Morphologische und entwicklungsgenetische Studien zur
Blattentwicklung und Blattevolution bei Gymnospermen
am Beispiel Sciadopitys verticillata (THUNB.) SIEBOLD & ZUCC.
Dissertation
zur Erlangung des Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Biologie und Biotechnologie
der Ruhr-Universität Bochum
angefertigt im
Lehrstuhl für Evolution und Biodiversität der Pflanzen
vorgelegt von
Diplom-Biologin
Nicole Hille
aus
Dortmund
Bochum 2008
Referent: Prof. Dr. Th. Stützel
Korreferent: Prof. Dr. R. Tollrian
„Das Gras wächst nicht schneller
wenn man daran zieht.“
Afrikanisches Sprichwort
√
für meine Eltern
INHALTSVERZEICHNIS
i
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS ............................................................................................ i ABBILDUNGSVERZEICHNIS ..................................................................................... iv ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .................................................................................... vi 1 EINLEITUNG ...................................................................................................... 1
1.1 Der pflanzliche Bauplan ........................................................................................................ 1
1.1.1 Das Meristem ............................................................................................................... 1
1.1.2 Blätter & Kurztriebe ..................................................................................................... 3
1.1.3 Ausgangspunkt: Doppelnadel-Problematik ................................................................ 4
1.2 Entwicklungsgenetische Lösungsansätze ............................................................................ 8
1.2.1 Pflanzliche Knox-Gene ................................................................................................ 10
1.2.2 Knox-Expression & der pflanzliche Bauplan ............................................................... 13
1.3 in-situ-Hybridisierung ............................................................................................................ 16 1.4 Ziel der Arbeit ....................................................................................................................... 17
2 MATERIAL & METHODEN ..................................................................................... 19
2.1 Pflanzenmaterial .................................................................................................................... 19
2.1.1 Materialsammlung ....................................................................................................... 19
2.1.2 Anzucht der Keimlinge ................................................................................................ 20
2.2 Morphologisch-anatomische Methoden ............................................................................... 20
2.2.1 Fixierung ...................................................................................................................... 20
2.2.2 Mikrotomtechnik .......................................................................................................... 20
2.2.3 Rasterelektropnenmikroskopie (REM) ......................................................................... 23
2.3 Molekulargenetische Methoden ........................................................................................... 24
2.3.1 Allgemeines . ................................................................................................................ 24
2.3.1.1 Primerdesign ................................................................................................... 24
2.3.1.2 Sequenzanalyse .............................................................................................. 24
2.3.2 Material für Molekulargenetische Methoden ............................................................... 24 2.3.2.1 Oligonukleotide ............................................................................................... 26
2.3.2.2 Plasmide ......................................................................................................... 27
2.3.2.3 Bakterienstämme ............................................................................................ 27
2.3.2.4 Kits .................................................................................................................. 28
2.3.2.5 Lösungen......................................................................................................... 28
2.3.3 Isolierung von RNA & DNA aus Pflanzen .................................................................... 29
2.3.4 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren .......................................................... 30
INHALTSVERZEICHNIS
ii
2.3.5 cDNA-Synthese ........................................................................................................... 30
2.3.6 PCR - Amplifikation von DNA-Fragmenten .................................................................. 31
2.3.7 Agarose-Gelelektrophorese ......................................................................................... 32
2.3.8 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen .................................................. 32
2.3.9 Ligation von DNA-Fragmenten..................................................................................... 32
2.3.10 Kultivierung von E. coli .............................................................................................. 33
2.3.11 Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli.................................................................. 34
2.3.12 Verdau von DNA mittels Restriktionsendonukleasen................................................. 34
2.3.13 DNA-Fällung (Phenolextraktion)................................................................................. 34
2.3.14 in-vitro-Transkription: Herstellung Digoxigenin-markierter RNA-Sonden .................. 35
2.3.15 Expressionsnachweis im Gewebe – in-situ-Hybridisierung ...................................... 36
2.3.15.1 Fixieren & Schneiden des Gewebes ............................................................. 37
2.3.15.2 Prähybridisierung .................... .................................................................... 38
2.3.15.3 Hybridisierung .............................................................................................. 40
2.3.15.4 Waschen nach der Hybridisierung................................................................ 41
2.3.15.5 Detektion des Signals ................................................................................... 41
2.3.15.6 Reaktionsstop ................................................................................................ 42
2.3.16 Heterologe Expression in E. coli ............................................................................... 42
2.4 Dokumentation ...................................................................................................................... 43
2.4.1 Mikroskopie & Bilderfassung ....................................................................................... 43
2.4.2 Digitalfotografie ........................................................................................................... 44
2.4.3 Bildbearbeitung ........................................................................................................... 44
3 ERGEBNISSE ..................................................................................................... 45
3.1 Morphologisch-anatomische Ausgangsbasis ...................................................................... 45
3.1.1 Morphogenese ............................................................................................................ 45 3.1.1.1 Sciadopitys verticillata - Kladodienentwicklung ............................................. 45
3.1.1.2 Abies homolepis - Nadelentwicklung ............................................................. 47
3.1.2 Leitbündelanschluss ................................................................................................... 49 3.1.2.1 Sciadopitys verticillata .................................................................................... 49
3.1.2.2 Abies homolepis ............................................................................................. 50
3.1.2.3 Pinus sylvestris ............................................................................................... 51
3.1.2 Anatomie der Sciadopitys-Kladodien ......................................................................... 52
3.1.3 Untersuchungen an Sciadopitys-Keimlingen .............................................................. 53
3.2 Primerdesign ......................................................................................................................... 60
3.3 Vorwort zu Methodenetablierung .......................................................................................... 63
3.3.1 Nukleinsäuregewinnung aus Gymnospermen ............................................................ 63
3.3.2 KNAT1 – Arabidopsis thaliana .................................................................................... 64
3.3.3 HBK1 – Picea abies ..................................................................................................... 67
3.4 Molekulargenetische Ansätze im Sciadopitys-Modell........................................................... 69
3.4.1 Funktionalitätstest mit PhyN1 ...................................................................................... 69
3.4.2 Test zur Synthese von cDNA ....................................................................................... 70
3.4.3 SvKnox – Suche nach Knox-Genen mit degenerierten Primern ................................. 70
INHALTSVERZEICHNIS
iii
3.4.4 Sondenherstellung für SvKnox .................................................................................... 75
3.5 Expressionsnachweis für SvKnox ......................................................................................... 77
3.5.1 in-situ-Hybridisierung – Methodisch ........................................................................... 77
3.5.1.1 Fixieren & Schneiden des Gewebes .............................................................. 78
3.5.1.2 Prähybridisierung ........................................................................................... 80
3.5.1.3 Hybridisierung ................................................................................................ 81
3.5.1.4 Waschschritte ................................................................................................. 82
3.5.1.5 Detektion des Signals ..................................................................................... 82
3.5.1.6 Reaktionsstop ................................................................................................. 84
3.5.2 in-situ-Hybridisierung – Inhaltlich ................................................................................ 84
3.5.2.1 Expression in vegetativen Knospen ............................................................... 85
3.5.2.2 Expression in Blättern ..................................................................................... 88
3.5.3 Heterologe Expression von SvKnox ............................................................................ 91
3.6 Knox-Suche in Phyllocladus trichomanoides ....................................................................... 92
4 DISKUSSION ...................................................................................................... 94
4.1 Morphologische Ausgangssituation ..................................................................................... 94
4.2 Keimlingsentwicklung ........................................................................................................... 99
4.3 Methodenetablierung ............................................................................................................ 100
4.4 Knox & Sciadopitys ............................................................................................................... 101
4.5 Ursprung des Gymnospermenblattes .................................................................................. 105
4.6 Ausblick ................................................................................................................................ 106
5 ZUSAMMENFASSUNG .......................................................................................... 108 6 LITERATURVERZEICHNIS ...................................................................................... 110 7 ANHANG ........................................................................................................... 116
DANKSAGUNG
LEBENSLAUF
ERKLÄRUNG
ABBLIDUNGSVERZEICHNIS
iv
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb. 1: Schematische Darstellung zum pflanzlichen Grundbauplan. ....................... 2
Abb. 2: Schematische Darstellung der Triebdifferenzierung bei Gymnospermen. ... 3
Abb. 3: S. verticillata, Theorien zur Doppelnadel-Problematik. .................................. 4
Abb. 4: S. verticillata, Habitus. ................................................................................... 5
Abb. 5: Morphologische Gegenüberstellung von S. verticillata & A. homolepis. ....... 7
Abb. 6: Thuja plicata, Schematische Darstellung des Sprossquerschnittes. ............ 8
Abb. 7: Schema zur unterschiedlichen Einflussnahme von KNOX-Transkriptions-
faktoren auf die Wachstumsregulierung. ....................................................... 11
Abb. 8: Schematischer Aufbau eines KNOX-Proteins. ............................................... 12
Abb. 9: Schematische Darstellung zum Scheitelmeristem (SAM). ............................. 14
Abb. 10: S. verticillata, Kladodienentwicklung. ............................................................ 46
Abb. 11: S. verticillata, Langtriebachse mit Schuppenblättern. ................................... 47
Abb. 12: A. homolepis, Nadelentwicklung. .................................................................. 48
Abb. 13: S. verticillata, Leitbündelanschluss der Kladodien. ....................................... 49
Abb. 14: A. homolepis, Leitbündelanschluss eines Nadelblattes. ............................... 50
Abb. 15: P. sylvestris, Leitbündelanschluss eines Kurztriebes. ................................... 51
Abb. 16: S. verticillata, Kladodium im Querschnitt. ...................................................... 52
Abb. 17: S. verticillata, reifer Same. ............................................................................. 54
Abb. 18: Keimungsreihe I: Fotodokumentation der Keimungsreihe K4. ...................... 56
Abb. 19: Keimungsreihe II: Schema & Lichtmikroskopische Aufnahmen (K4). ........... 57
Abb. 20: Keimungsreihe III: Fotodokumentation älterer Keimlinge aus K2. ................. 58
Abb. 21: Mikroskopische Aufnahmen zur Anlage der Primordien am Vegetations-
kegel. ............................................................................................................. 59
Abb. 22: Aminosäurenalignment zu Knox-Gensequenzen der Klasse 1. .................... 62
Abb. 23: A. thaliana, cDNA-Synthese von KNAT1 & Klonierungskontrolle durch
Restriktion. ..................................................................................................... 65
Abb. 24: A. thaliana, Primertest mit KNAT1-Fragment. ................................................ 66
Abb. 25: P. abies, Schema zum Primertest für dP-SvKnox und HBK1-Teilfragment. .. 68
Abb. 26: P. abies, Restriktionskontrolle für 359 bp-Insert. ........................................... 68
Abb. 27: S. verticillata, Primertest mit PhyN1-Fragment (579 bp) & Kontrolle der
cDNA-Synthese. ............................................................................................. 69
Abb. 28: S. verticillata, cDNA-Synthese mit dP-SvKnox & Klonierungskontrolle. ........ 71
Abb. 29: Schema der ermittelten Sciadopitys-Sequenz im Vergleich zur KNOX-
Proteinsequenz von P. abies (HBK1). ............................................................ 74
ABBLIDUNGSVERZEICHNIS
v
Abb. 30: S. verticillata, Testgel zur Sondenherstellung. ............................................... 75
Abb. 31: S. verticillata, in-vitro–Transkription & Dot Blot. ............................................. 77
Abb. 32: Sciadopitys-Gewebe nach Proteinase K-Behandlung. ................................. 80
Abb. 33: Detektionslösung: Gewebe mit Rückständen des Färbesubstrats. ............... 83
Abb. 34: S. verticillata, in-situ-Hybridisierung an Längsschnitten vegetativer
Knospen 6 Monate alter Keimlinge (I). .......................................................... 86
Abb. 35: S. verticillata, in-situ-Hybridisierung an Längsschnitten vegetativer
Knospen 6 Monate alter Keimlinge (II). ......................................................... 87
Abb. 36: S. verticillata, in-situ-Hybridisierung an Längsschnitten des terminalen
Sprossabschnittes 10 Wochen alter Keimlinge. ............................................ 89
Abb. 37: S. verticillata, in situ-Hybridisierung an Querschnitten von Keimblättern. .... 90
Abb. 38: Heterologe Expression von SvKnox. .............................................................. 91
Abb. 39: P. trichomanoides, cDNA-Synthese mit dP-SvKnox & Klonierungskontrolle. 92
Abb. 40: Schema der ermittelten Phyllocladus-Sequenz. ............................................ 93
Abb. 41: Sciadopitys-Kladodium und Nadelblätter im schematischen Querschnitt. ... 95
Abb. 42: Schema zur Transformationsreihe & Variabilität triebdifferenzierter
Systeme. ........................................................................................................ 97
Abb. 43: Schema zu genetischen Interaktionen am Scheitelmeristem. ....................... 99
Abb. 44: Schematische Darstellung ausgewählter Typen von Expressionsmustern
im Scheitelmeristem. ...................................................................................... 104
Abb. 45: Demonstration hypothetischer Expressionsmuster an REM-Aufnahmen
von A. homolepis & P. trichomanoides. ......................................................... 105
---
A1: Aminosäurenalignment zu Knox-Gensequenzen der Klassen 1&2. ................. 117
A2: Verifizierung der aus SvKnox abgeleiteten Aminosäurensequenz eines
Homöodomänen-Proteins der KNOX-Familie & der dazugehörigen
Nukleotidsequenz. ............................................................................................ 118
A3: S. verticillata, Astrablau-Safranin gefärbte Blattquerschnitte. .......................... 119
A4: S. verticillata, in-situ-Hybridisierung an Querschnitten von Primärblättern. ...... 120
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS vi
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
AK Antikörper AP Alkalische Phosphatase AS Aminosäure(n) BP Brevipedicellus, KNAT1 bp Basenpaare BSA Bovine (Rinder-) Serum
Albumin C Cuticula cDNA komplementäre DNA DEPC Diethyl-Pyrocarbonat DIG Digoxigenin DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease (d)NTP (Desoxy-)Ribonukleosid
Triphosphat dP degenerierter Primer ds DNA doppelsträngige DNA E Epidermis E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat Em Embryo En Endosperm (primäres) Es Embryosack FAA (FAE) Formalin-Alkohol-Eisessig for forward (5’-3’-Orientierung) H Hypodermis Ha Haare HBK Homeobox of KNOX class Hi Hilum HK Harzkanal Hy Hypokotyl IPTG Isopropylthiogalactosid K Kladodium kb Kilobasen KN1 Knotted1 KNAT Knotted-like aus A. thaliana KNOX Knotted1-like homeobox Ko Kotyledon/Keimblatt Kp Kladodienprimordium Ks Knospenschuppe KSp Kladodienspur KT Kurztrieb(achse) LB Leitbündel LS Leitbündelscheide LT Langtrieb(achse) M Marker MIA Multiple Image Alignment mRNA Messenger RNA
NBT/BCIP Nitroblau-Tetrazoliumsalz/
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphat
NCBI National Center for Biotechnology Information
Np Nadel(blatt)primordium NSp Nadel(blatt)spur OD Optische Dichte P Primärblatt p. a. per analysis, zur Analyse Pa Papillen PBS Sodium-Phosphat-Puffer PCR Polymerase-Kettenreaktion PFA Paraformaldehyd(-Fixierung) Pp Palisadenparenchym pW Primärwurzel Pwo Pyrococcus woesei Ra Radicula/Keimwurzel REM Rasterelektronenmikroskopie rev. reverse (3’-5’-Orientierung) RNA Ribonukleinsäure (RNS) RNase Ribonuklease rpm Umdrehungen pro Minute S Stomata SAM shoot apical meristem (Scheitelmeristem) Sb Schuppenblatt SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Sp Schwammparenchym SR Stomatareihe Su Suspensor T Testa TALE Three Amino Acid Loop
Extension (PYP) TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer Taq Thermus aquaticus u unit (funktionelle Einheit) ü. N. über Nacht UTP Uridintriphosphat VK Vegetationskegel Wh Wurzelhals X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-
galactopyranosid ZSp Zweigspur
EINLEITUNG 1
1 EINLEITUNG
1.1 Der pflanzliche Bauplan
Pflanzen sind ohne die Möglichkeit eines spontanen Standortwechsels im Unterschied zu
Tieren gezwungen, sich den jeweiligen Standortbedingungen mit allen Vor- und
Nachteilen anzupassen. Bei Pflanzen gleicher genetischer Konstitution kann die
phänotypische Ausprägung standortbedingt sehr variabel ausfallen. Im Verlauf der
pflanzlichen Entwicklung wird nur ein grundlegender Bauplan angelegt, der sich aus
Wurzel und Spross (= Sprossachse + Blätter) bzw. den drei universellen vegetativen
Grundorganen Wurzel, Sprossachse und Blatt zusammensetzt (Abb. 1). Die pflanzliche
Entwicklung zeichnet sich durch die Fähigkeit zur kontinuierlichen Anlage neuer Organe
aus, die auf der Aufrechterhaltung der meristematischen Aktivität in bestimmten
Bereichen des Pflanzenbauplans, den so genannten Meristemen, beruht. Ein Teil dieser
meristematischen Zellen bleibt das Pflanzenleben lang undifferenziert, während ein Teil
der Zellen ausdifferenziert und die Anlage lateraler Organe (z. B. Blätter) initiiert. Die
Grundlagen für ein besseres Verständnis der Diversität und Komplexität im Laufe der
Evolution (z. B. der Baupläne der Landpflanzen) werden unter dem Schlagwort „evo-
devo“ bzw. „evodevotics“ (evolutionary developmental biology) als einer neuen Disziplin,
zusammengefasst (THEISSEN et al, 2000; RAFF, 2000 & RAFF, 2007). Die Ansätze liegen
darin die morphologischen Veränderungen im Organismus über die Zeit mit
verschiedenen Disziplinen und aus verschiedenen Ansatzrichtungen zu betrachten und
zu einer gemeinsamen Aussage zu verbinden. Für Einblicke in die Evolution und deren
Formenvielfalt ist u. a. das Verständnis so genannter Entwicklungskontrollgene mit
entscheidend (SINGER & ASHTON, 2007).
1.1.1 Das Meristem
Der grundlegende Pflanzenbauplan wird schon im Zuge der Embryogenese festgelegt
und nicht verändert. Die ersten Organisationsschritte konzentrieren sich auf die
Festlegung der Hauptachsen (apikal-basal, dorsal-ventral, proximal-distal) und die
Formierung der zwei wichtigsten pflanzlichen Meristeme, des Spross- und des
Wurzelmeristems. Das Sprossmeristem ist Ursprung aller oberirdischen vegetativen und
EINLEITUNG 2
generativen Organe, das Wurzelmeristem bringt die unterirdischen Pflanzenteile hervor.
Eine bedeutende Aufgabe der Meristeme liegt in der postembryonalen Organisation der
morphogenetischen Prozesse. Meristeme zeichnen sich durch zwei Eigenschaften aus,
die essentiell für ein kontinuierliches Wachstum des Pflanzenkörpers sind. Sie bringen
nicht nur immer neue Blätter, Blüten und Triebgewebe hervor, sondern sind darüber
hinaus auch gleichzeitig zur Selbstorganisation und Selbsterhaltung befähigt.
Im Bereich des Sprossscheitels bzw. des Scheitelmeristems, kurz SAM (shoot apical
meristem), differenziert ein Teil der meristematischen Zellen, mit Determinierung neuer
Organe, aus und wird anschließend durch neu gebildete undifferenzierte Zellen
kompensiert bzw. wieder aufgefüllt. Die Anlage lateraler Organe, wie z. B. Blätter,
unterliegt dabei einem genauen Muster (Phyllotaxis). Die Blattform ist im Übergang aus
dem juvenilen zum adulten Stadium sehr variabel. Blätter und Blüten sind in ihrem
Wachstum begrenzte Strukturen, während z. B. Seitenzweige (z. T.) undeterminiert
bleiben. Histologisch lässt sich das Scheitelmeristem höherer Pflanzen in zwei Zonen
unterteilen. Die zentrale Zone umfasst die sich nur sehr langsam teilenden Initialzellen,
die Ausgangspunkt aller anderen meristematischen Zonen und der Selbsterhaltung sind.
Die periphere Zone zeichnet sich durch eine schnellere Zellteilung aus und bildet den
Ausgangspunkt der Organogenese (JACKSON et al., 1994; HAKE & JACKSON, 1995; ORI et
al., 2000; vergleiche 1.2.2: Abb. 9).
Abb. 1: Schematische Darstellung zum pflanzlichen Grundbauplan. (nach GIFFORD & FOSTER, 1989,verändert). Pflanzenkörper einer stark schematisierten Dikotylen mit Wurzel, Sprossachse und Blättern. Sprossachse und Blätter werden zusammengefasst als Spross bezeichnet. Das Meristem des Sprossscheitels (Scheitelmeristem) dient der Anlage aller oberirdischen Organe, das Wurzelmeristem dient der Anlage von Wurzeln. Seitenverzeigungen gehen aus axillären Meristemen hervor und inserieren jeweils in den Achseln von (Trag-)Blättern.
EINLEITUNG 3
1.1.2 Blätter & Kurztriebe
Die meisten Blätter der rezenten Gymnospermen werden umgangssprachlich als Nadeln
bezeichnet, sind in Größe und Form jedoch variabel. Die nadelförmigen, länglichen und
mehr oder weniger stark abgeflachten Blätter finden sich hauptsächlich bei Koniferen
(z. B. Pinaceae und Taxaceae). Bei Sprosssystemen unterscheidet man generell solche,
die immer einheitlich aufgebaut sind und daher als nicht triebdifferenziert anzusprechen
sind von triebdifferenzierten Systemen bei denen man zwischen Lang- und Kurztrieben
unterscheidet. Bei Triebdifferenzierung ist das Vorkommen von Blättern an älteren
Zweigen (nach Abwurf der Langtriebblätter) auf die Kurztriebachse beschränkt. Bei den
Gymnospermen Abies (Abb. 2 A) und Torreya findet man z. B. undifferenzierte
Sprosssysteme. Alle Triebe inklusive ihrer Benadelung sind hier gleich gestaltet.
Abb. 2: Schematische Darstellung der Triebdifferenzierung bei Gymnospermen. A: gleich gestaltete Seitenaustriebe mit terminaler, vegetativer Knospe und spiralig an der Achse stehenden Nadeln. B: Kurztriebe in Form blattartig verbreiterter Kladodien (= Phyllokladien), Schuppenblätter der einzelnen Teilphyllokladien erkennbar. C: von Schuppenblättern eingehüllte, reduzierte Kurztriebachsen stehen in Achseln von spiralig angeordneten, schuppenförmigen Tragblättern des Langtriebes; an älteren Zweigen ausschließlich Kurztrieb-Nadeln vorhanden. D: „Schirm“ im Aufriss; terminale, vegetative Knospe umgeben von sog. Kladodien bzw. Kurztrieben, die in Achseln spiralig angeordneter Schuppenblätter des Langtriebes stehen und umgangssprachlich als Doppelnadeln bezeichnet werden.
A
C D
B
EINLEITUNG 4
Bei Pinus sylvestris als Vertreter mit Triebdifferenzierung findet man, spätestens an im
zweiten Jahr unbenadelten Langtriebachsen, stark gestauchte 2-nadelige Kurztriebe. Die
Kurztriebachse selbst ist nicht sichtbar in eine Niederblattscheide eingehüllt, erkennbar
sind bei Pinus ausschließlich die Kurztriebnadeln (Abb. 2 C). In der Gattung Phyllocladus
kommen Kurztriebe in Form blattartig verbreiterter, photosynthetisch aktiver
Flachsprosse vor an deren Randbereichen die eigentlichen Blätter bis auf kleine
Schuppenblätter reduziert sind (Abb. 2 B). Ein weiteres Beispiel für eine Langtrieb-
Kurztrieb-Differenzierung findet sich in der Gattung Sciadopitys mit charakteristisch
schirmförmig angeordneten nadelartigen Kurztrieben, die auch als Doppelnadeln
bezeichnet werden (Abb. 2 D).
1.1.3 Ausgangspunkt: Doppelnadel-Problematik
Für ein evolutives Verständnis ist die Betrachtung von als sehr ursprünglich geltenden
Taxa mit Hilfe klassischer botanischer Methoden interessant. Im Zusammenhang mit der
Suche nach neuen Erkenntnissen für ein besseres Verständnis von der Funktion und
Evolution der Gymnospermenblätter scheint eine weitere Betrachtung von Sciadopitys
verticillata (THUNB.) SIEBOLD & ZUCC., als einem sehr ursprünglichen und damit sicherlich
phylogentisch aussagekräftigen Taxon, viel versprechend. Die Natur der Doppelnadeln
bzw. der Organcharakter der photosynthetisch aktiven Flachsprosse (Kladodien) bei
S. verticillata war wiederholt Thema verschiedener Arbeiten (ROTH, 1962; TROLL, 1937;
SCHNEIDER, 1913; GÖBEL, 1913, STRASBURGER, 1872; MOHL, 1871; ENGELMANN, 1868;
DICKSON, 1866). So lassen sich zur Klärung der morphologischen Natur der nadelartigen
Kladodien bzw. der „Blattentwicklung“ und deren mögliche phylogenetische Folgen grob
zwei Ansichten trennen (Abb. 3).
Abb. 3: S. verticillata, Theorien zur Doppelnadel-Problematik. A: „Verwachsungstheorie“-ENGELMANN
(1868); VON MOHL (1871); STRASBURGER (1872) & SCHNEIDER (1913); Vegetationspunkt des Kurztriebes erschöpft sich in der Bildung der beiden kongenital verwachsenen Blattanlagen, die basal-interkalar in gemeinsamer Basis wachsen (Pfeil), Hauptanteil der Doppelnadel: Blattgewebe. B: „Phyllokladientheorie“- DICKSON (1866); TROLL (1937); ROTH (1962); der Vegetationskegel des Sprosses/„phylloiden Stengels“ (DICKSON, 1866) baut die gesamte Doppelnadel auf, Hauptanteil der Doppelnadel: Achsengewebe; terminale Doppelspitze gedeutet als zwei Blattrudimente des Kurztriebes.
EINLEITUNG 5
Die entsprechenden Untersuchungen zum Organcharakter der Sciadopitys-Kladodien
befassen sich stets mit der Frage welcher Anteil Blatt und welcher Anteil Sprossachse
ist. Gegenwärtig lässt sich als Ausgangsbasis stark vereinfacht festhalten, dass die
Zuordnung der Doppelnadeln rein anatomisch und morphologisch über ihre Stellung klar
zu Gunsten des Sprosscharakters zu treffen ist (z. B. ROTH, 1962). Die Doppelnadeln
sind demnach, aktuell als photosynthetisch aktive Flachsprosse anzusehen, weil sie in
der Achsel von Tragblättern inserieren und sind folglich auch als nicht blatthomolog zu
betrachten (Abb. 4).
Abb. 4: S. verticillata, Habitus. A: Solitärpflanze im Botanischen Garten Marburg. B: mit Schuppenblättern besetzter Langtrieb, der terminal die charakteristisch schirmförmig angeordneten Kladodien (K) bzw. Doppelnadel-artigen Kurztriebe trägt. C: Aufsicht auf vegetative Knospe im Zentrum des „Schirms“. Vegetationskegel und junge Blattanlagen unter Knospenschuppen (Ks) geschützt verborgen. D: Vegetative Knospe in lateraler Ansicht, spiralig angeordnete Schuppenblätter (Sb) des Langtriebs durch gestauchte Internodien terminal gehäuft, Kladodien aus Schuppenblattachseln entfernt (Pfeil).
EINLEITUNG 6
Inwiefern an diesen Doppelnadel-artigen Kurztrieben bzw. Kladodien noch Blattanteile
vorhanden sind ist spekulativ. Im Kontext dieser Arbeit interessiert besonders, ob eine
Umgestaltung eines kompletten Kurztriebes bzw. einer Kurztriebachse hin zu einer
Struktur, die dann insgesamt als Blatt anzusprechen ist, nicht nur möglich sein kann,
sondern darüber hinaus, ob dies (noch) nachweisbar ist. Letzteres hieße stark
vereinfacht, dass in Teilen, die Blatt sind, hauptsächlich blattspezifische Gene aktiv sind
und in Sprossen demnach eher die Aktivität sprossspezifischer Gene zu erwarten ist.
Die umgangssprachliche Bezeichnung Doppelnadel für die Sciadopitys-Kladodien ist mit
Sicherheit nicht zuletzt das Resultat der sehr blattähnlichen Umgestaltung der
Kurztriebe. Wie weit die Ähnlichkeit der angesprochenen Kladodien mit normalen Nadeln
morphologisch, anatomisch und morphogenetisch (bereits) geht, bleibt allerdings offen.
Einzig das Vorkommen von Tragblättern schließt die Deutung als Blatt aus und bestätigt
gleichzeitig den Sprosscharakter. Würden die Tragblätter der Kladodien komplett
reduziert werden und fehlen, könnte man ihnen aufgrund ihrer Lage und
Entstehungsweise sowie ihres blattartigen anatomischen Aufbaus (STRASBURGER 1872;
ROTH, 1962) ohne weiteres reinen Blattcharakter zusprechen und sie für ganz
gewöhnliche Nadelblätter halten. Aufgrund dieser Tatsache gibt der bei Sciadopitys
gefundene Sachverhalt Anlass dazu, die nadelartigen Kurztriebe als ein einzelnes
Stadium („Momentaufnahme“) einer Transformationsreihe anzusehen, bei der ein axillärer
Kurztrieb sekundär in ein typisches Blatt umgewandelt wird. Als mögliche Folge wären
die umgewandelten Kurztriebe morphologisch nicht mehr von Blättern zu unterscheiden.
Die im Fall von Sciadopitys nur hypothetisch anzunehmende Reduktion von Tragblättern
kommt in anderen Pflanzenfamilien durchaus vor. Eine Reduktion bis zum vollständigen
Fehlen (Ablast) ist von den Tragblättern der Blüten bei Asteraceen und Eriocaulaceen
(Syngonanthus) bekannt. Innerhalb der Familie der Asteraceae ist die Reduktion von
Tragblättern der Einzelblüten (Spreuschuppen) im Bereich des Blütenstandes in einigen
Gattungen verbreitet und ein auf Gattungsniveau bestimmungsrelevantes Merkmal. Man
findet Reduktionen aber auch bei den männlichen Teilzapfen der Gymnospermengattung
Cephalotaxus, sowie bei den Teilkladodien von Phyllocladus. Bei Phyllocladus sind
Tragblätter soweit reduziert, dass man sie nur noch in frühen Entwicklungsstadien
nachweisen kann. Tragblattreduktionen sind also weder ungewöhnlich, noch auf
bestimmte Pflanzengruppen begrenzt.
Ausgehend von der Datenlage lässt sich im Fall von Sciadopitys als gedanklicher
Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen gegenwärtig eine Zwischenstellung
annehmen. Vorstellbar ist außerdem, dass dies als die Folge einer standortbedingten
EINLEITUNG 7
Veränderung und einer daraus resultierenden Anpassung deutbar ist. Es gibt zahlreiche
Beispiele dafür, dass wieder benötigte Organe auf anderem Wege durch analoge
Bildungen ersetzt werden. Es ist aber nicht zwangsläufig möglich, eine auf demselben
Weg identisch wieder gewonnene Struktur von einer nie verloren gegangenen zu
unterscheiden. Dies kann auch als Grundgedanke dienen die Entstehungsweise von
Blättern (einiger anderer als ursprünglich immergrün geführter Taxa) vor dem
Hintergrund umgewandelter Kurztriebe neu zu hinterfragen. Morphologisch und
anatomisch hat die Nadel von Abies (z. B. A. homolepis) Ähnlichkeit mit dem Kladodium
von Sciadopitys (Abb. 5). Bis auf das Fehlen einer dem Tragblatt vergleichbaren Struktur
ist auch die Ontogenie sehr ähnlich. So stellt sich die Frage, ob es Nadelblätter gibt, die
sich in dieser Weise phylogenetisch von Kladodien herleiten lassen und ob Abies ein
solches Beispiel ist oder nicht. Sind Blätter also phylogenetisch mehrfach unabhängig
voneinander einmal direkt und einmal „über Umwege“ (transformierte Spross(-Systeme))
entstanden?
Die Beantwortung der Frage nach dem Organcharakter ist nicht immer einfach, sollte
aber dennoch stets inhaltlich erfolgen. Bei Sichtung der Rohdaten ist abzuwägen in wie
weit die Möglichkeit besteht, dass die Morphologie durch Funktionalität überlagert wird
und histologisch möglicherweise das Funktionelle überwiegt. Beispiele für derartige
funktionelle Überlagerungen finden sich u. a. in den Podocarpaceen-Gattungen
Acmopyle und Falcatifolium (KNOPF, persönliche Mitteilung) sowie in den Cupressaceae
(z. B. Thuja). Am Beispiel der Gymnosperme Thuja zeigt sich, dass die Form einer der
Abb. 5: Morphologische Gegenüberstellung von S. verticillata & A. homolepis. A: S. verticillata, terminales Ende eines Kladodiums im Bereich der ausgebuchteten Spitze (Pfeil), Oberseite des Kladodiums mit Längsfurche (oben) und zwei Stomatareihen (SR) auf der Kladodien-Unterseite (unten). B: A. homolepis, Nadelspitze mit terminaler Ausbuchtung (Pfeil), adaxiale Seite ohne Längsfurche (oben), abaxial (unten) mit deutlich sichtbaren, längsverlaufenden Stomatareihen.
EINLEITUNG 8
Selektion unterliegenden Struktur immer mit deren Funktion in Einklang steht, wobei
letztere sogar die Morphologie dominieren kann. Dies ist besonders deutlich, wenn
bekannte und klar erkennbare morphologische Grundstrukturen durch funktionelle
Anpassungen überformt werden. Ein Beispiel findet sich im anatomischen Aufbau der
Kantenblätter von dorsiventral abgeflachten und plagiotrop ausgerichteten Zweigen bei
z. B. Thuja plicata oder Platycladus orientalis (Cupressaceae). Hier ist das üblicherweise
auf der morphologischen Blattoberseite lokalisierte Palisadenparenchym durch die
Ausrichtung der Zweige und entsprechend dem Lichteinfall im Bereich der
morphologischen Blattunterseite und dort besonders im Bereich der Licht exponierten
Kante des Blattes ausgebildet (Abb. 6 & TETZLAF, 2005). Schwieriger wird es, wenn die
funktionelle Überformung soweit geht, dass die morphologische Grundstruktur dadurch
noch stärker oder gar vollständig verschleiert wird. Es bietet sich also über den
morphologischen Ansatz hinaus an, die Nachweisbarkeit angenommener Organe über
den Einsatz von Genen zusätzlich zu überprüfen.
1.2 Entwicklungsgenetische Lösungsansätze
Blickt man zurück auf die vielen morphologisch-anatomisch geprägten Arbeiten mit
ihrem großen Beitrag zur Basis der Grundlagenforschung, zeigt sich, dass sich viele
evolutionsbiologische Fragestellungen/Fragen zur Biodiversität hervorragend über rein
anatomisch-morphologisch gewonnene Erkenntnisse lösen lassen. Die Erfahrung zeigt,
dass auf diese Weise gewonnene Ergebnisse sich meist auch genetisch zusätzlich
stützen lassen. Für die Fälle in denen über einen gewissen Punkt hinaus (z. B. durch
funktionelle Überlagerung) rein morphologisch-anatomisch keine zufrieden stellenden
Abb. 6: Thuja plicata, Schematische Darstellung des Sprossquerschnitts. Das eigentlich auf der morphologischen Blattoberseite zu erwartende Palisadenparenchym ist bei den gezeigten Kantenblättern auf der morphologischen Blattunterseite und dort in stark Licht exponierten Bereichen zu finden.
EINLEITUNG 9
Antworten (mehr) zu erwarten sind, bietet es sich an bereits bestehende Ergebnisse mit
Entwicklungsgenetik zu kombinieren. Der bei Sciadopitys in Form der geschilderten
Kurztriebe vorliegende Sachverhalt ist also ein Fall für den weiterführende genetische
Untersuchungen lohnend erscheinen.
Ältere Angaben aus der Literatur und historischen Zeichnungen, bei denen subjektive
Einflüsse des Autors nie gänzlich auszuschließen sind, bieten in Kombination mit (aktuell)
erfassten Rohdaten (REM, Digitalfotografie etc.) diesbezüglich keine richtige Klärung. So
werden auch definitive Aussagen zum Ansatz der vermuteten Transformationsreihe
dieser Kladodien nicht plausibler oder nachvollziehbarer. Ausgehend von der aus
morphologischer Sicht stellungsbedingten Sprossnatur der Kladodien, erscheint es
interessant diese unter Zuhilfenahme so genannter Organidentitäts- oder
Entwicklungsgene erneut zu betrachten. Entwicklungsgene sind in der Lage anhand
ihres Expressionsmusters oder über Nachweis des von ihnen kodierten Transkriptions-
faktors die Organidentität z. B. in Gewebeschnitten anzeigen zu können. Ein solcher
Versuchsansatz macht schon vor Erscheinen der Organanlagen „Einblicke“ möglich.
Hinweise zu einem derart frühen Zeitpunkt könnten essentiell sein, wenn es wie hier mit
Sichtbarwerden junger Organanlagen für Aussagen zur Identität möglicherweise schon
zu spät ist. Die Kombination aus Histologie und Genetik bzw. die Methode des
Expressionsnachweises im Gewebe (siehe 1.3) findet in den letzten Jahren verstärkt für
Angiospermen, und zunehmend auch für Untersuchungen an einzelnen Gymnospermen-
Taxa Anwendung (z. B. SUNDÅS-LARSSON, 1998; GUILLET-CLAUDE et al., 2004 & BELMONTE
et al., 2007). Je nach Auswahl der eingesetzten Entwicklungsgene werden so Aussagen
zur pflanzlichen Morphogenese inklusive der Organdifferenzierung möglich. Die relativ
große Diskrepanz in der Anzahl der molekulargenetisch untersuchten Angiospermen und
damit einhergehenden veröffentlichten Sequenzen im Vergleich zu Gymnospermen
erklärt sich erstens durch die in Angiospermen anteilmäßig große Zahl wirtschaftlich
hochinteressanter Nutzpflanzen wie z. B. Zea mays (Mais). Zweitens steigern ein im
Vergleich zu Gymnospermen oftmals sehr viel kürzerer Generationswechsel (z. B.
Arabidopsis) und ein (methodisch) einfacherer Gewebeaufschluss (Vorkommen weniger
stark verholzter Strukturen z. B. im Knospenbereich, etc.) die Attraktivität der
Angiospermen für genetische Ansätze. Ein kompletter Generationszyklus (Aussaat bis
Ausreifen der neuen „Samengeneration“) dauert bei A. thaliana gerade einmal ca.
sechs bis acht Wochen. Die Samen von S. verticillata benötigen allein für die Keimung
schon fast doppelt so lange (3 bis 4 Monate). Die Sciadopitys-Keimlinge bilden innerhalb
ihres ersten Lebensjahres zusätzlich zu den beiden Kotyledonen nur zwei weitere Blätter,
die Primärblätter, aus (http://www.schirmtanne.de/sciadopitys_verticillata.php).
EINLEITUNG 10
Gensequenzen einer aus molekularer Sicht scheinbar eher unpopulären Gymnosperme
wie Sciadopitys, gerade in Bezug auf Entwicklungsgene (!), sind in Gen-Datenbanken
aktuell nicht vorhanden.
1.2.1 Pflanzliche Knox-Gene
Knox-Gene gehören zur großen Gruppe der Homöobox-Gene. Homöobox-Gene bzw.
von ihnen kodierte Homöodomänen-Proteine wurden im tierischen Organismus, speziell
Drosophila, erstmals entdeckt (GEHRING, 1987). Der Name ergibt sich aus einer Mutation,
die homologe Strukturen betraf. Ein klassisches Beispiel ist eine Mutation im
Antennapedia-Gen, die zur Folge hat, dass anstelle von Antennen Beine ausgebildet
wurden (MC GINNIS & KRUMLAUF, 1992).
Bekannt und benannt wurden pflanzliche Knox-Gene im Zusammenhang mit der
Entdeckung des knotted1 (kn1)-Gens aus einer Mutante von Zea mays. Kn1, das erste
aus einer Pflanze isolierte Gen, das ein Homöobox-Motiv enthält wird bei normaler
Expression nur im Scheitelmeristem und sehr jungen Teilen der Sprossachse, nicht
jedoch in Blättern exprimiert (HAKE et al., 1989; VOLLBRECHT et al., 1991). In der
Überexpressions-Mutante („gain-of-function“) zeigte sich eine ektopische Expression in
Blättern (HAKE & ORI, 2002), die knotenartige Auswüchse im Bereich der Blattspreiten zur
Folge hatte (SMITH et al., 1992). Das Kn1-Gen wird seitdem für die Isolierung immer
neuer Vertreter der Knox (knotted1-like homeobox)-Gen-Familien aus Mais und vielen
anderen Spermatophyten wie beispielsweise den Angiospermen Arabidopsis (STM:
LONG et al., 1996; KNAT: LINCOLN et al., 1994) und Oryza (OSH1: MATSUOKA et al., 1993)
oder der Gymnosperme Picea abies (SUNDÅS-LARSSON et al., 1998) etc. genutzt. Das
Gen ist damit Ausgangspunkt einer Vielzahl von Arbeiten zu verschiedenen durch
Knox-Gene gesteuerte morphogenetische Prozess (Abb. 7). Die Knox-Gene bieten sich
im Zusammenhang mit der angesprochenen Morphogenese-Thematik als „Werkzeuge“
für die Analyse von Meristemfunktion und die daraus resultierende Diversität pflanzlicher
Baupläne besonders an. Sie eignen sich in vielen Fällen als hervorragende Zeiger
morphogenetischer Ereignisse (SINHA et al., 1993; LINCOLN et al., 1994). Die Produkte
dieser regulatorischen Gene sind, abhängig von deren räumlichen und zeitlichen
Expressionsmustern, in vielen Bereichen der Organentwicklung beteiligt. Ihnen kommt
demnach als Transkriptionsfaktoren eine wichtige (regulatorische) Kontrollfunktion
speziell bei der spezifischen Zelldifferenzierung zu (z. B. HAKE & JACKSON, 1995). Neben
KNOX gehören auch die Familien BELL, HD-Zip, PHD-finger, GLABRA2 und PALE zur
großen Gruppe der Homöobox-Gene (CHAN et al., 1998).
EINLEITUNG 11
Allen gemeinsam ist ein als Homöodomäne bezeichneter 61 Aminosäuren umfassender
konservierter Bereich, der von der Homöobox kodiert wird. Funktionell ist die
Homöodomäne über das „helix-turn-helix“-Motiv für die Protein-DNA-Interaktion
verantwortlich (VOLLBRECHT, 1991 & GEHRING et al., 1994). Homöodomänen-Proteine
funktionieren als DNA-abhängige Transkriptionsregulatoren (GEHRING et al., 1994). Als
Transkiptionsfaktoren stellen sie nur eine Komponente in einer langen Signalkaskade
(vom Kern ausgehend) dar. Sie regulieren über sequenzspezifische DNA-Bindungen
andere Gene, aktivieren und/oder unterdrücken (JAYNES & O’ FARRELL, 1989)
Transkriptionsenzyme, Signalmoleküle bzw. -proteine. Neben der Regulation anderer
Transkriptionsfaktoren verfügen sie über die Fähigkeit zur Autoregulation, indem sie an
regulatorische Sequenzmotive ihrer eigenen Gene binden und so ihre eigene Expression
steuern (HAYASHI & SCOTT, 1990). Die Ähnlichkeit in der Aminosäurensequenz der
Homöodomäne und weitere ebenfalls mehr oder weniger stark konservierte
Proteinmotive außerhalb der Homöodomäne sind ausschlaggebend für die Unterteilung
in die oben angeführten sechs verschiedenen Homöobox-Gen-Familien. Darüber hinaus
dienen die zusätzlichen, konservierten Domänen der Festlegung der verschiedenen
Homöobox-Gene selbst (CHAN et al., 1998).
Abb. 7: Schema zur unterschiedlichen Einflussnahme von KNOX-Tanskriptionsfaktoren auf die Wachstumsregulierung (nach HAY et al., 2004; verändert). KNOX greift regulierend in das Hormongleichgewicht ein und so möglicherweise indirekt auf die Zellwandstruktur (Gibberilinsäure und Auxin aktivieren die Expression der Zellwand-lösenden Proteine, der Expansine). KNOX reguliert direkt die Biosynthese der Zellwand wodurch die Zelldifferenzierung unterdrückt wird. KNOX aktiviert die Cytokinin-Biosynthese, die ihrerseits die Zellteilung aktiviert. KNOX unterdrückt die Gibberilin-Biosynthese, die möglicherweise die Anordnung des Cytoskelets reguliert, dass die Zelldifferenzierung kontrolliert. Veränderte Zellteilung und Regulierung der Expression der KNOX-Gene könnten zusammenhängen.
EINLEITUNG 12
Die Proteine der Knox-Familie zeigen einen ihnen eigenen, gleichen Aufbau (Abb. 8).
Strukturell zeichnen sich alle KNOX-Proteine neben ihrer nahe dem C-Terminus
lokalisierten Homöodomäne durch den Besitz zwei spezieller, konservierter Motive
N-terminal („upstream“) der Homöodomäne aus. Dabei handelt es sich um die ELK- und
die KNOX-Domäne (BÜRGLIN, 1997). Die ELK-Domäne (VOLLBRECHT et al., 1991) ist ein in
allen Mitgliedern der Knox-Familie hochkonservierter Bereich, der nach seinen ersten
drei Aminosäuren benannt ist. Funktionell ist das ELK-Motiv an
Protein-Protein-Bindungen beteiligt (BÜRGLIN, 1997). Das Sequenzelement der
ELK-Domäne kommt nur bei Vertretern pflanzlicher TALE-Proteine vor (SUNDAS-
LARSSON et al., 1998). Als KNOX-Domäne wird ein ca. 100 Aminosäuren umfassender,
stark konservierter Bereich N-terminal von ELK bezeichnet. Das Motiv ist ebenfalls
wichtig für Protein-Protein-Interaktionen (MÜLLER et al., 2001). Ein kleiner, weniger
konservierter Bereich zwischen der KNOX- und ELK-Domäne wird als GSE-Box
bezeichnet (BÜRGLIN, 1997). Die Homöodomäne beinhaltet drei α-Helix-Motive. Aufgrund
des Vorkommens von drei zusätzlichen Aminosäuren (PYP) im Bereich („loop“) zwischen
dem Helix I- und dem Helix II-Motiv wird sie zur Familie der so genannten „TALE (three
amino acis loop extension) Superclass“ gezählt. Zur TALE-Familie der Homöodomänen
in Pflanzen zählt neben KNOX auch BEL-like (BELL) (BERTOLINO et al., 1995;
BÜRGLIN, 1997). Das dritte α-Helix-Motiv (Helix III) (GEHRING et al., 1994;
KERSTETTER et al., 1994), die sogenannte „recognition helix“, ist für die Erkennung und
den sequenzspezifischen Kontakt mit DNA zuständig. Als sequenzspezifische
DNA-Bindeproteine regulieren Homöodomänen-Proteine die Expression spezifischer
Gruppen von Zielgenen (AFFOLTER et al., 1990 & HAYASHI & SCOTT, 1990). Obwohl die
verschiedensten Homöodomänen strukturidentisch sind, können sie unterschiedliche
DNA-Bindungsbereiche erkennen (KERSTETTER et al., 1994).
Knox-Gene werden abhängig von bestimmten Aminosäureresten innerhalb der
Homöodomäne, Intronposition(en) und Expressionsmustern in zwei unterschiedliche
Klassen, Knox-Gene der Klasse 1 und Klasse 2 eingeteilt (KERSTETTER et al., 1994;
Abb. 8: Schematischer Aufbau eines KNOX-Proteins. (Darstellung nach SAKAMOTO et al., 2001;verändert). KNOX-Protein mit den für nahezu alle pflanzlichen KNOX-Proteine typischen Motiven der KNOX, ELK- und Homöodomäne, sowie der GSE-Box. Die zur TALE-Gruppe zählende Homöodomäne setzt sich aus drei α-Helices, mit Helix-turn-Helix-Motiv für die DNA-Bindung inklusive eines charakteristischen PYP-Motivs („PYP-loop“) zusammen.
EINLEITUNG 13
REISER et al., 2000). Ein Vorkommen bestimmter Klassen von Knox-Genen ist nicht nur für
mono- und dikotyle Angiospermen (s. o.), Moose (CHAMPAGNE & ASHTON, 2001) und
Farne (SANO et al., 2005), sondern auch für Gymnospermen durch SUNDAS-LARSSON
et al. (HBK, 1998) gezeigt worden. Die Homöodomäne beider Klassen zeigt einen hohen
Grad an Übereinstimmung, hauptsächlich im Helix III-Motiv. Vermutlich interagieren sie
mit ähnlichen DNA-Sequenzen, aber schon kleinste Strukturveränderungen (außerhalb
der Helix III und im N-terminalen Abschnitt der Homöodomäne) führen dazu, dass sich
das DNA-Bindeverhalten und/oder die Protein-Interaktion für beide Klassen
unterscheiden (CHAN et al., 1998). Während Klasse 1-Gene hauptsächlich für die
Identitätsgebung und Meristemregulation zuständig sind (vergleiche 1.2.2), zeigen
Klasse 2-Vertreter ein sehr vielfältigeres Einsatzfeld, ggf. agieren sie erst in späteren
Stadien der Entwicklung (CHAN et al., 1998). Sowohl Klasse 1 und Klasse 2-Gene, als
auch die Knox-Familie selbst sind Monophyla (BÜRGLIN, 1997; BARATHAN et al., 1999;
REISER et al., 2000). Untersuchungen an Pflanzenlinien vor Beginn der Landpflanzen
(z. B. der Grünalgen Acetabularia acetabulum, SERIKAWA & MANDOLI, 1999) kamen zu
dem Ergebnis, dass die Duplikation der beiden Klassen erst vor 500 Millionen Jahren,
nach Formierung der Landpflanzen-Linie, auftrat (HAKE et al., 2004). Laut SINGER &
ASHTON (2007) kann man für Klasse 1 festhalten, dass eine heterologe Expression ihrer
Gene bzw. die resultierenden Phänotypen die Vermutung nahe legen, dass man den
Klasse 1-Genen nur entfernt verwandter Pflanzenvertreter wie Arabidopsis, Picea und
Ceratopteris durchaus eine homologe Funktion zusprechen kann (z. B.
HARRISON et al., 2005).
1.2.2 Knox-Expression & der pflanzliche Bauplan
Die pflanzliche Entwicklung zeigt gravierende Unterschiede zur Entwicklung von Tieren.
Pflanzliche Organe können zeitlebens neu gebildet werden. Der Grund liegt im
Vorhandensein spezieller, unbegrenzt teilungsfähiger Zellen, deren Zellverbände als so
genannte Meristeme erhalten bleiben. In Tieren kann man dies allenfalls auf totipotente
Stammzellen mit selbst erhaltenden Eigenschaften übertragen.
Für die Bildung aller oberirdischen Pflanzenteile hat das eingangs erwähnte
Scheitelmeristem eine besondere Bedeutung. Es ist über die Fähigkeit zur
Selbsterhaltung eine essentielle Quelle für meristematische Zellen bzw. Wachstum. Zwei
weitere sehr wichtige Aufgaben kommen dem Scheitelmeristem als Ursprungszentrum
von lateralen Organen wie Blättern, sowie weiteren axillären Meristemen und als
„Schaltzentrale“ im Zuge der Primordien(an)ordnung bzw. Phyllotaxis zu (MC STEEN &
HAKE, 1998; Abb. 9 A). Die im Bereich des Scheitelmeristems bei Anlage neuer
EINLEITUNG 14
Organprimordien ablaufenden Prozesse sind sehr komplex. Die Abläufe/Muster werden
zusätzlich zur Gen-abhängigen Expression noch über An- und Abwesenheit von
Hormonen beeinflusst. HAY et al. (2004) beschreibt, dass sich die verschiedenen Gene
nicht nur wechselseitig beeinflussen, sondern auch die Hormonaktivität regulierend auf
die Aktivität der KNOX-Proteine im Apex Einfluss nimmt. Verallgemeinert lässt sich
sagen, dass die Knox-Expression (eines Klasse 1 Gens wie z. B. Kn1 oder Stm) auf das
Sprossmeristem beschränkt ist und während der Blattentwicklung fehlt (seltener nur stark
herunterreguliert ist). Die Meristemzellen, die den Ursprung einer neuen Blattanlage
bilden (Plastochron 0/P0 Stadium, vgl. Abb. 9 B), verlieren die Expressionstätigkeit schon
vor ersten (sichtbaren) Anzeichen einer Blattanlage (HAKE et al., 2004).
Die Genprodukte beeinflussen zwar die Anlage von Blättern, sind im Blatt selber aber
nicht zu finden (SMITH et al., 1992; JACKSON et al., 1994). Die Expressionsmuster für
einfache und zusammengesetzte Blätter können variieren. Das Expressionsmuster ist
also allgemein eher mit dem Entwicklungsstadium des Blattprimordiums und nicht
zwangsläufig mit der endgültigen Blattmorphologie korreliert (BARATHAN et al., 2002 &
HAKE et al., 2004). So wichtig es für die Blattidentität ist die Expression bestimmter Gene
in Blättern abzuschalten, so wichtig ist aber auch, dann bestimmte Gene anzuschalten
Abb. 9: Schematische Darstellung zum Scheitelmeristem (SAM). Expressionsmuster eines Klasse 1Knox-Gens wie Kn1 oder Stm im vegetativen Meristem (nach MC STEEN & HAKE 1998, JACKSON et al., 1994 & HAY et al., 2004, jeweils verändert). Das SAM übernimmt die Aufgabe der Selbsterhaltung, Bildung von Blättern und axillären Meristemen sowie Phyllotaxis. Zellen der zentralen Zone dienen der Selbsterhaltung des SAM und teilen sich weniger häufig. Zellen des peripheren Bereichs teilen sich häufig und sind Ausgangspunkt für die Organogenese (nur Zellen im Bereich des (Blatt-)Primordiums differenzieren aus). P0-P2 stehen für die (ontogenetischen) Zeitintervalle, Plastochrone, zwischen der Anlage der Blattprimordien mit P1 als jüngstem Primordium bzw. jüngstem Blatt. P0 steht für den Bereich wo das nächste Primordium zu erwarten ist und die Expression des eigentlich im gesamten Meristem exprimierten Klasse 1-Gens unterdrückt ist/fehlt. Axilläre Meristeme entstehen in Blattachseln. A: Schematischer Querschnitt durch SAM. B: SAM, in lateraler Ansicht, keilförmig angeschnitten.
EINLEITUNG 15
(MC STEEN & HAKE, 1998). Pflanzliche Zellen geben über ihr Wuchsverhalten Antwort auf
Umweltbedingungen, erkennbar anhand ihrer Anpassungsfähigkeit und Koordination
ihrer Aktivität. Die wichtigste funktionelle Gemeinsamkeit aller Knox-Gene in der
Morphogenese der Pflanzen liegt in der Kontrolle der Zelldifferenzierungsprozesse und
der Formierung bestimmter Muster im pflanzlichen Bauplan. Die undifferenzierten
Meristemzellen differenzieren nach speziellen Mustern aus und bringen so laterale
Organe hervor. Mustervariationen sind Form gebend, indem sie im Zuge der vegetativen
Entwicklung Einfluss auf die Anlage von Blattformen, Leitbündelanschlüsse und
Phyllotaxis nehmen. Die unterschiedliche Genexpression ist im Hinblick auf verschiedene
Wuchsformen ein entscheidender evolutiver Mechanismus (HAKE & JACKSON, 1995).
Ein Verständnis der entstehenden Expressionsmuster bzw. von ektopischer Expression
wird erleichtert, wenn man auf mutationsbedingte Phänotypen (mit verändertem
Zellschicksal und anderem Teilungsverhalten) zur Illustration der Entwicklungsschritte
zurückgreift. Ein hoher Expressionslevel in transgenen Pflanzen bedingt einen Wechsel
hin zum Meristem und niedrigere Level verändern die entstehenden Zelltypen. Durch
(nicht letale) rezessive Wildtyp-Mutanten und spezielle induzierte Transformanten (Mono-
und Dikotyle sind kompatibel, SINHA et al., 1993) werden Aussagen und Analysen des
Gens und seiner Genprodukte möglich. Rezessive Mutationen informieren über die Rolle
des Genproduktes in der frühen Entwicklung (bezogen auf das Meristem). Eine
dominante Überexpression bzw. die so genannten „gain-of-function“-Phänotypen,
machen über ihr dosisabhängiges Erscheinungsbild Veränderungen im Bauplan
vorhersehbar (HAKE & JACKSON, 1995). Klasse 1 wird im Scheitelmeristem exprimiert. Die
Expression von Klasse 2 ist nicht so klar definiert (KERSTETTER et al., 1994,
SERIKAWA et al., 1996 & SERIKAWA et al., 1997). Ihre Expression ist nicht auf bestimmte
Gewebe beschränkt, sondern abhängig von Ort (Zelltyp) und Zeit der Expression in der
Pflanze sehr variabel, sie kommt in den meisten Geweben, jedoch nie im Meristem vor.
Aufgrund fehlender mutationsbedingter Phänotypen ist die Klasse 2-Funktion nicht so
klar beschreibbar wie die der Klasse 1-Gene (SERIKAWA et al., 1997).
Neben verschiedenen Modellen zur Blattentwicklung existieren für Monokotyle und
Dikotyle eigene Modelle zur Knox-Gen-Expression in der Embryo-, Sämlings- und
Infloreszenzentwicklung. Die Expression der Knox-Gene selbst ist auf vielfältigste Weise
und auf verschiedensten Leveln reguliert (HAKE et al., 2004). Bezogen auf den eingangs
erwähnten universellen Bau der Kormophyten (Abb. 1) bergen also die Expressions-
muster von Knox-Genen Hinweise auf die Organidentität und die Möglichkeit untersuchte
EINLEITUNG 16
Strukturen einem der drei vegetativen Grundorgane im pflanzlichen Bauplan zuzuordnen
und Aussagen über die Homologieverhältnisse zu machen.
Gegenwärtig nimmt erstens die Zahl der diesbezüglich untersuchten Gymnospermen
(gemessen an der Vielzahl von Untersuchungen an Angiospermen) immer weiter zu.
Zweitens ist mit der Arbeit von HIRAYAMA et al. (2007) auch der erste Schritt
unternommen umgestaltete Organe mit Sonderfunktion wie Phyllokladien (blattartige
Flachsprosse) näher zu untersuchen, bei denen die Zusammensetzung aus den
Grundorganen nicht immer hinreichend klar ist. Untersuchungen zu derartigen
„innovativen“ Organen (z. B. aus der Angiospermengattung Ruscus und der
Gymnospermengattung Phyllocladus) die zur morphologischen Differenzierung
beitragen sind wichtig. Während die Zusammensetzung für Phyllocladus in diesem
Zusammenhang einfach ist (RIEGER, 2002; BELL, 1991 & TOMLINSON et al. 1987), bleibt
Ruscus laut HIRAYAMA et al. (2007) morphologisch ein Problem. Mit Hilfe dieser
Versuchsansätze, könnte es einerseits möglich sein eine intermediäre Organidentität von
z. B. Phyllokladien zu belegen (vergleiche HIRAYAMA) und andererseits auch die
Wahrscheinlichkeit vermuteter Transformationsreihen für die blattartigen Kurztriebe bei
Sciadopitys zu überprüfen.
1.3 in-situ-Hybridisierung
Die in-situ-Hybridisierung ist ein Verfahren mit dem die mRNA eines bestimmten Gens
(im Gewebeschnitt) sichtbar gemacht wird und anhand dessen die für das Gewebe oder
die Zelle typische Proteinexpression ggf. inklusive des zeitlichen Verlaufes
nachvollziehbar wird (MÜHLHARDT, 2003).
Die ursprünglich im Zuge zytologischer Präparationen etablierte Methodik der
in-situ-Hybridisierung beruht auf der spezifischen Bindung einer markierten Sonde
(Nukleinsäure-Probe) im Gewebeschnitt unter selektiven Bedingungen. Für die Botanik
wurde diese Methodik erst später angepasst, um als diagnostisches Werkzeug zur
Detektierung von Pflanzenpathogenen, Genomanalysen von Pflanzengenen oder für
Expressionsstudien der mRNA und ihrer Proteinen im Gewebe eingesetzt zu werden.
Allen bestehenden Hybridisierungsvarianten liegt zu Grunde, dass die gewählte Sonde
an eine komplementäre Sequenz im Gewebe unter Bildung einer stabilen Hybride bindet
und anschließend histologisch detektierbar ist. Im Rahmen dieser Arbeit kommen so
genannte Antisense-mRNA-Transkripte zum Einsatz, die im pflanzlichen Gewebeverband
die genaue, temporäre Expression der Sense-mRNA-Zielsequenz lokalisieren. Die
EINLEITUNG 17
verwendeten Sonden (Riboproben) lassen sich sowohl radioaktiv als auch nicht
radioaktiv (Fluoreszenzfarbstoff oder Antikörper, Bindungsproteine) markieren. Die
Sensitivität beider Detektionsvarianten ist mittlerweile vergleichbar hoch. Auch geringe
Kopienzahlen von mRNA (auch in einzelnen Zellen) sind detektierbar. Ein sehr gängiger
Marker ist hierbei Digoxigenin, kurz DIG, ein Steroid aus Blüten und Blättern der
Digitalis-Pflanze. Es ist im Vergleich zum Biotin-Marker sensitiver. In der Regel werden
Marker an UTPs gekoppelt und sind über einen enzymgebundenen Antikörper (z. B.
Alkalische Phosphatase) gegen das verwendetet Marker-Molekül (z.B. Anti-DIG) unter
Entstehung eines chromogenen Substrates (z. B. BCIP/NBT) sichtbar und nachweisbar.
Das Verfahren bietet den Vorteil, dass sowohl eine gleichzeitige Ko-Lokalisation
verschiedener RNAs in ein und derselben Probe unter Einsatz verschiedener Marker, als
auch die gleichzeitige Detektion von RNA und dazugehörigem Protein möglich ist
(ZACHGO, 2002). Durch Einsatz der Doppelmarkierung („double labeling“) zeigte
JACKSON (2002), dass Kn1-mRNA und das zugehörige Protein an unterschiedlichen
Orten lokalisierbar waren und Proteine über Plasmodesmata „wandern“ können.
1.4 Ziel der Arbeit
Über die reine Anwendung der klassischen morphologisch-anatomischen Methodik
hinaus erscheint es viel versprechend, diese mit genetischen Versuchsansätzen zu
kombinieren, um neue und/oder zusätzliche Hinweise und unterstützende Aussagen zur
Funktion und Evolution der Gymnospermenblätter zu ermöglichen. Stellenweise liefern
die erfassten Rohdaten zur Morphogenese allein keine eindeutigen Aussagen zum
Organcharakter. Fragen zu Makroevolution könnten daher erst durch Kombination
molekularer Daten besser beantwortet werden. Die Paläobotanik bzw. Vergleiche mit
fossilen Funden aus der Anfangszeit der Gymnospermen sind insofern problematisch,
als man nicht sicher sein kann wie „komplett“ die Angaben zu Relikt- und Ur-Habitaten
sind. Außerdem lassen fossile Funde viel Spielraum für Spekulationen. Aussagen über
die Homologie oder Analogie rezenter Strukturen (z. B. über vergangene
standortbedingte Anpassungen) sind nur schwer möglich.
Vor diesem Hintergrund erscheint eine Methodenetablierung zum Expressionsnachweis
von Genen direkt im entscheidenden Gewebeverband eines so ursprünglichen
Gymnospermen-Taxons wie der Japanischen Schirmtanne, S. verticillata, angebracht.
Selbst in kladistischen Analysen unter Verwendung verschiedenster
(morphologischer/genetischer) Parameter und der über die Jahre ständig wechselnden
Zuordnung zu den verschiedensten Gymnospermen-Familien (FARJON, 2005) entsteht
EINLEITUNG 18
häufig der Eindruck eines „Mischorganismus“, dessen Zuordnung sich als verwirrend
erweist. Ziel der vorliegenden Arbeit ist daher erstens die allgemeine Etablierung der
angesprochenen genetischen Methoden wie z.B. die in-situ-Hybridisierung, inklusive der
Adaption an Sciadopitys, am Lehrstuhl zu realisieren. Zweitens soll über eine
Methodenetablierung für ein ursprüngliches Gymnospermen-Taxon, mit S. verticillata als
Modellgymnosperme, im Speziellen eine Knox-Gen-Sequenz aus S. verticillata
vergleichbar mit dem HBK-Gen aus P. abies (SUNDÅS-LARSSON et al., 1998) identifiziert
werden und entsprechende Primer für ein Klasse 1 Knox-Gen erstellt werden.
Bei den „Doppelnadeln“ bzw. Kladodien von Sciadopitys ist morphologisch eindeutig,
dass es sich um einen Spross handelt. Unklar ist, welchen Anteil Sprossachse und
möglicherweise vorhandene Blätter an Kladodien haben. Die Frage ist, ob sich die
Sprossnatur genetisch belegen lässt. Gelingt es, so schließt sich als nächstes die Frage
an, ob andere Gymnospermennadeln, die morphologisch sehr ähnlich, aber durch die
Stellung eindeutig als Blätter anzusehen sind, nicht ebenfalls umgewandelte Sprosse
sind. Führt die Studie zum Erfolg, bedeutet das, dass möglicherweise eine
polyphyletische Entstehung des Gymnospermenblattes belegt werden kann. Führt sie
nicht zum Erfolg, bedeutet es, dass in manchen Fällen die Auflösung morphologischer
Verfahren höher sein kann, als die genetischer Techniken.
MATERIAL & METHODEN
19
2 MATERIAL & METHODEN
2.1 Pflanzenmaterial
2.1.1 Materialsammlung
Die Sammlung und Probenentnahme erfolgten jeweils angepasst an die Erfordernisse
der verschiedenen Versuchsansätze. Das Material für Entwicklungsreihen wurde in
regelmäßigen, etwa 1-wöchigen Intervallen gesammelt. Die Proben für die genetischen
Ansätze wurden punktuell, d. h. im möglichst optimalen Entwicklungsstadium frisch und
zeitnah zum Versuchsbeginn entnommen. Zusätzlich wurde das für die Hybridisierung
gesammelte Material unmittelbar nach Entnahme und eventuell nötiger
Präparation/Fixierung gekühlt aufbewahrt. Material für die Isolierung von RNA oder DNA
wurde direkt nach Entnahme in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis Schock gefroren
und anschließend bei -80 °C gelagert. Knospen (vegetative und generative) und Blätter
stammen hauptsächlich aus dem Freiland des Botanischen Gartens Bochum (BGBO).
Samen und junge weibliche (♀) Zapfen von S. verticillata wurden größtenteils im Freiland
des Botanischen Gartens in Marburg (BGM) gesammelt (Tab. 1).
Tab. 1: Übersicht des verwendeten Pflanzenmaterials.
Art Pflanzenteil Herkunft
Abies homolepis SIEBOLD &
ZUCC.
Nadeln & Triebe
vegetative Knospen
BGBO, Freiland
BGBO, Freiland
Arabidopsis thaliana L. Blätter/Grundblattrosette BGBO, Freiland
Phyllocladus trichomanoides D.
DON. var. trichomanoides
Phyllokladien
vegetative Knospen
BGBO, Freiland
BGBO, Freiland
Picea abies (L.) H. KARST. var.
abies
Nadeln
vegetative Knospen
BGBO, Freiland
BGBO, Freiland
Pinus sylvestris L. Langtriebe & Kurztriebe/Nadeln BGBO, Freiland
Sciadopitys verticillata
(THUNB.) SIEBOLD & ZUCC.
Kladodien & Langtriebe
vegetative & generative Knospen
junge ♀ Zapfen & Samen (versch. Stadien)
reife Zapfen & Samen
angekeimte Samen & Keimlinge
BGBO, Freiland
BGBO, Freiland
BGM, Freiland
BGBO/BGM, Freiland
BGBO, Warmhaus
MATERIAL & METHODEN
20
2.1.2 Anzucht der Keimlinge
Die Anzucht der keimfähigen Samen aus Marburg erfolgte im Botanischen Garten
Bochum unter Warmhaus-Bedingungen bei 22 °C, mit Lüftung ab 26 °C. Ausgesät wurde
in ein Torf-Sand-Gemisch (inklusive Drainageschicht) mit einer dünnen Abschlussschicht
aus reinem Sand. Um die Substratoberfläche abzudunkeln und vor Austrocknung zu
schützen wurde das Pflanzgefäß bis zum Auflaufen der Samen abgedeckt. Gewässert
wurde einmal täglich, direkt auf das Substrat ohne die Keimlinge selbst zu benetzen. Im
Zeitraum von Ende Oktober bis März wurde von 6.00 bis 22.00 h zusätzlich beleuchtet
(OSRAM L 58/77, Fluora). Die entnommenen Samen bzw. Keimlinge wurden mit Hilfe von
RNAse-freiem Wasser von Substratresten gereinigt. Bei Schädlingsbefall wurde mit
Confidor WG70 (BAYER) als 0,03 %ige Lösung und/oder Mesurol® Schneckenkorn
(BAYER) behandelt.
2.2 Morphologisch-anatomische Methoden
2.2.1 Fixierung
Das gesammelte Pflanzenmaterial (siehe 2.1) wurde in FAA, einem Gemisch aus
Formalin, Ethanol und Eisessig, unmittelbar nach dem Sammeln für mindestens 72 h
fixiert und anschließend in Ethanol (70 %) überführt (kurz waschen) und gelagert.
Präpariert wurde unter einer Stereolupe Stemi SV11 von ZEISS bei bis zu 40 facher
Vergrößerung in Ethanol (70 %).
FAA (100 ml)
Ethanol (70 %, vergällt)
Formalin (37 %)
Eisessig (99-100 % ige Essigsäure)
90 ml
5 ml
5 ml
2.2.2 Mikrotomtechnik
Für die Herstellung von Serienschnitten in Paraffintechnik wurden die anatomisch zu
untersuchenden Präparate entwässert und für mindestens 24 h in Ethanol (70 %)
inkubiert (2.2.1). Die Überführung in HISTOWAX® (HISTOLAB PRODUCTS AB) erfolgte
mittels tertiärem (tert.) Butanol (Schmelzpunkt 25 °C) als Intermedium (GERLACH, 1984)
bei 37 °C im Wärmeschrank. Die Präparate wurden dabei für mindestens 24 h in
folgenden Lösungen (I-VI) belassen:
MATERIAL & METHODEN
21
Lösung I: 20 ml tert. Butanol, abs. + 50 ml Ethanol (96 %), vergällt + 30 ml Aqua dest.
Lösung II: 35 ml tert. Butanol, abs. + 50 ml Ethanol (96 %), vergällt + 15 ml Aqua dest.
Lösung III: 55 ml tert. Butanol, abs. + 45 ml Ethanol (96 %), vergällt
Lösung IV: 100 ml tert. Butanol, abs. + Eosin
Lösung V: 100 ml tert. Butanol, abs.
Lösung VI: 100 ml tert. Butanol, abs.
Um die Objekte auch im Wachsblock sichtbar zu machen und im weiteren Arbeitsverlauf
besser ausrichten zu können, wurde dem tertiären Butanol der Farbstoff Eosin
beigemischt. Das Eosin löst sich im Verlauf des Färbevorganges durch Alkohol wieder
heraus. Die entwässerten Proben wurden mit reinem tertiärem Butanol in Glasdosen mit
Rillendeckel übertragen und der Glasbehälter mit Wachskugeln aufgefüllt. Die Proben
wurden bei 63 °C für zwei bis drei Tage im verschlossenen Gefäß gelagert. Zum
Verdampfen wurden die Deckel entfernt und die Gefäße für zwei bis drei weitere Tage im
Wärmeschrank belassen.
Einbetten:
Das Einbetten der Proben in Wachs (Schmelzpunkt HISTOWAX® bei ca. 58 °C) erfolgte
nach GERLACH (1984). Nach dem Einbetten wurden die Wachsblöcke zugeschnitten und
mittels eines Rotationsmikrotoms MOD 1130/Biocut (REICHERT JUNG) mit automatischem
Objektrückzug 10 µm dicke Serienschnitte der Objekte angefertigt. Im Anschluss wurden
die fertigen Schnittbänder mit Eiweißglycerin (Glycerin/Hühnereiweiß 1:1, nach
MAYER; GERLACH 1984, S. 99 f) auf Objektträger geklebt und bei ca. 40 °C für 1 bis 2 h
getrocknet. Um ein Zerreißen der Schnitte während des Schneidens zu verhindern bzw.
zu verringern, wurden die entsprechenden (Paraffin-) Blöcke mit Glycerin behandelt. Es
ist hilfreich, die entsprechend angeschnittenen Blöcke entweder für ca. 24 h in Glycerin
einzulegen oder die Schnittfläche während des Schneidens wiederholt mit Glycerin zu
bestreichen. Ein Zerreißen ist gehäuft bei kompakten Knospen und stark cutinisierten
Strukturen (z. B. Nadeln) zu erwarten, da hier das Eindringen des Wachses in das Objekt
erschwert wird. Auch verholzte Objekte erwiesen sich nach einer Behandlung mit
Glycerin als besser schneidbar.
Färben:
Das Färben der Schnitte erfolgte mittels einer Safranin-Astrablau-Färbung nach
GERLACH (1984, S. 128 f) und wurde wie folgt modifiziert. Dem Färben der Schnitte ging
das Entfernen des Wachses mittels Roticlear® (ROTH), anstelle von Histol, voraus.
Anschließend wurden die Schnitte als Vorbereitung auf das Anfärben über eine
absteigende Alkoholreihe auf die wässrige Safranin-Astrablau-Färbung vorbereitet:
MATERIAL & METHODEN
22
Roticlear I 10 min.
Roticlear II 10 min.
Roticlear/Isopropanol (abs.), 1:1 5 min.
Isopropanol (abs.) 5 min.
Etahnol (96 %) 5 min.
Ethanol (70 %) 2 min.
Ethanol (50 %) 2 min.
Aqua dest. 2 min.
Anfärben der Schnitte:
Astrablau (0,5 g in 2 % iger Weinsäurelsg.) 5 min.
Aqua dest. kurz waschen
Aqua dest. kurz waschen
Aqua dest. kurz waschen
Safranin (1 % w/v) 5 min.
Aqua dest. kurz waschen
Aqua dest. kurz waschen
Aqua dest. kurz waschen
Verholzte Zellwände (Lignin) werden mit Safranin rot, reine Cellulose(wände) mit
Astrablau blau angefärbt. Um einer Pilzinfektion vorzubeugen, ist dem Astrablau eine
Messerspitze Phenol zugesetzt. Eine bleibende Überfärbung der Schnitte ist durch
Differenzieren nach Augenmaß zu vermeiden:
Aqua dest. + 3 Tropfen HCl (5 %)
Im Anschluss an das Differenzieren erfolgte die Entwässerung und Überführung in
Roticlear, um die Serienschnitte für das Eindecken vorzubereiten:
Ethanol (70 %) kurz waschen
Ethanol (96 %) kurz waschen
Isopropanol (abs.) 2 min.
Roticlear I 5 min.
Roticlear II 5 min.
Roticlear III 5 min.
Für die Herstellung von Dauerpräparaten wurden die Schnitte mit ENTELLAN® NEU
(MERCK) eingedeckt. Zusätzlich wurden mit einem Handmikrotom (ALLMIKRO) einzelne
MATERIAL & METHODEN
23
Gewebeschnitte von frischem Pflanzenmaterial (bzw. 24 h FAA-fixierten Proben) für die
Fluoreszenzmikroskopie hergestellt.
2.2.3 Rasterelektronenmikroskopie (REM)
Die in 70 %igem Ethanol aufbewahrten und präparierten Proben wurden vor der
rasterelektronenmikroskopischen Untersuchung für 12 h zur chemischen Entwässerung
in FDA (Formaldehyd-Dimethyl-Acetal; FLUKA) überführt. Darüber hinaus fungiert FDA als
Intermedium bei der Critical-Poit-Trocknung (GERSTERBERGER & LEINS, 1978) und wurde
im Verlauf des Trocknungsvorganges durch das eigentliche Trocknungsmedium CO2
ersetzt, welches im flüssigen Aggregatzustand (50 bar/10 °C) vorliegt und dessen
Kritischer Punkt bei 42 °C/73 bar erreicht wird. Verwendet wurde ein Critical Porint Dryer
CPD 030 der Firma BALZERS/BAL TEC AG.
Für die Präparation der Vegetationskegel von S. verticillata erwies es sich als vorteilhaft
die Objekte nach der Trocknung (unmittelbar vor dem Aufkleben) nachzupräparieren. Je
nach Präparatgröße erfolgte das Aufbringen der Objekte auf die massiven
Aluminiumzylinder entweder mit Leit-C (NEUBAUER CHEMIKALIEN) oder Leit-Tabs der Firma
PLANO. Zur Vorbereitung auf das Rasterelektronenmikroskop werden Objekte mit Hilfe
eines Sputtergerätes SCD von BALZERS mit einer dünnen Schicht Gold belegt. Für
Gymnospermenknospen erwies sich eine Besputterungszeit von ca. 5 min. als optimal.
Abhängig von der jeweiligen Oberflächenstruktur der Objekte musste teilweise
nachträglich erneut besputtert werden.
MATERIAL & METHODEN
24
2.3 Molekulargenetische Methoden
2.3.1 Allgemeines
Spezielle Abwandlungen bzw. Varianten der angegebenen Protokolle und
Arbeitsschritte, sowie genauere Angaben zu jeweils speziell verwendeten Primern etc.
werden im Folgenden eher allgemein behandelt. Die betreffenden Arbeitsschritte
werden, im Zuge der Methodenetablierung für Gymnospermen, im entsprechenden
Ergebnisteil aufgegriffen und Objekt bezogen(er) besprochen.
2.3.1.1 Primerdesign
Über die Suche in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), kurz NCBI, wurden bekannte Gensequenzen aus-
gewählter Pflanzen ermittelt. Zum Erstellen degenerierter Primer wurden entsprechende
Gensequenzen aus Angio- und Gymnospermen ausgewählt und in einem Alignment
unter Anwendung des Programms VectorNTI (INVITROGEN) verglichen. Hergestellt wurden
abhängig vom jeweiligen Versuchsansatz auch spezifische Primer. Die Synthese der
Primer aus der angegebenen Basensequenzen erfolgte durch die Firma MWG BIOTECH
(http://www.mwg-biotech.com).
2.3.1.2 Sequenzanalyse
Die zur Verifizierung von Klonierungsprodukten nötige Sequenzierung der DNA wurde
von der Firma MWG BIOTECH (http://www.mwg-biotech.com) durchgeführt. Ein
anschließender Abgleich der erhaltenen mit bereits vorhandenen Sequenzen erfolgte
über die Datenbank-eigene BLAST-Funktion von NCBI (Blast Search:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast).
2.3.2 Material für molekulargenetische Methoden
Die in diesem Kapitel verwendeten Lösungen und Medien werden, sofern nicht allgemein
im Abschnitt Lösungen erläutert, im jeweils zugehörigen thematischen Versuchsabschnitt
bzw. Methodenteil direkt aufgeführt. Sämtliche Lösungen für die in-situ-Hybridisierung
oder andere RNase-sensitive Schritte wurden mit Diethyl-Pyrocarbonat (0,1 %)-
behandeltem Aqua dest. (DEPC-H2O) und Chemikalien in p.a.-Qualität (frisch) angesetzt.
Die entsprechenden Lösungen und entsprechendes Material (Glasware etc.) wurden
autoklaviert bzw. sterilisiert. Die verwendeten Chemikalien, Verbrauchsmaterialien,
Enzyme etc. sind in Tabelle 2 aufgeführt.
MATERIAL & METHODEN
25
Tab. 2: Verwendete Materialien.
I. Chemikalien:
Acrylamid
BCIP/NBT (SIGMAFAST™)
Borsäure
Bromphenolblau
BSA, Fraktion V
CaCl2
Chloroform
Coomassie Brilliant Blue R250
Denhardt’s Lösung
DEPC
Dextransulfat (Natriumsalz)
EDTA (Titriplex)
Eosin
Essigsäure (100 %)
Essigsäureanhydride
Ethanol p.a
Ethidiumbromid
Formaldehyd (37 %)
Formamid
Glucose
Glutathion
Glycin
Glycerin
HCl (36-38 %)
HCl (2M, Lsg.)
IPTG
Isopropanol
KCl
Lithiumchlorid
MgCl2.6 H20
ß-Mercaptoethanol
Methanol
NaCl
Na2HPO4.2 H2O
NaH2PO4.H2O
NaOH (Pellets)
NaOH (4M, Lsg.)
Natriumacetat
OrangeG
Paraformaldehyd (16 %)
Polyvinylalkohol
Roti-Histol
SDS
APPLICHEM
SIGMA ALDRICH
APPLICHEM
SIGMA-ALDRICH
APPLICHEM
J. T. BAKER, BAKER ANALYZED
J.T. BAKER, BAKER ANALYZED
SIGMA-ALDRICH
APPLICHEM
APPLICHEM
APPLICHEM
MERCK
WALDECK DIVISION CHROMA
VWR LABORHANDEL
SIGMA-ALDRICH
MERCK
APPLICHEM
J. T. BAKER, BAKER ANALYZED
VWR-NORMAPUR
J.T. BAKER
MERCK
APPLICHEM
J.T. BAKER
J.T. BAKER, BAKER ANALYZED
APPLICHEM
APPLICHEM
J.T. BAKER, BAKER ANALYZED
J.T. BAKER, BAKER ANALYZED
J.T. BAKER, BAKER ANALYZED
APPLICHEM
MERCK
J. T. BAKER
J.T. BAKER, BAKER ANALYZED
J.T. BAKER, BAKER ANALYZED
J.T. BAKER, BAKER ANALYZED
J.T. BAKER, BAKER ANALYZED
RIEDEL-DE HAEN
J.T. BAKER, BAKER ANALYZED
APPLICHEM
ELECTRON MICROSCOPY SCIENCE
MERCK
ROTH
APPLICHEM
MATERIAL & METHODEN
26
Select Pepton
Triethanolamin
Tris
TrisHCl
Trypton
Tween 20
x-Gal
BD BIOSCIENCE
FLUKA/BIOCHEMIKA
APPLICHEM
APPLICHEM
APPLICHEM
APPLICHEM
APPLICHEM
II. Verbrauchsmaterial:
Agar
Agarose
Ampicillin
Entellan
Histowax
Paraplast Plus
PROTRAN BA85 , 0,45 µm /Ø 82 mm
POLYSINE™ Microscope Slides, precleaned;
BD BIOSCIENCE
BIOZYM
APPLICHEM
MERCK
HISTOLAB PRODUCTS AB
TYCO HEALTHCARE/KENDALL
WHATMAN
ESCO/ERIE SCIENTIFIC COMPANY
III. Enzyme & Sonstiges
PWO-Polymerase (1 u/µl)
Taq-Polymerase (5 u/µl)
T4-DNA-Ligase (1u/µl)
T7-Polymerase (1u/µl)
ProteinaseK-Lsg. (20mg/ml)
RevertAid™ H Minus M-MuLV Reverse Transkriptase (200u/µl)
RNaseA (10 mg/ml)
Restriktionsendonukleasen
*
Yeast tRNA
GeneRuler TM 100bp DNA LadderPlus (0,5 µg/Spur)
Hefe-Extrakt
DIG RNA Labeling Mix (DIG UTPs)
Nukleasefreies H2O, Molecular Biology Grade
SDS-Marker (MW-SDS-70L, 66 kDa)
PEQLAB
PEQLAB
FERMENTAS
FERMENTAS
APPLICHEM
FERMENTAS
APPLICHEM
NEW ENGLAND BIOLABS (NEB)
*
INVITROGEN (LIFE TECHNOLOGIES)
FERMENTAS
BD BIOSCIENCE
ROCHE
EPPENDORF
SIGMA-ALDRICH
2.3.2.1 Oligonukleotide
Die in dieser Arbeit verwendeten spezifischen und degenerierten Primer (dP) sind in
Tabelle 3 aufgelistet.
Tab. 3: Verwendete Primer.
Primer Sequenz
dP-SvKnox for1
dP-SvKnox for2
dP-SvKnox rev1
5’-CCRGARYTMGAYCARTTYATGGARGCWTAC –3’
5’-AAGAARAARAAGAAAGGDAARCTYCC –3’
5’-GGRAGYTTHCCTTTCTTYTTYTTCTT –3’
MATERIAL & METHODEN
27
dP-SvKnox rev2
Knat1 for
Knat1 rev
PaHbk1 for
PaHbK1rev
PhyN1 for
PhyN1 rev
SvSondeKnox for1
SvSondeKnox for2
SvSondeKnox rev1
SvSondeKnox rev2
SvGST for
SvGST rev
5’-ATRAACCAATTRTTKATTTGYTTYTGATCYARCCC–3’
5’–GGAATTCCATGGAAGAATACCAGC –3’
5’–GGGGTACCCCTTATGGACCGAGACG -3’
5’-CCTCGAGGGTACCCATGGAGCACCTGAATGCAG -3’
5’-GCGGCCGCGAGCTCGTTAGCAATCCAAATGATAGCC –3’
5’–CGAATTGGGTACCGATGATCATGGGGAGGTGAT –3’
5’–GCTGGAGCTCGATGTTGGGCTTCTGAGTGA –3’
5’–CCGAGCTCGAAGATTGCAGCACTGGTGAA –3’
5’–CTCAAGCTTAAGTTTACCTTTCTTTTTCTTCTTC –3’
5’–CCGAGCTCAAGTTTACCTTTCTTTTTCTTCTTC –3’
5’–CTAAGCTTGAAGATTGCAGCACTGGTGAA –3’
5’–CAGTGAATTCCCGGAGTTAGATCAATTTATGGA –3’
5’–GCCCTCGAGAAGTTTACCTTTCTTTTTCTTCTT –3’
2.3.2.2 Plasmide
Für die Klonierung von erstellten PCR-Fragmenten kamen folgende Plasmide zum
Einsatz:
Tab. 4: Verwendete Plasmide.
Plasmid Quelle
pBlueskript® SK +
pCR II TOPO
pJET 1.2
pGEM-11Zf
pGEX-4T1
STRATAGENE
INVITROGEN
FERMENTAS
PROMEGA
GE HEALTHCARE
2.3.2.3 Bakterienstämme
Zur Amplifikation von DNA und zur heterologen Expression wurden verschiedene
Stämme von E. coli verwendet:
Tab. 5: Verwendete Bakterienstämme.
Stamm Genotyp Quelle
DH5α*
TOP10
BL21(DE3)
F-Ф80dladacZ∆M15, rec A1, end A1, gyrA96, thi-1, hsd R17, (rK-mK-), sup E44, rel A1, deo R, (lac ZYA-arg F) U169 F- mcr A ∆(mrr-hsd RMS-mcr BC) Ф80lac Z∆M15 ∆lacX74 rec A1 deo R ara D139 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) end A1 nup G F- ompT hsdSB(rB
-mB-) gal dcm (DE3)
HANAHAN, 1983
INVITROGEN
INVITROGEN
*nur für Amplifkation der Vektoren verwendet
MATERIAL & METHODEN
28
2.3.2.4 Kits
Im Rahmen dieser Arbeit wurden für verschiedene molekularbiologische Arbeiten
unterschiedliche Kits verwendet. Die verwendeten Kits sind in Tabelle 6 aufgelistet.
Tab. 6: Verwendete Kits.
Methode Produkt (Hersteller)
Isolierung von Nukleinsäuren
Aufreinigung von Nukleinsäuren
cDNA-Synthese
Gelelution/Extraktion
Ligation
Sondenherstellung/Markierung
Detektion
- Rneasy Plant Mini Kit for Isolation of Total RNA from Plant
Cells and Tissue and Filamentous Fungi (QIAGEN)
- DNeasy Plant Mini Kit for Isolation of Total DNA from
Plant Cells and Tissue (QIAGEN)
- FastPlasmid® Mini Kit (EPPENDORF)
- RNA-Clean up Kit (MACHERYNAGEL)
- Revert Aid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit
(FERMENTAS)
- Perfectprep® Gel Cleanup Kit (EPPENDORF)
- GeneJet PCR Cloning Kit (FERMENTAS)
- TA Cloning Kit (INVITROGEN)
-Transcript AidTM T7 High Yield Transcription Kit
(FERMENTAS)
- DIG Nucleic Detection Kit (ROCHE)
2.3.2.5 Lösungen
Verwendung fanden folgende Puffer und Stammlösungen. Weitere, aus den
Stammlösungen angesetzte Lösungen, sind direkt in den jeweiligen Versuchsabläufen
aufgeführt.
DEPC-H2O, 1000 ml:
1 ml DEPC auf 1000 ml Aqua dest.,
über Nacht rühren (Abzug!),
im Anschluss autoklavieren!
Dextransulfat:
10 g Dextransulfat in 15 ml
DEPC-H2O
DNA-Probenpuffer (4x):
40 % (w/v) Saccharose
0,1 % (w/v) OrangeG
DNA-Probenpuffer (5x):
50 % (w/v) Glycerin
0,1 % (w/v) Bromphenolblau
NTE, pH 8,0:
0,5 M NaCl
10 mM Tris-HCl
1 mM EDTA
Puffer 1, pH 7,5:
100 m Tris-HCl
150 mM NaCl
MATERIAL & METHODEN
29
Puffer 2, pH 9,5:
100 mM Tris-Base
100 mM NaCl
50 mM MgCl2
PBS (10x):
1,3 M NaCl
0,07 M Na2HPO4
0,03 M NaH2PO4
DEPC-H2O ad 1000 ml
Proteinase K-Puffer:
20 mM Tris-HCl, pH 7,0
2 mM CaCl2
Salze (10x):
3 M NaCl
0,1 M Tris
0,05 M EDTA
0,5 M NaH2PO4·2 H2O
0,5 M Na2HPO4
SSPE (20x), pH 7,4:
3M NaCl
20 mM EDTA
200 mM NaH2PO4·2 H2O
TBE (1x), pH 8:
90 mM Trisbase
90 mM Borsäure
2, 5 mM EDTA
2.3.3 Isolierung von RNA & DNA aus Pflanzen
Die Isolierung der Gesamt-RNA aus Pflanzenmaterial (vergleiche 2.1, Tab. 1) erfolgte
mittels RNeasy Plant Mini Kit von QIAGEN (Tab. 6). Hierzu wurde das Pflanzenmaterial in
flüssigem Stickstoff pulverfein gemörsert. Die Isolierung erfolgte nach Angaben des
Herstellers inklusive aller Optionalschritte und unter Verwendung des RLT-Puffers.
Eingesetzt wurden max. 100 mg des Gewebepulvers. Nach Zugabe von 450 µl RLT-
Puffer wurden die Zellen unter vortexen und zusätzlicher 1 bis 3 min. Inkubation bei
56° C unter Zuhilfenahme eines Mini-Pistills lysiert. Zum Scheren der DNA und zur
weiteren Homogenisierung bzw. Reduktion der Viskosität wurde die Probe durch einen
Filter (QIASHREDDER) zentrifugiert (2 min./13.000 rpm). Der wässrige Überstand wurde
mit 0,5 Volumen Ethanol (100 %) versetzt. Die Probe wurde komplett auf einen Filter
gegeben und durch Zentrifugation (15 sec./10.000 rpm) an eine Silica-Gelmembran
gebunden. Die Membran wurde im Anschluss dreimal gewaschen: mit 700 µl RW1-Puffer
und Zentrifugation für 15 sec. bei 10.000 rpm, mit 500 µl RPE-Puffer inklusive einer
Zentrifugation für 15 sec. bei 10.000 rpm und 500 µl RPE für 2 min. Durch 1 min.
Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit wurde die Membran getrocknet. Die RNA
wurde mit 30 µl RNase freiem H2O eluiert.
Für die DNA-Isolierung aus Pflanzenmaterial wurde das DNeasy Plant Mini Kit der Firma
QIAGEN (Tab. 6) verwendet. Nach Herstellerangaben wurde das Stickstoff-gemörserte
Gewebepulver (max. 100 mg frisch oder 20 mg trocken) mit 400 µl des mitgelieferten
A1-Puffers und 4 µl RNAse (100 mg/ml Stock) versetzt und durch vortexen, sowie mit
Mini-Pistill homogenisiert. Unter zwei- bis dreimaligem Invertieren folgte eine Inkubation
des Lysats für 10 min. bei 65 °C, gefolgt von einer Zugabe von 130 µl des Kit-eigenen
AP2-Puffers, mischen und inkubieren für 5 min. auf Eis. Optional wurde abhängig vom
MATERIAL & METHODEN
30
jeweiligen Lysat zusätzlich bei 14.000 rpm für 5 min. zentrifugiert. Im Anschluss wurde
das komplette Lysat (ggf. Überstand aus Optionalschritt) für 2 min. bei 14.000 rpm durch
einen Filter (QIASHREDDER) zentrifugiert. Dem Überstand wurde zum Klären des Lysats
1,5 Volumen des AP3/E-Puffers (Mischen durch Pipettieren) zugegeben, dann auf eine
Silica-Gelmembran gegeben und 1 min. bei 8.000 rpm zentrifugiert. Die Membran wurde
anschließend mit 500 µl AW-Puffer und Zentrifugation bei 8.000 rpm 1 min. und erneut
mit 500 µl AW-Puffer für 2 min. und 14.000 rpm gewaschen. Die Matrix-gebundene DNA
wurde durch Inkubation mit 100 µl AE-Puffer bei Raumtemperatur und anschließender
Zentrifugation (1 min./8.000 rpm) eluiert. Der Elutionsschritt kann wiederholt werden.
Teilschritte des Kit-eigenen Protokolls wurden, entsprechend einer für Gymnospermen-
optimierten Vorgehensweise nach DOULIS et al. (2000), durchgeführt. Diese Optimierung
beinhaltet in Kürze die Durchführung aller optionalen Schritte der Kit-Vorschrift, die
Vorbehandlung des Mörsers, den Einsatz eines Einweg-Mini-Pistills zur Homogenisierung
(s. o.), die Aufnahme des geklärten Lysats (nach QIASHREDDER Membran) in
0,5 Volumen AP3E und 1 Volumen Ethanol (96-100 %), sowie eine additive
Vakuumbehandlung bei der Zentrifugation zum Trocknen der Membran.
2.3.4 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Die Nukleinsäurekonzentrationen wurden mit einem Spektralphotometer (Ultraspec 3000
pro, AMERSHAM) durch Absorbtionsmessung bei 260 nm bestimmt. Eine OD260 von 1
entspricht einem Gehalt von ca. 40 µg RNA oder 50 µg doppelsträngiger DNA. Der
Quotient OD260/OD280, als Maß für die Reinheit der Nukleinsäuren, sollte zwischen 1,8 und
2 liegen.
2.3.5 cDNA-Synthese
Die unter 2.3.3 isolierte Gesamt-RNA wurde mittels Reverser Transkription in DNA
umgeschrieben. Für die Synthese wurde das First Strand cDNA Synthesis Kit (Tab. 6)
der Firma FERMENTAS verwendet. Für die Erstrangsynthese wurde nach
Herstellerangaben ein 12 µl-Ansatz aus 10 ng-5 µg der RNA, 1 µl Olig(dT)18-Primern
(0,2 µg/µl) und RNase freiem H2O auf Eis pipettiert, 3-5 sec. anzentrifugiert und bei 70 °C
für 5 min. inkubiert. Nach anschließender kurzer Inkubation auf Eis und kurzem
Anzentrifugieren wurde die Probe auf Eis mit 4 µl 5x Reaktionspuffer, 1 µl Ribonuklease-
Inhibitor (20u/µl) und 2 µl 10mM dNTP Mix versetzt. Der Mix wurde kurz zentrifugiert und
für 5 min. bei 37 °C inkubiert. Nach Zugabe von 1 µl Reverser Transkriptase (H Minus,
MATERIAL & METHODEN
31
200 u/µl, Tab. 2 III) wurde 60 min. bei 42 °C inkubiert. Der Reaktionsstop erfolgte bei
70 °C/ 10 min. und Abkühlen auf Eis.
Als Template für die Zweitstrangsynthese wurden 2 µl (10 ng-0,5 µg) des aus der
Erstrangsynthese gewonnenen Produktes eingesetzt. Das Protokoll des Herstellers für
die Amplifizierung wurde in Abhängigkeit der Oligonukleotidsequenz und der Länge des
zu amplifizierenden DNA-Fragments angepasst. Die Annealing-Temperatur war Primer-
spezifisch, die Elongationszeit Template-spezifisch anzupassen. Die Zweitstrang-
synthese erfolgte mittels PCR (siehe 2.3.6), unter Verwendung einer Taq-Polymerase
(PEQLAB).
2.3.6 PCR – Amplifikation von DNA-Fragmenten
Die Protokolle der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurden in Abhängigkeit der
Oligonukleotidsequenzen und der Länge des zu amplifizierenden DNA-Fragments nach
Angaben des „PCR Applications Manual“ (ROCHE) optimiert. Als Template wurden
Plasmid-DNA (10 ng) oder einzelsträngige DNA (10 ng-0,5 µg) aus einer Reversen
Transkription eingesetzt. Verwendet wurde entweder eine Pwo-Poylmerase (PEQLAB) mit
3’-5’-Exonuklease-Aktivität oder eine Taq-DNA-Polymerase (PEQLAB) nach Hersteller-
angaben.
Ansatz (50 µl)
Denaturiert wurde initial bei 2 min./95 °C und zyklisch für je 30 sec./95 °C, das Annealing
findet bei Primer-abhängigen 45-55 °C für 30 sec. statt. Elongiert wird bei 72 °C, wobei
die Elongationszeit Polymerase-, als auch Template-abhängig variiert (Taq: 1 min./kb;
Pwo: 2 min./kb). Alle PCR-Reaktionen wurden im T3-Thermocycler der Firma BIOMETRA
durchgeführt.
Programm:
95 °C
95 °C
x °C
72 °C
72 °C
4 °C
2 min.
30 sec.
30 sec.
x min.
10 min.
Pause
Template (10 ng)
10x Reaktionspuffer (inkl. MgCl2)
5x dNTPs
DNA-Polymerase (1u/µl)
Primer for (100 pmol)
Primer rev (100 pmol)
Aqua dest.
x µl
5 µl
10 µl
x µl
0,5 µl
0,5 µl
ad 50 µl
30x
MATERIAL & METHODEN
32
2.3.7 Agarose-Gelelektrophorese
Die zu analysierenden DNA-Proben wurden mit DNA-Probenpuffer (siehe 2.3.2.5)
versetzt und je nach Fragmentgröße in 1-2 %igen horizontalen Agarose-Gelen
aufgetrennt. Die Agarose (BIOZYM) wurde in 1x TBE-Puffer (siehe 2.3.2.5) aufgelöst und
mit 0,5 µg/ml Ethidiumbromid (APPLICHEM) versetzt. Die Probe wurde zusammen mit
DNA-Probenpuffer (5x oder 4x) auf das Gel aufgetragen. Es wurden beispielsweise
jeweils 5 µl Probe (1/10 eines PCR-Ansatzes) mit je 1,25 µl des 5x Probenpuffers
versetzt. Die Elektrophorese erfolgte bei 140 Volt für 1 h bei Raumtemperatur. Als Marker
wurden 5 µl des GeneRuler 100bp DNA LadderPlus (FERMENTAS) aufgetragen.
2.3.8 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Die elektrophoretisch aufgetrennten DNA-Fragmente wurden unter präparativem
UV-Licht ausgeschnitten und mit dem Gelextraktions-Kit der Firma EPPENDORF (Tab. 6)
nach Protokoll aus dem Gel eluiert. Je ausgeschnittenem Gelstück wurde in 3 Volumen
des Bindungspuffers aufgenommen und für 10 min. bei 50 °C und 1000 rpm aufgelöst.
Die Lösung wurde mit 1 Volumen Isopropanol versetzt, invertiert und auf eine Silica-
Gelmembran gegeben. Nach Zentrifugation wurden 750 µl Waschpuffer auf die Säule
gegeben und erneut zentrifugiert. Der reine Zentrifugationsschritt wurde zum Trocknen
der Säule wiederholt. Die Elution erfolgte durch zentrifugieren mit 30 µl Elutionspuffer
durch pH-Veränderung. Alle Zentrifugationsschritte erfolgten für 1 min. bei 8000 rpm.
Das Eluat wurde bei -20° C gelagert. Um die DNA-Konzentration im Eluat zu erhöhen
wurde in Einzelfällen nur mit 10 µl Elutionspuffer eluiert.
2.3.9 Ligation von DNA-Fragmenten
Als Vorbereitung auf die Transformation in E. coli erfolgte der Einbau des Insert in einen
Vektor bzw. ein Plasmid unter Verwendung des GeneJet PCR Cloning Kit der Firma
FERMENTAS. Die Durchführung richtete sich nach den Angaben des Herstellers. Die
Ligation von Insert (ca. 150 ng DNA) und Vektor (ca. 50 ng DNA) erfolgte mit 1 unit (u)
der Kit-eigenen T4-DNA-Ligase und 10x Ligasepuffer ü. N. bei 16 °C in einem Volumen
von 20 µl. Zur Klonierung von DNA-Fragmenten ohne freie Überhänge wurde alternativ
das TA-Klonierungs Kit der Firma INVITROGEN (Tab. 6) nach Angaben des Herstellers
verwendet.
MATERIAL & METHODEN
33
Ligationsansatz
DNA
Vektor
steriles H2O
Ligationspuffer
Ligase
4 µl
2 µl
2 µl
1 µl
1 µl
Zur Vermehrung des Insert wurde anschließend die Hälfte des Ligationsansatzes in
CaCl2-kompetente E. coli-Zellen (TOP 10, INVITROGEN) transformiert, indem 50 µl der
Zellen (2.3.2.3) auf Eis aufgetaut und nach Zugabe der zu amplifizierenden, ligierten
DNA und einer anschließenden Inkubation von 15 bis 30 min. auf Eis, einem Hitzeschock
für 30 sec. bei 42 °C unterzogen wurden. Der Aufnahme der Zellen in 250 µl SOC-
Medium (s. u.) folgte eine Inkubation für 1 h bei 37 °C und 350 rpm .
SOC-Medium (1000 ml)
1 % (w/v) Trypton
0,5 % (w/v) Hefeextrakt
60 mM NaCl
2,5 mM KCl
10 mM MgCl2
20 mM Glucose
Aqua dest. ad 1000 ml
pH 7,0 mit NaOH, autoklavieren
Nach Sedimentation der Zellen (1 min./13.000 rpm) wurden diese in 50 µl Medium
resuspendiert und auf Selektivplatten (LBamp) ausplattiert, die zur Blau/Weiß-Selektion
mit 80 µl eines X-Gal/IPTG-Gemisches (1:1) versetzt waren. Die Vermehrung der
positiven (weißen) Klone erfolgte wie in 2.3.10 beschrieben.
2.3.10 Kultivierung von E. coli
Die Anzucht der E. coli-Stämme erfolgte in LB-Vollmedium, je nach Bedarf auf
Festagarplatten oder in Flüssigkultur (Kulturvolumen 1/10 bis 1/5 des Gefäßvolumens).
Hierzu wurde eine LB-Kultur (3 ml) mit einer einzelnen Bakterienkolonie angeimpft und
auf einem Rundschüttler über Nacht (ü. N.) bei 37° C inkubiert.
LB-Medium,pH 7,5
0,5% (w/v) Hefeextrakt
1 % (w/v) Select-Pepton
1 % (w/v) NaCl
pH 7,5 mit NaOH
MATERIAL & METHODEN
34
Zur Verwendung von LB-Festagarplatten wurde dem Flüssigmedium 14 % Agar (BD
BIOSCIENCE) zugegeben. Das LB-Medium wurde bei 120 °C, 20 min. autoklaviert.
Transformanten wurden unter Selektionsdruck mit Ampicillin (100 µg/ml Medium,
APPLICHEM) angezogen.
2.3.11 Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli
Die Präparation der zu amplifizierenden Plasmid-DNA erfolgte unter Verwendung des
Plasmidisolierungs-Kit der Firma EPPENDORF (Tab. 6). Hierzu wurden 1,5 ml einer
ü. N.-Bakterienkultur in einer Tischzentrifuge für 1 min. bei 13.000 rpm sedimentiert und
anschließend durch Zugabe von 400 µl 4 °C kaltem Lysis-Puffers durch 30 sec. vortexen
lysiert. Nach 3 min. Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Ansatz auf eine Silica-
Gelmembran gegeben. Nach Zentrifugation für 30-60 sec. bei 13.000 rpm wurden 400 µl
des Waschpuffers aufgetragen und erneut für 30-60 sec. bei 13.000 rpm zentrifugiert.
Die gebundene DNA wurde durch eine erneute Zentrifugation (1 min./13.000 rpm)
getrocknet. Die Elution erfolgte nach Zugabe von 50 µl des mitgelieferten Elutionspuffers
durch pH-Veränderung und anschließender Zentrifugation für 1 min. bei 13.000 rpm. Das
Eluat kann sofort weiterverwendet oder bei -20°C zwischengelagert werden.
2.3.12 Verdau von DNA mittels Restriktionsendonukleasen
Die eingesetzten Restriktionsenzyme richteten sich jeweils nach der weiteren
Verwendung der geschnittenen Fragmente (glatte „blunt“ oder überstehende „sticky“
DNA-Enden). Die Restriktion erfolgte unter den vom Hersteller der
Restriktionsendonukleasen (NEW ENGLAND BIOLABS) empfohlenen Bedingungen und im
empfohlenen Puffersystem. Die eingesetzte Enzymmenge richtete sich nach der
jeweiligen DNA-Konzentration, die Ansatzgröße nach der Weiterverwendung. Der Ansatz,
aus Restriktionspuffer (10x), BSA (10x), Plasmid-DNA bzw. PCR-Produkt, Restriktions-
enzym und Aqua dest. wurde 1,5 bis 2 h bei 37 °C inkubiert und zur Überprüfung auf ein
Agarosegel (siehe 2.3.5) aufgetragen.
2.3.13 DNA-Fällung (Phenolextraktion)
Wässrige DNA-Lösungen wurden durch Zugabe eines identischen Volumens einer
Phenol/Chloroform-Mischung (1:1) von Proteinresten gereinigt. Der Ansatz wurde für
5 min. bei 13.000 rpm zentrifugiert. Der Vorgang wurde solange wiederholt bis keine
Interphase mehr sichtbar war. Der komplette wässrige Überstand wurde anschließend
MATERIAL & METHODEN
35
mit Chloroform extrahiert und die DNA präzipitiert, indem der Lösung Natriumacetat (pH
5,5) in einer Endkonzentration von 0,4 M zugesetzt wurde. Anschließend wurden
1,25 Volumen eiskaltes Isopropanol zugegeben und bei Raumtemperatur für 45 min.
inkubiert. Die Sedimentation der DNA erfolgte durch Zentrifugation (10 min./13.000 rpm)
bei 4 °C und zweimaliges Waschen mit Ethanol (70 %). Das Sediment wurde
abschließend bei 55 °C für 10 min. getrocknet und in nukleasefreiem Wasser (Tab. 2 III)
resuspendiert.
2.3.14 in-vitro-Transkription: Herstellung Digoxigenin-markierter
RNA-Sonden
Die Digoxigenin (DIG)-markierten Antisense-mRNA-Sonden sowie entsprechende
(Sense–)Kontrollen wurden unter Verwendung des in-vitro–Transkriptions-Kits von
FERMENTAS (Tab. 6) nach Herstellerangaben synthetisiert. Die Markierung erfolgte in
Kombination mit dem DIG RNA Labeling Mix von ROCHE. Als Sondentemplate diente ein
linearisierter Vektor inklusive der einklonierten DNA-Matritze mit vorgelagerter
Promotorsequenz für die verwendete T7-RNA-Polymerase. Der restringierte Vektor wurde
gefällt (siehe 2.3.13) und in einer finalen Konzentration von 1 µg/Ansatz im
in-vitro-Transkriptionsansatz (20 µl) eingesetzt. Der Ansatz wurde bei 37 °C für 4 bis 8 h
inkubiert.
Transkriptionsansatz (20 µl)
Transkriptionspuffer (5x)
DIG-RNA Labeling Mix (ROCHE)
Sondentemplate (1µg)
T7-Polymerase
RNase freies H2O
4 µl
8 µl
x µl
2 µl
ad 20 µl
Anschließend wurde das DNA-Template durch Zugabe von 2 µl DNase I und Inkubation
für 15 min. bei 37 °C verdaut. Die RNA-Sonde wurde zur Beseitigung verbliebener freier
Nukleotide nachfolgend mit 2 µl 0,5 M EDTA bei 65 °C, 10 min. gefällt. Für die
nachfolgende Aufreinigung der RNA mittels RNA-Clean up-Kit (MACHERY-NAGEL) wurde
der Ansatz unter Zugabe von 76 µl DEPC-H2O auf 100 µl aufgefüllt. Aufgereinigt wurde
über eine Affinitätssäule unter Zugabe von 600 µl RA1-Puffer und Zentrifugation
(30 s/10.000 rpm), sowie Zugabe von 700 µl RA3-Puffer und Zentrifugation für 30 s,
10.000 rpm. Nach Zentrifugation (2 min./10000 rpm) mit 350 µl RA3-Puffer wurde
zweimal mit je 40 µl des mitgelieferten DEPC-H2O und 1 min. Zentrifugation bei
10000 rpm eluiert. Die Proben wurden bis zum Gebrauch bei -80 °C gelagert.
MATERIAL & METHODEN
36
Die anschließende Quantifizierung mittels Dot Blot-Analyse wurde nach Angaben von
ZACHGO (2002), leicht abgewandelt, durchgeführt. Als Kontrolle dienten unmarkierte
Antisense-mRNA-Sonden bzw. (markierte) Sense-mRNA-Sonden. Die Anti-DIG-
AP-konjugierten Antikörper und die Blocking Reagenz sind Komponenten des
DIG Nucleic Detection Kit von ROCHE. Als Positivkontrolle kann auch eine bereits
getestete mRNA-Sonde dienen.
Dot Blot:
Für die Quantifizierung nach ZACHGO (2002) wurden die markierte RNA-Sonde und die
Kontrolle jeweils mit nukleasefreiem Wasser (EPPENDORF, Tab. 2 III) im Verhältnis 1:10,
1:100 und 1:1000 verdünnt. Anschließend wurde je 1 µl der unverdünnten Probe und je
1 µl der verdünnten Proben auf eine Nitrocellulosemembran (PROTRAN BA85,
0,45 µm/Ø 82 mm, WHATMAN) aufgetragen und danach wie folgt denaturiert, neutralisiert,
equilibriert und geblockt:
NaOH (0,2 M) 5 min.
2x SSPE 5 min.
Puffer 1 + Tween 20 (0,1 %) 5 min.
Puffer 1 + Tween 20 (0,1 %) + Blocking Reagenz (0,5 %) 20 min.
Puffer 1 + Antikörperlösung (1:3000, verdünnt in Puffer 1) 50 min.
Puffer 1 + Tween 20 (0,1 %) 5 min.
Puffer 1 + Tween 20 (0,1 %) 5 min.
Puffer 1 + Tween 20 (0,1 %) 15 min.
Puffer 2 5 min.
Nach dem Equilibrieren in Puffer 2 wurde die Membran bis zum Sichtbarwerden des
Signals in einer Färbelösung aus Puffer 2 (10 ml) mit einer Tablette SIGMAFAST™
BCIP/NBT (SIGMA ALDRICH) für ca. 10 min. inkubiert. Die Zeit bis zum Erscheinen des
Signals kann sondenabhängig variieren.
2.3.15 Expressionsnachweis im Gewebe - in-situ-Hybridisierung
Die Durchführung der in-situ-Hybridisierung erfolgte in Anlehnung an die Methode nach
ZACHGO (2002) unter Verwendung des „In Situ Hybridization Protocol using Digoxigenin-
labeled probes on tissue sections (Stand April 2003)“ der Arbeitsgruppe von
DR. S. GLEISSBERG, Institut für Spezielle Botanik der Universität Mainz. Gegebenenfalls
erforderliche, objektabhängige Abweichungen vom angegebenen Protokoll werden im
Ergebnisteil 3.5.1 ausführlich behandelt und daher im Methodenteil nicht speziell
MATERIAL & METHODEN
37
vermerkt. Die nachfolgende Unterteilung dient primär der Übersicht, die Teile stehen
aber meist im engen Zusammenhang. Die Versuchsschritte ohne spezielle
Temperaturangaben erfolgen bei Raumtemperatur.
2.3.15.1 Fixieren & Schneiden des Gewebes
Für die Fixierung des Gewebes wurden zwei unterschiedliche Varianten genutzt.
Abzuwägen ist hier der Einfluss des Fixativs auf die Konservierungseigenschaft und die
Anfärbbarkeit des zu bearbeitenden Gewebes. Ausschlaggebend für die Verwendung
des gewählten Fixativs sollte das jeweilige Gewebe und das gewollte bzw. zu
erwartende Fixierungsergebnis sein. Fixiert wurde unter Einsatz des unter 2.2.1
beschriebenen FAA-Gemisches oder einer 4 %igen Paraformaldehydlösung (PFA) nach
ZACHGO (2002). Die Lösungen wurden immer frisch angesetzt und auf Eis gelagert. Das
Einbringen des Objekts in das gekühlte Fixativ erfolgte direkt, die Proben durften
nachfolgend zu keiner Zeit mehr trocken fallen. Für eine optimale Penetration der Probe
war es erforderlich zu Beginn solange unter Vakuum zu fixieren bis die Proben
absanken. Die Vakuumbehandlung erfolgte unter Zugabe eines Detergenz (ca. 0,1 %
Tween20 oder TritonX) für 30 bis 60 min. auf Eis.
Aufgrund der Flüchtigkeit einiger Fixativbestandteile wurde am Ende der
Vakuumbehandlung ein Fixativ-Wechsel durchgeführt. Die Proben wurden bei 4 °C über
Nacht (ü. N.), unter ständiger Bewegung im Fixativ inkubiert. Die komplette Fixierdauer
richtete sich nach den Penetrationseigenschaften des Fixativs und der Probengröße
(Gewebsstärke). Eine 4 %ige Paraformaldehyd-Lösung penetriert 2 mm Gewebe in 1 h
bei Raumtemperatur (ZACHGO, 2002). Zum Waschen wurden die Objekte bei 4 °C
zweimal für je 30 min. in 1x PBS inkubiert.
Variante I:
4 % Paraformaldehydlösung (PFA, 40 ml)
16% Paraformaldehyd (1 Ampulle)
10x PBS
DEPC-H2O
→ optional: Zugabe von Tween20 (o. TritonX)
10 ml
4 ml
26 ml
Variante II:
Das FAA-Gemisch (vergleiche 2.2.1) wurde frisch und in p.a.-Qualität hergestellt. Fixiert
wurde 72 h bei 4 °C. Anschließend wurden die Proben zweimal jeweils 5 min. in
70 %igem Ethanol auf Eis gewaschen (vgl. ZACHGO, 2002) und ü. N. in 70 %igem Ethanol
belassen. Bei Bedarf erfolgte eine ca. 10 min. Vakuumbehandlung (aber ohne
MATERIAL & METHODEN
38
Detergenz) mit anschließendem Fixativwechsel. Die Dehydrierung erfolgte wie
nachfolgend beschrieben, beginnend mit dem 70 %igen Ethanol-Schritt.
Als Vorbereitung auf die Paraffinbehandlung wurde über eine aufsteigende Alkoholreihe
dehydriert und in Roti-Histol von ROTH (als Intermedium) überführt:
Ethanol 30 % 60 min.
Ethanol 50 % 60 min.
Ethanol 70 % 60 min.
Ethanol 85 % 60 min.
Ethanol 95 % (w/Eosin) 60 min.
Ethanol 100 % 60 min.
Ethanol 100 % 60 min.
Ethanol 100 % : Roti-Histol (1:1) 60 min.
Roti-Histol 100 % 60 min.
Roti-Histol 100 % 60 min.
Anschließend wurden die Proben in einen Glasbehälter überführt mit Roti-Histol bedeckt
und mit ausreichend (1/5 Volumen) frischem Paraplast Plus (Schmelzpunkt 56 °C, TYCO
HEALTHCARE/KENDALL) oder HISTOWAX® (Schmelzpunkte 56-58 °C, HISTOLAB PRODUCTS
AB) überschichtet. Die Proben wurden eine Woche lang in Wachs belassen und bei ca.
60 °C gelagert. Um Rückstände des Intermediums Roti-Histol zu entfernen, erfolgte ein
täglicher Wachsaustausch und ein einmaliger Wechsel des Glasbehälters. Die
Vorgehensweise beim Einbetten, Aufblocken und Schneiden ist identisch mit der im
histologischen Teil 2.2.2, wobei hier allerdings ausschließlich sterile Geräte etc.
verwendet wurden. Die 10 µm starken Gewebeschnitte wurden auf
Polylysin-beschichteten Objektträger (POLYSINE™ Microscope Slides, ESCO/ERIE
SCIENTIFIC COMPANY) mittels DEPC-H2O bei 40 °C staubgeschützt gestreckt und ü. N. bei
40 °C, unter Verwendung eines Staubschutzes, getrocknet. Die trockenen Schnitte
wurden bis zum Gebrauch bei 4 °C gelagert.
2.3.15.2 Prähybridisierung
Die ü. N. getrockneten Gewebeschnitte aus 2.3.15.1 wurden in mehreren aufeinander
folgenden Schritten deparaffinisiert und auf die Hybridisierungsreaktion (siehe 2.3.15.3)
vorbereitet.
Deparaffinisierung:
MATERIAL & METHODEN
39
Roti-Histol (2x gebraucht) 5 min.
Roti-Histol (1x gebraucht) 5 min.
Roti-Histol (frisch) 5 min.
Roti-Histol:EtOH (1:1) 5 min.
100% EtOH 5 min.
100% EtOH 5 min.
95% EtOH in 0,85% NaCl 2 min.
85% EtOH in 0,85% NaCl 2 min.
70% EtOH in 0,85% NaCl 2 min.
50% EtOH in 0,85% NaCl 2 min.
30% EtOH in 0,85% NaCl 2 min.
0,2 M HCl 20 min.
DEPC-H2O 10 sec.
DEPC-H2O 10 sec.
2x SSPE 20 min., 70 °C
Proteinase K (5 µg/ml) in 37 °C warmem DEPC-H2O 37 °C, 20 min.
2x SSPE 5 min.
100mM Triethanolamine, pH 8
+ 0,5 % Essigsäure-Anhydride unter Rühren 10 min.
2x SSPE waschen
2x SSPE waschen
0,85 % NaCl kurz
30 %Ethanol* kurz
50 % Ethanol* kurz
70 % Ethanol* kurz
85 % Ethanol* kurz
95 % Ethanol* kurz
100 % Ethanol* kurz
100 % Ethanol* kurz
Die Proben können bei 4° C in geschlossener Küvette mit etwas 100 % Ethanol für einige
Stunden (zwischen)gelagert werden. Die letzte Ethanol-Reihe (*) kann für den im
Anschluss an die Detektion anstehenden Dehydrierungsschritt (siehe 2.3.15.6)
aufgehoben werden.
MATERIAL & METHODEN
40
2.3.15.3 Hybridisierung
Im Anschluss an die Deparaffinisierung erfolgte die Hybridisierung der Proben:
Hybridisierungslösung (8 ml)
Formamide
50% Dextransulfat
10x Salze (RT)
tRNA 10 mg/ml
50x Denhardt’s Reagenz
DEPC-H2O
4 ml
2 ml
1 ml
100 µl
200 µl
700 µl
Die Hybridisierungslösung der Proben ist frisch anzusetzen und kann bis zum Gebrauch
bei 55 °C gelagert werden. Die benötigte Lösungsmenge variierte. Als Richtwert wurde
mit 400 µl Hybridisierungslösung pro Objektträger kalkuliert. Es wurden gleichzeitig
Ansätze mit verschiedenen Sondenkonzentrationen und Kontrollen vorbereitet.
Probenvorbereitung:
Vor der eigentlichen Hybridisierung wurden die Schnitte für 30 min. bei 55 °C inkubiert.
Die Objektträger wurden in einer Hybridisierungskammer (verschließbare Box,
chloroformgereinigt) so auf Schienen gelagert, dass sie weder untereinander noch mit
dem 4x SSPE getränkten Filterpapier des Kammerbodens in Kontakt kamen. Die Ecken
jedes Objektträgers wurden mit Abstandshaltern (Glassplitter) für das Deckglas
versehen. Proben und Kontrollen sind immer in getrennten Hybrisierungskammern zu
lagern.
Sondenmix:
Die optimale Konzentration der Antisense-mRNA-Sonde wurde vorab per Dot Blot
(2.3.14) ermittelt. Die entsprechende Menge Antisense-mRNA-Sonde wurde mit der
55 °C warmen Hybridisierungslösung auf ein Endvolumen von 50 µl pro Objektträger
aufgefüllt und durch Invertieren gemischt. Für die Kontrollansätze wurde entsprechend
verfahren, jedoch mit unmarkierter Sonde, mit Sense-Sonde oder ohne Sonde/nur mit
Hybridisierungslösung. Der Mix aus Hybridisierungslösung plus Sonde wurde dann für
2 min. bei 80 °C, anschließend 5 min. auf Eis inkubiert und kurz anzentrifugiert. Nach
Zentrifugation wurde mit weiteren 350 µl warmer Hybridisierungslösung (55 °C) auf ein
Endvolumen von 400 µl je Objektträger aufgefüllt und durch vorsichtiges Pipettieren
homogenisiert. Die Gewebeschnitte wurden je Objektträger mit 400 µl des kompletten,
warmen (55 °C) Sondenmixes (in verschlossener Hybridisierungskammer) ü. N. bei
konstanten 55 °C hybridisiert.
MATERIAL & METHODEN
41
2.3.15.4 Waschen nach der Hybridisierung
Die Deckgläschen wurden vorsichtig mit warmem 3x SSPE (45 °C) abgespült. Die
Gewebeschnitte wurden dann wie folgt gewaschen und währenddessen leicht bewegt:
3x SSPE 30 min., 45 °C
3x SSPE 30 min., 45 °C
3x SSPE 30 min., 45 °C
NTE 20 min., 37 °C
RNase A (20 µg/ml) in NTE 30 min., 37 °C
NTE 5 min., 37° C
NTE 5 min., 37° C
1,5x SSPE 30 min., 52 °C
1x SSPE 30 min., 52 °C
0,4x SSPE 30 min., 52 °C
2.3.15.5 Detektion des Signals
Antikörperinkubation:
Vor der eigentlichen Behandlung mit Anti-DIG-Antikörpern wurden die Objekte wie folgt
vorbehandelt:
Puffer 1 5 min.
Puffer 1 + 0,5 % Blocking Reagenz 30 min
Puffer 1 + 1 % BSA + 0,1 % Tween 20 30 min.
Für die Antikörperinkubation der Schnitte mit 300 µl verdünnter Antikörperlösung wurden
die Anti-DIG-AP-konjugierten Antikörper aus dem DIG Nucleic Detection Kit von ROCHE
mittels Puffer 1 + 0,1 % BSA im Verhältnis 1:3000 verdünnt. Inkubiert wurde in einer
geschlossenen Box für 1 h bei Raumtemperatur (Deckgläschen auflegen) ohne Kontakt
zum Aqua dest.-getränkten Filterpapier (Schienen). Daran schlossen sich mehrere
Waschschritte an:
Puffer 1 + 0,1 % BSA & Tween 20 20 min.
Puffer 1 + 0,1 % BSA & Tween 20 20 min.
Puffer 1 + 0,1 % BSA & Tween 20 20 min.
Puffer 1 + 0,1 % BSA & Tween 20 20 min.
Puffer 2 + 0,1 % Tween 20 5 min.
MATERIAL & METHODEN
42
Anschließend wurden Boden, Kanten und Beschriftungsfeld der Objektträger getrocknet
und auf Schienen in eine mit Aqua dest. befeuchtetem Filterpapier ausgelegte Box
gegeben. Die geschlossene Box ist komplett vor Lichteinstrahlung zu schützen.
Außerdem wurden die Objektträger mit Abstandshaltern für die Deckgläser versehen.
Die Detektionslösung bestand aus einer Tablette SIGMAFAST™ BCIP/NBT (SIGMA
ALDRICH), die in 10 ml Polyvinylalkohol, DEPC-H2O oder Puffer 2 für mind. 2,5 h Rotation
bei 37 °C und vor Licht geschützt gelöst wurde. Bei reduziertem Raumlicht wurden dann
mindestens 200 µl Detektionslösung pro Objektträger auftragen, jeweils mit Deckglas
versehen und die Schnitte dann für 1 bis 4 Tage lichtgeschützt inkubiert bis sich das
Signal entwickelte. Gegebenenfalls musste Detektionslösung nachgegeben werden.
2.3.15.6 Reaktionsstop
Nach der Detektion wurden die Deckgläser mit Aqua dest. abgelöst und die Objekte zum
Stoppen der Reaktion 5 min. in Aqua dest. inkubiert:
Die Gewebeschnitte (siehe 2.3.15.1) wurden dann über eine aufsteigende Alkoholreihe
(30 % Ethanol - 50 % Ethanol - 70 % Ethanol - 85 % Ethanol - 95 % Ethanol -
100 % Ethanol - 100 % Ethanol aus Prähybridisierung*2.3.15.2) für jeweils 30 sec.
dehydriert, dabei ist zu beachten, dass Ethanol das Signal abschwächt (Auswaschen
des Signals). Anschließend wurden die Objektträger mit ENTELLAN® NEU (MERCK)
blasenfrei eingedeckelt.
2.3.16 Heterologe Expression in E. coli
Für die heterologe Expression wurden Fusionskonstrukte in den E. coli-Stamm BL21(D3)
(Tab. 5) transformiert. Die Anzucht der Transformanten erfolgte in LBamp-Medium
(37 °C, ü. N.). Die Kultur wurde auf eine optische Dichte OD600 von 0,1 in 500 ml des
Mediums verdünnt und bei 37 °C bis zu einer optischen Dichte OD600 von 0,6 kultiviert.
Es folgte eine Induktion mit 0,4 mM IPTG für 4 h bei 30 °C. Die Zellen wurden
anschließend bei 16.000 rpm für 10 min. sedimentiert. Die induzierten Zellen wurden in
10 ml/g Zellen 1x PBS-Aufschlusspuffer (pH 7,4 ) resuspendiert. Der Zellaufschluss
erfolgte mechanisch mittels French Press-Apparatur (Homogenisator von SLM
INSTRUMENTS). Das Homogenat wurde zur Abtrennung von unlöslichen Bestandteilen für
30 min. bei 16.000 rpm zentrifugiert. Die anschließende Affinitätsaufreinigung erfolgte
nach Angaben des Säulenmaterial (Glutathion-Sepharose 4B)-Herstellers
(GE HEALTHCARE). Hierfür wurde der Überstand aus der Zentrifugation über eine
äquilibrierte Säule mit 0,5 ml Säulenmaterial gegeben. Die Säule wurde mit dem
20 fachen Volumen Aufschlusspuffer gewaschen und die Proteine anschließend in zwei
MATERIAL & METHODEN
43
Schritten mit je 500 µl Elutionspuffer (50 mM Tris/HCl, pH 8,0 mit 10 mM Glutathion)
eluiert.
Zur elektrophoretischen Auftrennung von Proteinen unter denaturierenden Bedingungen
wurde eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nach LAEMMLI (1970)
durchgeführt. Als Gelapparatur wurde das System Mini Protean II der Firma BIORAD
verwendet. Die Auftrennung erfolgte in 1x Elektrophoresepuffer bei konstanten 30 bis
60 mA für 1 h. Die Polyacrylamid-Konzentration des Trenngels lag bei 12,5 %. Die
Proteine wurden nach LLOYD (1996) unter Verwendung des Farbstoffes Coomassie
Brilliant Blue R250 (SIGMA-ALDRICH) angefärbt.
2.4 Dokumentation
2.4.1 Mikroskopie & Bilderfassung
Die Aufnahme und Erfassung des entstanden Bildmaterials mittels Lichtmikroskop ist für
die aus den verschiedenen Versuchsansätzen resultierenden Gewebeschnitte
(vergleiche 2.2.2 & 2.3.15.1) identisch.
Lichtmikroskopie:
Die angefertigten Gewebeschnitte (2.2.2) wurden mit einem Lichtmikroskop Axioplan von
ZEISS mittels Hellfeld-(Durchlicht-)Mikroskopie untersucht. Für eine Betrachtung von
Frischpräparaten wurde die Fluoreszenzmethode unter Verwendung des
Filtersatzes 09 (BP 450-490, FT 510, LP 515) verwendet. Die Aufnahmen wurden mit der
Kamera ColorView (SOFT IMAGING SYSTEMS) aufgenommen und mit dem
Computerprogramm analySIS® der Firma SOFT IMAGING SYSTEMS erfasst.
Coomassie-Färbung
0,5 % (w/v) Coomassie-Blau
10 % (w/v) Essigsäure (100 %)
40 % (w/v) Methanol
SDS-Laufpuffer (10x)
250 mM Tris
1,92 M Glycin
1 % (w/v) SDS
Sammelgelpuffer
0,5 M Tris/HCl, pH 6,8
0,4 % (w/v) SDS
Trenngelpuffer
1,5 M Tris/HCl, pH 8,8
0,4 % (w/v) SDS
SDS-Probenpuffer (4x)
250 mM Tris/HCl, pH 6,8
40 % (w/v) Glycerin
8 % (w/v) SDS
20 % (v/v) ß-Mercaptoethanol
0,2 % (w/v) Bromphenolblau
MATERIAL & METHODEN
44
Rasterelektronenmikroskopie:
Für die Untersuchung der Präparate diente ein Rasterelektronenmikroskop DSM 950 von
ZEISS. Die Bilder wurden mit dem Computerprogramm DIPS (DIGITAL IMAGE PROCESSING
SYSTEM 2.2) mit einer Auflösung von 2000 x 2000 Pixel erfasst und aufgenommen. Der
Bildinhalt wurde über die Aufnahme hinaus nicht weiter nachbearbeitet.
2.4.2 Digitalfotografie
Die Fotodokumentation der Versuchspflanzen bzw. relevanter Pflanzenteile erfolgte unter
der Verwendung der Digitalkameras PowerShot S2 IS von CANON und COOLPIX 990
bzw. 995 der Firma NIKON. Falls erforderlich wurden die Objekte unter der Stereolupe
Stemi SV11 (ZEISS) mit Hilfe der angeschlossenen Digitalkamera ColorView (SOFT
IMAGING SYSTEMS) fotografiert. Inhaltliche Veränderungen wurden am Bildmaterial nicht
vorgenommen.
2.4.3 Bildbearbeitung
Die Gestaltung von Abbildungen und Schemazeichnungen entstand unter Verwendung
der Computerprogramme CORELDRAW® 12 und X3, die Tafelmontage erfolgte mit
ADOBE® Photoshop® 7.0. Die Größe einzelner Objekte erforderte eine nachträgliche
Montage großer Übersichtsbilder aus mehreren Einzelbildern bzw. Teilaufnahmen und
erfolgte über das programmeigene Multiple Image Alignment (MIA) der
Aufnahmesoftware (analySIS®, SOFT IMAGING SYSTEMS) direkt bei der Erfassung der
lichtmikroskopischen Aufnahmen (2.4.1). Gelfotos (aus Videodokumentationsanlage von
BIORAD) wurden komplett oder in Teilen eingescannt und sofern erforderlich (für eine
bessere Darstellung) ausschließlich technisch nachbearbeitet (Helligkeit/Kontrast).
ERGEBNISSE 45
3 ERGEBNISSE
3.1 Morphologisch-anatomische Ausgangsbasis
3.1.1 Morphogenese
3.1.1.1 Sciadopitys verticillata – Kladodienentwicklung
Für die Studien zur Morphogenese der Kladodien von S. verticillata wurden über einen
Zeitraum von ca. sechs Monaten vegetative Knospen entsprechend unterschiedlicher
Entwicklungsstufen gesammelt. Hierfür wurden in Serie angefertigte Gewebeschnitte
jedes einzelnen Stadiums lichtmikroskopisch untersucht. Zum besseren Verständnis
wurden gleich alte Stadien parallel auch rasterelektronenmikroskopisch betrachtet, um
zusätzlich einen räumlichen Eindruck zu erlangen. Die Primordien der Kladodien
inserieren jeweils in der Achsel schuppenförmiger Tragblätter bzw. Knospenschuppen
(Abb. 10 A-F). Bei den Tragblättern handelt es sich um die schuppenförmig
ausgebildeten Langtriebnadeln. Diese stehen im terminalen Bereich des Langtriebes
durch Stauchung der Internodien dicht zusammengerückt, verholzen im Zuge der
Entwicklung zunehmend und umhüllen den Vegetationspunkt des Langtriebes
schützend. Innerhalb einer Knospe sind unterschiedlich weit entwickelte Primordien
erkennbar, die jüngsten im Bereich des Vegetationskegels, die älteren Primordien weiter
basal (Abb. 10 A-B). Eine doppelte Spitze, wie sie für die ausdifferenzierten Kladodien
(Doppelnadeln) charakteristischerweise erkennbar ist, ist an jungen Primordien nicht
vorhanden und bildete sich erst im Verlauf der Morphogenese aus. Die ersten jungen
Primordien sind ab Anfang August als leichte dreieckige Erhebungen sichtbar. Ältere
Stadien, von Mitte Oktober, sind von umgekehrt V-förmiger Gestalt und zeigen bereits
erste Ansätze für eine Doppelspitze in Form lateraler Erhebungen (Abb. 10 C & E).
Ausgehend von diesem Stadium ist für die ältesten Primordien bereits ein leichter
Längenzuwachs zu verzeichnen (Abb. 10 E-F). Das in Abb. 10 E gezeigte Stadium war
gegen Anfang November für alle Primordien einer Knospe erreicht und stellt das Stadium
dar, in dem die Knospen den Winter überdauern.
ERGEBNISSE 46
Abb. 10: S. verticillata, Kladodienentwicklung. Vegetative Knospe, rasterelektronenmikroskopischeAufnahmen (A, C & E) & lichtmikroskopische Aufnahmen von Längsschnitten (B, D & F). A: Ende August, Knospe mit Kladodienprimordien (Kp) verschiedenen Alters in den Achseln von Schuppenblättern (Knospenschuppen, Ks) inserierend. B: medianer Längsschnitt (MIA) durch Knospe mit erkennbarer Langtriebachse (LT). C: Mitte September, junges Primordium mit deutlicher Doppelspitze (Pfeile). D: junges Primordium im Bereich der lateralen Erhebung längs getroffen, Tragblatt deutlich erkennbar. E: Mitte Oktober, Längenzuwachs durch Streckungswachstum, zunehmend von Haaren (Ha) eingehüllt. Vegetationskegel (Vk). F: älteres Primordium, von Oktober, im Längsschnitt.
ERGEBNISSE 47
Die weitere Entwicklung bis zum Austrieb im März/April besteht hauptsächlich in einem
weiteren Längenzuwachs infolge des wieder einsetzenden Streckungswachstums. Junge
Austriebe zeigen schirmförmig angeordnete Kladodien, die jeweils in den Achseln von
terminal dicht gedrängt stehenden, verholzten Langtriebnadeln/Schuppenblättern
stehen. Die Schuppenblätter sind kurz nach Austrieb grün und verholzen mit zu-
nehmendem Alter (Abb. 11 A-B). In den Blattachseln der basal stehenden
Langtriebblätter (Abb. 11 B C) sind keine Kladodienaustriebe erkennbar. Im Gegensatz
zum terminalen Bereich werden basal zwar achselständige Kurztriebprimordien angelegt
(Abb. 11 D-E), treiben aber nicht aus. Eine Austriebförderung der Kladodien ist auf den
terminalen Bereich beschränkt und erscheint für basale Langtriebbereiche unterdrückt
(Abb. 11, C & E).
3.1.1.2 Abies homolepis – Nadelentwicklung
Die zeitliche Abfolge bei der Anlage der Nadelprimordien ist der bei Anlage der
Kladodien sehr ähnlich. Gegen Ende August sind innerhalb einer Knospe spiralig
angelegte Primordien von unterschiedlicher Größe ausgebildet (Abb. 12 A -C). Die
jüngsten Primordien mit leicht elliptischer Form sind im Bereich des Vegetationskegels
erkennbar, während die älteren Primordien, annähernd rautenförmiger Gestalt, weiter
basal angelegt sind. Tragblätter sind nicht vorhanden (Abb. 12 B & E). Gegen Ende der
Winterruhe Anfang Februar ist an den verlängerten Nadelprimordien bzw. jungen
Nadelblätter eine Doppelspitze (Abb. 12 D) bzw. terminale Einbuchtung erkennbar.
Abb. 11: S. verticillata, Langtriebachse mit Schuppenblättern. A: Detail eines jungen, grünen Schuppenblattes (Sb) kurz nach Austrieb. B: Schuppenblätter des Langtriebes (LT), mit zunehmendem Alter verholzend. C: verholztes Schuppenblatt, im Detail. D: Kladodienrudiment (K*) eines basalen Schuppenblattes, in weiterer Entwicklung gehemmt. E: fluoreszenzmikroskopische Aufnahme eines frischen Kladodienrudiments in Schuppenblattachsel im Längsschnitt (Handschnitt); chlorophyllhaltiges Gewebe erscheint rot.
ERGEBNISSE 48
Abb. 12: A. homolepis, Nadelentwicklung. Vegetative Knospe, rasterelektronenmikros-kopische Aufnahmen (A, C & D) & lichtmikros-kopischen Aufnahmen von Längsschnitten (B & D). A: Ende August, Knospe mit Nadelblatt-primordien (Np) verschiedenen Alters. B: medianer Längsschnitt (MIA) durch Knospe mit erkennbarer Langtriebachse (LT); C: junge Primordien Ende August; D: junge Nadel mit deutlicher Doppelspitze (Pfeile); E: Nadelblattprimordium im Detail, Tragblätter sind nicht erkennbar. Vegetationskegel (Vk).
ERGEBNISSE 49
3.1.2 Leitbündelanschluss
3.1.2.1 Sciadopitys verticillata
Aus Serienquerschnitten im Bereich der terminal gestauchten Schuppenblätter der
Langtriebachse mit schirmförmig angeordneten Kladodien (Abb. 13 A-B) ist erkennbar,
dass die Leitbündel der zukünftigen Kladodien im Gewebe des Zentralzylinders des
Langtriebes als keilförmige Struktur (Abb. 13 C-F) heraus ziehen. Im weiteren Verlauf teilt
sich jedes der Bündel in radialer Richtung in zwei gleichgroße Untereinheiten
(Abb. 13 D-E) auf. Die beiden aus Phloem und Xylem bestehenden Untereinheiten
ziehen als zwei separate Leitbündel (Abb. 13 F) in das Kladodium (F, Umriss als grüne
Linie) ein. Ein Anschluss von Leitbündeln der Tragblätter an den Zentralzylinder ist nicht
erkennbar (Abb. 13 B).
Abb. 13: S. verticillata, Leitbündelanschluss der Kladodien. A: Schema zum Bereich der angefertigten Querschnittserie. B: Lichtmikroskopische Aufnahme der Langtriebachse im Querschnitt (MIA) mit verschiedenen Kladodienspuren (KSp) im Bereich des Zentralzylinders. C-F: Detail einer keilförmigen Kladodienspur; keilförmige Spur aus Phloem (blau) und Xylem (rot) zieht aus Zentralzylinder des Langtriebes (links unten) nach radial (C) in Richtung des Kladodiums und gliedert sich dabei in zwei Teilbündel (D-E), die als seperate Leitbündel in das Kladodium (grüne Linie) einziehen. G: Schema zur keilförmig herausziehenden Kladodienspur mit entsprechender Lücke im Zentralzylinder.
ERGEBNISSE 50
3.1.2.2 Abies homolepis
Der Leitbündelanschluss von Nadelblättern an die Hauptachse erfolgt über die
Ausbildung einer Blattlücke (Abb. 14 D) im Bereich des Zentralzylinders. Ein Querschnitt
einer Schnittserie durch die Hauptachse im Bereich einer herablaufenden
Nadelblattbasis (Abb. 14 A-B) zeigt, dass eine aus Phloem und Xylem bestehende
keilförmige Leitbündelstruktur (Abb. 14 C) in radialer Richtung aus dem Zentralzylinder
heraus nach distal zum Nadelblatt zieht. Im medianen Bereich des ausdifferenzierten
Blattes liegt es in zwei Teilbündeln vor.
Abb. 14: A. homolepis, Leitbündelanschluss eines Nadelblattes. A: Schema zur Lage der angefertigten Querschnitte. B: Lichtmikroskopische Aufnahme der Hauptachse im Bereich herausziehender Nadelblattspuren (NSp). C: Detail einer aus dem Zentralzylinder (links unten) herausziehenden, keilförmigen Nadelblattspur, bestehend aus Phloem (blau) und Xylem (rot) unter Ausbildung einer Blattlücke. D: Schema zur keilförmig aus dem Zentralzylinder herausziehenden Blattspur mit Blattlücke.
ERGEBNISSE 51
3.1.2.3 Pinus sylvestris
In Serienschnitten durch die Langtriebachse im Bereich eines abzweigenden
zweinadeligen Kurztriebes (Abb. 15 A-B) zeigt sich, dass das Leitgewebe der nicht
sichtbaren Sprossachse des Kurztriebes über Abschnürung einer zylinderförmigen
Zweigspur (Abb. 15 C-D) aus dem Zentralzylinder der Langtriebachse hervorgeht. Der
sich nach radial, in Richtung des Kurztriebes, abgliedernde neue Zylinder besteht aus
einem zentralen parenchymatischen Bereich, der ringförmig von Xylem- und Phloem-
Elementen umgeben ist (Abb. 15 C).
Abb. 15: P. sylvestris, Leitbündelanschluss eines Kurztriebes. A: Schema zur Lage der angefertigten Querschnitte durch die Langtriebachse im Bereich des Kurztrieb-Anschlusses. B: Lichtmikroskopische Aufnahme der Hauptachse im Bereich einer herausziehenden Kurztriebspur (Zweigspur, ZSp). C: Detail einer sich vom Zentralzylinder (links unten) abschnürenden, zylinderförmigen Zweigspur der in Aufsicht nicht sichtbaren Kurztriebachse, bestehend aus einem zentralen Parenchym umgeben von jeweils einem Ring Xylem (rot) und Phloem (blau); D: Schema zum Abschnüren einer zylinderförmigen Zweigspur vom Zentralzylinder.
ERGEBNISSE 52
3.1.2 Anatomie der Sciadopitys-Kladodien
Im medianen Querschnitt (Abb. 16) durch ein ausdifferenziertes Kladodium sind
charakteristische Blattkomponenten erkennbar. Jede der beiden kreisförmigen Hälften ist
der Länge nach von einem Leitbündel (mit eigener Leitbündelscheide) durchzogen.
Außerhalb der Leitbündelscheiden finden sich als Schwammparenchym
anzusprechende parenchymatische Mesophyllzellen. Ein Palisadenparenchym ist im
Anschluss an das Schwammparenchym auf der Kladodienoberseite lokalisiert. Nach
außen ist das Kladodium von einer einschichtigen, dickwandigen Epidermis umgeben,
der eine Cuticula aufgelagert ist. Nach innen folgt auf die Epidermis eine Hypodermis mit
stark sklerenchymatischen Zellen. Die Hypodermis ist im Bereich der Stomata
unterbrochen. Die Stomata finden sich nur auf der Kladodienunterseite. In Aufsicht auf
die Unterseite eines Kladodiums sind die Stomata entlang einer unterseits verlaufenden
Furche als zwei helle Längsreihen erkennbar (vergleiche 1.1.3: Abb. 5). Im marginalen
Bereich des Kladodiums sind Harzkanäle erkennbar, deren Zahl abhängig von der Höhe
des geführten Querschnittes variierte.
Abb. 16: S. verticillata, Kladodium im Querschnitt. Lichtmikroskopische Aufnahme (MIA) des medianen Querschnitts durch ein ausdifferenziertes Kladodium mit typischen Blattkomponenten. Cuticula (C); Epidermis (E); Harzkanal (HK); Hypodermis (H); Leitbündel (LB); Leitbündelscheide (LS); Palisardenparenchym (Pp); Schwammparenchym (Sp); Papillen (P); Stomata (S).
ERGEBNISSE 53
3.1.3 Untersuchungen an Sciadopitys-Keimlingen
Von Pinus-Keimlingen her ist bekannt, dass an Keimlingen auch dann noch normale
Langtriebblätter gebildet werden, wenn adulte Pflanzen solche nicht mehr zeigen. Daher
lag es nahe an Keimlingen nach für die Fragestellung relevanten Übergangs- und
Entwicklungsstadien zu suchen und diese dann z. B. für in-situ-Hybridisierungen zu
nutzen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher fünf verschiedene Untersuchungsreihen
an Keimlingen (K1-K5) angesetzt, um Informationen über die allgemeine Keimungsdauer
und das erste Auflaufen der Samen inklusive der zu erwartenden Keimungsraten zu
erhalten. Ziel war es festzustellen, wann nach Erscheinen der ersten vier normalen
Blätter, in Gestalt von Kotyledonen und Primärblättern, die ersten Anlagen für Kladodien
zu erwarten sind bzw. sichtbar werden.
Von den gesammelten Samen der Sciadopitys-Exemplare im Botanischen Garten
Bochum, erwies sich nur ein Teil als befruchtet und keimfähig. Das aus Bochum
stammende Sattgut stand nur in geringen Mengen zur Verfügung. Aus diesem Grund
wurde auf ein Exemplar des Botanischen Gartens in Marburg ausgewichen, das
weibliche Zapfen mehrerer Jahrgänge bis in den Bereich der bodennahen Seitenzweige
ausbildet und keimfähiges Saatgut in größeren Mengen bietet, welches sehr gut
zugänglich ist und daher in allen beschrieben Keimungsversuchen Verwendung fand.
Das eingesetzte reife Saatgut wurde für alle Ansätze mit Ausnahme von K2 im November
aus zweijährigen, weiblichen Zapfen entnommen, für K2 wurde im Februar gesammelt.
Das Saatgut wurde nicht stratifiziert. Aus den fünf verschiedenen Ansätzen lässt sich
anhand der gesammelten Beobachtungen zusammenfassend festhalten, dass bei
Verwendung von frisch gesammelten Samen die besten Ergebnisse erzielt wurden. Ein
Jahr bei Raumtemperatur gelagerte Samen verloren ihre Keimfähigkeit (bis auf eine
Ausnahme; K3).
Insgesamt vergingen ca. (sieben bis) acht Wochen von der Aussaat bis zum Auflaufen
der ersten Samen. Die Ausfallquote bis zum Auflaufen lag bei ca. 20 %. Ausfälle nach
der Keimung (weitere 5-10 %) gingen auf Wasseransammlungen im Bereich des
Vegetationskegels (K1) und Fraßschäden durch Schnecken und Tausendfüßler (K4)
zurück. Erstere führten bei K1 zum Ausfall einzelner Pflanzen durch die unter
Warmhaus-Bedingungen geförderte, resultierende Fäulnis. Schädlinge bedingten den
Totalverlust von einzelnen Keimlingen, bei K4, durch Fraß. Zu den Ausfällen vor
Auflaufen der Samen musste auch ein nachträglich bemerkter Befall vermutlich durch
Nematoden gezählt werden, der in unterschiedlich starkem Ausmaß an frisch
ausgesäten Samen (nach drei bis vier Tagen) auftrat. Die betroffenen Ansätze wurden
ERGEBNISSE 54
entsprechend mit Confidor und Schneckenkorn (vergleiche 2.1.1) behandelt. Ein
negativer Einfluss auf die Keimlingsentwicklung bei Kontrollversuchen an pikierten
Keimlingen aus K4 war nicht zu beobachten. In Kombination von Ergebnissen aus K4 mit
denen aus K2 (ca. 1 Jahr älter) zeigte sich, dass ein Auflaufen der Samen sehr
gleichmäßig war (max. mit 2 bis 3 Tagen Unterschied). Die Keimlinge der erst im Februar
gesammelten Samen, mit entsprechend längerer natürlicher Kälteperiode, unterschieden
sich hinsichtlich des gleichmäßigen Auflaufens der Samen nur minimal von den im
November gesammelten.
Die K4-Keimlinge wurden für eine Dokumentation der Keimlingsentwicklung über einen
Zeitraum von zehn Wochen (W1-10) gesammelt. Bis zur fünften Woche wurde in 7-
tägigen Abständen, ab Woche fünf in Abständen von drei bis vier Tagen gesammelt. In
den Samen (Abb. 18 A, Detail) ist, wie für Spermatophyten üblich, zum Zeitpunkt der
Aussaat (W0) bereits ein reifer Embryo mit jungen Kotyledonen erkennbar (Abb. 17 A &
Abb. 18 A). Die Radicula (Keimwurzel) und der Suspensor des ca. 1,5 mm großen
Embryos (Abb. 17 B) sind zur Mikropyle/zum Hilum hin orientiert (Abb. 19 B & D), die
Kotyledonen weisen in die entgegen gesetzte Richtung.
Innerhalb der ersten vier Wochen ist, speziell für Sciadopitys, ein Wachstum der jungen
Kotyledonen und der Radicula, bzw. eine Differenzierung des Gewebes im Bereich des
Sprossscheitels und des Wurzelscheitels, zu beobachten (Abb. 19 B-D). Nach vier bis
fünf Wochen ist an der Basis der Kotyledonen ein Vegetationskegel deutlich erkennbar
(Abb. 19 E). Ab ca. fünf Wochen nach Aussaat wächst die Primärwurzel (durch den
Embryosack) aus der Öffnung der Mikropyle in das Substrat ein (Abb. 18 B). Zum
Zeitpunkt der Samenkeimung sind die Samen noch vollständig von Substrat bedeckt
Abb. 17: S. verticillata, reifer Same. A: Schematische Darstellung, median im Bereich der Mikropyle und des Hilums geführter Längsschnitt durch einen geflügelten Samen, Stadium mit reifem Embryo entspricht dem Stadium W0 zum Zeitpunkt der Aussaat für alle fünf Keimungsversuche (K1-K5). B: Rasterelektronenmikrospkopische Aufnahme eines präparierten, reifen Embryos (W0).
A B
ERGEBNISSE 55
(Abb. 19 A, W1-5). Im Längsschnitt durch einen solchen Samen, von Sciadopitys, sind
bereits ergrünte Kotyledonen sichtbar (Abb. 18 B, Detail). Ab Ende der sechsten Woche
nach Aussaat ist ein Teil des Hypokotyls an der Substratoberfläche erkennbar
(Abb. 18 C W 6-7). Durch Streckung des Hypokotyls (siebte Woche) wird der Same
mitsamt den Kotyledonen an die Oberfläche des Substrats (Abb. 18 C-D) gehoben. Die
Kotyledonen verbleiben hier bis ca. zum Ende der siebten Woche im Samen (Abb. 19 A).
Ab Ende der achten Woche nach Aussaat hat die Mehrzahl der Sciadopitys-Keimlinge
jeweils beide Kotyledonen vollständig entfaltet (Abb. 18 E-F). Die jungen Keimpflanzen
sind im 2-Blatt-Stadium ca. 5 cm groß (Abb. 18 F). Im Längsschnitt durch den in Aufsicht
noch nicht sichtbaren Bereich des Vegetationskegels (vergleiche Abb. 21 A) sind in der
neunten/zehnten Woche die zwei ersten (und in diesem Falle einzigen) jungen
Primordien der Primärblätter zu erkennen (Abb. 21 E & Abb. 36 A).
Bei sechs Monaten alten, ca. 12 cm großen Sämlingen (K2) ist eine von grünen
Schuppenblättern eingehüllte, terminale Knospe sichtbar. Außerdem sind zusätzlich zu
den Kotyledonen die zwei vollständig entwickelten Primärblätter zu erkennen, die in den
Lücken zwischen den Kotyledonen (4-Blatt-Stadium, Abb. 20 A-D) stehen. In einem
medianen Längsschnitt durch den Knospenbereich eines 4-Blatt-Stadiums (Abb. 21 B-C)
sind am Vegetationskegel die Primordien der ersten Kladodien erkennbar. Jedes
Kladodium inseriert jeweils in der Achsel eines eigenen Tragblattes. Nach ca. einem Jahr
ist mit Ausbildung der ersten beiden achselständigen Kladodien ein 4+2-Stadium
(Abb. 20 E) erreicht. Die jungen Kladodien sind anhand einer deutlich ausgebildeten
Doppelspitze (Abb. 20 F, Pfeil) und einer erkennbaren Längsfurche (Abb. 20 G) gut von
den Keim- und Primärblättern unterscheidbar. Als Tragblätter der jungen Kladodien sind
kleine grüne, schuppenförmige Blätter sichtbar (Abb. 20 D).
ERGEBNISSE 56
Abb. 18: Keimungsreihe I: Fotodokumentation der Keimungsreihe K4. A: Same zum Zeitpunkt der Aussaat W0 (Detail), mit im Längsschnitt erkennbarem reifen Embryo (Em). B: keimender Same der Woche 5 nach Aussaat (W5), unterirdisches Stadium mit auswachsender Radicula (Ra) und ergrünten Kotyledonen (Ko, Detail). C-D: Stadium der Wochen 6/7 (C) und 8 (D), Streckungswachstum des Hypokotyls (Hy) hebt Same und Kotyledonen an die Substratoberfläche (gestrichelte Linie). E-F: junger ca. 5 cm großer Keimling (F), 2-Blatt-Stadium, zum Ende der 8. Woche (W8); Entfaltung der Kotyledonen, Endosperm (En); Embryosack (Es); Hilum (Hi); Suspensor (Su); Testa (T); Wurzelhals (Wh), Primärwurzel (pW).
ERGEBNISSE 57
Abb. 19: Keimungsreihe II: Schema & Lichtmikroskopische Aufnahmen (K4). A: Schematische Darstellung der ersten zehn Wochen (W1-10) der Samenkeimung. B & D: Längsschnitte (MIA) durch Same aus W1 (B) und W5 (D) nach Aussaat, Samenschale entfernt; reifer Embryo (Em) umgeben von Embryosack (Es) und Nährgewebe (primäres Endosperm, En), mit jungem Scheitelmeristem (SAM)/Vegetationskegel (Vk) an der Basis der jungen Kotyledonen (Ko), Hypokotyl (Hy), Radicula (Ra) und Suspensor (Su). C & E: Detail des Scheitelmeristems in W1(C) bzw. Vegetationskegels (E) in W5, um 180 °gedreht.
ERGEBNISSE 58
Abb. 20 : Keimungsreihe III: Fotodokumentation ältere Keimlinge aus K2. A: sechs Monate alter, ca. 12 cm großer Keimling, 4-Blatt-Stadium; in Aufsicht (Detail) mit terminal sichtbarer Knospe umgeben von zwei Primärblättern (P/2) in den Lücken der zwei Kotyledonen (Ko/1). B-D: terminaler Bereich eines ca. zehn Monaten alten Keimlings, mit erstem achselständigen Kladodium (K) in der Achsel eines grünen schuppenförmigen Tragblattes (D; Knospenschuppe, Ks), Primärblattbasis (C: Detail) ohne Tragblatt. E: ca. 12 Monate alter Keimling nach Ausbildung der ersten beiden Kladodien (K/3); Aufsicht auf 4+2-Stadium mit 4 Blättern (2 Kotyledonen/1 & 2 Primärblätter/2) + 2 Kladodien/3. F: ca. 14 Monate alter Keimling mit drittem, achselständigen Kladodium, Kladodien zeigen deutlich ausgeprägte Doppelspitze (Pfeil) und Längsfurche. G: Aufsicht auf Unterseite des jüngsten Kladodiums mit Stomata und beginnender Längsfurche (Pfeil) mit papillösen Erhebungen der Cuticula.
ERGEBNISSE 59
Abb. 21: Mikroskopische Aufnahmen zur Anlage der Primordien am Vegetationskegel. A-C: 4-Blattstadium (K2). A: Fluoreszenzaufnahme von lateral mit Aufsicht auf Knospenschuppen (Ks) im Bereich der terminalen Knospe; Primärblätter (P) und ein Kotyledon (Ko) entfernt (*). B: Frischmaterial aus A im medianen Längsschnitt (Hellfeld-Durchlicht/MIA) durch Vegetationskegel (Vk); Schnittebene parallel zu Kotyledonen; junge Primordien der ersten beiden Kladodien (Kp) erkennbar. C: Bereich der terminalen Knospe eines ca. einjährigen Keimlings im Querschnitt, Stadium zeigt junge, in Achseln der Knospenschuppen verborgene Kladodienprimordien. D: Schema eines Keimlings mit erstem ausgewachsenen Kladodium. E: W10-Keimling zeigt Vegetationskegel mit einem Primärblatt-Primordium; Schnittebene senkrecht zur Ansatzstelle der Kotyledonen geführt.
ERGEBNISSE 60
3.2 Primerdesign
Die aufgeführten Gensequenzen für Knox Klasse 1-Gene stammen aus der
Sequenzrecherche in der NCBI-Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Ausgewählt
wurden die kodierenden Sequenzen verschiedener Gymnospermen und Angiospermen,
von letzteren sowohl Dikotylen-, als auch Monokotylen-Vertreter. Das mit VectorNTI
(INVITROGEN) erstellte Alignment für Knox-Gene der Klasse 1 (Abb. 22) diente als Vorlage
für die Gestaltung verschiedener degenerierter Primer für eine Klasse 1-spezifische
Sequenz. Für eine bessere Eruierung der Klasse 1 wurden auch ausgewählte Klasse 2
Vertreter mit in das Alignment einbezogen (siehe Anhang A1). Ausschlaggebend für die
Wahl der betreffenden Sequenzabschnitte war neben einem hohen Konservierungsgrad
der Aminosäurensequenz eine möglichst niedrige Degeneration auf Nukleotidebene. Die
degenerierten Primer (Tab. 7) wurden für die Identifizierung gesuchter Knox-Sequenzen
bzw. für das Auffinden ihrer Sequenzmotive eingesetzt. Die spezifischen Primer (Tab. 7)
wurden aus der primären Nukleotidsequenz des jeweiligen Gens abgeleitet und zur
Überprüfung der Methodik herangezogen (z. B. über KNAT1, PhyN1). In Kombination mit
degenerierten Primern dienten sie der Erweiterung einer neu gefundenen Gensequenz
(z. B. SvKNOX).
ERGEBNISSE 61
Tab. 7: Sequenzübersicht verwendeter Primer.
I Verwendete Primer für Arabidopsis thaliana, KNAT1.
Primer Basensequenz AS-Sequenz
Knat1 for, EcoRI
Knat1 rev, KpnI
5’– GGAATTCCATGGAAGAATACCAGC –3’
5’– GGGGTACCCCTTATGGACCGAGACG -3’
MEEYQH
RLGP *
II Verwendete Primer für Picea abies, HBK1.
Primer Basensequenz AS-Sequenz
PaHbk1 for XhoI/Kpn1
PaHbK1rev, NotI/SacI
5’- CCTCGAGGGTACCCATGGAGCACCTGAATGCAG -3’
5’- GCGGCCGCGAGCTCGTTAGCAATCCAAATGATAGCC –3’
MEHLNA(A)
GYHLDC *
III Verwendete Primer für Sciadopitys verticillata, SvKnox
Primer Basensequenz AS-Sequenz
PhyN1 for, EcoRI/KpnI
PhyN1 rev, SacI
dP-SvKnox for1
dP-SvKnox for2
dP-SvKnox rev1
dP-SvKnox rev2
SvSondeKnox for1 SacI
SvSondeKnox for2 HindIII
SvSondeKnox rev1 SacI
SvSondeKnox rev2 HindIII
SvGSTfor, EcoRI
SvGSTrev XhoI
5’–CGAATTGGGTACCGATGATCATGGGGAGGTGAT –3’
5’–GCTGGAGCTCGATGTTGGGCTTCTGAGTGA –3’
5’- CCRGARYTMGAYCARTTYATGGARGCWTAC –3’
5’- AAGAARAARAAGAAAGGDAARCTYCC –3’
5’- GGRAGYTTHCCTTTCTTYTTYTTCTT –3’
5’- ATRAACCAATTRTTKATTTGYTTYTGATCYARCCC–3’
5’–CCGAGCTCGAAGATTGCAGCACTGGTGAA –3’
5’–CTCAAGCTTAAGTTTACCTTTCTTTTTCTTCTTC –3’
5’–CCGAGCTCAAGTTTACCTTTCTTTTTCTTCTTC –3’
5’–CTAAGCTTGAAGATTGCAGCACTGGTGAA –3’
5’–CAGTGAATTCCCGGAGTTAGATCAATTTATGGA –3’
5’–GCCCTCGAGAAGTTTACCTTTCTTTTTCTTCTT –3’
DDHGEV(I)
(V)TQKPNI
PELDQFMEAY
KKKKKGKL(P)
KKKKKGKL(P)
GLDQKQINNWF
EDCSTGE(M)
KKKKKGKL
KKKKKGKL
EDCSTGE(M)
PELDQFM
KKKKKGKL
- unterstrichen sind Klonierungssequenzen (linker); Restirktionsenzyme
ERGEBNISSE 62
ERGEBNISSE 63
3.3 Vorwort zur Methodenetablierung
Alle molekularbiologischen Arbeiten wurden im Zuge einer Methodenetablierung
erstmalig am Lehrstuhl durchgeführt. Der Focus lag hierbei speziell auf der Suche nach
Knox-Sequenzen in der Gymnosperme S. verticillata und deren Einsatz (Antisense-
mRNA-Sonde, vergleiche 3.4.4) in einer in-situ-Hybridisierung, sowie der Etablierung
eines in-situ-Hybridisierungs-Protokolls für Gymnospermen (siehe 3.5.1). Für Teilarbeiten
(z. B. S1-Arbeiten) wurde in ein anderes Labor/eine andere Arbeitsgruppe ausgewichen.
In Hinblick auf die Tatsache, dass Informationen zu Klasse 1 Knox-Genen für Sciadopitys
gänzlich fehlen, wurden die molekularen Vorarbeiten relativ weit ausgedehnt. Zum
besseren Verständnis einzelner Durchführungsschritte werden die Ergebnisse der
molekularen (Vor-)Arbeiten eher untypisch detailliert beschrieben. Darüber hinaus wird
die Diskussion bestimmter Details vorgezogen und erfolgt innerhalb dieses Kapitels
direkt zusammen mit der Ergebnispräsentation. Eine abschließende, allgemeinere
Diskussion aller molekularen Arbeiten folgt im Kapitel Diskussion und ist dort
entsprechend kürzer.
3.3.1 Nukleinsäuregewinnung aus Gymnospermen
Zur Extraktion von Nukleinsäuren wurde der verwendete Mörser nach DOULIS
et al. (2000) mit einer 2 %igen SDS-Lösung gespült, mit Chloroform behandelt und
anschließend mit flüssigem Stickstoff vorgekühlt. Frisch gesammeltes Pflanzenmaterial
wurde unter Zugabe von flüssigem Stickstoff fein gemörsert. Alternativ zum
Frischmaterial wurde tiefgekühltes (-80 °C schockgefrorenes) Material eingesetzt. Das
Verfahren zur Isolierung der Gesamt-RNA wurde, wie unter 2.3.3 beschrieben, in zwei
Ansätzen mit beiden Kit-eigenen Aufschlusspuffern (RLC & RLT von QIAGEN, Tab. 6)
durchgeführt. RLT besitzt laut Hersteller durch den Gehalt von Guanidinisothiocyanat
(GITC) bessere Zellzerstörungs- und Denaturierungseigenschaften. In Abhängigkeit vom
Gehalt an Sekundärmetaboliten (z. B. milchiges Endosperm) im Gewebe kann GITC
allerdings ausfallen und negativen Einfluss auf die Extraktion der RNA haben bzw. diese
mitunter unmöglich machen. Bei Einsatz von an Sekundärmetaboliten reichem Gewebe
wird daher der Einsatz von RLC-Puffer, mit Guanidinhydrochlorid, empfohlen. Für eine
verbesserte Homogenisierung des Gewebes wurde beim Aufschluss zusätzlich zum
Vortexen bei Bedarf mit einem Einweg-Minipistill gearbeitet (vergleiche DOULIS et al.,
2000).
ERGEBNISSE 64
3.3.2 KNAT1 – Arabidopsis thaliana
Das KNAT1-Gen (knotted-like from Arabidopsis thaliana: U14175), auch
BREVIPEDICELLUS (BP1) genannt, kodiert für einen Transkriptionsfaktor, der eine
Homöodomäne besitzt, die denen der Klasse 1-kodierten Homöodomänen in Zea mays
sehr ähnlich ist. In der pflanzlichen Entwicklung ist das Vorkommen von KNAT1-
Transkripten, wie bei Kn1, hauptsächlich auf den Bereich des Sprossscheitels (SAM)
beschränkt und ist in der Anlageregion neuer Blattprimordien herunterreguliert. KNAT1
(wie auch KNAT2) übernimmt als Klasse 1 (Kn1–like Homöobox) Gen eine wichtige
Aufgabe in der Morphogenese. Die Zugehörigkeit zur Klasse 1 basiert auf Ähnlichkeiten
in der Sequenz und im Expressionsmuster von KNAT1 mit Klasse 1 Genen aus Z. mays
(LINCOLN et al., 1994).
Als Angiospermen-Vertreter mit komplett sequenziertem Genom diente A. thaliana in
dieser Arbeit als Modellorganismus für die ersten molekulargenetischen Ansätze.
Aufgrund fehlender, für die Isolierung von Nukleinsäuren störender Sekundärmetaboliten
wie z. B. Milchsaft, war von einem guten Aufschlussverhalten auszugehen. Arabidopsis
war für einen ersten Gewebsaufschluss, Isolierungsansatz und Primertest besonders
geeignet. Bei der Isolierung von Gesamt-RNA aus Grundblattrosetten von A. thaliana
lieferten die beiden Puffer, RLT und RLC, nahezu identische Extraktionsergebnisse und
zeigten keine gravierenden Unterschiede für das Extraktionsverhalten des eingesetzten
Gewebes. Die Reverse Transkription der Gesamt-RNA in cDNA erfolgte wie unter 2.3.5
beschrieben, mit Kit-eigenen Oligo(dT)18-Primern (FERMENTAS). Die gesuchte
KNAT1-Sequenz wurde über eine Zweitstrangsynthese mittels PCR (siehe 2.3.6) unter
Verwendung des KNAT1-spezifischen Sense-Primers Knat1 for und Antisense-Primers
Knat1 rev isoliert. Die Gen-spezifischen Primer wurden für den Bereich der 5’- und
3’-Enden des betreffenden KNAT1-Gens gewählt und mit dem Einbau einer EcoRI/KpnI-
Schnittstelle für die Restriktion versehen (Abb. 23 A). Die PCR wurde mit einem initialen
Denaturierungsschritt bei 94 °C, 2 min. gestartet, gefolgt von fünf weiteren Zyklen
bestehend aus einer Denaturierung bei 94 °C, 30 sec., Annealing bei 45 °C, 30 sec. und
einer 3 min. Elongation bei 72 °C. Daran schlossen sich 25 weitere Zyklen mit
Denaturierung bei 94 °C, 30 sec., einem Annealing bei 42 °C, 30 sec., sowie einer finalen
Elongation bei 72 °C für 3 min. und 72 °C für 10 min an. Verwendet wurde eine
Pwo-Polymerase (500 bp/min, PEQLAB).
Das amplifizierte, doppelsträngige cDNA Fragment (ds cDNA) entsprach mit einer Länge
von ca. 1200 bp (Abb. 23 B) den aus der Wahl der Primer abgeleiteten 1198 bp. Das
geleluierte (vergleiche 2.3.8) Produkt wurde EcoRI/KpnI-geschnitten (2.3.12), in einen
ERGEBNISSE 65
Vektor pBlueskript SK+ (2.96 kb, STRATAGENE) ligiert (2.3.9) und in kompetente
TOP10 Zellen (INVITROGEN, Tab. 5) transformiert. Die Blau/Weiß-selektierten (2.3.9),
positiven Klone (insgesamt ca. 1/10 der Bakterienkolonien/Platte) wurden wie in 2.3.11
beschrieben präpariert und in einer Restriktionskontrolle mit EcoRI/KpnI geschnitten.
Anschließend wurden acht Klone über ein 1 %iges Agarosegel (vergleiche 2.3.7) auf den
richtigen Insert-Einbau hin überprüft (Abb. 23 C) und jeweils die Hälfte jedes
Restriktionsansatzes aufgetragen.
Das Ergebnis der Restriktion zeigte die erwarteten Fragmentgrößen von jeweils ca.
3000 bp für die 2960 bp großen Vektorfragmente und ca. 1200 bp für die
Insertfragmente. Von den vier erhaltenen Klonierungsfragmenten richtiger Größe (Nr. 3,
4, 6 & 8) wurde das aus Klon Nr. 3 verwendet, um die degenerierten Primer für die Knox-
Suche anhand von KNAT1 aus A. thaliana zu überprüfen.
Abb. 23: A. thaliana, cDNA-Synthese von KNAT1 & Klonierungskontrolle durch Restriktion. A: Schematische Darstellung des mit den spezifischen Primern Knat1 for/Knat1 rev zu erwartenden, 1198 bp großen KNAT1-Fragments; Primersequenz inkl. EcoRI bzw. KpnI Restriktionsschnittstelle. B: Reverser Ansatz; 1200 bp großes Fragment ds cDNA aus Zweitstrangsynthese mit Knat1 for/rev und Pwo-Polymerase im 1 %igen Agarosegel (5 µl PCR-Produkt+DNA-Probenpuffer+5 µl Marker (GeneRuler). C: Restriktionskontrolle für Insert. Überprüfung auf Einbau des Inserts aus B anhand von acht pBlueskript SK+ (2.96 kb) liegierten, Blau/Weiß-selektierten, positiven Klonen; vier (Nr. 3, 4, 6 & 8) der insgesamt acht untersuchten Klone zeigten eine 1200 bp große Bande als Insert. Weitergearbeitet wurde mit Klon Nr. 3.
B C
A
ERGEBNISSE 66
Zur Überprüfung der aus dem Alignment für Knox (Abb. 22) abgeleiteten Primer wurden
0,5 µl der 1:20 verdünnten Plasmid-DNA (10 ng) von Klon 3 mit Taq-Polymerase in einer
PCR (94 °C, 2 min.; 30 Zyklen: 94 °C, 30 sec; 50 °C, 30 sec., 72 °C, 1 min. und 72 °C, 10
min.) eingesetzt. Durch unterschiedliche Kombinationen der verwendeten degenerierten
dP-SvKnox-Primer mit KNAT1-spezifischen Primer (Tab. 7, Abb. 24) wurde überprüft, ob
die Amplifikation verschiedener Teilfragmente der KNAT1-Sequenz möglich ist. Als
Sense-Primer wurden der KNAT1-spezifische Primer Knat1 for und die degenerierten
Primer dP-SvKnox for1 und for2 verwendet. Als Antisense-Primer kamen die
degenerierten Primer dP-SvKnox rev1 und rev2 sowie der spezifische Primer Knat1 rev2
zum Einsatz. Die im Gel sichtbaren Banden 1-8 (vgl. Abb. 23 A-B). entsprachen den
Erwartungen: Im Vergleich mit dem Markerbanden (bekannter Größe) ist Fragment 1 ca.
1200 bp groß (erwartet waren 1198 bp), Bande 2 liegt zwischen 900 und 1031 bp
(erwartet waren 1026 bp), Bande 3 liegt bei ca. 1031 bp (1058 bp), Bande 4 liegt bei ca.
650 bp (624 bp), Bande 5 liegt bei 300 bp (297 bp), Bande 6 liegt bei ca. 350 bp
(347 bp), Bande 7 liegt bei 500 bp (485 bp) und Bande 8 liegt bei ca. 150 bp (157 bp).
Über die Vorversuche mit A. thaliana konnte daher die Funktionalität der degenerierten
Primer über den Einsatz der erfolgreich synthetisierten cDNA und eine gelungene
Amplifikation bestätigt werden.
Abb. 24: A. thaliana, Primertest mit KNAT1-Fragment. Kombinationen aus acht verschiedenen Paarungen KNAT1-spezifischer und degenerierter Primer dP-SvKnox für die Suche nach Knox-Genen (Tab. 7): 1) Knat1 for/Knat1 rev; 2) Knat1 for/dP-SvKnox rev1; 3) Knat for/dP-SvKnox rev2; 4) dP-SvKnox for1/Knat1 rev; 5) dP-SvKnox for2/Knat1 rev; 6) dP-SvKnox for1/rev1; 7) dP-SvKnox for1/rev2; 8) dP-SvKnox for2/rev2; die Fragmentgrößen 1-8 im Gel (links) entsprechen den je nach Primerkombination theoretisch zu erwartenden Größen (bp in rot) der zugehörigen KNAT1-Fragmentstücke. 1 %iges Agarosegel: aufgetragen sind PCR-Produkte (5 µl + DNA-Probenpuffer) und Marker (M: 5 µl GeneRuler); Amplifikation mit Taq-Polymerase.
ERGEBNISSE 67
3.3.3 HBK1 – Picea abies
Das in P. abies gefundene HBK1-Gen homeobox of KNOX class) wurde von
SUNDÅS-LARSSON et al. (1998) anhand phylogenetischer Analysen als Mitglied der Knox
Klasse 1 beschrieben (AF063248/komplette mRNA). HBK1 stimmt, verglichen mit
Knox-Genen (Klasse 1) aus verschiedenen Angiospermen, in Aufbau und
Aminosäurensequenz des Proteins sowie in Expressionsmuster (vgl. Kn1 aus Z. mays)
und Funktion (Kontrolle der Zelldifferenzierung im Scheitelmeristem) überein. P. abies
steht im Folgenden als Referenz für Untersuchungen zum Vorkommen von Klasse 1
Knox-Genen in Gymnospermen. HBK1 ist das erste für P. abies beschriebene Gen der
Klasse 1 (SUNDÅS-LARSSON et al., 1998).
Im Folgenden wurde aus Nadeln oder vegetativen Knospen von P. abies Gesamt-RNA
isoliert. Das Gewebe wurde auch in diesem Fall mit RLC- und RLT-Puffer aufgeschlossen
(siehe 2.3.3). Aufgrund des für viele Gymnospermen typisch hohen Harzgehaltes, wurde
bei P. abies der RLC-Ansatz weiterverwendet. Die RNA-Ausbeute des RLC-Ansatzes war
besser, als die nach Aufschluss mit RLT, allerdings waren die Unterschiede wider
Erwarten nicht gravierend (Daten nicht gezeigt). Die Erststrangsynthese des Reversen
Ansatzes (2.3.5) erfolgte mit Oligo(dT)18-Primern des verwendeten FERMENTAS-Kits
(Tab. 6), die Zweitstrangsynthese mit den vier degenerierten Primern dP-SvKnox for1/2
und dP-SvKnox rev1/2 (Tab. 7). Die Basenfolge der beiden Sense-Primer dP-SvKnox for
und der beiden Antisense-Primer dP-SvKnox rev wurden aus dem Alignment für Klasse 1
Knox-Gene abgeleitet (Abb. 22). Dieser Ansatz diente zur Überprüfung der Funktionalität
der degenerierten Primer in Bezug auf ihre funktionelle Übertragbarkeit auf
Gymnospermen bzw. die Amplifikation ihrer Klasse 1-spezifischen Sequenzabschnitte.
Die Zweitstrangsynthese erfolgte mit Taq-Polymerase in 30 Zyklen. Denaturiert wurde bei
95 °C, 1 min. und 95 °C, 30 sec. Das Annealing fand bei 50 °C, 30 sec., die
anschließende Elongation bei 72 °C, 1 min. und 72 °C, 10 min. statt. Für die
Amplifizierungsversuche von Teilfragmenten des HBK1-Gens, aus P. abies, wurden in
drei PCR-Ansätzen jeweils einmal dP-SvKnox for1/rev1, dP-SvKnox for2/rev2, sowie
dP-SvKnox for1/ rev2 miteinander kombiniert (Abb. 25).
Nur Primerpaar dP-SvKnox for1/rev1 lieferte ein erwartungsgemäßes Ergebnis (359 bp)
mit einer im Original-Gel nur sehr schwach sichtbaren Bande zwischen 300 und 400 bp
(Ergebnis nicht gezeigt). Die aus den anderen beiden Primerpaarungen erwarteten
Fragmente (158 bp und 491 bp) konnten nicht amplifiziert werden. Die Funktionalität der
getesteten degenerierten Primer konnte über den kombinierten Einsatz mit dem
Gymnospermen-Knox-Gen HBK1 für dP-SvKnoxfor1/rev1 erfolgreich überprüft werden.
ERGEBNISSE 68
Das ca. 360 bp große Teilfragment der erfolgreichen Kombination (Abb. 25) wurde
geleluiert (2.3.8), anschließend in einen 3,9 kb großen pCRII-TOPO Vektor (INVITROGEN)
ligiert und in kompetente E. coli-Zellen (TOP TEN, INVITROGEN) transformiert (2.3.9). Der
für die TA-Klonierung erforderliche A-Überhang („sticky end“) stammt aus der
Zweitstrangsynthese mit Taq-Polymerase (s. o.). Von den im Anschluss selektierten
(Blau/Weiß, vergleiche 2.3.9) Transformanten mit Insert (positiven Klonen) wurden sieben
ausgewählt. Die isolierten Plasmide der sieben Klone wurden in einem Restriktionsansatz
EcoRI-verdaut (vergleiche 2.3.12) und die Hälfte des Ansatzes durch Gelelektrophorese
(2.3.8) aufgetrennt. Das 1 %ige Agarosegel zur Prüfung des eingebauten Inserts
(Abb. 26), zeigte den Vektorbanden entsprechende Fragmente bei 4000 bp (Artefakt für
Klon 5 & 6) und ca. 400 bp große Inserts für Klone Nr. 1 und 3.
Abb. 26: P. abies, Restriktionskontrolle für 359 bp-Insert. Überprüfung auf Einbau des Inserts anhand der pCRII-TOPO (3,9 kb) liegierten, Blau/Weiß-selektierten, positiven Klonen. Aufgetragen wurden sieben EcoRI/KpnI-geschnittene Ansätze (je ½ Restriktionsansatz der Klone 1-7) auf 1 %iges Agarosegel mit 5 µl Marker und DNA-Probenpuffer; Gelausschnitt mit den zwei Insert-tragenden Klonen 1 und 3 (Klon Nr. 2 ohne Insert). Banden der Insertfragmente liegen im Bereich von ca. 400 bp; nicht gezeigte Klone waren ohne Insert.
Abb. 25: P. abies, Schema zum Primertest für dP-SvKnox und HBK1-Teilsequenz. Darstellung dertheoretisch zu erwartenden Größe von Teilfragmenten/dsDNA aus drei verschiedenen Paarungen von degenerierten dP-SvKnox-Primern für die HBK1-Sequenz (AF063248). dP-SvKnox for und dP-SvKnox rev sind aus Alignment abgeleitet.
ERGEBNISSE 69
3.4 Molekulargenetische Ansätze im Sciadopitys-Modell
3.4.1 Funktionalitätstest mit PhyN1
Für S. verticillata wurde ein erster Ansatz mit einer bekannten, Sciadopitys-spezifischen
Sequenz durchgeführt. Verwendet wurde eine 579 bp lange Teilsequenz (genomische
DNA: AJ286657) des Phytochrom-Proteins PHYN1. Im Allgemeinen kommen bei
Gymnospermen zwei bis vier Phytochrom-Typen vor. Phytochrome sind kernkodierte
Proteine, die zu den pflanzlichen Photorezeptoren gezählt werden. Neben den sonst
üblichen Chloroplasten-, Mitochondrien- und rRNA-Genen werden auch Phytochrom–
Sequenzen für Stammbaumanalysen zur Phylogenie der Gymnospermen herangezogen
(SCHMIDT & SCHNEIDER-POETSCH, 2002). Anhand der bekannten PhyN1-Sequenz wurden
die spezifischen Primer PhyN1 for und PhyN1 rev (Tab. 7) erstellt.
Die Primer PhyN1 for/PhyN1 rev wurden auf ihre Funktion als Kontrollprimer überprüft.
Für diese Überprüfung wurde aus männlichen Zapfen isolierte, genomische DNA
verwendet. Die Isolierung (2.3.3) erfolgte mit dem DNeasy Mini Kit von QIAGEN (Tab. 6)
nach Herstellerangaben und zusätzlich optimiert nach DOULIS et al. (2000). Für den
PCR-Ansatz wurde Taq-Polymerase verwendet. Das PCR-Programm bestand aus einer
ersten Denaturierung bei 94 °C 2 min. gefolgt von 30 Zyklen Denaturierung bei 94 °C
30 sec., Annealing bei 50 °C 30 sec. und einer Elongation bei 72 °C 1 min. und 72 °C
10 min..
Das im 1 % igen Agarosegel (Abb. 27 A) elektrophoretisch aufgetrennte (siehe 2.3.7),
ca. 600 bp große Fragment entsprach den aus der Primerwahl abgeleiteten 579 bp für
die PhyN1-Teilsequenz. Das Ergebnis zeigte, dass die gewählten Primer sich als
spezifische Referenz für Sciadopitys eignen.
Abb. 27: S. verticillata, Primertest mit PhyN1-Fragment(579 bp) & Kontrolle der cDNA-Synthese. A: ca. 600 bp großes PCR-Produkt aus Ansatz mit genomischer DNA als Template, PhyN1- spezifischen Primern PhyN1 for/rev und Taq- Polymerase im 1 %igen Agarose-Gel (5 µl PCR-Produkt + DNA-Probenpuffer + 5 µl Marker (GeneRuler, 2.3.2)); B: Reverser Ansatz, ca. 600 bp großes cDNA-Fragment aus Zweit-strangsynthese mit PhyN1 for/rev und Pwo-Polymerase im 1 % igen Agarosegel (5 µl PCR-Produkt + DNA-Proben-puffer+5 µl Marker (GeneRuler, 2.3.2)).
A
B
B
ERGEBNISSE 70
3.4.2 Test zur Synthese von cDNA
In einem zweiten Ansatz wurde Gesamt-RNA aus einem einjährigen Sciadopitys-Keimling
isoliert (vergleiche 2.3.3) und in einem Reversen Ansatz für die Synthese der
entsprechenden cDNA (2.3.5) eingesetzt. Bei der RNA-Isolierung aus verschiedenen
Gewebetypen lieferte vorwiegend der RLT-Ansatz die besseren RNA-Ausbeuten. Daher
wurde entgegen der Herstellerempfehlung (zu RLC für Sekundärmetaboliten-reiches
Gewebe) bei Sciadopitys der RLT-Aufschlusspuffer verwendet. Die beiden Synthese-
schritte des Reversen Ansatzes erfolgten wie für P. abies (siehe 3.3.3: HBK1 mit dP-
SvKnox) beschrieben. Für die Zweitstrangsynthese wurden die getesteten PhyN1-
spezifischen Primer aus 3.4.1 erneut eingesetzt. Dieser Ansatz hatte zum Ziel den
Reversen Ansatz und damit die Qualität der resultierenden cDNA bzw. des Templates zu
überprüfen. Das im Gel sichtbare Fragment war ca. 600 bp groß (Abb. 27 B). Das
Resultat des Template-Tests zeigte, dass die eingesetzte RNA und der Reverse Ansatz
auch auf Sciadopitys mit Erfolg anwendbar waren.
3.4.3 SvKnox - Suche nach Knox-Genen mit degenerierten Primern
Im Folgenden wurde der anhand einer bekannten Gensequenz auf Funktionalität
getestete Verfahrensansatz auch für das Auffinden einer unbekannten Sequenz unter
Verwendung degenerierter Primer angewendet. Für die Suche nach Klasse 1
Knox-Genen in Sciadopitys, wurde der bei P. abies getestete Ansatz (siehe 3.4.1) mit
den degenerierten Primer dP-SvKnox wiederholt. Die HBK1-getesteten degenerierten
Primer wurden im Folgenden auf die noch unbekannte Gensequenz von Sciadopitys
angewendet. Die jeweils aus den Sequenzvergleichen für Klasse 1 Knox-Gene
konstruierten Primer dP-SvKnox for1/for2, sowie dP-SvKnox rev1/rev2 wurden für die
Suche nach der Existenz eines Knox Klasse 1-ähnlichen Motivs in Sciadopitys
eingesetzt. Kombiniert wurden dP-SvKnox for1/rev1 bzw. rev2, sowie dP-
SvKnox for2/rev2. Die Primer dP-SvKnox for2/rev1 kodieren für dieselbe Aminosäuren-
sequenz, sind jedoch einmal für die Basensequenz in 5’/3’-Richtung (for2) und einmal in
die Gegenrichtung (rev1) konstruiert (Tab. 7).
Die Isolierung von Gesamt-RNA aus jungen Zapfen erfolgte mit RLT-Puffer (vgl. PhyN1-
Ansatz). Der Reverse Ansatz war identisch mit dem Picea-Ansatz, daher stimmt auch die
Zweitstrangsynthese mit der in Kapitel 3.4.1 überein: PCR mit Taq-Polymerase und
Denaturierung bei 95 °C, 1 min, gefolgt von 30 Zyklen Denaturierung bei 95 °C, 30 sec.;
Annealing bei 50 °C, 30 sec.; Elongation bei 72 °C, 1 min. und 72 °C, 10 min.. Im Gel
sind die Fragmente, entsprechend der aufgetragenen Kombinationen aus den
ERGEBNISSE 71
dP-SvKnox-Primern, bei ca. 359 bp (for1/rev1), 158 bp (for2/rev2) und 491 bp (for1/rev2)
zu erwarten (vergleiche 3.3.3: Abb. 25). Das 1 %ige Agarosegel zeigt eine erfolgreiche
Amplifikation für dP-SvKnox for1/rev1 mit einer Bande zwischen 300 und 400 bp, die mit
den erwarteten 359 bp übereinstimmte (Abb. 28 A: for1/rev1). Die Gelelution des 359 bp
großen Fragments, die Ligation in den pCRII-TOPO Vektor (INVITROGEN), die
Transformation und die Kontrollrestriktion mit EcoRI erfolgten wie für P. abies (3.4.1).
Insgesamt wurden auch hier die eingebauten Fragmente sieben verschiedener Klone im
1 %igen Agarosegel auf Richtigkeit überprüft (Abb. 28 B). Aufgetragen wurden die Klone
in Reihenfolge 1 bis 7 von links nach rechts. Für alle aufgetragenen sieben positiven
Klone war jeweils ein eingebautes Fragmente im Größenbereich von ca. 400 bp
erkennbar.
Für die weitere Betrachtung wurden nur die Klone Nr. 5 und 7 mit besonders intensiver
Bande herangezogen. Es wurden Aliquots der jeweiligen Plasmidisolierungen
sequenziert. Die Sequenzierung (MWG) lieferte eine M13 Reverse- und
M13(-40)Forward-flankierte (vgl. pCRII-TOPO Vektor, INVITROGEN), 350 bp lange
Basensequenz für Klon Nr. 7 (Sequenzierung 1). Beim Umschreiben der Basensequenz
in die entsprechende Aminosäurensequenz, dienten die für die cDNA-Synthese
(Zweitstrang) eingesetzten Primer als Orientierung. Die in Abb. 29 A gezeigte
Teilsequenz von Sciadopitys umfasst den mit dP-SvKnox for1/rev1 ermittelten Bereich
Abb. 28: S. verticillata, cDNA-Synthese mit dP-SvKnox & Klonierungskontrolle. A: Reverser Ansatz mit degenerierten Primern dP-SvKnox. Von den aufgetragenen Primerkombinationen (vgl. Abb. 25) lieferte nur der erste Ansatz mit dP-SvKnox for1/rev1 ein ds cDNA-Fragment von ca. 300 bis 400 bp Länge; das entsprechend erwartete Teilfragment für PaHBK1 ist 359 bp groß. Im 1 %igen Agarose-Gel wurden 5 µl PCR-Produkt + DNA-Probenpuffer + 5 µl Marker (GeneRuler, 2.3.2) aufgetragen; PCR-Ansatz mit Taq-Polymerase. B: Restriktionskontrolle für Insert aus A. Überprüfung auf Einbau des Inserts anhand der pCRII-TOPO (4 kb) ligierten, Blau/Weiß-selektierten, positiven Klonen. Aufgetragen wurden sieben EcoRI/KpnI-geschnittene Ansätze (je ½ Restriktionsansatz der Klone 1-7) auf 1 %iges Agarosegel mit 5 µl Marker und DNA-Probenpuffer. Alle Klone zeigen ein Fragment von ca. 400 bp, Banden sind von unterschiedlicher Intensität.
A B
ERGEBNISSE 72
PELDQFMEAY bis KKKKKGKL(P). In einem zweiten Ansatz wurde die Sequenz mit der
Primerpaarung SvSondeKnox for1/dP-SvKnox rev2 um 36 Aminosäuren (EDCSTGE(M)
bis GLDQKQINNW) erweitert (Sequenzierung 2, Abb. 29 A).
Sequenzerweiterung:
Die Ansätze für Sequenzierung 2 entsprachen der von Sequenzierung 1. Die
Erststrangsynthese erfolgte mit Oligo(dT)18-Primern unter Einsatz von RNA aus
vegetativen Knospen. Die Synthese der doppelsträngigen cDNA erfolgte mittels
SvSondeKnox for1, einem SvKnox-spezifischen Primer, und dP-SvKnox rev2, einem
degenerierten Primer mit Antisense-Orientierung. Die ds cDNA wurde über ein 2 %iges
Agarosegel aufgetrennt und das Fragment (ca. 110 bp), nach erfolgreicher
Restriktionskontrolle, sequenziert (MWG). Die 36 Aminosäuren umfassende Erweiterung
des Homöodomänenmotivs ist in Abb. 29 B abzulesen. Weitere Versuche zur
Verlängerung der Sequenz mit degenerierten Primern für den N- bzw. C-Terminus waren
nicht erfolgreich. Die terminalen Bereiche sind nur schwach konserviert (Abb. 22), so
dass jede Sciadopitys-spezifische Sequenzabweichung die Funktionalität, der aus dem
Sequenzvergleich hergeleiteten degenerierten Primer, in Frage stellt bzw. verhindert.
Ein direkter Vergleich der Aminosäurensequenzen von HBK1 und SvKNOX (Abb. 29), in
Kombination mit dem Alignment weiterer Homöodomänen-Proteinen verschiedener
Organismen (Abb. 22) unter gleichzeitiger Berücksichtigung der Basensequenz, zeigte,
dass die in Sciadopitys gefundene Teilsequenz für ein PaHBK1 ähnliches
(Homöodomänen-)Protein kodiert. Das betreffende Protein weist Bereiche auf, deren
Motive denen von KN1-Homöodomänen-Proteinen in Z. mays ähnlich sind. Der
N-terminale Bereich der Aminosäuren-Sequenz des Sciadopitys-Proteins von MKKKKK
bis QINNW ist eindeutig als hochkonservierter Bereich eines Homöodomänen-Proteins
deutbar (siehe Anhang, A2). Aus dem Sequenzvergleich mit dem Homöodomänen-
Bereich von HBK1 wird deutlich, dass die für alle KNOX-Proteine hochkonservierte
atypische, TALE-Homöodomäne, auch im N-terminalen Bereich der Sciadopitys-
Aminosäurensequenz zu finden ist. Die für die atypisch Homöodomänen-Gruppe
namensgebenden drei Aminosäuren PYP sind auch in der Sciadopitys-Sequenz zu
finden. PYP ist ein in allen KNOX-Proteinen hochkonservierter Bereich zwischen zwei von
drei α-Helix-Motiven (Helix I ca. 17 AS, N-terminal von PYP & Helix II ca. 12 AS C-terminal
von PYP). Der für die dritte Helix beschriebene Bereich von ca. 17 AS, nach dem so
genannten turn-Motiv (GLD), ist für Sciadopitys nicht vollständig. Insgesamt fehlt ca. 1/3
des C-Terminus der Homöodomäne. Die Aminosäurenfolge PEL bis NSL ist, mit
Ausnahme einzelner Aminosäuren, klar als C-terminales Motiv der KNOX-Domäne
ERGEBNISSE 73
erkennbar. Die N-terminale Hälfte der KNOX-Domäne fehlt. Die für HBK1 beschriebene
Zuordnung zu den Klasse 1 Genen (SUNDÅS-LARSSON et al., 1998) kann auch für
Sciadopitys über zwei fehlende Aminosäuren (Valin-Arginin: eine für Klasse 2 Gene wie
KNAT3 & 4 typische Insertion) getroffen werden. Auch der konservierte Bereich der ELK-
Domäne ist charakteristischer Bestandteil der identifzierten Sequenz. Der zwischen
KNOX- und ELK-Domäne liegende Bereich der neuen Sequenz wird der GSE-Domäne
zugeordnet und ist in ca. der Hälfte der kodierenden Sequenz mit HBK1 identisch.
Das Sequenzierungsergebnis (Abb. 29 A) zeigte, dass sich die Kombination der
degenerierten Primer dP-SvKnox for1/rev1 und eine Kombination aus degenerierten und
spezifischen Primern (SvSondeKnox for1/dP-SvKnox rev2) eignen, um unbekannte
Sequenzen mit Knox-Charakter zu isolieren (Abb. 29 B). Eine Komplettierung der neu
gefundenen Knox-Sequenz um den 3’- und 5’-Bereich bzw. die im Vergleich mit HBK1
fehlenden Aminosäuren (Abb. 29 B), steht noch aus. Die mit insgesamt fünf weiteren
degenerierten Primern (Daten nicht gezeigt) durchgeführten Ansätze waren bisher ohne
Erfolg. Der Sequenzbereich aus Sequenzierung 1 diente als Vorlage zur Synthese
spezifischer Primer für die nachfolgende Herstellung des Sondentemplates. Die weitere
Vorgehensweise erfolgt daher unter dem Aspekt der Herstellung einer Antisense-
mRNA-Sonde (vergleiche 3.4.4) für die in-situ-Hybridsierung (siehe 3.5.2)
ERGEBNISSE 74
Abb. 29: Schema der ermittelten Sciadopitys-Sequenz im Vergleich zur KNOX-Proteinsequenz von P. abies (HBK1). A: Darstellung der ermittelten Nukleotidsequenz und der daraus abgeleiteten Aminosäurenabfolge. B: Die aus P. abies hergeleitete Aminosäurensequenz (AF063248) wurde der in Sciadopitys gefundenen Teilsequenz, SvKNOX, gegenübergestellt; übereinstimmende Aminosäuren wurden gelb hinterlegt, abweichende, Sciadopitys-spezifische hellblau, die für HBK1 sind grau hinterlegt, charakteristische KNOX-Domänen sind durch farbige Rahmen gekennzeichnet; gezeigte Teilsequenz aus Kombination von zwei verschiedenen Sequenzierungsansätzen: 1) PELDQFMEAY…KKKKKGKL mit dP-SvKnox for/rev1; 2) EDCSTGE(M)… GLDQKQINNW) mit SvSondeKnox for1/dP-SvKnox rev2.
Pa HBK1 Sv KNOX identische AS
A
B
ERGEBNISSE 75
3.4.4 Sondenherstellung für SvKnox
Für die Herstellung des Sondentemplates wurde eine Teilsequenz mit einem
hochkonservierten Abschnitt der ELK- und der Homöodomäne ausgewählt. Der Bereich
um die fehlende Klasse 2-typische Aminosäureninsertion (vgl. HBK1, SUNDÅS-LARSSON et
al., 1998) ist ebenfalls enthalten. Im Transkriptionsansatz mit T7-RNA-Polymerase
(vergleiche 2.3.14) wurden die Sciadopitys-spezifischen Sondenprimer
SvSondeKnox for1/rev2 (für EDCSTGE(M)) und SvSondeKnox for2/rev1 (für KKKKKGKL)
zur Herstellung eines ca. 150 bp langen DNA-Fragments verwendet. Für die
Sondenherstellung kann ein linearisierter Plasmidvektor inklusive des Inserts oder ein
PCR-generiertes Template (200 ng/µl) als Matritze dienen. Für die Herstellung der Sense-
und Antisense-mRNA-Sonden wurde jeweils ein linearisierter Plasmidvektor als Matritze
eingesetzt. Dafür wurde vorab in einer PCR (siehe 2.3.6 mit Annealing bei 50 °C, 30 sec.)
mit Pwo-Polymerase und den SvKnox-spezifischen Sondenprimern (Sense-Sonde:
SvSondeKnox for1/for2; Antisense-Sonde: SvSondeKnox rev1/rev2) der ausgewählte
cDNA-Bereich amplifiziert (Abb. 30, Spur1). Als Template dienten 0,5 µl einer 1:20-
Verdünnung der Plasmidisolierung von Klon Nr. 7 aus 3.4.3. Die Sondenprimer waren so
konstruiert (Tab. 7), dass das resultierende DNA-Fragment über den zusätzlich zur
150 bp Sondensequenz vorhanden Restriktionslinker/SacI/HindIII-geschnitten (Abb. 30,
Spur 2) in den pGEM-Vektor, hinter eine T7-Promotorsequenz, kloniert werden konnte.
Der leere pGEM-Vektor (PROMEGA) wurde vor der Klonierung des Inserts ebenfalls
SacI/HindIII-geschnitten (Abb. 30, Spur3). Die Matritze (Abb. 30, Spur 4) wurde über ein
2 %iges Agarosegel überprüft. Die Bande bei ~150 bp entspricht dem eingebauten
Insert bestehend aus der sondenspezifische cDNA-Sequenz (150 bp), die 3221 bp
große Bande entspricht dem Vektoranteil. Im Testgel wurde parallel zum Antisense-
Ansatz (Spur1*-4*) auch ein Ansatz für die Sense-mRNA-Sonde (Spur1-4) getestet.
Abb. 30: S. verticillata, Testgel zur Sonden-herstellung. 2%iges Agarosegel aufgetragen 5 µl Ansatz + DNA-Probenpuffer (OrangeG) + 5 µl DNA-Marker (GeneRuler). Spuren 1*-4*= Ansätze für Antisense-Sonde, 1-4= Ansätze für Sense-Sonde. 1/1*= Amplifikationsprodukt aus PCR mit Pwo-Polymerase, Sondenprimern SvSondeKnox for1/2 bzw. rev1/2 und 1:20 Verdünnung aus Plasmid-isolierung von Klon Nr. 7. 2/2*= SacI/HindIII-geschnittenes PCR-Produkt. 3/3*= SacI/HindIII-geschnittener pGEM-Vektor (3221 bp). 4/4*= pGEM (PROMEGA) + 150 bp Insert bzw. Sondentemplate (SacI/HindIII-geschnitten).
ERGEBNISSE 76
Die hergestellte Antisense-mRNA-Sonde umfasst einen Bereich von 50 Aminosäuren und
ist entsprechend 150 bp lang. Aufgrund der gewählten Länge, die nach ZACHGO (2002)
im optimalen Bereich von 150-200 bp liegt, ist keine zusätzliche Sonden-Hydrolyse zur
Herstellung kleinerer Fragmente nötig. Die hergestellte Sonde sollte aufgrund ihrer Größe
gut in das Gewebe penetrieren können und keine unspezifisch starke
Hintergrundfärbung verursachen, wie z. B. zu lange Sonden. Die Sonde wurde mit dem
10x DIG Labeling Mix der Firma ROCHE nach Herstellerangaben mit DIG-UTPs markiert.
Durch ein Mischungsverhältnis von drei unmarkierten zu einem DIG-markierten Uracil
war jedes vierte Uracil (U) DIG-markiert. Die ausgewählte Sequenz enthält einen UTP-
Anteil von ca. 41 %. Die indirekte Markierung der DIG-UTPs erfolgte im Gewebe über
DIG-Antikörper (Alkalische Phosphatase-gebunden). Die nicht radioaktive
Markierungsvariante wurde aufgrund der unkomplizierteren Handhabung, besseren
Aufbewahrung bzw. längeren Lagerfähigkeit und möglichen Wiederverwendung gewählt.
Die Wahl fiel auf Digoxigenin, weil es als sensibler in Bezug auf die Detektion
beschrieben wird als z.B. Biotin (ZACHGO, 2002). Es wurden zwei parallele
in-vitro-Transkriptionen durchgeführt. In einem Ansatz mit DIG-UTPs wurden die
eigentliche Antisense-mRNA-Sonde und eine zusätzliche markierte Sense-mRNA-Sonde
hergestellt. Über den zweiten Transkriptionsansatz ohne DIG-UTPs wurden unmarkierte
Sense- und Antisense-mRNA-Sonden erstellt. Die zusätzlich zur DIG-Antisense-mRNA-
Sonde erstellten Sonden fungierten als Kontrollen.
Dot Blot
Da die richtige Sondenmenge für ein gutes Hybridisierungsergebnis essentiell ist, wurde
sie über das Dot Blot-Verfahren (siehe 2.3.14) quantifiziert und die unverdünnte
Antisense-mRNA-Sonde aufgrund des besten Detektionsergebnisses (Abb. 31 B) für die
Hybridisierung (siehe 3.5.2) ausgewählt.
Die Detektion (vergleiche 2.3.15.5) wurde mittels Substrat BCIP/NBT, in Tablettenform
(SIGMAFAST™ von SIGMA-ALDRICH), durchgeführt. Das Detektionsergebnis/Signal war
nach ca. 2 h sichtbar. Das Signal der Antisense-Sonde (300 µg/µl) war im Vergleich zu
einer unmarkierten Sense-mRNA-Sonde (Kontrolle 1: 1404 µg/µl) bzw. unmarkierten
Antisense-mRNA-Sonde (Kontrolle 2: 288 µg/µl) deutlich sichtbar. Im Vergleich mit einer
parallel getesteten markierten Sense-mRNA-Sonde (Kontrolle 3: 1008 µg/µl) war das
Signal, entsprechend des Konzentrationsunterschiedes, insgesamt schwächer
(verbesserte sich auch bei längerer Inkubation nicht deutlich). Die unverdünnten Sonden
lieferten die besten Signale. Die 1:10 Verdünnungen beider Ansätze waren sichtbar,
lieferten aber nur schwache Signale und wurden daher nicht weiterverwendet.
ERGEBNISSE 77
Entsprechendes gilt für den 1:100 verdünnten Ansatz der markierten Sense-Sonde. Die
entsprechende Verdünnung der markierten Antisense-Sonde lieferte kein Signal. Die
Signale der 1:1000 Verdünnung blieben in beiden Fällen aus.
3.5 Expressionsnachweis für SvKnox
3.5.1 in-situ-Hybridisierung – methodisch
Als Vorlage für die Durchführung der in-situ-Hybrdisierung wurde das unter 2.3.15
aufgeführte „GLEISSBERG-Protokoll“ als Vorschrift verwendet. Die Hybridisierungs-
Vorschrift ist speziell an dikotyle Angiospermen (z. B. Papaveraceae, Fumariaceae)
angepasst. In dieser Arbeit wurden Samen (mit angeschnittener/entfernter
Samenschale), vegetative Knospen (mit verholzten Knospenschuppen) und Keimlinge
(Kotyledonen mit Wachsschicht) von Sciadopitys fixiert. Eigenschaften der hier
eingesetzten Gewebe, wie z. B. starke Wachsauflagerungen etc. machten Anpassungen
erforderlich. Das Ursprungs-Protokoll wurde daher abgewandelt, um die Methode
optimal auf Sciadopitys anzupassen. Die methodischen Abwandlungen und
Ablaufvarianten werden hier beschrieben und anhand des Methodenprotokolls für
in-situ-Hybridisierung nach ZACHGO (2002) diskutiert. Die Abwandlungen der unter 2.3.15
Abb. 31: S. verticillata, in-vitro-Transkription & Dot Blot. A: Schema zur eingesetzten DNA-Matritze; linearisierter Vektor inklusive des einklonierten DNA-Fragments mit Promotor für T7-RNA-Polymerase. B: Dot Blot; Quantifizierungsergebnis für DIG(UTP)-markierte Sense- und Antisense-mRNA-Sonde; Aufgetragen: je 1 µl unverdünnte Sonde (Sense: ca. 1000 µg/µl, Antisense ca. 300 µg/µl) und Verdünnungen im Verhältnis 1:10, 1:100 und 1:1000 (erkennbare Signale eingekreist), Detektion über AP-gekoppelte Anti-DIG-Antikörper und BCIP/NBT.
A
B
ERGEBNISSE 78
beschriebenen Hybridisierung betrafen hauptsächlich die Fixierung (2.3.15.1), die
Proteinase K-Behandlung (Prähybridisierung, 2.3.15.2), die eingesetzte Sondenmenge
bzw. den Sondenmix (Hybridisierung, 2.3.15.3), die Färbelösung und die
Detektionsdauer (2.3.15.5).
3.5.1.1 Fixieren & Schneiden des Gewebes
Voraussetzung für eine erfolgreiche in-situ-Hybridisierung ist die Fixierung der RNA im zu
untersuchenden Gewebe. Wichtige Parameter sind hierbei die Wahl und die
Konzentration des Fixativs (Komponenten & Fixativ-spezifische Wechselwirkungen mit
dem Gewebe und der RNA), die Dauer der Fixierung und die Fixativmenge im Verhältnis
zur Probengröße. Bei der Objektpräparation des eingesetzten Pflanzenmaterials
(siehe 2.1.) wurde zwischen wichtigen Objektanteilen und der Fixierung/Infiltration
abgewogen, außerdem wurde die Präparation auf ein Minimum reduziert, um möglichen
RNase-Kontaminationen vorzubeugen. Die Dauer für eine komplette Infiltration war
entsprechend der Penetrationseigenschaften des Formaldhyd-Anteils (4%ige Lösung:
2 mm/h), maßgeblich von der Objektgröße abhängig. In dieser Arbeit wurde mit den
Standard-Fixierungstechniken FAA (Formalin-Alkohol-Eisessig-Gemisch) und PFA
(Formaldehyd, PBS-gepuffert) fixiert, da mit beiden gute Penetrationseigenschaften bei
gleichzeitig ausreichender Erhaltung der Morphologie zu erwarten waren.
Variante I:
Die PFA-Fixierung nach ZACHGO (2002) wurde wie im Methoden-Kapitel 2.3.15.1
beschrieben durchgeführt und entspricht der Fixierung im GLEISSBERG-Protokoll. Die
Fixierdauer hat Einfluss auf die Signalstärke (fehlende Signale bei der Detektion). Um
eine zu geringe Infiltration des Gewebes gegenüber einer Überfixierung abzuwägen,
wurden unterschiedliche Fixierzeiten genutzt. Fixiert wurde, wie im Protokoll angegeben,
für mind. 8 h bzw. 16 h. Dem Fixativ wurde ein Detergenz (ca. 0,1 %) zugegeben, um die
Infiltrationsdauer im Vakuum zusätzlich zu verkürzen. Die Dauer der Vakuumbehandlung
plus Detergenz für die Gewebeinfiltration zu Beginn der Fixierung wurde gewebebedingt
auf 30 bis 60 min. verlängert. Als Detergenz wurde nicht TritonX, sondern Tween20
zugegeben. Die 40 ml Fixativ wurden anschließend durch frische Lösung ersetzt.
Variante II:
FAA wurde in der am Lehrstuhl etablierten Zusammensetzung verwendet (siehe 2.2.1),
die für die morphologischen Studien an Sciadopitys, in Kombination mit einer Fixierdauer
von 72 h, gute Ergebnisse zeigte. Angepasst an die RNase-sensitive Arbeit wurde für
72 h bei 4° C gekühlt fixiert. Zu Beginn der Fixierung erfolgte eine Vakuumbehandlung, in
ERGEBNISSE 79
Anlehnung an die PFA-Fixierung, zum Zweck einer zusätzlichen Optimierung. Die
Vakuumbehandlung war allerdings aufgrund der besseren Infiltrationseigenschaften
(durch Eisessig und Alkohol) beschleunigt und vergleichsweise kurz (10 min.) und
bedurfte keiner Zugabe von Detergenz.
Für kleinere Objekte eigneten sich beide Fixierungsvarianten. Für größere Proben mit
verholzten Strukturen und/oder solche mit hohem Stärke- oder Milchsaftanteil, wie z.B.
präparierte Samen (Embryonen in Endosperm) und vegetative Knospen, lieferte die
Fixierung mit FAA die besseren Resultate. Eine unzureichende Fixierung hatte u. a.
negativen Einfluss auf die Infiltration mit Paraffin. Die Gewebeschnitte betreffender
Proben hafteten nicht optimal auf den Objektträgern und gingen während der
Durchführung (Prähybridisierung etc.) verloren.
Die Vorbereitung auf die Paraffinbehandlung erfolgte wie in 2.3.15.1 beschrieben, nach
GLEISSBERG-Protokoll, mit Roti-Histol als Intermedium. Im Zuge der ersten vier Tage
wurde ein Teil des verflüssigten Paraffins abgeschüttet und durch neues
ungeschmolzenes ersetzt. An den folgenden Tagen wurde entsprechend des Vorlagen-
Protokolls gegen frisches, geschmolzenes Paraffin ausgetauscht. Nachfolgend wurde
aufgrund von Schrumpfungsartefakten bei Verwendung von Paraffin mit Plastikpolymer-
Anteil (Paraplast Plus, „nach GLEISSBERG“), ausschließlich in reines Paraffin (HISTOWAX,
Abwandlung) eingebettet. Ob allein die Plastikpolymer-Komponente ausschlaggebend
war oder die Schrumpfung auf Temperaturschwankungen (Wärmeschrank) während der
Lagerung beim Hochführen der Proben zurückzuführen ist (Vergleich Schmelzpunkte
von Paraplast, 2.3.15.1), bleibt abzuwägen. Es wurden Gewebeschnitte in einer Stärke
von 10 µm hergestellt. Die Gewebeschnitte wurden in Anlehnung an Punkt 2.2.2 wie
beschrieben auf Polylysin-beschichteten Objektträgern gestreckt (DEPC-H2O) und
getrocknet (2.3.15.1). Bei den eingesetzten Gewebeschnitten handelte es sich meist um
Teilbänder einer Schnittreihe, bestehend aus ca. vier zusammenhängenden
Einzelschnitten. Objektabhängig (Zerreissen der Schnitte aufgrund von Verholzungen/
methodische Artefakte etc.) konnten allerdings teilweise nur viele Einzelschnitte erstellt
werden. Das Strecken der Schnitte erfolgte wie aus rein anatomisch-morphologischen
Arbeiten gewohnt, anstelle der mit Eiweißglycerin vorbehandelten Objektträger
(siehe 2.2.2) wurden allerdings fertige, Polylysin-beschichtete Objektträger verwendet.
Die Methodik des Streckens im Wasserbad (nicht auf dem Objektträger) wurde nicht vom
Vorlagenprotokoll übernommen, da sich der Transfer, Wasseroberfläche-Objektträger,
nicht für die vielfach entstandenen Einzelschnitte eignete. Für eine Kombination aus
Schnittbändern und Einzelschnitten erwies sich das gewohnte Strecken auf Wasser,
ERGEBNISSE 80
Abb. 32: Sciadopitys-Gewebe nach Proteinase K-Behandlung. Proteinase K-Konzentration von 10 µg/ml: Verlust der Gewebemorphologie über Auflösen der Zell-ververbände bei zu starkem Verdau.
direkt auf den Objektträgern als gut geeignet. Durch die im Material & Methoden-Teil
aufgeführten POLYSINE™ Microscope Slides (Tab. 2 II) war ein gutes Anhaften der
Schnitte und eine gute Verteilung des Wasserfilms (Strecken der Schnitte) gewährleistet.
Polylysin-beschichtete Objektträger eines anderen Herstellers erwiesen sich als nicht
ausreichend mit Wasser benetzbar, so dass die Schnitte beim Strecken mitsamt dem
Wasser abperlten und größtenteils verloren gingen.
3.5.1.2 Prähybridisierung
Die Prähybridisierungsschritte erfolgten wie in 2.3.15.2 beschrieben in jeweils 200 ml
Lösung (in Glasküvette). Die Durchführung ist der im anatomisch-morphologischen
Methodenteil beschriebenen Vorgehensweise sehr ähnlich und bedurfte daher keiner
weiteren Anpassung. Die Behandlung mit Roti-Histol- und Ethanol-Lösung diente der
Entfernung des Paraffins und der anschließenden Hydrierung über die mit
Natriumchlorid-Lösung (0,85 %) verdünnte, absteigende Ethanol-Reihe. Den
Waschschritten mit Salzsäure (HCl), DEPC-H2O und 2x SSPE-Puffer folgte der besonders
kritische Schritt der Proteinase K-Behandlung. Die Vorbehandlung mit Proteinase K
diente zur Verbesserung der Durchlässigkeit des Gewebes und machte daher immer
eine Anpassung an die jeweilige Gewebeart erforderlich. Eine Erhöhung der Proteinase-
Konzentration führt allgemein zu einer Verbesserung des Signals bei zunehmendem
Verlust der Gewebemorphologie der Schnitte durch Auflösen des Gewebeverbandes.
Die im Ausgangsprotokoll verwendete Proteinase K-Konzentration von 10 µg/ml, erwies
sich für alle verwendeten Objekte als zu stark (Abb. 32).
Der zu intensive Verdau führte zu
einer starken Auflösung des
Gewebeverbandes bis hin zum
Totalverlust der Gewebeschnitte.
Durch Reduktion der verwendeten
Enzym-Konzentration auf 5 µg/ml
blieb das Gewebe besser erhalten.
Über eine daran anschließende
Säurehydrolyse wurden Nukleotid-
gebundene Proteine teilweise
abgelöst und die Durchlässigkeit
des Gewebes für eine zusätzliche
Signaloptimierung weiter erhöht.
ERGEBNISSE 81
Die Bedingungen für Säurehydrolyse und Acetylierung (Triethanolamin/Essigsäure-
anhydride) und die weitere Prähybridisierung (SSPE & aufsteigende Ethanolreihe)
wurden hier nicht variiert und direkt vom Vorlagenprotokoll übernommen. Die Möglichkeit
der Zwischenlagerung in Ethanol (100 %) wurde i. R. nicht genutzt, stattdessen wurde
direkt mit der Hybridisierung fortgefahren.
3.5.1.3 Hybridisierung
Ein gutes Detektionsergebnis/die Signalstärke ist abhängig von der Bildung spezifischer
Hybride aus Antisense-mRNA-Sonde und Ziel-RNA/Sense-mRNA (ZACHGO, 2002). Die
Bildung spezifischer Hybridmoleküle wird allgemein über die Komponenten der
Hybridisierungslösung beeinflusst. Außerdem wird ein starkes Hintergrundsignal über die
Entstehung unspezifischer Bindungen positiv beeinflusst. Die Formamide ermöglichen
allgemein eine Senkung der Temperatur, die für eine RNA-RNA-Bindung nötig ist. Die
Spezifität der Hybridbindung ist zusätzlich über Na+-Ionen beeinflussbar: Je höher die
Konzentration der monovalenten Ionen ist, desto mehr stabile Duplexe entstehen, weil
ausschließlich Sequenzen mit hohem Homologiegrad binden. Eine zu niedrige
Konzentration erzeugt unspezifischere Hybriden, durch Bindung weniger homologer
Sequenzbereiche aneinander (ZACHGO, 2002). Der Anteil nicht spezifischer Bindungen
ist zusätzlich über die in der Hybridisierungslösung enthaltene tRNA und Denhardt’s
Lösung abblockbar. In dieser Arbeit wurde die vorgegebene Hybridisierung, bei 55 °C
ü. N. übernommen.
Probenvorbereitung:
Die Hybridisierung fand, wie in 2.3.15.3 beschrieben (nach GLEISSBERG-Protokoll), unter
Verwendung von Deckgläsern in einer verschlossenen Box (chloroformgereinigt) und vor
Verdunstung geschützt statt. Die Kontrollen wurden parallel mitgeführt, aber immer
separat behandelt (Handschuhwechsel, separate Kammern), um einen Kontakt mit den
markierten Proben auszuschließen.
Sondenmix:
In der eigentlichen Hybridisierungsreaktion (vergleiche 2.3.15.3) wurde hier aus-
schließlich die Menge der eingesetzten Sonde im Sondenmix (in Abhängigkeit von der
Sondenkonzentration) bzw. pro Objektträger variiert. Es wurden Sondenmengen von 180
bis 900 ng pro Objektträger verwendet. Vom Sondenmix (Hybridisierungslösung plus
Sonde) wurde anstelle von 200 µl ein Endvolumen von 400 µl pro Objektträger
eingesetzt, um eine homogene Verteilung (über alle Schnitte) zu gewährleisten. In
Kontrollansätzen wurden die entsprechenden Objektträger entweder mit 400 µl reiner
ERGEBNISSE 82
Hybridisierungslösung (ohne Sonde), 400 µl Sondenmix mit unmarkierter Sense-
/Antisense-Sonde oder markierter Sense-Sonde (anstelle der Antisense-Sonde)
behandelt. Es gilt generell einen Sondenüberschuss (im Vergleich zur Zielsequenz) zu
vermeiden, da es zu Überlagerung des eigentlichen Signals durch verstärkte
Hintergrundfärbung führen kann. Daher wurde die eingesetzte Menge per Dot Blot
abgeschätzt (vergleiche 2.3.14). Der Anteil an Dextransulfat in der Hybridisierungslösung
sorgt dabei für ein weiteres Ankonzentrieren der Sonde, weil es in wässrigen Lösungen
so stark hydratisiert, dass die Makromoleküle durch ausbleibende Hydratisierung (hier
RNA) stärker ankonzentriert werden (ZACHGO, 2002).
3.5.1.4 Waschschritte
Die Waschschritte im Anschluss an die Hybridisierung wurden wie in Punkt 2.3.15.4
beschrieben, nach GLEISSBERG-Protokoll, unter leichter Bewegung für einen
gleichmäßigen Lösungskontakt der Schnitte durchgeführt und dienten der Beseitigung
aller Komponenten, die zu einer verstärkten Hintergrundfärbung bei der Signaldetektion
beitragen würden. Die Deckgläser wurden vor der Inkubation in den jeweiligen
Waschlösungen (je 200 ml) entfernt (3x SSPE). Die Inkubation in Puffern mit steigenden
Salzkonzentrationen diente dazu ungebundene, markierte Sonden zu entfernen. Die
fehlgepaarten Hybride und/oder nicht spezifisch gebundenen Komponenten wurden
über die ansteigende Temperatur der Pufferlösungen unter gleichzeitiger Absenkung
deren Salzkonzentration beseitigt (ZACHGO, 2002). Die einzelsträngigen RNA-Moleküle
(z. B. nicht gebundene markierte RNA-Sonden) wurden mit RNase A (20 µg/µl in NTE)
verdaut.
3.5.1.5 Detektion des Signals
Die Antikörperbehandlung wird hier zusammen mit der Detektion besprochen. Um ein
mögliches Trockenfallen etc. der Gewebeschnitte zu verhindern und den
Versuchsablaufs gleichzeitig zeitlich zu straffen wurden beide Schritte lückenlos
aneinandergereiht. Die Schnitte wurden daher abweichend vom Ausgangsprotokoll,
ohne eine Zwischenlagerung (4 °C, ü. N.), nach insgesamt 80 min. Inkubation in
Puffer 1 mit Tween20 direkt weiter in Puffer 2 mit Tween überführt bzw. equilibriert.
Antikörperinkubation:
Als Vorbereitung auf die Inkubation mit Anti-DIG-Antikörpern, wurden die Schnitte über
Inkubation mit Puffer 1 wie beschrieben (2.3.14.6), unter Zugabe von 0,5 % Blocking-
Reagenz und 0,1 % BSA in Puffer 1, geblockt. Die 1 h Antikörperinkubation, mit 300 µl
verdünnter (1:3000) Antikörperlösung pro Objektträger, wurde unverändert übernommen
ERGEBNISSE 83
und wie im Methodenkapitel (s. o.) beschrieben durchgeführt. Auf jeden Objektträger
wurden anschließend 300 µl der verdünnten Antikörperlösung aufgetragen und die
Objektträger entsprechend der Anweisung inkubiert und als Vorbereitung auf die
Detektion gewaschen (siehe 2.3.14.5).
Detektion:
Für die Detektion der Anti-DIG-gekoppelten Alkalischen Phosphatase wurde das ent-
sprechende Substrat BCIP/NBT in Tablettenform (SIGMAFAST™, SIGMA ALDRICH)
verwendet. Die Tabletten wurden in dieser Arbeit mit Polyvinylalkohol (10 %) oder
alternativ in DEPC-H2O bzw. Puffer 2 gelöst (vergleiche 2.3.14.5). Es wurden 200 µl der
Detektionslösung pro Objektträger aufgetragen. Die Verwendung von Polyvinylalkohol
entspricht dabei der Version nach GLEISSBERG-Protokoll. Der Einsatz von Polyvinylalkohol
dient generell der Beschleunigung der Reaktion und einer genaueren Lokalisierung des
Signals, indem es z. B. die Diffusion des gebildeten Reaktionsproduktes
Formazan/Violettfärbung unterdrückt (ZACHGO, 2002). Aufgrund der stark viskosen
Beschaffenheit der Polyvinyl-Färbelösung erschienen die Schnitte innerhalb eines
Objektträgers durch die inhomogene Verteilung der Lösung unterschiedlich gut benetzt
bzw. angefärbt (Abb. 33).
Bei Verwendung der über DEPC-H2O
gelösten Färbelösung (bevorzugte
Variante) blieben derartige Artefakte aus
und lieferten durch vollständiges Lösen der
Tablette (homogene Lösung) die besten
Ergebnisse. Bei Verwendung von Puffer 2,
in direkter Anlehnung an den
durchgeführten Dot Blot aus 2.3.14, war
das Ergebnis vergleichbar mit den
Resultaten mit DEPC-H2O. Die einmalige
Verwendung einer Detektions Kit-eigenen
NBT/BCIP-Stocklösung, nach Hersteller-
angaben (ROCHE, Tab. 6), führte zu keinem
Erfolg.
Die Detektionsreaktion wurde unter Verwendung von Deckgläsern und vor Licht und
Verdunstung geschützt durchgeführt. Die Färberesultate variierten nicht nur je nach
eingesetztem Medium zum Lösen der Färbetablette, sondern auch je nach eingesetzter
Abb. 33: Detektionslösung: Gewebe mit Rück-ständen des Färbesubstrats. Färbelösung mit Polyvinylalkohol: viskose Färbelösung mit inhomoger Verteilung über Objekträger bzw. Gewebe.
ERGEBNISSE 84
Sondenmenge für die Hybridisierung und Einwirkzeit der Färbelösung (Detektionszeit).
Die Kombinationen aus Sondenmenge und Einwirkzeit wurden in verschiedenen
Ansätzen variiert. Die Detektionsdauer der durchgeführten in-situ-Hybridisierungen lag
dabei zwischen 16 h und 24 h, max. bei 4 Tagen. Außerdem kam es bei Einsatz
markierter Sense-mRNA-Sonde, wie auch bei ZACHGO (2002) beschrieben, zur
Signalentwicklung.
3.5.1.6 Reaktionsstop
Der Zeitpunkt des Abstoppens mit Aqua dest. (vergleiche 2.3.15.6), wurde festgelegt,
indem die Intensität der Hintergrundfärbung im Vergleich zum eigentlichen Signal
abgewogen wurde. Für Ergebnisse mit nur schwachem Detektionsignal war beim
Dehydrieren der Schnitte zu beachten, dass sich das Signal über die aufsteigende
Alkoholreihe auswäscht.
Die gesamte Hybridisierung ist durch die Veränderung einzelner Parameter in der
Durchführung auf vielfältige Weise adaptierbar. Die Erfolge sind daher stark
Parameterahängig bzw. über deren Veränderungen beeinflusst. Insgesamt wurden, mit
Ausnahme der Detektionszeit (s. o), innerhalb eines kompletten Versuchsdurchlaufes
ausgehend von der gewählten Fixierung nur maximal zwei parallele Parameter-
veränderungen (Proteinase K & Sondenmenge/Objektträger) durchgeführt. Die Variation
der Sondenkonzentration kann durch Erhöhung der eingesetzten Menge, bis zum
Sättigungspunkt der Ziel-RNA-Sequenz, verbesserte Signale bewirken.
3.5.2 in-situ-Hybridisierung – inhaltlich
Im Folgenden werden lichtmikroskopische Aufnahmen von mit mRNA-Sonde
hybridisierten Gewebeschnitten gezeigt. Bei den dargestellten Ergebnissen handelt es
sich um vier Tage mit Färbelösung inkubierte Proben. Die gewählte Konzentration lag für
alle Sondenvarianten dieses Ansatzes mit 450 ng Sonde pro Objektträger im mittleren
Bereich. Die Einwirkzeit der Färbelösung entsprach der maximalen Dauer. Die
Ergebnisse zeigen erkennbare Detektionssignale bei gleichzeitig sehr starker
Hintergrundfärbung. Gezeigt sind Längsschnitte bzw. kleinere Serien aufeinander
folgender Schnitte, die median oder nahe der Medianen durch den Vegetationskegel
verlaufen. Parallel wurden auch Querschnitte von Keim- und Primärblättern betrachtet.
Ein Teil dieser Schnitte wurde zur Kontrolle mit unmarkierter Antisense-mRNA-Sonde
(Kontrolle 1) oder markierter Sense-mRNA-Sonde (Kontrolle 2) und der übrige Teil, im
eigentlichen Ansatz, mit DIG-markierter Antisense-mRNA-Sonde behandelt. Der
ERGEBNISSE 85
gewählte Ansatz zeigt die für die hergestellte Sonde bestmöglichen Detektions-
ergebnisse. Die hybridisierten Schnitte anderer Ansätze waren überwiegend nicht
auswertbar, weil sich die (Kontroll-)Schnitte im Versuchsverlauf von den Objektträgern
lösten, die Schnitte entsprechend des jeweils verwendeten Mediums zum Lösen der
Färbetabletten nicht anfärbten und/oder aufgrund der Kombination aus Detektionslänge
und Sondenkonzentration keine zufrieden stellenden Resultate lieferten. Ein Ansatz, der
im Vergleich zum hier präsentierten, mit der maximalen Sondenkonzentration und
entsprechend kürzer 24 h Detektionszeit durchgeführt wurde und viel versprechend war,
ist daher nicht präsentierbar. Für den hier gezeigten Ansatz wurden zwei terminale
Knospen sechs Monate alter Keimlinge aus K2 (4-Blatt-Stadium), sowie deren Keim- und
Primärblätter FAA-fixiert. Zusätzlich wurden zwei Proben des terminal zwischen den
Kotyledonen liegenden Abschnittes zehn Wochen (W10) alter Keimlinge aus K4
gesammelt, von denen eine mit FAA und die andere mit PFA fixiert wurde. Alle fixierten
Proben wurden in HISTOWAX, als Paraffin, eingebettet.
3.5.2.1 Expression in vegetativen Knospen
Ein Vergleich der Übersichtsaufnahmen (MIA, Abb. 34) von Knospen und terminalen
Sprossabschnitten von Keimlingen zeigt, dass die unmarkierte Kontrolle 1 nur sehr
schwach violett, die Färbung der markierten Kontrolle 2 und der Antisense-Probe sehr
viel intensiver ist. Die intensivsten Signale liegen in Bereichen mit größerer Zelldichte
bzw. erhöhter Zellteilungsaktivität. Bei der leichten Anfärbung der unmarkierten
Kontrolle 1 handelt es sich um das Hintergrundsignal, dass auf die sehr lange
Detektionszeit zurückgeht und nach zwei Tagen noch nicht sichtbar war. Punktuell sind
ungleichmäßig über die Gewebeschnitte verteilte fleckige, violette Bereiche erkennbar
(Abb. 34 B-D) bei denen es sich um ungelöste Reste des Färbesubstrats handelt. Ein
intensives, jedoch unspezifisches Färberesultat für Primärblätter (vergleiche 3.5.2.2) ist
z. B. in den in den Übersichtsaufnahmen A-C der Abb. 34 von Knospen-Längsschnitten
erkennbar.
An Knospen-Stadien sechs Monate alter Keimlinge im 4-Blatt-Stadium
(vergleiche Abb. 20 A) sind neben den (hier teilweise entfernten) Keim- und
Primärblättern am Vegetationskegel bereits die Primordien der ersten jungen Kladodien
in den Achseln von Knospenschuppen sichtbar (Abb. 34). Bei detaillierter Betrachtung
der hybridisierten Gewebeschnitten junger Kladodienprimordien und ihren
dazugehörigen Knospenschuppen bzw. Tragblättern (Abb. 35 A-C) zeigen die Zellen der
mit unmarkierter Kontrolle behandelten Gewebe abgesehen vom Hintergrundsignal keine
weitere Violettfärbung (Abb. 35 A). Eine zusätzlich zum Hintergrundsignal erkennbare
ERGEBNISSE 86
Anfärbung ist nur für die markierte Kontrolle 2 und die Antisense-Probe erkennbar. In
beiden Fällen erscheinen die Zellkerne der kleinlumigen Zellen der Kladodien (Abb. 35
B-C), im Gegensatz zu blasseren Zellwänden und Cytoplasma und im Vergleich zum
gesamten Gewebe/großlumigeren Zellen der Knospenschuppen (leicht) violett angefärbt.
Das Signal der Antisense-Probe (Abb. 35 C) erscheint im Vergleich zur markierten
Kontrolle 2 (Abb. 35 B) insgesamt etwas intensiver gefärbt. Außerdem ist in den für die
Antisense-Probe gezeigten Details (Abb. 35) in Abb. 35 D eine Violettfärbung im basalen
Abschnitt einer Knospenschuppe dargestellt. In Abb. 35 E-F sind abhängig von der
Schnittebene auch angefärbte Knospenschuppenachseln (Pfeil) sichtbar.
Abb. 34: S. verticillata, in-situ-Hybridisierung an Längsschnitten vegetativer Knospen 6 Monate alter Keimlinge (I). Lichtmikroskopische Übersichts-Aufnahmen (MIA) der mit unterschiedlichen Sonden behandelten Gewebeschnitte. A: Kontrolle 1, unmarkierte Antisense-mRNA-Sonde. B: Kontrolle 2, DIG-markierte Sense-mRNA-Sonde. C-D: Antisense-Probe, DIG-markierte Antisense-mRNA-Sonde. D mit Artefakt (diagonal verlaufender Bereich durch Auffaltung des Gewebeschnittes stärker angefärbt erscheinend). Kotyledonen (Ko); Kladodien(primordium) (Kp); Knospenschuppe (Ks), Primärblatt(primordium) (P); Vegetationskegel (Vk).
ERGEBNISSE 87
Die Farbreaktion im Bereich des Leitgewebes der Sprossachse ist mit der für die
jüngeren Keimlinge identisch und dort in Abb. 37 abgebildet. Auf die zusätzliche
Darstellung der vergleichbaren Aufnahmen (s. o.) der markierten Kontrolle 2 wird hier
verzichtet. Die zusätzlich erkennbare Rot-Braun-Färbung einzelner Strukturen steht in
keinem Zusammenhang mit den Hybridisierungsversuchen, sondern geht auf
eingelagerte Sekundärmetaboliten zurück und ist auch in unbehandelten Schnitten
erkennbar.
Abb. 35: S. verticillata, in-situ-Hybridisierung an Längsschnitten vegetativer Knospen 6 Monate alter Keimlinge (II). Lichtmikroskopische Detail-Aufnahmen der mit unterschiedlichen Sonden behandelten Gewebeschnitte; Bereich des Vegetationskegels (Vk, E-F) mit jungen Kladodien (Kp, A-C) und Knospenschuppen (Ks, D). A: Kontrolle 1, unmarkierte Antisense-mRNA-Sonde. B: Kontrolle 2, DIG-markierte Sense-mRNA-Sonde. C-F: Antisense-Probe, DIG-markierte Antisense-mRNA-Sonde.
ERGEBNISSE 88
Betrachtet man die Längsschnitte durch den terminalen Bereich zehn Wochen alter
Keimlinge im 2-Blatt-Stadium (siehe auch Abb. 18 E-F) sind im Gegensatz zu den älteren
Knospen weder Knospenschuppen noch Primordien von Kladodien erkennbar (Abb. 36).
Zu diesem Zeitpunkt sind ausschließlich die Primordien der beiden Primärblätter am
Vegetationskegel sichtbar (Abb. 36 A-D). Bei den durch eingelagerte Sekundär-
metaboliten braun erscheinenden Strukturen im Bereich des Vegetationskegels
(z. B. Abb. 36 C-D) handelt es sich um mehrzellige Haare (siehe auch Abb. 10). Bei den
Gewebeschnitten aus Abb. 36 A und C verläuft der Längsschnitt im 90 ° Winkel versetzt
zu den Kotyledonen, entsprechend sind beide Primärblätter gleichzeitig getroffen. In den
Schnitten aus Abb. 36 B und D ist der Schnitt parallel zu den Kotyledonen geführt, daher
ist zusätzlich zum Vegetationskegel nur ein Primärblatt-Primordium erkennbar. Vergleicht
man die Zellen der Primärblatt-Primordien mit dem Bereich des Vegetationskegels, so
zeigt letzterer die intensiveren Signale. Im Ursprungsbereich der ersten Knospen-
schuppe erscheint die Anfärbung des Vegetationskegels reduziert (Abb. 36 C). Die sehr
junge Anlage der Knospenschuppe (*) zeigt ein schwaches Farbsignal, vergleichbar mit
dem der Primärblätter. Für die Primärblätter ist nur ein schwaches Farbsignal an der
Basis lokalisierbar (Abb. 36 D). Darüber hinaus zeigt sich eine Anfärbung in den die
Leitelemente des Sprosses flankierenden Zellen (Abb. 36 D, Pfeil). Die Anfärbung des
Blattgewebes der Kotyledonen (Abb. 36 E) ist, sofern vorhanden, nur unspezifisch zu
deuten (siehe auch 3.5.2.2). Auf die zusätzliche Darstellung der vergleichbaren
Aufnahmen (s. o.) der markierten Kontrolle 2 wird hier verzichtet.
3.5.2.2 Expression in Blättern
Zusammen mit den gezeigten Untersuchungen an Knospen wurden gleichzeitig auch
Keim- und Primärblätter in die Untersuchung mit einbezogen, weil für diese im
Unterschied zu undifferenziertem meristematischem Gewebe keine spezifischen Signale
zu erwarten sind. Die vorhandenen Anfärbungen der Keimblatt-Querschnitte (Abb. 37 A-
C) werden daher auch als nicht spezifisch gewertet, da generell in Färbetechniken eine
Affinität der Farbstoffe zu Chloroplasten und Sekundärmetaboliten zu bestehen scheint,
wie ähnliche Farbablagerungen auch mit anderen histologischen Färbetechniken (z. B.
Astrablau-Safranin-Färbung nach Gerlach (siehe Anhang, A 3) belegen. In
Detailaufnahmen (Abb. 37 D-F) ist die Violettfärbung unterschiedlichster Zellstrukturen im
Bereich des Palisaden- und Schwammparenchyms gut erkennbar. Die für die
Keimblätter gezeigten Ergebnisse gelten auch für die untersuchten Primärblättern (siehe
Anhang, A 4).
ERGEBNISSE 89
Abb. 36: S. verticillata, in-situ-Hybridisierung an Längsschnitten des terminalen Spross-abschnittes 10 Wochen alter Keimlinge (III). Lichtmikroskopische Aufnahmen der DIG-markierten Antisense-mRNA-Sonde. A & C: Übersicht (A, MIA) und Detail (B) mit Schnittebene parallel zu Kotyledonen. B & D: Übersicht (C, MIA) und Detail (D) mit Schnittebene senkrecht zu Kotyledonen. E: Detail der Sprossachse mit intensiv gefärbten Leitbündel-Flanken (Pfeil). F: Kotyledonengewebe im Detail. Haare (Ha); Kotyledonen (Ko); Knospenschuppe (Ks), Leitbündel (LB), Primärblatt(primordium) (P); Vegetationskegel (Vk, gestrichelte Linie).
ERGEBNISSE 90
Abb. 37: S. verticillata, in-situ-Hybridisierung an Querschnitten von Keimblättern. Licht-mikroskopische Aufnahmen, von Übersichts- (A-C, MIA) und Detailaufnahmen (E-F) der mit unterschiedlichen Sonden behandelten Gewebeschnitte. A & E: Kontrolle 1, unmarkierte Antisense-mRNA-Sonde. B & D: Kontrolle 2, DIG-markierte Sense-mRNA-Sonde. C & F: Antisense-Probe, DIG-markierte Antisense-mRNA-Sonde. Cuticula (C); Epidermis (E); Harzkanal (Hk); Interzellulare (I); Leitbündel (LB); Leitbündelscheide (LS); Palisadenparenchym (Pp); Stomata (S); Schwammparenchym (Sp).
ERGEBNISSE 91
3.5.3 Heterologe Expression von SvKnox
Um neben der Lokalisierung SvKnox-spezifischer mRNA (im direkten Vergleich durch
doppelte Markierung) auch die Ko-Lokalisation des entsprechenden Proteins zu
ermöglichen wurden erste Schritte für die Herstellung SvKNOX-spezifischer Antikörper
unternommen. Für die heterologe Expression wurde die aus S. verticillata isolierte
Sequenz in einen E. coli Expressionsvektor kloniert. Hierzu wurde das Fragment mittels
PCR mit den Primern SvGST for/rev und Plasmid-DNA von Klon Nr. 7 (aus 3.4.3) als
Template amplifiziert (Abb. 38 A, Spur 1). Das 350 pb große Produkt, sowie der pGEX-
4T1 Zielvektor (GE HEALTHCARE) wurden EcoRI/XhoI geschnitten (Abb. 38 A, Spur 2/3)
und miteinander ligiert (Abb. 38 A, Spur 4). Das erhaltene Plasmidkonstrukt wurde zur
Expression in E. coli Stamm BL21DE3 (Tab. 5) transformiert und unter selektiven
Bedingungen angezogen. Eine Induktion des Fusionsproteins erfolgte während der
exponentiellen Wachstumsphase durch Zugabe von 0,4 M IPTG. Nach 4 h Inkubation bei
30 °C wurden die E. coli-Zellen sedimentiert, in Aufschlusspuffer unter Zugabe von
Protease-Inhibitoren aufgenommen und durch French Press-Behandlung mechanisch
aufgeschlossen. Die nicht aufgeschlossenen Zellen wurden zusammen mit den
Membranen und den unlöslichen Proteinen durch Zentrifugation (30 min./ 16.000 rpm)
sedimentiert. Der lösliche Überstand, der das exprimierte GST-Fusionsprotein enthielt,
wurde über eine Glutathion Sepharose-Matrix gegeben. Zur Reduktion unspezifischer
Bindungen wurde die Säule mit dem 10 fachen Säulenvolumen gewaschen. Die Elution
erfolgte durch wiederholte Zugabe von 10 mM reduziertem Glutathion. Die Analyse des
Reinigungsverlaufs mittels SDS-PAGE und anschließender Coomassie-Färbung (2.3.16)
der Proteine (Abb. 38 B) zeigte eine erfolgreiche Expression und Aufreinigung der
isolierten SvKNOX-Sequenz als GST-Fusion in E. coli. Das mit 38,7 kDa kalkulierte
Fusionsprotein konnte in einer Konzentration von 2,4 mg/ml aufgereinigt werden und
steht nun für eine Immunisierung zur Antikörpergewinnung zur Verfügung.
Abb. 38: Heterologe Expression von SvKnox. A: Klonierung in pGEX-4T1. 1 %iges Agarosegel: aufgetragen 5 µl Marker (GeneRuler), 1= PCR mit SvGST for/rev, 2= EcoRI/XhoI-geschnittenes Fragment, 3= pGEX-4T1, EcoRI/XhoI-geschnitten, 4= positiver Klon, EcoRI/XhoI-geschnitten. B: GST-SvKNOX überexprimiert in E. coli (BL21DE3); 12,5 %igen SDS-Polyacrylamidgel, Protein-Detektion durch Coomassie-Färbung. 1= SDS-Marker (SIGMA-ALDRICH), 2= E. coli vor Induktion mit IPTG, 3= E. coli nach Induktion mit IPTG, Spur 4= Zelllysat der induzierten E. coli-Zellen nach Zellaufschluß, 5= Sediment nach Zentrifugation (16.000 rpm, 30 min), 6= Überstand nach Zentrifugation (16.000 rpm, 30 min), 7= Durchlauf der nicht gebundene Proteine, 8= Waschfraktion, 9= Eluat 1 (10 mMGlutathion), 10= Eluat 2 (10 mM Glutathion).
B A
ERGEBNISSE 92
3.6 Knox-Suche in Phyllocladus trichomanoides
Die erfolgreich auf Funktionalität getestete Kombination der degenerierten Primer
dP-SvKnox for1/rev1 wurde auch für die Suche nach einer KNOX-Sequenz in
Phyllocladus eingesetzt. Ziel ist es, bei etablierter Methodik der in situ-Hybridisierung,
Phyllocladus als Vergleich in einem Ansatz mit vegetativen Knospen heranzuziehen.
Darin sollen die Expressionsmuster im Anlagebereich junger Phyllokladien am
Sprossscheitel mit denen junger Kladodien von Sciadopitys überprüft werden. Ein
späterer Abgleich möglicher übereinstimmender Expressionsmuster beider Flachspross-
Typen wäre dann als zusätzliche Kontrolle bzw. mögliche Bestätigung der Sciadopitys-
Resultate verwendbar.
Die RNA-Isolierung erfolgte unter Verwendung des RLC-Puffers inklusive aller
Optionalschritte (2.3.3). Isoliert wurde aus einem jungen ca. 1 cm großen Phyllokladium
oder drei vegetative Knospen. Der Reverse Ansatz entspricht dem von Sciadopitys bzw.
Picea mit dP-SvKnox (siehe 3.3.3 & 3.4.3). Über ein 1,5 %iges Agarosegel wurden 5 µl
Fragment (versetzt mit DNA-Probenpuffer Orange G von APPLICHEM) zusammen mit 5 µl
GeneRuler (FERMENTAS) aufgetrennt. Das in Anlehnung an HBK1 (Abb. 25) bei 359 bp zu
erwartende Fragment wird durch die im Gel zwischen 300 und 400 bp liegende Bande,
auch hier, bestätigt (Abb. 39 A). Die entsprechende Bande wurde geleluiert und bis
einschließlich der Kontrollrestriktion entsprechend der Anleitung für Picea (siehe 3.3.3)
behandelt. Von den selektierten positiven Klonen (vergleiche 2.3.9) wurden sechs auf
den Einbau des richtigen Inserts hin kontrolliert.
Abb. 39: P. trichomanoides, cDNA-Synthese mit dP-SvKnox & Klonierungskontrolle. A: Reverser Ansatz, dP-SvKnox for1/rev1(vgl. Abb. 25) lieferten ein DNA-Fragment von ca. 300 bis 400 bp Länge; 1 %iges Agarose-Gel mit 5 µl PCR-Produkt + 1,25 µl 5x DNA-Probenpuffer & 5 µl Marker (GeneRuler, FERMENTAS). B: Restriktionskontrolle, Überprüfung von Einbau des Inserts aus A in pCRII-TOPO (4 kb) ligierte, Blau/Weiß-selektierte, positive Klone. Aufgetragen wurden sechs EcoRI/KpnI-geschnittene Ansätze (je ½ Restriktionsansatz der Klone 1-7) auf 1 %iges Agarosegel mit 5 µl Marker und DNA-Probenpuffer; Klone 1-5 mit eingebaute Fragmente von ca. 350-400 bp, Banden sind von unterschiedlicher Intensität.
B A
ERGEBNISSE 93
Das Gel zur Restriktionskontrolle (Abb. 39 B) zeigte für alle sechs Klone, mit Ausnahme
von Klon Nr. 6, Insertfragmente passender Größe. Zur Sequenzierung wurden Aliquots
der isolierten Plasmide von den zwei Klonen Nr. 4 und 5, mit der intensivsten
Bandenausprägung, sequenziert (MWG). Die Sequenzierungsergebnisse deuten darauf
hin, dass es sich bei dem in Klon 5 eingebauten Fragment um eine Teilsequenz eines
Knox Klasse 1-Gens, ähnlich PaHBK1 und SvKNOX (vergleiche Abb. 29), handelt. Die
Phyllocladus-Sequenz (Abb. 40) steht als Template zur Sondenherstellung für eine
spätere in-situ-Hybridisierung zur Verfügung.
Abb. 40: Schema der ermittelten Phyllocladus-Sequenz. Darstellung der ermittelten Basensequenz für PtKnox-Teilsequenz und der daraus abgeleiteten Aminosäurenabfolge für das kodierte Protein-Fragment von PtKNOX; die sequenzierte cDNA wurde mit dP-SvKnox for1/rev1 synthetisiert.
DISKUSSION 94
4 DISKUSSION
4.1 Morphologische Ausgangssituation
Betrachtet man die gesammelten morphologischen Daten für Sciadopitys, bilden deren
durch funktionelle Überlagerung blattähnlich erscheinenden, achselständigen Kurztriebe
den allgemeinen Ausgangspunkt. Zu klären ist, ob die innerhalb der Gymnospermen
vorkommenden einfachen Nadelblätter auf unterschiedlichem Wege entstanden sein
können. In Hinblick auf die Methodenetablierung zum Expressionsnachweis von Knox-
Genen in Sciadopitys, ist ein morphologisches Verständnis nötig, um die Resultate mit
Organidentitäts-Genen in Relation setzen zu können. Eine Kombination aus den anhand
der morphologischen Ausgangsbasis zu erwartenden Hybridisierungsergebnissen mit
den tatsächlichen Signalen erscheint essentiell für eine Beantwortung weiterführender
Fragen zur Makroevolution der Blätter rezenter Gymnospermen, bzw. rezenter Strukturen
im Allgemeinen.
Betrachtet man Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen vegetativer Knospen von
Sciadopitys (Abb. 10) zeigt sich, dass die ersten jungen Kladodien gegen Ende
Juli/Anfang August als Primordien sichtbar werden (Abb. 10 A-D). Die charakteristische
Doppelspitze wird innerhalb der ersten vier Wochen nach Erscheinen der Primordien
deutlich sichtbar (Abb. 10 E). Für jedes Kladodienprimordium ist zu diesem Zeitpunkt
bereits eine eigene Knospenschuppe (als Tragblatt) sichtbar, wodurch die Sprossnatur
schon von Beginn an deutlich ist (z. B. 10 E-F). Bei der Betrachtung von Querschnitten
ausdifferenzierter Kladodien (Abb. 16) zeigen diese einen Aufbau, der mit denen
normaler Nadelblätter, von Koniferen wie z. B. Abies oder Pinus, deutliche
Übereinstimmungen zeigt. In allen drei Fällen sind blatttypische Gewebe wie z. B.
Palisaden- und Schwammparenchym ausgebildet (Abb. 41). Die blattähnlichen
Kladodien sind daher optimal an ihre Photosyntheseaktivität angepasst. Die
abweichende Orientierung der Leitbündel resultiert aus der Sprossnatur der Sciadopitys-
Kladodien und hat keinerlei Einfluss auf die Vergleichbarkeit des Kladodiums mit Nadeln.
DISKUSSION 95
Würden die als Tragblätter der Kladodien fungierenden, schuppenartig ausgebildeten
Langtriebblätter als Bezugssysteme fehlen (z. B. Abb. 4; Abb. 11) wäre die Sprossnatur
schon rein vom äußeren Erscheinungsbild her nicht belegbar und die Sciadopitys-
Kladodien nicht von normalen Nadelblättern zu unterscheiden (Abb. 4 B; Abb. 5).
Bezieht man die lichtmikroskopischen Aufnahmen zum Leitbündelanschluss an den
Zentralzylinder der Langtriebachse (Abb. 13-15) mit ein, so wir deutlich, dass der
Anschluss der Sciadopitys-Kladodien über das Einziehen einer aus Xylem und Phloem
bestehenden keilförmigen Struktur erfolgt (Abb. 13). Diese Art des Anschlusses kommt
dem normaler Blätter, mit Ausbildung einer Blattlücke im Bereich der ringförmig
angeordneten Leitelemente der Hauptachse (Abb. 14), sehr viel näher als dem anderer
Kurztriebe unter Ausbildung einer ringförmigen Struktur (Abb. 15). In Querschnitten
durch den terminalen Bereich der Langtriebachse von Sciadopitys (Abb. 13 B) sind
zusätzlich zu den Kladodienspuren keine weiteren einziehenden Blattspuren erkennbar
die eindeutig den Tragblättern zuzuordnen sind. Die in den Knospenschuppen
erkennbaren Leitbündel bzw. Xylem-Elemente sind rudimentär und zeigen keine
Verbindung zum Zentralzylinder des Langtriebes. Anders als in älterer Literatur
angegeben (z. B. STRASBURGER, 1872) ist das Vorhandensein von Leitelementen nicht
zwangsläufig auch mit deren Anschluss an die Hauptachse korreliert. Die Differenzierung
neuer Leitelemente erfolgt dort wo sie gebraucht werden und ist immer vom Blatt in
Richtung des Zentralzylinders gerichtet und nicht umgekehrt. Leitbündel sind daher als
variable Strukturen zu betrachten, deren Anordnung im großen Maße über
physiologische Gegebenheiten beeinflussbar ist. Der blattähnliche Aufbau der Kladodien
und der entsprechend blattartige Leitbündelanschluss dieser Kurztriebe lassen sich gut
mit einer morphologischen Anpassung an eine funktionelle Überlagerung in Bezug
setzen.
Abb. 41: Sciadopitys-Kladodium und Nadelblätter im schematischen Querschnitt. Vergleichende Darstellung der am Aufbau beteiligten (blattcharakteristischen) Gewebetypen. *Abweichende Orientierung der Kladodien-Leitbündel resultiert aus der Sprossnatur und ist zu vernachlässigen.
DISKUSSION 96
Betrachtet man die Verteilung der Kurztriebe entlang der Langtriebachse (Abb. 4 B) wird
deutlich, dass die Kladodien im Bereich der gestauchten Internodien der Langtriebachse
gefördert sind. In den Schuppenblattachseln der nicht gestauchten Langtriebinternodien
(Abb. 11) ist die Ausbildung der Kladodien dagegen unterdrückt. Hier sind lediglich
Kladodienrudimente erkennbar (Abb. 11 D-E). Die Knospenschuppen bzw.
Langtriebblätter sind zum Zeitpunkt des Austriebes noch grün (Abb. 11 A), verholzen
aber mit der Zeit zunehmend und sind an älteren Trieben braun und verholzt (Abb. B).
Die Kombination einer zunehmenden Verholzung und die nur rudimentäre Ausbildung
der Leitbündel lassen die Vorstellung einer weiteren Reduktion der
Langtriebblätter/Tragblätter bis hin zum Ausbleiben ihrer Anlage durchaus vorstellbar
erscheinen. Die Hinweise auf eine Reduktion der Langtriebblätter, die gleichzeitig die
Bezugssysteme für die Achsennatur sind (Abb. 42), stützen die Vorstellung für eine
Transformationsreihe hin zum sekundär entstandenen Nadelblatt zusätzlich.
Überlegungen zur Entstehungsweise photosynthetisch aktiver Flachsprosse legen die
Vermutung nahe, dass die Ausgangsgruppen der heute nicht laubwerfenden
Gymnospermen laubwerfend gewesen sein müssen. Auszugehen ist dabei von einem
undifferenzierten Triebsystem wie dem bei Abies oder Picea mit spiralig stehenden,
allseitswendigen einfachen Blättern. Eine für viele rezente Gehölze wie z.B. Ginkgo, Larix
oder Taxodium typische Langtrieb-Kurztrieb-Differenzierung (Abb. 42) steht im
Zusammenhang mit Laubabwurf. Derartig umgebaute Systeme stellen Adaptionen an
Klimaveränderungen dar und ziehen eine Verlagerung der Blätter an die Kurztriebe nach
sich. Der Vorteil derartiger Veränderungen im Bauplan liegt in einem vergleichsweise
geringeren energetischen Aufwand. Die Belaubung kann jährlich in ausreichender
Menge neu gebildet werden, ohne dass in nennenswertem Umfang in Gerüstsubstanz
wie Zweige investiert werden muss. In einigen Pinus-Vertretern ist die Ausbildung von
Langtriebnadeln bereits auf die Jugendphase der Entwicklung beschränkt.
Langtriebblätter adulter Formen sind, z.B. bei P. sylvestris, nur als spiralig angeordnete
braune Schuppenblätter ausgebildet, während die photosynthetisch aktiven Nadeln auf
die Kurztriebe beschränkt sind. Die Anzahl der Nadeln pro Kurztrieb variiert. In der
Gattung Pinus können die Kurztriebnadeln arttypisch bis auf eine einzelne reduziert sein
(P. monophylla). Bei Phyllocladus finden sich Kurztriebe, die blattartig ausgebildet sind
und noch zahlreiche randständige Schuppenblätter tragen (vgl. RIEGER, 2002), bei
denen also noch beide Kurztriebkomponenten (Achse und Blätter) erkennbar sind
(Abb. 42). Betrachtet man die Kurztriebe von Sciadopitys als nadellos, so wäre dies das
zweite Extrem nach Pinus mit Kurztrieben bestehend aus reduzierter Kurztriebachse und
deutlich entwickelten Kurztriebnadeln.
DISKUSSION 97
Abb. 42: Schema zur Transformationsreihe & Variabilität triebdifferenzierter Systeme. Triebdifferen-zierung (Ausschnitte) in ausgewählten Gymnospermen-Vertretern mit unterschiedlicher Betonung der beteiligten Sprosskomponenten (oben). „Momentaufnahme“ mit nadelartigem, achselständigem Kladodium von Sciadopitys (links) als Ausgangspunkt für Entstehung der Nadelblätter (vgl. A. homolepis) aus umgewandelten Kurztrieben über Verlust der Kurztrieb-Tragblätter (Kasten); Nicht colorierte Bereiche dienen der Vollständigkeit.
DISKUSSION 98
Machen erneute klimatische bzw. standortbedingte Änderungen eine Rückkehr zur
immergrünen Lebensweise möglich so erscheint es plausibel, dass nach
abgeschlossener Reduktion aller Kurztriebblätter, die Sprossachsen blatthomolog
umgewandelt werden, um die Funktion der fehlenden Blätter zu übernehmen. Einmal
reduzierte Strukturen bzw. Blätter können nach der DOLLO´schen Regel nicht auf
demselben Wege zurück gewonnen werden.
Blattlose Kurztriebe machen funktionelle Anpassungen im Achsengewebe erforderlich,
um die Verluste der photosynthetisch aktiven Blätter zu kompensieren. Palisaden-
parenchym kann je nach Lichtexposition, wie für Thuja gezeigt (Abb. 6), an untypischen
Stellen im Blatt und im Spross lokalisiert sein. Bei Sciadopitys übernehmen Kladodien die
assimilatorischen Aufgaben (von Blättern) und sind funktionell bzw. morphologisch
optimal an diese Aufgabe angepasst (Abb. 16). Abgesehen von der achselständigen
Stellung sind die Sciadopitys-Kladodien daher sehr blattähnlich.
Unter der Voraussetzung, dass die Zuordnung fossiler Sciadopitys-Funde (z. B.
CHRISTOPHEL, 1973) korrekt ist, liegt es nahe aus dem Fund isolierter Kladodien auf einen
ehemals Laub abwerfenden Vorfahren zu schließen. KRAMER (1974) nimmt über
Ausführungen zu „Flüchtlinge vor der heranrückenden Eiszeit“ Bezug auf die
Zusammenhänge der tertiären und rezenten Florenverteilung unter Berücksichtigung der
klimatischen Bedingungen. Schilderungen wie diese lassen die eingangs erwähnte
Transformationsreihe (Abb. 42) hin zum blattartigen Kurztrieb durchaus vorstellbar
erscheinen.
Genetische Untersuchungen geben Einblicke auf einer neuen Ebene. Sie können
zusätzliche Erkenntnisse zu Ereignissen vor Sichtbarwerden von Anlagen liefern.
Aussagen zum Aufbau aus verschiedenen Organen und zu deren Anteil an den rezenten
Kladodien können so überprüft und möglicherweise konkretisiert werden. Aus
genetischer Sicht entspricht der Zustand Blatt bzw. laterales Organ vereinfacht „nur“
einer veränderten Gen-Expression. Das Ein- und Ausschalten bestimmter Gene nimmt
Einfluss auf den morphologischen Bauplan indem z. B. der Befehl für Zelldifferenzierung,
„Blatt-AN bzw. Sprossmeristem-AUS“, gegeben oder unterdrückt wird
(„Sprossmeristem-AN bzw. Blatt-AUS“). Diversität entsteht auf molekularer Ebene durch
Mutationen in regulatorisch wirksamen Sequenzen. Morphologische Veränderungen
können als Folge einer Expressionsänderung entstehen, indem Transkriptionsfaktoren
mit neuen Ziel-Genen interagieren. Darüber hinaus stehen Knox-Gene und von ihnen
kodierte Transkriptionsfaktoren eng mit der Biosynthese von Phytohormonen in
DISKUSSION 99
Verbindung (HAY et al., 2002; HAKE et al., 2004; HAY et al, 2004 & Abb. 43). Knox-Gene
und (veränderte) Umweltfaktoren sind über eine entsprechende Antwort/Anpassung auf
genetischem und morphologischem Niveau (TESTONE, 2008) miteinander korreliert. Der
Promotor von KNAT3, einem Klasse 2 Gen, wird beispielsweise von SERIKAWA et al.
(1997) als lichtinduzierbar beschrieben. Der Expressionslevel eines Gens kann auch
Einfluss auf die morphologische Gestalt haben. Bei Überexpressionsmutanten von kn1
(knotted1) resultiert der Phänotyp aus Sprossmeristemen, die im ausdifferenzierten
Blattgewebe der Blattlamina als knotenförmige Strukturen erscheinen und im Fall von
Zea mays Blattader-assoziiert entstehen (z. B. VOLLBRECHT et al., 1991).
4.2 Keimlingsentwicklung
Bisher fehlten vergleichbare detaillierte Studien zur Keimlingsentwicklung bzw.
Kladodienentwicklung an Keimpflanzen von Sciadopitys. Die hier neu gewonnenen
Erkenntnisse zur Anlage der ersten Kladodien(primordien) an Sciadopitys-Keimlingen
(siehe 3.1.2) erwiesen sich wie erwartet als sehr hilfreich für den Einsatz in
Hybridisierungen. Die ersten Terminalknospen sind zum Zeitpunkt der Anlage von
Primärblättern bis zur Entwicklung der ersten Kladodienanlagen sehr viel übersichtlicher
als vegetative Knospen zweijähriger Triebe. Die Anzucht von Keimlingen, hat,
abgesehen von der zeitlichen Komponente, den Vorteil die optimalen Keimlingsstadien
für die Hybridisierung zu ermitteln. Besonders bedeutsam ist, dass diese Stadien auf
diese Weise auch in möglichst großen Mengen über gezielte Anzucht, „termingerecht“
produzierbar sind. Die richtigen Knospenstadien zu sammeln war nur dann
problematisch, wenn jahreszeitlich untypische, starke Witterungsschwankungen
auftraten und die Entwicklung der Knospen entsprechend stark mitschwankte. Die
Entnahme geeigneter Knospenstadien von Freilandpflanzen war nur in begrenzter
Abb. 43: Schema zu genetischen Interaktionen am Scheitelmeristem (nach Hay et al., 2004, verändert). Knox-Gene (weiß); Hormone (gelb); andere Transkriptionfaktoren (schwarz). STM-Expression im gesamten Meristem, fehlt aber im Bereich einer Blattanlage; STM unterdrückt Gibberillin-Oxidase-Expression (Expression auf Blatt beschränkt). ASYMMETRIC LEAVES 1&2 beschränkt auf Blätter, fehlen im Scheitelmeristem, werden über STM negativ reguliert; AS 1/AS 2-Aktivität, wenn STM herunter-reguliert; AS1-AS2-Heterodimere regulieren Knox-Genexpression im Meristem negativ. Abaxiale im Blatt exprimierte YABBY-Gene unterdrücken BP (und STM). Heterodimer-Bildung aus KNOX und BELL zum Transkriptionskomplex im Scheitelmeristem möglich.
DISKUSSION 100
Anzahl möglich, wenn man deren verfügbare Menge mit der Anzahl der in relativ großer
Stückzahl produzierbaren Keimpflanzen vergleicht. Im Zuge der anfänglichen
Parameteranpassung bei der Hybridisierung waren die im Freiland entnommen Proben
entsprechend schneller aufgebraucht, ohne dass die gewünschten Ergebnisse zu
erzielen waren. Die hier gewählten Bedingungen für die Anzucht der Sciadopitys-Samen
führten verglichen mit anderen Angaben zur Aussaat (z. B. BÄRTELS, 1996 und
http://www.schirmtanne.de/sciadopitys_verticillata.php), zu einem zeitlich deutlich
optimierten Keimungs-Ergebnis. Das beschleunigte Auflaufen der Samen bleibt dennoch
um ein Vielfaches langsamer als jenes von Angiospermen wie z. B. Arabidopsis. Eine
nähere Betrachtung der gesammelten Stadien zeigte, dass die ersten beiden Kladodien
an ca. sechs Monate alten Keimlingen erkennbar werden, wenn Kotyledonen und
Primärblätter bereits ausgebildet sind (Abb. 20; Abb. 21). Vergleicht man die Abfolge der
Kotyledonen, Primärblätter und Kladodien der hier gesammelten Keimlings-Proben mit
den bei STRASBURGER (1872) beschriebenen Beobachtungen, so sind beide
Beobachtungen abgesehen von der Deutung, rein morphologisch gut vereinbar.
4.3 Methodenetablierung
Über erste Vorversuche an bekannten Gensequenzen von Arabidopsis (siehe 3.3.2:
KNAT1) konnte der Umgang mit den neuen molekulargenetischen Techniken erfolgreich
getestet werden. Auch der Test der für die Suche nach Knox in Sciadopitys konstruierten
degenerierten Primer dP-SvKnox for1/rev1 in Kombination mit einer bekannten Picea-
Sequenz (siehe 3.3.3: HBK1) war erfolgreich. Mit den getesteten degenerierten Primern
dP-SvKnox for1/rev1 war es möglich aus der noch unbekannten Sciadopitys-
Gensequenz ein 350 bp langes DNA-Fragment (Abb. 28 A) zu isolieren (siehe 3.4.3:
SvKnox). Nach erfolgreicher Sequenzierung (Abb. 29, Sequenzierung1: PEL bis
KKKKKGKL) dienten die für EDC bis GKL (Abb. 29) kodierenden Bereiche der
Basensequenz als Template für die Sondenherstellung und die Expressionsstudien
(vergleiche 3.4.4 & 3.5). Die Sciadopitys-Sequenz konnte zum 3’-Ende hin über eine
Sequenzerweiterung (siehe 3.4.3) um weitere 108 bp verlängert werden (Abb. 29,
Sequenzierung 2: EDC bis QINNW). Die Komplettierung der bisher identifizierten
Teilsequenz von SvKnox ist Voraussetzung für eine funktionelle Charakterisierung. Zur
Vervollständigung der Basensequenz wurden daher unterschiedliche Ansätze wie z. B.
3’- bzw. 5’-RACE verfolgt. Die Komplettierungsansätze blieben allerdings, abgesehen
von der 108 bp-Erweiterung, bisher ohne Erfolg. Gründe sind vermutlich im allgemein
schwachen Konservierungsgrad der Primärsequenz(en) zu suchen (vergleiche
Alignment/Abb. 22), durch die die Konstruktion geeigneter Primer für die noch
unbekannten terminalen Sequenzabschnitte entsprechend komplizierter ist. Für
DISKUSSION 101
Sciadopitys kommt erschwerend hinzu, dass man aufgrund ihrer basalen Stellung im
Stammbaum, davon ausgehen muss, dass ihre Sequenz sehr ursprünglich ist und man
im Vergleich zu den bekannten, insgesamt recht variablen terminalen Sequenzen mit
einem zusätzlich gesteigerten Degenerationsgrad zu rechnen hat. Zusätzlich zur in
Teilen erfolgreichen Sequenzermittlung konnte für Sciadopitys auch die in-situ-
Hybridisierung inklusive der Fixierung etc. unter rein methodischen Gesichtpunkten
(siehe 3.5.1 & 3.5.2/Signal) erfolgreich angepasst werden.
Erste Vorarbeiten für einen Expressionsnachweis von Knox in P. trichomanoides
(dP-SvKnox for1/rev1, Vgl. 3.6) lieferten auch für Phyllocladus eine ca. 360 bp große
Teilsequenz (Abb. 39 A), die entsprechend der abgeleiteten Proteinsequenz (Abb. 40),
Knox-Charakter hat. Entsprechende Arbeiten für A. homolepis lieferten trotz Einsatz der
für Sciadopitys und Phyllocladus erfolgreichen Primerpaarung bisher keine Erfolge. Für
Abies war bereits der Gewebeaufschluss bzw. die Isolierung der Gesamt-RNA und DNA
(vergleiche 2.3.3) aus verschiedensten Geweben, möglicherweise aufgrund des hohen
Harzgehaltes, bislang nicht erfolgreich.
4.4 Knox & Sciadopitys
In neueren Arbeiten zum Thema Knox wird die Suche nach Knox-homologen Genen oder
von ihnen kodierten Proteinen auch in Nicht-Blütenpflanzen immer mehr thematisiert (vgl.
SINGER & ASHTON, 2007). Für Gymnospermen, genauer gesagt für Koniferen, sind hier im
Speziellen die Arbeiten von SUNDÅS-LARSSON et al. (1998), HJORTSWANG et al. (2002) und
GUILLET-CLAUDE et al. (2004) zu nennen, die sich speziell mit Picea befassen. Eine sehr
detaillierte Ausführung zu den Ursprüngen von Knox findet sich bei SINGER & ASHTON
(2007). Hier werden Arbeiten von Gymnospermen und Farnen, als Nicht-Blütenpflanzen,
mit Arbeiten zu Arabidopsis, als klassischer Angiosperme (Blütenpflanze), vergleichend
betrachtet. Über die allgemeinen Expressionsmuster und Phänotypen heterolog in
Arabidopsis eprimierter Knox-Gene aus Gynospermen oder Farnen wird aufgezeigt,
dass Klasse 1 Gene von Arabidopsis, Ceratopteris, und Picea als homolog zu betrachten
sind auch wenn der Verwandtschaftsgrad der drei Taxa vergleichsweise niedrig ist
(SINGER & ASHTON, 2007). Die Autoren leiten aus den bis dato existierenden Arbeiten zu
Knox-Genen in Algen (Chlamydomonas und Acetabularia) ab, dass in Algen Merkmale
für Klasse 1 und Klasse 2 Knox-Gene nebeneinander vorkommen. Aus Studien zur
Evolution der KNOX-Homöodomänenproteine ziehen BARATHAN et al (1999) den Schluss,
dass der Vorfahr der Knox-Gene in allen Teilen der Pflanze exprimiert war und erst
später, mit Klasse 1, der Schritt zum Herunterregulieren in Wurzel und Blatt auftrat.
Außerdem besitzt der Vorfahr aller Angiospermen bereits beide Klassen von Knox-
DISKUSSION 102
Genen. SUNDÅS-LARSSON et al. (1998) datieren das gemeinsame Vorkommen beider Gen
Klassen sogar noch weiter zurück. Über Studien zu HBK1 zeigte sich, dass sowohl die
Knox-Gene allgemein und beide Klassen im Speziellen schon älter als 300 Millionen
Jahre sein müssen und schon der letzte gemeinsame Vorfahre der Gymno- und
Angiospermen Knox-Gene besessen haben muss. Bei SINGER & ASHTON (2007) werden
Genduplikationsereignisse (bzw. Anpassungen) hin zu den zwei Klassen auf einen
Zeitpunkt vor Abspaltung der Moose von der Linie zu den Gefäßpflanzen datiert.
Gleichzeitig werden die ursprünglichen Knox-Funktionen als notwendige Adaption in
Verbindung mit dem Schritt an Land gedeutet.
Leitet man aus der 458 bp langen Sciadopitys-Teilsequenz die entsprechend kodierte
Aminosäurensequenz, SvKNOX, ab und vergleicht man diese mit HBK1 aus P. abies,
wird deutlich, dass die ermittelte Gensequenz Teil eines Knox Klasse 1-Gens ist
(Abb. 29). Zwei für Klasse 2 typische Aminosäuren im Bereich der ELK-Domäne
(SUNDÅS-LARSSON et al. 1998) fehlen beispielsweise. Besonders die Übereinstimmungen
beider Sequenzen im Bereich ihrer ELK-Domäne und TALE-Homöodomäne legen die
Eigenschaft als Transkriptionsfaktor für SvKNOX nahe. Das auch in SvKNOX gut
konservierte, ca. 60 Aminosäuren lange Motiv der Homöodomäne, gilt allgemein als
DNA-Bindemotiv für die sequenzspezifische Erkennung anderer Gene (z. B. CHAN et al,
1998). Die Bindedomäne besteht aus den drei α-Helices, von denen besonders Helix III
der Sequenzerkennung dient. Über die Bindung der Zielgene kann so Einfluss auf deren
Expression genommen werden. Knox-Gene interagieren beispielsweise mit Genen der
Gibberillin-Biosynthese (GA-Oxidase, z. B. SAKAMOTO et al., 2001; HAY et al., 2002).
Darüber hinaus verfügt die gefundene Sciadopitys-Sequenz mit den Domänen ELK und
KNOX über Bereiche durch die die Interaktion mit anderen Proteinen möglich wird.
KNOX-Proteine bilden beispielsweise Transkriptionskomplexe mit BELL-Proteinen
(BELLAOUI et al., 2001; Abb. 43). Sowohl Helix III als auch die KNOX-Domäne konnten
bisher nur ansequenziert werden.
Mit den aus der in situ-Hybridisierung gewonnen Expressionsmustern (siehe 3.5.2) ist
keine zusätzliche Bestätigung der Zugehörigkeit von SvKnox zur Knox-Klasse 1 zu
erhalten. Konkrete Aussagen zum Organcharakter, wie man sie aus Studien an z. B.
KNAT1 (LINCOLN et al., 1994) oder HBK1 (SUNDÅS-LARSSON et al., 1998) gewohnt ist, sind
hier aus mehreren Gründen nicht sicher möglich: Durch die Kombination einer langen
Detektionszeit mit einer relativ niedrigen Sondenkonzentration ist ein im Vergleich zu
Ergebnissen anderer Arbeiten (s.o) nur schwaches Signal vor intensivem Hintergrund
erkennbar. Aus diesem Grund sind erwartete Signale, sofern sichtbar (Abb. 34 bis 36),
DISKUSSION 103
nur schwer zu eruieren. Sense- und Antisense-Ansatz zeigen vergleichbare Signale.
Diese Signale liegen in beiden Fällen in Bereichen erhöhter meristematischer Aktivität.
Die Lokalisierung der Signalhäufung erinnert an die für KNAT1 beschriebenen
Expressionsmuster (vergleiche. LINCOLN et al., 1994). Die Sense-Kontrolle sollte im
Normalfall kein Signal liefern. Es lässt sich nur vermuten, dass die hier dennoch
sichtbaren Signale über unspezifische Bindungen der Sense-Sonde entstanden sind.
Unspezifische Bindungen sind bei näherer Betrachtung der zur Sondenherstellung
gewählten Template-Sequenz (s.o.) auf das 3’-Ende mit hohem A/T-Anteil (vergleiche
Abb. 29: KKKKK) zurückzuführen und sind daher auch für die Antisense-Sonde nicht
auszuschließen. Ein hoher A/T-Anteil kann zu erhöhter Fehlpaarung bzw. unspezifischen
Bindungen führen. Fehlerhafte Signale durch cDNA-Reste aus der Sondenherstellung
können ausgeschlossen werden, weil am Ende der Reaktion ein DNA-Verdau
durchgeführt wurde. Die Signalentwicklung für Sense-Kontrollen mit Ähnlichkeit zum
eigentlichen Signal ist leider keine Seltenheit und wird auch bei ZACHGO (2002)
entsprechend diskutiert. Die Tatsache, dass die Färbung der Antisense-Proben
intensiver ist als die der Kontrollen lässt einen erhöhten Anteil spezifischer Bindung bzw.
„richtiger Signale“ zwar vermuten, bleibt aber spekulativ. Zur Sondenherstellung bietet
sich als Template der aus einer nachträglichen Sequenzerweiterung stammende,
erweiterte 5’-Bereich bzw. das INNW-Proteinmotiv sehr viel mehr an (Abb. 29). Hier ist
die Wahrscheinlichkeit von unspezifischen Bindungen durch den höheren GC-Anteil
deutlich herabgesetzt. Dieser Ansatz mit spezifischerer Sonde kann allerdings erst
verfolgt werden, wenn die bis dato noch fehlenden sechs Aminosäuren (Abb. 29) auch
identifiziert sind. Verlässliche Aussagen zu Expressionsmustern sind daher erst möglich,
wenn unspezifische Bindungen der Sense-Sonde so gut wie möglich auszuschließen
sind. Für zukünftige Hybridisierungen erscheint der Ansatz mit der spezifischeren Sonde
sehr Erfolg versprechend. Außerdem erscheint der Einsatz einer höheren
Sondenkonzentration kombiniert mit einer kürzeren Detektionszeit (und ohne Deckgläser)
lohnenswert, weil so zu intensive Hintergrundsignale zu vermindern sind. Natürlich ist es
dann auch möglich, dass sich die in 3.5.3 sichtbare Signalverteilung (KNAT1-ähnliches
Expressionsmuster, vergleiche Abb. 44) bestätigen lässt.
Man muss allerdings auch damit rechnen, dass die funktionelle Überlagerung der
Kladodien auf morphologischer Ebene auch Einfluss auf die genetische Expression
haben kann. Die mögliche Folge wäre ein sehr spezifisches und neues
Expressionsmuster wie es beispielsweise auch schon für Knox Klasse 1-Gene in der
Blattentstehung von Lycopersicon esculentum (Tomate), mit Signalen in Meristem und
Blattprimordien, gezeigt wurde (CHEN et al., 1997). Für die Kladodien von Sciadopitys ist
DISKUSSION 104
auch nicht abwegig, dass die Klasse 1 ähnliche Sequenz dennoch ein unspezifisches,
Klasse 2-ähnliches Muster mit Expression in allen Organen hervorbringt.
Die klassische Trennung beider Knox-Klassen könnte aus zwei Gründen fehlen. Erstens
kann Sciadopitys so ursprünglich sein, dass das Duplikationsereignis, das zu Trennung
der beiden Klassen führte hier nicht oder nur unvollständig stattgefunden hat. Eine
zweite Ursache könnte auch in der funktionellen Überformung bzw. der Anpassung auch
auf genetischer Ebene, durch Sciadopitys-spezifische Duplikationsereignisse, zu suchen
sein. Zeigen sich Unterschiede auf genetischer Ebene ist fraglich, wie groß das
Zeitfenster ist in dem dies noch erkennbar ist/bleibt (vergleiche BARATHAN et al., 2002).
Ein Nachweis ist dann entsprechend schwieriger.
Interessant und hilfreich erscheinen in diesem Zusammenhang auch Knox-
Expressionsmuster von den bei HIRAYAMA et al. (2007) als intermediäre Organe
(„doppelte Organidentität“) beschriebenen Ruscus-Phyllokladien, die im genannten
Artikel bereits angekündigt werden, bis dato aber noch nicht publiziert sind. Die anhand
von Expressionsstudien zu Knox- und Yabby-Genen beschriebene „Doppelte Identität“
der Phyllokladien (HIRAYAMA et al., 2007) hilft wenig, wenn wie bei Ruscus die Ableitung
von Vorläufern mit eindeutigen Identitäten sicher ist. Über Ruscus wird eher deutlich,
dass die „doppelte Identität“ sich mehr als Hinweis dafür eignet, dass genetische
Identität noch schneller verloren geht oder verwischt wird als morphologische Identität.
Abb. 44: Schematische Darstellung ausgewählter Typen von Expressionsmustern im Scheitelmeristem (nach HAKE & ORI, 2002 & REISER et al., 2000, jeweils verändert). Zwei Grundmuster der Expression (violett) von STM & KNAT/BP in Zea (Mais), Oryza (Reis), Nicotiana (Tabak) und A. thaliana (HAKE & ORI, 2002). STM-Expression im gesamten Scheitelmeristem, Ausnahme sind Ausgangszellen für neue Blattanlage (P0). Expression von KNAT/BP (ähnlich STM) in bestimmten Meristemregionen (z.B. Internodien-bereichen/Blattbasen, Leitbündelflanken/sehr junge Achse). LeT6-Expression (REISER et al., 2000) in gesamtem Meristem inklusive P0, in jungen Blattprimordien (P) und adaxialen Regionen älterer Primordien exprimiert (vgl. CHEN et al., 1997). Hypothetische Zuordnung (?) von Sciadopitys zu gezeigten Grundmustern wurde ergänzt.
Arabidopsis Lycopersicon
STM KNAT/BP LeT6
? Sciadopitys ? ? Sciadopitys ?
DISKUSSION 105
4.5 Ursprung des Gymnospermenblattes
Die Übertragungen der aus Sciadopitys gewonnen Ergebnisse auf die Nadelblätter
anderer Gymnospermen bzw. deren mögliche polyphyletische Entstehungsweise stehen
weiterhin aus. Um die eingangs erwähnten, möglichen Zusammenhänge zwischen Abies
und Sciadopitys aufzudecken, könnten die Knox-Expressionsmuster bei der
Nadelentstehung von Abies möglicherweise schon aussagekräftig genug sein. Die
Phyllokladienentstehung bei Phyllocladus könnte zusätzliche Hilfestellung bei der
Auswertung der Expressionsmuster von Sciadopitys geben. Geht man von der allgemein
gültigen morphologischen Sprossnatur für die Phyllokladien von Phyllocladus und der
normalen Blattnatur von Abies-Nadeln aus, müssten sich die zu erwartenden
Expressionsmuster eigentlich von selbst ergeben (Abb. 45).
An dieser Stelle kann die Lokalisierung der zu erwartenden Expressionsmuster nur rein
hypothetisch behandelt werden, weil diesbezügliche Ergebnisse nicht existieren
(Veröffentlichungen fehlen). Müssten Vermutungen angestellt werden, dann sollten
Expressionsmuster bei der Nadelentstehung (als normale Blätter) bei Abies mit denen
bei Picea (HBK1) übereinstimmen. Die Expression für Knox-Gene (Klasse 1) sollte auf
das Meristem beschränkt und vom (Anlage-) Bereich der Nadelprimordien
ausgeschlossen sein (Abb. 45 B). Auch Phyllocladus sollte die spezifischen
Expressionsunterschiede der Klasse 1-Gene in Meristem und Blatt (Vgl. z.B. KNAT1 oder
STM) wiedergeben. Eine Expression wäre hier nur für die Meristeme bzw. jungen
Abb. 45: Demonstration hypothetischer Expressionsmuster an REM-Aufnahmen von A. homolepis &P. trichomanoides. A: junges Phyllokladium von P. trichomanoides zu Beginn der Differenzierung der Teilabschnitte des Phyllokladiums (Schuppenblätter der linken Seite entfernt), nach RIEGER, 2002: mit Schuppenblatt (Sb) und Phyllokladien-Teilabschnitt (T); entsprechende Schemazeichnung des REM-Objektes nach Austrieb & Expressionsmuster (lila) wurden ergänzt. B: junge, vegetative Knospe von A. homolepis (vgl. Abb. 12). mit jungen Nadel(blatt)primordien (Nb) am Vegetationskegel (Vk), hypothetisches Expressionsmuster wurde ergänzt.
A B
DISKUSSION 106
Bereiche der Phyllokladien, nicht für (Schuppen-)Blätter zu erwarten (Abb. 45 A). Es
besteht natürlich auch die Möglichkeit, dass Expressionsmuster zusammengesetzter
Phyllokladien denen von zusammengesetzten Blättern der Tomate (s. o.) nahe kommen.
Die Schuppenblätter bzw. Tragblätter der Seitenverzweigungen müssten dann
entsprechend innerhalb des gesamten Phyllokladiums Signale zeigen. Allerdings kann
erst in Kombination mit Sciadopitys abgewogen werden, ob die oben hypothetisch
beschriebenen Abies-Resultate auf eine normale Blattnatur zurück zu führen wären oder
dies aus einer auf genetischem Level wirksamen gewordenen funktionellen
Überlagerung von umgewandelten Sprossen resultiert.
4.6 Ausblick
Die Homologie bzw. Orthologie von Genen verschiedener Organismen gemeinsamen
Ursprungs, ist teilweise kompliziert festzustellen. Die unabhängige Entstehung von
paralogen Genen innerhalb eines Organismus, durch Genduplikation, kann den
homologen Ursprung zu Genen anderer Organismen sehr verwischen. Die in Sciadopitys
gefundene Sequenz spricht dafür, dass es sich bei SvKnox um ein PaHBK-orthologes
Klasse1 Knox-Gen handelt. Um definitive Aussagen treffen zu können sind, zusätzlich
zur Komplettierung der Sequenz, mindestens noch die entsprechenden Ergebnisse der
Expressionsstudien (mit optimierter Sonde) abzuwarten. Zukünftige Versuche beinhalten
daher zu allererst die Herstellung einer spezifischeren Sonde über die Verwendung der
erweiterten Sequenz als Template. Außerdem erscheint der Einsatz höherer
Sondenkonzentrationen kombiniert mit einer kürzeren Detektionszeit (und ohne
Deckgläser) lohnenswert, weil so zu intensive Hintergrundsignale zu verhindern sind. Bei
intermediär erscheinenden Organen, wie z. B. Sciadopitys-Kladodien, empfiehlt es sich,
wie bereits bei HIRAYAMA et al. (2007) gezeigt, zusätzlich zu Knox-Genen auch
Hybridisierungen mit Blatt-typischen Genen, z. B. Yabby, durchzuführen und beide
Ergebnisse miteinander zu vergleichen. Außerdem sollte zusätzlich zum reinen Nachweis
der mRNA auch der Verbleib des kodierten Transkriptionsfaktors erfolgen. Eine ähnliche
Expression von Genen deutet nicht zwangsläufig auf eine gleiche Funktion hin. Zuerst
muss geklärt werden, wo das dazugehörige Protein, als eigentlich wirksame
Komponente, vorkommt. Geplant ist eine Hybridisierung durchzuführen, in der über
doppelte Markierung (JACKSON, 2002) gleichzeitig die mRNA und das dazugehörige
Protein parallel im Gewebe nachgewiesen werden können. Erste Vorbereitungen für die
Proteinmarkierung sind über die heterologe Expression des SvKNOX-Proteins in E.coli
bereits getroffen (siehe 3.5.3) und stehen für eine erforderliche Antikörperherstellung
bereit. Zu den weiteren Arbeiten zählt außerdem der Expressionsnachweis von Knox in
Phyllocladus. Die ermittelte Sequenz zur Herstellung einer Antisense-mRNA-Sonde für
DISKUSSION 107
die Hybridisierungsreaktion konnte bereits ermittelt werden (vergleiche 3.6). Ein
entsprechender Ansatz ist darüber hinaus auch für A. homolepis geplant. Die
Vorarbeiten zur Sequenzsuche müssen allerdings im Vorfeld weiter optimiert werden.
Außerdem sollten Interaktionsstudien mit bekannten Knox-Bindepartnern folgen. Ein
Two Hybrid-Ansatz mit KNOX- und BELL-Proteinen als Interaktionspartner kann weitere
Klarheit bringen, ob die nahe liegende Orthologie von SvKNOX zu HBK1 bzw. zu Knox
im Allgemeinen zu stützen ist. Besonders interessant für die Orthologie-Frage ist welche
phänotypischen Ausprägungen aus einer SvKnox-Expression in Arabidopsis resultieren
würden und welche neuen Erkenntnisse aus einem anschließenden Vergleich mit bereits
bestehenden HBK1-Phänotypen gezogen werden können.
ZUSAMMENFASSUNG
108
5 ZUSAMMENFASSUNG Anhand der durchgeführten morphologischen Studien kann eine hypothetische
Transformationsreihe zur Umwandlung von Kurztrieben in normale Blätter formuliert
werden. Der Schritt der vollständigen Tragblatt-Reduktion innerhalb der Reihe erscheint
durch die reduzierte Gestalt der Tragblätter von Sciadopitys-Kladodien sehr nahe
liegend. Die morphologische Ähnlichkeit der Kladodien mit normalen Nadeln kann als
Folge der funktionellen Überlagerung gesehen werden. Die Anpassungen der Kladodien
an ihre photosynthetische Aktivität (Funktion als Blattersatz) bestätigen, dass sie bei
Wegfall ihres Tragblattes als Bezugssystem nicht mehr von normalen Blättern, wie z. B.
den Nadeln von A. homolepis, zu unterscheiden sind.
Die Etablierung der Methoden, um diese Transformation auch entwicklungsgenetisch zu
erfassen, war in vielerlei Hinsicht erfolgreich: Im Zuge der entwicklungsgenetischen
Etablierungsversuche konnten für S. verticillata degenerierte Primer konstruiert werden
mit denen aus einer bis dato unbekannten Sequenz erstmalig ein Sciadopitys-
spezifisches Knox-Gen amplifiziert werden konnte. Die neu ermittelte Teilsequenz diente
nicht nur als Template für die Herstellung DIG-markieter mRNA-Sonden für den
Expressionsnachweis, sondern diente auch über heterologe Expression in E.coli der
erfolgreichen Gewinnung eines dazugehörigen KNOX-Proteinfragments, des kodierten
Transkriptionsfaktors. Die Methodik der in-situ-Hybridisierung konnte über Abwandlung
eines für Angiospermen etablierten Protokolls erfolgreich an Sciadopitys angepasst
werden.
Die Sciadopitys-Keimlinge aus eigener Anzucht erwiesen sich als eine sehr gut Quelle
zur gezielten Gewinnung gewünschter Entwicklungsstadien für die in-situ-
Hybridisierungen. Die terminalen Knospen der Keimlinge stellen sehr viel
übersichtlichere Objekte dar als die im Freiland gesammelten Knospen. Ein weiterer
Vorteil liegt in der durch konstante Warmhausbedingungen berechenbareren
Entwicklung im Vergleich zu den z. T. starken Witterungsschwankungen unterworfenen
Freilandproben. Gleichzeitig konnte anhand der durchgeführten verschiedenen Ansätze
zu Untersuchungen an Sciadopitys-Keimlingen über optimierte Anzuchtbedingungen
ZUSAMMENFASSUNG
109
außerdem die herkömmliche Dauer bis zum Auflaufen der Samen und der Entwicklung
erster Kladodien verkürzt werden.
Mit den erfolgreich zur Knox-Suche in Sciadopitys eingesetzten Primern war auch aus
der unbekannten Sequenz von P. trichomanoides die erfolgreiche Ermittlung einer ersten
Teilsequenz mit Knox-Charakter möglich. Die hier konstruierten Primer erscheinen daher
auch für die Suche nach Knox in Abies geeignet.
Zusammenfassend ist zu sagen, dass die erste Isolierung eines Knox-Gens aus der noch
unbekannten Sciadopitys-Sequenz gelungen ist und die Anpassung des verwendeten
in-situ-Hybridisierungs-Protokolls (für Angiospermen) an Gymnospermen-Verhältnisse
erfolgreich war. Für eine komplette Charakterisierung des gefundenen Knox-Gens sind
mit einer Sequenzerweiterung zur Komplettierung des neuen Knox-Gens bereits erste
Teilerfolge erzielt. Mit der ersten Sequenzverlängerung und erfolgreichen
Proteinisolierung sind bereits die Vorbereitungen für eine zukünftige in-situ-
Hybridisierung mit optimierter Sonde inklusive eines doppelten Nachweises von mRNA
und ihrem entsprechenden Proteins (kodierten Transkriptionsfaktors) im Gewebe
getroffen. Außerdem können zukünftige Expressionsnachweise der gefundenen
Phyllocladus-Sequenz für ein Knox-Gen als Referenz für Ergebnisse in Sciadopitys
genutzt werden.
Inwiefern die Ergebnisse der noch anstehenden Versuche helfen die Frage nach der
Entstehung von Nadelblättern aus umgewandelten Kurztrieben zu beantworten bleibt
abzuwarten. Mit der Kombination aus Morphologie und Molekulargenetik im Rahmen der
Methodenetablierung neu gewonnenen Erkenntnisse wurden in dieser Arbeit bereits
erste grundlegende Schritte unternommen die Annahme der polyphyletischen
Entstehung des Gymnospermenblattes zu überprüfen. Die Qualität der erzielten in-situ-
Hybridisierungen muss und kann zweifellos weiter verbessert werden. Dies beinhaltet
allerdings nicht zwingend, dass die Auflösung im Hinblick auf die untersuchte
Fragestellung besser wird und zu einem eindeutigen Ergebnis führt.
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CARSTENS BAUMSCHULEN: http://www.schirmtanne.de/sciadopitys_verticillata.php
MWG BIOTECH: http://www.mwg-biotech.com
NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
NCBI-BLAST Search: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast
ANHANG 116
7 ANHANG
Aminosäuren/Code: Aminosäure Abkürzung Ein-Buchstaben-Code Alanin Ala A Arginin Arg R Asparagin Asn N Aspartat Asp D Cystein Cys C Glutamin Gln Q Glutamat Glu E Glycin Gly G Histidin His H Isoleucin Ile I Leucin Leu L Lysin Lys K Methionin Met M Phenylalanin Phe F Prolin Pro P Serin Ser S Threonin Thr T Tryptophan Trp W Tyrosin Tyr Y Valin Val V
Basen/degenerierter Code:
degenerierte Basen
Basen
A T G C M + + R + + K + + S + + Y + + W + + D + + + H + + + V + + + B + + + N + + + +
ANHANG 117
ANHANG 118
A2: Verifizierung der aus SvKnox abgeleiteten Aminosäurensequenz eines Homöodomänen-Proteins der KNOX-Familie & der dazugehörigen Nukleotidsequenz. A: Ausschnitt eines erfolgreichen Sequenz-vergleichs auf Aminosäurenebene in der NCBI-Datenbank („BLAST“-Suche) mit insgesamt 100 Suchergebnissen. Die höchste erzielte Übereinstimmung der eingesetzten Teilsequenz (PELDQFM bis QINNW, vergleiche Abb. 29) zeigte sich für KNOX-Proteinen anderer Gymnospermen (grüner Rahmen) mit max. 70 %. Übereinstimmung mit KNAT1 aus A. thaliana lag bei 61 %. B: Ausschnitt eines erfolgreichen Sequenzvergleichs auf Nukleotidebene. Gezeigt sind die ersten vier von insgesamt 100 Treffern, die Übereinstimmung mit den gezeigten Gymnospermen-Sequenzen liegt bei 76 %.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast
……
……
A
B
ANHANG 119
A3: S. verticillata, Astrablau-Safranin gefärbte Blattquerschnitte. Lichtmikroskopische Übersichtsaufnahmen (MIA). A: Keimblatt. B: Primärblatt. Cuticula (C); Epidermis (E); Hypodermis (H); Harzkanal (HK); Interzellulare (I); Leitbündel (LB); Leitbündelscheide (LS); Palisardenparenchym; Schwammparenchym (Sp).
ANHANG 120
A4: S. verticillata, in-situ-Hybridisierung an Querschnitten von Primärblättern. Lichtmikroskopische Aufnahmen von Übersichts- (A-C, MIA) und Detailufnahmen (E-F) der mit unterschiedlichen Sonden behandelten Gewebeschnitte. A & B: Kontrolle 1, unmarkierte Antisense-mRNA-Sonde. C & D: Kontrolle 2, DIG-markierte Sense-mRNA-Sonde. E-F: Antisense-Probe, DIG-markierte Antisense-mRNA-Sonde. Cuticula (C); Epidermis (E); Harzkanal (Hk); Interzellulare (I); Leitbündel (LB); Leitbündelscheide (LS); Palisadenparenchym (Pp); Schwammparenchym (Sp).
DANKSAGUNG
Ich danke Herrn Prof. Stützel für seine hilfreichen Anregungen und das in mich gesetzte Vertrauen
bei der Überlassung dieses Themas.
Herrn Prof. Tollrian danke ich für die freundliche Übernahme des Korreferates.
Vielen Dank an Herrn Dr. Stefan Gleissberg und seine Arbeitsgruppe am Institut für Spezielle
Botanik der Universität Mainz, für die Überlassung des laboreigenen Versuchsprotokolls zur in-situ-Hybridisierung sowie für die freundliche Einladung nach Mainz und die damit verbundene
Demonstration eines kompletten Hybridisierungsablaufes vor Ort.
Im Zuge der Methodenetablierung danke ich …
… der Abteilung Systembiochemie (Prof. Erdmann) am Institut für Physiologische Chemie, der
Fakultät für Medizin an der Ruhr-Universität Bochum, für die Mitbenutzung ihrer Labore und
Geräte sowie den Genuss eines etablierten Labors und die damit verbundene Möglichkeit zur
Realisierung meiner genetischen Versuche. Ein besonderer Dank geht an Dr. Markus Deckers für
ein Stück seiner Laborbank, seine fachliche Unterstützung und Beratung sowie seine ständige
Diskussionsbereitschaft, die mir eine große Hilfe waren und im großen Maße zum Gelingen dieser
Arbeit beigetragen haben.
…dem Lehrstuhl Biologie der Mikroorganismen (Prof. Naberhaus) für das Autoklavieren der
Lösungen und die freundliche Leihgabe einzelner Geräte sowie der AG Parasitologie (Prof.
Schaub) für einen zusätzlichen, kühlen „Sonden-Stellplatz“.
Für das Pflanzenmaterial danke ich den Botanischen Gärten Bochum und Marburg. Herrn M.
Goerigk danke ich für die gastfreundliche Aufnahme meiner Sicadopitys-Anzuchten, die tägliche
Wässerung und eine sehr freundliche „Aufzucht-Atmosphäre“. Gärtnermeister U. Katz danke ich
für den Tipp und die schnelle Hilfe mit Confidor im Kampf gegen den Nematodenbefall.
Ich bedanke mich bei allen „SpezBots“ - den Mitgliedern des Lehrstuhls für Evolution und
Biodiversität der Pflanzen und meinen Mitstreitern.
Ein Dankeschön an Petra Lerch für die unübertroffene Voraussicht in allen organisatorischen
Belangen.
Ein Dankeschön an Ilse Wessel für ihre stetige Hilfsbereitschaft, die nur durch ihre
unvergleichliche Freundlichkeit übertroffen wurde.
Ein Dankeschön an Sabine Adler, die Hüterin der Material-Schatzkiste. Sabine, Danke für deinen
„heißen Draht“ zur Werkstatt und den „Bestell-Firmen“ UND die Quelle der Nervennahrung (nicht
wahr Julia!?).
Danke an Hanno, den Administrator mit dem „südländischen Charme“, für den es eigentlich keine
Computerprobleme gibt, die er nicht durch Handauflegen lösen kann.
Patrick, dem Unverbesserlichen, möchte ich für die schon legendären Sammlungsreisen danken,
die nicht nur fachlich eine Bereicherung waren, sondern allen Beteiligten wohl in vielerlei Hinsicht
in Erinnerung bleiben werden (CODE: Blondes (Meer-)Schwein123).
Ein herzlicher Dank geht an Veit(i), den nervösen „Adoptiv-Vater“ aller (!) Scia-Keimlinge, dessen
enorme Begeisterungsfähigkeit und Tatendrang nicht nur den Lehrstuhl immens bereichern,
sondern auch mir immer wieder neuen Schwung brachten.
Eine besonders große MADS-Box (Mein Ausserordentliches DankeSchön) geht an Julia als ein
kollegiales und freundschaftliches Dankeschön für die beste Reisebegleitung in die „Molli-Welt (für Anfänger)“ und die gemeinsame Zeit in 773 & 772.
Meinen Freunden danke ich für den verständnisvollen und gnädigen ;) Umgang mit dem
„Akademischen Way of life“.
Ein ganz liebes Dankeschön an meine Eltern, für ihren unerschütterlichen Glauben an mich und in
meine Arbeit – DANKE!
Und ein riesigengroßes doppeltes Dankeschön an meinen Freund, fachlich & privat. DANKE, dass
du so bist, wie du bist – ein ganz besonderer Mensch.
√
LEBENSLAUF
Nicole Hille
geboren am 29.09.1976 in Dortmund
Staatsangehörigkeit: deutsch
Familienstand: ledig
Schulische Ausbildung:
1983 bis 1987 Lutherschule, Waltrop
1987 bis 1996 Theodor-Heuss-Gymnasium, Waltrop
Abschluss: Allgemeine Hochschulreife
Studium:
1996 bis 2002 Studium der Biologie an der Ruhr-Universität Bochum
2001 bis 2002 Diplomarbeit
am Lehrstuhl Spezielle Botanik
Fakultät für Biologie an der Ruhr-Universität Bochum
bei Prof. Dr. Th. Stützel
Abschluss: Diplom
seit 2002 Wissenschaftliche Hilfskraft/Mitarbeiterin am Lehrstuhl Spezielle
Botanik, Fakultät für Biologie der Ruhr-Universität Bochum
11/2002-03/2004 Mitarbeit im Drittmittelprojekt am Lehrstuhl Spezielle Botanik:
Wurzeleinwuchs in Abwasserleitungen und –kanäle - Ursachen,
Prüfung & Vermeidung (Ministerium für Umwelt & Naturschutz
des Landes NRW)
seit 2004 Wissenschaftliche Mitarbeit & Promotion am Lehrstuhl Spezielle
Botanik (seit 2007: LS Evolution und Biodiversität der Pflanzen),
Fakultät für Biologie (seit 2007: Fakultät für Biologie und
Biotechnologie) der Ruhr-Universität Bochum
ERKLÄRUNG
Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbstständig verfasst und bei keiner anderen
Fakultät eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel
verwendet habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um
fünf in Wort und Bild völlig übereinstimmende Exemplare.
Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten und in
keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.
Bochum, den 14.04.2008
(Nicole Hille)