Jure Stojan
2. predavanje
termodinamične osnove,
encimske katalize
encimska kataliza
časovni potek encimske
reakcije
začetna hitrost
Matjaž Zorko
3. predavanje
vplivi na hitrost encimske
reakcije
vpliv substrata (Michaelisova
kinetika)
ravnotežno - stacionarno
stanje
VPLIV:- koncentracije substrata- koncentracije encima- pH- temperature
FFA: Laboratorijska medicina, Molekularna encimologija, 2010/2011 3.predavanje
kA + B → C
2
*
RT
G
eNh
RTk
∆−
⋅=2
A ↔ BK
Encimska kinetika
• Obravnava hitrost, s katero se spreminjajo reaktanti (substrati S) v produkte (P):
S → P
• Hitrost podaja spremembo koncentracije substrata/produkta v časovni enoti
(mol/s) V = -d(S)/dt = d(P)/dt
• Hitrost encimske reakcije je merilo za aktivnost encima; enote za encimsko
aktivnost: U = 1μmol/min ali katal (SI sistem) = 1mol/s
• Specifična aktivnost encimskega pripravka: aktivnost/mg proteina; enote za
specifično aktivnost: μmol/min/mg ali katal/min/mg
A B
•Masa proteinov (vse kroglice) je večja v čaši A kot v čaši B•Št. molekul encima (rdeče kroglice) je enako v obeh čašah – encimska aktivnost enaka v obeh čašah•Encimska aktivnost, izražena na mg proteinov (specifična aktivnost) je večja v čaši B kot v čaši A
Začetna hitrost in vpliv koncentracije substrata
S → P
v = ∆(P)/∆t
Koncentracija substrata se s časom zmanjšuje, zato se zmanjšuje tudi hitrost! → začetna hitrost (vo)……je hitrost pri t = 0
S4 > S3 > S2 > S1
V0=k[S]1
1. order reaction
V0=k[S]0
0. order reaction
Če so nanašali vo v diagram v odvisnosti od [S], so dobili krivuljo nasičenja
Krivulja nasičenja ���� nasičenje E s S
E
ES
S
][][
][
][
]][[
S
K
ES
EK
ES
SE S
s =→=
Henry (1903) in kasneje Michaelis in Mentenova (1913) so skušali na osnovi ravnotežja najti enačbo za popis eksperimentalno dobljene krivulje.
Pogoj: k2 mora biti zelo majhna (k2<<k-1)!
][]][[ 11 ESkSEk −= �sK
k
k
ES
SE== −
1
1
][
]][[
Ks je disociacijska konstanta kompleksa ES – substratna konstanta!
sKES
SE=
][
]][[
KAJ SKUŠAMO NAREDITI:1. IZRAZITI [ES], ker vo=k2[ES]2.VPELJATI [Eo], ker je to merljiva količina!
[E] = [Eo] – [ES]
sKES
SESEo=
−
][
]])[[]([�
sKS
SEoES
+=
][
]][[][
sKS
SEoES
+=
][
]][[][
vo=k2[ES]upoštevamo:
sKS
SEokESk
+=
][
]][[][ 2
2pomnožimo s k2
s
oKS
SEokv
+=
][
]][[2
Vmax=k2[Eo]upoštevamo:s
oKS
SVv
+=
][
][max
[So]>>[Eo]upoštevamo:
zato je [S] = [So]
,in
so
oo
KS
SVv
+=
][
][max
so
oo
KS
SVv
+=
][
][max
1
1
k
kKS
−=
je Michaelis-Mentenova enačba
POZOR: (E) = konst.!
Ker pogoj ravnotežja ni bil v celoti izpolnjen, enačba ni imela splošne veljave – veljala je le za omejeno količino encimov!
Zato so iskali splošno rešitev. Briggs-Haldanov pristop:
STACIONARNO STANJE!
OPIŠI RAZLIKO MED RAVNOTEŽNIM IN STACIONARNIM STANJEM!
RAVNOTEŽNO STANJEZAČETNO STANJE
Višini vode v ‘sodih’ sta odvisni od dotoka in iztoka ter debeline prehodne cevi; pri konstantnem dotoku in iztoku se višini ne spreminjata: STACIONARNO STANJE
[S]o
E+S
E+P
ES
Če je koncentracija ES stalna, mora [ES] enako hitro nastajati kot razpadati!
)]([][][]][[ 21211 kkESESkESkSEk +=+= −−
MKk
kk
ES
SE=
+= −
1
21
][
]][[
Mo
oo
KS
SVv
+=
][
][max
Podobno kot M.- M. dobimo analogno enačbo, ki pa velja za STACIONARNO STANJE, takorekoč splošno:
nastajanje ES razpadanje ES razpadanje ES
)]([]][[ 211 kkESSEk += −
Pag
e 47
9
[ ][ ]SK
SVv
M
o+
⋅= max
Michaelis–Mentenova enačba in krivulja
1
21
k
kkKM
+= −
Dvojno recipročni (Lineweaver–Burkov) diagramP
age
480
[ ] maxmax
111
VSV
K
v
M
o
+⋅=
0.2 21
Mo
oo
KS
SVv
+=
][
][max
KDAJ Michaelis-Mentenova ENAČBA VELJA:
1. KADAR SMO V RAZMERAH ZAČETNE HITROSTI
2. KADAR JE [S]>>[E]
3. KADAR IMAMO LE EN AKTIVNI CENTER ali
4. KADAR JE AKTIVNIH CENTROV VEČ, A SO NEODVISNI
PRI KONSTRUKCIJI M.-M. KRIVULJE ALI NJENIH DERIVATOV (L.-B. KRIVULJA) MORAMO DRŽATI [E]O KONSTANTNO!
Pomen Km
• Vmax , Km določimo eksperimentalno
• Km - odraža afiniteto encima do substrata
- in tudi fiziološke razmere:
Km ≈ [S]physiol.
≈ = KS
≈
POMNI: - velika Km ���� majhna afiniteta encima do substrata
- majhna Km ���� velika afiniteta encima do substrata
KM - odraža afiniteto encima do substrata in nam pove pri katerih koncentracijah substrata bo encim učinkovit!
Pomen KM v fiziologiji
primer: občutljivost Azijcev na alkohol
• Japonci in Kitajci dosežejo isti učinek alkohola (vazodilatacija, pospešen ritem
srca...) že pri nižji koncentraciji zaužitega alkohola kot Evropejci
• Reakcije razgradnje alkohola
CH3CH2OH + NAD+ → CH3CHO + H+ + NADH encim: alkoholna
dehidrogenaza
CH3CHO + NAD+ → CH3COOH + H+ + NADH encim: aldehidna
dehidrogenaza
• Azijci nimajo izoencimske oblike encima aldehidne dehidrogenaze
z nizko KM ; posledica: aldehid v krvi dolgo kroži po telesu
Izoemcimi: katalizirajo isto reakcijo (isti substrat), različne pa so molekulske lastnosti
encimov: različna molekulska masa (Mr), različna encimska aktivnost (V0), različna
MM konstanta (Km); izoencime kodirajo različni geni!
kkat
• kkat = k najpočasnejše stopnje v desno!
• kkat - pretvorbeno število (turnover number):
število molekul (molov) substrata, ki se pretvori
v produkt na eni molekuli (molu) encima v
časovni enoti (navadno sekundi).
Kinetična učinkovitost encimov: pretvorbeno število (turnover
number), kkat
Zakaj za mero učinkovitosti encima ne uporabljamo Vmax? Ker je odvisna od koncentracije encima, saj velja enačba:
Vmax=k2[E]o
kkat/Km
vo=kkat[ES]
Vmax=kkat[E]o
1
1
k
kkK kat
M
+= − Kadar je k2 = kkat!
Mo
oo
KS
SVv
+=
][
][max
A B P Q
E EA EAB EPQ EQ E
E
QB P
E
EQEA
A
AB
EBEABEPQ
EP
Q P
-
A
EA FA F FB EQ E
P B Q
E - -
urejen sekvenčni mehanizem:
naključni sekvenčni mehanizem:
ping-pong mehanizem:
Bisubstratne reakcije:
Zelo različni mehanizmi!
A A
A
B
B
B
E
A A
A
B
B
B
E
Ping Pong mehanizem [B] = konstanten.
Ping Pong mehanizem [A] = konstanten.
Vsi sekvenčni mehanizmi imajo dvojne
recipročne diagrame, kjer se premice sekajo.
Vpliv koncentracije encima na aktivnost.
Dokler velja [S] >> [E] se s povečanjem [E]
proporcionalno poveča [ES].
Ker velja enačba vo= kkat[ES], velja linearna zveza med vo
in [E]: če se [E] dvakrat poveča, se tudi vo dvakrat poveča.
vo
[E]
Vpliv pH na aktivnost encima (fumaraza).
Zelo različne krivulje za
različne encime,
navadno so v skladu s
fiziološkim delovanjem
pH profil peptidaze – pomen skupin v
aktivnem mestu encima in v substratu
pKa!
KAJ PA POMEN SKUPIN DRUGJE V STRUKTURI ENCIMA?
Različni encimi – različni pH profili(zaradi različnih disociabilnih skupin v encimu in substratu)
pepsin glukoza-6-fosfataza
Učinek pH je lahko kompleksen –npr. kimotripsin
Cumulative pH effect
pH affects kcat pH affects KM
M
cat
K
kv ∝
pH optimum 17β-HSD
Krivulji temperaturne in pH odvisnosti sta si podobni
2
*
RT
G
eNh
RTk
∆−
⋅=
vo=k2[ES]
T narašča do Topt: več in močnejši trki, zato hitrost narašča!
ToptpHopt
T narašča nad Topt: encim se denaturira, zato hitrost pada!
Razpad IV., III. in II. strukture encima, zato encim ni več aktiven!
Navidezni temperaturni optimum 17β-HSD
Temperaturna stabilnost 17β-HSD
Jure Stojan
4. predavanje
Inhibicija - aktivacija -
modulacija encimske
katalize
hitre kinetične metode
matematično modeliranje -
analiza podatkov
Matjaž Zorko
3. predavanje
vplivi na hitrost encimske
reakcije
vpliv substrata (Michaelisova
kinetika)
ravnotežno - stacionarno stanje
VPLIV:
- koncentracije substrata
- koncentracije encima
- pH
- temperature