogen pada kondisi normal (sampel yang sama dan diuji secara berurutan)
• Terbagi : Repeatability, intermediate precision dan reproducibility
04/12/23
Repeatability/ripitabilitas:
• Within lab.precision
• Melihat konsistensi analis, tingkat kesulitan metode, kesesuaian metode dan contoh uji.
• Presisi yang mengukur keragaman nilai hasil uji yang dilakukan pada kondisi operator, alat, sample, lab yang sama dalam interval pemeriksaan waktu yang singkat
04/12/23
Intermediate Precision/Presisi antara (Rw):• Memastikan bahwa dalam laboratorium yang sama metode
akan menyediakan hasil yang sama • Untuk mengevaluasi kinerja operator, mengetahui dan
meningkatkan mutu lab dan mengetahui tingkat kesulitan metode
• Variasi pengukuran dengan waktu yang lebih lama dan ditentukan dengan membandingkan hasil antara metode yang dilakukan di lab.yang sama
• Hasil presisi dengan cara mengulang pemeriksaan dengan menggunakan alat yang berbeda, operator yang berbeda, hari yang berbeda, standar dan pereaksi dari suplier berbeda atau kombinasi di atas pada lab yang sama
04/12/23
Reproducibility/reprodusibilitas:
• Between lab precision• Memastikan bahwa metode menyediakan hasil
yang sama di lab. yang berbeda• Mengetahui kehandalan/kinerja lab• Presisi yang mengukur keragaman nilai hasil uji
dari sampel yang sama pada kondisi operator, peralatan, lab dan waktu yang berbeda
• Validasi reprodusibilitas penting dilakukan jika metode akan digunakan di lab yang berbeda
04/12/23
Faktor yang mempengaruhi Reprodusibilitas
• Perbedaan suhu kamar dan kelembaban• Operator dengan pengalaman dan
pengetahuan berbeda• Peralatan dengan karakteristik berbeda• Variasi bahan dan kondisi instrumen• Umur pakai alat yang berbeda• Pelarut, pereaksi dan bahan lain dengan
mutu berbeda
04/12/23
Pengukuran
• Yang diuji : standar , reference material, atau blanko
contoh yang ditambah analit dengan berbagai konsentrasi
• Analisis 10 x • Yang dihitung : hitung standar deviasi standar (SD) pada
masing-masing konsentrasi, lalu RSD
04/12/23
Akurasi :
• Menunjukkan kedekatan antara hasil percobaan dengan nilai sebenarnya (true value)
• Mengukur kesesuaian antara hasil dan nilai sebenarnya
• Menggambarkan kesalahan sistematis
04/12/23
Asesmen akurasi hasil analisis
• Hasil analisis harus dibandingkan dengan nilai sebenarnya• Dalam praktek, CRM memiliki nilai yang tertelusur ke SI
dan dapat dijadikan sebagai nilai acuan (refrence value) untuk nilai yang sebenarnya
• Syarat CRM yang digunakan : matriks cocok dengan contoh uji (memiliki komposisi matriks yang mirip matriks contoh uji)
• Bagaimana bila CRM tidak tersedia ? : Gunakan bahan yang mirip contoh uji, yang diperkaya (spiked) dengan analit yang kemurniannya tinggi, lalu diuji % recoverynya
04/12/23
Pendekatan :
• Menganalisis contoh yang sudah diketahui konsentrasinya lalu dibandingkan nilai yang terukur dengan nilai yang sebenarnya
• Membandingkan hasil tes dari metode baru dengan hasil metode alternatif yang sudah ada dan diketahui bahwa metode tersebut akurat
• Menambahkan analit ke dalam matriks blanko yang kemudian diukur % recovery
• Adisi standar yang dapat menentukan % recovery dari analit yang ditambahkan
04/12/23
Bias Metode:
• Yang diuji :
blanko reagen dan CRM masing-masing dianalisis 10 kali memakai metode yang divalidasi
• Yang dihitung :
Hasil rata-rata CRM dikoreksi hasil rata-rata blanko reagen
Bias penyimpangan metode :
hasil rata-rata CRM – nilai sertifikat
04/12/23
Trueness dan Bias
• Trueness (akurasi rata-rata) : kedekatan antara nilai rata-rata yang diperoleh dari serangkaian hasil pengujian dengan nilai acuan
• Adanya penyimpangan nilai rata-rata hasil pengukuran dari nilai sebenarnya disebabkan adanya bias
• Bias : perbedaan hasil analisis rata-rata dengan nilai acuan
04/12/23
Prosedur:
• Diperiksa larutan standar dengan konsentrasi tertentu sebanyak 7 x ( A)
• Diperiksa larutan standar dengan konsentrasi tertentu + placebo sebanyak 7 x (B)
• Nilai rata-rata, SD, RSD• Bias : A – B x 100 %
A
Nilai keberterimaan : bias -2.0 % s.d + 2,0 %
04/12/23
Data Reliability -
Accuracy versus Precision
Data Reliability -
Accuracy versus Precision
accuracy precision accuracy &precision
04/12/23
13
12
10
8
7
3SD
2SD
Mean
2SD3SD
Control chart of laboratory control samples analysed over a period of time
Rules for control chartsMethod is “out of control” if:(a) one point lies outside 3 from mean(b) two consecutive points lie outside 2(c) seven consecutive points are ascending or descending
CONTROL CHARTS
04/12/23
04/12/23
Uji Recovery
• Analit yang terkait dalam matriks contoh harus dilarutkan/diekstraksi/dibebaskan sebelum dapat diukur
• Agar hasil pengujian akurat maka efisiensi pelarutan/ekstraksi harus 100%
• Analit tidak boleh hilang selama proses• Uji ini dilaukan dengan mengerjakan pengujian
atas contoh yang diperkaya (spike) dengan sejumlah kuantitatif analit yang akan ditetapkan
04/12/23
Cara Pengukuran :
• Mula-mula contoh diuji dan hasil pengujian = C2
• Kepada contoh yang sama ditambahkan (spiking) sejumlah analit yang diketahui banyaknya, misalnya konsentrasi = C3, lalu dilakukan pengujian dengan hasil C1
• Analit yang diperoleh kembali = (C1 – C2) dari banyaknya yang ditambahkan (C3)
• Nilai perolehan kembali (%) = C1 – C2 x 100 C3
• Apabila dalam pengujian ini tidak ada kesalahan sistematik maka recovery tidak akan berbeda secara signifikan dari 100%
04/12/23
Ruggedness/Robustness metode :• Ukuran bagi suatu metode analisis dalam mempertahankan unjuk kerjanya dalam situasi
dimana pengaturan kondisi analisis tidak sesempurna seperti yang ditetapkan dalam metode yang bersangkutan
• Dalam metode analisis ada tahap-tahap kritis dimana bila tidak dikerjakan secara hati-hati akan menimbulkan kesalahan yang besar
• Dilakukan dengan memvariasikan kondisi analisis sedemikian rupa dan mengukur pengaruhnya terhadap presisi dan akurasi yang dicapai. Setiap perubahan kondisi dilakukan 2 kali analisis saja
• Membantu dalam mengantisipasi dan mengeliminasi sumber kesalahan yang mungkin
• Mendemonstrasikan bahwa metode stabil terhadap perubahan kondisi metode yang kecil
• Plackett Burman Method Design
04/12/23
• Ketahanan suatu metode terhadap perubahan kecil dari kondisi pada prosedur, misalnya :stabilitas larutan analit, waktu ekstraksi, perbedaan kolom, perubahan temperatur
04/12/23
Validasi metode bermanfaat untuk menetapkan :Instrumen :• IDL untuk semua analit• Ripitabilitas instrumen• Sensitivitas instrumen : linieritas (atau
sensitivitas) standar • Rentang kalibrasi instrumen• Presisi : ripitabilitas standar atau
reprodusibilitas standar
04/12/23
Metode :• MDL untuk semua analit dalam semua
matriks• Akurasi• Ruggedness atau robustness metode• Presisi dengan operator yang berbeda• Ripitabilitas sampel• Selektivitas atau spesipisitas metode• Ketidakpastian