Download - Moderní způsoby kultivace
Moderní způsoby kultivace
Ing. Aleš Prell, CSc.Mikrobiologický ústav AVČR, v.v.i.
Biotechnologická hala
moderní způsoby kultivace v bioreaktorech
kultivace v bioreaktorechsubmerzní kultivace v kapalině (SLC)
míchané bioreaktorymíchané bioreaktory
jednorázové kultivační vakyjednorázové kultivační vaky
membránové bioreaktorymembránové bioreaktory
kultivace na pevných půdách (SSC)proces – dynamika, řízení, optimalizace
základní typy kultivačních procesůzákladní typy kultivačních procesů
optimalizace bioprocesuoptimalizace bioprocesu
kultivace v bioreaktorech
BIOREAKTOR
zařízení, kde probíhá růst buněk a tvorba produktů nebo konverze
substrátu na jeden či více produktů
ideální bioreaktor
rychlý přestup tepla, kyslíku a hmoty, rychlá homogenizace,
nízké provozní náklady
transport živin a metabolitů
1.mezifázové rozhraní plyn-kapalina
2.transport v kapalině3.kapalina-pevná fáze4.transport
aglomerátem5.transport přes
biologické membrány
Sj - substráty, Pj - produkty, ∆Hv - tepelná bilance
rozdělení bioreaktorů / kultivací
podle skupenské fáze submerzní (suspenzní) – částice se volně vznášejí v
kapalné fázi míchané reaktorymíchané reaktory air-liftair-lift bublané kolonybublané kolony
imobilizované – buňky jsou ukotveny v pevné struktuře membránové – oddělení fází či komponent systémumembránové – oddělení fází či komponent systému pevné lože (packed-bed) – protékání pevného nosičepevné lože (packed-bed) – protékání pevného nosiče fluidní lože – vznáší se v proudufluidní lože – vznáší se v proudu
na pevné fázi – médium v tomto uspořádání tvoří pevný povrch a buňky tvoří povlak čí nárůst
submerzní kultivace(Solid-Liquid-Cultivation – SLC)
vs.kultivace s imobilizací
vs.kultivace na pevném substrátu(Solid-Solid-Cultivation – SSC)
submerzní kultivace kultivace s imobilizací
výskyt gradientu živin živiny protékají
nízká vrstva substrátu vysoká vrstva média
transportní procesy transportní procesy / limitace
kyslík rozpuštěn v kapalině kyslík rozpuštěn v kapalině
růst MO na povrchu substrátu MO rostou v médiu růst MO na/v matriciprodukt koncentrovaný nízká koncentrace produktu vyšší koncentrace produktu
obtížný scale-up definovaný scale-up
kultivace na pevném substrátu
živiny jsou rovnoměrně rozptýlené
průtočný systém / vznos / míchání
limitace transportu tepla a hmoty
třífázový systém pevná – kapalina - plyn
dvoufázový systém kapalina - plyn
třífázový systém pevná – kapalina - plyn
kyslík je dodáván hlavně z plynné fáze
teplo se odvádí pomocí plynné fáze
teplo se odvádí vnějším chlazením
teplo se odvádí vnějším chlazením / problematický
přechod z pevné fáze
obtížné sledování a řízení procesu
sledování a řízení procesu je běžné
sledování a řízení procesu je možné, ale obtížnější v pevné
fázi
obtížněji definovatelný scale-up
rozdělení bioreaktorů podle operačního módu
vsádkový (batch)vsádkový (batch) přítokovaný (fed-batch)přítokovaný (fed-batch) kontinuálníkontinuální perfuzní perfuzní
měřítka laboratorní (do 30 L)laboratorní (do 30 L) čtvrtprovozní (do 100 L)čtvrtprovozní (do 100 L) poloprovozní (do 5000 L)poloprovozní (do 5000 L) provozníprovozní
výběr bioreaktoru přestup kyslíku přestup tepla přestup hmoty požadavky na míchání nároky na energie citlivost kultury ke střižným
silám reologie kapaliny - viskozita
média (míchání, přestup hmoty, přestup tepla, střižné síly)
minimalizace odparu kapaliny
tlaková odolnost
sterilita operace
čištění bioreaktoru
bezpečnost
účelová flexibilita a kompatibilita
cena zařízení a jeho provozu
přestup kyslíku a tepla jsou limitující faktory pro provoz bioreaktoru a scale-up
živné půdy (media)
kultivační médium
je nezbytné pro růst a metabolismus mikroorganismů
tvoří vnější prostředí, které ovlivňuje chování mikroorganismu (růst, metabolismus, fyziologie)
ovlivňuje výtěžnost, rychlost tvorby produktu, složení produktu
musí obsahovat dostatečné množství živin živiny – růst buněk, získání energie pro syntézu
produktu a zachování buněčné integrity
základní typy médií
KOMPLEXNÍ organický zdroj živin
hydrolyzáty proteinů hydrolyzáty proteinů (peptony)(peptony)
extrakty masa, kvasnicextrakty masa, kvasnic
DEFINOVANÁznámo složení
minerální soliminerální soličisté esenciální složkyčisté esenciální složkyzdroj uhlíku a energiezdroj uhlíku a energie
návrh složení média
je nutno znát biochemii kultivace – vliv na metabolismus a fyziologii buněčné populace
účel kultivace – složení média (DSP) cena (tvoří přes 50% ceny konečného produktu),
stálost jeho složení formulace média - kompromis mezi nutričními
požadavky, cenou a dostupností složek média chemické složení média – určí se ze složení
biomasy a produktu, výtěžnostních koeficientů a doplňkových experimentů
funkce živin
zdroj stavebního materiálu nebo prekurzorů pro syntézu nových buněčných součástí – sloučeniny, které se stanou součástí biomasy
zdroj energie - sloučeniny, které se nestávají přímo součástí biomasy, ale slouží k výrobě energie (jako donory nebo akceptory elektronů)
ovlivňují složení mikrobiální buňky elementární složení všech mikrobiálních buněk je
relativně podobné – možnost odhadu obecných požadavků MO na živiny a návrh média – obsah hlavních prvků (C, H, N, O, S, P)
fyziologické funkce média
uhlík, vodík, kyslík, dusík, fosfor, síra, kationty a stopové prvky, voda...
část oxidována na CO2 (disimilace), využití takto získané energie na syntézu biomasy ze zbylé části (asimilace)
poměr asimilované a disimilované části je závislý na stupni redukce C-zdroje
maximální výtěžnost substrátu - čím více oxidovaný zdroj uhlíku, tím více je ho disimilováno a méně asimilováno odrazí se to v YX / S
hlavní elementární složky
VODÍK – hlavní zdroj je katabolický NAPDPH+
KYSLÍK – plynný, mění typy metabolismu DUSÍK – amonné soli, dusičnany, aminokyseliny,
močovina, pepton, hydrolyzát kaseinu, kvasničný extrakt
FOSFOR – anorganické fosfáty IONTY KOVŮ – Fe, Mg, K, Ca...
definované roztoky nebo komplexní org. zdrojedefinované roztoky nebo komplexní org. zdroje
další nezbytné složky
stopové prvky – Na, Mn, Co, Ni, Cu růstové faktory - esenciální org. sloučeniny, které si
buňka neumí sama syntetizovat vitamíny – často kofaktory enzymůvitamíny – často kofaktory enzymů L-aminokyseliny – především glutamováL-aminokyseliny – především glutamová puriny a pyrimidiny - syntéza nukleových kyselinpuriny a pyrimidiny - syntéza nukleových kyselin
VODA – pitná, deionizovaná, destilovaná... odpěňovadla – povrchové napětí, oleje, polyglykoly
polymery (PPG)
pH a iontová rovnováha stabilizace pH – užití pufrů v médiích
organické kyseliny, fosfáty, peptony, TRIS, HEPES …organické kyseliny, fosfáty, peptony, TRIS, HEPES … regulace pH
NaOH, NHNaOH, NH33, H, H33POPO44, H, H22SOSO44
iontová síla, redox – ovlivňují růst, produkci a produkty
příprava inokula, sterilizace, inokulace
příprava inokula
uchování kmenů lyofilizace, tekutý dusík, hluboké zmrazenílyofilizace, tekutý dusík, hluboké zmrazení přeočkovávání na pevných půdáchpřeočkovávání na pevných půdách
revitalizace v kapalném médiu – třepání inokulační tanky
poměr 1:10 až 1:20poměr 1:10 až 1:20 důraz na růst, nikoli produkci, často komplexní média důraz na růst, nikoli produkci, často komplexní média
a převod do definovanýcha převod do definovaných co nejméně inokulačních stupňůco nejméně inokulačních stupňů
aseptický proces, sterilizace
požadavky na aseptický proces sterilita – nepřítomnost živých organismů odstranění veškerých živých MO ze zařízení zabránění vstupu kontaminace po sterilaci zachování sterility – ekonomika procesu, bezpečnostní
hledisko sterilizace bioreaktoru a veškerého dalšího zařízení a
portů (potrubí, ventily, filtry, příchozí i odcházející vzduch, vzorkovací zařízení, senzory atd.)
úrovně požadavků na čistotu
pro dekontaminace životního prostředí pro agrotechnologie pro krmivářství potravinářská kvalita pro biochemii, biotransformace farmaceutická a medicínská kvalita
kontaminace může způsobit
likvidaci producenta (bakteriofágy) produkci toxinů (bezpečnost produktu,
inhibice produkčního kmene) produkci enzymů (degradace produktu) snížení výtěžnosti (spotřeba substrátu) produkci metabolitů (polysacharidy) spotřebu části substrátu (výtěžnost)
sterilizace média a bioreaktoru
ostrou párou min 121ºC, 0.2 MPa horkým vzduchem 150-180ºC chemicky – ethanol, chlornan sodný, fenol,
formaldehyd.... UV, X-rays – většinou povrchy, prostory ultrafiltrace – plyny, roztoky velké bioreaktory in situ (SIP), malé v autoklávu
hodnocení sterility
D-hodnota – snížení počtu zárodků na 1/10 závisí na odolnosti mikroorganismu
NN – počet živých zárodků, – počet živých zárodků, tt – čas sterilizace, – čas sterilizace, k - k - konstanta MO pro mokré/suché teplokonstanta MO pro mokré/suché teplo
Bacillus subtilis D121 = 0.4 - 0.7 min (mokré teplo) pro N0/Nt = 1012 je t = 12.D
−dNdt
=kN lnN t
N 0=−kt
sterilizace parou in situ
naplnění médiem, zapnutí přívodu páry, míchání pomalé, horní otvor otevřen, ostatní uzavřeny, zahřátí média, vypuzení vzduchu, dosažení 100ºC
uzavření horního otvoru, jediná cesta – kondenzátor, sterilace filtrů (in/out), sterilace potrubí a výpustního ventilu, dosažení 121ºC, sterilace 20 minut
ochlazení na kultivační teplotu nutnost sterilního vzorkování a filtrace vzduchu
sterilizace vzduchu a odplynů
možnost sterilizace velkých objemových průtoků: vzdušnění obvykle 1 VVMvzdušnění obvykle 1 VVM 10 m10 m33 reaktor – za 48 h 29 000 m reaktor – za 48 h 29 000 m33 vzduchu vzduchu koncentrace MO ve vzduchu – 1-10/L vzduchukoncentrace MO ve vzduchu – 1-10/L vzduchu ultrafiltraceultrafiltrace – splňuje všechny požadavky, používá se ke – splňuje všechny požadavky, používá se ke
sterilizaci vzduchu, hydrofobní membránové filtry vsterilizaci vzduchu, hydrofobní membránové filtry v patroně, póry 0.1 μmpatroně, póry 0.1 μm
inokulace
aseptické převedení inokula do bioreaktoru vyššího stupně
sterilizovatelné potrubní spojení čerpání tlakem sterilního vzduchučerpání tlakem sterilního vzduchu
sterilní inokulační jehly septa v aperturách ve víku bioreaktoru čerpání peristaltickými čerpadly
inokulum nepřichází do styku s čerpadleminokulum nepřichází do styku s čerpadlem
přestup tepla, aeracea přestup kyslíku
přestup tepla vznik tepla - míchání (příkon míchadla 15 kJ/m3.s,
aerace, činnost mikroorganismů aerobní procesy – množství uvolněného tepla
proporcionální spotřebovanému kyslíku, Q(kJ/mQ(kJ/m33.s) = 0,12 . OCR(mmol O.s) = 0,12 . OCR(mmol O22/m/m33.s) .s) Q – rychlost produkce tepla, OCR – rychlost Q – rychlost produkce tepla, OCR – rychlost
spotřeby kyslíku 450 kJ tepla/mol utilizovaného Ospotřeby kyslíku 450 kJ tepla/mol utilizovaného O22
submerzní kultury 3-15 kJ/m3.s odvod tepla – chlazení, externí plášť, interní vestavby scale-up – přestup kyslíku a tepla limitující (omezená
chladicí plocha – vyšší objem, menší chladicí plocha)
aerace (provzdušňování) aktivní přísun vzduchu do bioreaktoru za
současné účinné dispergace – velké mezifázové rozhraní
stupeň dispergace DDbb – průměr bublin (2-3 mm), – průměr bublin (2-3 mm), ε – plynová zádržε – plynová zádrž
vvm – volume/volume/minute VVGG – průtok vzduchu – průtok vzduchu VVrr – objem reaktoru – objem reaktoru
a=6⋅ϵDb
vvm=V G
V r
přestup kyslíku
rychlost přestupu kyslíku (oxygen transfer rate)
rychlost spotřeby kyslíku (oxygen uptake rate)
OTR=K La⋅(C*−C )
OUR=X⋅qO2=μXY X /O
vlivy na přestup kyslíku C*: rovnovážná koncentrace kyslíku
teplota, tlak a charakter kapaliny (koncentrace solí, teplota, tlak a charakter kapaliny (koncentrace solí, viskozita)viskozita)
C: aktuální koncentrace kyslíku geometrie nádoby - průměr, kapacita, konfigurace a geometrie nádoby - průměr, kapacita, konfigurace a
velikost míchadla, příkon, zarážkyvelikost míchadla, příkon, zarážky aerace - velikost a umístění distributorů vzduchu, aerace - velikost a umístění distributorů vzduchu,
způsob operacezpůsob operace vlastnosti kapaliny (morfologie a koncentrace MO, vlastnosti kapaliny (morfologie a koncentrace MO,
odpěňovací činidla) ovlivňují Codpěňovací činidla) ovlivňují C velké fermentory (>5000 L) OTR < 300 mmol/L.h
jak zvýšit přestup kyslíkuza daných podmínek
zvýšení průtoku vzduchu zvýšení otáček míchadla zvýšení tlaku v bioreaktoru zvýšení obsahu kyslíku ve vzduchu závislosti jsou nelineární
submerzní kultivace vkapalném médiu
SLC
submerzní bioreaktory kyslík - aerobní, anaerobní konstrukce
míchání - mechanické, pneumatické nebo hydraulickémíchání - mechanické, pneumatické nebo hydraulické fluidní vrstvafluidní vrstva náplňovénáplňové membránovémembránové fotobioreaktoryfotobioreaktory ......................
hlavní funkce bioreaktoru
zajistit ideální prostředí pro růst a tvorbu produktu médium médium →→ živiny živiny →→ homogenita homogenita →→ míchánímíchání médium médium →→ živiny živiny → → přítokovánípřítokování aerobní procesy aerobní procesy →→ přestup kyslíku přestup kyslíku → → míchání, aeracemíchání, aerace tepelná bilance tepelná bilance → → míchání, temperacemíchání, temperace regulace pHregulace pH
míchané bioreaktory
míchání bioreaktoru s mechanickým mícháním s pneumatickým promícháváním
probublávané reaktoryprobublávané reaktory prostéprosté s vnitřními vestavbami (air-lift)s vnitřními vestavbami (air-lift)
s cirkulační trubkous cirkulační trubkou s vnější cirkulacís vnější cirkulací
fluidní lože
pneumaticky míchané reaktory
vstup energie pouze plynnou fází (aeračním plynem) vzduch vstupuje zespoda tryskami aerobní kultivace vhodné pro MO citlivé ke střižným silám výhody: jednoduché zařízení, neporuchové, investičně
nenáročné, rychlost přenosu kyslíku vysoká nevýhody: ne pro média s vyšší viskozitou, velká spotřeba
vzduchu, pěnění média
probublávané reaktory
cylindrická nádoba, poměr 1:2 (kolona) rozdělovač plynu obvykle naspodu reaktoru nepřítomnost speciálních difuzorů a vestaveb přestup kyslíku a míchání – dáno rychlostí proudění
vzduchu a reologií kapaliny maximální rychlost míchání obvykle ≤ 0,1 ms-1
nevýhoda – obvykle malý přestup O2
air-lift reaktory
vestavby – zarážka, cirkulační trubka funkce vestaveb:
dostatečná dispergace plynu – umožňuje obnovování dostatečná dispergace plynu – umožňuje obnovování mezifázového povrchu – zvyšuje přestup kyslíkumezifázového povrchu – zvyšuje přestup kyslíku
organizování toku fázíorganizování toku fází zvýšení doby prodlení plynuzvýšení doby prodlení plynu zvýšení mikroturbulencezvýšení mikroturbulence
air-lift reaktory - cirkulace
systémy s vnitřní cirkulací difuzor pod cirkulační trubkou, vzestupné proudění v trubce, difuzor pod cirkulační trubkou, vzestupné proudění v trubce,
část odplynů odchod horní částí, v mezikruhové ploše proudí část odplynů odchod horní částí, v mezikruhové ploše proudí kapalina zpět dolůkapalina zpět dolů
cirkulační trubkacirkulační trubka systémy s vnější cirkulací
2 kolony spojené ve spodní a horní části2 kolony spojené ve spodní a horní části aerovaná kolona – větší průměraerovaná kolona – větší průměr úplná separace bublin z kapaliny v horní části reaktoruúplná separace bublin z kapaliny v horní části reaktoru indukovaná cirkulace směruje vzduch a kapalinu v reaktoruindukovaná cirkulace směruje vzduch a kapalinu v reaktoru
bublaná kolona aair-lift s centrální trubkou
reaktory s fluidním ložem I vhodné pro imobilizované MO nebo enzymy, flokulované MO kapalina proudí vzhůru – suspendace pevné fáze podobné probublávaným reaktorům, horní část rozšířená –
redukce povrchové rychlosti – pevné částice se vracejí do střední části, kapalina odchází lze probublávat vzduchem/jiným plynem – zvýšení turbulence
a míchání příliš lehké částice – použití nosiče, zvýšení sedimentační
schopnosti náplňové bioreaktory pevná matrice (porézní x neporézní, polymer x rigidní
materiál), biokatalyzátor
reaktory s fluidním ložem II
přívod živin, kontinuální, proudí přes náplň, metabolity a produkty odváděny
výška náplně – hustota a kompresibilita nosiče, proudění kapalin (tlak na nosič), prostor pro proudění plynů
nehomogenní prostředí – změna koncentrace živin s výškou náplně, gradient pH, špatné promíchávání
využití – reakce, kde se vyskytuje inhibice produktem (rozdílná koncentrace produktu podél náplně)
další typy bioreaktorů
fotobioreaktory fotosyntetizující kultury – mikrořasy, cyanobakteriefotosyntetizující kultury – mikrořasy, cyanobakterie
bioreaktory pro kultivaci na pevné fázi bioreaktory pro kultivaci živočišných buněk
mechanicky míchané reaktory třífázový systém: plyn-kapalina-pevná fáze účel míchání – homogenizace, dispergace koncentrační a teplotní homogenita střihové napětí – rozbíjení bublin – velká mezifázová plocha vysoká turbulence – přestup látky a tepla mechanické míchadlo (disková turbína, 4-6 listů, d asi 0.3
dT) vzdušnění zespoda zarážky pro optimální promíchávání (4-8, d asi 0.1dT) –
zamezení vzniku víru aerační věnec - bubliny rozbíjeny míchadlem vrchní část - odplyny
mechanicky míchaný bioreaktor – tlaková nádoba I
1 - nádoba bioreaktoru
2 - plášť
3,4 - izolace
5 – přívod inokula
6 – porty pro pH elektrody
7 - míchadlo
8 – aerační věnec
9 – ucpávka
10 - převodovka
11 – motor
12 – vypouštěcí otvor
mechanicky míchaný bioreaktor – tlaková nádoba II
13 – chlazení pláště
14 – vzorkovací otvor s připojením páry
15 – prosklená plocha (pozorování obsahu)
16 – přívod roztoků na úpravu pH a odpěňovadla
17 – vstup vzduchu
18 – víko
19 – přívod média
20 – odvod vzduchu
21 – porty na různé senzory (O2, T,…)
22 – rozbíječ pěny
23 – přívod páry
24 – tryska
dispergace mícháním rozbíjení bublin – velká mezifázová plocha – vysoký
přestup O2 do kapaliny vytvoření dostatečného střihového napětí nutno znát maximální střihové napětí, které
mikroorganismy snáší kompromis mezi maximální dodávkou kyslíku a
homogenizací a velikostí střihových sil
základní typy míchadel
vrtulové vysoká čerpací kapacita, menší střižné síly, axiální tokvysoká čerpací kapacita, menší střižné síly, axiální tok
turbínové otevřená disková turbína s dělicím kotoučem, vzduch otevřená disková turbína s dělicím kotoučem, vzduch
přiváděn do aeračního věnce pod míchadlem; výhody přiváděn do aeračního věnce pod míchadlem; výhody – vysoké střižné síly způsobují dispergaci – vysoké střižné síly způsobují dispergaci vzduchových bublin, dělicí kotouč zabraňuje vzduchových bublin, dělicí kotouč zabraňuje zkratovému toku vzduchu kolem hřídele; nevýhoda – zkratovému toku vzduchu kolem hřídele; nevýhoda – omezená čerpací kapacitaomezená čerpací kapacita
mechanická míchadla
nahoře: disková míchadla - různý směr lopatek
dole: a) vrtulovéa) vrtulové b) diskové s b) diskové s
narážkaminarážkami c) diskové bez c) diskové bez
narážeknarážek
základní konfigurace obvykle více míchadel – zlepšení homogenizace
(vzdálenost 1-1.5 D) rychlost míchání – limitace dle systému (vibrace) velikost míchadla – větší průměr – lepší míchání
(D/DT = 0.4-0.5) zarážky – zlepšení míchání, minimalizace vzniku víru,
4 ks 0.1 DT vzdušnění – zlepšení míchání PG
P=f ( V̇ G
n⋅d3 )
příkon míchadel
pro newtonské kapaliny
příkonové číslo je funkcí Reynoldsova čísla
P0 – příkonové číslo, ρ – hustota, n – otáčky, d – průměr míchadla, μ – dynamická viskozita
P=P0⋅ρ⋅n3⋅d 5
Re= n⋅d2⋅ρμ
důvodem pro intenzívní míchání není obvykle homogenizace, ale
přestup kyslíku
kultivace v jednorázových kultivačních vacích
charakter kultivačních vaků
stupňování požadavků na čistotu a sterilitu citlivost tkáňových kultur na střižné síly předsterilizované jednorázové plastové
kultivační vaky kultivační objemy od stovek mililitrů až po
tisíc litrů nedostatek kyslíku – jemná dispergace náklady na jednorázové zařízení jsou vysoké
- drahé produkty
bioreaktory s vlnovým mícháním
1: základna,2: čep,3: vsádka,4: vak,5: výstupní filtr, 6: vstupní filtr.
výbava kultivačních vaků
apertury pro vstupy a výstupy médií, inokula, aeračního plynu a výdechového plynu
sterilita plynů se zajišťuje mikrofiltry spoje jsou realizovány jednorázovými
trubkami, hadicemi a konektory jednorázové senzory pro kultivační
parametry - pH, teplotu, koncentraci rozpuštěného kyslíku
vaky s mechanickým mícháním
nedostatečné míchání v plastových vacích plastové nebo ocelové mechanické míchadlo pohyblivé spojení je zajištěno magnetickou
spojkou, nebo různými typy plastových či keramických ucpávek
vak je často umístěn v ocelové nádobě
Sartorius Stedim Biotech:BIOSTAT CultiBag STR Plus
membránové bioreaktory
charakter a použití MBR
charakteristická zádrž buněk nebo nosičů je možné dělení produktů katalyzovaná reakce (retězec reakcí)
mimo membránu mimo membránu uvnitř membrány (funkcionalizovaná membrána) uvnitř membrány (funkcionalizovaná membrána)
vhodné pro kultivace tkáňových buněk, kmenových buněkkultivace tkáňových buněk, kmenových buněk čištění odpadních vodčištění odpadních vod
submerzní membránový bioreaktor
funkční dělení MBR
bioreaktory se separací buněk (biomass separation membrane bioreactor, BSMBR)
bioreaktory s aerací přes membránu (membrane aeration bioreactor, MABR)
extraktivní bioreaktory, kde se odděluje metabolit či produkt (extractive membrane bioreactor, EMBR)
bioreaktory s výměnou iontů na membráně (ion exchange membrane bioreactor, IEMBR)
perfuzní bioreaktory
distribuce media sítí kanálů k buňkám - kontinuální výměna média
hollow-fibre bioreaktor
dvou-kompartmentový systém intrakapilární a extrakapilární prostorintrakapilární a extrakapilární prostor
svazek dutých vláken svazek dutých vláken rovnoměrný průtok pro všechna vlákna rovnoměrný průtok pro všechna vlákna
svazkusvazku svazek dutých vláken je uložen v svazek dutých vláken je uložen v
cylindrickém pouzdře, kterým proudí cylindrickém pouzdře, kterým proudí extrakapilární tokextrakapilární tok
semipermeabilní membrána - selektivní semipermeabilní membrána - selektivní prostup složek médiaprostup složek média
kultivace na pevných půdáchSSC
výhody SSC jednoduchost a nenáročnost na strojní vybavení vyšší objemová koncentrace produktů efektivnější izolace produktů jednodušší inokulace, absence tvorby pěny menším objem odpadů některé organismy se v submerzním prostředí kultivují obtížně,
nebo netvoří žádané produkty (např. některé vláknité mikroorganismy, nebo tkáňové buňky adherující na pevné povrchy)
uvádí se vyšší odolnost ke kontaminaci, protože SSC představují selektivnější prostředí z hlediska dostupnosti substrátu a snížené vlhkosti.
je obtížnější zajistit sterilitu technicky
bioreaktory pro pevný substrát
nemíchané bioreaktory
nemíchaný a neaerovaný otevřená vana, nad kterou cirkuluje vzduchotevřená vana, nad kterou cirkuluje vzduch
nemíchaný a aerovaný packed-bed – suchý substrát ve vertikálním loži, zespoda packed-bed – suchý substrát ve vertikálním loži, zespoda
vháněný zvlhčovaný vzduchvháněný zvlhčovaný vzduch
míchané bioreaktory
s aerací nebo bez bubnové rotační, bubnové s lopatkamibubnové rotační, bubnové s lopatkami vertikální s oběžným míchadlemvertikální s oběžným míchadlem
Terrafors 15 L rotating drum
submerzní kultivace kultivace s imobilizací
výskyt gradientu živin živiny protékají
nízká vrstva substrátu vysoká vrstva média
transportní procesy transportní procesy / limitace
kyslík rozpuštěn v kapalině kyslík rozpuštěn v kapalině
růst MO na povrchu substrátu MO rostou v médiu růst MO na/v matriciprodukt koncentrovaný nízká koncentrace produktu vyšší koncentrace produktu
obtížný scale-up definovaný scale-up
kultivace na pevném substrátu
živiny jsou rovnoměrně rozptýlené
průtočný systém / vznos / míchání
limitace transportu tepla a hmoty
třífázový systém pevná – kapalina - plyn
dvoufázový systém kapalina - plyn
třífázový systém pevná – kapalina - plyn
kyslík je dodáván hlavně z plynné fáze
teplo se odvádí pomocí plynné fáze
teplo se odvádí vnějším chlazením
teplo se odvádí vnějším chlazením / problematický
přechod z pevné fáze
obtížné sledování a řízení procesu
sledování a řízení procesu je běžné
sledování a řízení procesu je možné, ale obtížnější v pevné
fázi
obtížněji definovatelný scale-up
kultivační proces – dynamika, řízení, optimalizace
základní typy kultivací
vsádková (batch) uzavřený systém, není průběžný přítok živin ani uzavřený systém, není průběžný přítok živin ani
odvod metabolitůodvod metabolitů přítokovaná (fed-batch)
přítok média ano, odvod média ne – objem přítok média ano, odvod média ne – objem reaktoru není konstantníreaktoru není konstantní
kontinuální (continuous cultivation) otevřený systém, plynulý přítok a odtok média, otevřený systém, plynulý přítok a odtok média,
konstantní objem reaktorukonstantní objem reaktoru
vsádková kultivace (batch)
uzavřený systém všechny živiny i inokulum přivedeny na počátku
kultivace živiny postupně spotřebovávány, akumulace
biomasy a metabolitů – činností metabolismu MO
konstantní objem bioreaktoru zanedbává se změna objemu – úprava pH,
odpěňování, vzdušnění
fáze růstu v batch režimu
lag fáze exponenciální fáze stacionární fáze fáze odumírání mezi jednotlivými fázemi tranzientní stavy požadavky: minimalizace lag fáze, prodloužení
a exponenciální fáze
fáze růstové křivky
exponenciální fáze růstu
intenzivní a pravidelný růst – lze ho sledovat jako koncentraci buněk nebo biomasy
T – doba zdvojení, n – počet generací
X=X 0⋅eμ t dXdt
=μ⋅X
t=n⋅T X=X 0⋅2n
ln (X )=μ t+ ln (X 0)
průběh vsádky v exp. fázi
maximalizace μ
složení média, teplota, pH, DOT, koncentrace substrátů atd.
množství vytvořené biomasy přímo úměrné množství spotřebované živiny
výtěžnost (yield): rychlost růstu úměrná rychlosti spotřeby živiny
a naopak hodnota YX /S za různých podmínek různá
Y X /S=dXdS
řízení vsádkového procesu
produkce biomasy – maximální délka exponenciální fáze růstu
produkce primárního metabolitu – prodloužení exponenciální fáze růstu za současné produkce metabolitu
produkce sekundárního metabolitu – krátká exponenciální fáze, prodloužená stacionární fáze
přítokovaná kultivace (fed-batch) jedna nebo více živin dávkováno do bioreaktoru
během kultivace, produkt zůstává v bioreaktoru přítok média ano, odvod média ne – Vr není
konstantní řízení rychlosti přítokování limitujícího substrátu řízení
rychlosti spotřeby substrátu řízení reakčních rychlostí a metabolismu
výhoda – řízenou změnou koncentrace živin lze ovlivnit výtěžek nebo produktivitu
živiny jsou dodávány během kultivace, neodvádí se médium - objem bioreaktoru roste
uplatnění fed-batch
substrátová inhibice (methanol, ethanol, kyselina octová, atd.)
hustá kultura – vysoká koncentrace buněk glukosový efekt (over-flow metabolismus) katabolická represe – snadno metabolizovatelný
zdroj (glukosa) optimalizace tvorby metabolitu – produkce AK,
řízené udržování nízké koncentrace S prodloužení produkční fáze (oddělení produkční a
růstové fáze) – sekundární metabolity
řízení přítoků I
koncentrace substrátu se udržuje konstantní nebo se mění podle optimálního algoritmu pomalý konstantní přítok média – lineární růst pomalý konstantní přítok média – lineární růst
celkové biomasycelkové biomasy exponenciální přítok média – exponenciální růst exponenciální přítok média – exponenciální růst
biomasybiomasy přítokování média podle zvoleného parametru
spojeného s růstem biomasy nebo produkcí (zpětnovazebná regulace)
řízení přítoků II
podle předem daného schématu – přerušovaný nástřik podle vypočtené funkce
přímo – měření koncentrace substrátu v bioreaktoru, podle toho upraven nástřik
nepřímo – měření jiných parametrů, které jsou spjaté s metabolismem buňky – DOT, pH, CO2 a O2 v odplynech atd.
kontinuální kultivace
otevřený systém plynulé(nepřetržité) dodávání živin (média) plynulý odběr média pozměněného
metabolickou činností MO i s částí biomasy rychlost přítoku = rychlost odvodu konstantní objem bioreaktoru rozmnožování za optimálních podmínek
typy kontinuálů - chemostat
chemostat konstantní rychlost přítoku média F (konstantní konstantní rychlost přítoku média F (konstantní
zřeďovací rychlost D, rychlost přítoku substrátu = zřeďovací rychlost D, rychlost přítoku substrátu = rychlost spotřeby substrátu) mikroorganismy si podle rychlost spotřeby substrátu) mikroorganismy si podle podmínek nastaví konstantní podmínek nastaví konstantní μμ a konstantní X a konstantní X
D= FV
(s−1 , h−1) D=μ
další typy kontinuálů
turbidistat konstantní turbidita (koncentrace biomasy) – mění se D konstantní turbidita (koncentrace biomasy) – mění se D
(automatická regulace)(automatická regulace) auxostat
konstantní parametr spjatý s růstem – mění se D konstantní parametr spjatý s růstem – mění se D (nutristat: S=konst, oxistat: DOT=konst, CO(nutristat: S=konst, oxistat: DOT=konst, CO22stat: stat: COCO22=konst)=konst)
optimalizace bioprocesu
konstrukce/selekce produkčního kmene optimalizace složení média výběr typu kultivace
podle optimalizovaného parametru, technických podle optimalizovaného parametru, technických možností a dalších kritériímožností a dalších kritérií
optimalizace kultivačních parametrů (pH, teplota, aerace, míchání...)
optimalizace složení média
kvalitativní a semikvantitativní složení baňkové pokusy, využít optimalizační metodu, např. baňkové pokusy, využít optimalizační metodu, např.
experimentální design odvozený od Response Surface experimentální design odvozený od Response Surface Methodology, Optimal či Central Composition Methodology, Optimal či Central Composition Design, ke snížení počtu experimentůDesign, ke snížení počtu experimentů
kvantitativní složení vychází z experimentů v laboratorním fermentoru a vychází z experimentů v laboratorním fermentoru a
vhodného strukturovaného modelu s bilancí procesu, vhodného strukturovaného modelu s bilancí procesu, mění se v časemění se v čase
bilanční modelování
matematický model procesu nebo zařízení vztahy popisující jeho chování v časevztahy popisující jeho chování v čase diferenciální rovnice, nelineární rovnicediferenciální rovnice, nelineární rovnice
VSTUP + ZDROJ = VÝSTUP + AKUMULACE
identifikace modelu - konstanty
aproximace empirických dat metodou nejmenších čtverců
optimalizace, extrém funkce, účelová funkce = kritérium optimalizace
optimalizační proměnné, např. μ, π, YP / X, YP / S
S=∫ ( yM− y E)2⋅dt
optimalizace kultivačních parametrů
teplota optimální růstová teplota kmene, lze využít pro optimální růstová teplota kmene, lze využít pro
změny rychlosti růstu a produkcezměny rychlosti růstu a produkce pH
optimální růstové pH kmene, lze omezit kontaminaci, optimální růstové pH kmene, lze omezit kontaminaci, vliv složení média, indikátor metabolismuvliv složení média, indikátor metabolismu
aerace (řízení DOT) podle metabolismu produkce, limitace kyslíkem v podle metabolismu produkce, limitace kyslíkem v
různých fázích, řízení dostupnosti energie, změny různých fázích, řízení dostupnosti energie, změny metabolismumetabolismu
monitoring a automatizace konstrukční součást bioreaktoru senzory a zařízení pro měření základních stavových
veličin pH, teplota, DO, redox, DCO2, odplyny, X, S, PpH, teplota, DO, redox, DCO2, odplyny, X, S, P
měření a řízení základních procesních parametrů otáčky míchadla, průtok vzduchu, tlak, přítokyotáčky míchadla, průtok vzduchu, tlak, přítoky
analogové měřící a řídící jednotky DDC (Direct Digital Control) realizované PLC nadřazené monitorovací, archivační a řídící systémy
základní regulace pH – automatizované dávkování H+ a OH-
teplota – dvojitý plášť, pára, tepelná média DO –
otáčky míchadla – asynchronní elektromotory, otáčky míchadla – asynchronní elektromotory, frekvenční měničefrekvenční měniče
průtok vzduchu - kompresory, turbodmychadla, škrtící průtok vzduchu - kompresory, turbodmychadla, škrtící regulace podle MS měřeníregulace podle MS měření
tlak – tenzometrická čidla, regulace na výstupu podle tlak – tenzometrická čidla, regulace na výstupu podle SPSP
přítokování - tlakové nebo peristaltické pumpy, měření nejpřesněji tlakové nebo peristaltické pumpy, měření nejpřesněji
vážením reaktoru nebo zásobníkuvážením reaktoru nebo zásobníku