Mikroelektrochemische Methoden
in der Biosensorik und Elektroanalytik
Dissertation
zur Erlangung des Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Chemie
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Marcus Mosbach
Bochum, Februar 2001
Diese Arbeit wurde in der Zeit von Juli 1998 bis Februar 2001 am Lehrstuhl für
Analytische Chemie, AG Elektroanalytik und Sensorik unter der Leitung von Prof. Dr.
W. Schuhmann angefertigt.
Eingereicht am: 22. Februar 2001
Tag der mündlichen Prüfung: 04. April 2001
Referent: Prof. Dr. W. Schuhmann
Koreferent: Prof. Dr. W. S. Sheldrick
Prüfer: Prof. Dr. Ch. Wöll
Teile dieser Arbeit sind veröffentlicht als
M. Mosbach, T. Laurell, J. Nilsson, E. Csöregi, W. Schuhmann„Determination of Diffusion Coefficients of Electroactive Species in "Time-of-Flight-Experiments" Using a Microdispenser and Microelectrodes“Analytical Chemistry, akzeptiert
M. Mosbach, T. Laurell, J. Nilsson, E. Csöregi, W. Schuhmann„A Miniaturized Electrochemical Affinity Assay Based on a Wall-Free Sample Dropletand Micro-Dispensing of the Redox-Labelled Binding Partner“Biosensors & Bioelectronics, akzeptiert
M. Mosbach, H. Zimmermann, T. Laurell, J. Nilsson, E. Csöregi, W. Schuhmann„Picodroplet-Deposition of Enzymes on Functionalized Self-Assembled Monolayersas a Basis for Miniaturized Multi-Sensor Structures“Biosensors & Bioelectronics, akzeptiert
M. Mosbach, W. Schuhmann„Modulation of the Diffusion Coefficient of a Hapten-Modified Redox Species as aBasis for an Amplified Electrochemical Affinity Assay“Sensors & Actuators B 70 (2000) 145-152
K. Habermüller, M. Mosbach, W. Schuhmann„Electron-Transfer Mechanisms in Amperometric Biosensors“Fresenius Journal of Analytical Chemistry 366 (2000) 560-568
Patentanmeldung
P19917052.5 M. Mosbach, W. Schuhmann„Vorrichtung und Verfahren zur Bestimmung chemischer und biochemischer Analytemittels amplifizierter mikroelektrochemischer Detektion“
zur Veröffentlichung eingereicht
S. Gaspar, M. Mosbach, L. Wallman, T. Laurell, E. Csöregi, W. Schuhmann„Generation of Enzyme Microstructures Using a Flow-Through Microdispenser -A New Method to Design and Study Recognition Layers in Biosensors“Analytical Chemistry
in Vorbereitung
M. Mosbach, W. Schuhmann„Electrochemical Measurements in Picoliter Droplets Deposited in an Oil-Environment by Means of a Microdispenser“
M. Mosbach, A. Salmon, P. Jutzi, W. Schuhmann„Determination of Diffusion Coefficients of Redoxactive Compounds Using aMicrodispenser and Fast Scan Cyclic Voltammetry“
F.D. Munteanu, M. Mosbach, A. Schulte, W. Schuhmann, L. Gorton„Fast Scan Cyclic Voltammetry and Scanning Electrochemical Microscopy forStudies on the Acidic pH-Effect on 2-Electron Mediators Immobilized on ZirconiumPhosphate“
Vorträge
61. AGEF-Seminar, Düsseldorf, 15.11.2000M. Mosbach, S. Gaspar, T. Laurell, J. Nilsson, E. Csöregi, W. Schuhmann„Miniaturisierte Multisensor-Strukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auffunktionalisierten selbstorganisierten Monoschichten“
6th World Congress on Biosensors, San Diego (USA), 24.-26.05.2000Keynote Lecture, ausgezeichnet mit dem Biosensors & Bioelectronics Award 2000M. Mosbach,T. Laurell, J. Nilsson, E. Csöregi, W. Schuhmann:„Modulation of the Diffusion Coefficient of a Hapten-Modified Redox Species as aBasis for an Amplified Miniaturized Electrochemical Affinity Assay“
Industriepräsentation, Institut für Bioanalytik, Göttingen, 21.01.2000M. Mosbach, W. Schuhmann„Amplifizierter elektrochemischer Affinitätsassay durch Modulation vonDiffusionskoeffizienten“
5. Doktorandentreffen der Elektroanalytiker, Bochum, 09.-11.06.1999M. Mosbach, W. Schuhmann„Amplifizierter elektrochemischer Affinitätsassay durch Modulation vonDiffusionskoeffizienten“
Biosensor Symposium 1999, München, 14.-16.04.1999M. Mosbach, W. Schuhmann„Direkte Affinitätsassays durch Modulation des Diffusionskoeffizienten einerRedoxspezies“
Posterpräsentation
Electrochemical Microsystem Technologies / Interfinish 2000,Garmisch-Partenkirchen, 11.-15.09.2000 (mit Kurzvortrag)M. Mosbach, H. Zimmermann, T. Laurell, J. Nilsson, E. Csöregi, W. Schuhmann„Picodroplet-Deposition of Enzymes on Functionalized Self-Assembled Monolayersas a Basis for Miniaturized Multi-Sensor Structures“
DANKSAGUNG
Ich danke
Herrn Prof. Dr. Wolfgang Schuhmann für die hervorragende Betreuungund Unterstützung, seinen mitreißenden Optimismus, dasfreundschaftliche Verhältnis und die vielen „5 Minuten“ Zeit, die erimmer für meine Anliegen hatte
Herrn Prof. Dr. Thomas Laurell, Dr. Johan Nilsson und Herrn LarsWallman (Institut für Elektrische Messtechnik, Technische HochschuleLund, Schweden) für die freundliche Aufnahme in die Arbeitsgruppewährend meiner Aufenthalte in Schweden, die Ausbildung in Silizium-Mikrotechnologie und die Einweihung in die Geheimnisse derMikrodispenser
Frau Dr. Elisabeth Csöregi (Institut für Biotechnologie, Universität Lund,Schweden) für die Organisation meiner Forschungsaufenthalte inSchweden
Herrn Szilveszter Gaspar (Institut für Biotechnologie, Universität Lund,Schweden) für die gute Zusammenarbeit in Lund und Bochum und dieUntersuchungen auf dem Gebiet der Multischicht-Sensorstrukturen
Herrn Dr. Thomas Schmidt (Institut für Bioanalytik, Göttingen) für diegroßzügige Bereitstellung von Streptavidin
Herrn Prof. Dr. Jutzi (Lehrstuhl für Anorganische Chemie, UniversitätBielefeld) für das Interesse, das der dieser Arbeit entgegenbrachte unddie gute Kooperation mit seiner Arbeitsgruppe
Herrn Alexander Salmon (Lehrstuhl für Anorganische Chemie,Universität Bielefeld) für die Synthese und Bereitstellung derFerrocenderivate
Frau Florentina Munteanu (Institut für Analytische Chemie, UniversitätLund, Schweden) für die gemeinsamen Arbeiten auf dem Gebiet derCarbonpastenelektroden
Herrn Ralf Arnold (Lehrstuhl für Physikalische Chemie, Ruhr-UniversitätBochum) für die Goldbedampfung der Siliziumwafer
der Feinmechanik-Werkstatt der Fakultät für Chemie der Ruhr-Universität Bochum, besonders Herrn Lindner, für die präzise undschnelle Fertigung der benötigten Teile
den ehemaligen Mitgliedern der Arbeitsgruppe Elektroanalytik undSensorik, als da wären
Frau Dr. Katja Habermüller für den Großteil der Arbeit amgemeinsamen Übersichtsartikel
Herrn Dr. Heiko Zimmermann für die gemeinsamen Forschungs-arbeiten am VW-Projekt und die gute Schreibtisch-Nachbarschaft
Herrn Dr. Andreas Hengstenberg für die Unterstützung bei derschnellen Datenaufnahme-Software
allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe Elektroanalytik und Sensorik für dasfreundliche Arbeitsklima, die stete Hilfs- und Diskussionsbereitschaftund die vielen netten gemeinsamen Unternehmungen
ganz besonders meinen Eltern, deren Unterstützung ich immer hintermir wusste
und vor allem Kerstin.
MEINEN ELTERN
Inhaltsverzeichnis I
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG ........................................................................................................................................ 1
2 STAND DER FORSCHUNG................................................................................................................. 3
2.1 AUFBAU UND ANWENDUNGEN VON METABOLISCHEN BIOSENSOREN UND AFFINITÄTSSENSOREN......... 3
2.2 ELEKTROCHEMIE IN DER BIOSENSORIK............................................................................................. 62.2.1 Enzymbasierte elektrochemische Biosensoren...................................................................... 62.2.2 Redoxmediatoren als artifizielle Cosubstrate in Biosensoren ................................................ 92.2.3 Elektrochemische Affinitätsassys......................................................................................... 11
2.3 MOLEKULARE ERKENNUNG ZWISCHEN BIOTIN UND STREPTAVIDIN................................................... 15
2.4 MINIATURISIERUNG VON ELEKTROCHEMISCHEN MESSSYSTEMEN..................................................... 182.4.1 Mikroelektroden.................................................................................................................... 182.4.2 Elektrochemische Rastermikroskopie.................................................................................. 222.4.3 Funktionsprinzip des Elektrochemischen Rastermikroskops............................................... 232.4.4 Mikrobandelektroden und Interdigitalelektroden .................................................................. 33
2.5 MIKROSTRUKTURIERUNG VON OBERFLÄCHEN MIT BIOMOLEKÜLEN.................................................. 35
3 PROBLEMSTELLUNG....................................................................................................................... 39
4 EIGENE ARBEITEN ........................................................................................................................... 42
4.1 AMPLIFIZIERTER AFFINITÄTSASSAY DURCH MODULATION VON DIFFUSIONSKOEFFIZIENTEN VON
HAPTEN-MODIFIZIERTEN REDOXSPEZIES ......................................................................................... 424.1.1 Biotin-Streptavidin als Modellsystem für molekulare Erkennung ......................................... 434.1.2 Synthese eines redoxmarkierten Biotinderivats ................................................................... 454.1.3 Messprinzip des Affinitätsassays ......................................................................................... 474.1.4 Messelektroden .................................................................................................................... 484.1.5 Signalamplifizierung durch Redoxrecycling.......................................................................... 504.1.6 Messapparatur ..................................................................................................................... 524.1.7 Messvorgang mit Redoxamplifizierung ................................................................................ 554.1.8 Detektion von Biotin-Streptavidin Bindungsereignissen über die Modulation des
Diffusionskoeffizienten von Fc-Biotin ................................................................................... 574.1.9 Sandwich-Assay zur Bestimmung biotinilierter Komplexe ................................................... 624.1.10 Miniaturisierung des Affinitätsassays ................................................................................. 65
4.2 AUFBAU, FUNKTIONSWEISE UND FABRIKATION DES MIKRODISPENSERS........................................... 704.2.1 Aufbau .................................................................................................................................. 704.2.2 Funktionsweise..................................................................................................................... 724.2.3 Fabrikationsverfahren........................................................................................................... 75
4.3 ELEKTROCHEMIE IN PIKOLITERTROPFEN......................................................................................... 914.3.1 Deposition und Konservierung von Pikolitertropfen in Öl ..................................................... 914.3.2 Elektrochemie in konservierten Pikolitertropfen ................................................................... 94
4.4 BESTIMMUNG DER DIFFUSIONSKOEFFIZIENTEN VON REDOXMOLEKÜLEN IN ELEKTROCHEMISCHEN
„TIME OF FLIGHT“-EXPERIMENTEN ............................................................................................... 1024.4.1 Dispensieren von Redoxspezies in die Nähe einer Elektrodenoberfläche mit
amperometrischer Detektion.............................................................................................. 1034.4.2 Abhängigkeit des Peakstroms von der Dispenserposition ................................................. 1054.4.3 Abhängigkeit des Peakstroms von der geschossenen Tropfenzahl .................................. 1074.4.4 Abhängigkeit des zeitlichen Auftretens der Strompeaks von der Dispenserposition ......... 110
Inhaltsverzeichnis II
4.4.5 Bestimmung von absoluten Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten......... 1124.4.6 Bestimmung von relativen Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten
durch Kalibrierung mit einer zweiten Redoxspezies .......................................................... 1194.4.7 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten mit Mikroelektroden in chrono-
amperometrischen Experimenten...................................................................................... 127
4.5 SCHNELLE CYCLISCHE VOLTAMMETRIE......................................................................................... 1314.5.1 Bestimmung relativer Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten mit
schneller cyclischer Voltammetrie...................................................................................... 1364.5.2 Untersuchung des Ausblutens von Redoxmediatoren aus Carbonpastenelektroden
mit schneller cyclischer Voltammetrie................................................................................ 145
4.6 MINIATURISIERUNG VON ELEKTROCHEMISCHEN AFFINITÄTSASSAYS DURCH MIKROLITERTROPFEN
ALS ELEKTROCHEMISCHE MESSZELLEN........................................................................................ 1494.6.1 Aufbau zur Verwendung von Mikrolitertropfen als elektrochemische Messzellen ............. 1494.6.2 Dispensieren von Redoxspezies in elektrochemische Tropfenzellen ................................ 1544.6.3 Miniaturisierter elektrochemischer Affinitätsassay in Tropfenzellen................................... 1584.6.4 Signalverstärkung durch Redoxamplifizierung................................................................... 160
4.7 DEPOSITION VON ENZYM-PIKOLITERTROPFEN AUF OBERFLÄCHEN ALS BASIS FÜR MINIATURISIERTE
MULTIANALYT-SENSORSTRUKTUREN ............................................................................................ 1644.7.1 Herstellung von Enzym-Mikrostrukturen ............................................................................ 1644.7.2 Visualisierung von immobilisierter Enzymaktivität mittels Elektrochemischer
Rastermikroskopie ............................................................................................................. 1694.7.3 Quantitative Bestimmung von Enzymsubstratkonzentrationen .......................................... 1754.7.4 Multianalyt-Sensorstrukturen.............................................................................................. 1784.7.5 Multischicht-Sensorstrukturen............................................................................................ 181
5 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK ....................................................................................... 188
6 EXPERIMENTELLER TEIL .............................................................................................................. 193
6.1 METHODEN.................................................................................................................................. 1936.1.1 Elektrochemische Messungen ........................................................................................... 1936.1.2 Herstellung von Mikroelektroden........................................................................................ 1936.1.3 Reinigung der Mikroelektroden .......................................................................................... 1946.1.4 Herstellung von Pseudo-Referenzelektroden..................................................................... 1946.1.5 Goldbedampfung von Siliziumwafern................................................................................. 1946.1.6 Modifizierung von Goldoberflächen mit selbstorganisierenden Monoschichten................. 1946.1.7 Immobilisierung von Enzymen auf Oberflächen................................................................. 195
6.2 SYNTHESEN................................................................................................................................. 1966.2.1 Synthese des ferrocenmarkierten Biotinderivats (Fc-Biotin) .............................................. 1966.2.2 Synthese biotinilierter Glucoseoxidase............................................................................... 197
6.3 CHEMIKALIEN .............................................................................................................................. 1986.3.1 Chemikalien........................................................................................................................ 1986.3.2 Enzyme und Proteine ......................................................................................................... 199
6.4 MATERIALIEN UND GERÄTE .......................................................................................................... 2006.4.1 Materialien .......................................................................................................................... 2006.4.2 Geräte ................................................................................................................................ 2016.4.3 Software ............................................................................................................................. 201
7 LITERATUR...................................................................................................................................... 202
Formelzeichen und Abkürzungen III
Formelzeichen
A Fläche
c Konzentration
∅ Durchmesser
D Diffusionskoeffizient [cm2 s-1]
E Potential
E0 Standardpotential
F FARADAY-Konstante (96487 C mol-1)
i Strom
KM MICHAELIS-MENTEN-Konstante
n Zahl der in einer Reaktion übertragenen Elektronen
NA Avogadro-Zahl (6.023 1023 mol-1)
Q Ladung
r Radius
t Zeit
U Unit, 1U = 1 µmol min-1, Substratumsatz des Enzyms beiSubstratüberschuss
V Volumen
v Potentialvorschubgeschwindigkeit [V s-1]
Formelzeichen und Abkürzungen IV
Abkürzungen
AFM* Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy)
Ag/AgCl Silber/Silberchlorid-Referenzelektrode
BSA Rinderserumalbumin (Bovine Serum Albumin)
CV Cyclische Voltammetrie / Cyclisches Voltammogramm
DMF Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonucleinsäure
FAD/FADH2 Flavin-Adenin-Dinucleotid (oxidierte/reduzierte Form)
Fc Ferrocen
GOD Glucoseoxidase
NAD+/NADH β-Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid (oxidiert/reduziert)
NHE Normalwasserstoffelektrode
PEGDGE Poly(ethylenglycol)-(400)-diglycidylether
RNA Ribonucleinsäure
SAM selbstorganisierende Monoschicht (Self-Assembled Monolayer)
SECM* Elektrochemische Rastermikroskopie (Scanning ElectrochemicalMicroscopy)
SCE gesättigte Kalomel-Referenzelektrode
SPA Streptavidin
STM* Rastertunnelmikroskopie (Scanning Tunneling Microscopy)
* Die Abkürzung wird sowohl für die Methode als auch für das entsprechende Gerät verwendet.
1 Einleitung 1
1 Einleitung
Die Biosensorik hat als eigenständiges Forschungsgebiet in den letzten Jahren stark
an Bedeutung gewonnen. Nachdem der Glucose-Biosensor die Forschungsebene
bereits vor längerer Zeit verlassen hat und sich im klinischen Bereich und im privaten
Bereich als portables Blutzucker-Messgerät für Diabetiker etabliert hat, werden nun
auch andere Biosensoren vermehrt in klinische und industrielle Anwendungen
integriert.
Durch die größer werdende industrielle Nutzung der Biosensoren gewinnt auch die
Kostenfrage stetig an Bedeutung. Aus diesem Grund werden auch im universitären
Bereich bei der Neuentwicklung von Biosensoren und Immunosensoren neben dem
Nachweis der prinzipiellen Machbarkeit immer häufiger ökonomische Faktoren, wie
Automatisierbarkeit des Messsystems oder günstige Produktions- und
Betriebskosten, berücksichtigt.
Die möglichst effektive Minimierung der letztgenannten Kostenfaktoren, z. B. durch
die Reduzierung des Verbrauchs an kostenintensiven biochemischen Komponenten,
hat eine deutliche Tendenz zur Verkleinerung der Messsysteme hervorgerufen.
Dieser Trend zur Miniaturisierung ist bereits soweit fortgeschritten, dass bei den
Strukturgrößen der makroskopische Bereich verlassen wurde und man z. B. durch
photolitographische Techniken bis in den Mikrometer- und Nanometer-Bereich
vorgedrungen ist.
Großes Forschungsinteresse wird in den analytischen Techniken momentan dem
High-Throughput-Screening (HTS) entgegengebracht, dem automatisierten Testen
von möglichst vielen Substanzen bzw. Proben in möglichst kurzer Zeit. HTS ist für
viele Bereiche, wie beispielsweise der pharmazeutischen Forschung, interessant, da
so in kürzester Zeit viele Substanzen oder Substanzgemische, die als potentielle
Medikamente oder biochemische Wirkstoffe in Frage kommen, auf ihre tatsächliche
Eignung geprüft werden können. Ein weiteres Anwendungsgebiet liegt in der DNA-
Analytik, bei der Bindungsereignisse zwischen einer großen Zahl von immobilisierten
DNA-Fragmenten oder Oligonucleotiden und DNA- oder RNA-Bestandteilen in der
Probe detektiert werden.
Als Mess- und Detektionsverfahren haben sich für Messsysteme im kommerziellen
Einsatz vor allem optische Verfahren etabliert. In neuester Zeit hat neben den
1 Einleitung 2
optischen Verfahren wie z. B. Photometrie, Fluoreszenzmessung oder Oberflächen-
plasmonenresonanz (Surface Plasmon Resonance, SPR), die Elektrochemie eine
immer größer werdende Bedeutung erlangt. Vor allem SPR und Fluoreszenz-
messgeräte haben einen Anschaffungswert, der um ein Vielfaches höher ist, als für
vergleichbare amperometrische Messsysteme. Die Elektrochemie zeichnet sich
gegenüber den optischen Methoden zudem durch einen vergleichsweise geringen
technischen Aufwand aus. Aufgrund der Einfachheit und Robustheit werden
elektrochemische Verfahren für viele Anwendungen wie z. B. portable
Blutzuckermessgeräte bevorzugt.
Der bereits erwähnte Trend zur Miniaturisierung von Sensorsystemen stellt jedoch
hohe Anforderungen an die elektrochemische Messtechnik. So müssen für eine
Miniaturisierung des Messsystems auch entsprechend miniaturisierte
elektrochemische Messsonden und aufgrund der verringerten Elektrodengröße auch
genügend sensitive Messverfahren zur Verfügung stehen. Die Integration von
mikroelektrochemischen Messverfahren in miniaturisierte Biosensorsysteme kann
dabei eine Schlüsseltechnologie zur Entwicklung von alternativen, kostengünstigen
Analysemethoden darstellen.
In dieser Arbeit werden neue Strategien und Verfahren zur Nutzung von
mikroelektrochemischen Messmethoden in miniaturisierten Enzym-Biosensor-
systemen, als auch zur Detektion von Bindungsereignissen zwischen
komplementären biologischen Erkennungsstrukturen in miniaturisierten Affinitäts-
assays vorgestellt.
2 Stand der Forschung 3
2 Stand der Forschung
Das Gebiet der Biosensorik lässt sich in die Bereiche metabolische Biosensoren und
Affinitätssensoren und -assays einteilen.
Metabolische Biosensoren sind dabei im weitesten Sinne alle Messsysteme, die auf
biologischen Erkennungselementen mit einem regenerierbaren Zyklus mit
Stoffumsatz basieren. Hauptsächlich werden Enzyme als biologische
Erkennungselemente verwendet und über die Bildung oder den Verbrauch einer an
der enzymatischen Reaktion beteiligten Substanz können Rückschlüsse auf die
Konzentration des Analyten gezogen werden.
Affinitätsassays und -sensoren hingegen beruhen auf der spezifischen molekularen
Erkennung und Bindung komplementärer biologischer Erkennungsstrukturen. Das
affinante Bindungsereignis wird detektiert und so das Vorhandensein des
spezifischen Erkennungselementes in der Probe nachgewiesen.
2.1 Aufbau und Anwendungen von metabolischen Biosensorenund Affinitätssensoren
Metabolische Biosensoren und Affinitätssensoren sind prinzipiell gleich aufgebaut
und bestehen aus folgenden Komponenten: Einer biologischen Erkennungsstruktur,
einem Transducer, der die biologische Information in ein messbares Signal
umwandelt, einem Detektor zur Erfassung des Messsignals und einem Schreiber
oder Computer zur Darstellung, Speicherung und Verarbeitung der Messwerte.
Die biologischen Erkennungselemente werden zur möglichst optimalen
Signalgewinnung in dichter Nähe des Transducers immobilisiert oder direkt an die
Transduceroberfläche gekoppelt.
Abbildung 2.1-1 oben zeigt die schematische Darstellung des Aufbaus eines
enzymbasierten Metabolismus-Biosensors. Der untere Teil der Abbildung zeigt eine
analoge Darstellung für einen Affinitätssensor.
2 Stand der Forschung 4
(2) (4)(3)(1)
Substrat
Produkt
(2) (4)(3)(1)
Abbildung 2.1-1 schematische Darstellung eines Metabolismus-Biosensors (oben) und einesAffinitätssensors (unten)(1) immobilisierte biologische Strukturen(2) Transducer(3) Detektor(4) Schreiber oder Computer
Bei den enzymbasierten metabolischen Biosensoren liegt ein Reaktionszyklus vor, in
dem das enzymspezifische Substrat zu seinem Produkt und gegebenenfalls ein
weiteres Cosubstrat zur Regeneration des Enzyms umgesetzt werden. Somit gibt es
eine Fülle von Detektionsmöglichkeiten der enzymatischen Reaktion. Es genügt,
wenn eine der in der Reaktion ständig gebildeten bzw. verbrauchten Substanzen
quantitativ bestimmt werden kann. Unter bestimmten Voraussetzungen ist auch eine
direkte Kommunikation des Enzyms mit dem Transducer möglich, z. B. kann,
entsprechend der Marcus-Theorie [1,2] für Elektronentransferprozesse von Enzymen
[3], die Regeneration des Enzyms über eine Elektronentransferreaktion mit einer
geeigneten Elektrode erfolgen [4-8].
2 Stand der Forschung 5
Die Anwendungen von metabolischen Biosensoren liegen vorwiegend in der
Bestimmung von Enzymsubstraten, wie z. B. Alkohol [9-11], Lactat [12-15], Glutamat
[16,17], Harnstoff [18,19], Cholesterin [20,21] und vielen weiteren biologisch
relevanten Substanzen. Den größten und wichtigsten Anteil der Anwendungen
stellen die Glucosesensoren [22-25] dar, die unter anderem in
Blutzuckermessgeräten für Diabetiker eingesetzt werden. Ein weiteres
Anwendungsgebiet von Biosensoren liegt in der Umweltanalytik [26] in der
Bestimmung von z. B. Phosphaten [27], Cyaniden [28] oder Pestiziden [29]. Auf die
genaue Funktionsweise mit Beispielen und Strategien zur Entwicklung von
enzymbasierten Biosensoren wird in einem späteren Kapitel eingegangen.
Bei Affinitäts- oder Immunosensoren wird die Bildung eines Komplexes zwischen
rekombinanten biologischen Erkennungsstrukturen, z. B. Antigen-Antikörper oder
Oligonucleotid-DNA, detektiert. Im Normalfall ist damit keine chemische oder
biochemische Reaktion mit Stoffumsatz verknüpft, so dass hier eine andere
Strategie verfolgt werden muss, um quantitative oder qualitative Aussagen über das
Vorhandensein eines der Bindungspartner machen zu können. Hierfür gibt es eine
Vielzahl verschiedener Ansätze, von denen einige im entsprechenden Kapitel näher
dargestellt werden. Die Hauptanwendungsbereiche von Affinitätssensoren und
Affinitätsassays liegen in der Quantifizierung von Immunreaktionen, wie dem
Nachweisen von Antigenen oder Antikörpern, als Kriterium für die Diagnose von
Krankheiten [30]. Durch den direkten Nachweis von biologischen Substanzen, auf
die Krankheiten zurückzuführen sind, können Affinitätssensoren für die Diagnose
von beispielsweise Hepatitis B [31], HIV [32], Herpes [33], oder Leukämie eingesetzt
werden. Weiterhin können physiologisch wichtige Substanzen und Rezeptoren, wie
beispielsweise Hormone [34,35], Myoglobin [36], Thyrotrophin [37], Cortison [38,39]
oder Biotin [40] bestimmt werden. Für den Nachweis von Drogenmissbrauch und für
Dopingtests sind Bestimmungsverfahren für Kokain [41,42], Amphetaminen [43] und
Morphinen [44,45] von Bedeutung.
2 Stand der Forschung 6
2.2 Elektrochemie in der Biosensorik
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit mikroelektrochemischen Methoden und
Detektionsverfahren in der Biosensorik. Da die Vielzahl von unterschiedlichen
Detektionsmethoden derart hoch ist, dass eine vollständige Beschreibung und
Aufzählung den Rahmen dieser Arbeit übersteigt, sind die folgenden Abschnitte auf
Biosensoren und Affinitätsassays mit elektrochemischen Messmethoden fokussiert.
Ein guter Überblick über die in der Biosensorik zum Einsatz kommenden
Messverfahren ist beispielsweise in [46] zu finden.
Die Elektrochemie spielt in der Biosensorik eine bedeutende Rolle, was sich in der
hohen Zahl an wissenschaftlichen Neu-Veröffentlichungen und regelmäßigen
Übersichtsartikeln auf den Gebieten der elektrochemischen Biosensoren [47-56] und
Affinitätsassays und -sensoren [57-61] wiederspiegelt. Vor allem die Forschung in
Richtung miniaturisierter elektrochemischer Messsysteme ist in letzter Zeit
intensiviert worden [62,63].
2.2.1 Enzymbasierte elektrochemische Biosensoren
Den Hauptanteil der enzymbasierten elektrochemischen Biosensoren stellen die
amperometrischen und voltammetrischen Sensoren dar. Daneben gibt es einige
Beispiele mit potentiometrischen [64,65] und konduktometrischen [66-68]
Messverfahren.
Als Enzyme werden in amperometrischen Biosensoren vor allem Enzyme aus der
Gruppe der Oxidoreduktasen, die in ihren katalytischen Reaktionen Elektronen
übertragen, verwendet. Das weitverbreitetste und wichtigste Enzym dieser Gruppe ist
dabei Glucoseoxidase (GOD), welche die Oxidation von β-D-Glucose zu
D-Glucono-δ-lacton katalysiert.
2 Stand der Forschung 7
Die prosthetische Gruppe der Glucoseoxidase ist Flavin-Adenin-Dinucleotid (FAD).
β-D-Glucose wird in einer 2-Elektronentransferreaktion zu D-Glucono-δ-lacton
oxidiert, während FAD zu FADH2 reduziert wird, wobei zwei Protonen der
β-D-Glucose aufgenommen werden. In einem zweiten Schritt wird das Enzym
regeneriert, indem das reduzierte FADH2 durch ein entsprechendes Cosubstrat
wieder zu FAD reoxidiert wird. Das natürliche Cosubstrat der Glucoseoxidase ist
dabei Sauerstoff, der zu Wasserstoffperoxid reduziert wird. Die Regeneration ist
dabei nicht auf Sauerstoff als Cosubstrat beschränkt. FADH2 kann auch durch eine
Vielzahl von Redoxmediatoren, wie z. B. Hexacyanoferrat, Ferrocencarbonsäure
oder verschiedene Osmium-Komplexe als artifizielle Cosubstrate reoxidiert werden
[69-73].
Die biologische Antwort des Enzyms auf eine gegebene Substratkonzentration muss
für ein amperometrisches Messverfahren durch den Transducer in eine messbare
Stromantwort transformiert werden. Als Transducer werden in der Amperometrie
üblicherweise Elektroden aus Edelmetallen, wie Platin oder Gold, oder aus
Kohlenstoff verwendet, auf die das Enzym mit geeigneten Immobilisierungstechniken
fixiert wird. Beispiele hierfür sind die Anbindung oder der Einschluss in eine Vielzahl
unterschiedlicher Polymerfilme, z. B. durch Sol-Gel-Verfahren [74], elektrochemisch
abscheidbare leitende Polymere, wie Polypyrrol [75-78] oder Polythiophen [79],
abscheidbare nichtleitende Polymere [80] oder die Verwendung von
Quervernetzungsreagenzien wie Glutaraldehyd [81] oder Polyethylenglycol-
diglycidylether [82]. Eine weitere elegante Methode zur Immobilisierung von
Biomolekülen stellen selbstorganisierende Monoschichten (Self-Assembled
Monolayer, SAM) mit funktionellen Kopfgruppen (z. B. Säure- Amino- oder
N-hydroxysuccinimidylester-Gruppen) dar. Thiole und Disulfide lagern sich spontan
β-D-Glucose + O2 GOD(FAD)
D-Glucono-δ-lacton + H2O2
Hydrolyse
Gluconsäure
Abbildung 2.2-1 Reaktionsschema der katalytischen Reaktion von Glucoseoxidase
2 Stand der Forschung 8
auf saubere Goldoberflächen an und bilden eine geordnete stabile Monoschicht aus.
An die funktionellen terminalen Gruppen der Monoschicht können Biomoleküle wie
Redoxproteine [83-85], Enzyme [85-87], DNA [88], Antigene oder Antikörper [89]
oder Biotin [90,91] gebunden werden.
Die Signaltransduktion bei amperometrischen Biosensoren erfolgt über eine
heterogene Elektronentransferreaktion zwischen der Messelektrode und einer an der
enzymatischen Reaktion beteiligten elektrochemisch aktiven Komponente. In
seltenen Einzelfällen kann die prosthetische Gruppe des Enzyms auch direkt über
eine Elektronentransferreaktion mit der Elektrodenoberfläche regeneriert werden
[5-7].
Für die amperometrische Bestimmung von Glucose mit Glucoseoxidase gibt es
folgende Möglichkeiten:
Wie im Reaktionsschema in Abbildung 2.2-1 gezeigt, wird bei der katalytischen
Umsetzung von Glucose zu Gluconolacton der im Lösungsmittel gelöste Sauerstoff
verbraucht und zu Wasserstoffperoxid umgesetzt. Beide Stoffe sind einer
elektrochemischen Messung zugänglich. Die Menge an Glucose kann somit über die
Messung der Abnahme an Sauerstoff oder die Bildung von Wasserstoffperoxid
bestimmt werden.
Die Messung der Sauerstoffabnahme in der enzymatischen Reaktion von
Glucoseoxidase war dabei eine der Pionierleistungen in der Entwicklung der
Biosensorik. Mit Hilfe der CLARK-Sauerstoffelektrode, die mit einer Membran zur
Immobilisierung von Glucoseoxidase versehen war, gelang die amperometrische
Bestimmung von Glucose über die Messung der Abnahme der Sauerstoff-
konzentration [92].
Eine weitere weniger aufwendige und häufiger genutzte Möglichkeit ist die
Bestimmung der Glucosekonzentration über die amperometrische Messung des in
der enzymatischen Reaktion gebildeten Wasserstoffperoxid [78,93]. Wasserstoff-
peroxid kann beispielsweise an Platinelektroden bei einem Potential von +600 mV
vs. Ag/AgCl mit diffusionskontrollierter Rate oxidiert werden:
H2O2 → O2 + 2H+ + 2e-
2 Stand der Forschung 9
Der durch die Oxidation des H2O2 an der Elektrode hervorgerufene Stromfluss ist
direkt mit der Konzentration an H2O2 und somit auch mit der Konzentration an
Glucose (vgl. Abbildung 2.2-2) korreliert.
2.2.2 Redoxmediatoren als artifizielle Cosubstrate in Biosensoren
Wie bereits erwähnt, lässt sich Sauerstoff als Cosubstrat der Glucoseoxidase durch
artifizielle Redoxmediatoren substituieren. Diese sind ebenfalls einer
amperometrischen Messung zugänglich, so dass über den Stromfluss,
hervorgerufen durch den heterogenen Elektronentransfer zwischen der
Messelektrode und dem entsprechenden Redoxmediator, Glucosekonzentrationen
bestimmt werden können. Artifizielle Redoxmediatoren bieten gegenüber Sauerstoff
als natürlichem Cosubstrat den Vorteil, dass sie z. T. bei erheblich niedrigeren
Potentialen als Wasserstoffperoxid an Elektrodenoberflächen oxidiert bzw. reduziert
werden können. Hiermit können Interferenzen durch Cooxidation von
Probebestandteilen, wie z. B. Ascorbinsäure, Harnsäure, Cystein oder Paracetamol,
die ebenfalls bei einem Elektrodenpotential von +0.6 V vs. Ag/AgCl oxidiert werden,
wirkungsvoll eliminiert werden [69]. Weiterhin kann durch eine genügend hohe
Konzentration an Redoxmediator eine eventuelle Limitierung der enzymatischen
GOD
Glucose Gluconolacton
O2 H2O2
+600 mV
FAD FADH2
Abbildung 2.2-2 Schema der Bestimmung von Glucose durch amperometrische Messung vonenzymatisch gebildetem H2O2 an einer Elektrode
2 Stand der Forschung 10
Reaktion durch das Cosubstrat verhindert werden [94]. Voraussetzung dafür ist,
dass die Geschwindigkeitskonstante des Elektronentransfers zwischen Enzym und
Redoxmediator (angenommen sei eine Kinetik erster Ordnung) hoch sein muss, so
dass diese gegenüber dem natürlichem Cosubstrat bevorzugt wird. Vor allem bei
den Sensoren auf der Basis von Oxidasen kann die Konkurrenz zwischen Sauerstoff
und Redoxmediator zu einer mehr oder weniger stark ausgeprägten Abhängigkeit
von der Sauerstoffkonzentration führen.
Inkorporiert man die Redoxmediatoren mit den Enzymen in einem Film oder einer
Polymermatrix auf der Elektrodenoberfläche, so erhält man sogenannte reagenzlose
Biosensoren [78,95], die ohne den Zusatz von Redoxmediatoren oder anderen
Reagenzien direkt in einer Probelösung messen können. Dabei erfolgt der
Elektronentransfer vom Enzym über die im Film eingeschlossenen Redoxmediatoren
zur Elektrodenoberfläche [96].
Weiterhin können mit Hilfe künstlicher Redoxmediatoren auch Enzymreaktionen
amperometrisch verfolgt werden, in denen das Cosubstrat nicht direkt an der
Elektrodenoberfläche umgesetzt werden kann. Dies ist z. B. bei Enzymreaktionen
der Fall, bei denen das NAD+/NADH-System (NAD = β-Nicotinsäureamid-Adenin-
Dinucleotid) als Cosubstrat genutzt wird. Bekanntestes Beispiel hierfür ist die Gruppe
der NAD-abhängigen Dehydrogenasen. Bei der Oxidation von NADH zu NAD+ an
reinen Edelmetallelektroden ist Elektrodenfouling ein bekanntes Problem,
hervorgerufen durch die Bildung radikalischer Intermediate während der zwei
separaten Ein-Elektron-Transferprozesse [97]. Zudem findet die anodische Oxidation
von NADH zu NAD+ an reinen Metalloberflächen bei hohen Überpotentialen von
mehr als +0.6 V vs. SCE statt [98], so dass Interferenzen durch elektrochemisch co-
oxidierbare Interferenzen, die in komplexen Analyt-Matrizes vorkommen, auftreten.
Ein Ansatz zur Lösung dieser Probleme ist, das Elektrodenpotentials, das zur
Oxidation von NADH nötig ist, zu senken und gleichzeitig einen simultanen Zwei-
Elektronen-Transfer zu gewährleisten. Beide Ziele können durch die Immobilisierung
von geeigneten Redoxmediatoren auf der Elektrodenoberfläche erreicht werden. Die
Redoxmediatoren müssen dabei in der Lage sein, den Elektronentransfer von NADH
zur Elektrodenoberfläche zu modulieren und so einen simultanen Zwei-
Elektronentransfer zu ermöglichen [99].
2 Stand der Forschung 11
Beispiele für geeignete Mediatoren sind Methylengrün [100], Methylenblau
(Phenothiazin) [101,102] oder Nilblau (Phenoxazin) [103-106]. Weiterhin konnte
gezeigt werden, dass Polymerfilme, die durch elektrochemische Polymerisation von
Chinon-modifiziertem Pyrrol [107] oder Osmium enthaltenden Redoxpolymeren [108]
auf Elektrodenoberflächen abgeschieden wurden, eine hohe Aktivität für die
elektrokatalytische Oxidation von NADH zeigen.
2.2.3 Elektrochemische Affinitätsassys
Elektrochemische Affinitätsassays und Affinitätsassays allgemein lassen sich
entsprechend ihrer Signaltransduktion in direkte und indirekte Formate einteilen.
In direkten Verfahren ist die Verfolgung des Bindungsprozesses kontinuierlich und in
Echtzeit möglich, wofür aber zumeist hochentwickelte und teure Systeme wie
Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) [109-111] oder piezoelektrische Techniken
[112-114] erforderlich sind. Mit SPR ist zudem ein einfache Bestimmung von
kinetischen Konstanten, wie Affinitäts- oder Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten
möglich [115]. Die piezoelektrische Techniken auf der Basis von Quarz-Mikrowaagen
weisen eine sehr hohe Sensitivität auf, haben aber häufig aufgrund ihrer hohen
Querempfindlichkeit durch unspezifische Adsorption nur eine vergleichsweise
geringe Spezifität.
In indirekten, kompetitiven Assays wird der zu bestimmende Analyt oder Antikörper
mit einer Markierung (z. B. redoxaktive Gruppen, Enzyme, Fluoreszenzmarker oder
radioaktive Markierungen) versehen, um das komplementäre Bindungsereignis zu
detektieren. Ein Vergleich der verschiedenen Markierungsmethoden ist z. B. in [116]
zu finden. Die markierten Komplexe werden der Probe zugesetzt und konkurrieren
mit dem Analyten um eine begrenzte Anzahl an Bindungsstellen. Anschließend wird
die Intensität bzw. Menge der gebundenen Markierung bestimmt, über die auf die
Konzentration des Analyten geschlossen werden kann. Bei maximaler Intensität sind
die Bindungsstellen nur mit markierten Komplexen belegt, was bedeutet, dass der
entsprechende Analyt nicht in der Probe vorhanden ist.
2 Stand der Forschung 12
Das bekannteste und weitverbreitetste Verfahren für indirekte, kompetitive
Affinitätsassays sind die sogenannten ELISA-Assays (ELISA = Enzyme Linked
Immunosorbent Assay), deren Messprinzip in Abbildung 2.2-3 schematisch
dargestellt ist.
Die quantitative Bestimmung des im ELISA-Assay enzymatisch gebildeten Produktes
kann dabei über elektrochemische oder photometrische Messverfahren erfolgen.
Häufig verwendete Markerenzyme sind Alkalische Phosphatase [117-119],
Peroxidasen [120-122], oder Glucoseoxidase [120,123,124].
Ein anderes indirektes Verfahren besteht in der Verwendung markierter sekundärer
Antikörper, über die das primäre Bindungsereignis zwischen Analyt und auf einer
Matrix immobilisierten Bindungsstellen detektiert werden kann. Die sekundären
Antikörper sind dabei spezifisch für den Analyten und können nur über die
Verbrückung durch den Analyten an die limitierte Zahl von Bindungsstellen
anbinden. Je höher das Intensitätssignal der Markierung des sekundären Antikörpers
ist, desto höher ist die Analytkonzentration in Lösung.
Affinitätsassays werden weiterhin in homogene und heterogene Formate unterteilt. In
heterogenen Assayformaten müssen vor dem Messprozess die spezifisch
gebundenen Erkennungselemente von ungebundenen getrennt werden, wozu
verschiedene Wasch- und Separationsschritte nötig sind. Homogene Assayverfahren
beruhen auf der Signaländerung einer Markierung, hervorgerufen durch die Bildung
E
E
E
E E E E E E
S PS PS
P
E
Abbildung 2.2-3 schematische Darstellung des Messprinzips eines ELISA-AssaysAnalyt (schwarz) und enymmarkierter Analyt (grün), welcher der Probezugesetzt wird, konkurrieren um eine begrenzte Anzahl an Bindungsstellen(orange). Nicht gebundene Spezies werden abgewaschen. Das EnzymsubstratS wird zugesetzt. Über die Bestimmung des enzymatisch gebildeten Produkts Pkann auf die in der Probe enthaltene Menge an Analyt geschlossen werden.
2 Stand der Forschung 13
eines Immunkomplexes in Lösung. Das Messsignal wird dabei direkt in der
Reaktionslösung ohne vorherige Separationsschritte detektiert. Als Abwandlung der
homogenen Formate sind die pseudohomogenen Verfahren zu betrachten, die
ebenfalls ohne Separationsschritte auskommen, bei denen die prinzipielle
Immunreaktion aber an einer Elektrodenoberfläche stattfindet [59].
Elektrochemische Techniken haben breite Anwendung gefunden, um in kompetitiven
Assays mit enzymmarkierten Erkennungselementen komplementäre Bindungs-
ereignisse zu detektieren. Beispielsweise wurden elektrochemische Affinitätsassays
entwickelt, die auf der Verwendung von Antikörper, die mit Alkalischer Phosphatase
[118,119], Meerrettich-Peroxidase [121,122] oder Glucoseoxidase [123,124] markiert
sind, und der amperometrischen Messung von elektroaktiven Spezies, die in der
enzymkatalysierten Reaktion in Gegenwart des spezifischen Enzymsubstrats
gebildet werden, basieren.
Mit elektrochemischen Methoden gelingt auch die direkte elektrochemische
Detektion von molekularen Erkennungsprozessen, wobei die meisten der
beschriebenen Systeme sehr speziell auf einen Analyten ausgelegt sind, so dass
eine Adaption an andere Analyte oder Erkennungssysteme meist nicht möglich ist.
So wurden homogene elektrochemische Affinitätsassays für das komplementäre
Biotin-Avidin-System entwickelt. Dazu wurde Biotinhydrazid [125] oder Biotinderivate
mit Daunomycin [126,127] oder Nilblau [128] als elektrochemisch aktive
Markierungen verwendet. Bei entsprechenden Elektrodenpotentialen können diese
Redoxspezies auf der Elektrodenoberfläche angereichert und in einer nachfolgenden
linearen Potentialrampe oxidiert oder reduziert werden (Stripping Voltammetrie).
Wird jedoch der Biotin-Teil der redoxaktiven Moleküle durch Avidin erkannt und
gebunden, so wird der elektrochemisch aktive Teil ebenfalls mit in die
Bindungstasche gezogen, was zu einem Verlust der elektrochemischen Aktivität
führt. Die Abnahme des Stromes im Stripping Voltammogramm kann mit der
Konzentration an Avidin korreliert werden und dient als Basis für den Affinitätsassay.
Etwas abgewandelte Versionen dieses Prinzips verwenden N-Iodoacetyl-N-biotin-
hexylendiamin [129] und mit Cystein markiertes Biotin [130]. Quecksilber(II) wurde
dabei als Marker zur Detektion des Bindungsereignisses zwischen Biotin und Avidin
genutzt. Die Oxidationswelle von Quecksilber im Stripping Voltammogramm
erniedrigt sich, wenn der Cystein-Teil des Biotinderivats Quecksilber(II) komplexiert.
2 Stand der Forschung 14
Ist Avidin in der Lösung, so bindet das Cystein-Biotin an Avidin, so dass
Quecksilber(II) nicht komplexiert werden kann und keine Abnahme des Quecksilber-
Peaks zu beobachten ist. Ein analoges Messprinzip nutzt mit Dopamin markiertes
Biotin [131]. Freies dopamin-markiertes Biotin besitzt eine elektrokatalytische
Aktivität für die Oxidation von NADH. Nach Bindung an Avidin verliert der Dopamin-
Teil seine elektrokatalytische Aktivität, was zu einer Verminderung des NADH-
Oxidations-Stroms führt.
In einem anderen Ansatz zur Detektion von Biotin-Avidin-Interaktion wurden mit
Streptavidin modifizierte Goldkolloide verwendet [132]. Auf der Elektrodenoberfläche
wird biotiniliertes Rinder-Serum-Albumin (Bovine Serum Albumin, BSA) immobilisiert.
Die Elektrode wird mit Streptavidin und streptavidin-modifizierten Goldkolloiden
inkubiert. Anschließend werden in 0.1 M HCl Lösung die an der Oberfläche
gebundenen Goldkolloide elektrochemisch in Gold-Chloro-Komplexe überführt. Die
Intensität des Reduktionspeak der Gold-Chloro-Komplexe im nachfolgenden linearen
Potentialscan stellt das Signal des Assays dar und kann mit der Konzentration an
Streptavidin in der Inkubationslösung korreliert werden.
Bindungsereignisse zwischen Antigen und Antikörpern konnten direkt mit Hilfe von
Glucoseoxidase oder BSA, die mit Ferrocengruppen und Digoxin modifiziert wurden,
detektiert werden [133,134]. Nach Inkubation mit einem Anti-Digoxin Antikörper
konnte eine Stromabnahme beobachtet werden. Eine Verstärkung des Stromsignals
konnte durch Mehrfachmarkieren der Proteine mit Ferrocen und im Falle von
Glucoseoxidase zusätzlich durch enzymatische Verstärkung durch den Zusatz von
Glucose erreicht werden.
Eine andere Möglichkeit, komplementäre Bindungsereignisse mit elektrochemischen
Methoden direkt zu detektieren basiert auf der Intercalation eines redoxaktiven
Komplexes, z. B. Actinomycin, zwischen DNA-Doppelsträngen, was zu einer
Verringerung des Diffusionskoeffizienten und somit zu einem verringerten
polarographischen Stromsignal führt [135].
2 Stand der Forschung 15
2.3 Molekulare Erkennung zwischen Biotin und Streptavidin
In der Affinitäts- und Immunosensorik sind Verfahren für die Quantifizierung der
verschiedensten Immun- und Erkennungsreaktionen entwickelt worden. In der
folgenden Tabelle ist ein Überblick über die verwendeten molekularen
Erkennungssysteme gegeben.
Molekulares Erkennungselement Analyt / Bindungspartner
Antikörper
polyklonal Antigen / Hapten
monoklonal Antigen / Hapten
Bindeproteine
Protein A und G Immunglobulin G (IgG)
Avidin / Streptavidin Biotin, biotinilierte Substanzen
Singlestrand-Binding Protein (SSB) einsträngige DNA (ssDNA)
Nucleinsäuren komplementäre Nucleinsäuren
Lectine Kohlenhydrate / Glycoproteine /Zelloberflächen
Lipide hydrophobe Substanzen
Rezeptoren z. B. Neurotransmitter / Inhibitoren
Enzyme Inhibitoren / Substrate / Cosubstrate
Das Hauptanwendungsgebiet liegt in der Quantifizierung der molekularen Erkennung
zwischen Antigenen und Antikörpern. Die Herstellung von Antikörpern mit
immunologischen Methoden ist jedoch ein aufwendiger Prozess, so dass Antikörper
recht hohe Produktionskosten haben. Aus diesem Grunde werden für die
Entwicklung neuer Assayverfahren häufig zunächst Modellsysteme anstelle des
Antigen-Antikörper-Systems verwendet. Erweist sich das Verfahren als erfolgreich,
so sind beim Übergang vom Modellsystem zum realen System meist nur geringe
Adaptionen nötig, wodurch Entwicklungskosten gespart werden können.
2 Stand der Forschung 16
Ein Modellsystem, das häufig für die Entwicklung neuer Assaytechnologien
verwendet wird, ist das Biotin-Avidin bzw. Biotin-Streptavidin-System, das im
Folgenden kurz vorgestellt werden soll.
Avidin und Streptavidin dienen dabei nicht nur als Modellsysteme, sondern sind
wichtige nicht-immunologische molekulare Erkennungssysteme, die in einer Vielzahl
von bioanalytischen Verfahren [136-138] und der klinischen Diagnostik, z. B. in
Immunoassays, der DNA-Diagnostik und der Immunohistochemie, verwendet
werden [139].
Avidin und Streptavidin sind intensiv erforscht worden. So sind die Gensequenzen
beider Proteine bekannt, kloniert und in E. Coli exprimiert worden [140,141]. Ebenso
aufgeklärt sind die primären Aminosäuresequenzen und die dreidimensionalen
Strukturen [140,142,143]
Avidin ist ein in Eiweiß vorkommendes Glycoprotein, das aus vier identischen
Untereinheiten aus je 128 Aminosäureresten, inklusive 2 Cysteinresten, besteht
[144]. Das Molekül hat eine sehr hohe konformale Stabilität und besitzt nur eine
Disulfidbindung zwischen den Peptidketten [145]. Streptavidin, ein zu Avidin
homologes Protein aus dem Actinobakterium Streptomyces avidinii [146], hingegen
besitzt keine Kohlenhydrateigenschaften und ist frei von Aminosäureresten mit
Schwefelatomen [147,148]. Obwohl Streptavidin 30 Aminosäurereste mehr als
Avidin besitzt, weist es eine fast identische globuläre Tertiärstruktur auf [149].
Avidin stellt 0.05 % der Proteinmenge in Eiweiß dar. Bereits 1898 wurde festgestellt,
das ungekochtes Eiweiß toxisch ist [150] und in einem Vitamindefizit resultiert [151].
Später wurde entdeckt, dass Avidin Biotin (Vitamin H) bindet und somit dessen
Absorption im Darm verhindert. Im Falle von Mikroorganismen wird die Aufnahme
von Biotin aus dem Wachstumsmedium unterdrückt, was Avidin antibakterielle
Eigenschaften verleiht. Streptavidin besitzt gleiche Bindungseigenschaften für Biotin
wie Avidin.
Jedes Streptavidin- und Avidinmolekül ist in der Lage vier Moleküle D-Biotin mit einer
ungewöhnlich hohen Affinität (Dissoziationskonstante KD = 10-15 M) und Spezifität
über nichtkovalente Wechselwirkungen zu binden [146,147]. Die hohe Affinität kann
dabei auf mehrere Faktoren zurückgeführt werden, wie die Verdrängung von
gebundenem Wasser, die multiple Ausbildung von Wasserstoffbrücken, van der
Waals-Wechselwirkungen zwischen Heteroatomen des Biotins und der
2 Stand der Forschung 17
Bindungstasche des Proteins (z. B. zwischen dem Schwefelatom des Biotin und
Threonin-Resten in der Bindungstasche), zusammen mit der Ausrichtung eines
Oberflächen-Polypeptidrings, der das Biotin im Inneren des Proteins einschließt. Die
genauen strukturellen Gründe und Ursachen für die hohe Bindungsaffinität zwischen
Biotin und Streptavidin sind in der Literatur intensiv erforscht und beschrieben
worden [143,152]. Die Stärke der Streptavidin-Biotin Wechselwirkung wurde z. B.
durch Kraftmessungen mit Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy, AFM)
bestimmt [153,154], während die Bindungskinetik u. a. mit Oberflächenplasmonen-
resonanz untersucht wurde [155].
Streptavidin gilt als eines der stabilsten Proteine. So behält es seine funktionellen
Eigenschaften selbst bei hohen Temperaturen, extremen pH-Werten und in der
Gegenwart von hohen Konzentrationen an denaturierenden Reagenzien oder
organischen Lösungsmitteln und besitzt eine hohe Stabilität gegenüber Proteolyse.
Diese besonderen Eigenschaften von Streptavidin in Kombination mit der
Möglichkeit Biotin in verschiedene biologische Materialien und Substanzen zu
inkorporieren, hat Streptavidin zu einem der variabelsten und meistverwendeten
Affinitäts-Tag-Systeme (Tag (engl.) = (angebrachte) Erkennungsmarkierung) in
biologischen Anwendungen gemacht.
Die Klonierung und die Fusionierung des Streptavidin-Gens mit anderen Genen
durch Sano und Cantor im Jahr 1990 öffnete den Weg zum „Genetic Engineering“
von Streptavidin [156]. Zur Erweiterung des Anwendungsgebiets wurde Streptavidin
genetisch verändert, um so eine besonders hohe Affinität zu bestimmten Protein-
Tags, z. B. StrepTag [157-159], oder eine reduzierte Affinität zu Biotin [160,161] zu
erhalten. Weiterhin gelang die Herstellung eines rekombinanten Fusionsproteins aus
Streptavidin und Protein A, das beide Funktionalitäten aufweist [160]. Protein A
bindet an die unspezifische Fc-Domäne von Immunglobulin G-Antikörpern (IgG) ohne
deren Fähigkeit Antigene zu binden einzuschränken [162] und wird deshalb häufig in
immunologischen Anwendungen für die Aufreinigung oder untergruppenspezifische
Bestimmung von Antikörpern benutzt.
2 Stand der Forschung 18
2.4 Miniaturisierung von elektrochemischen Messsystemen
Wie bereits einleitend erwähnt, besteht zunehmendes Interesse an der
Miniaturisierung von Biosensoren und Affinitätsassays. Hierzu müssen miniaturisierte
Messsonden und Verfahren zur Herstellung entsprechend kleiner Sensorstrukturen
entwickelt werden. Ein wichtiger Schritt in der Miniaturisierung elektrochemischer
Messsysteme war die Entwicklung von Mikroelektroden und der Elektrochemischen
Rastermikroskopie (Scanning Electrochemical Microscopy, SECM).
2.4.1 Mikroelektroden
In der Elektrochemischen Rastermikroskopie werden Scheibenmikroelektroden, d. h.
Elektroden, deren Durchmesser der aktiven Elektrodenoberfläche kleiner als 50 µm
ist, als Messsonden verwendet. Durch das Verständnis des voltammetrischen
Verhaltens von Mikroelektroden wurde die fundamentale Grundlage für die
Entwicklung des SECM geschaffen.
Scheibenmikroelektroden mit Durchmessern von 50 µm und weniger weisen in
voltammetrischen Experimenten ein von Makroelektroden (∅ > 100 µm)
abweichendes Verhalten auf, das intensiv theoretisch behandelt worden ist, und in
der Literatur in vielen Publikationen und Übersichtsartikeln beschrieben wird
[163-169].
Im Folgenden soll eine kurze Zusammenfassung mit den wichtigsten Grundlagen
gegeben werden.
Generell spricht man von Mikroelektroden, wenn in der Zeitskala des Experimentes
die Ausdehnung der an sich schon kleinen Diffusionsschicht größer wird, als die
charakteristische Dimension der Elektrode [170]. Im Falle von Scheibenelektroden
handelt es sich hierbei um den Radius der aktiven Elektrodenoberfläche. An
stromdurchflossenen Scheibenmikroelektroden entwickeln sich innerhalb kürzester
Zeit sehr große Diffusionsschichten. Der anfängliche zeitabhängige Massentransport
zur Elektrodenoberfläche geht dabei in einen stationären Massentransport über.
Diffusionskanteneffekte an den Grenzflächen zwischen aktiver Elektrodenoberfläche
und isolierender Ummantelung kommen bei den kleinen Ausmaßen von
Mikroelektroden besonders zum Tragen, was bedeutet, dass zusätzlich zur üblichen
2 Stand der Forschung 19
axialen Diffusion eine radiale Diffusionskomponente parallel zur Oberfläche wirksam
wird. Die anfangs eindimensionalen Diffusionsfelder wandeln sich in räumliche um.
Daraus ergibt sich einerseits, dass pro Zeit- und Flächeneinheit wesentlich mehr
elektroaktive Spezies die Elektrodenoberfläche erreichen als im Falle planarer
Diffusion. Andererseits bedingt das durch die Elektrodengeometrie in einem
vorgegebenen Raumwinkel anwachsende Volumen des Diffusionsfeldes, dass der
Teilchenfluss in und aus Raumvolumenelementen mit fortschreitender Zeit stationär
wird und die Diffusionsschicht nicht weiter anwächst.
Der Massentransportkoeffizient m, der ein Maß für die Transportgeschwindigkeit der
Teilchen in der stationären Diffusionsschicht darstellt, verhält sich in einem
sphärischen Diffusionsfeld umgekehrt proportional zum Elektrodenradius (m = D r-1
[cm s-1] D = Diffusionskoeffizient). Daraus resultiert, dass bei Mikroelektroden trotz
absolut abnehmender Ströme die Stromdichten gegenüber konventionellen
Makroelektroden um viele Größenordnungen ansteigen, wodurch sich das Verhältnis
vom FARADAY-Strom zu kapazitivem Strom erheblich verbessert.
Die geringen kapazitiven Stromanteile, die dementsprechend rasch abklingen,
erlauben die Verwendung von hohen Vorschubgeschwindigkeiten und ermöglichen
so Messungen in sehr kleinen Zeitdomänen, wie sie für Untersuchungen schneller
Elektronentransferreaktionen und Reaktionsmechanismen mit schneller cyclischer
Voltammetrie erforderlich sind [171].
Die speziellen Eigenschaften von Mikroelektroden werden besonders in
voltammetrischen Experimenten deutlich. Hierbei wird ausgehend von einem
Anfangswert das Potential der Arbeitselektrode zeitlich linear bis zu einem Endwert
verändert und der resultierende Stromfluss gemessen. Führt man den
Potentialvorschub nach Erreichen des Endpotentials wiederum linear bis zum
Anfangswert zurück, so spricht man von cyclischer Voltammetrie [172,173]. Die
Messzeitskala wird dabei über die Potentialvorschubgeschwindigkeit v = ∆E / ∆t
festgelegt.
In Abbildung 2.4-1 sind als Vergleich cyclische Voltammogramme einer Makro- und
einer Mikroelektrode gezeigt.
2 Stand der Forschung 20
0 100 200 300 400 500
-20
-10
0
10
20
30
i [µ
A]
E vs. Ag/AgCl [mV]0 100 200 300 400 500
-5
0
5
10
15
20
i [nA
]
E vs. Ag/AgCl [mV]
Abbildung 2.4-1 Beispielhafte cyclische Voltammogramme einer Makroelektrode (∅ = 2.5 mm)(links) und einer Mikroelektrode (∅ = 10 µm) (rechts) bei gleicherVorschubgeschwindigkeit (20 mV/s) und gleicher Konzentration an K4[Fe(CN)6]
Die unterschiedlichen Diffusionsfelder von Makro- und Mikroelektroden spiegeln sich
im unterschiedlichen Verlauf ihrer Cyclovoltammogramme wieder.
Im Folgenden soll der allgemeine Fall einer heterogenen Elektronentransferreaktion
an Makroelektroden behandelt werden:
OX + e- RED
Mit zunehmenden Potential nimmt entsprechend der NERNST-Gleichung
]d[Re
]Ox[log
n
059.0EE o += (Gleichung 4.2-1)
die Oberflächenkonzentration an OX ab und von RED zu, wodurch der Gradient und
damit auch der heterogene Ladungstransfer durch die Reduktion von OX zu RED
anwächst. Nach Überschreiten des E0-Potentials wird die Oberflächenkonzentration
von OX verschwindend gering und der Strom erreicht ein Maximum, dessen Höhe
durch die RANDLES-SEVCIK-Gleichung beschrieben wird [172,174]:
ip = (2.69 105) n3/2 A D1/2 v1/2 c (Gleichung 4.2.-2)
Der Konzentrationsgradient an der Elektrodenoberfläche wird nahezu unabhängig
vom Potential. Der Stromfluss wird jetzt durch den Nachtransport von umsetzbarer
Spezies durch das planare Diffusionsfeld zur Elektrodenoberfläche bestimmt. Die
Diffusionsschicht dehnt sich dabei weiter in die Lösung aus, was zum Absinken des
Stroms führt. Der abfallende Stromverlauf bei Makroelektroden kann dabei durch die
2 Stand der Forschung 21
COTTRELL-Gleichung beschrieben werden [172,174]:
π=
t
AnFcDi
2/1
t (Gleichung 4.2-3)
Im Unterschied dazu erfolgt im Falle von Mikroelektroden der Massentransport durch
ein hemisphärisches Diffusionsfeld. Die hemisphärische Diffusion führt auf die
Fläche bezogen zu einem erhöhten und sich schnell einstellenden Massentransfer
zur Elektrodenoberfläche. Der erhöhte Massentransfer durch ein stationäres
Diffusionsfeld führt dazu, dass es vor der Elektrodenoberfläche nicht zu Verarmung
an umsetzbarer Spezies kommt, so dass bei Potentialen oberhalb des
Normalpotentials keine Abnahme des Stromflusses auftritt, sondern sich ein
konstanter, potentialunabhängiger Stromfluss einstellt. Die Cyclovoltammogramme
von Mikroelektroden haben daher eine sigmoide Form, die polarographischen Stufen
ähnelt.
Die Einstellzeit bis zu einem stationären Zustand des Diffusionsfeldes vor der
Elektrodenoberfläche beträgt bei einem durchschnittlichen Diffusionskoeffizienten
von D = 10-6 cm2 s-1 und einem Elektrodendurchmesser von 1 µm ca. 0.01 s und bei
einem Durchmesser von 10 µm ca. 1.3 s [175]. Die Einstellzeit ist für die
Elektrochemische Rastermikroskopie insofern von Bedeutung, da sie festlegt, mit
welcher Geschwindigkeit die Mikroelektrode über die zu untersuchende Oberfläche
bewegt werden kann.
In umfangreichen theoretischen Studien [175-177] konnte gezeigt werden, dass die
stationären, zeitunabhängigen Grenzströme is für Kugel-, Halbkugel-, und
Scheibenmikroelektroden mit (hemi)sphärischen Diffusionsfelder mit einer
identischen Beziehung zu beschreiben sind, sofern man einen Oberflächen-
durchmesser d einführt:
is = 2nFcDd (Gleichung 2.4-4)
Für den Oberflächendurchmesser ergibt sich für die Kugel d = 2πr, für die Halbkugel
d = πr und für die Scheibenelektrode d = 2r (mit r = Radius der aktiven Elektroden-
oberfläche).
Somit ergibt sich für den stationären Grenzstrom is einer Scheibenmikroelektrode:
is = 4nFcDr (Gleichung 2.4-5)
2 Stand der Forschung 22
2.4.2 Elektrochemische Rastermikroskopie
Das Prinzip der Elektrochemischen Rastermikroskopie (SECM) wurde Mitte der
achtziger Jahre von Engstrom et al. [178] erfunden und von Bard et al. [179,180]
Ende der achtziger Jahre zur Methode weiterentwickelt. Aber erst in der letzten Zeit
hat die Elektrochemische Rastermikroskopie als elektroanalytische Untersuchungs-
methode stärker an Bedeutung gewonnen, was aktuelle Übersichtsartikel
verdeutlichen [181-186].
Das SECM gehört zu der Gruppe der Rastersonden-Mikroskopien (Scanning Probe
Microscopy), welche auf dem Abrastern einer Probenoberfläche mit einer
miniaturisierten Messsonde, die in alle drei Raumrichtungen mit hochauflösenden
Positioniersystemen bewegt werden kann, beruht. Als Messdaten werden dabei der
Ort bzw. die Position der Sonde zusammen mit dem lokal aufgenommenen
Messsignal der Sonde registriert. Mittels spezieller Software können die Messdaten
in Bilder umgewandelt werden.
Der wesentlicher Unterschied zwischen der Elektrochemischen Rastermikroskopie
und ähnlichen Techniken wie Rastertunnelmikroskopie (Scanning Tunneling
Microscopy, STM) oder Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy, AFM) ist,
dass mit dem SECM zusätzlich zur Topographie der Probe auch deren chemische
Eigenschaften untersucht werden können. Allerdings ist das Auflösungsvermögen
des SECM um mehrere Größenordnungen schlechter als das des STM und AFM,
die bis in den atomaren Bereich vordringen können.
Das Auflösungsvermögen des SECM wird hauptsächlich durch die Größe des
Durchmessers der aktiven Elektrodenoberfläche der als Messsonden verwendeten
Mikroelektroden und deren Abstand zur Probenoberfläche bestimmt [187].
Momentan ist man in der Lage Ultramikroelektroden herzustellen, deren
Durchmesser sich im unteren Mikrometerbereich und Sub-Mikrometerbereich
befinden [188-194], so dass auch das Auflösungsvermögen des SECM in diesem
Bereich anzusiedeln ist.
Im einfachsten Untersuchungsmodus des SECM wird eine Mikroelektrode in einer
Elektrolytlösung, die eine reversibel oxidierbare und reduzierbare Spezies
(Redoxmediator) enthält, mit konstanter Geschwindigkeit und konstanter
Höhenposition über die zu untersuchende Probenoberfläche bewegt. Die
Mikroelektrode wird dabei mit einem Potential belegt, so dass die Redoxspezies
2 Stand der Forschung 23
diffusionskontrolliert an der Elektrodenoberfläche umgesetzt wird. Der resultierende
FARADAY-Strom stellt das Messsignal im SECM-Experiment dar.
Die Größe dieses Stroms enthält Informationen über Topographie [195], lokale
Leitfähigkeit [196], Konzentrationsprofile [197] und chemisch aktive Bereiche der
Oberfläche (sogenannte hot spots) [198].
Ein weiteres Anwendungsgebiet des SECM ist die lokale Modifikation von
Oberflächen. So konnten mit dem SECM Metalle [199,200] und Halbleiter [201,202]
geätzt werden, sowie leitende [203-205] und nichtleitende Polymere [206] und
Metalle [207] abgeschieden werden. Weiterhin kann das SECM für die Bestimmung
von Diffusionskoeffizienten [208] und für kinetische Studien des Elektronentransfers
[209,210] und chemischer Reaktionen [211] ohne laterale Auflösung genutzt werden.
In neuerer Zeit ist das SECM auch vermehrt zur Charakterisierung von biologischen
komplexen Systemen wie Zellen herangezogen worden [184,212,213]. So gelang mit
dem SECM die Abbildung von Zellen und die ortsaufgelöste amperometrische
Detektion von singulären Exocytose-Ereignissen [214,215].
Weiterhin konnte das SECM zur Untersuchung von Enzymreaktionen, sowie zur
Charakterisierung und Herstellung von Enzym-Mikrostrukturen verwendet werden,
worauf später in dieser Arbeit noch eingegangen wird.
2.4.3 Funktionsprinzip des Elektrochemischen Rastermikroskops
Ein SECM besteht prinzipiell aus folgenden Komponenten:
• Eine elektrochemische Zelle, die mit Elektrolytlösung, der häufig eine redoxaktive
Spezies zugesetzt wird, befüllt ist. Am Boden der elektrochemischen Zelle
befindet sich die zu untersuchende Probe.
• Eine Mikroelektrode, die senkrecht zur Probenoberfläche orientiert von oben in die
elektrochemische Zelle abgesenkt werden kann.
• Ein Präzisionspositioniersystem für alle Raumrichtungen, mit dem die relative
Position zwischen Mikroelektrode und Probenoberfläche exakt justiert werden
kann. Dabei gibt es mehrere Möglichkeiten: So kann entweder die Position der
elektrochemischen Zelle variiert werden und die Mikroelektrode bleibt ortsfest
oder umgekehrt.
2 Stand der Forschung 24
• Ein (Bi-)Potentiostat zur Polarisierung der Mikroelektrode und/oder der Probe auf
ein festes Potential oder zur Durchführung elektrochemischer Messungen.
• Ein Computer zur Steuerung der Positioniereinheiten, des Potentiostaten und zur
Aufnahme und Auswertung der Messdaten.
Detaillierte Beschreibungen des in dieser Arbeit verwendeten SECM mit allen
Komponenten und der Steuersoftware finden sich in [187,212].
Abbildung 2.4-2 schematische Darstellung des Aufbaus eines SECM (adaptiert aus [187])
2 Stand der Forschung 25
Im einfachsten SECM-Experiment wird die Mikroelektrode in kurzem Abstand zur
Probe positioniert, auf ein festes Potential polarisiert und anschließend kammartig
über die Probenoberfläche gerastert. Über die sich ändernden Stromwerte der
Mikroelektrode kann auf die lokale Oberflächenbeschaffenheit geschlossen werden.
Je nach experimenteller Anordnung der Mikroelektrode und der Probenoberfläche
kann man verschiedene Betriebsmodi unterscheiden, von denen im Folgenden nur
die für die Arbeit relevanten behandelt werden.
Zu Beginn des Experiments wird die Mikroelektrode in die mit einer Elektrolytlösung
und redoxaktiven Spezies gefüllte elektrochemische Zelle eingeführt und auf ein
Potential polarisiert, so dass die in Lösung befindliche Redoxspezies unter
Diffusionskontrolle umgesetzt wird.
Nach Ausbildung eines hemisphärisches Diffusionsfeld vor der Mikroelektrode fließt
der diffusionskontrollierte Grenzstrom entsprechend folgender Gleichung:
it,∞ = 4nFcDr (Gleichung 2.4-6)
n = Zahl der ausgetauschten Elektronen
F = FARADAY-Konstante
c = Konzentration der Redoxspezies
D = Diffusionskoeffizient der Redoxspezies
r = Radius der aktiven Elektrodenoberfläche
Der Messeffekt des SECM ergibt sich nun, wenn die Mikroelektrode senkrecht an die
zu untersuchende Oberfläche, im Folgenden auch Substratoberfläche genannt,
angenähert wird. Entsprechend den Eigenschaften der Oberfläche können dabei
mehrere Fälle unterschieden werden, die im Folgenden diskutiert werden.
2 Stand der Forschung 26
2.4.3.1 Annäherung an nichtleitende Oberflächen (negativer Feedback)
Je dichter sich die Mikroelektrode
senkrecht einer nichtleitenden Oberfläche
nähert, desto kleiner wird der aktuell
fließende Strom it. Durch die
Substratoberfläche wird das Diffusionsfeld
vor der Mikroelektrode partiell blockiert, so
dass der Diffusionsfluss zur Mikroelektrode
gehemmt wird und weniger umsetzbare
Spezies pro Zeiteinheit die Mikroelektrode
erreichen, was zu einem Absinken des
Stroms führt. Bei sehr dichter Annäherung
erreicht der Strom einen Grenzwert von
null. Die Mikroelektrode hat auf der
Oberfläche aufgesetzt, welche nun den
gesamten Redoxmediatorfluss zur
Mikroelektrode blockiert, so dass kein Stromfluss mehr zu verzeichnen ist. Da in der
Praxis eine perfekte Planparallelität zwischen Mikroelektrode und Substratoberfläche
nur selten gegeben ist, erfolgt keine vollständige Blockierung des Diffusionsfeldes,
so dass immer ein geringer Reststrom zu messen ist.
Da bei der Annäherung an eine nichtleitende Oberfläche der Strom it kleiner wird als
der Grenzstrom it,∞ in unendlicher Entfernung von der Oberfläche bezeichnet man
diesen Effekt als negativen Feedback.
Das Verhalten von Scheibenmikroelektroden beim Annähern an nichtleitende und
leitende Oberflächen ist von Kwack und Bard theoretisch behandelt worden [216].
Die Annäherungskurven konnten unter folgenden Annahmen numerisch berechnet
werden:
• Die Probenoberfläche ist planar, unbegrenzt ausgedehnt und planparallel zur
Mikroelektrode ausgerichtet.
• Der Radius der Isolierung der Scheibenmikroelektrode ist um ein Vielfaches
größer als der Radius der aktiven Elektrodenoberfläche.
d
r
Abbildung 2.4-3 negativer Feedback übereiner nichtleitendenOberfläche
2 Stand der Forschung 27
• Die Umsetzung des Redoxmediators an der Mikroelektrode verläuft
diffusionskontrolliert. Im Falle leitender Substratoberflächen verläuft die
Umsetzung des Redoxmediators an diesen ebenfalls unter Diffusionskontrolle.
Die Berechnungen erfolgten für isolierende Ummantelungen, die 10- bzw. 100-fach
größer waren als der Elektrodenradius. Um Elektroden verschiedener Größe
vergleichen zu können, wird der Abstand d der Mikroelektrode von der
Substratoberfläche auf den aktiven Elektrodenradius r normiert.
Interpoliert man die einzelnen berechneten Werte mit verschiedenen
mathematischen Ausdrücken, so erhält man für eine Annäherung an eine
nichtleitende Substratoberfläche folgende Näherungsformel [217]:
−⋅++
=∞
)r/d(
4035.2exp6553.0
)r/d(
5151.1292.0
1
i
i
,t
t
(Gleichung 2.4-7)
Diese Näherung hat eine Abweichung von 1.2 % von den durch Simulation
berechneten Werten und besitzt ihre Gültigkeit für Werte von d/r im Bereich von 0.05
bis 20.
0 2 4 6 8 100.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
i t / i
t,∞
d / r
Abbildung 2.4-4 theoretisch berechnete Annäherungskurve einer Mikroelektrode an einenichtleitende Oberfläche
2 Stand der Forschung 28
Abbildung 2.4-4 zeigt die nach Gleichung 2.4-7 berechnete Stromänderung mit der
Distanz zwischen Mikroelektrode und Substratoberfläche. Auf der Ordinate ist der
auf den Elektrodenradius normierte Abstand der Mikroelektrode von der
Substratoberfläche aufgetragen; die Abszisse stellt den auf it,∞ normierten Stromfluss
durch die Mikroelektrode dar. Die Beeinflussung des FARADAY-Stroms durch die
nichtleitende Oberfläche setzt bei Abständen an, die um das ca. 5-fache größer sind
als der Radius der aktiven Elektrodenoberfläche. Ein weiterer Parameter, der die
Annäherungskurve beeinflusst, ist das Verhältnis von isolierender Ummantelung zu
aktiver Elektrodenoberfläche, was in der Näherung nicht berücksichtigt wird.
2.4.3.2 Annäherung an leitende Oberflächen (positiver Feedback)
Nähert man die Mikroelektrode einer
leitenden Oberfläche (z. B. einer Metall-
oberfläche), an der die Umkehrreaktion der
Mikroelektrodenreaktion OX + e- → RED
stattfinden kann, so steigt mit geringer
werdender Distanz der Strom an. An der
leitenden Oberfläche bildet sich ein
Potential aus, das durch das Verhältnis
von oxidierter Spezies OX zu reduzierter
Spezies RED in der Lösung über die
NERNST-Gleichung bestimmt wird:
]d[Re
]Ox[log
n
059.0EE o +=
Im Falle einer Oxidationsreaktion an der Mikroelektrode legt man eine Lösung vor,
die nur die reduzierte Form der Redoxspezies enthält. Somit ist das Verhältnis von
[OX] zu [RED] sehr klein. Der Logarithmus in Gleichung 4.2-8 wird negativ, und das
Potential der leitenden Oberfläche wird kleiner als das Standardpotential der
Reaktion RED → OX + e-. Daraus folgt, dass die an der Mikroelektrode generierte
oxidierte Spezies OX aufgrund des niedrigen Potentials der leitenden Oberfläche an
Red Ox
d
r
Abbildung 2.4-5 positiver Feedback übereiner leitenden Oberfläche
2 Stand der Forschung 29
dieser wieder zur Spezies RED reduziert wird. Das Potential der leitenden Oberfläche
wird vom Konzentrationsverhältnis von OX zu RED über der gesamten
Substratoberfläche bestimmt. Da die Substratoberfläche im Vergleich zur
Mikroelektrode sehr viel größer ist, führt die lokale Erhöhung des
Konzentrationsverhältnisses von oxidierter zu reduzierter Spezies in der Nähe der
Mikroelektrode im Vergleich zur restlichen Lösung nicht zu einer Änderung des
Potentials der leitenden Oberfläche, sondern zu der zuvor erwähnten Umsetzung.
Durch diesen Recycling-Prozess erreichen mehr umsetzbare Redoxspezies pro
Zeiteinheit die Mikroelektrode als im Falle des diffusionskontrollierten Transports aus
dem Volumen der Lösung zu einer Mikroelektrode, die sich weit entfernt von der
leitenden Oberfläche befindet. An der Mikroelektrode können somit mehr
elektroaktive Spezies pro Zeiteinheit umgesetzt werden, was eine Stromerhöhung
zur Folge hat.
Aufgrund des Stromanstiegs im Vergleich zum Grenzstrom it,∞ in unendlicher
Entfernung von der Oberfläche bezeichnet man diesen Effekt als positiven
Feedback.
Die Größe von it im Vergleich zu it,∞ ist zum einen distanzabhängig und zum anderen
anhängig von den Eigenschaften der Oberfläche. In der Praxis kann die Situation
jedoch komplizierter werden, nämlich dann, wenn nicht - wie oben angenommen -
die Diffusion von der Substratoberfläche zur Mikroelektrode der limitierende Faktor
ist, sondern die Geschwindigkeit des heterogenen Ladungstransfers zwischen dem
Mediator und der Substratoberfläche. In diesem Fall kann das SECM zur
Untersuchung der Reaktionskinetik heterogener Elektronentransferreaktionen
benutzt werden [210,218,219].
Die Annäherungskurve von Mikroelektroden an leitende Oberflächen ist ebenfalls
theoretisch behandelt worden. Im Gegensatz zu nichtleitenden Oberflächen, bei
denen die Radien von aktiver Elektrodenoberfläche und isolierender Ummantelung
Einfluss auf die Annäherungskurve haben, ist bei leitenden Oberflächen nur die
aktive Elektrodenoberfläche von Bedeutung [216].
2 Stand der Forschung 30
Der Stromverlauf für die Annäherung an leitende Oberflächen kann durch folgende
Näherungsformel beschrieben werden [217]:
−⋅++=
∞ )r/d(
0672.1exp3315.0
)r/d(
78377.068.0
i
i
,t
t(Gleichung 2.4-8)
Diese Näherung hat eine Abweichung von 0.7 % zu der durch Simulation
berechneten Kurve. Die Gültigkeit liegt im Wertebereich für d/r von 0.05 bis 20.
Abbildung 2.4-6 zeigt die nach Gleichung 2.4-8 berechnete Stromänderung mit der
Distanz zwischen Mikroelektrode und Substratoberfläche. Auf der Ordinate ist
wiederum der auf den Elektrodenradius normierte Abstand aufgetragen; die
Abszisse stellt den auf it,∞ normierten Strom dar. Die Beeinflussung des Stroms der
Mikroelektrode durch die leitende Substratoberfläche setzt bei Abständen ein, die
ungefähr dem 5-fachen des aktiven Elektrodenradius entsprechen.
0 2 4 6 8 100
1
2
3
4
5
i t / i t,
∞
d / r
Abbildung 2.4-6 theoretisch berechnete Annäherungskurve einer Mikroelektrode an eine leitendeOberfläche
2 Stand der Forschung 31
2.4.3.3 Enzymatischer Generator-Kollektor-Modus / Enzymatischer Feedback
Die Detektion von immobilisierter
Enzymaktivität mit dem SECM kann
prinzipiell mit zwei Methoden erfolgen, die
im Folgenden erläutert werden.
Im enzymatischen Generator-Kollektor-
Modus und im Generator-Kollektor-Modus
allgemein wird lokal generierte
elektrochemisch aktive Spezies mit der
positionierten Mikroelektrode detektiert.
Eine theoretische Behandlung ist
schwierig, da die Bewegung der
Mikroelektrode und die Umsetzung an der
Mikroelektrode das Diffusionsfeld der
Substratoberfläche stört. Bei sehr kurzen
Abständen muss zudem berücksichtigt
werden, dass durch die Mikroelektrode die
Diffusion der Reaktanden zur Substratoberfläche partiell blockiert wird. Ein Beispiel
für den enzymatischen Generator-Kollektor-Modus ist die Detektion der
Enzymaktivität von immobilisierter Glucoseoxidase. In Gegenwart von Glucose kann
das von der immobilisierten Glucoseoxidase enzymatisch gebildete H2O2 an einer
Mikroelektrode, die sich in kurzem Abstand direkt über der Glucoseoxidase befindet
und auf +600 mV vs. Ag/AgCl polarisiert ist, detektiert werden [220]. In diesem Fall
stehen die Synonyme OX und RED in Abbildung 2.4-7 für O2 und H2O2.
Ein weitere Möglichkeit für die Detektion von Enzymaktivität mit dem SECM stellt der
enzymatische Feedback-Modus dar, der eng mit dem Generator-Kollektor-Modus
verknüpft ist. In einer Lösung, die nur die reduzierte Form einer artifiziellen
Redoxspezies enthält, wird an der Mikroelektrode die oxidierte Form produziert, die
in der enzymatischen Reaktion als Cosubstrat fungieren kann. Ist das Enzymsubstrat
in der Lösung vorhanden, so wird die an der Mikroelektrode generierte oxidierte
Form des Mediators in der enzymatischen Reaktion wieder in die reduzierte Form
überführt. Durch dieses Recycling tritt, analog zum bereits diskutierten positiven
Red Ox
EnzymSubstrat Produkt
Abbildung 2.4-7 Schema der Detektion vonimmobilisierter Enzym-aktivität mit dem SECM
2 Stand der Forschung 32
Feedback-Effekt, eine Zunahme des Stroms der Mikroelektrode auf. Die Synonyme
OX und RED in Abbildung 2.4-7 stellen im Falle von immobilisierter Glucoseoxidase
z. B. [FeIII(CN)6]3- und [FeII(CN)6]
4- dar.
Pierce et al. beschrieben bereits 1992 die Detektion von immobilisierter
Glucoseoxidase mit [FeII(CN)6]4-, Fc-COOH und Hydrochinon als Mediatoren, sowie
erste Ansätze für theoretische Beschreibungen des enzymatischen Feedback-
Effektes und für die kinetische Bestimmung der involvierten Reaktionsraten [221].
Um immobilisierte Enzymaktivität mit dem SECM zu detektieren, muss die
Enzymreaktion den reduzierten Mediator mit eine genügend hohen Reaktionsrate
regenerieren, um mit dem Massentransfer vom Volumen der Lösung zur Elektrode
konkurrieren zu können. Diese Voraussetzung konnte quantitativ durch die digitale
Simulation des enzymatischen Feedback-Effekt für Glucoseoxidase beschrieben
werden [221]:
kcat Γenz ≥ 10-3 DRed cRed r-1 (Gleichung 2.4-9)
Die linke Seite der Gleichung fasst die enzym-abhängigen Terme zusammen: kcat
charakterisiert die katalytische Reaktionsrate unter Substratsättigung, d. h. bei hohen
Substratkonzentrationen. Γenz ist die Oberflächenkonzentration des Enzyms, oder im
Falle von Filmen endlicher Schichtdicke das Produkt aus Enzymkonzentration im
Film und Filmdicke. Die rechte Seite fasst die experimentellen Terme zusammen:
DRed ist der Diffusionskoeffizient und cRed die Konzentration der reduzierten Spezies
im Volumen der Lösung, r steht für den Radius der Mikroelektrode.
Aus Gleichung 2.4-9 wird deutlich, dass das Kriterium zur Detektion von
immobilisierter Enzymaktivität am einfachsten durch die Verwendung von niedrigen
Mediatorkonzentrationen und Mikroelektroden mit einem großen Radius erfüllt
werden kann.
2 Stand der Forschung 33
2.4.4 Mikrobandelektroden und Interdigitalelektroden
Ein weiterer wichtiger Schritt in der Miniaturisierung elektrochemischer Messsysteme
war die Entwicklung von Mikrobandelektroden- und Interdigitalelektroden-Arrays.
Mikrobandelektroden und Interdigitalelektroden besitzen ähnliche Eigenschaften und
Herstellungsprozeduren, so werden beide in Silizium-Mikrotechnologie unter
Reinraumbedingungen gefertigt. Die schematischen Darstellungen von Mikroband-
und Interdigitalelektroden sind in Abbildung 2.4-8 gezeigt.
Die Dimensionen der einzelnen Elektrodenfinger und Abstände liegen bei beiden
Strukturen im unteren Mikrometerbereich [222-224]. Typische Größenordnungen für
im Biosensorbereich verwendete Mikrobandelektroden sind 25 µm x 1000 µm mit
einem Abstand von 25 µm zwischen den einzelnen Elektroden [225].
Elektrodenfinger dieser Größenordnung besitzen noch die spezifischen
Eigenschaften von Mikroelektroden. Interdigitalelektroden-Arrays (IDA) sind in
verschiedenen Größen und Geometrien gefertigt worden. Dabei wurden neben der
Größe und der Zahl der Finger auch der Abstand zwischen den Fingern variiert. Den
Einfluss dieser Parameter auf das elektrochemische Verhalten der
Abbildung 2.4-8 schematische Darstellung von parallelen Mikrobandelektroden (links) undInterdigitalelektroden-Arrays (rechts)Die dunkelgrauen Flächen sind verkapselt, so dass die darunter liegendenMetallflächen von der Elektrolytlösung isoliert sind, die hellgrauen sind freigelegtund kommen somit mit der Elektrolytlösung in Kontakt. Die Kreise stellenKontaktstellen zum Potentiostaten dar und befinden sich außerhalb derElektrolytlösung.
2 Stand der Forschung 34
Interdigitalelektroden ist intensiv in Theorie und Praxis untersucht worden [226-231].
Mit IDA ist eine Verstärkung des amperometrischen Stromsignals durch
Redoxrecycling analog zum positiven Feedback im SECM möglich. Allerdings
müssen dazu die Elektrodenkämme in bipotentiostatischer Anordnung geschaltet
werden. Dieser Effekt soll am folgenden Beispiel erläutert werden: In der
Elektrolytlösung befindet sich eine Redoxspezies, die reversibel oxidiert und
reduziert werden kann. Ein Elektrodenkamm wird auf ein Potential polarisiert, so
dass die Redoxspezies diffusionskontrolliert oxidiert werden kann; der andere auf ein
Potential, so dass die diffusionskontrollierte Reduktion der Redoxspezies an diesem
stattfinden kann. Bei sehr kleinen Abständen zwischen den Elektrodenkämmen
kommt es zu einer Überlappung der Diffusionsfelder benachbarter Elektroden. Die
an einem Kamm generierten oxidierten Redoxspezies gelangen über sehr kurze
Diffusionswege zum anderen Kamm, an dem sie wieder reduziert werden. Die
kurzen Diffusionswege der oxidierbaren Redoxspezies zum anodisch geschalteten
Elektrodenkamm und der reduzierbaren Redoxspezies zum kathodischen Kamm
führen zu einer Regeneration im Diffusionsfeld, damit zu einer erhöhten
Transportrate und folglich zu einer Verstärkung sowohl des kathodischen, als auch
des anodischen Stromsignals. Die Effizienz des Redoxrecyclings („Kollektor-
Effizienz“) ist, wie theoretische und praktische Untersuchungen zeigen [230,231],
stark abhängig vom Abstand zwischen den Elektrodenfingern. Typische
Verstärkungsfaktoren von Interdigitalelektroden-Arrays liegen zwischen 5 und 15
[228].
Interdigitalelektroden werden in der Biosensorik häufig in Fliessinjektionssystemen
eingesetzt [232,233]. Die in einem vorgeschalteten enzymatischen Reaktor
gebildeten elektrochemisch aktiven Enzymprodukte werden amperometrisch mit IDA
detektiert. Beispielsweise wurde die Konzentration von p-Aminophenol als
elektrochemisch aktives Produkt der enzymatischen Reaktion von Alkalischer
Phosphatase, die als Enzymmarkierung in einem Enzym-Immunoassay verwendet
wurde, bestimmt [234].
Eine aktuelle Übersicht über die Verwendung von in photolitographischen Verfahren
gefertigten Mikroelektroden in der Biosensorik ist in [235] zu finden.
2 Stand der Forschung 35
2.5 Mikrostrukturierung von Oberflächen mit Biomolekülen
Seit der Entwicklung des ersten Biosensors wurde verschiedene chemische und
physikalische Methoden entwickelt, um Biomoleküle auf Transduceroberflächen zu
immobilisieren. Eine geeignete Immobilisierungsmethode muss dabei zum einen
gewährleisten, dass bei der Immobilisierung die Aktivität des Biomoleküls erhalten
bleibt und zum anderen eine gute Langzeitstabilität aufweisen. Seit Miniaturisierung
ein zunehmender Trend in der Biosensorforschung geworden ist, ist das Interesse
an nichtmanuellen Immobilisierungsmethoden mit hoher lokaler Auflösung
gewachsen. Die Immobilisierung von verschiedenen Enzymen an verschiedenen
exakt definierten Orten auf einem festen Substrat stellt dabei eine wichtige Basis zur
Entwicklung von homogenen Multi-Analyt-Sensorsystemen dar.
Die verschiedenen Methoden zur Strukturierung von Oberflächen mit Proteinen
können in zwei Klassen eingeteilt werden: Indirekte Methoden und aktive
Strukturierungsmethoden (Active Placement) [236].
Indirekte Methoden beruhen auf der lokalen Änderung der Reaktivität der Oberfläche
in Bezug auf Biomoleküle. Viele dieser Methoden basieren auf der Modifikation von
Oberflächen mit selbstorganisierenden Monoschichten (Self-Assembled Monolayer,
SAM), die funktionelle terminale Gruppen besitzen. Über diese funktionellen
Gruppen (z. B. Amino-, Säure- oder N-Hydroxysuccinimidyl-Gruppen) erfolgt die
Anbindung und Immobilisierung der Biomoleküle.
Die einfachste indirekte Methode besteht darin, vorstrukturierte Substrate mit
Biomolekülen zu modifizieren. Beispielsweise können die einzelnen Elektroden eines
Mikrobandelektroden-Arrays (vgl. Abbildung 2.4-8) durch elektrochemisch induzierte
Koagulation und anschließender Quervernetzung mit verschiedenen Enzymen
modifiziert werden [237]. Durch den geringen Abstand von 25 µm zwischen den
einzelnen Bandelektroden treten Interferenzen und „Cross-Talk“-Effekte zwischen
benachbarten Bandelektroden auf, die mit dem SECM charakterisiert werden
konnten [238].
Die Elektrochemische Rastermikroskopie ist eine der Schlüsseltechniken in der
Herstellung und Charakterisierung von enzymatischen Mikrostrukturen.
Zur Herstellung enzymatisch aktiver Kreisstrukturen (im Folgenden als Spots
bezeichnet) wurde eine Goldoberfläche mit einer nichtfunktionalisierten Monoschicht
2 Stand der Forschung 36
modifiziert und diese lokal elektrochemisch desorbiert. Die lokal freigelegte
Goldoberfläche wurde mit funktionalisierten SAM modifiziert und an diese
Glucoseoxidase kovalent gebunden. Die Aktivität der immobilisierten
Glucoseoxidase konnte mit dem SECM über die Detektion von enzymatisch
generiertem H2O2 visualisiert werden [239,240].
In einer anderen indirekten Methode wurden mit dem SECM mit Aminogruppen
modifizierte Pyrrolderivate lokal abgeschieden, an die kovalent Glucoseoxidase
angebunden wurde. Mit Fc-COOH oder Osmium-(2,2’-bipyridyl)formylpyridinium-
chlorid als Redoxmediatoren gelang die lokale Detektion der immobilisierten
Enzymaktivität [241].
Weiterhin konnte das SECM genutzt werden, um auf eine Siliziumoberfläche lokal
Goldpartikel abzuscheiden, die nachfolgend mit funktionalisierten SAM modifiziert
wurden. Anschließend konnten an die Goldpartikel fluoreszierende Isothiocyanate
oder Glucoseoxidase angebunden werden [242].
Eine andere Methode nutzt die lokale Immobilisierung von magnetischen sehr
kleinen Kugeln (Beads), die mit primären Anti-Maus-Antikörpern modifiziert sind.
Mittels einer Mikropipette und einem Permanentmagneten konnten kreisförmige
Mikrostrukturen von Beads mit einem Durchmesser zwischen 25 µm und 150 µm
erzeugt werden. Unter Nutzung eines sekundären, mit Alkalischer Phosphatase
markierten Anti-Maus-Antikörpers konnte ein Sandwich-Assay für Maus-IgG etabliert
werden, in dem die Enzymaktivität des sekundären Antikörpers mit dem SECM
detektiert wird [243,244]. Alkalische Phosphatase katalysiert die Umsetzung von
elektrochemisch inaktivem 4-Aminophenyl-phosphat zu elektrochemisch aktivem
p-Aminophenol, welches an der Mikroelektrode oxidiert wird.
Die Enzymaktivität von biotinilierter Glucoseoxidase, die an immobilisierten
streptavidin-modifizierte Beads angebunden wurde, konnte ebenfalls mittels SECM
über in der Enzymreaktion gebildetes H2O2 detektiert werden [244].
Eine andere Methode, die seit kurzer Zeit für die Strukturierung von Oberflächen mit
Biomolekülen verwendet wird, ist Mikrokontakt-Stempeln [245,246]. Das Prinzip des
Mikrokontakt-Stempeln ist die Übertragung der dreidimensionalen Struktur des
Stempels in eine laterale Struktur auf der Substratoberfläche. Dazu werden
mikrostrukturierte elastische Stempel aus PDMS (Poly(dimethylsiloxan)) mit einer
Lösung eines Thiolderivats benetzt und auf die Substratoberfläche gedrückt,
2 Stand der Forschung 37
wodurch die Oberfläche entsprechend der Stempelstruktur mit Thiolaten modifiziert
wird [247,248]. Komplexere Mikrostrukturen lassen sich durch sequentielle
Stempelschritte mit verschiedenen Thiolen oder dem Verfüllen unmodifizierter
Substratstellen erhalten. Durch Mikrokontakt-Stempeln konnten 200 µm breite
alternierende Streifen von ω-Hydroxy-Undekanthiolat und einer Mischung aus
ω-Hydroxy-Undekanthiolat und einem biotin-modifiziertem Thiolat erhalten werden.
Durch weitere Anbindung an das biotin-modifizierte Thiolat wurden Mikrostrukturen
G-Protein-gekoppelter Rezeptoren mit definierter Orientierung erhalten [249].
Neben selbstorganisierenden Monoschichten kann auch das Biotin-Avidin-System
genutzt werden, um mit indirekten Methoden Mikrostrukturen immobilisierter
Biomoleküle zu erhalten. Mittels konfokaler Lasermikroskopie wurden durch lokale
Immobilisierung eines photoaktiven Biotinderivats Biotin-Mikrostrukturen mit lateralen
Strukturen zwischen 5 µm und 20 µm auf Glaskohlenstoff- oder Siliziumoberflächen
erzeugt. Anschließend wurde an die Biotinstrukturen ein fluoreszierendes Avidin
gebunden, so dass die Mikrostrukturen mittels Fluoreszenzmikroskopie detektiert
werden konnten [250].
In aktiven Strukturierungsmethoden (Active Placement) werden die Biomoleküle an
definierten Stellen direkt auf die Oberfläche aufgebracht. Im einfachsten Ansatz
wurden als Basis für einen Immunoassay mit einer Glaskapillare unter Beobachtung
mit einem Mikroskop 20 µm große Spots von chrorionischem Anti-Human
Gonadropin und plazentalem Anti-Human Lactogen auf einem Glassubstrat
aufgebracht [251].
Ein konventioneller Tintenstrahl-Druckkopf (Ink-Jet) wurde benutzt, um kleine
Tropfen eines Gemisches aus Enzym und BSA zu schießen und so selektiv die
Gates von ionensensitiven Feldeffekt-Transistoren (ISFET) mit Glucoseoxidase oder
Urease zu modifizieren [252]. Um eine stabile quervernetzte Enzymschicht zu
erhalten, müssen die Strukturen nach jedem Schiessvorgang in einer
Gludaraldehyd-Atmosphäre inkubiert werden, wobei die schlechte
Reproduzierbarkeit des Quervernetzungsprozesses ein Problem darstellt.
Nach einem ähnlichen Prinzip konnten mit einem Ink-Jet-Verfahren
amperometrische Glucosesensoren hergestellt werden, indem Schichten von
Glucoseoxidase, BSA und Glutaraldehyd auf im Siebdruck-Verfahren hergestellte
2 Stand der Forschung 38
Kohlenstoff-Makroelektroden aufgebracht wurden [253].
Ink-Jet-Verfahren konnten weiterhin genutzt werden, um DNA-Mikroarrays auf
Glasoberflächen aufzubringen [254]. Konventionelle Tintenstrahldrucker wurden
benutzt, um ein- und zweidimensionale Arrays von Meerrettich-Peroxidase Spots auf
Zellulosepapier [255] oder DNA-Strukturen auf Nylon oder Nitrozellulose [256]
herzustellen. Mit einem auf einem CD-Rotierteller montierten Tintenstrahl-Druckkopf
wurden Mikroarrays von Erkennungselementen auf eine CD aufgebracht, um
kompetitive Immunoassays für Hydroxyatrazin, Carbaryl, und Molinat zu entwickeln
[257]. Die resultierenden Mikrospots, die einen Durchmesser von 75 µm haben,
wurden nach der Inkubation mit dem Analyten und einem kompetitiven Inhibitor mit
einem fluoreszierenden sekundären Antikörper inkubiert und mit einem kommerziell
erhältlichen Fluoreszenzdetektor, der ebenfalls an dem CD-Rotierteller angebracht
ist, visualisiert.
Nachteilig bei all diesen Verfahren ist, dass aufgrund der Tintenstrahltechnik, die
bisher nur vier verschiedene Farben benutzt, auch nur Mikrospot-Arrays von
maximal vier verschiedenen Substanzen hergestellt werden können. Weiterhin muss
berücksichtigt werden, dass eine technisch bedingte wechselseitige Kontaminierung
(Cross-Kontaminierung) der Mikrospots auftreten kann.
3 Problemstellung 39
3 Problemstellung
In der Biosensorik sind elektrochemische Messmethoden den optischen Verfahren
hinsichtlich Einfachheit, Kostengünstigkeit und technischem Aufwand überlegen,
weswegen sie in neuer Zeit zunehmend auch in kommerziellen Geräten Anwendung
finden. Die Vorteile mikroelektrochemischer Verfahren sind in der Biosensorik aber
erst ansatzweise ausgenutzt worden. Gerade die besonderen Eigenschaften von
Scheibenmikroelektroden, z. B. in der Kombination mit Elektrochemischer
Rastermikroskopie, bieten eine Fülle von neuen Anwendungsmöglichkeiten.
In der Affinitätssensorik sind homogene nichtkompetitive Messverfahren vorteilhaft,
da aufwendige Wasch- und Separationsschritte entfallen und ein kostenintensives
Markieren des Analyten, der bei jeder Messung der Probenlösung zugesetzt werden
muss, nicht notwendig ist. Die bisher in der Literatur beschriebenen
elektrochemischen homogenen Affinitätsassays nutzen bisher nicht ausreichend die
besonderen Möglichkeiten der Mikroelektrochemie. Viele dieser Methoden sind
zudem auf ein spezielles Erkennungssystem beschränkt und können nicht ohne
weiteres an andere Erkennungssysteme adaptiert werden. Eine mögliche
Miniaturisierung und Automatisierbarkeit des Messverfahrens wird ebenfalls häufig
nicht berücksichtigt.
An diesem Punkt soll die vorliegende Arbeit ansetzen:
Unter Nutzung der besonderen Eigenschaften von mikroelektrochemischen
Verfahren soll eine Strategie für einen elektrochemischen Affinitätsassay mit einem
allgemeinen Detektionsprinzip, das auf beliebige molekulare Erkennungssysteme
übertragen werden kann, entwickelt werden.
Weitere Voraussetzungen, die der Affinitätsassay erfüllen soll, sind:
• homogenes, nichtkompetitives Assayformat
• Miniaturisierbarkeit
• möglichst hoher Automatisierbarkeitsgrad
• geringe Materialkosten
• Kompatibilität zum Titerplattenstandard
3 Problemstellung 40
Bei der Entwicklung von Biosensoren haben nichtmanuelle Immobilisierungs- und
Strukturierungstechniken an Bedeutung gewonnen. Nichtmanuelle Methoden
besitzen gegenüber manuellen Methoden den Vorteil, dass die Strukturen mit einer
höheren Reproduzierbarkeit hergestellt werden können und dass die
Herstellungsprozedur weitgehend automatisiert werden kann.
Das strukturierte Anordnen von verschiedenen Biomolekülen an definierten
Positionen auf einer Oberfläche oder einem Transducer stellt eine wichtige
Grundlage für die Entwicklung von miniaturisierten Multisensor-Strukturen dar. Eine
Sensoroberfläche mit einer großen Zahl von mikroskopischen Strukturen, jede davon
sensitiv für ein anderes Substrat, kann eine effektive Möglichkeit darstellen, bei einer
Minimierung des Probevolumens einen hohen Probendurchsatz (High-Throughput)
zu gewährleisten.
Bisher wurden dafür vor allem vorstrukturierte Substrate benutzt, die dann mit
Biomolekülen modifiziert wurden, oder es waren aufwendige Vorbereitungsschritte
wie die lokale Desorption von selbstorganisierenden Monoschichten oder das lokale
Abscheiden von Metallen oder Polymeren nötig, was zum einen apparativ aufwendig
ist und zum anderen gut ausgebildetes Personal benötigt.
Viele der bisher beschriebenen Strukturierungsmethoden haben Defizite in Bezug
auf:
• mangelnde Flexibilität bezüglich der Oberflächenbeschaffenheit
• unbefriedigende Reproduzierbarkeit durch manuelle Verfahren
• hoher Verbrauch an wertvollen biochemischen Substanzen
• spezialisiert auf nur eine Immobilisierungsmethode
• geringes Automatisierungspotential
• hoher apparativer und zeitlicher Aufwand
• Herstellung von Mikrostrukturen unterschiedlicher Biomoleküle an definierten
Orten, z. B. Enzym-Arrays als Multisensor-Strukturen
• Aufbau von Multischicht-Strukturen zur Nutzung oder Untersuchung der
Interaktion verschiedener Enzyme oder Biomoleküle
Im Rahmen dieser Arbeit soll ein einfaches, universelles Verfahren zur
Mikrostrukturierung von beliebigen Oberflächen mit Biomolekülen entwickelt werden,
das nicht die genannten Limitierungen aufweist.
3 Problemstellung 41
Weiterhin muss durch entsprechende Messverfahren nachgewiesen werden, dass
die Aktivität der immobilisierten Biomoleküle erhalten bleibt. Durch die Kombination
verschiedener Enzyme in Multischichtstrukturen und Enzym-Arrays soll die Eignung
des Verfahrens zur Herstellung von miniaturisierten Multisensor-Strukturen gezeigt
werden. Mit mikroelektrochemische Messverfahren soll demonstriert werden, dass
mit diesen Mikrostrukturen quantitative Bestimmungen von physiologisch relevanten
Substanzen möglich sind.
Das zusammenfassende Ziel dieser Arbeit ist es, neue Ansätze zur Nutzung mikro-
elektrochemischer Messverfahren in der Biosensorik und in der Elektroanalytik zu
erarbeiten.
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 42
4 Eigene Arbeiten
Elektroanalytische Techniken haben in der Entwicklung von Affinitätsassays
aufgrund geringer Kostenfaktoren zunehmend an Interesse gewonnen. Für eine
breite Anwendbarkeit sind universelle Konzepte, die auf möglichst viele molekulare
Erkennungssysteme übertragen werden können, wünschenswert. Weiterhin sind
eine Miniaturisierung zur Einsparung von Chemikalien- und Entsorgungskosten und
ein hoher Automatisierbarkeitsgrad zur Reduzierung von Personalkosten von
Bedeutung.
Wie bereits im Stand der Technik erläutert, sind bei Affinitätsassays
nichtkompetitive, homogene Verfahren vorteilhaft, da bei der Durchführung keine
Separations- und Waschschritte notwendig sind und kostenintensives Markieren des
Analyten entfällt.
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation vonDiffusionskoeffizienten von hapten-modifizierten Redox-spezies
Im Folgenden soll ein neuer Ansatz für einen elektrochemischen Affinitätsassay
vorgestellt werden, der alle im einleitenden Teil dieses Kapitels erwähnten
Voraussetzungen erfüllt. Dieser basiert auf der Veränderung des
Diffusionskoeffizienten von redoxaktiven Molekülen, die mit einem biologischen
niedermolekularen Erkennungselement (Hapten) markiert sind, durch die molekulare
Erkennung und Anbindung der komplementären Erkennungsstruktur.
Der Diffusionskoeffizient von redoxaktiven Molekülen kann durch eine Vielzahl
elektroanalytischer Techniken, wie z. B. cyclische Voltammetrie, Differenz-Puls-
Voltammetrie oder Chronoamperometrie, bestimmt werden. Für Makroelektroden ist
die Relation zwischen Diffusionskoeffizient und FARADAY-Strom über die COTTRELL-
Gleichung gegeben:
π=
t
AnFcDi
2/1
t (Gleichung 4.1-1)
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 43
Bei Makroelektroden ist der FARADAY-Strom proportional zur Wurzel des
Diffusionskoeffizienten. Im Gegensatz dazu ist bei Mikroelektroden der FARADAY-
Strom direkt proportional zum Diffusionskoeffizienten:
it,∞ = 4nFcDr (Gleichung 4.1-2)
Prinzipiell kann somit jede der genannten Techniken und Elektroden benutzt werden,
um Veränderungen des Diffusionskoeffizienten einer Redoxspezies zu detektieren.
4.1.1 Biotin-Streptavidin als Modellsystem für molekulare Erkennung
Als Modellsystem für molekulare Erkennung wurde auf das bekannte Biotin-
Streptavidin-System zurückgegriffen. Gründe hierfür waren die hohe Spezifität der
Bindung, die sehr niedrige Dissoziationskonstante von 10-15 M [146,147], die
Verfügbarkeit von funktionalisierten Biotinderivaten und die Bedeutung des Biotin-
Streptavidin-Systems für die Bestimmung von StrepTag-modifizierten rekombinanten
Proteinen [157-159].
Die Molekülstruktur von Biotin ist in Abbildung 4.1-1 dargestellt. Abbildung 4.1-2 zeigt
die Peptidkettenstruktur von Streptavidin mit gebundenen Biotinliganden.
NHHN
O
S
HH
O
OH
Abbildung 4.1-1 Molekülstruktur von Biotin
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 44
Streptavidin (M.W. ≈ 53.000 Da) ist symmetrisch aus vier identischen Untereinheiten
aufgebaut, von denen jede ein Biotin oder Biotinderivat binden kann. Biotin wird
dabei in der Art gebunden, dass sich der bicyclische Ring mit den Heteroatomen im
Inneren der Bindungstasche befindet und die Säuregruppe am Ende der
Kohlenstoffkette zum offenen Ende der Bindungstasche orientiert ist. Somit können
auch Biotinderivate, die an der endständigen Säuregruppe modifiziert sind, von
Streptavidin gebunden werden.
Die Bindungsaffinität jeder Bindungsstelle von Streptavidin ist identisch und
weitestgehend unabhängig von den Besetzungen der anderen Bindungsstellen
[147]. Bei einer statistischen Berechnung von Besetzungsverteilungen können somit
alle Bindungsstellen als gleichwertig behandelt werden.
Abbildung 4.1-2 Peptidkettenstruktur von Streptavidin mit gebundenen Biotinliganden.Die Biotinliganden (farbige Kugeln: gelb = Schwefel, rot = Sauerstoff,blau = Stickstoff) sind zur Verdeutlichung vergrößert dargestellt.
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 45
4.1.2 Synthese eines redoxmarkierten Biotinderivats
Um das Bindungsereignis zwischen Biotin und Streptavidin mit elektrochemischen
Methoden detektieren zu können, wurde ein wasserlösliches elektrochemisch aktives
Biotinderivat synthetisiert. Als elektrochemisch aktive Gruppe wurde aufgrund der
guten heterogenen Elektronentransfereigenschaften, der hohen Reversibilität und
des moderaten Formalpotentials die Ferrocenylgruppe gewählt. Die Struktur des
ferrocenmarkierten Biotinderivats, im Folgenden Fc-Biotin genannt, ist in Abbildung
4.1-3 dargestellt.
Um eine Bindung des Biotinteils an Streptavidin sterisch nicht zu behindern wurde
zwischen der Ferrocengruppe und der Biotingruppe ein längerer Alkylketten-Spacer
eingefügt. Die Sauerstoffatome in der Alkylkette erhöhen die Polarität des Moleküls
und verbessern so die Löslichkeit in polaren Medien.
Fc-Biotin wird in einer zweistufigen Synthese dargestellt. In einem ersten Schritt wird
der Spacer an die Ferrocenylgruppe gebunden, indem Ferrocenaldehyd mit einem
Überschuss an 2,2’-(Ethylendioxy)diethylamin umgesetzt wird. Im zweiten
Syntheseschritt wird dieses Produkt mit N-Hydroxysuccinimido-biotin (NHS-Biotin)
zur Reaktion gebracht. Dabei bindet NHS-Biotin unter Abspaltung der
Aktivestergruppe an die endständige Aminogruppe des Ferrocenderivats. Das
komplette Reaktionsschema ist in Abbildung 4.1-4 dargestellt.
NHHN
O
S
HH
O
NHO
ONH
FeO
Abbildung 4.1-3 Molekülstruktur des ferrocenmarkierten Biotinderivats (Fc-Biotin)
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 46
NHHN
O
S
HH
O
NHO
ONH
Fe
Fe
O
HO
ONH2
H2N+ DMF
100°C
Fe
OO
NH2N + H2O
FeH2N
NHO
OS
HH
O
O
NHHN
O
N
O
O
+
Phosphatpuffer
pH 7
H2NNH
OO
Fe
OO
NH2N
Fe
25°C
NaBH4
O
O
NHO+
Abbildung 4.1-4 Synthese des ferrocenmarkierten Biotinderivats
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 47
4.1.3 Messprinzip des Affinitätsassays
Das Messprinzip des Affinitätsassays ist nicht auf das Biotin-Streptavidin beschränkt,
weswegen im Folgenden eine für alle molekularen Erkennungssysteme
verallgemeinerte Beschreibung und Erläuterung des Verfahrens gegeben wird.
Die Modulation von Diffusionskoeffizienten stellt die Basis des entwickelten
Affinitätsassays dar, in dem die spezifische Erkennung und Bindung zweier
komplementärer Erkennungsstrukturen zu einer Erhöhung der molaren Masse einer
Redoxspezies, die mit einer der Erkennungsstrukturen markiert ist, führt. Die
Erhöhung der molaren Masse geht dabei einher mit einer Abnahme des
Diffusionskoeffizienten. In Abbildung 4.1-5 ist eine schematische Illustration des
Messprinzips gezeigt.
Eine Messelektrode wird auf ein Potential polarisiert, so dass das redoxmarkierte
Hapten unter Diffusionskontrolle an dieser umgesetzt wird. Somit wird der
diffusionskontrolliert fließende Grenzstrom idiff1 durch den Nachtransport der
Redoxspezies zur Elektrodenoberfläche und damit durch die Diffusionskoeffizienten
D1 und D1’ bestimmt. Die Diffusionskoeffizienten der oxidierten und reduzierten Form
D1 und D1’ können dabei als gleich angenommen werden [208]. Nach Zugabe und
D1 D1’
D2 D2’
i diff 1 i diff 2
+
Abbildung 4.1-5 schematische Darstellung der Modulation des Diffusionskoeffizienten einerRedoxspezies durch Bindung der komplementären Erkennungsstruktur
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 48
Bindung der komplementären Erkennungsstruktur erhöht sich die molare Masse des
redoxmarkierten Moleküls, was eine gleichzeitige Verringerung des
Diffusionskoeffizienten bedingt. Der Nachtransport zur Elektrodenoberfläche erfolgt
langsamer, so dass ein verringerter diffusionskontrollierter Strom idiff2 fließt. Die
Stromdifferenz zwischen idiff1 und idiff2 ist direkt auf die molekulare Erkennung
zurückzuführen und kann somit als Messsignal für einen elektrochemischen
Affinitätsassay genutzt werden.
Bei molekularen Erkennungssystemen mit mehreren Bindungsstellen, wie z. B. im
Fall von Biotin und Streptavidin, muss in Betracht gezogen werden, dass ein
Streptavidin mehr als ein redoxmarkiertes Biotin binden kann. Dadurch wird die
Konzentration an Redoxmolekülen verringert, während aber gleichzeitig die Zahl an
übertragbaren Elektronen zunimmt. Unter der Annahme, dass nach Erreichen der
Elektrolyt-Elektroden-Grenzschicht alle Redoxzentren eines Moleküls oxidiert oder
reduziert werden können, bleibt der diffusionskontrollierte Strom in Gleichung 4.1-1
und Gleichung 4.1-2 unverändert.
4.1.4 Messelektroden
Das Messsignal des Affinitätsassays ist ein FARADAY-Strom, hervorgerufen durch
einen reversiblen heterogenen Elektronentransfer zwischen Elektrodenoberfläche
und einer löslichen Redoxspezies. Dies ist die einfachste Art einer
elektrochemischen Elektrodenreaktion, so dass keine hohen Anforderungen an die
Messelektroden gestellt werden. Konventionelle Scheibenelektroden aus Platin, Gold
oder Kohlenstoff sind hierfür bestens geeignet. Aufwendige Modifikationen der
Elektrodenoberfläche mit Polymeren oder Beschichtungen, wie sie z.B. bei der
elektrochemischen Messung von NADH erforderlich sind, und zeitintensive
Elektrodenvorbereitung und Reinigungsprozeduren sind nicht notwendig.
Wie bereits einleitend erläutert, ist sowohl bei Makro- als auch bei Mikroelektroden
das Stromsignal mit dem Diffusionskoeffizienten der Redoxspezies korreliert, so
dass prinzipiell beide Elektrodentypen verwendet werden können.
Bei Mikroelektroden ist der absolute Stromwert aufgrund der geringeren
Elektrodenoberfläche viel geringer als bei Makroelektroden, was aber aufgrund des
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 49
hohen Entwicklungsstands bei der potentiostatischen Strommessung messtechnisch
kein Problem darstellt.
Mikroelektroden bieten jedoch einige interessante Vorteile gegenüber
Makroelektroden:
Bei Makroelektroden erfolgt der Transport der Redoxspezies zur
Elektrodenoberfläche über ein planares Diffusionsfeld, das mit zunehmender Zeit in
die Lösung hineinwächst. Somit kann sich kein stationäres Diffusionsfeld aufbauen
und die zunehmende Verarmung an Redoxspezies an der Elektrodenoberfläche führt
zu einem kontinuierlichem Absinken des Stromes.
Aufgrund der sehr kleinen Elektrodenoberfläche erfolgt bei Mikroelektroden der
Transport der Redoxspezies zur Elektrodenoberfläche über ein hemisphärisches
Diffusionsfeld. Aufgrund der höheren Transportrate durch hemisphärische Diffusion
kommt es zu keiner Verarmung an Redoxspezies an der Elektrodenoberfläche und
es bildet sich ein stationäres Diffusionsfeld aus. In diesem Fall ist der FARADAY-
Strom keine Funktion der Zeit.
Dieses unterschiedliche Verhalten von Makro- und Mikroelektroden spiegelt sich
auch im cyclovoltammetrischen Experiment wieder. Während man bei
Makroelektroden nach dem Anstieg des Stromes ein Absinken bei Potentialwerten
oberhalb des Normalpotentials der Redoxspezies beobachtet und somit eine
Peakform entsteht, stellt sich bei Mikroelektroden bei Potentialen oberhalb des
Normalpotentials ein stationärer Strom ein, der unabhängig vom Elektrodenpotential
ist.
Dies bedeutet, dass die Stromauswertung bei Mikroelektroden wesentlich einfacher
ist: Im chronoamperometrischen Experiment muss bei Makroelektroden die
Stromantwort zeitaufgelöst ausgewertet werden und bei cyclovoltammetrischen
Experiment muss eine recht aufwendige Peak-Auswertung durchgeführt werden. Bei
Mikroelektroden ist nach Ausbildung des hemisphärischen Diffusionsfeldes das
Stromsignal im chronoamperometrischen Experiment zeitunabhängig und im
cyclovoltammetrischen Experiment bei Potentialwerten oberhalb des
Normalpotentials potentialunabhängig, so dass bei beiden Experimenten eine
Punktauswertung ausreichend ist.
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 50
Für den beschriebenen Affinitätsassay bedeutet dies, dass die Verwendung von
Mikroelektroden eine wesentlich einfachere und schnellere Möglichkeit zur
Signalauswertung zulässt.
Ein weiterer wichtiger Punkt wurde bereits im einleitenden Teil des Kapitels erwähnt:
Während bei Makroelektroden der FARADAY-Strom von der Wurzel des
Diffusionskoeffizienten abhängt, ist bei Mikroelektroden ein linearer Zusammenhang
gegeben. Im Affinitätsassay ist bei Mikroelektroden somit eine höhere relative
Signaländerung zu erwarten, da das Messsignal eine Stromänderung, hervorgerufen
durch die Veränderung des Diffusionskoeffizienten, darstellt.
Mikroelektroden zeigen im Vergleich zu Makroelektroden noch einen weiteren
interessanten Aspekt. So kann bei Mikroelektroden eine Amplifizierung des
Stromsignals durch senkrechte Annäherung an eine leitende Oberfläche erreicht
werden. Dieser auch in der SECM-Technik genutzte Effekt ist bereits im Kapitel
„Stand der Forschung“ erläutert worden, seine Relevanz für den Affinitätsassay soll
jedoch noch einmal kurz aufgegriffen werden.
4.1.5 Signalamplifizierung durch Redoxrecycling
Polarisiert man eine Mikroelektrode auf ein Potential, so dass die in Lösung
befindliche Redoxspezies unter Diffusionskontrolle umgesetzt wird und nähert man
sie senkrecht sehr dicht an eine leitende Oberfläche an, so ist eine Erhöhung des
FARADAY-Stroms durch eine Regeneration des Redoxmediators an der leitenden
Oberfläche zu verzeichnen. Abbildung 4.1-6 zeigt eine simulierte Annäherungskurve
einer Mikroelektrode an eine leitende Oberfläche [217], bei der die Stromzunahme
gegen den Abstand zwischen Mikroelektrode und leitende Oberfläche aufgetragen
ist. Der Strom ist dabei auf den Stromwert der Elektrode in unendlicher Entfernung
von der Oberfläche normiert, und der Abstand d ist normiert auf den
Elektrodenradius r.
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 51
Aus Abbildung 4.1-6 wird deutlich, dass der Verstärkungsfaktor eine starke Funktion
des Abstandes zwischen Mikroelektrode und leitende Oberfläche ist und für kleine
Abstände sehr groß wird.
Zurückkommend auf den Affinitätsassay bedeutet dies, dass man durch Annäherung
der Mikroelektrode an eine leitende Oberfläche oder eine Makroelektrode eine
einfache Möglichkeit zur Amplifizierung des Assaysignals hat. Dabei lässt sich der
Verstärkungsfaktor über die Distanz zwischen Mikroelektrode und leitende
Oberfläche variieren und so flexibel an die jeweiligen Erfordernisse, z. B. bei
verschiedenen Analyten oder Konzentrationsbereichen anpassen.
Hierin liegt ein enormer Vorteil gegenüber Interdigitalelektroden (IDA), die ebenfalls
eine Signalverstärkung durch Redoxrecycling zeigen. Bei Interdigitalelektroden ist
der Abstand zwischen den einzelnen Elektrodenkämmen jedoch konstant, so dass
ein unveränderlicher Verstärkungsfaktor vorliegt. Will man den Verstärkungsfaktor
variieren, muss eine komplett neue Mikrostruktur mit einem anderen Abstand
zwischen den Elektrodenkämmen entworfen und gefertigt werden. Da
Interdigitalelektroden in Mikrotechnologie gefertigt werden und die Elektrodenkämme
aus mit Edelmetall bedampften Silizium bestehen, treten beim längeren Gebrauch
0.0 0.5 1.0 1.50
5
10
15
20
Vers
tärk
ung
sfakt
or
= i t /
i t, ∞
d / r
Abbildung 4.1-6 simulierte Annäherungskurve einer Mikroelektrode aneine leitende Oberfläche
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 52
Veränderungen oder Ablösungen des Elektrodenmaterials auf. Weiterhin erschwert
diese Bedampfung die Reinigung der Interdigitalelektroden, da ein Polieren der
Elektrodenoberflächen, wie im Falle glasummantelter Scheibenmikroelektroden nicht
möglich ist. Bei der elektrochemischen Reinigung der Interdigitalelektroden, z. B.
durch die elektrochemische Reduktion oder Oxidation von Wasser in Basen oder
Säuren, lösen sich durch die mechanische Belastung der Oberfläche durch die
Gasentwicklung häufig Teile des Elektrodenmaterials ab.
Aufgrund der genannten Kriterien wurden für den Affinitätsassay als
Arbeitselektroden glasummantelte Scheibenmikroelektroden mit einem Durchmesser
von 50 µm verwendet. Der für Mikroelektroden recht große Durchmesser erleichtert
durch entsprechend hohe Ströme das Messen bei kleinen Konzentrationen, zeigt
aber bei langsamen Vorschubgeschwindigkeiten dennoch die für Mikroelektroden
typischen Eigenschaften.
4.1.6 Messapparatur
Eine geeignete Messapparatur für den Affinitätsassay muss folgende
Voraussetzungen erfüllen:
• präzise Positionierbarkeit der Mikroelektrode in lateraler, insbesondere aber in
vertikaler Richtung
• Redoxamplifizierung
• elektrochemische Messzelle mit 3-Elektrodenanordnung
• Verwendung möglichst geringer Elektrolytvolumina
• potentielle Automatisierbarkeit durch Computerkontrolle aller Komponenten
Eine schematische Zeichnung der entwickelten Messapparatur, die diese
Voraussetzungen erfüllt, ist in Abbildung 4.1-7 dargestellt.
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 53
Potentiostat
Mikrometerschrauben zurlateralen Positionierung
Höhenverstellung mit Mikrometerschraube undcomputergesteuertem Piezoelement
Elektrodenhalter mitMikroelektrode
AERefGE
Personal Computer zurSteuerung und
Messwerterfassung
Messzellenhalter mitMesszelle
Abbildung 4.1-7 schematische Darstellung der Messapparatur für den Affinitätsassay
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 54
Die verwendete elektrochemische Messzelle ist aus durchsichtigem Acrylglas
gefertigt und hat zur Redoxamplifizierung einen extern kontaktierbaren planaren
Platinboden sowie eine integrierte Platin-Gegenelektrode. Vervollständigt wird die
3-Elektrodenanordnung über eine einschraubbare Ag/AgCl-Referenzelektrode. Der
Durchmesser der Messzelle beträgt ca. 0.5 cm und die Tiefe etwa 0.4 cm, wodurch
ein Arbeiten mit Elektrolytvolumina zwischen 200 und 600 µL möglich ist.
Die Mikroelektrode wird an eine Karosseriescheibe geklebt und mittels einer
Magnethalterung am Elektrodenturm befestigt.
Eine präzise Positionierung der Messzelle relativ zur Mikroelektrode kann mit Hilfe
von Verschiebetischen mit Mikrometerschrauben in alle Raumrichtungen
vorgenommen werden. Eine Feinjustierung des Abstandes zwischen Mikroelektrode
und leitendem Platinboden der Messzelle ist über ein zusätzliches im
Verschiebetisch integriertes computergesteuertes Hochspannungspiezoelement mit
einem maximalen Verstellweg von 200 µm möglich.
Der Potentiostat zur Messwertaufnahme ist ebenfalls computergesteuert. Mithilfe
eines Computerprogramms, welches analog zur Steuersoftware eines SECM
arbeitet, kann über die fortlaufende Kontrolle des FARADAY-Stroms der
Mikroelektrode die Annäherung der Messzelle an die Mikroelektrode automatisiert
erfolgen und bei einem vorher festgelegten Verstärkungsfaktor angehalten werden.
Durch Austausch der Mikrometerschrauben gegen computergesteuerte
Schrittmotoren und durch Benutzung von Schlauchpumpen zum Befüllen und
Entleeren der Messzelle ist eine vollständige Automatisierung des Messsystems
prinzipiell möglich.
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 55
4.1.7 Messvorgang mit Redoxamplifizierung
Nachdem der Messvorgang des Affinitätsassays ohne Redoxamplifizierung bereits in
Kapitel 4.1.3 bei der Erläuterung des Messprinzips prinzipiell dargestellt wurde, soll
im Folgenden kurz auf die Besonderheiten, die sich bei der Durchführung des
Affinitätsassays mit Redoxamplifizierung ergeben, eingegangen werden.
Abbildung 4.1-8 zeigt die prinzipiellen Schritte eines Messvorganges mit
Signalverstärkung durch Redoxrecycling.
(1) Im ersten Schritt wird die Mikroelektrode auf ein Potential polarisiert, so dass
die hapten-modifizierte Redoxspezies unter Diffusionskontrolle umgesetzt wird.
Bei gleichzeitiger Aufnahme des Stroms it wird die Mikroelektrode der leitenden
Oberfläche angenähert. Sobald ein bestimmter Verstärkungsfaktor erreicht ist,
wird die Annäherung abgebrochen und die Position der Mikroelektrode im
weiteren Verlauf der Messung nicht mehr verändert.
i1
Zugabe des Analyten
∆ t
+
it
i2
i2<i1
(1) (2) (3) (4)
Abbildung 4.1-8 Messvorgang des Affinitätsassays mit Redoxamplifizierung
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 56
(2) Ein elektrochemisches Messverfahren, das mit dem Diffusionskoeffizient der
Redoxspezies in Lösung korreliert ist, wird durchgeführt und der
diffusionskontrolliert fließende Strom i1 bestimmt.
(3) Der Analyt wird zugesetzt und die Inkubationszeit ∆t wird abgewartet.
(4) Das elektrochemische Messverfahren wird erneut durchgeführt und der
diffusionskontrolliert fließende Strom i2 ermittelt. Aus dem Strom i2 oder der
Stromdifferenz zwischen i1 und i2 kann durch Vergleich mit Kalibrierkurven die
Konzentration des Analyten bestimmt werden.
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 57
4.1.8 Detektion von Biotin-Streptavidin Bindungsereignissen über dieModulation des Diffusionskoeffizienten von Fc-Biotin
Als elektrochemisches Messverfahren für die Detektion von Bindungsereignissen
zwischen Fc-Biotin und Streptavidin wurde die cyclische Voltammetrie verwendet.
Das kontinuierliche Zyklisieren der Mikroelektrode reduziert Effekte wie
Elektrodenfouling oder unspezifische Adsorption auf der Elektrodenoberfläche, wie
sie in chronoamperometrischen Messungen bei konstantem Potential auftreten
können.
In Abbildung 4.1-9 sind Sequenzen von cyclischen Voltammogrammen dargestellt,
die den Effekt der Modulation des Diffusionskoeffizienten von Fc-Biotin durch
Anbindung von Streptavidin demonstrieren.
200 250 300 350 400 450 500
-200
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
i [p
A]
E vs. Ag/AgCl [mV]
1
2
3
4
Abbildung 4.1-9 Cyclische Voltammogramme von Fc-Biotin vor und nach der Zugabe einerSättigungskonzentration an Streptavidin. Die roten Voltammogramme wurdenmit Redoxamplifizierung, die blauen ohne Redoxamplifizierung aufgenommen.(∅ Mikroelektrode = 50 µm, Scangeschwindigkeit = 10 mV/s, Elektrolyt-volumen = 300 µL, c(Fc-Biotin) = 100 µM)
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 58
Die cyclischen Voltammogramme von Fc-Biotin (Voltammogramme 1 und 3) zeigen
die typischen S-förmigen Strom-Potential-Kurven, wie sie für einen quasi-reversiblen
Elektronentransfer an einer Mikroelektrode zu erwarten sind. Aufgrund der geringen
Konzentration an Fc-Biotin und eines offensichtlichen langsamen
Elektronentransfers sind nur kleine Ströme zu beobachten. Dies führt zu einer
deutlichen Hysterese in den Voltammogrammen, zusätzlich verursacht durch die für
eine Mikroelektrode relativ große Elektrodenoberfläche, die zu merklichen
kapazitiven Ladeströmen der elektrochemischen Doppelschicht führt.
Die Stromdifferenz im diffusionslimitierten Potentialbereich zwischen
Voltammogramm 1 und 3 wird durch Redoxamplifizierung nach Annähern der
Mikroelektrode an eine leitende Oberfläche hervorgerufen.
Nach Zugabe einer Sättigungskonzentration an Streptavidin, so dass jedes Fc-Biotin
an Streptavidin gebunden ist, nimmt aufgrund der bereits erläuterten Abnahme des
Diffusionskoeffizienten von Fc-Biotin in beiden Fällen der diffusionskontrollierte
Strom ab. Voltammogramm 2 zeigt dabei die Stromabnahme mit Redox-
amplifizierung und Voltammogramm 4 ohne Redoxamplifizierung.
Die durch die Zugabe einer Sättigungskonzentration an Streptavidin verursachte
Stromabnahme in der Messreihe mit Redoxamplifizierung (rote Voltammogramme 1
und 2) ist um den Faktor 2.3 höher als die entsprechende Stromabnahme in der
Messreihe ohne Redoxamplifizierung (blaue Voltammogramme 3 und 4).
Daraus wird deutlich, dass durch Redoxrecycling das absolute Messsignal erhöht
werden kann, was die Sensitivität des Assays beträchtlich steigert und zu einem
höheren Signal-Rausch-Verhältnis führt. Redoxamplifizierung hat jedoch keine
Auswirkungen auf die Größe des Messbereichs, der durch die Konzentration der
hapten-modifizierten Redoxspezies bestimmt wird.
Da die Analytkonzentration aus den Stromwerten vor und nach der Anbindung von
Streptavidin bestimmt werden kann, ist es nicht notwendig, die absoluten Werte der
Diffusionskoeffizienten der gebundenen und ungebundenen Spezies zu ermitteln.
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 59
Als Kontrollversuche wurden analoge Experimente mit Ferrocencarbonsäure
(Fc-COOH) anstelle von Fc-Biotin durchgeführt.
Anhand des in Abbildung 4.1-10 dargestellten Kontrollexperiments mit Fc-COOH
wird deutlich, dass die Zugabe von Streptavidin zu einer Redoxspezies, die keine
affinante Wechselwirkung mit Streptavidin eingeht, zu keiner signifikanten Abnahme
des FARADAY-Stroms führt. Störeffekte, wie unspezifische Adsorption und
Elektrodenfouling sind vergleichsweise klein und können vernachlässigt werden.
In den bisher vorgestellten Experimenten, die die prinzipielle Machbarkeit des
Assayverfahrens demonstrieren, wurde jeweils ein Überschuss an Streptavidin
zugesetzt. Gibt man zur Fc-Biotin-Lösung kleinere Mengen an Streptavidin, so dass
nach der ersten Zugabe noch nicht alle Fc-Biotin-Moleküle einen Bindungspartner
zur Verfügung haben, so setzt sich der Diffusionsgrenzstrom aus Stromanteile des
Fc-Biotins und des Fc-Biotin-Streptavidin-Komplexes zusammen.
200 250 300 350 400 450 500-200
0
200
400
600
800
i [pA
]
E vs. Ag/AgCl [mV]
Abbildung 4.1-10 Kontrollexperiment mit Fc-COOH anstelle von Fc-Biotin ohne Redox-amplifizierungDas schwarze Cyclovoltammogramm wurde vor, das rote nach Zugabe vonStreptavidin aufgenommen.(∅ Mikroelektrode = 50 µm, Scangeschwindigkeit = 10 mV/s, Elektrolyt-volumen = 300 µL, c(Fc-COOH) = 100 µM)
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 60
In Abbildung 4.1-11 sind cyclische Voltammogramme (mit Redoxamplifizierung)
gezeigt, die nach sequentieller Erhöhung der Konzentration an Streptavidin in 5 µM
Schritten, erhalten wurden.
Der diffusionslimitierte Grenzstrom verringert sich nach jeder Zugabe an Streptavidin
und erreicht nach Zugabe von ca. 25 µM Streptavidin einen stationären Wert. Eine
weitere Erhöhung der Konzentration an Streptavidin führt zu keiner weiteren
signifikanten Verringerung des Diffusionsgrenzstroms. Sobald alle Fc-Biotin-
Moleküle an Streptavidin gebunden sind, führt eine weitere Erhöhung der
Konzentration an Streptavidin zu keiner weiteren Erniedrigung des
Diffusionskoeffizienten der redoxaktiven Spezies, so dass keine weitere
Stromabnahme erfolgt.
Trägt man die diffusionslimitierten Grenzströme gegen die Konzentration an
Streptavidin auf, so erhält man eine Kalibrierkurve für Streptavidin, die in Abbildung
4.1-12 gezeigt wird.
200 250 300 350 400 450 500
-200
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
i [p
A]
E vs. Ag/AgCl [mV]
Abbildung 4.1-11 Sequenz von cyclischen Voltammogrammen (mit Redoxamplifizierung) von Fc-Biotin nach schrittweiser Erhöhung der Konzentration an Streptavidin um jeweils5 µM(∅ Mikroelektrode = 50 µm, Scangeschwindigkeit = 10 mV/s, Elektrolyt-volumen = 300 µL, c(Fc-Biotin) 100 µM)
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 61
Ab einer Streptavidinkonzentration von 25 µM ist die Sättigung erreicht; es ist keine
weitere signifikante Stromabnahme zu verzeichnen. Berücksichtigt man, dass jedes
Streptavidin in der Lage ist, vier Fc-Biotin-Moleküle zu binden, korreliert die
Sättigungskonzentration von 25 µM Streptavidin gut mit der Konzentration an
Fc-Biotin von 100 µM.
Durch Biotin-Streptavidin als Modellsystem für molekulare Erkennung konnte gezeigt
werden, dass ein Affinitätsassay, der auf der Veränderung des
Diffusionskoeffizienten einer mit biologischen Erkennungselementen markierten
Redoxspezies basiert, ein tragfähiges Konzept darstellt. Der Messbereich des
vorgestellten Assays wird durch die Konzentration bzw. Stoffmenge der biotin-
markierten Redoxspezies bestimmt und kann somit einfach an verschiedene
spezifische analytische Fragestellungen adaptiert werden. Der stufenlos einstellbare
Verstärkungsfaktor erlaubt zudem ein einfaches Anpassen der Sensitivität an die
jeweiligen Anforderungen. Die untere Nachweisgrenze des Assays kann durch die
Verwendung von Potentiostaten mit stromsensitiven Vorverstärkern weiter gesenkt
werden. Eine zusätzlicher Schritt in diese Richtung kann durch die Erhöhung des
Verstärkungsfaktors durch dichteres Annähern der Mikroelektrode an die leitende
Oberfläche erreicht werden.
i [p
A]
0 5 10 15 20 25 30
900
1000
1100
1200
1300
1400
c (Streptavidin) [µM]
Abbildung 4.1-12 Kalibrierkurve für Streptavidin, abgeleitet aus den diffusionslimitierten Strömenbei 480 mV der cyclischen Voltammogramme in Abbildung 4.1-11
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 62
Die Universalität des Assayverfahrens wird im folgenden Kapitel unter weiterer
Nutzung des Biotin-Streptavidin-Systems durch die Erweiterung zu einem Sandwich-
Assay demonstriert. Damit wird die prinzipielle Möglichkeit geschaffen, jeden
biotinilierten Komplex zu bestimmen.
4.1.9 Sandwich-Assay zur Bestimmung biotinilierter Komplexe
Die Tatsache, dass Streptavidin vier Bindungsstellen für Biotin besitzt, ermöglicht die
Erweiterung des vorgestellten Affinitätsassays zu einem Sandwich-Assay. Dazu
muss im ersten Schritt mindestens eine der Bindungstaschen eines
Streptavidinmoleküls mit einem ferrocenmarkierten Biotin besetzt werden. In einem
zweiten Schritt kann danach die Anbindung eines beliebigen biotinilierten Komplexes
an die verbleibenden Bindungsstellen erfolgen.
Eine schematische Darstellung des Prinzips des Sandwich-Assays mit biotinilierter
Glucoseoxidase (GOD) als Beispiel für einen biotinilierten Komplex ist in Abbildung
4.1-13 dargestellt.
+
Überschuss
GODGOD +
Abbildung 4.1-13 schematische Illustration des Prinzips des Sandwich-Assays
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 63
Im ersten Schritt wird Fc-Biotin ein Überschuss an Streptavidin zugesetzt. Es können
nicht alle Bindungsstellen des Streptavidins besetzt werden. Dies hat zur Folge, dass
es eine den Mengenverhältnissen entsprechende statistische Verteilung von
Streptavidinmolekülen mit einem, zwei drei oder vier Fc-Biotin-Liganden gibt, da alle
Bindungsstellen von Streptavidin gleichwertig sind [147]. Die freien Bindungsstellen
stehen wiederum für die Anbindung eines weiteren Biotins oder Biotinderivats zur
Verfügung.
Da in beiden Schritten des Sandwich-Assays der Diffusionskoeffizient der
redoxaktiven Spezies moduliert wird, können in beiden Fällen die affinanten
Anbindungen mit elektrochemischen Messverfahren visualisiert werden. Der dem
Mittelwert der Diffusionskoeffizienten der mit unterschiedlich vielen Fc-Biotin-
Liganden modifizierten Streptavidinmoleküle entsprechende Stromwert stellt dabei
die Grundlinie für die nachfolgende Bestimmung des biotinilierten Komplexes dar.
In Abbildung 4.1-14 sind typische Cyclovoltammogramme eines Sandwich-Assays
unter Verwendung biotinilierter Glucoseoxidase gezeigt.
200 250 300 350 400 450 500
-200
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
i [p
A]
E vs. Ag/AgCl [mV]
1
23
4
Abbildung 4.1-14 Sequenz von Cyclovoltammogrammen eines Sandwich-Assays mit biotinilierterGlucoseoxidase mit RedoxamplifizierungVoltammogramm 1 wurde vor und Voltammogramm 2 nach Zusatz einesÜberschusses an Streptavidin zu Fc-Biotin aufgenommen. Voltammogramm 3entspricht der Zugabe von 15 µL Phosphatpuffer zur Evaluierung desVerdünnungseffekts. Voltammogramm 4 wurde nach Zusatz von 15 µL einerLösung biotinilierter Glucoseoxidase erhalten.(∅ Mikroelektrode = 50 µm, Scangeschwindigkeit = 10 mV/s, Elektrolyt-volumen = 300 µL, c(Fc-Biotin) = 100 µM)
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 64
Das erste Cyclovoltammogramm repräsentiert Fc-Biotin mit Redoxamplifizierung.
Nach Zusatzes eines Überschusses an festem Streptavidin tritt die bereits erläuterte
Abnahme des Diffusionsgrenzstroms auf (Voltammogramm 2). Da die biotinilierte
Glucoseoxidase in Phosphatpuffer gelöst vorliegt, wurde eine Evaluierung der durch
Volumenzunahme bedingten Stromabnahme durchgeführt. Hierzu wurden 15 µL
einer Phosphatpuffer-Lösung zugesetzt und die durch die Verdünnung (9,5 %, von
300 auf 315 µL) hervorgerufene Stromabnahme gemessen, die offensichtlich gering
ist (Voltammogramm 3). Im letzten Schritt wurden 15 µL biotinilierter Glucoseoxidase
zugesetzt (Voltammogramm 4), was zu einer sehr starken Abnahme des
Diffusionsgrenzstromes führt. Diese starke Stromabnahme, die sehr viel
ausgeprägter ist als im Fall von Streptavidin, kann zum einen auf das hohe
Molgewicht von Glucoseoxidase (M.W. ≈ 186.000 Da) und eine mögliche
Quervernetzung von redoxmarkierten Streptavidinmolekülen durch mehrfach
biotinilierte Glucoseoxidase (siehe Abbildung 4.1-13) zurückgeführt werden. Diese
Quervernetzung erhöht das Molgewicht noch weiter, was sich in den beobachteten,
veränderten Diffusionseigenschaften der redoxaktiven Ferrocenmarkierung
wiederspiegelt.
Es ist offensichtlich, dass eine Kalibrierkurve durch schrittweise Zugabe von
biotinilierter Glucoseoxidase erhalten werden kann.
Nach dem gleichen Sandwich-Prinzip wie bei biotinilierter Glucoseoxidase können
sämtliche StrepTag-modifizierte Proteine bestimmt werden.
Weiterhin kann das Konzept des vorgestellten Sandwich-Assays durch die
Einführung einer Redoxmarkierung an nahezu jedes konventionelle Sandwich-Assay
System adaptiert werden.
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 65
4.1.10 Miniaturisierung des Affinitätsassays
Obwohl mit der bisher benutzen Messzelle elektrochemische Messungen in geringen
Volumina zwischen 200 und 300 µL möglich waren, mussten doch vergleichsweise
große Mengen an kostenintensiven Substanzen wie Streptavidin, Fc-Biotin und im
Falle des Sandwich-Assays, eines biotinilierten Proteins, eingesetzt werden. Um den
Chemikalienverbrauch und damit die Analysekosten zu reduzieren und einen Schritt
in Richtung einer möglichen Automatisierung zu gehen, wurde ein Konzept zur
Miniaturisierung des Affinitätsassays erarbeitet. Dazu muss das zu einer Messung
erforderliche Volumen, unter Beibehaltung des Messprinzips und des prinzipiellen
Aufbaus, signifikant verringert werden.
Dies gelang unter Verwendung von sehr kleinen Flüssigkeitstropfen als wandfreie
elektrochemische Messzellen.
In Abbildung 4.1-15 ist eine schematische Darstellung und ein Foto des
miniaturisierten Messaufbaus gezeigt, mit dem elektrochemische Messungen in
kleinen Flüssigkeitstropfen möglich sind.
Ag/AgCl Pseudo-Referenz-elektrode
Pt-Gegen-elektrode
an Magnet befestigteKontaktklemme
Metallplatte
Mikroelektrode
Au-Makroelektrode
Abbildung 4.1-15 Schematische Darstellung und Foto der elektrochemischen Tropfenzelle mitmöglicher Redoxamplifizierung durch eine Gold-MakroelektrodeDie Platin-Gegenelektrode und die Pseudo-Referenzelektrode werden in denTropfen eingeführt, indem die auf Magneten montierten Klemmen auf derMetallplatte entsprechend ausgerichtet werden. Die Distanz zwischenMikroelektrode und Gold-Makroelektrode (∅ 2.5 mm) kann über Mikro-positioniersysteme eingestellt werden. Eine entsprechende Mikrometerschraubeist auf dem Foto vorne zu erkennen. Alle weiteren Komponenten derMessapparatur wurden bereits in Abbildung 4.1-5 gezeigt.
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 66
Die Mikroelektrode wird in kurzer Entfernung zur Gold-Makroelektrode
vorpositioniert. Mit Hilfe einer Mikroliter-Pipette wird ein Tropfen an das obere Ende
der Mikroelektrode gebracht, welcher den Schaft der Mikroelektrode heruntergleitet
und einen halbkugelförmigen Tropfen bildet, der die Spitze der Mikroelektrode
umschließt und durch die hydrophobe Tefloneinfassung der Gold-Makroelektrode
begrenzt wird. Typische verwendbare Tropfenvolumina liegen dabei im Bereich
zwischen 20 und 50 µL. Bei Tropfenvolumina kleiner als 20 µL gestaltet sich die
Zugabe von Streptavidin im Affinitätsassay als schwierig. Zudem spielen bei kleinen
Tropfen Verdampfungseffekte des Lösungsmittels eine stärkere Rolle als bei
größeren Tropfen.
Die elektrochemische 3-Elektrodenanordnung wird durch einen Platindraht als
Gegenelektrode und einen mit Silberchlorid beschichteten Silberdraht als Pseudo-
Referenzelektrode komplettiert. Die Drähte werden dabei von Kontaktklemmen
gehalten, die jeweils an einem Magneten befestigt sind. Die Klemmen können auf
einer Metallplatte so bewegt werden, dass die Enden des Platin- und Silberdrahts in
den Tropfen hineinragen.
Damit sind alle Voraussetzungen erfüllt, um elektrochemische Experimente im
Flüssigkeitstropfen mit Redoxamplifizierung durchführen zu können.
Im Folgenden soll gezeigt werden, dass es möglich ist, den beschriebenen
Affinitätsassay für Streptavidin, basierend auf der Modulation des
Diffusionskoeffizienten von Fc-Biotin, an die Tropfenzelle zu adaptieren.
Zunächst wird eine Tropfenzelle mit einem Tropfen Fc-Biotin-Lösung, wie oben
beschrieben, aufgebaut. Anschließend wird die Mikroelektrode auf +500mV
polarisiert und unter kontinuierlicher Aufnahme des Stroms an die Gold-
Makroelektrode angenähert bis der vordefinierte Amplifizierungsfaktor erreicht ist.
Das Potential der Gold-Makroelektrode wird dazu nicht potentiostatisch kontrolliert,
befindet sich also auf dem über die Nernst-Gleichung festgelegten „Open Circuit“-
Potential.
Ein elektrochemisches Experiment wird durchgeführt und der diffusionslimitierte
Strom bestimmt. Danach muss Streptavidin als komplementäre Erkennungsstruktur
zu Fc-Biotin zugesetzt werden, was sich aufgrund des kleinen Tropfenvolumens als
schwierig gestaltet, und ein erneutes elektrochemisches Experiment in der
Tropfenzelle zur Strombestimmung durchgeführt werden.
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 67
Bei der Zugabe von Streptavidin sind die folgenden prinzipielle Möglichkeiten zu
betrachten:
1) Man gibt Streptavidin in Lösung zu. Hierzu muss auch bei Zugabe kleinster
Volumina aufgrund der geringen Tropfengröße die Volumenzunahme
berücksichtigt werden, da eine signifikante Verdünnung der Konzentration der
Redoxspezies erfolgt. Die durch die Abnahme des Diffusionskoeffizienten der
Redoxspezies verursachte Stromabnahme wird überlagert von der
Stromabnahme, hervorgerufen durch die mit der Zunahme des Volumens
verbundene Konzentrationserniedrigung. Somit ist die Aufnahme einer weiteren
Kalibrierkurve, die nur die Volumenvergrößerung berücksichtigt, notwendig.
2) Die Zugabe von Streptavidin erfolgt in fester Form. Hierbei muss eine
Mindesttropfengröße vorhanden sein, so dass ein Teils des Volumens der
Tropfenzelle entnommen, Streptavidin in ihm gelöst und wieder der Tropfenzelle
hinzugefügt werden kann. Der Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, dass keine
Volumenzunahme berücksichtigt werden muss, und das Messsignal somit nur
der Stromabnahme entspricht, die auf die Veränderung des
Diffusionskoeffizienten zurückzuführen ist.
In Abbildung 4.1-16 sind die Cyclovoltammogramme eines entsprechenden
Experiments in einer 50 µL Tropfenzelle dargestellt.
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 68
Wie erwartet nimmt nach der ersten Zugabe von Streptavidin in den Tropfen aus
Fc-Biotin-Lösung der FARADAY-Strom aufgrund der Verringerung des
Diffusionskoeffizienten von Fc-Biotin ab (siehe Voltammogramm 1 und 2). Eine
weitere Zugabe von Streptavidin führt zu keiner weiteren Stromänderung
(Voltammogramm 3). Dies ist darauf zurückzuführen, dass bereits nach dem ersten
Zusatz von Streptavidin alle Fc-Biotin-Moleküle im Tropfen mit Fc-Biotin abgesättigt
sind und einer weitere Zugabe von Streptavidin zu keiner weiteren Veränderung des
Diffusionskoeffizienten der redoxaktiven Spezies führt. Verdampfungseffekte des
Tropfens können aufgrund der Tropfengröße von 50 µL und einer relativ kurzen
Messdauer vernachlässigt werden.
Mit diesem Experiment konnte demonstriert werden, dass eine Miniaturisierung des
vorgestellten Affinitätsassays durch die Verwendung von kleinen Tropfen als
elektrochemische Messzellen möglich ist.
Probleme ergeben sich jedoch bei der Reagenz/Proben-Dosierung und einer
potentiellen Automatisierung. Da kleinere Mengen als 0.1 mg nicht reproduzierbar
abgewogen werden können, ist die Aufnahme einer Kalibrierkurve mit den bisherigen
200 250 300 350 400 450 500
0
500
1000
1500
i [pA
]
E vs. Ag/AgCl [mV]
1
23
Abbildung 4.1-16 Sequenz von cyclischen Voltammogrammen (mit Redoxamplifizierung) in einerTropfenzelleVoltammogramm 1 wurde vor der Zugabe von Streptavidin zu Fc-Biotinaufgenommen, Voltammogramm 2 und 3 jeweils nach einer Zugabe von 0.1 mgfestem Streptavidin.(∅ Mikroelektrode = 50 µm, Scangeschwindigkeit = 10 mV/s, Elektrolyt-volumen = 50 µL, c(Fc-Biotin) = 100 µM)
4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 69
Mitteln nicht möglich. Die Zugabe von Streptavidin in Lösung als alternative Methode
weist ebenfalls einige Nachteile auf, die bereits ansatzweise diskutiert wurden.
Zusätzlich bringt die Zugabe von Lösung in die Tropfenzelle technische Probleme
mit sich. So ist mit manuellen Mikropipetten das minimal reproduzierbar dosierbare
Volumen etwa 1 µL. Will man die Miniaturisierung weiter vorantreiben, z. B. auf eine
Tropfengröße von unter 10 µL, so kann die Zugabe von Probe durch eine manuelle
Mikropipette zu einem hohen prozentualen Volumenfehler führen. Weiterhin ist bei
derartig kleinen Tropfen die Gefahr groß, dass beim manuellen Zugeben eine
Berührung der Pipettenspitze mit der Mikro- oder Makroelektrode stattfindet und so
der Amplifizierungsfaktor unkontrolliert während der Messung verändert wird.
Aus diesen Gründen muss im Hinblick auf eine weitere Miniaturisierung und
Automatisierung ein präzises, nicht-manuelles Dosierungsverfahren für den Einsatz
im miniaturisierten Affinitätsassay in der Tropfenzelle gefunden werden.
4.2 Aufbau und Fabrikation des Mikrodispensers 70
Die Arbeitsgruppe von Prof. Thomas Laurell, Institut für Elektrische Messtechnik,
Technische Hochschule Lund, Schweden arbeitet seit Jahren auf dem Gebiet der
Entwicklung von Dispensern und Ink-Jet-Verfahren zur Mikrodosierung von
Flüssigkeiten. Das Institut für Elektrische Messtechnik besitzt Reinraumlaboratorien,
in denen in Mikrotechnologie gefertigte Mikrodispenser gebaut werden können.
Im Rahmen eines durch den Deutschen Akademischen Auslandsdienstes (DAAD)
geförderten Kooperationsprojekts wurden während mehrerer Forschungsaufenthalte
in Schweden alle Komponenten des Mikrodispensers mit Mikrotechnologie im
Reinraum selbst hergestellt, zum fertigen funktionsfähigen Dispenser
zusammengebaut und an elektrochemische Anwendungen adaptiert.
4.2 Aufbau, Funktionsweise und Fabrikation des Mikrodispensers
Der im Folgenden vorgestellte und bereits in [258] publizierte Mikrodispenser
gestattet die reproduzierbare Dosierung kleinster Flüssigkeitsmengen im Piko- bis
Nanoliter-Maßstab. Die Größe einer Dosiereinheit kann dabei über die Anzahl von
hintereinander ausgestoßenen kleinen Tropfen festgelegt werden. Die Tropfen
bewegen sich nach dem Ausstoßen auf einer von Luftbewegungen unabhängigen,
stabilen linearen Flugbahn von 2-3 cm. Im weiteren Verlauf ist die Flugbahn
ungeordnet und von zufälligen Luftbewegungen und -verwirbelungen bestimmt.
Der Aufbau und das Funktionsprinzip des Mikrodispensers ist dabei ähnlich dem
eines konventionellen Tintenstrahldruckers mit Piezotechnologie und wird im
folgenden Abschnitt erläutert.
4.2.1 Aufbau
Der Mikrodispenser besteht aus zwei miteinander verbundenen, in Mikrotechnologie
gefertigten Siliziumstrukturen mit einer Größe von 13 x 6 mm. Die Struktur, welche
die Rückseite darstellt, besitzt einen Ein- und Auslasskanal zum Befüllen des
Dispensers und eine Membran, die mit einem Piezoelement verbunden ist. Das
Piezoelement ist an einen Spannungspulsgenerator angeschlossen. Die zweite
Siliziumstruktur formt den Durchflusskanal und besitzt gegenüberliegend der
4.2 Aufbau und Fabrikation des Mikrodispensers 71
Membran eine nach Außen gerichtete Siliziumpyramide mit einer Auslassöffnung. Im
Gegensatz zu konventionellen Ink-Jet-Druckköpfen, die mit nur einer Lösung aus
einem Reservoir befüllt werden können und bei denen ein Lösungswechsel ein
aufwendiges Verfahren darstellt, kann der hier vorgestellte Mikrodispenser im
Durchflussmodus betrieben werden. Mittels einer Schlauchpumpe kann z. B. ein
kontinuierlicher Lösungsfluss durch den Dispenser geleitet werden und zu
bestimmten Zeiten oder in bestimmten Intervallen kann dann eine Probe dispensiert
werden. Ist der Zuleitungsschlauch mit mehreren Probensegmenten befüllt, so
können durch Vorpumpen des entsprechenden Segmentes vor die Auslassöffnung
sequentiell definierte Mengen jedes Segmentes entnommen werden.
Eine schematische Zeichnung des Aufbaus des Mikrodispensers ist in Abbildung
4.2-1 dargestellt.
Flow inlet & outlet
Crossection of the third generation dispenser
Plexiglassstands
Piezoceramicbimorph
Actuatingmembrane
Flow channelPN-etch stop
defined nozzle
Bottom die
Top die
Abbildung 4.2-1 schematische Darstellung des Aufbaus des Mikrodispensers
4.2 Aufbau und Fabrikation des Mikrodispensers 72
Abbildung 4.2-2 zeigt ein rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der
Siliziumpyramide mit der Auslassöffnung. Die Höhe der Pyramide beträgt etwa
70 µm. Die Öffnung hat eine Größe von 40 µm x 40 µm; die Pyramidenwände haben
eine Breite von ca. 8 µm.
4.2.2 Funktionsweise
Zur einwandfreien Funktion des Mikrodispensers ist es essentiell, dass der
Mikrodispenser blasenfrei mit Lösung befüllt wird, da sonst statt einer
Tropfenformation lediglich eine Oszillation der Luftblase stattfindet [259].
Mittels eines Pulsgenerators wird ein kurzer, hoher Spannungspuls an das
Piezoelement angelegt. Typische Parameter sind Amplituden zwischen 10 und 35
Volt mit Pulsdauern um 100 µs. Im Falle von bimorphen Piezoelementen führt das
Anlegen des Spannungspulses zu einer kurzzeitigen Verbiegung. Dadurch drückt die
mittlere Plastikrolle (siehe Abbildung 4.2-1, unteres Bild) auf die Membran. Die
entstehende Druckwelle im Durchflusskanal führt zum Herauspressen eines
einzelnen Tropfens aus der pyramidenförmigen Düse auf der gegenüberliegenden
Seite der Membran. Die sich nach oben verjüngenden Form der pyramidenförmigen
Abbildung 4.2-2 SEM-Bild der pyramidenförmigen Auslassdüse des Mikrodispensers
4.2 Aufbau und Fabrikation des Mikrodispensers 73
Düse erhöht die Stabilität der Tropfenformation und der Flugbahn. Durch die kleine
Oberfläche des Randes der Auslassöffnung werden Störeffekte durch Benetzung,
Partikelablagerung oder Auskristallisierung von Lösungsbestandteilen reduziert. Da
die Dimensionen der Pyramidenwände sehr viel größer sind als die des oberen
Randes, werden durch die Oberflächenspannung leckende Flüssigkeit und
Flüssigkeitsreste auf die Pyramidenwände oder auf die Bodenfläche des Dispensers
gezogen, wo sie die Tropfenformation nicht beeinträchtigen.
Abbildung 4.2-3 zeigt das Herausdrücken und die Formation eines Tropfens aus der
pyramidenförmigen Düse.
Die Tropfenformation ist sehr reproduzierbar und es können Tropfen sehr schnell
hintereinander herausgeschossen werden. Stabile Tropfenbildung kann dabei bis in
den kHz-Bereich beobachtet werden. Die Fluggeschwindigkeit der ausgestoßenen
Tropfen ist unterhalb von 600 Hz, das Tropfenvolumen unterhalb von 1 kHz
unabhängig von der Frequenz [258].
Typische Betriebsfrequenzen liegen im niedrigeren Frequenzbereich um 100 Hz.
Die Geschwindigkeit des herausgedrückten Tropfens hängt stark von der Amplitude
des Spannungspulses ab und nimmt mit steigender Pulshöhe zu. Das
Tropfenvolumen hängt nur in geringem Maße vom Spannungspuls ab, sondern wird
vornehmlich durch die Größe der Auslassöffnung bestimmt [258]. Im Falle einer
Öffnung von 40 µm x 40 µm habe die einzelnen Tropfen ein Volumen von etwa
100 pL.
Mittels einer einfachen Steuerelektronik wird der Rückpuls zeitlich verlangsamt, so
dass Resonanzen im Dispenser verringert werden und eine stabilere
Tropfenformation erreicht wird.
Abbildung 4.2-3 Tropfenformation aus der pyramidenförmigen Düse
4.2 Aufbau und Fabrikation des Mikrodispensers 74
Das Anlegen von Spannungspulsen mit zu hoher Amplitude führt zur Bildung von
ungewollten kleineren Satellitentropfen, die sich neben dem größeren Haupttropfen
bilden. Die Flugbahn der Satellitentropfen unterscheidet sich dabei meist merklich
von der des Haupttropfens, so dass kein präzises lokal aufgelöstes Dispensieren
möglich ist. Abbildung 4.2-4 zeigt die Bildung eines kleineren Satellitentropfen, der
nach dem Haupttropfen aus der pyramidenförmigen Düse gedrückt wird.
Ein weiterer zu berücksichtigender Punkt sind die physikalischen Eigenschaften der
Flüssigkeit, wie Viskosität, Oberflächenspannung und Dichte. Damit eine
Tropfenformation überhaupt stattfindet, muss die pulsartige Druckänderung die
Oberflächenspannungskräfte an der Auslassöffnung und die viskosen Druckverluste
im Inneren des Dispensers überschreiten und die Masse der ausgestoßenen
Flüssigkeit beschleunigen. In den meisten chemischen Anwendungen stellt dabei die
Oberflächenspannung den am häufigsten variierenden Parameter dar. Wässrige
Lösungen haben dabei hohe Oberflächenspannungen, während lösungsmittel-
basierte Flüssigkeiten, wie z. B. Ethanol oder Acetonitril, niedrige Oberflächen-
spannungen besitzen.
Die verschiedenen Flüssigkeitseigenschaften beeinflussen dabei Tropfengröße,
Geschwindigkeit und die Formation von Satellitentropfen, so dass die
Betriebsparameter, wie Pulshöhe und Pulslänge, entsprechend angepasst werden
müssen. Der hier vorgestellte Mikrodispenser gestattet verschiedene Flüssigkeiten
Abbildung 4.2-4 Bildung eines Satellitentropfen
4.2 Aufbau und Fabrikation des Mikrodispensers 75
mit einem weiten Bereich an Viskositäten und Oberflächenspannungen zu
dispensieren [260].
4.2.3 Fabrikationsverfahren
Das Herzstück des Mikrodispensers, die miteinander verbundenen Silizium-
strukturen, werden in Mikrotechnologie unter Reinraumbedingungen gefertigt. Das
Anbringen des Piezoelementes, der Halterung und der Schlauchverbindungen erfolgt
außerhalb des Reinraums.
Die Herstellung der beiden Siliziumstrukturen des Mikrodispensers im Reinraum
erfolgt mit photolitographischen Standardverfahren mit nachfolgenden Ätzschritten,
um die entsprechenden Mikrostrukturen zu erhalten.
Einige wichtige Grundlagen zur Mikrostrukturierung von Silizium werden im
Folgenden kurz dargestellt.
4.2.3.1 Grundlagen der Silizium-Mikrotechnologie
Silizium kristallisiert kubisch flächenzentriert im Diamanttyp mit einer Gitterkonstante
von a = 5.43 Å. Die entstehenden Netzebenen eines Kristallgitters werden durch drei
Miller-Indizes (h k l) klassifiziert.
Kommerziell erhältliche Einkristall-Siliziumwafer werden üblicherweise mit
Oberflächen (111), (100) und (110) angefertigt. In Abbildung 4.2-5 sind
entsprechende Kristallflächen gezeigt.
4.2 Aufbau und Fabrikation des Mikrodispensers 76
Es gibt zwei Dotierungsmöglichkeiten für Silizium: p-dotiert oder n-dotiert. N-dotiertes
Silizium besitzt einen Überschuss und p-dotiertes ein Defizit an Elektronen, was
bedeutet, dass beide elektrische Leiter ist. Typische Dotierungsmaterialen sind
Phosphor für n-dotiertes Silizium und Bohr für p-dotiertes Silizium. Zur Dotierung
wird Silizium in Gegenwart von Phosphin oder Diboran auf hohe Temperaturen
erhitzt. In der ersten Phase werden die Phosphor- oder Bohr-Atome an die
Siliziumoberfläche angelagert, in der zweiten Temperungsphase dringen die Atome
durch die bei hohen Temperaturen erhöhte Diffusionsrate tiefer in das Kristallgitter
ein.
Um Siliziumwafer in Ätzprozessen dreidimensional strukturieren zu können, muss
das gewünschte Strukturmuster auf das Silizium übertragen werden. Zu ätzende
Flächen müssen dabei frei bleiben, alle anderen Flächen müssen mit einer
Schutzschicht passiviert sein. Im Falle von KOH als Ätzmittel, kann Siliziumdioxid
(SiO2), das mit einer langsameren Rate geätzt wird als Silizium, zur Passivierung
verwendet werden [261]. Ein Siliziumwafer kann mit SiO2 als Passivierungsschicht
versehen werden, indem man die obersten Schichten bei hohen Temperaturen in
Wasserdampfatmosphäre oxidiert [262].
Der oxidierte Wafer wird mit einem lichtempfindlichen Polymer (positivem
Photoresist) beschichtet. Dazu wird in die Mitte des Wafers eine geringe Menge
Photoresist aufgetragen und der Wafer mit hohen Umdrehungszahlen rotiert, so
(100) (110) (111)
Abbildung 4.2-5 ausgewählte Kristallflächen der Kristallformen {100}, {110} und {111} desSiliziumkristalls
4.2 Aufbau und Fabrikation des Mikrodispensers 77
dass die gesamte Oberfläche mit Photoresist bedeckt wird (Spin Coating).
Anschließend wird eine Glasmaske, die das gewünschte Strukturmuster trägt,
ausgerichtet auf den Wafer gelegt und mit UV-Licht bestrahlt. Der mit dem
Photoresist beschichtete Wafer wird entwickelt, wobei der bestrahlte Teil des
Photoresist, dessen Polymerketten durch die UV-Bestrahlung zerstört wurden,
entfernt wird. Der verbleibende Photoresist stellt nunmehr eine Ätzmaske für das
chemische Ätzen von SiO2 mit gepufferter HF dar. Nachdem das SiO2 weggeätzt
und das darunterliegende Silizium freigelegt wurde, wird der verbleibende
Photoresist entfernt. Das Muster der Maske wurde somit in die Oxidschicht des
Wafers überführt. Das Schema dieses Prozesses ist in Abbildung 4.2-6 gezeigt.
(1)
(2)
(3)
(1) Der Wafer wird mit Photoresist beschichtetund durch eine Glasmaske, die dasStrukturmuster trägt, belichtet.
(2) Der bestrahlte Photoresist wird entfernt,dadurch wird das Strukturmuster in denPhotoresist übertragen.
(3) Das freigelegte SiO2 wird mit gepufferterHF geätzt. Das Strukturmuster wurde so indas SiO2 übertragen, das als Ätzmaske fürdas nachfolgende Siliziumätzen dient.
Abbildung 4.2-6 Schema des photolitographischen Prozessesschwarz = Si, grau = SiO2, rot = Photoresist
4.2 Aufbau und Fabrikation des Mikrodispensers 78
Silizium kann chemisch isotrop oder anisotrop geätzt werden. Beim isotropen Ätzen
ist die Ätzrate des Siliziums für alle Raumrichtungen gleich groß. Für isotropes Ätzen
benutzt man üblicherweise eine Mischung aus HNO3 und HF. Das Ätzprofil für ein
isotropes Ätzen von Silizium ist in Abbildung 4.2-7 dargestellt.
Beim anisotropen Ätzen treten unterschiedliche Ätzraten für unterschiedliche
Raumrichtungen des Kristalls auf. Übliche Ätzreagenzien hierfür sind wässrige KOH-
Lösungen oder Mischungen aus Ethylendiamin, Pyrocatechol und Wasser. Das
Ätzprofil hängt dabei von der Orientierung des Materials ab. Beim Ätzen von Silizium
mit KOH wird die (111) Kristallfläche langsamer geätzt und kann somit als
Ätzbegrenzung fungieren (Abbildung 4.2-8).
Abbildung 4.2-7 Ätzprofil für isotropes Ätzen von Siliziumschwarz = Silizium, grau = Ätzmaske
54.7°
a b
Abbildung 4.2-8 Ätzprofil von Silizium in KOHschwarz = Silizium, grau = Ätzmaskea) (100) orientierte Siliziumoberflächeb) (110) orientierte Siliziumoberfläche
4.2 Aufbau und Fabrikation des Mikrodispensers 79
Die Ätzraten für die (100) und (110) Flächen sind stark temperatur- und
konzentrationsabhängig und liegen im Bereich zwischen 0.3 und 1.5 µm/min. Bei in
der Praxis üblichen Konzentration von 44 g KOH in 100 mL H2O und einer
Temperatur von 85 °C beträgt die Ätzrate für die (110) Fläche 1.4 µm/min und ist
damit etwa 400 mal höher als die Ätzrate der (111) Fläche. SiO2 als
Maskierungsmaterial wird unter diesen Bedingungen nur mit einer Rate von 14 Å/min
geätzt.
Umfangreiche und detaillierte Informationen über Mikrostrukturierung und
anisotropes Ätzen von Silizium finden sich beispielsweise in [261-266].
4.2 Aufbau und Fabrikation des Mikrodispensers 80
4.2.3.2 Herstellungsprozedur des Mikrodispensers
Als Basis für die Fertigung der Mikrodispenser dienen zwei konven-
tionelle Siliziumwafer, ∅ 76 mm, Orientierung (100), Bohr-Dotierung (p-dotiert). Der
Wafer für die Membranseite hat eine Dicke von 250 µm. Für die Seite mit der
Auslassöffnung wird ein Wafer mit einer Dicke von 360 µm verwendet.
Die unterschiedlichen Mikrostrukturen werden in mehreren, sich wiederholenden
Schritten in die Wafer geätzt. Zunächst wird die prinzipielle Methode erläutert,
danach werden nähere Erläuterungen gegeben und Bilder der einzelnen Schritte
gezeigt.
Ein Strukturierungsschritt besteht dabei aus folgenden Prozeduren
1. Die obere Schicht des Wafers wird 4 Stunden lang bei 1100 °C in
Wasserdampfatmosphäre oxidiert.
2. Mittels Spincoating wird der Wafer mit positivem Photoresist beschichtet.
3. „Soft Baking“ des Photoresist: 20 Minuten bei 75 °C
4. Die Maske, welche die gewünschte Struktur trägt, wird auf den Wafer gelegt,
anhand von Markierungen ausgerichtet und der zu ätzende Teil mit UV-Licht
bestrahlt.
5. Der belichtete Photoresist wird in der entsprechenden Entwickler-Lösung
entfernt.
6. „Hard Baking“ des Photoresist: 20 Minuten bei 120 °C
7. Der freigelegte Teil der SiO2-Schutzschicht wird durch Ätzen in gepufferter HF
entfernt.
8. Der Photoresist wird entfernt.
9. Das freigelegte Silizium wird anisotrop in wässriger KOH (0.4 g/mL) bei 80 °C
geätzt.
10. Der Wafer wird in einer Waschprozedur („RCA-Washing“) intensiv gereinigt.
4.2 Aufbau und Fabrikation des Mikrodispensers 81
Eine schematische Darstellung des Querschnitts durch eine Dispenser-Mikrostruktur
mit allen zur Herstellung notwendigen Ätzschritte ist in Abbildung 4.2-9 gezeigt.
Alle Strukturierungsschritte erfolgen nach der beschriebenen Prozedur durch
anisotropes Ätzen in KOH. Die letzten Ätzschritte bei beiden Wafern, in denen die
dünne Membran und die pyramidenförmige Düse freigelegt werden, unterscheiden
sich von den vorherigen Ätzschritten, da hier eine Begrenzung des Ätzprozesses
über einen sogenannten „pn-Etch Stop“ erfolgt. Eine schematische Darstellung
dieses Verfahrens ist Abbildung 4.2-10 gezeigt.
a
b
Abbildung 4.2-9 schematische Darstellung der Ätzschritte zur Herstellung der Dispenser-Mikrostrukturen
a) Wafer mit der Auslassöffnung (Wafer 1)(1) Ätzen der inversen Pyramide(2) Ätzen des Durchflusskanals(3) Öffnen und Freilegen der pyramidenförmigen Düse
b) Membran-Wafer (Wafer 2)(1) Vorätzen der Ein- und Auslassöffnung(2) Durchätzen der Ein- und Auslassöffnung und Ätzen der Membran mit
„Pushbar“ zum Anbringen des Piezoelements
4.2 Aufbau und Fabrikation des Mikrodispensers 82
Zur Herstellung der dünnen Membran und der pyramidenförmigen Düse, werden die
p-dotierten Wafer auf der entsprechenden Waferseite n-dotiert. Die Tiefe des
Eindringens der Phosphoratome in das Siliziumkristallgitter bestimmt dabei die Dicke
der Membran bzw. die Breite der Pyramidenwände.
Zunächst wird die Außenseite des Wafers mit der inversen Pyramide solange in
KOH geätzt, bis die gewünschte Größe der Öffnung erreicht ist. Das Ätzen wird
dabei von Zeit zu Zeit unterbrochen und der Wafer im Mikroskop inspiziert.
Anschließend wird potentiostatisch ein Passivierungspotential von +0.7 V gegen eine
Platinelektrode als Referenz an die n-dotierte Seite des Wafers angelegt. Durch das
anodische Potential wird das n-dotierte Silizium durch fortlaufende elektrochemische
Oxidbildung passiviert [267]. Aufgrund der umgekehrten Polarität der pn-Sperrschicht
liegt das p-dotierte Silizium weiterhin auf dem „Open Circuit“-Potential und wird somit
weiterhin geätzt. Wird während des Ätzens eine n-dotierte Schicht erreicht, so wird
aufgrund der Passivierung der Ätzvorgang automatisch an der n-dotierten Schicht
gestoppt [268-270]. Beim letzten Ätzschritt des anderen Wafers mit der Membran
wird bereits zu Beginn des Ätzvorgangs im „pn-Etch Stop“-Verfahren die n-dotierte
Seite polarisiert.
a b
c d
Abbildung 4.2-10 schematische Darstellung des "pn-Etch Stop"-Prozessesa) anisotropes Ätzen der inversen Pyramide in die Mitte des Durchflusskanalsb) n-Dotieren der Waferseite mit der inversen Pyramidec) anisotropes Ätzen von der Außenseite des Wafers bis die gewünschte Größe
der Auslassöffnung erreicht istd) Freilegen der Pyramide durch weiteres Ätzen mit pn-Etch Stop, bei dem nur
p-dotiertes Silizium geätzt wird
4.2 Aufbau und Fabrikation des Mikrodispensers 83
1. Schritt: Ätzen der inversen Pyramide (Wafer 1)
Abbildung 4.2-11 vollständig geätzte inversePyramide
Abbildung 4.2-12 unvollständig geätzte inversePyramide
Im ersten Schritt wird die Innenseite der pyramidenförmigen Düse anisotrop in den
Wafer geätzt. Der Ätzschritt ist dabei, wie im Grundlagenteil erläutert,
selbstlimitierend. Die beiden Abbildungen zeigen Mikroskopaufnahmen einer bis zum
Ende geätzten inversen Pyramide (kleine Spitzenfläche, Abbildung 4.2-11) und einer
unvollständig geätzen inversen Pyramide (große Spitzenfläche, Abbildung 4.2-12).
Das Mikroskop ist jeweils auf die Pyramidenspitze bzw. auf das Plateau fokussiert.
Bei der unvollständig geätzten Pyramide wurde der Ätzvorgang vor der
Selbstlimitierung des anisotropen Ätzens abgebrochen. Man erkennt, dass die
Pyramide noch nicht bis zum Ende geätzt wurde, da an der tiefsten Ätzstelle ein
großes Plateau statt einer kleinen Spitzenfläche zu beobachten ist. Die dunklen
Quadrate zeigen die Bodenflächen der Pyramiden, die hellen Flächen entsprechen
den Flächen der Pyramidenspitzen. Die Tiefe der vollständig geätzten Pyramide
beträgt etwa 250 µm, die quadratische Grundfläche hat eine Seitenlänge von
300 µm.
4.2 Aufbau und Fabrikation des Mikrodispensers 84
2. Schritt: Ätzen des Durchflusskanals (Wafer 1)
Im zweiten Schritt wird der längliche Durchflusskanal mit einer Tiefe von 50-60 µm
anisotrop in die Waferseite mit der inversen Pyramide geätzt. Dabei befindet sich die
inverse Pyramide in der Mitte des Durchflusskanals, der eine Länge von etwa 12 mm
aufweist. Abbildung 4.2-13 zeigt einen Ausschnitt des mittleren Teils des
Durchflusskanals mit der in schwarz zu erkennenden inversen Pyramide.
3. Schritt: Phosphor-Dotierung (Wafer 1 und 2)
Beide Wafer werden bei einer Temperatur von 1000 °C in Gegenwart eines hoch mit
Phosphor dotierten Wafers n-dotiert. Dabei ist zu beachten, dass die Seite mit den
inversen Pyramiden zum phosphordotierten Wafer orientiert ist, damit nur diese
dotiert wird. Beim zweiten, neuen Wafer für die Membranseite des Dispensers spielt
dies keine Rolle: Nach dem Dotierungsprozess muss lediglich bekannt sein, welche
Seite des Wafers n-dotiert ist.
Anschließend werden die Wafer eine Stunde lang bei 1100 °C oxidiert. In diesem
Temperungsschritt diffundieren die Phosphoratome tiefer in das Kristallgitter des
Silizium, wodurch die spätere Dicke der Membran und Pyramidenwände bestimmt
wird.
Abbildung 4.2-13 eingeätzter Durchflusskanal
4.2 Aufbau und Fabrikation des Mikrodispensers 85
4. Schritt: Vorätzen der Ein- und Auslassöffnungen (Wafer 2)
In die n-dotierte Seite des Membran-Wafers werden quadratische Löcher, welche die
späteren Ein- und Auslassöffnungen an den Enden des Durchflusskanals darstellen,
geätzt. Die Tiefe muss dabei mindestens 30 µm betragen. In einem späteren Schritt
wird von der Rückseite her die Öffnung durchgeätzt.
5. Schritt: Freilegen der pyramidenförmigen Düse (Wafer 1)
Zum Freilegen der pyramidenförmigen Düse wird von der bisher unstrukturierten
Rückseite her geätzt. Mit Hilfe photolitographischer Maskierung wird nicht die
gesamte Rückseite geätzt, sondern nur der Teil der Fläche, der sich direkt um der
Pyramide befindet. Zunächst wird konventionell in KOH geätzt, bis der erste
Durchbruch durch den Wafer zu beobachten ist. Danach wird in kurzen
Zeitabständen mit häufiger Kontrolle im Mikroskop soweit geätzt bis eine Öffnung
von 40 x 40 µm entstanden ist. Anschließend wird das Ätzen in KOH mit der
beschriebenen „pn-Etch Stop“-Technik fortgesetzt, bis die Pyramide auf einer Höhe
von etwa 70 µm freigelegt ist.
Abbildung 4.2-14 freigelegte pyramidenförmige Düse
4.2 Aufbau und Fabrikation des Mikrodispensers 86
Abbildung 4.2-14 zeigt die Aufsicht auf die freigelegte pyramidenförmige Düse. Der
graue Teil in der Mitte stellt die quadratische von unten beleuchtete Öffnung dar, die
von einem scharf definierten, 7 µm dicken Rand umgeben ist. Die breite schwarze
Umrandung entspricht den zum Boden des Wafers hin breiter werdenden
Seitenwänden der Pyramide.
6. Schritt: Ätzen der Membran und der Ein- und Auslassöffnungen (Wafer 2)
Mittels Photolitographie wird die Struktur der Membran und der Ein- und
Auslasskanäle auf die bisher unbehandelte p-dotierte Seite des Membran-Wafers
übertragen. Es wird vom Beginn des Ätzvorgangs in KOH an mit „pn-etch stop“-
Technik geätzt. Da bereits von der anderen Seite her der Ein- und Auslasskanal in
einer Tiefe von mehr als 30 µm vorgeätzt wurden, wird an diesen Stellen durch den
Wafer geätzt und die Kanäle werden geöffnet. Die Membran wird bis zu ihrer durch
den n-Dotierungsprozess definierten Dicke geätzt. In der Mitte der Membran bleibt
ein durch Maskierung geschützter dünner Siliziumstreifen (Pushbar) ungeätzt, um
später das Piezoelement an diesem zu befestigen.
4.2 Aufbau und Fabrikation des Mikrodispensers 87
Nach allen Ätzprozessen sehen die Wafer wie folgt aus:
Wafer mit pyramidenförmiger Auslassdüse (Wafer1)
Außenseite mit pyramidenförmiger Düse(befindet sich jeweils an den Kreuzungen)
Innenseite mit Durchflusskanal und Innenseite derpyramidenförmigen Auslassdüse
Membran-Wafer (Wafer 2)
Außenseite des Dispensers mit Membran und Ein-und Auslasskanal
Innenseite des Dispensers mit Ein- undAuslasskanal
Abbildung 4.2-15 fertige Wafer nach Beendigung aller Ätzvorgänge
4.2 Aufbau und Fabrikation des Mikrodispensers 88
7. Schritt: Direktes Verbinden der Wafer durch „Silicon Fusion Bonding“
Wenn zwei Wafer dicht zusammengebracht werden, so findet eine spontane feste
Bindung statt.
Direktes Binden der Wafer durch „Fusion Bonding“ ist möglich zwischen:
• zwei reinen Siliziumwafern
• einem reinen Siliziumwafer und einem Siliziumwafer mit einer thermischen
Oxidschicht
• zwei Siliziumwafern mit einer thermischen Oxidschicht
Es wird vermutet, dass die Bindung im Falle von hydrophoben Waferoberflächen auf
van der Waals-Wechselwirkungen und im Falle von hydrophilen Oberflächen auf
Wasserstoffbrückenbindung zurückzuführen ist [271,272]. In einem Temperungs-
schritt bei hohen Temperaturen kann die Stärke der Bindung weiter gefestigt werden.
Das Verbinden der Wafer durch „Fusion Bonding“ ist ein kritischer Schritt. Die
Qualität und Reinheit der Oberfläche ist entscheidend für eine erfolgreiche Bindung.
Im ersten Schritt werden die sorgfältig gereinigten Wafer oxidiert. Die dünne
Oxidschicht des Membran-Wafers wird durch Ätzen in HF entfernt. Der oxidierte und
nicht-oxidierte Wafer werden mit Hilfe von Markierungen passend übereinander
gelegt und aneinander gepresst. Anschließend werden die verbundenen Wafer über
Nacht bei 800 °C getempert und so der Zusammenhalt erhöht.
8. Schritt: Schneiden der Wafer
Im nächsten Schritt, der erste außerhalb des Reinraums, werden die Wafer entlang
der Kreuzmarkierungen auf der Außenseite des Wafers mit der pyramidenförmige
Düse (siehe Abbildung 4.2-15, oben links) maschinell geschnitten.
Wenn die Wafer homogen geätzt wurden, so dass alle Strukturen gleich und intakt
sind, so erhält man 46 Dispenser-Mikrostrukturen. In der Praxis verliert man jedoch
einige Dispenser durch nicht geöffnete pyramidenförmige Düsen, schlecht definierte
nicht quadratische Auslassöffnungen oder defekte Membranen.
4.2 Aufbau und Fabrikation des Mikrodispensers 89
9. Schritt: Anbringen des Piezoelements und der Schlauchverbindungen
Der hier vorgestellte Mikrodispenser hat, abweichend von dem in Abschnitt 4.2.1
erläuterten Dispenser, ein verbessertes Verfahren zum Generieren des Druckpulses.
Das bimorphe Piezoelement wird gegen einen Piezostapel ersetzt, der direkt an den
hochstehenden Siliziumstreifen der Membran angeklebt wird. Dadurch kann auf die
Plastikrollen verzichtet werden, was die Herstellungsprozedur vereinfacht und
verkürzt. Das Funktionsprinzip bleibt trotz dieser Modifikation gleich, ist aber in
Abbildung 4.2-16 noch einmal schematisch dargestellt.
Abbildung 4.2-16 Aktuatorprinzip des Dispensers mit einem PiezostapelBeim Anlegen des Spannungspulses dehnt sich der Piezostapelkurzzeitig aus und drückt auf die Membran, so dass einFlüssigkeitstropfen aus der gegenüberliegenden Öffnungausgestoßen wird.
4.2 Aufbau und Fabrikation des Mikrodispensers 90
Der Piezostapel wird in eine U-förmige Plastikhalterung geklebt. Die Plastikhalterung
wird auf der Siliziumstruktur so ausgerichtet, dass das Piezoelement direkt auf den
Pushbar der Membran drückt. Die Membran wird mit dem Piezoelement verklebt und
die Plastikhalterung ober- und unterhalb der Membran mit der Siliziumstruktur.
An die Ein- und Auslassöffnung werden Silikonschläuche geklebt, über die Standard-
Teflonschläuche zum Befüllen des Dispensers angeschlossen werden können.
Abbildung 4.2-17 zeigt einen zusammengebauten Dispenser vor dem Anbringen der
Silikonschläuche an die Füllkanäle. Eine dieser beiden quadratischen Öffnungen ist
in der Mitte des rechten Teils der Siliziumstruktur zu erkennen. In der Mitte der
Siliziumstruktur befindet sich das mit der Membran verbundene Stapel-Piezoelement
mit angelöteten Kabeln.
Abbildung 4.2-17 fertig zusammengebauter Dispenser
4.3 Elektrochemie in Pikolitertropfen 91
Die Tropfengröße eines einzelnen Tropfens, der aus einem Mikrodispenser mit einer
Auslassöffnung von 40 µm x 40 µm geschossen wird, kann mit einem optischen
Aufbau, der aus einem Stroboskop und einer CCD-Kamera besteht, aus dem
Durchmesser der Tropfen abgeschätzt werden und beträgt etwa 100 pL. Im
folgenden Kapitel wird eine alternative elektrochemische Methode zur Bestimmung
der Größe eines Tropfens vorgestellt.
4.3 Elektrochemie in Pikolitertropfen
Die Verdampfungsrate von Tropfen im Piko- bis Nanoliterbereich mit einem großen
Verhältnis von Oberfläche zu Volumen ist sehr hoch, so dass unmittelbar nach dem
Auftreffen auf eine Oberfläche Verdampfungseffekte einsetzen und die Flüssigkeit
des Tropfens in wenigen Augenblicken in die Gasphase übergeht.
Um elektrochemische Messungen in einem Tropfen durchführen zu können, müssen
die ausgestoßenen Tropfen durch ein Konservierungsverfahren vor dem
Verdampfen bewahrt werden.
4.3.1 Deposition und Konservierung von Pikolitertropfen in Öl
In der Literatur wurde beschrieben, dass es möglich ist, mit Mikropipetten oder
Diffusions-Mikrobüretten abgelegte Tropfen bzw. mit einem Zerstäuber versprühte
Tropfen unter einer Ölschicht oder unter Heptan zu konservieren [273,274]. Bislang
konnte jedoch nicht gezeigt werden, dass es möglich ist, mit nicht-manuellen
Methoden kleinste Flüssigkeitsmengen mit hoher Reproduzierbarkeit und an
definierten Orten zu konservieren.
Als Konservierungsverfahren wurde die Deposition der Pikolitertropfen auf einem
Glasobjektträger unter einer Ölschicht untersucht. Als Öl wurde dabei aufgrund
seiner Viskosität und seiner optischen Eigenschaften Paraffinöl ausgewählt.
Zunächst muss untersucht werden, ob es möglich ist, mit dem Dispenser Tropfen
durch einen Ölfilm bis auf den Glasobjektträger zu schießen, wo sie anhaften und
konserviert werden.
4.3 Elektrochemie in Pikolitertropfen 92
Ein konventioneller Glasobjektträger wird mit einem Paraffinölfilm belegt. Der
Dispenser wird mit einer Lösung an „Green Fluorescent Protein“ (GFP) gefüllt.
Mittels eines Drehgelenks wird der Dispenser so orientiert, dass der Winkel zwischen
der horizontal liegenden Glasoberfläche und der Flugbahn der Tropfen größer als
45° ist. Anschließend wird der Dispenser dicht an den Ölfilm auf dem
Glasobjektträger angenähert. Durch Anlegen eines Spannungspulses an das
Piezoelement des Dispensers wird ein einzelner Tropfen aus der pyramidenförmigen
Öffnung in Richtung des Ölfilms herausgeschossen.
Es können je nach Schichtdicke des Ölfilms und Geschwindigkeit des Tropfens
folgende Fälle auftreten:
• Der Ölfilm ist zu dick. Der Tropfen trifft auf den Ölfilm, kann jedoch nicht tief genug
in das Öl eindringen und schwimmt auf dem Ölfilm. Neigt man den
Glasobjektträger, so dass der Ölfilm sich langsam bewegt, so bewegt sich auch
der Tropfen. Durch den partiellen Kontakt des Tropfens mit dem Öl wird die
Verdampfung zwar verlangsamt aber nicht unterbunden.
• Der Ölfilm ist zu dünn. Der Tropfen trifft auf den Ölfilm und dringt bis zum
Glasobjektträger vor, verdrängt aber dadurch das Öl von der Glasoberfläche. Der
Tropfen ist nicht durch einen Ölfilm geschützt und verdampft. Das viskose Öl fließt
nicht nach und im Ölfilm bleibt ein Loch von der Größe des auf die Glasoberfläche
aufgetroffenen Tropfens zurück.
• Bei einer optimalen Dicke des Ölfilms durchdringt der Tropfen den Ölfilm, dringt
bis zur Glasoberfläche vor, haftet dort an und wird vom umgebenen Öl vor dem
Verdampfen geschützt.
Als Testsubstanz wurde zunächst fluoreszierendes GFP verwendet, da mit Hilfe der
Fluoreszenzmikroskopie zwischen kristallinem GFP und GFP in Lösung
unterschieden werden kann. GFP besitzt ein Absorptionsmaximum bei einer
Wellenlänge von 397 nm und ein Emissionsmaximum bei 510 nm [275].
4.3 Elektrochemie in Pikolitertropfen 93
Abbildung 4.3-1 fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von GFP-Spots auf einer Glasoberfläche
Abbildung 4.3-2 fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von in Öl konservierten GFP-Tropfen
In Abbildung 4.3-1 ist eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme (Filter:
BP = 450-490 nm, FT = 510 nm, LP = 520 nm) eines Rasters von einzelnen GFP-
Tropfen gezeigt, die auf eine Glasoberfläche geschossen wurden. Im rechten Teil
der Abbildung ist ein Spot vergrößert dargestellt. Zwischen dem Dispensieren der
einzelnen Tropfen wurde die relative Position des Glasobjektträgers zum Dispenser
geändert. Zur exakten lateralen Positionierung kann der Glasobjektträger mit zwei
Mikrometerschrauben bewegt werden. Der Abstand zwischen zwei Spots beträgt
jeweils 300 µm. Trifft ein einzelner Tropfen auf die Glasoberfläche, so verdampft die
Flüssigkeit, und die im Tropfen enthaltene GFP-Menge kristallisiert aus und bleibt
auf der Glasoberfläche zurück, wodurch die heterogene Struktur der GFP-Spots
entsteht. Abbildung 4.3-2 zeigt ein analoges Experiment, bei dem die Tropfen in
einen Ölfilm optimaler Dicke geschossen wurden. Der GFP-Tropfen haftet an der
Glasoberfläche und wird vom umgebenen Öl vor dem Verdampfen geschützt. Die
4.3 Elektrochemie in Pikolitertropfen 94
milchige homogene Färbung mit der höchsten Intensität in der Mitte der Spots zeigt,
dass GFP in Lösung vorliegt und nicht auskristallisiert ist. Die Konservierung der
Tropfen durch das umgebende Öl ist dabei über mehrere Stunden stabil.
Bei den durchgeführten Versuchen mit Fluoreszenz ist die Art des verwendeten Öls
von großer Bedeutung, da es keinerlei Eigenfluoreszenz aufweisen darf. Mineral-
oder Pumpenöle zeigen im Fluoreszenzbereich von GFP eine derartig hohe
Fluoreszenz, so dass das im Öl konservierte GFP nicht detektiert werden kann.
Abhilfe schafft hier die Verwendung von Paraffinöl, welches aus langkettigen
gesättigten Alkanen besteht und keine fluoreszierenden Eigenschaften besitzt.
4.3.2 Elektrochemie in konservierten Pikolitertropfen
Der Mikrodispenser wird mit einer Lösung einer redoxaktiven Substanz befüllt und
Pikolitertropfen werden in einen auf einem Glasobjektträger befindlichen Ölfilm
geschossen und dort konserviert. Dies führt zur Ausbildung von elektrochemisch
aktiven „Enklaven“ im elektrochemisch inerten Öl.
Um elektrochemische Messungen in den konservierten Tropfen durchführen zu
können, muss eine entsprechende Messapparatur konzipiert werden, die folgende
Bedingungen erfüllt:
• Eine miniaturisierte Messsonde, z. B. eine Mikroelektrode, muss mit hoher
Präzision in den Tropfen eingeführt werden können.
• Eine optische Kontrolle, mit der die konservierten Tropfen visualisiert werden
können, so dass sie mit der Messsonde angefahren werden können.
• Komplettierung der 3-Elektrodenanordnung durch Referenz- und Gegenelektrode.
Ein Beispiel für einen derartigen Aufbau wurde kürzlich von Kashyap und Gratzl
beschrieben [273]. In diesem Aufbau wurden eine Mikroelektrode und eine
miniaturisierte Referenzelektrode (beide mit einem nominalen Durchmesser von
7.5 µm) in Heptan konservierte Pikolitertropfen einer Lösung von [Ru(NH3)6]3+
eingeführt und elektrochemische Messungen durchgeführt. Es wurde jedoch
festgestellt, dass bei diesem Aufbau Probleme durch die Referenzelektrode
4.3 Elektrochemie in Pikolitertropfen 95
auftraten. Das verwendete Agar-Diaphragma besaß nicht die erforderlichen
Eigenschaften in Bezug auf Dichtigkeit, so dass ein Teil des Tropfens durch das
Diaphragma in die Referenzelektrode diffundierte. Mit einem ähnlichen Aufbau unter
Verwendung einer Diffusions-Mikrobürette [274] konnten komplexometrische [276]
und Säure-Base-Titrationen [277] in Pikolitertropfen durchgeführt werden.
Weiterhin konnten mit ionensensitiven Mikrokapillarelektroden potentiometrische
Messungen in manuell abgelegten, unter Öl konservierten Tropfen durchgeführt
werden. Durch ionensensitive Mehrkanal-Elektroden gelang die simultane
Bestimmung der Mg2+-Konzentration und des pH-Wertes [278].
Im Folgenden wird ein neuer Ansatz für einen Aufbau vorgestellt, der
voltammetrische Messungen in konservierten Pikolitertropfen gestattet.
Abbildung 4.3-3 zeigt ein schematisches Bild des entsprechenden Aufbaus. Der
Glasobjektträger wird auf einer U-förmigen Halterung befestigt, so dass er mit Hilfe
des Videomikroskops von unten beobachtet werden kann. Zur Visualisierung der
konservierten Tropfen ist eine Anpassung der Lichtverhältnisse durch eine
Kaltlichtquelle unerlässlich. Der Objektträger kann über Mikrometerschrauben lateral
bewegt werden, um die konservierten Tropfen in den Blickwinkel des
Videomikroskop
x,y,z-Mikrometer-Verschiebetische
Glasobjektträger mit Ölfilm undPikolitertropfen
Klemmenhalter für Referenz-und Gegenelektrode Halter für
Mikroelektrode
Abbildung 4.3-3 schematische Darstellung des Aufbaus zur Durchführung von elektro-chemischen Messungen in konservierten Pikolitertropfen mit Mikroelektroden
4.3 Elektrochemie in Pikolitertropfen 96
Videomikroskops zu bringen. Mithilfe der Mikrometerschraube zur
Höhenpositionierung kann der Objektträgers in den Beobachtungsabstand des
Videomikroskops gebracht werden und so die Schärfe des Bildes justiert werden.
Die Mikroelektrode wird an dem Elektrodenhalter befestigt und kann über
Mikrometerschrauben bzw. Schrittmotoren ebenfalls in allen Raumrichtungen frei
positioniert werden.
Die 3-Elektrodenanordnung wird komplettiert, indem außerhalb des Ölfilms ein
Tropfen wässriger Leitsalzlösung aufgebracht wird, so dass sich eine direkte
Phasengrenzfläche zwischen der wässrigen und der Ölphase ausbildet. In die
wässrige Phase werden über verschiebbare Magnetklemmen ein Platindraht als
Gegenelektrode und ein chloridisierter Silberdraht als Pseudo-Referenzelektrode
eingetaucht (siehe auch Kapitel 4.1.10.). Zur Erhöhung der Leitfähigkeit können dem
Paraffinöl geringe Mengen an Tetrabutylammonium-hexafluorophosphat (TBAPF6)
als Leitsalz zugesetzt werden.
Nachdem der Glasobjektträgers so positioniert wurde, dass die konservierten
Tropfen mit dem Videomikroskop lokalisiert werden konnten, wird die Mikroelektrode
in eine Position gebracht, so dass sie ebenfalls von der Videokamera erfasst wird.
Dazu werden nur die Verstelleinheiten für die Positionierung der Mikroelektrode
benutzt; die Position des Glasobjektträgers und damit die Position der Tropfen auf
dem Videobild bleiben unverändert. Abbildung 4.3-4 zeigt ein typisches Bild des
Videomikroskops vor dem Positionieren und Eintauchen der Mikroelektrode in den
Tropfen.
4.3 Elektrochemie in Pikolitertropfen 97
Oben rechts in der Abbildung ist die Spitze der Mikroelektrode mit ihrer isolierenden
Glasummantelung zu erkennen. Die aktive Elektrodenoberfläche (dunkler Kreis in
der Mitte) hat einen Durchmesser von 50 µm. In der Mitte der Abbildung erkennt man
mehrere konservierte Flüssigkeitstropfen, die einen Durchmesser von je etwa
100 µm besitzen. Die Mikroelektrode wird über einen Tropfen lateral positioniert und
dann abgesenkt und unter optischer Kontrolle in den Tropfen eingeführt. Sobald die
Spitze der Mikroelektrode in den Tropfen eintaucht, findet eine Adhäsion des
Tropfens an der Mikroelektrode statt, was im Videomikroskop als eine leichte
Verformung der Tropfenbegrenzung erkennbar ist.
Als elektrochemisch aktive Substanz wurde Kaliumhexacyanoferrat(III)
(K3[FeIII(CN)6]) verwendet, welches elektrochemisch reduziert werden kann. Das
Normalpotential dieser reversiblen Redoxreaktion liegt bei 360 mV vs. NHE [279].
Der Dispenser wurde mit einer 20 mM Lösung an Kaliumhexacyanoferrat(III) in 0.1 M
KCl befüllt und einzelne Tropfen wurden entsprechend dem erläuterten Verfahren in
Paraffinöl konserviert.
Abbildung 4.3-4 videomikroskopische Aufnahme der Mikroelektrode und der konserviertenTropfen. Zur besseren Visualisierung sind die Tropfen in einer nachträglichenBildbearbeitung weiß umrandet worden.
4.3 Elektrochemie in Pikolitertropfen 98
Abbildung 4.3-5 zeigt cyclische Voltammogramme einer Mikroelektrode mit
verschiedenen Vorschubgeschwindigkeiten, die mit der beschriebenen
Messanordnung in einem konservierten Tropfen K3[FeIII(CN)6]-Lösung erhalten
wurden.
Die cyclischen Voltammogramme zeigen nicht das für Mikroelektroden typische
sigmoide Verhalten, sondern eine ausgeprägte Peakform mit einer sehr hohen
Peakseparation. Die Peakseparation ist dabei stark abhängig von der
Vorschubgeschwindigkeit. Das Auftreten der Peakform und die hohe Peakseparation
können durch die schlechte Leitfähigkeit des Öls und die besonderen Eigenschaften
der elektrochemischen Zelle erklärt werden. Das Öl kann formal als Widerstand
zwischen Arbeits- und Gegen- bzw. Referenzelektrode betrachtet werden. Dadurch
tritt ein Potentialabfall („iR-Drop“) auf, um den das tatsächlich an der
Arbeitselektrode anliegende Potential vermindert wird. Dies bedeutet, dass sowohl in
reduktiver Richtung als auch in oxidativer Richtung ein höheres Potential
aufgewendet werden muss, um diesen Potentialabfall zu kompensieren. Dadurch
wird die Reduktionswelle weiter in den reduktiven Potentialbereich und die
-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40 4 mV/s 8 mV/s 16 mV/s 32 mV/s
i [nA
]
Potential vs. Ag/AgCl [V]
Abbildung 4.3-5 Cyclische Voltammogramme einer Mikroelektrode in einem in Öl konserviertenTropfen mit verschiedenen Vorschubgeschwindigkeiten(∅ Mikroelektrode = 50 µm, c(K3[Fe(CN)6]) = 20 mM)
4.3 Elektrochemie in Pikolitertropfen 99
Oxidationswelle in den oxidativen Bereich verschoben, was zu den beobachteten
hohen Peakseparationen führt.
Da das Volumen der konservierten Tropfen im Vergleich zum Durchmesser der
Elektrodenoberfläche von 50 µm relativ klein ist, tritt hier der elektrochemische
Sonderfall der Dünnschichtzelle auf. Man spricht von einer Dünnschichtzelle, wenn
das Lösungsvolumen und damit die absolute Menge an Redoxspezies so klein ist,
dass sie durch die Elektrode innerhalb kurzer Zeit vollständig umgesetzt werden
kann. Üblicherweise wird dies durch eine große Elektrodenoberfläche, die in einen
sehr dünnen Flüssigkeitsfilm der Elektrolytlösung taucht, erreicht.
Im hier beschriebenen Experiment liegt eine ähnliche Situation vor: Zu Beginn des
Potentialzyklus liegt die gesamte Menge an Kaliumhexacyanoferrat in der
Oxidationsstufe +III vor. Durch die fortlaufende Polarisierung der Mikroelektrode zu
reduktiven Potentialen wird das Hexacyanoferrat reduziert. Nach Unterschreitung
des Normalpotentials verläuft die Reduktion nicht mehr unter kinetischer Kontrolle,
beschrieben durch die Nernst-Gleichung, sondern unter Diffusionskontrolle. Ist das
Elektrolytvolumen groß genug, so stellt sich bei Mikroelektroden ein zeit- und
potentialunabhängiges Diffusionsfeld ein und der Strom mündet in einen stationären
Grenzwert. Im hier vorliegenden Fall nimmt der Strom im cyclovoltammetrischen
Experiment nach Überschreiten eines Maximums ab und kehrt zur Grundlinie zurück.
Dies lässt sich dadurch erklären, dass die Gesamtmenge der im Tropfen zur
Verfügung stehenden reduzierbaren Spezies umgesetzt wurde, so dass kein
Stromfluss mehr möglich ist.
Unter dieser Bedingung lässt sich über die in einem Halbzyklus ausgetauschte
Ladungsmenge das Volumen des konservierten Tropfens abschätzen. Der Strom
eines Halbzyklus wird über die Zeit integriert und so die Ladungsmenge bestimmt.
Unter der Annahme, dass pro Hexacyanoferrat-Molekül ein Elektron ausgetauscht
wird, kann die Anzahl der im Tropfen befindlichen Moleküle berechnet werden.
Mithilfe der bekannten Konzentration kann schließlich das Volumen des Tropfens
wie folgt berechnet werden:
== −−− L
]mol[]Lmol[]C[
]C[
Nc1062.1
QV
11A
19 (Gleichung 4.3-1)
4.3 Elektrochemie in Pikolitertropfen 100
Integriert man den Strom über die Zeit im Reduktionshalbzyklus cyclischer
Voltammogramme verschiedener Vorschubgeschwindigkeiten entlang der in
Abbildung 4.3-6 gezeigten Basislinien, so erhält man folgende Werte:
v [mV s-1] Q [*10-7 C]
4 3.38
8 3.54
16 3.91
Mit größer werdender Vorschubgeschwindigkeit steigt die ausgetauschte
Ladungsmenge an. Neben der Ladungsmenge, die durch einen heterogenen
Elektronentransfer zwischen Elektrode und Redoxmediatormolekülen ausgetauscht
wird, findet ein zusätzlicher Ladungstransfer durch das Aufladen der
elektrochemischen Doppelschicht an der Grenzfläche zwischen Elektrode und
Elektrolyt statt. Die Kapazität der elektrochemischen Doppelschicht einer Elektrode
im cyclovoltammetrischen Experiment ist eine Funktion der Vorschubgeschwindigkeit
und nimmt mit steigender Vorschubgeschwindigkeit zu. Trägt man die
0 100 200 300 400 500-30
-20
-10
0
10
20
30 4 mV/s
8 mV/s
16 mV/s
i [n
A]
t [s]
Abbildung 4.3-6 Integration des Stroms über die Zeit in cyclischen Voltammogrammenunterschiedlicher Vorschubgeschwindigkeiten in einem in Öl konserviertenTropfen
(∅ Mikroelektrode = 50 µm, c(K3[Fe(CN)6]) = 20 mM)
4.3 Elektrochemie in Pikolitertropfen 101
Ladungsmenge gegen die Vorschubgeschwindigkeit auf, so erhält man eine Gerade
(Abbildung 4.3-7).
Extrapoliert man die Gerade auf eine Vorschubgeschwindigkeit von 0 mV/s, so erhält
man einen Wert für die Ladungsmenge, bei der der kapazitive Anteil weitestgehend
eliminiert ist. Mithilfe der Regressionsgeraden wird hierfür ein Wert von 3.2 10-7 C
bestimmt. Durch Einsetzen in Gleichung 4.3-1 errechnet sich daraus ein Volumen
von 148 pL für den in Öl konservierten Tropfen.
Das mit dieser Methode bestimmte Tropfenvolumen ist somit in guter
Übereinstimmung mit den Tropfenvolumina, die mit optischen Methoden aus dem
Durchmesser des Tropfens unter Annahme einer Kugelform bestimmt wurden. Für
den hier verwendeten Mikrodispensertyp mit einer Auslassöffnung von 40 x 40 µm
wurden für Wasser Tropfenvolumina um 100 pL bestimmt. Wie bereits im vorherigen
Kapitel erläutert, ist das Tropfenvolumen ein für jeden Dispenser spezifischer
Parameter, der im wesentlichen von der Größe der Auslassöffnung, den
physikalischen Eigenschaften der Flüssigkeit und in geringem Maße auch von der
Höhe des Spannungspulses abhängig ist.
0 2 4 6 8 10 12 14 16
3.2
3.4
3.6
3.8
4.0
Q [
*10
-7 C
]
v [mV/s]
Abbildung 4.3-7 Auftragung des Ladungsmenge gegen die VorschubgeschwindigkeitLineare Regression: Steigung = 0.044, Achsenabschnitt = 3.2, r = 0.9999
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 102
4.4 Bestimmung der Diffusionskoeffizienten von Redoxmolekülenin elektrochemischen „time of flight“-Experimenten
Die Bestimmung von Diffusionskoeffizienten elektrochemisch aktiver Moleküle
erfordert die genaue Kenntnis von Systemparametern, wie Konzentration oder
Größe der elektrochemisch aktiven Oberfläche, die z. T. in langwierigen
Vorversuchen ermittelt werden muss.
Die präzisen Dosierungseigenschaften des Mikrodispensers in Kombination mit
zeitlich und lokal aufgelösten elektrochemischen Detektionsverfahren können
ausgenutzt werden, um die Diffusionskoeffizienten elektrochemisch aktiver Moleküle
ohne Kenntnis dieser Systemparameter zu bestimmen.
Hierzu wurde ein Messaufbau konzipiert, der im Folgenden schematisch und als
Fotografie dargestellt ist:
����������������������������������������������������������������������������������������
Gegen-elektrode
Referenz-elektrode
einschraubbareElektrode
Mikrodispenser
ausgestoßene Tropfen
0.1M KCl
X
YZ
Abbildung 4.4-1 schematische Darstellung und Fotografie des Messaufbaus zur Bestimmungvon Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 103
Eine Arbeitselektrode wird von unten in die elektrochemische Messzelle
eingeschraubt und mit einer Lösung, die nur Leitelektrolyt enthält befüllt, so dass
sich die aktive Elektrodenoberfläche dicht unterhalb des Oberfläche der Flüssigkeit
befindet. Der Mikrodispenser wird mit einer Lösung, welche die zu untersuchende
Redoxspezies enthält, befüllt. Mittels eines Gelenks wird der Winkel zwischen dem
herausgeschossenen Tropfenstrahl und der Flüssigkeitsoberfläche auf ca. 90°
eingestellt. Die elektrochemische Zelle kann mit Mikrometerschrauben präzise in alle
Raumrichtungen positioniert werden. Über einen Funktionsgenerator mit „Burst“-
Option kann die Anzahl der vom Dispenser ausgestoßenen Tropfen in jedem
Experiment exakt festgelegt werden.
4.4.1 Dispensieren von Redoxspezies in die Nähe einer Elektrodenoberflächemit amperometrischer Detektion
Der Mikrodispenser wird mit Kaliumhexacyanoferrat(II) (20 mM K4[FeII(CN)6] in 0.1 M
KCl) als Redoxspezies befüllt. Als Arbeitselektrode wird in die elektrochemische
Messzelle eine Platin-Makroelektrode mit einem Durchmesser der aktiven
Elektrodenoberfläche von 0.5 mm von unten eingeschraubt. Die Messzelle wird mit
Basiselektrolyt (3 mL 0.1 M KCl) befüllt. Die Platin-Arbeitselektrode wird auf ein
Potential von +300 mV vs. Ag/AgCl gelegt, so dass Hexacyanoferrat(II) an dieser zu
Hexacyanoferrat(III) oxidiert werden kann. Der Ausgang des Potentiostaten ist mit
einem Linienschreiber (20 mm/min) verbunden.
Die elektrochemische Zelle wird mittels Mikrometerschrauben so positioniert, dass
der aus dem Dispenser ausgestoßene Tropfenstrahl in direkter Nähe der
elektroaktiven Elektrodenoberfläche auf die Flüssigkeitsoberfläche trifft.
Abbildung 4.4-2 zeigt die Stromantwort der Elektrode nach dem Dispensieren von 50
Tropfen der Hexacyanoferrat(II)-Lösung in die Nähe der Elektrodenoberfläche.
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 104
Direkt nach dem Dispensieren tritt ein scharfer Strompeak (Höhe ∼700 nA) auf, der
nach einer Abklingzeit von etwa 75 Sekunden wieder zur Grundlinie zurückkehrt.
Das Schiessen von Hexacyanoferrat(II) in die Nähe der Elektrode führt zu einem
plötzlichen Anstieg der Konzentration an umsetzbarer Redoxspezies vor der
Elektrodenoberfläche. Die Oxidation des Hexacyanoferrat(II) zu Hexacyanoferrat(III)
führt dabei zu dem starken Stromanstieg. Die nachfolgende Stromabnahme kann auf
zwei Effekten basieren:
1. Die gesamte in die Nähe der Elektrodenoberfläche geschossene Redoxspezies
wird an der Elektrodenoberfläche umgesetzt, so dass nach dem Oxidieren aller
Hexacyanoferrat(II)-Moleküle eine Rückkehr zum Grundstrom erfolgt.
2. Die Redoxspezies diffundiert in das Volumen des Elektrolyten, so dass die
Menge an oxidierbarer Spezies vor der Elektrodenoberfläche abnimmt. Direkt
nach dem Dispensieren befindet sich eine hohe Konzentration an Redoxspezies
in einem sehr kleinen Volumenteil. Das umgebende Volumen enthält keine
Redoxspezies, so dass ein hoher Konzentrationsgradient vorliegt. Da das
Lösungsvolumen der Messzelle sehr viel größer ist als das Volumen der
Abbildung 4.4-2 zeitaufgelöste Stromantwort einer Makroelektrode nach demDispensieren von 50 Tropfen 20 mM K4[Fe(CN)6]-Lösung(Schreiberauftragung: Strom gegen Zeit,∅ Elektrode = 0.5 mm, E = 350 mV vs. Ag/AgCl)
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 105
geschossenen Tropfen, ist nach vollständiger Verdünnung die Konzentration an
Redoxspezies in der Messzelle nahezu null.
Nachdem gezeigt wurde, dass es möglich ist, geringe Mengen Redoxspezies,
welche in die Nähe einer Elektrode geschossen werden, amperometrisch zu
detektieren, ist für weitere Anwendungen, wie z. B. die Bestimmung von
Diffusionskoeffizienten, eine Optimierung erforderlich. Der in Abbildung 4.4-2
gezeigte Peak resultiert aus dem Schiessen einer großen Anzahl an Tropfen mit
einer hohen Konzentration an Redoxspezies. Für potentielle Anwendungen ist es
notwendig, das Detektionslimit des Verfahrens zu bestimmen und die Abhängigkeit
des Stromsignals von der Tropfenzahl und der Position der Elektrode zu
untersuchen.
4.4.2 Abhängigkeit des Peakstroms von der Dispenserposition
Zur Untersuchung des Einflusses des Abstandes zwischen dem Punkt, an dem die
Tropfen in die Lösung treffen, und der aktiven Elektrodenoberfläche wurden analoge
Experimente an verschiedenen Dispenserpositionen durchgeführt. Zunächst wird der
Dispenser so vorpositioniert, dass nach dem Dispensieren der Redoxspezies nur ein
geringer Strompeak auftritt. Nach der Rückkehr des Stroms zur Grundlinie wird die
Position der elektrochemischen Zelle mit Hilfe der Mikrometerschrauben so
geändert, dass die Distanz zwischen dem Punkt, an dem die Tropfen in die Lösung
treffen, und der aktiven Elektrodenoberfläche kleiner wird. Das Dispensieren wird mit
der gleichen Anzahl an Tropfen wiederholt und die Höhe des Peakstroms wird
bestimmt. In nachfolgenden analogen Experimenten wird die Position der
elektrochemischen Zelle in gleichen Abständen (200 µm) weiter entlang der Geraden
geändert, die durch die ersten beiden Messpositionen festgelegt wird. Das bedeutet,
dass in nachfolgenden Experimenten zunächst eine radiale Annäherung des
Punktes, an dem die Tropfen in die Lösung treffen, an die aktive
Elektrodenoberfläche stattfindet. Nach Erreichen des kurzmöglichsten Abstandes,
erhöht sich in jedem Experiment durch die Änderung der Messpositionen der
Abstand zwischen dem Auftreffpunkt und der Elektrodenoberfläche.
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 106
In Abbildung 4.4-3 ist eine Auftragung der Höhe der Peakströme gegen die so
angefahrenen Positionen dargestellt.
Die Höhe des Peakstroms ist stark abhängig vom Abstand zwischen aktiver
Elektrodenoberfläche und dem Punkt, an dem die Tropfen in die Lösung treffen. Je
kürzer der Abstand zwischen diesen beiden Punkten ist, desto höher ist der
Peakstrom. Bei immer größer werdenden Abständen nimmt die Peakhöhe ab, bis bei
sehr großen Abständen die Verdünnung der Redoxspezies vor dem Erreichen der
aktiven Elektrodenoberfläche so hoch ist, dass kein signifikanter Stromanstieg mehr
zu verzeichnen ist.
Das Dispensieren führt zu einer hohen lokalen Konzentration an Redoxspezies an
dem Punkt, an dem die Tropfen in die Lösung treffen. Aufgrund des hohen
Konzentrationsgradienten breitet sich das Konzentrationsprofil in das
Lösungsvolumen aus. Die Durchmischung mit dem Basiselektrolyten des
Lösungsvolumens führt dabei zu einer Abnahme der Konzentration der
Redoxspezies. Somit nimmt die lokale Konzentration mit zunehmender Zeit und
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Distanz [µm]
Peakh
öhe [nA
]
Abbildung 4.4-3 Abhängigkeit des Peakstroms von der Distanz zwischen aktiver Elektroden-oberfläche und Auftreffpunkt der Tropfen in die LösungDer maximale Peakstrom wird beim kleinstmöglichsten Abstand zwischen aktiverElektrodenoberfläche und Auftreffpunkt erreicht, so dass dieser Punkt alsNullpunkt für die Abstandsskala festgelegt wurde.(300 Tropfen 0.5 mM K4[Fe(CN)6]-Lösung, ∅ Elektrode = 0.5 mm, E = 300 mVvs. Ag/AgCl)
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 107
zunehmender Distanz vom Zentrum ab. Bei vollständiger Verdünnung wird aufgrund
der Größe des Lösungsvolumens im Vergleich zum Volumen der geschossenen
Tropfen die Konzentration an Redoxspezies überall annähernd gleich null. Daraus
folgt: Je weiter die aktive Elektrodenoberfläche, an der die Redoxspezies umgesetzt
werden können, von dem Punkt entfernt ist, an dem die höchste Konzentration an
Redoxspezies herrschte, desto kleiner wird der resultierende Strompeak. Bei sehr
großen Abständen treten keine Strompeaks mehr auf, da die Verdünnung soweit
fortgeschritten ist, dass das Detektionslimit der amperometrischen Bestimmung
unterschritten wird.
Die aus den Höhen der Peakströme resultierende Kurve in Abbildung 4.4-3 kann
somit als Abbild der elektroaktiven Elektrodenoberfläche gesehen werden. Zieht man
die halbe Peakhöhe des Stromverlaufs in Abbildung 4.4-3 als Maß für die
Elektrodenoberfläche heran, so erhält man einen Wert von 0.65 mm, der gut mit
dem tatsächlichen Durchmesser der aktiven Elektrodenoberfläche von 0.5 mm
korreliert.
Aus diesen Ergebnissen wird deutlich, dass der Abstand zwischen aktiver
Elektrodenoberfläche und dem Punkt, an dem die Tropfen in die Lösung treffen, und
somit die relative Position des Dispensers zur Elektrodenoberfläche ein essentieller
Parameter für die sensitive amperometrische Detektion von Redoxspezies darstellt.
4.4.3 Abhängigkeit des Peakstroms von der geschossenen Tropfenzahl
Um eine höchstmögliche Sensitivität und eine niedrige Nachweisgrenze bei der
amperometrischen Detektion der geschossenen Redoxspezies zu erreichen, ist eine
Optimierung der relativen Positionen von Elektrode und Mikrodispenser nötig. Für die
folgenden Experimente wurde daher die Dispenserposition nach dem im vorherigen
Abschnitt beschriebenen Verfahren so optimiert, dass sich der kürzestmögliche
Abstand zwischen der aktiven Elektrodenoberfläche und dem Punkt, an dem die
Tropfen in die Lösung treffen, ergibt. Unter Beibehaltung der optimierten Position
wurden Experimente zur Ermittlung des Detektionslimit und zur Untersuchung der
Abhängigkeit des Stromsignals von der geschossenen Tropfenzahl durchgeführt.
Abbildung 4.4-4 zeigt eine Strom-Zeit-Kurve der Elektrode nach dem Dispensieren
von unterschiedlichen Tropfenzahlen.
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 108
Wie erwartet nimmt mit steigender Zahl an Tropfen in jedem Experiment auch die
Peakhöhe der Stromantwort zu, wobei Wiederholungsexperimente eine gute
Reproduzierbarkeit zeigen. Selbst ein einzelner geschossener Tropfen kann
detektiert werden. Mit steigender Tropfenzahl nähert sich der Strompeak einem
Grenzwert an; die Peakspitze verbreitert sich zu einem Plateau, so dass der
gesamte Peak an Breite gewinnt.
Tropfenzahl Peakhöhe #1[nA]
Peakhöhe #2[nA]
Peakhöhe #3[nA]
gemitteltePeakhöhe [nA]
1 14 14 14 142 22 24 24 234 43 41 46 448 70 77 77 7516 140 140 133 13832 216 205 207 20964 280 270 255 270128 294 274 270 279256 294 270 270 278
Abbildung 4.4-4 amperometrisches Signal nach dem Schiessen von unterschiedlichenTropfenzahlen einer 0.5 mM K4[Fe(CN)6]-Lösung(Schreiberauftragung: Strom gegen Zeit, ∅ Elektrode = 0.5 mm, E = 300 mVvs. Ag/AgCl)
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 109
Trägt man die Höhe der Strompeaks gegen die Anzahl an geschossenen Tropfen
auf, so erhält man die in Abbildung 4.4-5 dargestellte Kurve.
Bei kleinen Tropfenzahlen steigen die Stromhöhen linear mit der Tropfenzahl an, bei
hohen Tropfenzahlen strebt der Peakstrom jedoch einem Grenzwert entgegen. Dies
ist dadurch zu erklären, dass bei hohen Tropfenzahlen eine derart große Menge an
Redoxspezies in die Nähe der Elektrode geschossen wird, dass kurzzeitig lokal die
gleiche Konzentration an Redoxspezies herrscht, wie im Dispenser. Liegt nach dem
Dispensieren einer bestimmten Tropfenzahl vor der Elektrodenoberfläche diese
Konzentration vor, so führt eine Erhöhung der Tropfenzahl nicht zu einer Erhöhung
des Peakstroms. Die zusätzliche zugefügte Menge an Redoxspezies erhöht nicht die
lokale Konzentration, sondern führt lediglich dazu, dass sich das Gebiet mit der
maximal möglichen Konzentration ausweitet. Dadurch benötigt die Verdünnung
durch Diffusion mehr Zeit, so dass die hohe lokale Konzentration länger erhalten
bleibt, was zu einer Verbreiterung des Strompeaks führt.
Die Peakhöhe nach dem Schiessen eines Tropfens beträgt 14 nA. Setzt man für das
Volumen eines Tropfens einen Wert von 100 pL voraus, so wurden hier absolute
Mengen von weniger als 50 fmol detektiert. Mit aktueller Potentiostat-Technik lassen
sich leicht Ströme bis in den pA-Bereich messen, so dass das Detektionslimit in
0 25 50 75 100 1250
50
100
150
200
250
300P
eakh
öhe
[nA
]
Tropfenzahl
Abbildung 4.4-5 Abhängigkeit des Peakstroms von der Anzahl der geschossenen Tropfen(Messwerte aus Abbildung 4.4-4)
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 110
diesem Experiment bei weitem noch nicht erreicht wurde. Da die Tropfenzahl nicht
kleiner als eins werden kann, kann als weiterer Parameter die Konzentration der
Redoxspezies, mit der der Dispenser befüllt wird, gesenkt werden. Setzt man einer
Verbesserung um einen Faktor von mindestens 100 voraus, lassen sich absolute
Stoffmengen im unteren femtomolaren Bereich detektieren.
4.4.4 Abhängigkeit des zeitlichen Auftretens der Strompeaks von derDispenserposition
Im vorherigen Kapitel wurde bereits die Abhängigkeit der Höhe des Strompeaks vom
Abstand zwischen dem Punkt, an dem die Tropfen in die Lösung treffen, und der
aktiven Elektrodenoberfläche untersucht. Im Folgenden soll nun auf die Abhängigkeit
des zeitlichen Auftretens des Strompeaks von der Dispenserposition eingegangen
werden. Wiederholt man das Schiessen von gleichen Mengen an Redoxspezies an
verschiedenen relativen Positionen von Elektrode und Dispenser, so lässt sich nicht
nur die bereits erläuterte Abhängigkeit des Peakstroms von der Dispenserposition
feststellen, sondern auch das zeitliche Auftreten des Peaks ist mit der
Dispenserposition korreliert. Abbildung 4.4-6 zeigt zwei Strompeaks, die nach dem
Dispensieren von gleichen Mengen an Redoxspezies an verschiedenen
Dispenserpositionen erhalten wurden. Das erste Experiment entspricht einem
geringen Abstand zwischen Auftreffpunkt und aktiver Elektrodenoberfläche; das
zweite wurde nach einer Vergrößerung des Abstandes um 100 µm durchgeführt. Die
beiden rechteckigen Stromanstiege vor jedem Peak wurden beim Starten des
Dispensieren manuell verursacht und legen auf der Zeitskala den Nullpunkt für jedes
Experiment fest.
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 111
Durch das Experiment wird zum einen noch einmal die bereits erläuterte
Abhängigkeit der Höhe des Peakstroms vom Abstand deutlich, zum anderen ist zu
erkennen, dass im zweiten Experiment, in dem der Abstand zwischen
Elektrodenoberfläche und Auftreffpunkt der Tropfen in die Lösung vergrößert wurde,
der Strompeak viel breiter ist und das Maximum im zeitlichen Vergleich bezogen auf
den jeweiligen Zeitpunkt des Schiessens viel später auftritt. Im ersten Experiment
vergehen 0.9 s vom Zeitpunkt des Dispensierens bis zum Erreichen des
Strommaximums, nach Vergrößerung des Abstandes im zweiten Experiment
vergrößert sich diese Zeitspanne auf 2.3 s.
Zur vereinfachten sprachlichen Darstellung werden folgende Begriffe definiert:
• Die Zeitspanne, die zwischen dem Dispensieren der Redoxspezies und dem
Erreichen des Strommaximums verstreicht, wird im Folgenden als „Peakzeit“
bezeichnet.
• Der Punkt, an dem die vom Dispenser geschossenen Tropfen in die Lösung
treffen, wird im Folgenden als „Auftreffpunkt“ bezeichnet.
Abbildung 4.4-6 verdeutlicht die starke Abhängigkeit der Peakzeit vom Abstand
zwischen Auftreffpunkt und aktiver Elektrodenoberfläche. In beiden Experimenten ist
Abbildung 4.4-6 zeitaufgelöstes amperometrisches Signal bei verschiedenen Abständenzwischen Elektrodenoberfläche und Auftreffpunkt der Tropfen in die Lösung.Die rechteckigen Stromanstiege entsprechen dem Zeitpunkt des Schiessens.t max1 = 0.9 s , t max2 = 2.3 s(Schreiberauftragung: Strom gegen Zeit, lateraler Verfahrweg zwischen Peak 1und 2 = 100 µm, 10 Tropfen 0.5 mM K4[Fe(CN)6], ∅ Elektrode = 0.5 mm,E = 300 mV vs. Ag/AgCl)
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 112
die gleiche, sehr geringe Menge an Redoxspezies geschossen worden. Es wurden
jeweils 10 Tropfen mit einer Frequenz von 50 Hz geschossen, das Dispensieren
dauert somit lediglich 0.2 s. Somit wird in kurzer Zeit eine sehr hohe lokale
Konzentration an Redoxspezies erzeugt. Aufgrund des Konzentrationsgradienten
findet eine diffusionskontrollierte Verdünnung der Redoxspezies in das Volumen der
Lösung statt. Ist die aktive Elektrodenoberfläche weiter von dem Ort der hohen
lokalen Konzentration an Redoxspezies entfernt, so wird mehr Zeit benötigt um die
Strecke durch Diffusion zurückzulegen, so dass das Strommaximum später auftritt.
Durch die größere Distanz wird auch die Verdünnung größer, so dass ein breiterer
Strompeak mit einem niedrigeren Maximum auftritt (siehe Kapitel 4.4.2).
Die Verdünnung der Redoxspezies verläuft unter Diffusionskontrolle und ist somit
direkt mit dem Diffusionskoeffizienten korreliert.
Im Folgenden soll ein Verfahren vorgestellt werden, das es ermöglicht, nur aus den
Peakzeiten und den Abständen zwischen verschiedenen Dispenserpositionen den
Diffusionskoeffizient einer Redoxspezies zu bestimmen. Ähnliche Verfahren wurden
bereits mit Mikrobandelektroden-Arrays durchgeführt, bei denen an einem
Elektrodenfinger eine Spezies generiert wurde und die anderen Elektrodenfinger zur
Detektion dieser Spezies benutzt wurden [280,281]. Diese Verfahren setzen jedoch
eine hohe Reversibilität des heterogenen Elektronentransfers voraus, was bei dem
hier beschriebenen Verfahren nicht zwingend notwendig ist.
4.4.5 Bestimmung von absoluten Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten
Im vorherigen Kapitel wurde zur Auswertung des Strom-Zeit-Signals der Elektrode
ein Schreiber benutzt. Die Peakhöhen und die Peakzeiten wurden mit einem Lineal
ausgemessen. Über die Vorschubgeschwindigkeit des Schreibers und die
Messbereiche des Potentiostaten und des Schreibers konnte auf die tatsächlichen
Peakzeiten und Höhe der Strompeaks zurückgerechnet werden. Weiterhin wurde der
Zeitpunkt des Dispensierens, der den Bezugspunkt für die Bestimmung der Peakzeit
darstellt, durch ein manuell gegebenes Signal in die Messkurve eingefügt, wodurch
ein großes Maß an Ungenauigkeit bei der Bestimmung der Peakzeiten resultiert.
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 113
Für eine mathematische Betrachtung des Sachverhaltes müssen sowohl der
Auftreffpunkt als auch die Elektrodenoberfläche als Punktquellen betrachtet werden,
was für die zur Strommessung verwendete große Makroelektrode nicht zulässig ist.
Die entsprechenden Modifikationen des Messaufbaus für eine möglichst exakte
Messung von Strom, Peakzeit und Abstand zwischen Elektrodenoberfläche und
Auftreffpunkt werden im Folgenden erläutert:
• Die Makroelektrode wird durch eine Mikroelektrode mit einem Durchmesser von
25 µm oder 50 µm ersetzt.
• Zur Messung der Stromwerte wird der Schreiber gegen einen Computer mit AD-
Karte ersetzt. Die verwendete Software zur Datenaufnahme gestattet dabei die
Aufnahme von bis zu 1000 Datenpunkten pro Sekunde. Die Messwerte für jedes
Experiment können gespeichert und später mit entsprechenden Programmen
ausgewertet werden.
• Die Datenaufnahmesoftware wird über ein Trigger-Signal mit dem
Funktionsgenerator gekoppelt. Beim Starten des Dispensierens wird ein Trigger-
Signal an den Computer übergeben, welches die Datenaufnahme startet. Das
Dispensieren und die Aufnahme der Stromwerte erfolgen somit zeitgleich, so dass
eine exakte Festlegung des Nullpunktes der Zeitmessung gegeben ist. Zur
Verdeutlichung zeigt Abbildung 4.4-7 ein entsprechendes Flussdiagramm.
Funktionsgenerator
Computer zurDatenaufnahme
Mikrodispenser
startet
Stromsignal
zeitaufgelöstesStromsignal
Dispensieren vonRedoxspezies
Potentiostat(legt kontinuierlich
Potential an Elektrode an)
Abbildung 4.4-7 Flussdiagramm der zeitaufgelösten Stromwertaufnahme
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 114
Positioniert man den Dispenser so, dass die Tropfen sehr dicht in der Nähe der
Mikroelektrode in die Lösung treffen, so erhält man wiederum peakförmige Strom-
Zeit-Kurven. Abbildung 4.4-8 zeigt zwei typische Strom-Zeit-Kurven bei
verschiedenen Abständen zwischen aktiver Elektrodenoberfläche und dem
Auftreffpunkt der Tropfen in die Lösung.
Zu Beginn des Experiments, direkt nach dem Dispensieren, ist der Stromwert gleich
null, da sich keine umsetzbare Redoxspezies vor der aktiven Elektrodenoberfläche
befindet. Nach einer kurzen Zeitverzögerung tritt ein starker Stromanstieg auf,
hervorgerufen durch die Oxidation der Redoxspezies an der Elektrode. Diese
Zeitverzögerung entspricht der Zeit, die die Redoxspezies benötigt, um die Distanz
vom Auftreffpunkt bis zur aktiven Elektrodenoberfläche zurückzulegen. Nach
Erreichen des Maximums verringert sich der Strom durch die Verdünnung der
Redoxspezies im Volumen der Lösung. Die unterschiedlichen Kurvenverläufe bei
verschiedenen Abständen wurden bereits im vorherigen Kapitel ausführlich
diskutiert, weswegen hier nicht weiter darauf eingegangen wird. Im Unterschied zu
den bisherigen Experimenten mit einem kontinuierlich aufzeichnenden Schreiber ist
die Zeitachse genau definiert, da über das Trigger-Signal die Datenaufnahme
0 2 4 6 8 10 12 140
2
4
6
8
10
i [n
A]
t [s]
Abbildung 4.4-8 Strom-Zeit Kurven einer Mikroelektrode nach dem Dispensieren von 10 Tropfeneiner 20 mM K4[Fe(CN)6]-LösungDie rote Kurve entspricht einem kurzen Abstand zwischen Elektrode, bei derblauen Kurve wurde die Distanz um 100 µm erhöht.(∅ Elektrode = 50 µm, E = 500 mV vs. Ag/AgCl)
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 115
gestartet wird, und so der Zeitnullpunkt durch den Zeitpunkt des Schiessens
festgelegt wird.
Zur Bestimmung des Diffusionskoeffizienten aus experimentellen Daten ist es
notwendig, die Zeitspanne zu kennen, die die Redoxspezies benötigt, um eine genau
bekannte Distanz zurückzulegen. Die Zeit, die in dem obigen Experiment gemessen
wird, entspricht der Zeit, die die Redoxspezies benötigt, um vom Auftreffpunkt bis zur
Elektrodenoberfläche vorzudringen. Um aus einem dieser Experimente den
Diffusionskoeffizient bestimmen zu können, muss man die zurückgelegte Distanz der
Redoxspezies, also den tatsächlichen Abstand zwischen Auftreffpunkt und aktiver
Elektrodenoberfläche kennen. Die Ermittlung dieser Distanz ist aber ohne weiteres
nicht möglich. Zur Umgehung dieses Problems schießt man gleiche Mengen an
Redoxspezies an definierten Positionen. Aus den resultierenden Peakzeiten und
dem bekannten Abstand zwischen den Positionen kann der Diffusionskoeffizient
bestimmt werden.
Trägt man in einem Diagramm die Peakzeiten nach dem Dispensieren immer
gleicher Mengen an Redoxspezies gegen die jeweilige Distanz zwischen
nachfolgenden Dispenserpositionen auf, so lässt sich die aktive
Elektrodenoberfläche der Mikroelektrode visualisieren. Zunächst wird eine grobe
Vorpositionierung vorgenommen, so dass sich der Auftreffpunkt bereits in der Nähe
der aktiven Elektrodenoberfläche befindet. Anschließend wird die Position der
Dispensers in 100 µm Schritten so verändert, dass sich ein rechtwinkliges Gitter von
400 µm x 500 µm ergibt, in dem sich die aktive Elektrodenoberfläche befindet. An
jeder Gitterposition werden 10 Tropfen Redoxspezies geschossen und die Peakzeit,
die bis zum Erreichen des Strompeaks benötigt wird, ermittelt. In Abbildung 4.4-9
sind die Peakzeiten gegen die Gitterposition aufgetragen.
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 116
Dunkle Bereiche entsprechen kurzen Peakzeiten und hellere Bereich entsprechen
längeren Peakzeiten. Der schwarze Bereich, mit einem Durchmesser von etwa
100 µm, stellt den kurzmöglichsten Abstand zwischen Auftreffpunkt und
elektroaktiver Oberfläche dar. Berücksichtigt man den Einfluss der
Flüssigkeitsschicht über der Mikroelektrode, die relative groben Gitterabstände von
100 µm und die Tatsache, dass der Auftreffpunkt keine perfekte Punktquelle
darstellt, so ist die so bestimmte Größe der aktiven Oberfläche der Mikroelektrode
von 100 µm in guter Übereinstimmung mit dem tatsächlichen Durchmesser von
50 µm.
Mit Hilfe dieser Messdaten ist es möglich, ohne Kenntnis der Größe der aktiven
Elektrodenoberfläche und der Konzentration der Redoxspezies, den
Diffusionskoeffizienten der Redoxspezies, hier [FeII(CN)6]4-, zu bestimmen. Dazu
müssen folgende Annahmen gemacht werden:
1. Das Quadrat im Gitter zwischen 100 µm < x < 200 µm und 200 µm < y < 300 µm,
das der Fläche der aktiven Elektrodenoberfläche entspricht (siehe Abbildung 4.4-
9) wird als Nullpunkt für die Bestimmung von Abständen festgelegt.
Abbildung 4.4-9 Auftragung der Peakzeiten gegen die DispenserpositionDie Distanz zwischen zwei Gitterpunkten beträgt 100 µm. Dunkle Bereicheentsprechen kurzen Peakzeiten und helle Bereiche langen Peakzeiten.(10 Tropfen 20 mM K4[Fe(CN)6]-Lösung, ∅ Elektrode = 50 µm, E = 500 mV vs.Ag/AgCl)
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 117
2. Die radial vom Null-Quadranten gemessene Distanz zwischen zwei
Auftreffpunkten ist gleich dem Diffusionsweg, den die Redoxspezies zwischen
beiden Auftreffpunkten zurücklegt. Diese Näherung ist essentiell, da die Dicke
der Flüssigkeitsschicht über der Mikroelektrode nicht bekannt ist, und so eine
exakte Bestimmung des Diffusionsweges unmöglich ist.
3. Der Auftreffpunkt und die aktive Elektrodenoberfläche können als Punktquelle
bzw. Punktkollektor betrachtet werden.
4. Konvektive Effekte können vernachlässigt werden.
5. Die Einstein-Smoluchowsky Gleichung [282],
Dt2d = (Gleichung 4.4.-1)
die den Zusammenhang zwischen Diffusionsweg d und Diffusionszeit t für eine
Dimension beschreibt, ist gültig.
Die Distanz zwischen einem ersten Auftreffpunkt und der aktiven
Elektrodenoberfläche ist x. Die Redoxspezies benötigt die dem Strommaximum
entsprechende Zeit t1, um die aktive Elektrodenoberfläche zu erreichen. Die Distanz
zwischen einem zweiten Auftreffpunkt, der auf der radialen Geraden liegt, die durch
den Nullpunkt und dem ersten Auftreffpunkt festgelegt ist, und der aktiven
Elektrodenoberfläche ist d+x. Nach dem Dispensieren der Redoxspezies erhält man
einen zweiten Strompeak bei einer Zeit t2, welche aufgrund der größeren Distanz
größer ist als die Zeit t1. Die Distanz x ist nicht bekannt, jedoch kann die Distanz d
zwischen dem ersten und dem zweiten Auftreffpunkt exakt aus dem Gitter bestimmt
werden. Unter Berücksichtigung der oben gemachten Annahmen können folgende
Terme aus der Einstein-Smoluchowsky-Gleichung abgeleitet werden:
1
2
2t
xD = (Gleichung 4.4-2)
und
2
2
2t
d)(xD
+= (Gleichung 4.4-3).
Gleichung 4.4-2 und 4.4-3 können kombiniert und das entstehende
Gleichungssystem gelöst werden, so dass man eine Gleichung für den
Diffusionskoeffizienten erhält.
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 118
2
−−
−−
−−=
)t2(t
d
)t2(t
2td
)t2(t
2tdD
21
22
21
1
21
1 (Gleichung 4.4.-4)
Tabelle 4.4-1 zeigt die aus verschiedenen Gitterpunkten berechneten Werte für den
Diffusionskoeffizient für Hexacyanoferrat(II)
Der Mittelwert von 5.38 ± 0.58 10-6 cm2 s-1 stimmt gut mit den in der Literatur
beschriebenen Werten überein. Stackelberg et al. [283] bestimmten für
Hexacyanoferrat(II) in 0.1 M KCl einen Wert von 6.50 10-6 cm2 s-1.
Ein genauerer Blick in die Literatur zeigt, dass die veröffentlichten Werte für den
Diffusionskoeffizienten für die gleiche Redoxspezies zum Teil weit voneinander
abweichen. Je nach Bestimmungsmethode und Auswertealgorithmus findet man
Werte für den Diffusionskoeffizienten von Hexacyanoferrat(II) in 1 M KCl von
5.19 10-6 cm2 s-1 [284] bis 7.98 10-6 cm2 s-1 [285].
Die Abweichung des ermittelten Wertes des Diffusionskoeffizienten von
Hexacyanoferrat(II) von den Literaturwerten lässt sich durch die oben genannten
Annahmen erklären. Es wird angenommen, dass der Diffusionsweg der
Redoxspezies gleich dem Verfahrweg der elektrochemischen Zelle ist. Der
tatsächliche Diffusionsweg wird jedoch durch das rechtwinklige Dreieck aus
Auftreffpunkt, aktiver Elektrodenoberfläche und Dicke der Flüssigkeitsschicht über
Auftreffpunkt 1 Auftreffpunkt 2 d [µm] D [10-6 cm2 s-1]Gitter-
koordinatet1 [s] Gitter-
koordinatet2 [s]
100,100 1.33 100,0 4.40 100 4.73
200,100 1.05 200,0 4.08 100 5.39300,100 1.90 400,0 8.64 141 5.33300,200 1.38 400,100 4.13 100 4.87300,300 1.13 400,300 2.95 100 6.47300,400 1.85 400,500 7.5 141 5.92200,400 1.09 200,500 4.54 100 4.96
Tabelle 4.4-1 berechnete Diffusionskoeffizienten von Kaliumhexacyanoferrat(II) in 0.1 MKCl aus den Peakzeiten und Abständen verschiedener Gitterpunkte(vgl. Abbildung 4.4-9)
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 119
der Mikroelektrode bestimmt. Somit wird die Distanz d, die für die Berechnung des
Diffusionskoeffizienten benutzt wird, zu klein abgeschätzt. Da in Gleichung 4.4-4,
über die der Diffusionskoeffizient berechnet wird, die Distanz d nur im Nenner
vorkommt, tritt bei der Bestimmung des Diffusionskoeffizienten eine systematische
Abweichung in Richtung zu niedrigerer Werte auf.
Konvektive Effekte hingegen, die in diesem Ansatz nicht berücksichtigt werden,
resultieren in einer positiven Abweichung. Konvektion wird hauptsächlich durch das
Auftreffen der Tropfen in die Lösung verursacht. Da die Zeitspanne zwischen dem
Dispensieren der Tropfen und der Detektion an der Mikroelektrode aber relativ lang
ist, spielt die durch das Auftreffen der Tropfen in die Lösung verursachten
konvektiven Effekte eine vernachlässigbare Rolle.
4.4.6 Bestimmung von relativen Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten durch Kalibrierung mit einer zweiten Redoxspezies
Um diese Limitierungen zu überwinden wurde eine zweite Redoxspezies zur
Kalibrierung benutzt. Der Mikrodispenser wird dazu mit einer Lösung, die beide
Redoxspezies enthält, befüllt. Als erstes wurde eine Mischung aus
Hexacyanoferrat(II) und Ferrocencarbonsäure (Fc-COOH) verwendet. Legt man an
die Mikroelektrode ein Potential von 500 mV an, so werden beide Redoxspezies
unter Diffusionskontrolle oxidiert. Falls die Differenz zwischen den
Diffusionskoeffizienten beider Redoxspezies groß genug ist, sollten durch die
unterschiedlichen Diffusionszeiten zwei Peaks in der Strom-gegen-Zeit-Kurve
auftreten. In der Strom-Zeit-Kurve konnte jedoch nur eine Peakverbreiterung
beobachtet werden, aus der die Peaks nicht separiert werden können, so dass eine
Diffusionskoeffizientenbestimmung nicht möglich war.
Um dieses Problem zu umgehen, wurde eine zweite Redoxspezies benutzt, welche
im Potentialbereich, in dem die erste Redoxspezies oxidiert wird, keine
elektrochemische Umsetzung zeigt. Weiterhin müssen beide Redoxspezies im
gleichen Leitsalzelektrolyten stabil vorliegen, ohne sich gegeneinander zu
beeinflussen. Eine Mischung aus Ferrocencarbonsäure (FC-COOH) und Ruthenium-
hexamin ([Ru(NH3)6]Cl3) in 0.1 M KCl erfüllt diese Bedingungen.
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 120
Der Dispenser wird mit einer Lösung, die 10 mM [Ru(NH3)6]3+ und 10 mM Fc-COOH
enthält befüllt und der Aufbau wird wie bereits beschrieben vervollständigt. Im
Gegensatz zu den Experimenten, bei denen nur eine Redoxspezies geschossen
wurde, sind für jeden Punkt des Gitters zwei Messungen bei verschiedenen
Potentialen notwendig. Im ersten Experiment wird die Mikroelektrode auf 500 mV
polarisiert, so dass Fc-COOH diffusionskontrolliert an dieser oxidiert wird. Eine
genau bekannte Zahl an Tropfen wird geschossen und die resultierende Strom-Zeit-
Kurve aufgenommen. Anschließend wird zur diffusionskontrollierten Reduktion von
[Ru(NH3)6]3+ zu [Ru(NH3)6]
2+ die Mikroelektrode auf -300 mV polarisiert, die gleiche
Anzahl an Tropfen nochmals geschossen und die Strom-Zeit-Kurve aufgenommen.
Die Position des Mikrodispensers wird verändert und analoge Experimente werden
an den anderen Gitterpunkten durchgeführt.
In Abbildung 4.4-10 ist ein Beispiel für eine Strom-Zeit-Kurve von Fc-COOH und
[Ru(NH3)6]3+ gezeigt. In beide Experimenten wurden 5 Tropfen Fc-COOH/
[Ru(NH3)6]3+-Lösung an derselben Position geschossen. Die Stromwerte sind auf
den jeweiligen Peakstrom normiert.
0 1 2 3 4 5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
i (n
orm
iert
)
t [s]
Abbildung 4.4-10 normierte Strom-Zeit-Kurven nach dem Dispensieren von jeweils 5 Tropfeneiner Fc-COOH / [Ru(NH3)6]
3+-Lösung. Die obere Kurve wurde bei 500 mVerhalten; bei der unteren Kurve wurde das Potential auf -300 mV justiert. Dieobere Kurve zeigt somit die Oxidation von Fc-COOH, während die untere derReduktion von [Ru(NH3)6]
3+ entspricht.(∅ Elektrode = 25 µm, c( Fc-COOH) = 10 mM, c([Ru(NH3)6]
3+) = 10 mM)
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 121
Die Strom-Zeit-Kurve von Fc-COOH hat ein Peakmaximum bei t = 1.33 s, während
das Peakmaximum bei [Ru(NH3)6]3+ bei t = 1.15 s auftritt. Da in beiden Experimenten
alle Systemparameter gleich sind, sind die unterschiedlichen Peakzeiten auf die
unterschiedlichen Diffusionskoeffizienten von Fc-COOH und [Ru(NH3)6]3+
zurückzuführen. Wiederholt man derartige Experimente in verschiedenen Abständen
zur aktiven Elektrodenoberfläche und trägt die Peakzeiten von [Ru(NH3)6]3+ gegen
die Peakzeiten von Fc-COOH auf, so erhält man die in Abbildung 4.4-11 gezeigte
schwarze Gerade. Die Steigung von 0.90 entspricht dabei dem Verhältnis der
Diffusionskoeffizienten von Fc-COOH und [Ru(NH3)6]3+, so dass bei Bekanntsein des
Diffusionskoeffizienten einer der Redoxspezies der Diffusionskoeffizient der anderen
Redoxspezies durch Multiplizieren bzw. Dividieren berechnet werden kann.
0 1 2 3 4 5 6 70
1
2
3
4
5
6
t P
eak
(Ru
-hexa
min
) [s
]
t Peak (Fc-COOH) [s]
Abbildung 4.4-11 Auftragung der Peakzeiten von [Ru(NH3)6]3+ gegen die Peakzeiten von
Fc-COOH an verschiedenen Dispenserpositionenschwarze Quadrate: c([Ru(NH3)6]
3+) = 10 mM , c(Fc-COOH) = 10 mMlineare Regression: Steigung = 0.90, Achsenabschnitt = 0.03, r = 0.995roten Kreise: c([Ru(NH3)6]
3+) = 5 mM , c(Fc-COOH) = 10 mMlineare Regression: Steigung = 0.88, Achsenabschnitt = 0.04, r = 0.986(∅ Elektrode = 25 µm, Tropfenzahl = 5, Messpotentiale: [Ru(NH3)6]
3+ = -300 mV,Fc-COOH = 500 mV vs. Ag/AgCl)
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 122
Die rote Gerade in Abbildung 4.4-11 entstammt einer Messreihe, bei der die
Konzentration der Lösung an [Ru(NH3)6]3+ im Dispenser um die Hälfte reduziert
wurde, während die Konzentration von Fc-COOH nicht verändert wurde. Trotz der
Verminderung der Konzentration an [Ru(NH3)6]3+ ergibt sich annähernd die gleiche
Regressionsgerade. Somit konnte gezeigt werden, dass die Peakzeiten, wie
erwartet, von der Konzentration der Redoxspezies im Dispenser unabhängig sind.
Die Substitution von Fc-COOH gegen ein Ferrocenderivat mit einer höheren molaren
Masse und einem entsprechend niedrigerem Diffusionskoeffizienten sollte in einer
verminderten Steigung in der Korrelationskurve gegen [Ru(NH3)6]3+ resultieren.
Im Rahmen einer Kooperation wurden vom Lehrstuhl für Anorganische Chemie der
Universität Bielefeld (AG Prof. Jutzi) zwei wasserlösliche Ferrocenderivate zur
Verfügung gestellt [286]. In Abbildung 4.4-12 sind die Strukturen der
Ferrocenderivate gezeigt.
Ferrocenderivat 1
N+
N+
N+
OH
FeFe
OHN
+
N+
Fe
Ferrocenderivat 2
Abbildung 4.4-12 Strukturen der Ferrocenderivate 1 und 2Die Gegenionen Br- sind nicht dargestelltFerrocenderivat 1: [1,3-Bis(N,N-dimethyl-N-(2-ferrocenylethyl)ammonium-methyl)-5-(N,N-dimethyl-N-(2-hydroxyethyl)ammoniummethyl]benzoltribromidFerrocenderivat 2: [1-(N,N-dimethyl-N-(2-ferrocenylethyl)ammoniummethyl)-4-(N,N-dimethyl-N-(2-hydroxyethyl) ammoniummethyl)]benzoldibromid
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 123
Sowohl Ferrocenderivat 1 als auch Ferrocenderivat 2 liegen in Gegenwart
[Ru(NH3)6]3+ in 0.1 M KCl stabil in der reduzierten Form vor. Beide Ferrocenderivate
müssen mit Dimethylsulfoxid (DMSO) angelöst werden, können aber anschließend
mit der wässrigen KCl-Lösung verdünnt werden.
Ferrocenderivat 1 besitzt zwei Ferrocengruppen und ist vergleichsweise größer als
Fc-COOH, während Ferrocenderivat 2 und Fc-COOH von vergleichbarer Größe sind.
Führt man analoge Experiment mit [Ru(NH3)6]3+ und Ferrocenderivat 2 bzw.
[Ru(NH3)6]3+ und Ferrocenderivat 1 durch, so sollte man für Ferrocenderivat 2 eine
ähnliche Peakzeit wie für Fc-COOH erwarten, während man aufgrund der
komplexeren Molekülstruktur im Falle von Ferrocenderivat 1 eine längere Peakzeit
erwarten kann.
Führt man Messreihen an verschiedenen Dispenserpositionen mit Lösungen von
Ferrocenderivat 1 und [Ru(NH3)6]3+ bzw. Ferrocenderivat 2 und [Ru(NH3)6]
3+ durch
und trägt die Peakzeiten von [Ru(NH3)6]3+ gegen die Peakzeiten des jeweiligen
Ferrocenderivats auf, so erhält man die in Abbildung 4.4-13 gezeigten Geraden.
0 1 2 3 4 50
1
2
3
4
5
Fc-Derivat 1 Fc-Derivat 2
t P
eak
(R
u-h
exa
min
) [s
]
t Peak
(Fc-Derivat 1 bzw. 2) [s]
Abbildung 4.4-13 Auftragung der Peakzeiten von [Ru(NH3)6]3+ gegen die Peakzeiten von
Fc-Derivat 1 und von [Ru(NH3)6]3+ gegen Fc-Derivat 2
blaue Diamanten: c([Ru(NH3)6]3+) = 5.3 mM , c(Fc-Derivat 1) = 5.8 mM
lineare Regression: Steigung = 0.63, Achsenabschnitt = 0.13, r = 0.990grüne Dreiecke: c([Ru(NH3)6]
3+) = 6.1 mM , c(Fc-Derivat 2) = 6.2 mMlineare Regression: Steigung = 0.87, Achsenabschnitt = -0.05, r = 0.980(∅ Elektrode = 25 µm, Tropfenzahl = 5, Messpotentiale: [Ru(NH3)6]
3+ = -300 mV,Fc-Derivate = 500 mV)
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 124
Wie erwartet ist für Ferrocenderivat 2, das eine geringfügig komplexere
Molekülstruktur wie Fc-COOH besitzt, mit 0.87 eine ähnliche Geradensteigung wie
für Fc-COOH (Steigung = 0.90) zu beobachten. Ferrocenderivat 1, das eine
wesentlich komplexere Molekülstruktur als Fc-COOH hat, zeigt mit 0.63 eine
wesentlich geringere Geradensteigung. Die ermittelten Diffusionskoeffizienten der
beiden Ferrocenderivate und Fc-COOH relativ zu [Ru(NH3)6]3+ stehen somit in
Einklang mit der Komplexität ihrer Molekülstrukturen. Ferrocenderivat 1 mit der
komplexesten Molekülstruktur hat den niedrigsten relativen Diffusionskoeffizienten,
während Fc-COOH mit der einfachsten Molekülstruktur den höchsten relativen
Diffusionskoeffizient besitzt.
Somit konnte demonstriert werden, dass es möglich ist, ohne Kenntnis von
Parametern, wie Größe der aktiven Elektrodenoberfläche, Konzentration der
Redoxspezies oder Zahl der ausgetauschten Elektronen, die relativen
Diffusionskoeffizienten verschiedener Ferrocenderivate relativ zu [Ru(NH3)6]3+ zu
bestimmen; allerdings unter der Voraussetzung, dass sich unabhängig voneinander
die Diffusionszeiten der beiden Redoxspezies, die verschiedene Oxidationszustände
und Formalpotentiale haben, bestimmen lassen.
Es sollte weiterhin möglich sein, die relativen Diffusionskoeffizienten zweier
Redoxspezies zu bestimmen, die ähnliche Formalpotentiale besitzen, sich aber
signifikant in ihrem Diffusionskoeffizient unterscheiden. Hierzu muss die
Mikroelektrode auf ein Potential polarisiert werden, das hoch genug ist, um beide
Redoxspezies unter Diffusionskontrolle umzusetzen. Falls die Differenz der
Diffusionskoeffizienten beider Redoxspezies groß genug ist, sollte die
entsprechende Strom-Zeit-Kurve zwei einzelne Peaks oder eine Peakaufspaltung mit
zwei detektierbaren Maxima zeigen.
Da sich die relativen Diffusionskoeffizienten von Ferrocenderivat 1 und Fc-COOH
hinreichend unterscheiden, kann man beim Dispensieren einer Lösung, die eine
Mischung dieser beiden Substanzen enthält, zumindest eine Aufspaltung des
resultierenden Strompeaks erwarten.
Zur Überprüfung dieser Hypothese wurden Dispensier-Experimente mit einer
Mischung aus Fc-COOH und Ferrocenderivat 1 bei einem Mikroelektroden-Potential
von 500 mV durchgeführt. Bei den meisten der untersuchten Kombinationen der
Systemparameter, wie Abstand zwischen Auftreffpunkt und aktiver
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 125
Elektrodenoberfläche, Zahl der geschossenen Tropfen und Dicke der
Elektrolytschicht über der Mikroelektrode konnte keine Peakseparation beobachtet
werden. Bei kleinen Distanzen zwischen Auftreffpunkt und Elektrodenoberfläche sind
die Transitzeiten für beide Redoxspezies kurz. Dementsprechend sind die
Unterschiede zwischen den jeweiligen Transitzeiten so klein, dass sie nicht aufgelöst
werden können und eine Peakverbreiterung zu beobachten ist. Wenn die Abstände
zwischen Auftreffpunkt und Elektrodenoberfläche groß sind, ist durch die
Verbreiterung der Strompeaks eine klare Peakidentifizierung nur sehr schwer
möglich.
Trotzdem kann mit einem optimierten Satz an Parametern eine Peakseparation
beobachtet werden. Ein entsprechende Strom-Zeit-Kurve ist in Abbildung 4.4-14
gezeigt.
Es ist eine Aufspaltung des Strompeaks mit zwei Maxima bei t = 0.92 s und
t = 1.40 s ist zu beobachten. Aufgrund der kleineren Molekülstruktur stellt Fc-COOH
den ersten Peak dar und Ferrocenderivat 1 den zweiten Peak dar. Die Höhe des
ersten Strommaximum beträgt 16.1 nA, der zweite Peak hat einen Maximalstrom von
17.1 nA. Obwohl die Konzentration von Ferrocenderivat 1 nur etwa halb so groß wie
0 1 2 3 4 50.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
i [n
A]
t [s]
Abbildung 4.4-14 Strom-Zeit Kurve einer 25 µm Mikroelektrode (E = 500 mV) nach demDispensieren von 90 Tropfen einer Lösung aus Fc-COOH (c = 10 mM) undFerrocenderivat 1 (c = 5.2 mM)
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 126
die Konzentration von Fc-COOH ist, ist der Strompeak dennoch von vergleichbarer
Höhe, da Ferrocenderivat 1 zwei oxidierbare Ferrocengruppen pro Molekül besitzt.
Wiederholt man analoge Dispensier-Experimente, so dass Doppelpeaks erhalten
werden, und trägt die Zeiten des ersten Peaks gegen die des zweiten Peaks auf, so
erhält man wiederum eine Gerade mit einer Steigung von 1.37 und einem
Achsenabschnitt von 0.04 (r = 0.998).
Um die Selbstkonsistenz des vorgestellten Verfahrens zur Bestimmung von
Diffusionskoeffizienten zu zeigen, können die relativen Werte der
Diffusionskoeffizienten von Fc-COOH gegen [Ru(NH3)6]3+ und von Ferrocenderivat 1
gegen [Ru(NH3)6]3+ mit den relativen Werten von Fc-COOH gegen Ferrocenderivat 1
verglichen werden.
89.0))D(Ru(NH
COOH)D(Fc363
=−+
63.0))D(Ru(NH
)1 Derivat-D(Fc363
=+ 41.163.0
89.0
)1 Derivat-D(Fc
COOH)-D(Fc ==⇒
Der so berechnete Wert des Quotienten der Diffusionskoeffizienten von Fc-COOH
und Ferrocenderivat 1 von 1.41 ist sehr dicht am experimentell bestimmten Wert von
1.37. Diese gute Übereinstimmung demonstriert die Selbstkonsistenz und
Universalität der vorgestellten Methode zur Bestimmung von Diffusionskoeffizienten.
Da die Ferrocenderivate 1 und 2 neu synthetisiert wurden und bisher nicht in der
Literatur bekannt sind, wurden die Diffusionskoeffizienten mit einer alternativen, in
der Literatur beschriebenen Methode bestimmt. Hierfür wurde eine Methode gewählt,
die unabhängig von der Konzentration der Redoxspezies ist, um eventuelle
Konzentrationsfehler durch nicht vollständige Aufreinigung auszuschließen.
Weiterhin können zur Evaluierung des hier beschriebenen Verfahrens die ermittelten
Diffusionskoeffizienten mit einer etablierten Methode verglichen werden.
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 127
4.4.7 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten mit Mikroelektroden inchronoamperometrischen Experimenten
Mikroelektroden haben sich für die Bestimmung von Diffusionskoeffizienten
elektroaktiver Spezies etabliert. In der Literatur sind eine Vielzahl von Publikationen
zu diesem Thema zu finden [285,287-290]. Bei den meisten Verfahren muss jedoch
die Konzentration der Redoxspezies genau bekannt sein. Da die hier verwendeten
Substanzen neu synthetisiert wurden und hygroskopisch sind, ist eine genaue
Konzentrationsangabe oder Bestimmung schwierig. Aus diesem Grund wurde ein
von Bard et. al. [284] beschriebenes Verfahren zur Bestimmung von
Diffusionskoeffizienten benutzt, das unabhängig von der Konzentration der
Redoxspezies ist. Dazu wird ein chronoamperometrisches Experiment mit
Mikroelektroden mit einem Potentialsprung von einem Potential, bei dem keine
Umsetzung der Redoxspezies stattfindet, auf ein Potential, bei dem ein
diffusionskontrollierter Umsatz stattfindet, durchgeführt. In einem zweiten Experiment
wird der zeitunabhängige diffusionskontrolliert fließende Grenzstrom bestimmt, der
sich nach dem Potentialpuls einstellt.
Zur Ermittlung des Diffusionskoeffizienten trägt man in einem Diagramm den auf den
zeitunabhängigen Grenzstrom normierten Strom der Mikroelektrode gegen die
inverse Quadratwurzel der Zeit auf. Man erhält eine Gerade, über deren Steigung b
und dem Radius der aktiven Elektrodenoberfläche r sich der Diffusionskoeffizient der
Redoxspezies nach der folgenden Formel berechnen lässt:
2
2
b16
rD
π= (Gleichung 4.4.-5)
Zur Evaluierung dieses Verfahrens wurden zunächst Experimente mit einer
Redoxspezies mit bekanntem Diffusionskoeffizient durchgeführt. Aufgrund seiner
guten Bekanntheit in der Literatur und seiner guten reversiblen heterogenen
Elektronentransfereigenschaften wurde Kaliumhexacyanoferrat(II) benutzt.
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 128
Abbildung 4.4-15 zeigt die Auftragung des normierten Stroms gegen die inverse
Quadratwurzel der Zeit einer Mikroelektrode nach einem Potentialsprung von 0 auf
500 mV vs. Ag/AgCl in einer Lösung von Hexacyanoferrat(II).
Berechnet man aus der Steigung der Geraden anhand von Gleichung 4.4-5 den
Diffusionskoeffizient von Hexacyanoferrat(II) in 0.1 M KCl, so erhält man einen Wert
von 6.49 10-6 cm2 s-1, welcher sehr dicht am oft zitierten Literaturwert von 6.50 10-6
cm2 s-1 von Stackelberg et al. liegt [283].
Nachdem sich dieses Verfahren als geeignet für die exakte Bestimmung von
Diffusionskoeffizienten erwiesen hat, wurden analoge chronoamperometrische
Experimente mit den Ferrocenderivaten 1 und 2 durchgeführt. Die entsprechenden
Auftragungen der normierten Stromwerte gegen die inverse Quadratwurzel der Zeit
sind in Abbildung 4.4-16 dargestellt.
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
1.00
1.02
1.04
1.06
1.08
1.10
1.12
i (n
orm
iert
)
1 / √t
Abbildung 4.4-15 Auftragung der normierten Stromwerte gegen die inverse Quadratwurzel der Zeitim chronoamperometrischen Experiment mit [Fe(CN)6]
4-
lineare Regression: Steigung = 0.087, Achsenabschnitt = 0.980, r = 0.998(∅ Elektrode = 10 µm, Potentialsprung von 0 mV nach 500 mV vs. Ag/AgCl,c(K4[Fe(CN)6]) = 10 mM in 0.1 M KCl)
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 129
Die inversen Quadrate der Steigungen der Geraden in Abbildung 4.4-16 sind
proportional zum Diffusionskoeffizienten (vgl. Gleichung 4.4-5). Bildet man den
Quotienten der inversen Quadrate der Steigungen von Ferrocenderivat 1 und 2, so
erhält man einen Wert von 0.733, der dem Verhältnis ihrer Diffusionskoeffizienten
entspricht.
Aus den im vorherigen Abschnitt beschriebenen „time of flight“-Experimenten unter
Nutzung des Mikrodispensers wurden folgende relative Diffusionskoeffizienten
bestimmt:
63.0))D(Ru(NH
)1 Derivat-D(Fc363
=+
87.0))D(Ru(NH
)2 Derivat-D(Fc363
=+ 72.063.0
87.0
)2 Derivat-D(Fc
)1 Derivat-D(Fc ==⇒
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
1.00
1.05
1.10
1.15
Ferrocenderivat 1 Ferrocenderivat 2
i (n
orm
iert
)
1 / √t
Abbildung 4.4-16 Auftragung der normierten Stromwerte gegen die inverse Quadratwurzel der Zeitin chronoamperometrischen Experimentenschwarze Quadrate: Ferrocenderivat 1,lineare Regression: Steigung = 0.132, Achsenabschnitt = 0.967, r = 0.995rote Kreise: Ferrocenderivat 2,lineare Regression: Steigung = 0.113, Achsenabschnitt = 0.973, r = 0.993(∅ Elektrode = 10 µm, Potentialsprung von 0 mV nach 500 mV vs. Ag/AgCl,gleiche Lösungen wie in den Experimenten in Abbildung 4.4-13: c(Fc-Derivat 1)= 5.8 mM, c(Fc-Derivat 2) = 6.2 mM)
4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 130
Vergleicht man das in den „time of flight“-Experimenten bestimmte Verhältnis der
Diffusionskoeffizienten von 0.72 mit dem in chronoamperometrischen Experimenten
bestimmten Verhältnis von 0.73, so lässt sich eine sehr gute Übereinstimmung
feststellen. Somit konnten die in den time of flight“-Experimenten bestimmten Werte
für die Diffusionskoeffizienten der Ferrocenderivate 1 und 2 durch ein unabhängiges
Verfahren bestätigt werden.
Berechnet man die absoluten Werte der Diffusionskoeffizienten so erhält man für
Ferrocenderivat 1 einen Wert von 2.81 10-6 cm2 s-1 und für Ferrocenderivat 2 einen
Wert von 3.84 10-6 cm2 s-1 in 0.1 M KCl (mit 15 % DMSO-Anteil).
4.5 Schnelle Cyclische Voltammetrie 131
4.5 Schnelle cyclische Voltammetrie
In den bisherigen „time of flight“-Experimenten mit zwei Redoxspezies mussten an
jedem Messpunkt zwei amperometrische Messungen bei unterschiedlichen
Potentialen durchgeführt werden, um unabhängig voneinander die Transitzeit jeder
Redoxspezies zu bestimmen. Trotz einer hohen Reproduzierbarkeit stellen zwei
separate Experimente immer eine recht hohes Fehlerpotential dar. Aus diesem
Grund ist es wünschenswert, beide Transitzeiten in einem Experiment zu ermitteln.
Eine geeignete Möglichkeit hierzu stellt die schnelle cyclische Voltammetrie (Fast
Scan Cyclic Voltammetry) dar. Schnelle cyclische Voltammetrie verfolgt dasselbe
Prinzip wie die konventionelle cyclische Voltammetrie, jedoch mit wesentlich höheren
Vorschubgeschwindigkeiten von mehreren hundert bis mehreren tausend Volt pro
Sekunde. Hierbei treten sehr hohe kapazitive Ströme auf, so dass schnelle cyclische
Voltammetrie nur mit Mikroelektroden sinnvoll durchführbar ist. Im Gegensatz zur
konventionellen cyclischen Voltammetrie werden bei der schnellen cyclischen
Voltammetrie die kapazitiven Stromanteile, d. h. ein schnelles cyclisches
Voltammogramm, das in reiner Leitsalzlösung aufgenommen wird, von der
eigentlichen Messung abgezogen. Aufgrund der hohen Vorschubgeschwindigkeit bei
schneller cyclischer Voltammetrie verändert sich die Form des Voltammogramms der
Mikroelektroden. Die übliche sigmoide Form bei langsamen Vorschub-
geschwindigkeiten geht bei hohen Vorschubgeschwindigkeit in eine Peakform mit
hohen Peakseparationen zwischen Oxidations- und Reduktionswelle über. Bei
langsamen Vorschubgeschwindigkeiten kann die Nachdiffusion schnell genug
erfolgen, so dass sich das typische stationäre hemisphärische Diffusionsfeld
ausbildet. Bei hohen Vorschubgeschwindigkeiten kann sich das hemisphärische
Diffusionsfeld nicht vollständig ausbilden, so dass es wie bei Makroelektroden zu
einer Stromabnahme durch die Limitierung des Massentransfers kommt.
Detaillierte Informationen über schnelle cyclische Voltammetrie finden sich
beispielsweise in [171,291-294].
Prinzipiell kann schnelle cyclische Voltammetrie in den bisher beschriebenen
Messaufbau zur Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-
Experimenten integriert werden. Das Trigger-Signal, das beim Starten des
Dispensieren der Tropfen durch den Funktionsgenerator gegeben wird, muss an
4.5 Schnelle Cyclische Voltammetrie 132
eine entsprechende Software zum Starten der kontinuierlichen Aufnahme von
schnellen cyclischen Voltammogrammen gegeben werden. Problematisch ist
allerdings die große Menge an Daten, die während einer Messung entsteht und die
verarbeitet, gespeichert, ausgewertet und dargestellt werden muss. Weiterhin
müssen aus der Datenmenge die relevanten Potential-, Strom- und
Zeitinformationen gefiltert werden.
Diese Anforderungen erfüllt bisher keine kommerziell erhältliche Potentiostat-
Software, so dass eine eigene Software zur Datenaufnahme und Auswertung, sowie
zur Ansteuerung des Potentiostaten entwickelt worden ist.
Die zu entwickelnde Software sollte dabei folgende Anforderungen erfüllen:
• Ansteuern des Potentiostaten und Generieren der Potentialrampe
• Möglichkeit zur Aufnahme eines Leer-Voltammogramms in reinem Leitsalz, das
von allen späteren Voltammogrammen subtrahiert wird. (Hintergrund-Korrektur)
• kontinuierliches Aufnehmen schneller cyclischer Voltammogramme nach Start
durch das Trigger-Signal des Dispensers
• simultane Darstellungsmöglichkeit aller relevanten Parameter wie Zeit, Potential
und Strom
• Auswertemöglichkeit des Strom-Zeit-Verlaufs bei einzelnen Potentialwerten
nachfolgender Cyclovoltammogramme
Als Programmiersprache wurde die graphische Programmiersprache „HP VEE 5.0“
unter WINDOWS 98 in Kombination mit der Schnittstellen-Software „Universal Library“
zum Ansteuern der AD/DA-Karte (Computer Boards, PCI-DAS 1602) im Computer
(Intel Pentium III, 600 MHz) benutzt.
Die Software kann in zwei verschiedenen Modi betrieben werden. Zum einen
ermöglicht die Software in Kombination mit einem Funktionsgenerator die komplette
Steuerung eines Potentiostaten und die Aufnahme der entsprechenden Messwerte,
zum anderen kann die Software auch dazu dienen, in Echtzeit die Potential- und
Stromwerte aus fast jedem kommerziell erhältlichen Potentiostat bzw. dessen
Software einzulesen.
Zum Ansteuern von Potentiostaten wird zusätzlich ein programmierbarer
Funktionsgenerator (Hewlett-Packard 33120 A) benutzt, der die Potentialrampe
generiert, die an den Potentiostaten übergeben wird. Da nur Daten in den Computer
4.5 Schnelle Cyclische Voltammetrie 133
eingelesen werden, erhöht sich die Verarbeitungsgeschwindigkeit und ermöglicht
somit hohe Vorschubgeschwindigkeiten. Über die serielle Schnittstelle wird der
Funktionsgenerator so programmiert, dass er die durch den Benutzer im Programm
vorgegebene Rampe an den Potentiostaten ausgibt. Das Starten der
Datenaufnahme des Programms und das Ausgeben der Potentialrampe durch den
Funktionsgenerators erfolgt zeitgleich über ein Trigger-Signal, das die Software an
den Funktionsgenerator gibt; die resultierenden Potential- und Stromwerte des
Potentiostaten werden über die 16-Bit-AD-Karte in den Computer eingelesen.
Alternativ dazu können Potential- und Stromwerte aus kommerziellen Potentiostaten
bzw. deren Software eingelesen werden. Das HP VEE Programm liest dabei nur die
vom Potentiostaten ausgegebenen Potential- und Stromwerte ein. Das Generieren
der Rampe und Einstellen der Parameter wird über den Potentiostaten bzw. dessen
Software vorgenommen. Zeitlich korreliert wird die Datenaufnahme durch ein
Trigger-Signal, das durch den Potentiostaten vor jedem Cyclovoltammogramm
gegeben wird und die Datenaufnahme startet. In der Datenaufnahme-Software
müssen nur die entsprechenden Rampenparameter des Potentiostaten durch den
Benutzer eingegeben werden und der externe Trigger-Eingang aktiviert werden.
In Abbildung 4.5-1 ist das Bedienfeld der entwickelten Software gezeigt.
4.5 Schnelle Cyclische Voltammetrie 134
Im Folgenden werden kurz tabellarisch die wesentlichen Merkmale und
Einstellmöglichkeiten des Programms dargestellt.
Bedien- / Anzeige-Element
Funktion
Rate [Points/s](Datenaufnahmefrequenzder AD-Karte)
legt die Zahl der Punkte pro CV fest(siehe Feld Points / Cycle)
No. of Scans Anzahl der aufzunehmenden VoltammogrammeTime per Scan [s]Overall Time [s]
theoretisch berechnete Zeitdauer für ein CV bzw. für alleCVs
Reader #1 [V]Reader #2 [V]
Verfolgung des zeitlichen Stromverlaufs beiausgewählten Potentialen:Zwei frei wählbare Potentialwerte, bei denen derentsprechende Stromwert in jedem CV ausgelesen,dargestellt und separat gespeichert wird.
Time Factor [s] Zeitfaktor, der die Verzögerung vom Ausgeben des
Abbildung 4.5-1 Bedienoberfläche der Fast Scan CV Software
4.5 Schnelle Cyclische Voltammetrie 135
(nur bei Verwendung desFunktionsgenerators zumGenerieren der Rampevon Bedeutung)
Trigger-Signals an den Funktionsgenerator bis zumendgültigen Start der Datenaufnahme berücksichtigt.
Startpotential [V]Switchpotential [V]Scanrate [V/s]
Start- und Unkehrpunkt der Potentialrampe undVorschubgeschwindigkeitDiese Werte werden bei Benutzung desFunktionsgenerators zum Programmieren der Rampeherangezogen und an den Funktionsgenerator nachdem Aktivieren des „Transmit“-Buttons übertragen. ImFalle der Benutzung als reine Datenaufnahme-Softwaremüssen diese Parameter mit den Parametern desPotentiostaten bzw. dessen Software übereinstimmen.
Time / Cycle [s] Aus den Potentiostat-Einstellungen berechneteZeitdauer für ein CV
Current Range [µA/V] Messbereichseinstellung des PotentiostatenPre Scan TriggerData Acquisition Trigger
Aktivieren bzw. Deaktivieren der externen Trigger-FunktionWenn die Trigger-Funktion aktiviert ist, startet dasProgramm die Datenaufnahme erst, wenn es dasexterne Trigger-Signal erhalten hat.
„Accept“-Button Übernahme aller eingegebenen Werte und Berechnungder entsprechenden Parameter
„Transmit“-Button Übertragung der Rampe an den Funktionsgeneratorüber die serielle Schnittstelle
„Start“-Button Start des Pre Scans bzw. der Messwertaufnahme„Pre Scan“-Button Legt fest, ob ein Pre Scan oder eine Messreihe
durchgeführt wird.Der Pre Scan wird von allen CVs der Messreihesubtrahiert (Hintergrund-Korrektur).
„Pre Scan“-Fenster Das Leer-CV wird zusammen mit der Potentialrampedargestellt. Ist ein stabiles CV erreicht, kann dasHäkchen bei „Pre Scan“ entfernt werden und dieMessreihe gestartet werden.
Subtracted CV Hier wird während der Messung das aktuellehintergrund-korrigierte CV dargestellt.
Single Data Point Reader Die Stromwerte der beiden ausgewählten Potentiale#1 (rot) und #2 (weiß) werden hier während derMessung gegen die entsprechende Nummer desVoltammogramms dargestellt.
Gespeichert werden nach Beendigung der Messung alle Voltammogramme, alle
hintergrund-korrigierten Voltammogramme, sowie die Stromwerte der beiden
ausgewählten Potentiale zusammen mit der entsprechenden Nummer des
Voltammogramms. Die gewünschten Dateinamen können vor Beginn der Messreihe
in die entsprechenden schwarz hinterlegten Felder eingetragen werden.
4.5 Schnelle Cyclische Voltammetrie 136
Zur Weiterverarbeitung und Darstellung der Messdaten wurden zwei weitere
Programme entwickelt:
Da die Dateien, die die vollständigen CVs enthalten, mehrere Megabyte groß sein
können, ist eine Verarbeitung und Darstellung mit üblichen Auswertungsprogrammen
wie ORIGIN oder EXCEL nicht möglich. Aus diesem Grunde wurde ein weiteres
Programm geschrieben, das diese Dateien wieder einliest und jedes gewünschte CV
einzeln darstellen kann. Jedes CV, das von Interesse ist, kann anschließend in eine
separate Datei gespeichert werden.
Mithilfe eines Filter-Programms, das eine Datenreduktion vornimmt, können die
Dateien, die die Messdaten aller CVs enthalten, in ein Standard-Datenformat
konvertiert werden, so dass die graphische Darstellung von Potential, Strom und Zeit
mit einer bereits vorhandenen in der Programmiersprache IDL entwickelten
Software, die für die Darstellung von SECM-Messdaten entwickelt wurde, erfolgen
kann.
4.5.1 Bestimmung relativer Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten mit schneller cyclischer Voltammetrie
Zur Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten mit
schneller cyclischer Voltammetrie wurde der gleiche Aufbau, der in Abbildung 4.4-1
gezeigt ist, verwendet, mit dem Unterschied, dass die einschraubbare
Referenzelektrode durch einen chloridisierten Silberdraht als Pseudo-
Referenzelektrode ersetzt wurde. Als Modellsubstanzen wurden [Ru(NH3)6]3+ und ein
mit Ferrocengruppen modifiziertes hochmolekulares Dendrimer, das ebenfalls am
Lehrstuhl für Anorganische Chemie der Universität Bielefeld in der Arbeitsgruppe
von Prof. Jutzi synthetisiert wurde, verwendet. Dargestellt wurde diese Verbindung
aus dem käuflichen erwerbbaren Polypropylenimin-octaamin-Dendrimer (DAB-Am 8,
Generation 2.0) durch reduktive Aminierung mit Ferrocenaldedyd und
anschließender Fällung als Multihydrochlorid [286]. Da diese Substanz sehr
hygroskopisch ist, ist eine Konzentrationsangabe sehr schwierig. [Ru(NH3)6]3+ und
das Ferrocen-Dendrimer wurden sukzessiv in 0.1 M KCl gelöst, so dass im
cyclovoltammetrischen Experiment beide Redoxwellen eine ähnliche Intensität
4.5 Schnelle Cyclische Voltammetrie 137
zeigen. In diesen Experimenten zeigte sich zudem, dass das Ferrocen-Dendrimer
zur Adsorption an der Elektrodenoberfläche neigt.
Trotzdem wurde das hochmolekulare Ferrocen-Dendrimer als zweite Redoxspezies
benutzt, da durch die großen Unterschiede in der Komplexität der Molekülstruktur
von [Ru(NH3)6]3+ und dem Ferrocen-Denrimer in „time of flight“-Experimenten eine
deutliche zeitliche Verschiebung zwischen dem Auftreten der beiden
amperometrischen Signalen zu erwarten ist.
Für die Bestimmung von Diffusionskoeffizienten wurde die Fast Scan-Software im
Datenaufnahme-Modus betrieben. Als Potentiostat wird ein HEKA PG 310 mit der
entsprechenden Software benutzt. Zu Beginn jedes Voltammogramms gibt die
Software des HEKA-Potentiostaten ein Trigger-Signal an die HP VEE Software und
startet so die Datenaufnahme.
Im Standardbetrieb schreibt die Software des HEKA-Potentiostaten nach jedem
Voltammogramm die Messdaten auf die Festplatte, was viel Zeit in Anspruch nimmt
und zu einer ungewollten Zeitverzögerung zwischen den einzelnen
Voltammogrammen führt. Diese Option kann ausgeschaltet werden, da die HP VEE
Software die Daten ebenfalls aufnimmt, diese aber im Hauptspeicher ablegt und erst
nach Beendigung aller Voltammogramme auf Festplatte schreibt, was zu einer
merklichen Geschwindigkeitssteigerung der intermediären Datenverarbeitung führt.
Direkt nach dem Starten einer Serie von 200 Cyclovoltammogrammen im
Potentialbereich zwischen -0.6 V und 0.7 V vs. Ag/AgCl (Pseudo-Referenz) mit einer
Vorschubgeschwindigkeit von 100 V/s wurde mit einer Mikropipette ein 1 µL großer
Tropfen in die Nähe der Mikroelektrode pipettiert.
Als Potentiale, bei denen die Stromwerte in jedem CV ausgelesen werden und
gespeichert werden sollen, wurden -0.2 V und 0.4 V ausgewählt, da diese den
Maxima der Redoxwellen von [Ru(NH3)6]3+ und dem Ferrocen-Dendrimer
entsprechen.
Abbildung 4.5-2 zeigt den resultierenden Stromverlauf bei -0.2 V und 0.4 V
aufgetragen gegen die Nummer des Cyclovoltammogramms.
4.5 Schnelle Cyclische Voltammetrie 138
Wie erwartet tritt die Redoxwelle von [Ru(NH3)6]3+ früher auf als die Redoxwelle des
Ferrocen-Dendrimers. Das zeitlich versetzte Auftreten der Strompeaks ist auf die
unterschiedlichen Diffusionskoeffizienten von [Ru(NH3)6]3+ und dem Ferrocen-
Dendrimer zurückzuführen und wurde bereits in früheren Abschnitten ausführlich
diskutiert. Nach Erreichen des Peakmaximums sinkt der Stromverlauf bei
[Ru(NH3)6]3+ wieder auf den Grundstrom ab. Zwar fällt der Stromverlauf beim
Ferrocen-Dendrimer nach Erreichen eines Maximums ebenfalls wieder ab, erreicht
jedoch nicht die Grundlinie, sondern bleibt auf einem hohen Stromniveau konstant.
Die hier gezeigten Stromverläufe spiegeln nur den zeitlichen Verlauf der jeweiligen
Oxidationswelle wieder. Aufschlussreicher ist eine Auftragung des gesamten Strom-
gegen Potentialverlaufs über die Zeit, also die Darstellung aller
Cyclovoltammogramme in einem Diagramm. Hierfür ist die gleichzeitige Darstellung
der 3 Koordinaten Potential, Strom und Nummer des CVs notwendig. Dieses
Problem wurde bereits für SECM-Messdaten, die ebenfalls 3 Koordinaten enthalten,
gelöst, so dass nur ein entsprechendes Filterprogramm entwickelt werden musste,
welches das Datenformat des Fast Scan CV-Programms in das SECM-Datenformat
konvertiert. Da durch Hin- und Rückscan bedingt, für jeden Potentialwert zwei
50 100 150 2000.0
0.2
0.4
0.6 -0.2 V 0.4 V
i [µ
A]
Nr. CV
Abbildung 4.5-2 Auftragung des Stromverlaufs bei -0.2 V und 0.4 V gegen die Nummer desVoltammogrammsDie schwarze Kurve bei -0.2 V entspricht der Umsetzung von [Ru(NH3)6]
3+ unddie rote Kurve bei 0.4 V entspricht der Umsetzung des Ferrocen-Dendrimers ander Elektrodenoberfläche(∅ Elektrode = 25 µm, 200 Cyclen, E = -0.6 V - 0.7 V vs. Ag/AgCl,Scangeschwindigkeit = 100 V/s, 1 µL Lösungsgemisch aus [Ru(NH3)6]
3+ undFerrocen-Dendrimer pipettiert)
4.5 Schnelle Cyclische Voltammetrie 139
Stromwerte existieren, werden Hin- und Rückscan voneinander getrennt in zwei
verschiedenen Diagrammen dargestellt.
In Abbildung 4.5-3 ist die zeitliche Entwicklung des Vorwärtsscans in einer
dreidimensionalen Darstellung gezeigt.
Der erste Peak bei -0.2 V entspricht der Redoxwelle von [Ru(NH3)6]3+, die zweite
Redoxwelle bei 0.4 V dem Ferrocen-Dendrimer. Durch diese Abbildung wird deutlich,
dass eine gegenseitige Beeinflussung der Strompeaks stattfindet. [Ru(NH3)6]3+
erreicht zuerst die Elektrodenoberfläche und wird dort umgesetzt. Man erkennt, dass
im Potentialbereich oberhalb des Formalpotentials der Strom nicht auf den
Grundstrom zurückkehrt, sondern sich der Grenzstrom einstellt, der durch das im
Rückscan generierte [Ru(NH3)6]2+ bestimmt wird. Daraus folgt, dass der erste
Stromanstieg in Abbildung 4.5-2 bei 0.4 V nicht auf die Oxidation des Ferrocen-
Dendrimers zurückzuführen ist, sondern lediglich einer Erhöhung des
Hintergrundsignals entspricht. Wenn [Ru(NH3)6]3+ sich vollständig mit dem
Lösungsvolumen verdünnt hat und dadurch keine detektierbare Umsetzung von
[Ru(NH3)6]3+ mehr an der Elektrodenoberfläche stattfindet, so klingt der
Abbildung 4.5-3 Dreidimensionale Darstellung des Vorwärtsscans einer Serie von schnellencyclischen VoltammogrammenAuf der x-Achse sind die Potentialwerte des Halbzyklus aufgetragen, in y-Richtung sind nachfolgende Voltammogramme aufgetragen. Die Stromwertesind in z-Richtung aufgetragen.Experimentelle Parameter: siehe Abbildung 4.5-2
4.5 Schnelle Cyclische Voltammetrie 140
entsprechende Strompeak vollständig ab und das Stromhintergrundsignal im
Potentialbereich zwischen den beiden Redoxwellen kehrt wieder auf seinen
Anfangswert zurück.
Abbildung 4.5-4 zeigt Farb-Darstellungen des Vorwärts- und Rückscans des in
Abbildung 4.5-2 vorgestellten Experiments.
Abbildung 4.5-4 Farb-Darstellung von schnellen cyclischen VoltammogrammenAuf der x-Achse von links nach rechts ist der Potentialbereich eines Halbzyklusaufgetragen. Die linke Abbildung zeigt den Vorwärtsscan, in x-Richtung sindsomit Potentialwerte von -0.6 V bis 0.7 V aufgetragen. Die rechte Abbildungzeigt den Rückscan mit Potentialwerten in x-Richtung von 0.7 V bis -0.6 V. In y-Richtung von unten nach oben sind die nachfolgenden Voltammogrammeaufgetragen; die y-Achse entspricht somit einer Zeitachse. Die Stromhöhe isteiner Farbskala zugeordnet.Experimentelle Parameter: siehe Abbildung 4.5-2
Auch hier wird wiederum deutlich, dass [Ru(NH3)6]3+ vor dem höhermolekularen
Ferrocen-Dendrimer die Elektrodenoberfläche erreicht. Sowohl beim Hin- als auch
beim Rückscan ist die Redoxwelle von [Ru(NH3)6]3+ bereits vollständig abgeklungen,
bevor die Redoxwelle des Ferrocen-Dendrimers ihren Maximalstrom erreicht.
Die Abbildungen verdeutlichen, dass schnelle cyclischer Voltammetrie die
Möglichkeit bietet, Zeit-, Strom- und Potentialinformation simultan in einem
Experiment zu erhalten und so die Basis für die Bestimmung von relativen
Diffusionskoeffizienten in einem „time of flight“-Experiment darstellt.
4.5 Schnelle Cyclische Voltammetrie 141
Zur Bestimmung von relativen Diffusionskoeffizienten müssen, wie bereits erläutert,
die Transitzeiten, d. h. die Zeitspanne, die die Redoxspezies benötigen, um vom
Auftreffpunkt bis zur Elektrodenoberfläche zu gelangen, bekannt sein. In dem bisher
vorgestellten Experiment wurde manuell ein Tropfen Redoxspezies in die Nähe der
Elektrodenoberfläche gebracht, was ausreicht, um qualitative Unterschiede in den
Transitzeiten festzustellen. Mit dieser Methode können jedoch keine absoluten
Transitzeiten ermittelt werden.
Aus diesem Grunde wurde wiederum auf einen Aufbau mit einem integrierten
Mikrodispenser zurückgegriffen. Der Aufbau entspricht dabei dem in Abbildung 4.4-1
erläutertem Prinzip. Der Mikrodispenser wird mit einer Lösung, die ein Gemisch aus
[Ru(NH3)6]3+ und dem Ferrocen-Dendrimer erhält, befüllt. Beim Starten des
Dispensiervorgangs wird ein Trigger-Signal vom Funktionsgenerator des Dispensers
gegeben.
Die Software des HEKA-Potentiostat wird so eingestellt, dass sie erst startet, wenn
sie das Trigger-Signal vom Funktionsgenerator erhält. Anschließend werden
kontinuierlich schnelle cyclische Voltammogramme aufgenommen. Die HP VEE
Software wird, wie bereits beschrieben, über ein Trigger-Signal, das die Software
des HEKA-Potentiostaten vor jedem Voltammogramm gibt, in die Datenaufnahme
eingebunden. Über diese Verknüpfung mit Trigger-Signalen ist der Beginn der
Aufnahme der schnellen cyclischen Voltammogramme zeitlich direkt mit dem
Einbringen der Redoxspezies in die Nähe der Elektrodenoberfläche korreliert.
In Abbildung 4.5-5 sind die mit Hilfe der HP VEE Software aufgenommenen
zeitlichen Verläufe der Stromwerte bei -0.2 V und 0.4 V nach dem Schiessen von
500 Tropfen dargestellt.
4.5 Schnelle Cyclische Voltammetrie 142
Die Peakform des [Ru(NH3)6]3+-Peaks kann trotz einer leichten Aufspaltung, die
durch eventuelle Satellitentropfen zurückzuführen ist, gut ausgewertet werden. Der
Verlauf der Stromkurve des Ferrocen-Dendrimers bereitet jedoch Schwierigkeiten.
Zum einen ist die Kurve sehr breit gezogen und zeigt keinen richtigen Abfall, zum
anderen scheint auch hier eine Aufspaltung vorzuliegen. Aus diesem Grunde
erschien es sinnvoll, einige interessante Voltammogramme aus der Gesamtzahl der
kontinuierlich aufgenommenen Voltammogramme einzeln anzuschauen.
In Abbildung 4.5-6 sind vier ausgewählte Voltammogramme gezeigt.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 40 80 120 160 200 240
Nr. CV
i (b
ei 0
.4 V
) [µ
A]
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
i (b
ei -
0.2
V)
[µA
]
0.4 V
-0.2V
Abbildung 4.5-5 Auftragung des Stromverlaufs bei -0.2 V und 0.4 V gegen die Nummer desVoltammogrammsDie schwarze Kurve bei -0.2 V entspricht der Umsetzung von [Ru(NH3)6]
3+ unddie rote Kurve bei 0.4 V entspricht der Umsetzung des Ferrocen-Dendrimers ander Elektrodenoberfläche(∅ Elektrode = 25 µm, 240 Cyclen, E = -0.6 V - 0.7 V vs. Ag/AgCl,Scangeschwindigkeit = 100 V/s, 500 Tropfen Lösungsgemisch aus [Ru(NH3)6]
3+
und Ferrocen-Dendrimer geschossen)
4.5 Schnelle Cyclische Voltammetrie 143
Das erste Voltammogramm, direkt nach dem Dispensieren aufgenommen, zeigt nur
die Basislinie, d. h. es ist noch keine der beiden Redoxspezies vor der aktiven
Elektrodenoberfläche vorhanden. Voltammogramm #48 zeigt das Maximum der
reversiblen Redoxwelle von [Ru(NH3)6]3+, das aufgrund des höheren
Diffusionskoeffizienten zuerst die Elektrodenoberfläche erreicht hat. Im
Potentialbereich des Ferrocenderivats bei 0.4 V ist keine signifikante Redoxwelle zu
erkennen. In Voltammogramm #65 hat die Höhe der Redoxwelle von [Ru(NH3)6]3+
aufgrund der fortschreitenden Verdünnung abgenommen. Das Ferrocen-Dendrimer
erreicht die Elektrodenoberfläche, so dass eine schwache Redoxwelle im Bereich
um 0.4 V entsteht. In Voltammogramm #200 ist [Ru(NH3)6]3+ vollständig im Volumen
der Lösung verdünnt, so dass die entsprechende Redoxwelle bei -0.2 V nicht mehr
vorhanden ist. Im Potentialbereich des Ferrocen-Dendrimers ist ein starker
Oxidationspeak zu erkennen In nachfolgenden Voltammogramme bleibt dieser
relativ konstant und verliert nur langsam an Intensität. Im Gegensatz zum hohen
Oxidationspeak ist der Reduktionspeak des Ferrocen-Dendrimers nur schwach
ausgeprägt. Die starke Diskrepanz zwischen Oxidations- und Reduktionspeak und
-0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8 CV #1 CV #48 CV #65 CV #200
i [µ
A]
E vs. Ag/AgCl [V]
Abbildung 4.5-6 ausgewählte Voltammogramme einer Serie von kontinuierlich aufgenommenschnellen Cyclovoltammogrammen nach dem Schiessen einesLösungsgemisches aus [Ru(NH3)6]
3+ und Ferrocen-DendrimerAlle Voltammogramme sind hintergrundkorrigiert.(∅ Elektrode = 25 µm, 240 Cyclen, E = -0.6 V - 0.7 V vs. Ag/AgCl, Scan-geschwindigkeit = 100 V/s, 500 Tropfen Lösungsgemisch aus [Ru(NH3)6]
3+ undFerrocen-Dendrimer geschossen)
4.5 Schnelle Cyclische Voltammetrie 144
das zeitlich konstante Auftreten des Oxidationspeaks deuten stark darauf hin, dass
das Ferrocen-Dendrimer auf der Elektrodenoberfläche adsorbiert.
Aus diesem Grunde ist eine Bestimmung der genauen Transitzeit des Ferrocen-
Dendrimers schwierig. Zieht man als grober Abschätzung die Mitte des ersten Peaks
als Transitzeit heran und bezieht diese auf die Mitte des ersten Peaks des
[Ru(NH3)6]3+, so lässt sich das Verhältnis der Diffusionskoeffizienten aus dem
Quotienten der Nummer des entsprechenden Voltammogramms abschätzen. Dabei
bleibt die Zeitspanne, die während eines Voltammogramms vergeht,
unberücksichtigt. Ein Voltammogramm wird einem Zeitpunkt, und zwar dem
Anfangszeitpunkt zu Beginn des Voltammogramms zugeordnet. Zur Vereinfachung
werden die entsprechenden Stromwerte der beiden Redoxspezies diesem Zeitpunkt
zugeordnet. Da ein Voltammogramm aber nur etwa 30 Millisekunden dauert, ist
diese Zeitauflösung für die Abschätzung der relativen Diffusionskoeffizienten zweier
Redoxspezies, die sich hinreichend in ihren Diffusionskoeffizienten unterscheiden,
ausreichend.
Schätzt man die Transitzeiten für [Ru(NH3)6]3+ und das Ferrocen-Dendrimer wie
oben beschrieben aus Abbildung 4.5-5 ab, so erhält man für den Quotienten aus
D([Ru(NH3)6]3+) und D(Ferrocen-Dendrimer) einen Wert von etwa 0.4. Dieser Wert ist
aus den erläuterten Gründen sehr stark fehlerbehaftet, liegt jedoch im erwarteten
Bereich, wenn man die Molekülstrukturen des Ferrocen-Dendrimers mit
Ferrocenderivat 1 vergleicht, für das im Vergleich zu [Ru(NH3)6]3+ ein relativer
Diffusionskoeffizienten von 0.63 ermittelt wurde.
4.5 Schnelle Cyclische Voltammetrie 145
4.5.2 Untersuchung des Ausblutens von Redoxmediatoren aus Carbonpasten-elektroden mit schneller cyclischer Voltammetrie
Carbonpastenelektroden, in denen neben einem Redoxmediator auch
Zirkoniumphosphat immobilisiert ist, zeigen eine gute Aktivität für die
elektrokatalytische Oxidation von NADH [295]. Geeignete Redoxmediatoren hierfür
sind z. B. Methylenblau, Nilblau, Methylengrün oder Riboflavin [295,296]. Derartige
Elektroden zeigen eine hohe Stabilität bezüglich des Ausblutens des Mediators
(Med), da dieser über einen Ionenaustausch an Zirkoniumphosphat (ZP) gebunden
wird:
ZPH + MedCl ZPMed + HCl
Im neutralen und basischen Bereich liegt das Gleichgewicht auf der Seite des
Zirkoniumphosphat-Mediator-Komplexes, so dass eine hohe Stabilität der Elektroden
in Bezug auf das Ausbluten des Mediators resultiert. Bei niedrigen pH-Werten jedoch
wird das Gleichgewicht nach links in Richtung des „freien“ Mediators verschoben,
welcher aus der Carbonpastenelektrode herausdiffundieren kann.
Bei einer pH-Wert-Änderung in der Lösung findet nur an der äußeren Schicht der
Carbonpastenelektrode ein Ausbluten des Mediators statt, so dass eine
Untersuchung mit integralen elektrochemischen Methoden schwierig ist. Der Strom,
der in voltammetrischen Experimenten durch den Elektronentransfer zwischen
Carbonpaste und Mediator hervorgerufen wird, wird über den Gesamtgehalt an
Redoxmediator in der Carbonpastenelektrode bestimmt. Da eine Änderung der
Mediatorkonzentration an der Elektroden-Lösungsmittel-Grenzfläche nur geringen
Einfluss auf die Gesamtkonzentration an Redoxmediator in der Carbonpaste hat, ist
eine Detektion des Ausblutens über eine Stromabnahme nur schwer möglich.
Eine geeignete alternative Untersuchungsmethode hierfür stellt schnelle cyclische
Voltammetrie mit einer positionierten Mikroelektrode dar. Hierfür wird die
Carbonpastenelektrode von unten in eine elektrochemische Messzelle eingeschraubt
(vgl. Abbildung 4.4-1). Die elektrochemische Zelle wird mit tris-Pufferlösung (0.1 M,
pH 7.5) befüllt. Von oben wird eine Mikroelektrode mittels Mikrometerschrauben
senkrecht sehr nahe an die elektroaktive Oberfläche der Carbonpastenelektrode
angenähert. Die Mikroelektrode wird dazu auf ein Potential von -350 mV vs. Ag/AgCl
gelegt, so dass der im Lösungsmittel gelöste Sauerstoff an der Mikroelektrode
elektrochemisch reduziert wird. Die Annäherung wird gestoppt, wenn eine definierte
4.5 Schnelle Cyclische Voltammetrie 146
Abnahme des Stroms der Mikroelektrode durch die Blockierung ihres
Diffusionsfeldes durch die Carbonpastenelektrode erreicht ist (negativer Feedback).
Anschließend kann der aus der Carbonpastenelektrode ausblutende Mediator mittels
schneller cyclische Voltammetrie detektiert werden.
Nach Einstellung eines stabilen „Leer“-Voltammogramms wird eine Messreihe mit
600 aufeinanderfolgenden schnellen cyclischen Voltammogrammen gestartet.
Während der Messung wird der pH-Wert der Lösung lokal an der
Carbonpastenelektrode verändert, indem mit einer Mikropipette an den Schaft der
Mikroelektrode ein 4 µL Tropfen 1 M Salzsäure platziert wird, der an der
Mikroelektrode herunter in die Lösung gleitet.
Mit diesem Verfahren wurde die pH-Wert-Abhängigkeit des Meditor-Ausblutens von
Carbonpastenelektroden untersucht, die Riboflavin oder Methylengrün als
Redoxmediator enthielten.
In Abbildung 4.5-7 und Abbildung 4.5-8 sind die resultierenden schnellen cyclischen
Voltammogramme einer Carbonpastenelektrode mit Zirkoniumphosphat und
Riboflavin gezeigt.
Abbildung 4.5-7 Farb-Darstellung von schnellen cyclischen VoltammogrammenAuf der x-Achse von links nach rechts ist der Potentialbereich eines Halbzyklusaufgetragen. Die linke Abbildung zeigt den Vorwärtsscan, in x-Richtung sindsomit Potentialwerte von -0.7 V bis 0.7 V aufgetragen. Die rechte Abbildungzeigt den Rückscan mit Potentialwerten in x-Richtung von 0.7 V bis -0.7 V. In y-Richtung von unten nach oben sind die nachfolgenden Voltammogrammeaufgetragen; die y-Achse entspricht somit einer Zeitachse. Die Stromhöhe isteiner Farbskala zugeordnet.(∅ Mikroelektrode = 25 µm, v = 100 V/s, 600 Cyclen, CPE: 35% Carbonpaste,65% ZP+Riboflavin)
4.5 Schnelle Cyclische Voltammetrie 147
Im neutralen pH-Bereich zu Beginn des Experiments tritt sowohl im Vor- als auch im
Rückscan eine homogene Farbverteilung über den gesamten Potentialbereich auf.
Es treten keine Redoxwellen auf, was bedeutet, dass mit der positionierten
Mikroelektrode und schneller cyclischer Voltammetrie keine Ausbluten des Mediators
zu detektieren ist. Unmittelbar nach Zusatz von 4 µL HCl tritt eine starke Oxidations-
und Reduktionswelle auf, die im Laufe des Experiments wieder abfällt. Anhand der
Potentialwerte, bei denen die Redoxwelle auftritt, kann die Substanz eindeutig als
Riboflavin identifiziert werden (Abbildung 4.5-8).
Nach Zusatz von HCl findet an der Carbonpastenelektrode eine lokal begrenzte pH-
Wert-Erniedrigung statt, die zu einer Verdrängung der an Zirkoniumphosphat
gebundenen Redoxmediatormoleküle durch Protonen führt. Die freiwerdenden
Redoxmediatormoleküle diffundieren aus der Carbonpastenelektrode in die Lösung,
wo sie von der positionierten Mikroelektrode als reversible Redoxwelle detektiert
werden. Die lokale pH-Wert-Erniedrigung wird jedoch von der Pufferlösung sehr
schnell abgefangen, so dass sich an der Carbonpaste nach kurzer Zeit wieder der
pH-Wert der Lösung von 7.5 einstellt. Bei diesem pH-Wert wird der Mediator wieder
an Zirkoniumphosphat gebunden, so dass das Ausbluten des Mediators
-0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0 CV #7
CV #159
i [µ
A]
E vs. Ag/AgCl [V]
Abbildung 4.5-8 ausgewählte Voltammogramme aus der in Abbildung 4.5-7 gezeigten Serie vonkontinuierlich aufgenommenen schnellen Cyclovoltammogrammen. BeideVoltammogramme sind hintergrundkorrigiert. Voltammogramm #7 vor derZugabe von HCl zeigt die keine Redoxwelle. Voltammogramm #159 nach derZugabe von HCl zeigt die Redoxwelle von Riboflavin.
4.5 Schnelle Cyclische Voltammetrie 148
unterbunden wird. Dies führt dazu, dass die Intensität der Redoxwelle mit
zunehmender Zeit nach der Injektion von HCl abnimmt und nahezu völlig
verschwindet. Die verbleibende geringe Redoxwelle ist auf eine Adsorption von
Riboflavin auf der Oberfläche der Mikroelektrode zurückzuführen.
Diese Resultate zeigen, dass das durch pH-Wert-Änderungen ausgelöste Ausbluten
des Redoxmediators aus den Carbonpastenelektroden ein reversibler Prozess ist.
Wiederholungsexperimente mit mehren sequentiellen pH-Wert-Änderungen zeigen,
dass der Ausblutungs-Effekt mehrfach hintereinander beobachtet werden kann, was
bedeutet, dass bei der ersten pH-Wert-Änderung nicht die gesamtmögliche Menge
an Mediator aus der Carbonpastenelektrode herausdiffundiert ist.
Führt man gleiche Experimente mit der Zugabe von 1 M NaOH durch, so ist kein
signifikantes Ausbluten des Redoxmediators zu beobachten.
Es wurden analoge Experimente mit Methylengrün, das ebenfalls als Redoxmediator
in einer Zirkoniumphosphat enthaltenden Carbonpastenelektrode verwendet wird,
durchgeführt. Dabei konnte ein analoges Ausblutungsverhalten beobachtet werden.
Aus den Ergebnisse wird deutlich, dass Carbonpastenelektroden auf der Basis von
Redoxmediatoren, die an Zirkoniumphosphat gebunden sind, eine starke
Abhängigkeit des Ausblutungsverhalten vom pH-Wert zeigen und dass das
Ausbluten einen reversiblen Prozess darstellt.
Daraus folgt, dass bei NADH-Messungen mit diesen Elektroden im saurem Milieu
berücksichtigt werden muss, dass eine Kontaminierung der Probelösung mit dem in
der Carbonpaste inkorporiertem Redoxmediator erfolgt.
4.6 Miniaturisierter elektrochemischer Affinitätsassay in Mikrolitertropfen 149
4.6 Miniaturisierung von elektrochemischen Affinitätsassaysdurch Mikrolitertropfen als elektrochemische Messzellen
Die Kosten einer Analyse mit einem Affinitätsassay werden zum größten Teil durch
die verwendete Menge des biologischen Erkennungselementes bestimmt. Weiterhin
zu berücksichtigen sind Kosten zur Anschaffung von Chemikalien und
Lösungsmitteln, sowie zu deren Entsorgung. Zur Minimierung dieser Kosten wird
zunehmend in Richtung miniaturisierter Affinitätsassays und Biosensorsysteme
geforscht.
Der in dieser Arbeit in Kapitel 4.1 vorgestellte Affinitätsassays, der auf der
Modulation des Diffusionskoeffizienten einer hapten-modifizierten Redoxspezies
nach dem Erkennen der komplementären Bindungsstruktur beruht, konnte bereits
ansatzweise miniaturisiert werden. In Kapitel 4.1.10 wurden kleine, nur wenige
Mikroliter große Tropfen als elektrochemische Messzellen für den Affinitätsassay
vorgestellt. Ein bisher nicht gelöstes Problem war dabei, eine geeignete
Dosiereinheit zu finden, die in der Lage ist, reproduzierbar und möglichst
automatisiert Probe oder Reagenz in diese Tropfenzellen zu dosieren. Bei der
Verwendung derartig kleiner Volumina und Stoffmengen muss besonderes
Augenmerk auf eine potentielle Cross-Kontaminierung beim Dosieren von Probe
oder Reagenz gelegt werden.
4.6.1 Aufbau zur Verwendung von Mikrolitertropfen als elektrochemischeMesszellen
Der in Kapitel 4.2 vorgestellte Mikrodispenser besitzt die Eigenschaft, reproduzierbar
kleinste Flüssigkeitsmengen zu dosieren. Über die Anzahl der Tropfen kann die
Größe des zu dosierenden Volumens exakt festgelegt werden. Die Flugbahn der aus
dem Mikrodispenser ausgestoßenen Tropfen ist über eine Distanz von 2-3 cm stabil.
Damit ist zur Dosierung kein physikalischer Kontakt zwischen dem Mikrodispenser
und der Tropfenzelle nötig, so dass eine mögliche Cross-Kontaminierung
ausgeschlossen wird.
Um eine möglichst reproduzierbare Bildung der Tropfenzelle und einen hohen
Automatisierungsgrad zu erreichen, wurde der in Kapitel 4.1.10 vorgestellte
4.6 Miniaturisierter elektrochemischer Affinitätsassay in Mikrolitertropfen 150
Messaufbau modifiziert und mit einem neu konzipierten Elektrodenhalter und einer
computergesteuerten motorgetriebenen Präzisions-Spritzenpumpe zur Dosierung
der Tropfenzelle versehen. In Abbildung 4.6-1 ist eine schematische Darstellung des
Aufbaus mit integriertem Mikrodispenser zur Dosierung in die Tropfenzellen gezeigt.
Die Mikroelektrode wird in den aus transparentem Polyacrylat gefertigten
Elektrodenhalter von oben eingeführt und in ihrer vertikale Position mittels einer
Schraube und einer Silikondichtung fixiert, so dass nur die Spitze der Mikroelektrode
aus der Öffnung am unteren Teil des Elektrodenhalters herausragt. Um eine
vertikale Ausrichtung der Mikroelektrode zu erhalten, ist der Durchmesser des
oberen Teil des Kanals im Inneren des Halters nur minimal größer als der
Durchmesser der Mikroelektrode. Auf beiden Seiten des unteren, breiteren Teils des
vertikalen Kanals zweigen zwei weitere Kanäle ab, von denen der untere einen
chloridisierten Silberdraht trägt, der mit einem Fitting und einer Dichtung fixiert ist.
Der obere Kanal ist über ein Fitting und einen Schlauch mit einer Präzisions-
Spritzenpumpe verbunden, mit der eine Tropfenzelle um die Spitze der
Mikroelektrode erzeugt werden kann. Aus diesem Grund besitzt der untere Teil des
chloridisierter Silberdraht
Mikroelektrode
Mikro-dispenser
Lösung
��������
Spritzen-pumpe
Spannungspulse
Fitting
Gegen-elektrode
Elektrodenhalter mit Durchflusskanal
Abbildung 4.6-1 schematische Darstellung des Messaufbaus zum Dispensieren kleiner Tropfenals elektrochemische Messzellen mit einer Spritzenpumpe und einemMikrodispenser zum Dosieren in die Tropfenzelle
4.6 Miniaturisierter elektrochemischer Affinitätsassay in Mikrolitertropfen 151
vertikalen Kanals einen größeren Durchmesser, damit Flüssigkeit um den Schaft der
Mikroelektrode herum bis zur unteren Öffnung des Elektrodenhalters fließen kann.
Mithilfe von Mikrometerschrauben wird die Gold-Makroelektrode in kurzer Entfernung
zur Mikroelektrode vorpositioniert. In einem späteren Schritt kann durch eine weitere
Verringerung der Distanz zwischen Mikroelektrode und Goldelektrode
Redoxamplifizierung erreicht werden.
Mit Hilfe der Spritzenpumpe wird eine exakte Menge an Flüssigkeit aus der Öffnung
am unteren Ende des Elektrodenhalters herausgedrückt, so dass ein Tropfen um die
Spitze der Mikroelektrode gebildet wird, der von der Goldelektrode und der
Auslassöffnung des Elektrodenhalters begrenzt wird. Aufgrund der geringen Distanz
zwischen Mikroelektrode und Goldelektrode benetzt die aus der Öffnung
heraustretende Flüssigkeit die Goldoberfläche. Da die Goldoberfläche von einer
hydrophoben Teflonummantelung umgeben ist, wird nur der Goldteil der Elektrode
benetzt, so dass die Form des Tropfens durch den Durchmesser der Goldoberfläche
und der Öffnung des Elektrodenhalters bestimmt wird. Somit führt das Dispensieren
eines genau definierten Volumens mit der Spritzenpumpe zur Ausbildung eines
definierten Tropfens zwischen Elektrodenhalter und Goldelektrode. Abhängig vom
Volumen der Spritzenpumpe und der Distanz zwischen Mikroelektrode und
Elektrodenhalter können so reproduzierbar Tropfen mit Volumina zwischen 5 und
50 µL erzeugt werden.
Der Mikrodispenser wird so positioniert, dass der ausgestoßene Tropfenstrahl nahe
der aktiven Elektrodenoberfläche der Mikroelektrode in die Tropfenzelle trifft. Um die
Störung durch Luftbewegung möglichst gering zu halten, wird der Mikrodispenser
dabei so positioniert, dass die zurückgelegte Distanz des Tropfenstrahls vor dem
Auftreffen auf die Tropfenzelle geringer als 1 cm ist.
Zur Minimierung der Verdampfung der Tropfenzelle befindet sich der gesamte
Aufbau in einem FARADAY-Käfig mit einer möglichst wassergesättigten Atmosphäre.
Weiterhin ist die Gold-Makroelektrode von einem Wasserreservoir mit
wassergetränkten Filterpapieren umgeben, um lokal eine mit Wasser maximal
gesättigte Atmosphäre zu erhalten. In Abbildung 4.6-2 ist eine Fotografie des
Elektrodenhalters mit dem Wasserreservoir gezeigt.
4.6 Miniaturisierter elektrochemischer Affinitätsassay in Mikrolitertropfen 152
Es existieren prinzipiell zwei Möglichkeiten, den Affinitätsassay auf Basis der
Modulation des Diffusionskoeffizienten einer hapten-modifizierten Redoxspezies (vgl.
Kapitel 4.1) mit dem beschriebenen Aufbau durchzuführen. Entweder wird die Probe
mit dem Mikrodispenser in eine Tropfenzelle, die hapten-modifizierte Redoxspezies
enthält, geschossen (Abbildung 4.6-3 a) oder der Mikrodispenser wird mit der
hapten-modifizierten Redoxspezies befüllt, die dann in den Probetropfen geschossen
wird (Abbildung 4.6-3 b).
Abbildung 4.6-2 Fotografie des Elektrodenhalters mit positioniertem MikrodispenserZur besseren Übersicht wurde das Filterpapier aus dem Wasserreservoir, dasdie Goldelektrode und die Tropfenzelle umgibt, entfernt.
4.6 Miniaturisierter elektrochemischer Affinitätsassay in Mikrolitertropfen 153
Das Messsignal des Affinitätsassays ist die Abnahme des diffusionskontrolliert
fließenden Stromes, hervorgerufen durch die Änderung des Diffusionskoeffizienten
der hapten-modifizierten Redoxspezies nach Anbindung des komplementären
Bindungspartners. Das maximale Messsignal wird erreicht, wenn die Gesamtmenge
an Redoxspezies an den komplementären Bindungspartner in der Probe gebunden
ist. Aufgrund der großen Differenz zwischen dem Volumen der Tropfenzelle (~10 µL)
und dem Volumen der mit dem Mikrodispenser geschossenen Tropfen (~100 pL)
erscheint es nicht sinnvoll, die Probe in eine Tropfenzelle, die hapten-modifizierte
Redoxspezies enthält, zu schießen, was im Folgenden näher erläutert wird. Obwohl
diese Methode ein Minimum an Probelösung benötigt, können beim Betreiben des
Mikrodispensers im Durchflussmodus Probleme durch Viskositätsunterschiede und
unterschiedliche Beschaffenheiten der Proben auftreten. Um ein reibungsloses
Funktionieren des Dispensers zu gewährleisten, müssten alle Proben sorgfältig
filtriert und vorbereitet werden, so dass diese möglichst gleiche physikalische
Eigenschaften aufweisen. Um Störeffekte, die durch die Volumenzunahme in der
Tropfenzelle nach dem Schiessen der Probe entstehen und ebenfalls zu einer
Stromabnahme führen, zu minimieren, ist es vorteilhaft, so wenige Pikolitertropfen
wie möglich in die Tropfenzelle zu schießen. Dies impliziert die Verwendung
hochkonzentrierter Probelösungen bei niedrigen Konzentrationen der hapten-
modifizierten Redoxspezies in der Tropfenzelle. Hierbei ist zu bemerken, dass in
a) b)
Abbildung 4.6-3 schematische Darstellung der beiden prinzipiellen Möglichkeiten zurDurchführung des Affinitätsassays
4.6 Miniaturisierter elektrochemischer Affinitätsassay in Mikrolitertropfen 154
realen Proben hohe Konzentrationen an biologischen Erkennungselementen eher
unwahrscheinlich sind.
Aus diesen Gründen wurde sich für das folgende Verfahren entschieden: Mit Hilfe
der Spritzenpumpe wird einen definierter Probetropfen erzeugt, in den dann mit dem
Mikrodispenser die hapten-modifizierte Redoxspezies als Reagenz
hineingeschossen wird. Hierbei wird der Mikrodispenser, als wertvollstes Teil der
Apparatur, nicht mit Probe kontaminiert. Diese Variante gestattet zudem die
Verwendung von geringen Probekonzentrationen, da hier keine Überlagerung des
Messsignals des Assays durch die Volumenzunahme der Tropfenzelle auftritt,
welche durch Kalibrierkurven ausgeglichen werden muss.
Eine typische Messprozedur des miniaturisierten Affinitätsassays mit diesem
Verfahren setzt sich aus folgenden Schritten zusammen:
1. Die Probe (z. B. Streptavidin) wird in die Spritzenpumpe eingesaugt und der
Mikrodispenser wird mit der hapten-modifizierten Redoxspezies (z. B. Fc-Biotin)
befüllt.
2. Mithilfe der Spritzenpumpe wird ein festgelegtes Volumen dosiert, so dass sich
eine definierte Tropfenzelle um die Mikroelektrode formt.
3. Eine definierte Tropfenzahl hapten-modifizierter Redoxspezies wird mit dem
Mikrodispenser in den Probetropfen geschossen und das komplementäre
Bindungsereignis zwischen Probe und hapten-modifizierter Redoxspezies wird
mit elektrochemischen Messverfahren (z. B. cyclische Voltammetrie oder
Chronoamperometrie) detektiert.
4. Aus dem diffusionskontrolliert fließenden Strom wird durch Vergleich mit
Kalibrierkurven die Konzentration der Probe ermittelt.
4.6.2 Dispensieren von Redoxspezies in elektrochemische Tropfenzellen
Um die Reproduzierbarkeit dieses Ansatzes, die intrinsischen Fehler durch
Verdampfung des Tropfens und unvollständiges Mischen innerhalb des Tropfens zu
evaluieren, wurden Experimente durchgeführt, in denen Redoxspezies in eine nur
aus Basiselektrolyt bestehende Tropfenzelle geschossen wurde und die
resultierende Stromantwort der Mikroelektrode aufgezeichnet wurde. Als
4.6 Miniaturisierter elektrochemischer Affinitätsassay in Mikrolitertropfen 155
elektrochemische Methode wurde die kontinuierliche cyclische Voltammetrie
gewählt, um Störeffekte wie Elektrodenfouling und unspezifische Adsorption zu
verringern.
Als Redoxspezies wird das auch im Affinitätsassay zur Anwendung kommende
Fc-Biotin (siehe Abbildung 4.1-3, Struktur von Fc-Biotin) verwendet.
Wenn eine definierte Anzahl an Tropfen Fc-Biotin-Lösung in die Tropfenzelle
geschossen wird, so tritt direkt nach dem Dispensieren eine hohe lokale
Konzentration an Fc-Biotin im Auftreffpunkt auf. Der hohe Konzentrationsgradient
bewirkt eine Diffusion des Fc-Biotin vom Auftreffpunkt in das Volumen des Tropfens
bis eine homogene Verteilung erreicht ist. Die Konzentration von Fc-Biotin an der
Elektrodenoberfläche der Mikroelektrode hängt somit vom Abstand zwischen
Auftreffpunkt und Elektrodenoberfläche und von der Zeitspanne zwischen dem
Dispensieren der Redoxspezies und dem Erreichen der Elektrodenoberfläche ab.
Man erhält eine peakförmiges Stromsignal der Mikroelektrode, analog zu der in
Kapitel 4.4.1 (Dispensieren von Redoxspezies in die Nähe einer
Elektrodenoberfläche mit amperometrischer Detektion) beschriebenen Situation. Ist
vollständige Verdünnung erreicht, so wird die Konzentration von Fc-Biotin an der
Elektrodenoberfläche zeitunabhängig. Der resultierende FARADAY-Strom spiegelt die
mittlere Konzentration an Fc-Biotin im Tropfen wieder.
Abbildung 4.6-4 zeigt eine Serie von kontinuierlich aufgenommenen
Cyclovoltammogrammen nach dem Schiessen von 10000 Tropfen Fc-Biotin in eine
Tropfenzelle aus 10 µL Phosphatpuffer.
4.6 Miniaturisierter elektrochemischer Affinitätsassay in Mikrolitertropfen 156
Das erste Voltammogramm zeigt nur die Ladeströme der elektrochemischen
Doppelschicht in der Basiselektrolytlösung. Nach dem Schiessen der Redoxspezies
bildet sich eine durch die Oxidation und Reduktion von Fc-Biotin an der
Elektrodenoberfläche verursachte reversible Redoxwelle aus. Die Ströme im
diffusionslimitierten Potentialbereich steigen in jedem Voltammogramm an, bis sie
schließlich ein Maximum erreichen. In weiteren Cyclovoltammogrammen sinkt der
Strom wieder ab, bis bei vollständiger Verdünnung des Fc-Biotins in der Tropfenzelle
ein stationärer Strom erreicht wird.
In Abbildung 4.6-5 ist der diffusionskontrolliert fließende Strom bei 0.3 V, der sich in
analogen Experimenten mit unterschiedlicher Anzahl an geschossenen Fc-Biotin
Tropfen ergibt, gegen die Nummer des entsprechenden Voltammogramms
aufgetragen.
0.0 0.1 0.2 0.3
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
7-10
6
5
4
3
2
1
i [n
A]
E vs. Ag/AgCl [V]
Abbildung 4.6-4 Serie von kontinuierlich aufgenommenen Cyclovoltammogrammen nach demSchiessen von 10000 Tropfen Fc-Biotin in eine 10 µL Tropfenzelle aus 0.1 MPhosphatpuffer(∅ Elektrode = 50 µm, 10 Cyclen, Scangeschwindigkeit = 15 mV/s, c(Fc-Biotin)= 1.15 mM)
4.6 Miniaturisierter elektrochemischer Affinitätsassay in Mikrolitertropfen 157
Nach dem Schiessen von 10000 Tropfen Fc-Biotin stellt sich ein stationärer
Stromwert bei vollständiger Verdünnung von 0.789 nA ein. In einem analogen
Experiment mit 15000 Tropfen Fc-Biotin ergibt sich ein Stromwert von 1.186 nA.
Diese Stromwerte sind direkt mit der Konzentration an Fc-Biotin im Tropfen
korreliert. Bildet man den Quotienten aus den beiden Stromwerten, so erhält man
einen Wert von 1.503, welcher sehr gut mit dem theoretisch berechneten Wert von
1.5 aus dem Quotienten der Zahl der geschossenen Tropfen Fc-Biotin
übereinstimmt.
Dieses verdeutlicht die Möglichkeit, die Konzentration an Fc-Biotin in der
Tropfenzelle über die Anzahl an geschossenen Fc-Biotin Tropfen festzulegen. Durch
das Schiessen der entsprechenden Anzahl an Tropfen kann jede beliebige
Konzentration im Tropfen etabliert werden.
Zur Evaluierung der Verdampfung des Lösungsmittels im Tropfen wurde die
Spritzenpumpe mit 0.13 mM Fc-COOH in 0.1 M Phosphatpuffer befüllt und eine
10 µL große Tropfenzelle erzeugt. Anschließend wurde kontinuierlich cyclische
0 5 10 15 20 25 30 351.10
1.15
1.20
1.25
1.30
1.35
1.40
1.45
i [n
A]
Nr. CV
2 4 6 8 10 12 140.5
1.0
1.5
2.0
2.5
(a) 10000 Tropfen Fc-Biotin (b) 15000 Tropfen Fc-Biotin (c) Verdampfungseffekt
i [nA
]
Nr. CV
Abbildung 4.6-5 Stromwerte bei 0.3 V in nachfolgenden Voltammogrammen in 10 µLTropfenzellen aus 0.1 M Phosphatpuffer nach dem Schiessen von 10000Tropfen Fc-Biotin (Kurve a) und 15000 Tropfen Fc-Biotin (Kurve b).(∅ Elektrode = 50 µm, Scangeschwindigkeit = 15 mV/s, c(Fc-Biotin)= 1.15 mM)Kurve c (oben rechts mit vergrößerter Skala) zeigt als VergleichsmessungStromwerte gemessen in einer 10 µL Tropfenzelle aus 0.13 mM Fc-COOH. DerStromanstieg ist auf die Verdampfung des Lösungsmittels aus der Tropfenzellezurückzuführen.
4.6 Miniaturisierter elektrochemischer Affinitätsassay in Mikrolitertropfen 158
Voltammogramme mit der Mikroelektrode aufgenommen. Setzt man eine hohe
Reversibilität der heterogenen Elektronentransferreaktion voraus, so sind die
Stromzunahmen in nachfolgenden cyclischen Voltammogrammen im
diffusionskontrollierten Potentialbereich auf eine Erhöhung der Konzentration an
Fc-COOH im Tropfen durch eine Verdampfung des Lösungsmittels zurückzuführen.
Trägt man den Strom im diffusionslimitierten Potentialbereich bei 0.3 V gegen die
Nummer des Voltammogramms auf (Abbildung 4.6-5, Kurve c), so ergibt sich nur ein
leichter Stromanstieg, was verdeutlicht, dass Verdampfungseffekte vernachlässigt
werden können.
4.6.3 Miniaturisierter elektrochemischer Affinitätsassay in Tropfenzellen
Nachdem demonstriert wurde, dass der beschriebene Aufbau in der Lage ist,
Pikolitertropfen mit hoher Präzision in eine Tropfenzelle zu schießen und man durch
die Zahl der geschossenen Tropfen die Konzentration an Redoxspezies in der
Tropfenzelle definieren kann, muss eine Prozedur zur Durchführung des
elektrochemischen Affinitätsassay basierend auf der Modulation des
Diffusionskoeffizienten der hapten-modifizierten Redoxspezies entwickelt werden.
In den Teflonschlauch, der die Spritzenpumpe mit dem Elektrodenhalter verbindet,
werden Probensegmente (jedes mit einem Volumen von 50 µL) mit
unterschiedlichen Konzentrationen an Streptavidin eingesogen. Für eine Messung
wird eine 10 µL Tropfenzelle aus der Mitte jedes Probensegmentes um die
Mikroelektrode erzeugt. Der Mikrodispenser wird Fc-Biotin Lösung gefüllt und eine
festgelegte Anzahl an Pikolitertropfen wird in die Tropfenzelle geschossen. Die
resultierende Stromantwort der Mikroelektrode wird mittels kontinuierlicher cyclischer
Voltammetrie detektiert. Die diffusionslimitierten Stromwerte bei einem Potential von
0.3 V werden gegen die Nummer des entsprechenden Voltammogramms
aufgetragen bis ein stationärer Stromwert erreicht wird. Nachdem die Messung
beendet ist, wird die Tropfenzelle entfernt und nach Waschschritten mit den
folgenden Segmenten wird aus der Mitte des nächsten Probensegmentes eine neue
10 µL Tropfenzelle erzeugt.
4.6 Miniaturisierter elektrochemischer Affinitätsassay in Mikrolitertropfen 159
In Abbildung 4.6-6 ist eine entsprechende Kalibrierkurve gezeigt, bei der die
stationären Ströme bei 0.3 V gegen die Konzentration an Streptavidin des jeweiligen
Probensegmentes aufgetragen sind.
Die Anbindung von Streptavidin an den Biotinteil des biotin-markierten Ferrocens
resultiert in einer Erniedrigung des Diffusionskoeffizienten und führt somit zu einer
Verringerung des diffusionslimitierten Stroms. In Probensegmenten, die nur geringe
Konzentrationen an Streptavidin enthalten, können nicht alle Fc-Biotin Moleküle
einen Bindungspartner finden. Somit setzt der diffusionslimitierte Strom der
Mikroelektrode aus Anteilen an freiem Fc-Biotin und an Streptavidin gebundenem
Fc-Biotin zusammen. Wenn allerdings die Streptavidinkonzentration den
Sättigungswert erreicht hat, so dass alle Fc-Biotin Moleküle einen Bindungspartner
finden, so wird der Strom unabhängig von der Streptavidinkonzentration. Dies führt
dazu, dass die Kalibrierkurve bei hohen Konzentrationen an Streptavidin einem
Grenzwert zustrebt.
Die absolute Menge an Streptavidin in einem 10 µL Tropfen mit einer Konzentration
von 1 mg/mL beträgt 180 pmol. Durch das Schiessen von 10000 Tropfen einer 1 mM
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
0.64
0.66
0.68
0.70
0.72
0.74
0.76
0.78
i [nA
]
c (Streptavidin) [mg/ml]
Abbildung 4.6-6 Kalibrierkurve für Streptavidin abgeleitet aus den diffusionslimitiertenStromwerten bei 0.3 V von stationären cyclischen Voltammogrammen beivollständiger Verdünnung von Fc-BiotinIn 10 µL Tropfenzellen mit unterschiedlichen Konzentrationen an Streptavidinwurden jeweils 10000 Tropfen Fc-Biotin geschossen.(∅ Elektrode = 50 µm , Scangeschwindigkeit = 15 mV/s, c(Fc-Biotin) = 1 mM)
4.6 Miniaturisierter elektrochemischer Affinitätsassay in Mikrolitertropfen 160
Fc-Biotin Lösung mit dem Mikrodispenser wird eine absolute Stoffmenge von 1 nmol
Fc-Biotin in die Tropfenzelle gebracht. Berücksichtigt man die Tatsache, dass jedes
Streptavidinmolekül vier Bindungsstellen für Biotin hat, so wird eine Sättigung bei
einer Streptavidinkonzentration von 1.4 mg/mL erreicht. Diese Abschätzung ist in
guter Übereinstimmung mit der Kalibrierkurve, die bei Streptavidinkonzentrationen
zwischen 1 mg/mL und 2 mg/mL in ihren Grenzwert erreicht. Extrapoliert man
zwischen diesen beiden Punkten so ergibt sich eine Sättigungskonzentration für
Streptavidin von 1.5 mg/mL.
4.6.4 Signalverstärkung durch Redoxamplifizierung
Um mit dem hier beschriebenen Aufbau eine Signalverstärkung durch
Redoxamplifizierung zu erreichen, muss die Mikroelektrode sehr dicht an die Gold-
Makroelektrode angenähert werden. Der Effekt der Redoxamplifizierung ist bereits in
vorherigen Kapiteln ausführlich diskutiert worden, weswegen hier nicht noch einmal
darauf eingegangen wird.
Die Gold-Makroelektrode kann mittels einer Mikrometerschraube und einem
Piezoelement in vertikaler Richtung positioniert werden. Eine 10 µL Tropfenzelle, die
neben Basiselektrolyt auch Fc-Biotin enthält, wird erzeugt. Die Mikroelektrode wird
auf 0.5 V polarisiert, so dass Fc-Biotin unter Diffusionskontrolle an dieser umgesetzt
wird. Während kontinuierlich der Strom der Mikroelektrode aufgenommen wird,
nähert man die Goldelektrode mittels der Mikrometerschraube an die Mikroelektrode
an. Sobald eine Stromzunahme durch Redoxrecycling des Fc-Biotins an der
Goldelektrode zu verzeichnen ist, wird eine Feineinstellung der vertikalen Position
der Goldelektrode mit dem Piezoelement vorgenommen. Ist der gewünschte
Verstärkungsfaktor erreicht, wird die Annäherung gestoppt und die Position der
Goldelektrode für alle folgenden Experimente konstant gehalten. Die Tropfenzelle
wird entfernt und nach einigen Waschschritten werden mit der Spritzenpumpe
Tropfenzellen mit verschiedenen Konzentrationen an Streptavidin erzeugt. Analog zu
den im vorherigen Abschnitt beschriebenen Verfahren wird mittels cyclischer
Voltammetrie der diffusionslimitierte Strom bestimmt, der sich nach dem
Dispensieren von Fc-Biotin in die Tropfenzelle ergibt.
4.6 Miniaturisierter elektrochemischer Affinitätsassay in Mikrolitertropfen 161
In Abbildung 4.6-7 sind entsprechende cyclische Voltammogramme bei vollständiger
Verdünnung nach dem Schiessen von jeweils 10000 Tropfen Fc-Biotin in
Tropfenzellen unterschiedlicher Streptavidinkonzentration gezeigt. Nach dem letzten
Experiment mit der höchsten Streptavidinkonzentration wurde die Goldelektrode
mittels des Piezoelementes um 100 µm abgesenkt, um den Bereich der
Redoxamplifizierung zu verlassen. Ein weiteres cyclisches Voltammogramm wurde
aufgenommen, aus welchem man den Verstärkungsfaktor bestimmen kann. In
diesem Experiment wurde ein Verstärkungsfaktor von 2.9 benutzt, welcher sich aus
den Verhältnis der Stromwerte bei einem Potential von 0.3 V des Voltammogramms
mit und ohne Redoxamplifizierung ergibt.
Trägt man die Stromwerte bei 0.3 V jedes stationären Cyclovoltammogramms gegen
die entsprechende Konzentration an Streptavidin auf, so erhält man eine
Kalibrierkurve, die in Abbildung 4.6-8 gezeigt ist.
0.1 0.2 0.3
0
1
2
3
6
4,532
1(1) Phosphatpuffer
(2) 0.25 mg/ml SPA
(3) 0.50 mg/ml SPA
(4) 1.00 mg/ml SPA
(5) 2.00 mg/ml SPA
(6) ohne Redoxamplifizierung
i [nA
]
E vs. Ag/AgCl [V]
Abbildung 4.6-7 Stationäre cyclische Voltammogramme mit Redoxamplifizierung beivollständiger Verdünnung von Fc-Biotin in 10 µL Tropfenzellen unterschiedlicherStreptavidinkonzentration nach dem Dispensieren von 10000 Tropfen Fc-Biotin. Nach der letzten Messung wurde die Elektrode aus dem Feedbackbereichbewegt und Voltammogramm 6 wurde ohne Redoxamplifizierungaufgenommen.(∅ Elektrode = 50 µm , Scangeschwindigkeit = 10 mV/s, c(Fc-Biotin) = 1 mM)
4.6 Miniaturisierter elektrochemischer Affinitätsassay in Mikrolitertropfen 162
Die Kalibrierkurve zeigt die bereits diskutierte Form, wobei durch das Redoxrecycling
zwischen Mikroelektrode und Gegenelektrode eine Erhöhung der Stromdifferenzen
und damit des Messsignals zu verzeichnen ist, was zu einer verbesserten Sensitivität
des Assays führt. Redoxamplifizierung hat keinen Einfluss auf den Messbereich des
Assays, der durch die Konzentration an Fc-Biotin, der Anzahl an geschossenen
Pikolitertropfen und der Größe der Tropfenzelle festgelegt wird. Da diese Parameter
unverändert sind, erhält man eine Kalibrierkurve mit der gleichen Sättigungs-
charakteristik wie ohne Redoxamplifizierung.
Ein direkter Vergleich der Kalibrierkurven des Fc-Biotin/Streptavidin Affinitätsassays
mit und ohne Redoxamplifizierung verdeutlicht die Erhöhung der Sensitivität des
Verfahrens durch Redoxamplifizierung (Abbildung 4.6-9).
0.0 0.5 1.0 1.5 2.02.6
2.7
2.8
2.9
3.0
3.1
3.2
i [n
A]
c(Streptavidin) [mg/ml]
Abbildung 4.6-8 Kalibrierkurve für Streptavidin, abgeleitet aus den diffusionskontrolliertenStrömen bei 0.3 V der Cyclovoltammogramme in Abbildung 4.6-7
4.6 Miniaturisierter elektrochemischer Affinitätsassay in Mikrolitertropfen 163
Neben dem Amplifizierungsfaktor können in dem entwickelten Affinitätsassays eine
Reihe von Parametern, wie Volumen der Tropfenzelle, Zahl der geschossenen
Pikolitertropfen und Konzentration der hapten-modifizierten Redoxspezies an die
spezifischen Bedürfnisse einer analytischen Fragestellung angepasst werden.
Eine weitere Reduzierung der Größe der Tropfenzelle, eine Erhöhung der
Konzentration der hapten-modifizierten Redoxspezies und eine Optimierung der
geschossenen Tropfenzahl in Kombination mit einem höheren Amplifizierungsfaktor
erlaubt eine Verbesserung des Detektionslimits. Gleichzeitig kann der Verbrauch an
Probe und hapten-modifizierter Redoxspezies weiter gesenkt werden.
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0-0.5
-0.4
-0.3
-0.2
-0.1
0.0 (a) ohne Redoxamplifizierung (b) mit Redoxamplifizierung
∆ i [n
A]
c(Streptavidin) [mg/ml]
Abbildung 4.6-9 Erhöhung der Sensitivität des Affinitätsassays durch RedoxamplifizierungKalibrierkurve (a) wurde ohne und Kalibrierkurve (b) mit Redoxamplifizierungerhalten.(∅ Elektrode = 50 µm , Scangeschwindigkeit = 10 mV/s, Stromwerte inVoltammogrammen bei 0.3 V bestimmt, V(Tropfenzelle) = 10 µL, 10000Pikolitertropfen Fc-Biotin geschossen, c(Fc-Biotin) = 1 mM)
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 164
4.7 Deposition von Enzym-Pikolitertropfen auf Oberflächen alsBasis für miniaturisierte Multianalyt-Sensorstrukturen
Die laterale Strukturierung von Oberflächen mit Enzymen und biologischen
Erkennungselementen auf Transduceroberflächen findet zunehmendes Interesse
seit die Miniaturisierung ein starker Trend in der Forschung und Entwicklung von
neuen Sensorsystemen geworden ist.
Im Folgenden soll ein neues Verfahren vorgestellt werden, dass es sowohl
ermöglicht, mit hohe lokaler Auflösung und Präzision biologisch aktive Strukturen auf
beliebigen Oberflächen herzustellen, als auch die biologische Information mit lokaler
Auflösung quantitativ auszulesen.
Zur Mikrostrukturierung wird der in Kapitel 4.2 vorgestellte Mikrodispenser benutzt
und zum Auslesen der biologischen Information wird Elektrochemische
Rastermikroskopie (SECM) eingesetzt.
4.7.1 Herstellung von Enzym-Mikrostrukturen
Zur Mikrostrukturierung von Enzymen auf Oberflächen ist ein Aufbau entwickelt
worden, der aus einem x,y,z-Mikromanipulator zur Positionierung der
Substratoberfläche und einem Mikrodispenser, dessen x,y,z-Position ebenfalls mit
Mikrometerschrauben festgelegt werden kann, besteht. Das Substrat, in diesem Fall
ein goldbeschichtetes Siliziumplättchen, wird mit doppelseitigem Klebeband an den
Halter des Mikromanipulators befestigt, so dass eine Feinpositionierung der
Oberfläche in allen Raumrichtungen möglich ist. Der Mikrodispenser wird mit der
entsprechenden Enzymlösung befüllt und so positioniert, dass die vom Dispenser
ausgestoßenen Tropfen auf die gewünschte Stelle der Oberfläche treffen. Eine
schematische Abbildung des Aufbaus ist in Abbildung 4.7-1 gezeigt.
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 165
Zur Herstellung von Enzym-Mikrostrukturen wird ein einzelner Tropfen mit einem
Volumen von 100 pL aus der Öffnung des Dispensers herausgestoßen. Dieser trifft
auf die Oberfläche und bildet dort einen kreisförmigen Spot mit einem Durchmesser
von ca. 100 µm. Anschließend wird das Substrat mit den Mikromanipulatoren in
lateraler Richtung bewegt und ein weiterer Tropfen wird auf die Oberfläche
geschossen. Ist die Distanz groß genug, so erhält man einzelne Enzymspots mit
einem Durchmesser von 100 µm. Wenn die Distanz zwischen zwei
Tropfenausstößen kleiner als 100 µm ist, so führt dies zu einer Überlappung
benachbarter Spots. Mit Hilfe dieser Methode lassen sich beliebige enzymatische
Strukturen auf die Oberfläche schreiben. Eine Automatisierung des Verfahrens
(Dispensieren, Bewegen der Oberfläche, Dispensieren) ist durch den Austausch der
Mikrometerschrauben durch computergesteuerte Schrittmotoren und einer
entsprechenden Software möglich.
Damit die Enzymstrukturen sich bei späteren Untersuchungen in wässrigen
Lösungen nicht ablösen, müssen geeignete Immobilisierungstechniken zur Fixierung
der Enzyme auf der Oberfläche verwendet werden.
���������� +
-
Düse
Piezoaktor
Enzym- lösung
Goldplättchen
Mikrostrukturen
X
Y
Z
Mikropositionier-system
Abbildung 4.7-1 schematische Darstellung des Aufbaus zur Herstellung von Enzym-Mikrostrukturen bestehend aus Mikrodispenser mit Enzymlösung,Positioniersystem und Substratoberfläche
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 166
Dabei stehen prinzipiell zwei Methoden zur Auswahl:
1. Kovalente Anbindung an die mit funktionellen Gruppen modifizierte
Substratoberfläche
2. Quervernetzung der Enzyme mit Kopplungsreagenzien oder physikalischer
Einschluss in einer geeigneten Polymermatrix
Für beide Methoden wurden mehrere Beispiele untersucht, die im Folgenden
erläutert werden.
Zur kovalenten Anbindung an die Oberfläche muss diese mit funktionellen Gruppen
versehen werden. Geeignet hierfür sind beispielsweise Goldoberflächen, die sich mit
selbstorganisierenden Monoschichten (Self Assembled Monolayer, SAM)
modifizieren lassen. Thiole und Disulfide lagern sich spontan an eine saubere
Goldoberfläche an und bilden dort geordnete Monoschichten. Verwendet man Thiole
und Disulfide mit terminalen funktionellen Gruppen, so erhält man nach Ausbildung
einer Monoschicht eine funktionalisierte Goldoberfläche, an die eine weitere
kovalente Anbindung stattfinden kann. Besonders geeignet hierfür sind
Funktionalitäten wie Aminogruppen, Säuregruppen oder N-Hydroxysuccinimidylester-
Gruppen.
Als Substratoberflächen wurden goldbedampfte Siliziumwafer benutzt, die in 0.5 cm
x 0.5 cm große Stücke geschnitten wurden. Zur Funktionalisierung werden die
Goldoberflächen für 2 Stunden in eine Lösung des entsprechenden Disulfids
getaucht. Durch die Verwendung eines amino-terminierten Disulfids (Cystamin)
können mit Aminogruppen funktionalisierte Goldoberfläche erhalten werden und
durch die Verwendung von 3-3’-Dithiodipropionsäure-di(N-succinimidylester) kann
die Goldoberfläche mit N-hydroxysuccinimidylester-Gruppen (im Folgenden
Aktivester-Gruppen genannt) modifiziert werden.
Im Falle der mit Aminogruppen modifizierten Oberfläche wird der Dispenser mit einer
Lösung befüllt, die neben dem Enzym ein Carbodiimid (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino-
propyl)carbodiimid, EDAC) enthält, welches die Säuregruppen des Enzyms aktiviert
und so die kovalente Anbindung an die Aminogruppen der modifizierten
Goldoberfläche ermöglicht. Gleichzeitig kann ein Quervernetzen der Enzyme über
die aktivierten Säuregruppen und die Lysinreste eines zweiten Enzymmoleküls
stattfinden.
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 167
Bei der mit Aktivester-Gruppen modifizierten Goldoberfläche ist kein zusätzliches
Reagenz notwendig. Der Dispenser wird nur mit einer wässrigen Lösung des
Enzyms befüllt. Es findet eine kovalente Kopplung der Enzyme über Lysinreste an
die aktivierten Säuregruppen der Goldoberfläche unter Ausbildung einer
Amidbindung statt. Da hierbei keine Quervernetzung auftritt, führt diese Methode zur
Ausbildung einer definierten Enzym-Monoschicht auf der Goldoberfläche.
In beiden Fällen wird nach einer Inkubationszeit von mindestens 2 Stunden die nicht
gebundene Menge an Enzym mit Pufferlösung hoher Ionenstärke intensiv
abgewaschen.
Beide Reaktionssequenzen zur Enzymimmobilisierung sind in Abbildung 4.7-2
dargestellt.
O
O
OON
S
O
O
OON
S
O
O
OON
S
O
O
OON
S
NH2
O-
O
S
O-
O
S
O
S
NH
O
S
NH
NH2
S
NH2
S
NH2
S
NH2
S
NH2
S
NH2
S
NH2
SCOOH
+ EDAC
NH2
S
NH2
S
NH2
S
NH2
S
NH
S
O
NH
O
NH2
S
NH
S
O
Abbildung 4.7-2 Reaktionssequenzen zur kovalenten Kopplung von Enzymen an funktionalisierteMonoschichtenoberes Schema: Ausbildung von Amidbindungen zwischen carbodiimid-aktivierten Säuregruppen des Enzyms und terminalen Aminogruppen derCystamin-Monoschichtunteres Schema: Ausbildung von Amidbindungen zwischen Lysinresten desEnzyms und terminalen Aktivester-Gruppen einer 3-Thiopropionsäure(N-succinimidylester)-Monoschicht
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 168
Die bisher beschriebenen Methoden setzen eine Oberfläche mit funktionellen
Gruppen voraus, so dass nur eine begrenzte Zahl von Materialien in Frage kommt.
Setzt man der Enzymlösung im Dispenser Quervernetzungsreagenzien oder eine
Polymermatrix, in das Enzym eingeschlossen werden kann, zu, so lassen sich
praktisch auf jede Oberfläche enzymatische Mikrostrukturen aufbringen.
Als Beispiel für eine Quervernetzung der Enzyme wurde der Enzymlösung als
Kopplungsreagenz Poly(ethylenglycol)-(400)-diglycidylether (PEGDGE) zugesetzt.
Die beiden terminalen Epoxidringe des PEGDGE binden unter Ringöffnung an die
Lysinreste der Enzyme, so dass eine Quervernetzung der Enzyme über ihre
Aminogruppen mit PEGDGE als Brückenmolekül stattfindet [297].
Nach einer Reaktionszeit von 2 Stunden wird nicht quervernetztes Enzym mit
Pufferlösung hoher Ionenstärke von der Oberfläche abgespült.
Für eine Immobilisierung der Enzyme durch physikalischen Einschluss in einer
Polymermatrix wurde Vinnapas EP 16, eine wässrige Polyvinylacetat-Polyethylen-
Copolymer-Dispersion, verwendet [298,299]. Die Enzymlösung wird dazu mit einer
wässrigen Dispersion des Vinnapas EP 16 Polymers vermischt. Nach dem
Dispensieren der Mikrostrukturen werden die Substratoberflächen zum Trocknen der
Polymermatrix für 12 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt und anschließend
intensiv mit Pufferlösung gespült.
O
CH2 O (CH2 CH2 O)n CH2
O+ NH22 R
CH2 O (CH2 CH2 O)nCHCH2NHR
OH
CH2 CH CH2 NH R
OH
Abbildung 4.7-3 Reaktionsschema der Quervernetzung von Enzymen mit PEGDGE
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 169
In Abbildung 4.7-4 sind zwei Beispiele für unterschiedliche Strukturen gezeigt, die mit
diesen Immobilisierungstechniken auf Oberflächen aufgebracht wurden. Die
Fotografien wurden jeweils vor dem Spülen der Substratoberflächen mit Pufferlösung
aufgenommen.
Abbildung 4.7-4 Fotografien von immobilisierten Enzym-MikrostrukturenDie Abbildung links zeigt zwei Linien immobilisierter Glucoseoxidase, die durchSchiessen von EDAC-aktivierter Glucoseoxidase auf eine cystamin-modifizierteGoldoberfläche erhalten wurden. Die Linien haben einen Durchmesser von etwa100 µm und einen Abstand von 500 µmDas Foto rechts zeigt eine Meanderstruktur aus Glucoseoxidase, die mittelsSchiessen von Glucoseoxidase-Lösung auf eine aktivester-modifizierteGoldoberfläche hergestellt wurde.
4.7.2 Visualisierung von immobilisierter Enzymaktivität mittels Elektro-chemischer Rastermikroskopie
Aufgrund der Tatsache, dass die Fläche mit immobilisierten Enzymen im Vergleich
zur gesamten Oberfläche sehr klein ist, können integrale Methoden, wie z. B.
Amperometrie, nicht zur Bestimmung der Aktivität der immobilisierten Enzyme
verwendet werden, da die bei dieser Technik auftretenden Hintergrundströme und
Kapazitäten sehr viel größer wären als das vergleichsweise geringe
amperometrische Messsignal. Photometrische Methoden besitzen zwar eine
ausreichend hohe Sensitivität zur Erfassung der immobilisierten Enzymaktivität,
jedoch können mit dieser Technik keine Aussagen über die lokale Variation der
Enzymaktivität gemacht werden.
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 170
Aus diesem Grund wurde zur Erfassung der lokal immobilisierten Enzymaktivität die
Elektrochemische Rastermikroskopie (SECM) verwendet. Im Kapitel „Stand der
Forschung“ sind bereits mehrere Anwendungsfälle beschrieben worden, in denen
SECM erfolgreich zur Untersuchung von immobilisierter Enzymaktivität eingesetzt
worden ist.
Im Falle von immobilisierten Oxidasen ist die einfachste Methode, das enzymatisch
generierte H2O2 im Generator-Kollektor-Modus an einer positionierten
Mikroelektrode, welche auf ein Potential von 600 mV vs. Ag/AgCl polarisiert ist, zu
oxidieren. Der resultierende Stromfluss durch die Mikroelektrode ist direkt korreliert
mit der H2O2-Konzentration und somit auch mit der lokalen Enzymaktivität. Bewegt
man die Mikroelektrode lateral über die Probenoberfläche, so kann zwischen Orten
hoher Enzymaktivität (hoher Strom) und Orten, an denen keine Enzymaktivität
vorhanden ist (niedriger Hintergrundstrom), unterschieden werden. Trägt man den
Strom gegen die x,y-Position der Mikroelektrode auf, so lässt sich ein
Enzymaktivitätsprofil der Probe erhalten. Eine schematische Darstellung dieses
Verfahrens zur Visualisierung immobilisierter Enzymaktivität ist in Abbildung 4.7-5
gezeigt.
X
YZ
Probenoberfläche
Enzym-substrat
ProduktO2 H2O2
immobilisierteEnzyme
Strom
Abbildung 4.7-5 Schematische Darstellung der Detektion von immobilisierter Enzymaktivität mitdem SECMDie Oxidation des enzymatisch lokal generierten H2O2 an der Mikroelektrodeführt zu einem Stromfluss. Beim lateralen Bewegen der Mikroelektrode über dieProbenoberfläche sind über immobilisierten Enzymen hohe Ströme und überunmodifizierten Flächen niedrige Ströme zu verzeichnen (vgl. blaue Linie).
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 171
Der Aufbau und die Funktionsweise eines SECM ist detailliert im Kapitel „Stand der
Forschung“ erläutert worden, weswegen hier nicht noch einmal darauf eingegangen
wird.
Die zu untersuchende Probe wird in eine für das SECM geeignete Messzelle
montiert und diese mit Basiselektrolyt-Lösung befüllt. Die Mikroelektrode wird von
oben in die Messzelle abgesenkt. Eine Ag/AgCl-Referenz- und Platin-
Gegenelektrode komplettieren die 3-Elektrodenanordnung. Zur Visualisierung des
enzymatisch generierten H2O2 muss die Mikroelektrode der Probeoberfläche bis auf
eine Distanz, die in der Größenordnung des Durchmessers der aktiven
Elektrodenoberfläche der Mikroelektrode liegt, angenähert werden. Um eine
Annäherung unabhängig von der enzymatischen Reaktion an der Probenoberfläche
machen zu können, wurde die Reduktion von molekularem Sauerstoff an der
Mikroelektrode genutzt. Die Mikroelektrode wird dazu auf -350 mV vs. Ag/AgCl
polarisiert und langsam der Probenoberfläche angenähert. Sobald die
Mikroelektrode so dicht an die Probeoberfläche angenähert ist, dass die
Nachdiffusion des O2 partiell durch diese blockiert wird, ist eine Abnahme des
Reduktionsstroms der Mikroelektrode zu verzeichnen (negativer Feedback). Die
Annäherung wird fortgesetzt und gestoppt, sobald eine vordefinierte Stromabnahme
(typischerweise 75 %) erreicht ist.
Das entsprechende Substrat des immobilisierten Enzyms wird der Lösung in der
Messzelle zugesetzt. Anschließend wird die Mikroelektrode auf 600 mV vs. Ag/AgCl
polarisiert und zur Detektion der immobilisierten Enzymaktivität lateral über die
Probenoberfläche bewegt.
Abbildung 4.7-6 zeigt das resultierende SECM-Bild für die in Abbildung 4.7-4
gezeigten immobilisierten zwei Glucoseoxidaselinien.
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 172
Die Stromzunahmen über den beiden immobilisierten Glucoseoxidaselinien zeigen
die typische durch das Diffusionsprofil des H2O2 verursachte verbreiterte Peakform.
Wie erwartet, beträgt der Abstand zwischen den beiden Maxima 500 µm. In
y-Richtung ist ein starker linearer Stromanstieg zu beobachten, welcher entweder auf
eine Verkippung zwischen Mikroelektrode und Probenoberfläche oder einer
Akkumulation des enzymatisch gebildeten H2O2 zurückzuführen ist.
Zur Klärung dieses Sachverhaltes wurde ein Topographiebild der Probenoberfläche
aufgenommen. Dazu wurde die Glucoselösung aus der Messzelle entfernt und nach
gründlichem Spülen gegen eine Lösung mit Hexacyanoferrat(II) als lösliche
Redoxspezies ausgetauscht. Die Mikroelektrode wird auf 500 mV vs. Ag/AgCl
polarisiert, so dass Hexacyanoferrat(II) unter Diffusionskontrolle oxidiert wird.
Anschließend wird der gleiche Bereich wird noch einmal abgerastert. Das
resultierende SECM-Bild ist in Abbildung 4.7-7 dargestellt.
Abbildung 4.7-6 SECM-Bild der Enzymaktivität von zwei immobilisierten Glucoseoxidaselinien,aufgenommen in 0.1 M Glucoselösung(∅ Elektrode = 25 µm , E = 0.6 V vs. Ag/AgCl)
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 173
Da Glucose als Enzymsubstrat der Glucoseoxidase nicht mehr in der Lösung
vorhanden ist, ist die immobilisierte Glucose inaktiv und es sind keine Stromanstiege
über den Glucoseoxidaselinien zu verzeichnen. Lediglich sehr kleine
Stromschwankungen, die Oberflächenrauhigkeiten zuzuordnen sind, sind über den
Glucoseoxidaselinien zu erkennen. In y-Richtung ist eine starke Stromzunahme zu
verzeichnen. Das an der Mikroelektrode generierte Hexacyanoferrat(III) wird an der
leitenden Goldoberfläche wieder zu Hexacyanoferrat(II) reduziert (positiver
Feedback-Effekt). Dieses Redoxrecycling zwischen Mikroelektrode und
Goldoberfläche führt zu einer Zunahme des Stroms der Mikroelektrode und ist stark
abstandsabhängig. Ändert sich durch eine nicht planparallele Ausrichtung der
Abstand zwischen Mikroelektrode und Goldoberfläche beim Rastern der
Mikroelektrode, so wird bei einer Vergrößerung des Abstandes eine Stromabnahme
und bei einer Verkleinerung des Abstands eine Stromzunahme beobachtet.
Die Stromzunahme in y-Richtung kann somit auf eine Verringerung der Distanz
zwischen Mikroelektrode und Goldoberfläche in y-Richtung zurückgeführt werden.
Damit erklärt sich auch der Stromanstieg in y-Richtung in Abbildung 4.7-6, welche
die Enzymaktivitäten der Glucoseoxidaselinien zeigt. Der Stromanstieg wird also
Abbildung 4.7-7 SECM-Bild der Topographie der Goldoberfläche mit zwei immobilisiertenGlucoseoxidaselinien, aufgenommen in 1 mM K4[Fe(CN)6]Der untersuchte Bereich ist identisch zu dem in Abbildung 4.7-6.
(∅ Elektrode = 25 µm , E = 0.5 V vs. Ag/AgCl)
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 174
offensichtlich nicht durch eine Akkumulation des enzymatisch generierten H2O2
verursacht, sondern kann auf die Verringerung der Distanz zwischen Mikroelektrode
und Goldoberfläche während des Abrasterns zurückgeführt werden.
Im Folgenden soll gezeigt werden, dass die Detektion von Enzymaktivität mit dem
SECM sensitiv genug ist, um auch Monoschichten immobilisierter Glucoseoxidase zu
detektieren. Die Linienstruktur, die in den vorherigen Experimenten untersucht
wurde, basierte auf der Immobilisierung von mit EDAC aktivierten Enzymen auf einer
Cystamin-Monoschicht, wobei es durch Kopplung der Enzyme untereinander zur
Ausbildung einer Enzymmultischicht kommen kann. Benutzt man die
Immobilisierungsmethode, bei der die Goldoberfläche mit Aktivester-Gruppen
modifiziert wird, und auf die nur reine Enzymlösung geschossen wird, so kann keine
Quervernetzung der Enzyme stattfinden und man erhält eine Monoschicht
immobilisierter Enzyme auf der Oberfläche. Eine mit dieser Methode hergestellte
Meanderstruktur (vgl. Abbildung 4.7-4) wurde mit dem SECM untersucht. Das
resultierende SECM-Bild ist in Abbildung 4.7-8 gezeigt.
Abbildung 4.7-8 SECM-Bild der Enzymaktivität einer Meanderstruktur aus immobilisierterGlucoseoxidase, aufgenommen in 0.1 M Glucose(∅ Elektrode = 25 µm , E = 0.6 V vs. Ag/AgCl)
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 175
Die Abbildung verdeutlicht, dass auch eine Monoschicht immobilisierter
Glucoseoxidase über die Detektion des enzymatisch produzierten H2O2 mit der
Mikroelektrode visualisiert werden kann. Die Meanderstruktur ist dabei klar als
Anstieg des Oxidationsstroms im SECM-Bild wiederzuerkennen.
4.7.3 Quantitative Bestimmung von Enzymsubstratkonzentrationen
Die bisherigen Messungen demonstrieren die Möglichkeit, mit Hilfe des SECM die
Aktivität der immobilisierten Enzym-Mikrostrukturen zu detektieren. Jedoch wurde
bislang nicht gezeigt, dass es möglich ist, mit dieser Methode quantitative
Messungen mit unterschiedlichen Substratkonzentrationen durchzuführen. Das
Quantifizieren von Substratkonzentrationen ist aber eine unabdingbare
Voraussetzungen für eine eventuelle Nutzung dieser Strukturen als Biosensoren
oder Multianalyt-Sensorsysteme.
Um ein hohes Messsignal durch eine möglichst große Menge an immobilisierter
Enzymaktivität zu erhalten, wurde eine Linien-Mikrostruktur aus Glucoseoxidase
unter Nutzung von PEGDGE als Quervernetzungsreagenz auf einer Goldoberfläche
hergestellt.
Bewegt man die positionierte Mikroelektrode in Gegenwart unterschiedlicher
Konzentrationen an Glucose über die Linie immobilisierter Glucoseoxidase und
zeichnet den jeweils resultierenden Strom der Mikroelektrode auf, so erhält man die
in Abbildung 4.7-9 gezeigten Kurven.
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 176
Trägt man die Höhe der Peakströme von der jeweiligen Grundlinie der Kurven in
Abbildung 4.7-9 gegen die entsprechende Glucosekonzentration auf, so erhält man
eine Kalibrierkurve für Glucose, die in Abbildung 4.7-10 gezeigt ist.
0 500 1000 1500 20000.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8 1 mM 2 mM 3 mM 4 mM 5 mM 8 mM 13 mM 23 mM
i [n
A]
Distanz [µm]
Abbildung 4.7-9 H2O2-Oxidationsströme einer Mikroelektrode beim Rastern über einerimmobilisierten Glucoseoxidaselinie in Gegenwart unterschiedlicher Glucose-konzentrationen(∅ Elektrode = 50 µm , E = 0.6 V vs. Ag/AgCl)
0 5 10 15 20 250.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
i [nA
]
c (Glucose) [mM]
Abbildung 4.7-10 Kalibrierkurve für Glucose erhalten aus den Peakströmen der Linienscans inAbbildung 4.7-9
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 177
Die Kalibrierkurve zeigt die für eine MICHAELIS-MENTEN-Kinetik typische
Sättigungscharakteristik bei hohen Glucosekonzentrationen. Ermittelt man die
kinetischen Daten des Sensors mittels nicht-linearerer Regression nach der
Modellgleichung
cK
cii
M
max
+= (Gleichung 4.7-1)
unter Variation der Parameter imax und KM nach dem LEVENBERG-MARQUARDT-
Algorithmus, so erhält man für die MICHAELIS-MENTEN-Konstante KM einen Wert von
2.81 ± 0.26 mM und für den Maximalstrom imax einen Wert von 0.55 ± 0.01 nA.
Diese Ergebnisse verdeutlichen die Möglichkeit, mit Enzym-Mikrostrukturen unter
Nutzung des SECM quantitativ Substratkonzentrationen zu bestimmen.
Mit Hilfe dieser Messmethode können zudem Interferenzen durch in der Probelösung
vorhandene co-oxidierbare Substanzen eliminiert werden, die bei dem angelegten
Potential von 0.6 V vs. Ag/AgCl ebenfalls an der Elektrode umgesetzt werden
können. Die Cooxidation von Interferenzien, wie z. B. Ascorbinsäure oder
Paracetamol, führt bei vielen amperometrischen Sensoren, die auf der Detektion von
H2O2 basieren, zu einem höheren Stromfluss, so dass der daraus ermittelte Wert für
die Glucosekonzentration höher ist als der tatsächliche.
Abbildung 4.7-11 zeigt den Einfluss von Ascorbinsäure auf das Messsignal beim
Rastern der Mikroelektrode über eine Glucoseoxidaselinie. Zunächst wurde das
Stromsignal der Mikroelektrode in einem Linienscan über der Glucoseoxidaselinie in
Gegenwart von Glucose aufgezeichnet. Anschließend wurde der Lösung
Ascorbinsäure zugesetzt und der gleiche Linienscan noch einmal durchgeführt.
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 178
Der Zusatz von Ascorbinsäure bewirkt eine Erhöhung der Basislinie. Der
Stromhintergrund steigt durch die Oxidation von Ascorbinsäure an der
Mikroelektrode von 0.2 nA auf etwa 0.9 nA an. Die Höhe des Stromanstiegs von der
jeweiligen Basislinie bis zum Strommaximum, hervorgerufen durch das von der
immobilisierten Glucoseoxidase produzierte H2O2, bleibt jedoch konstant. Das
Messsignal zur Bestimmung der Glucosekonzentration ist somit unabhängig von der
Gegenwart von Ascorbinsäure.
Hierdurch wird deutlich, dass Interferenzen durch co-oxidierbare Probenbestandteile
durch die Subtraktion des Stromhintergrunds wirkungsvoll eliminiert werden können.
Zu bemerken ist, dass hierfür im Gegensatz zu vielen anderen Sensorsystemen
keine zusätzliche Messung mit einer Vergleichselektrode, die nur das durch co-
oxidierbare Substanzen verursachte Stromsignal erfasst, notwendig ist.
Das Potential der Kombination von SECM und Enzym-Mikrostrukturen wird in den
folgenden Abschnitten anhand von Multianalyt- und Multischicht-Sensorstrukturen
verdeutlicht.
0 500 1000 1500 2000
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
4 mM Glucose
4 mM Glucose + 0.1 M Ascorbinsäure
i [nA
]
Distanz [µm]
Abbildung 4.7-11 Oxidationsströme einer Mikroelektrode beim Rastern über einer immobilisiertenGlucoseoxidaselinie in Gegenwart von Glucose (untere Linie) und in Gegenwartvon Glucose und Ascorbinsäure (obere Linie)(∅ Elektrode = 50 µm , E = 0.6 V vs. Ag/AgCl)
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 179
4.7.4 Multianalyt-Sensorstrukturen
Für die Herstellung von Multisensor-Strukturen mit dem Mikrodispenser müssen zwei
oder mehrere Enzymstrukturen sequentiell in sehr kurzem Abstand voneinander auf
das Substrat aufgebracht werden. Als Immobilisierungsmethode wurde auf eine mit
Aktivester-Gruppen modifizierte Goldoberfläche zurückgegriffen, auf die eine
wässrige Lösung des zu immobilisierenden Enzyms geschossen wird. Durch den
Verzicht auf den Zusatz von Quervernetzungsreagenzien kann zum einen die
Enzymlösung für mehrere Versuche benutzt werden, zum anderen können durch die
milden Reaktionsbedingungen auch labile Enzyme verwendet werden. Es ist
beispielsweise nicht möglich, Lactatoxidase mit EDAC unter Beibehaltung der
enzymatischen Aktivität zu aktivieren.
Um das Detektionsprinzip (Oxidation von H2O2 an einer lateral bewegten
Mikroelektrode) beizubehalten, wurden verschiedene Oxidasen als Basis für eine
Multisensor-Struktur ausgewählt.
Neben Glucoseoxidase wurde Lactatoxidase als zweite Oxidase ausgewählt, da der
simultanen Bestimmung von Lactat und Glucose hohe Bedeutung zukommt, z. B. bei
der Überwachung von Molkereiprodukten oder in der klinischen Analytik [300].
Bewegt man die positionierte Mikroelektrode über lokal separierte Strukturen von
verschiedenen immobilisierten Oxidasen, so kann jede von ihnen nur dann über eine
Stromzunahme visualisiert werden, wenn sich das entsprechende Enzymsubstrat in
der Lösung befindet. Ein Strompeak über einer immobilisierten Oxidasestruktur zeigt
somit die Gegenwart des entsprechenden Enzymsubstrats in der Probenlösung an.
Aus der Höhe des Strompeaks kann, wie im vorherigen Abschnitt erläutert, die
Konzentration des Substrats bestimmt werden.
Zur Herstellung derartiger Multisensor-Strukturen wurde der Dispenser mit einer
wässrigen Lösung von Lactatoxidase befüllt und eine Linie auf eine mit Aktivester-
Gruppen modifizierte Goldoberfläche geschossen. Der Mikrodispenser wird intensiv
mit Wasser gespült und mit einer wässrigen Lösung von Glucoseoxidase befüllt. Das
Goldsubstrat wird mit den Mikrometerschrauben lateral bewegt und eine
Glucoseoxidaselinie wird parallel zur Lactatoxidaselinie geschossen.
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 180
Damit ergeben sich folgende Reaktionssequenzen:
- an der Glucoseoxidaselinie: ββββ-D-Glucose + O2 → D-Glucono-δ-lacton + H2O2
- an der Lactatoxidaselinie: L-Lactat + O2 → Pyruvat + H2O2
Durch die lokale Detektion von enzymatisch generiertem H2O2 mit dem SECM
können somit beide Enzymlinien visualisiert werden.
Abbildung 4.7-12 SECM-Bilder einer Linie immobilisierter Glucoseoxidase und einer Linieimmobilisierter LactatoxidaseDie linke Abbildung wurde in der Gegenwart von 0.1 M Lactat aufgenommen, sodass nur die Lactatoxidaselinie visualisiert wird. Die rechte Abbildung wurdenach dem Zusatz von Glucose erhalten und zeigt somit die Aktivität derimmobilisierten Glucoseoxidase und Lactatoxidase.(∅ Elektrode = 25 µm , E = 0.6 V vs. Ag/AgCl)
Abbildung 4.7-12 links zeigt ein SECM-Bild der Region beider immobilisierter
Enzymlinien in der Gegenwart von Lactat. Wie erwartet, ist eine einzelne Linie hoher
Stromwerte bei einer x-Position von 1600 µm zu erkennen, was in guter
Übereinstimmung mit der Lage der immobilisierten Lactatoxidase ist. Anschließend
wurde der Lösung Glucose zugesetzt und der gleiche Bereich noch einmal
abgerastert. Das resultierende SECM-Bild ist in Abbildung 4.7-12 rechts gezeigt. Die
Lactatoxidaselinie ist weiterhin zu erkennen; zusätzlich tritt eine weitere Linie hoher
Stromwerte bei einer x-Position von 600 µm auf, die durch die Oxidation des von der
jetzt aktiven Glucoseoxidase erzeugten H2O2 an der Mikroelektrode hervorgerufen
wird.
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 181
Diese Resultate zeigen, dass lokales Strukturieren von Oberflächen mit
verschiedenen Enzymen mit dem Mikrodispenser möglich ist.
Die Detektion des Diffusionsprofils von lokal enzymatisch generiertem H2O2
ermöglicht die simultane quantitative Bestimmung verschiedener Enzymsubstrate
während eines einzigen Linienscans ohne Interferenzprobleme und Hintergrund-
korrekturen.
4.7.5 Multischicht-Sensorstrukturen
Die bisher generierten Enzymstrukturen bestanden aus nur einer
Immobilisierungsschicht, die jeweils nur ein Enzym enthielt. Die
Immobilisierungsmethoden unter Nutzung von PEGDGE als Quervernetzungs-
reagenz oder Vinnapas EP 16 als Polymermatrix zum Einschließen von Enzymen
gestatten jedoch auch das Aufbauen von Enzymmultischichten ohne signifikante
Vergrößerung der lateralen Dimensionen.
Diese Möglichkeit eröffnet den Weg zu Sensorstrukturen, mit denen durch
Interaktion verschiedener Enzyme in Multischichtstrukturen fast jedes biologische
Substrat bestimmt werden kann.
Im Folgenden wird die Interaktion verschiedener Enzyme in derartigen
Multischichtstrukturen an mehren Beispielen demonstriert.
Zur Untersuchung der Interaktion verschiedener Enzyme wurden unterschiedliche
Mikrostrukturen nach folgendem Schema hergestellt. Es werden mehrere parallele
Linien eines ersten Enzyms A auf die Oberfläche aufgebracht, anschließend wird die
Lösung im Dispenser gegen Enzymlösung B ausgetauscht und es werden um 90°
verdrehte parallele Linien geschossen. An den Kreuzungspunkten der beiden
Enzymlinien liegen immobilisierte Multienzymschichten vor.
Ein Beispiel für eine derartige Gitterstruktur ist in Abbildung 4.7-13 gezeigt.
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 182
Zur Evaluierung wurde zunächst eine Monoenzymstruktur aus Glucoseoxidase
hergestellt. Im SECM-Experiment ist zu erwarten, dass bei dieser Struktur die
Gitterkreuzungen aufgrund der größeren Menge an immobilisiertem Enzym einen
höheren Strom zeigen, als die Gitterlinien. In Abbildung 4.7-14 ist das SECM-Bild
einer Gitterstruktur von immobilisierter Glucoseoxidase gezeigt, das über die
Detektion von H2O2 in Gegenwart von Glucose erhalten wurde.
Abbildung 4.7-13 Fotografie einer Gitterstruktur verschiedener Enzyme (Einschluss in VinnapasEP16 auf einer Goldoberfläche)In den Quer- und Längslinien sind die Enzyme A bzw. B immobilisiert, so dassan den Kreuzungspunkten Multienzymschichten vorliegen. Die Breite der Linienbeträgt 100 µm.
Abbildung 4.7-14 SECM-Bild der Aktivität einer Gitterstruktur von immobilisierter Glucoseoxidasein Gegenwart von 1 M Glucose(∅ Elektrode = 50 µm, E = 0.6 V vs. Ag/AgCl)
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 183
Die Gitterstruktur der immobilisierten Glucoseoxidase kann gut im SECM-Bild
wiedererkannt werden. Weiterhin zeigt sich, dass, wie erwartet, an den Kreuzungen
der Gitterlinien aufgrund der höheren immobilisierten Enzymaktivität ein höherer
Strom als über den Enzymlinien zu verzeichnen ist.
Dieses Experiment demonstriert die Möglichkeit, durch Gitterstrukturen
Enzymschichten übereinander zu immobilisieren und die Gitterkreuzungspunkte
mittels SECM eindeutig zu erfassen.
Aufbauend auf diesen Grundlagen wurde zu Multienzymschicht-Strukturen
übergegangen.
Ein System von zwei interagierenden Enzymen stellen Glucoseoxidase und Catalase
dar. Catalase wird in Kombination mit Oxidasen benutzt, um Interferenzen in
amperometrischen Biosensoren durch endogenes H2O2 zu eliminieren. Catalase
katalysiert die Disproportionierungsreaktion von H2O2, wobei das H2O2 sowohl als
Substrat als auch als Cosubstrat dient [301].
Wird Catalase mit Glucoseoxidase gekoppelt, so findet die folgende
Reaktionssequenz statt:
- an der Glucoseoxidase-Struktur: ββββ-D-Glucose + O2 → D-Glucono-δ-lacton + H2O2
- an der Catalase-Struktur: 2 H2O2 → 2 H2O + O2
Um die Kopplung und Interaktion zweier Enzyme in Enzym-Mikrostrukturen zu
zeigen und um das bekannte Detektionsprinzip beizubehalten, wurde eine zu
Abbildung 4.7-13 analoge Gitterstruktur aus Glucoseoxidase und Catalase
hergestellt. Dementsprechend bestehen die Linien A aus immobilisierter
Glucoseoxidase und die Linien B aus immobilisierter Catalase.
In Abbildung 4.7-15 ist in einer schematischen Zeichnung das im SECM-Experiment
erwartete Stromprofil erläutert.
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 184
In Abbildung 4.7-16 ist das SECM-Bild einer Gittermikrostruktur aus Glucoseoxidase
und Catalase gezeigt, das durch die Detektion des von der Glucoseoxidase in
Gegenwart von Glucose produziertem H2O2 an der Mikroelektrode erhalten wurde.
Abbildung 4.7-15 erwartetes Stromprofil im SECM-Experiment über einer Glucoseoxidase-Catalase-Gitterstruktur in Gegenwart von GlucoseDas von der Glucoseoxidase (Enzym 1) produzierte von der Mikroelektrodedetektierbare H2O2 wird von der Catalase (Enzym 2) umgesetzt, so dass anden Kreuzungspunkten eine lokal verringerte H2O2 Konzentration herrscht.
Abbildung 4.7-16 SECM-Bild einer Glucoseoxidase-Catalase Gitterstruktur aufgenommen in 1 MGlucoseDie drei Glucoseoxidaselinien sind parallel zur y-Achse und die drei Catalase-linien parallel zur x-Achse orientiert.(∅ Elektrode = 50 µm , E = 0.6 V vs. Ag/AgCl)
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 185
Die Linien immobilisierter Glucoseoxidase parallel zur y-Achse sind klar als
Stromanstiege zu erkennen. An den Kreuzungspunkten mit den parallel zur x-Achse
verlaufenden Catalaselinien ist jedoch eine starke Stromabnahme zu beobachten,
was darauf zurückzuführen ist, dass das in der unteren Glucoseoxidaseschicht
produzierte H2O2 in der darüber liegenden Catalaseschicht enzymatisch gespalten
wird. Somit bildet sich an diesen Punkten kein H2O2 Diffusionsprofil aus, so dass mit
der Mikroelektrode an diesen Stellen ein verringerter Stromfluss zu messen ist.
Weiterhin zu bemerken ist, dass aufgrund der enzymatischen Zersetzung von H2O2
entlang der Catalaselinien durchgehend eine Verringerung des Hintergrundstroms
zu verzeichnen ist.
Eine der Hauptanwendungen interagierender Enzyme in amperometrischen
Biosensoren ist die Bestimmung von Substraten, welche in der enzymatischen
Reaktion zu einem elektrochemisch inaktiven Produkt umgesetzt werden. Das
elektrochemisch inaktive Produkt, das in der primären enzymatischen Reaktion
gebildet wird, dient dabei als Substrat eines zweiten Enzyms, aus dessen
Katalysereaktion ein elektrochemisch aktives Produkt hervorgeht. Eine derartige
Kopplung von Enzymen ist dabei nicht auf zwei Enzyme beschränkt, sondern kann
entsprechend der interagierenden Eigenschaften der Enzyme zu beliebigen
Enzymkaskaden ausgedehnt werden.
Im Folgenden wird ein Beispiel für drei interagierende Enzyme vorgestellt, welche die
Bestimmung des Disaccharids Maltose gestatten. Dabei wird die Interaktion
zwischen den Enzymen α-Glucosidase, Mutarotase und Glucoseoxidase in folgender
Reaktionssequenz ausgenutzt:
- in der α-Glucosidase-Struktur: Maltose + H2O → 2 α-D-Glucose
- in der Mutarotase-Struktur: α-D-Glucose → β-D-Glucose
- in der Glucoseoxidase-Struktur: β-D-Glucose + O2 → D-Glucono-δ-lacton + H2O2
Somit kann erwartet werden, dass sich Maltose durch die Detektion des in der
Glucoseoxidase-Strukur gebildeten H2O2 bestimmen lässt.
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 186
Abbildung 4.7-17 zeigt eine schematische Zeichnung, in der das zu erwartende
Stromprofil im SECM-Experiment in Gegenwart von Maltose erläutert wird.
Es wurde eine Gittermikrostruktur hergestellt, in der sich drei Linien immobilisierter
Glucoseoxidase mit drei Linien, die sowohl immobilisierte α-Glucosidase als auch
immobilisierte Mutarotase enthalten, schneiden. In Gegenwart von Maltose wurde
ein entsprechendes SECM-Experiment an dieser Struktur durchgeführt, in dem
enzymatisch gebildetes H2O2 mit der Mikroelektrode detektiert wird.
Das so erhaltene SECM-Bild ist in Abbildung 4.7-18 gezeigt.
Abbildung 4.7-17 erwartetes Stromprofil im SECM-Experiment über einer Glucoseoxidase/Glucosidase/Mutarotase-Gitterstruktur in Gegenwart von MaltoseDie von der Glucosidase/Mutarotase-Struktur (Enzym 2) aus Maltose(Substrat 2) generierte Glucose (Substrat 1) wird von der Glucoseoxidase(Enzym 1) umgesetzt, wobei H2O2 als detektierbares Produkt gebildet wird.Diese Enzymkopplung findet nur an den Kreuzungspunkten statt, so dass dorteine hohe lokale H2O2 Konzentration zu erwarten ist.
4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 187
An den neun Kreuzungspunkten zwischen den Enzymlinien sind klare
Stromerhöhungen zu erkennen. Dies bedeutet, dass an diesen Punkten die oben
aufgeführten enzymatischen Reaktionen ablaufen und das dabei generierte H2O2 mit
der Mikroelektrode detektiert werden kann. Da Maltose als einziges Enzymsubstrat
zur Lösung zugegeben wurde, ist es offensichtlich, dass der gemessene
Oxidationsstrom proportional zur Maltosekonzentration in Lösung ist. Die
Quantifizierung der Substratkonzentration über das Stromsignal der Mikroelektrode
wurde bereits in Kapitel 4.7.3 demonstriert.
Die kommerzielle Erhältlichkeit von Enzymen wie z. B. Galactoseoxidase in
Kombination mit der hier vorgestellten Strukturierungsmethode und dem SECM zur
lokalen Detektion biochemischer Reaktionen öffnet einen neuen Weg zur
Bestimmung von Mono- und Oligosacchariden. Die Bestimmung von Sacchariden
hat große Bedeutung für die Überwachung und Qualitätskontrolle von
Milchprodukten und erfordert kostenintensive bisher chromatographische
Trennmethoden [302-304].
Abbildung 4.7-18 SECM-Bild einer Gitterstruktur aus α-Glucosidase, Mutarotase undGlucoseoxidase in Gegenwart von 0.083 M MaltoseDie drei Glucoseoxidaselinien sind parallel zur y-Achse und die dreiα-Glucosidase/Mutarotase-Linien parallel zur x-Achse orientiert.(∅ Elektrode = 50 µm , E = 0.6 V vs. Ag/AgCl)
5 Zusammenfassung und Ausblick 188
5 Zusammenfassung und Ausblick
Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue Methoden und Strategien für die Entwicklung
von miniaturisierten Biosensor- und Affinitätssensor-Systemen unter Nutzung von
mikroelektrochemischen Detektionsmethoden erarbeitet. Dies gelang unter anderem
durch die Etablierung eines in Mikrotechnologie gefertigten Mikrodispensers zur
Herstellung von Biosensor-Mikrostrukturen und zur Proben- bzw.
Reagenziendosierung in Affinitätsassays.
Ein elektrochemischer Affinitätsassay mit einem neuen Detektionsverfahren, das auf
der Modulation des Diffusionskoeffizienten einer hapten-modifizierten Redoxspezies
beruht, ist entwickelt worden. Die Erniedrigung des Diffusionskoeffizienten einer
hapten-modifizierten Redoxspezies führt nach Anbindung der komplementären
Erkennungsstruktur zu einem verringerten diffusionskontrollierten Strom. Als
Modellsystem für molekulare Erkennung wurde auf das bekannte Biotin-Streptavidin-
System zurückgegriffen. Als geeignete Messelektroden für den Affinitätsassays
haben sich Mikroelektroden erwiesen, mit dem Vorteil, dass durch Redoxrecycling an
einer leitenden Oberfläche eine Verstärkung des Messsignals erzielt werden konnte
(Kapitel 4.1).
Durch die Verwendung von Erkennungselementen mit mehreren Bindungsstellen
gelang die Erweiterung des Verfahrens auf einen Sandwich-Assay, indem freie
Bindungsstellen zur Anbindung eines weiteren affinanten Bindungspartners genutzt
werden konnten (Kapitel 4.1.9). Der vorgestellte Sandwich-Assay zur Bestimmung
biotinilierter Komponenten besitzt potentielle Anwendung für die Bestimmung
Strep-Tag modifizierter Proteine in der Bioanalytik.
Die Miniaturisierung des amplifizierten Affinitätsassays gelang über die Verwendung
von sehr kleinen Tropfen im Mikrolitermaßstab als wandfreie elektrochemische
Messzellen. Für eine potentielle Automatisierung wurde ein neuartiger Aufbau
konzipiert, mit einer motorgetriebenen Spritzenpumpe zur Bildung der Tropfenzelle
und einem Mikrodispenser zum Dosieren von sehr kleinen Mengen an Reagenz oder
Probe in die Tropfenzelle (Kapitel 4.6).
Ein Vorteil des entwickelten Assayverfahrens ist, dass das Format zum einen
homogen ist, was bedeutet, dass während der Messprozedur keine Wasch- und
Separationsschritte nötig sind, und zum anderen nichtkompetitiv ist, so dass der
5 Zusammenfassung und Ausblick 189
Analyt nicht in markierter Form zugegeben werden muss. Das zugrundeliegende
Messprinzip ist allgemein gültig und kann auf nahezu jedes biologische
Erkennungssystem übertragen werden, in dem Erkennungselemente möglichst
unterschiedlicher Strukturgröße, von denen das niedermolekulare mit einer
Redoxmarkierung versehen werden kann, einen Affinitätskomplex eingehen.
Beispiele für derartige molekulare Erkennungssysteme sind z. B. Antigen-Antikörper
oder Oligonucleotid-DNA.
Im Gegensatz zu Interdigitalelektroden, bei denen der Amplifizierungsfaktor fest über
die Elektrodengeometrie vorgegeben ist, kann bei dem hier vorgestellten Verfahren
der Verstärkungsfaktor stufenlos gewählt werden, so dass eine einfache Anpassung
an die individuellen Bedürfnisse jedes analytischen Problems möglich ist. Weiterhin
besitzen in Glas eingeschmolzene Mikroelektroden eine wesentlich höhere
mechanische Stabilität und Lebensdauer als auf Silizium aufgedampfte Metallfilme,
die bei Interdigitalelektroden als Elektrodenmaterial verwendet werden.
Das Assayverfahren konnte zudem miniaturisiert werden, so dass nur geringe
Mengen an Probe und Reagenzien nötig sind. Der dazu vorgestellte miniaturisierte
Aufbau besitzt ein hohes Automatisierungspotential und kann ohne größere
Modifikationen an Standard-Mikrotiterplatten angepasst werden. Das Assayverfahren
kann durch eine Optimierung von Parametern, wie Sensitivität des Potentiostaten,
Amplifizierungsfaktor und Elektronentransfereigenschaften des redoxmarkierten
Haptens, weiter verbessert werden.
Der im miniaturisierten Assay zur Dosierung verwendete in Silizium-Mikrotechnologie
gefertigte Mikrodispenser wurde im Rahmen eines Kooperationsprojektes während
eines Forschungsaufenthaltes am Institut für Elektrische Messtechnik der Universität
Lund (Schweden) selbst hergestellt (Kapitel 4.2) und in weitere
mikroelektrochemische Anwendungen integriert.
Mittels der Deposition der aus dem Mikrodispenser ausgestoßenen Pikolitertropfen
in einer Ölatmosphäre, um eine Verdampfung der Tropfen zu verhindern, und
elektrochemischen Messverfahren mit positionierten, in den Tropfen eintauchenden
Mikroelektroden, gelang es, ein neues Verfahren zur Bestimmung des Volumens der
aus dem Dispenser ausgestoßenen Tropfen zu entwickeln (Kapitel 4.3).
Weiterhin konnte der Mikrodispenser genutzt werden, um die Diffusionskoeffizienten
elektrochemisch aktiver Spezies in „time of flight“-Experimenten zu bestimmen.
5 Zusammenfassung und Ausblick 190
Hierfür konnten zwei neue Verfahren etabliert werden.
Mit dem ersten Verfahren gelang die Abschätzung von Diffusionskoeffizienten in
zeitaufgelösten amperometrischen Experimenten aus der Zeitspanne, die die
Redoxspezies benötigt, um von dem Punkt, an dem sie in die Lösung gebracht
werden, bis zur elektroaktiven Oberfläche der Mikroelektrode zu gelangen, und der
dabei zurückgelegten Strecke (Kapitel 4.4.5).
Durch den Zusatz einer zweiten Redoxspezies (mit bekanntem
Diffusionskoeffizienten) konnte das Verfahren vereinfacht werden und die Zahl der
nötigen Experimente reduziert werden. Die Transitzeiten der beiden Redoxspezies,
die sich in ihrem Formalpotential unterscheiden müssen, werden sequentiell in zwei
analogen amperometrischen Experimenten mit identischen Parametern, aber bei
verschiedenen Potentialen erfasst. Über den Quotienten der Transitzeiten kann der
unbekannte Diffusionskoeffizient bestimmt werden (Kapitel 4.4.6). Die so ermittelten
Diffusionskoeffizienten konnten mit einer in der Literatur beschriebenen
Standardmethode verifiziert werden (Kapitel 4.4.7).
Eine weitere Vereinfachung des Verfahrens konnte durch die Verwendung schneller
cyclischer Voltammetrie in Kombination mit einer neu entwickelten Datenaufnahme-
und Auswertungs-Software erreicht werden, die es ermöglicht, die Transitzeiten
beider Redoxspezies in nur einem Experiment zu ermitteln (Kapitel 4.5.1).
Das vorgestellte Verfahren zur Bestimmung von Diffusionskoeffizienten ist
unabhängig von experimentellen Parametern wie Konzentration der Redoxspezies,
Größe der aktiven Elektrodenoberfläche und Zahl der ausgetauschten Elektronen, so
dass aufwendige Vorversuche zur Bestimmung dieser Parameter entfallen. Dadurch
ist das Verfahren auch für die Bestimmung des Diffusionskoeffizienten von
Substanzen geeignet, die hygroskopisch sind und deren genaue Konzentrations-
bestimmung nur schwer möglich ist, oder die zu Adsorption auf der
Elektrodenoberfläche neigen. Im Gegensatz zu vielen anderen elektrochemischen
Verfahren, die zur Bestimmung des Diffusionskoeffizienten eine hohe Reversibilität
des heterogenen Elektronentransfers voraussetzen, ist dies bei der hier
beschriebenen Methode nicht zwingend notwendig, so dass auch
Diffusionskoeffizienten von redoxaktiven Molekülen, die einen quasireversiblen oder
irreversiblen heterogenen Elektronentransfer zeigen, bestimmt werden können.
5 Zusammenfassung und Ausblick 191
Mit Hilfe der neu entwickelten Software für schnelle cyclische Voltammetrie und
positionierten Mikroelektroden wurde ein neues Verfahren zur Untersuchung des
Ausblutungsverhaltens von Carbonpastenelektroden entwickelt (Kapitel 4.5.2). Durch
die Zeit-, Strom- und Potentialauflösung des Verfahrens konnte gezeigt werden,
dass das Ausbluten des Redoxmediators aus Carbonpastenelektroden auf der Basis
von Zirkoniumphosphat einen bei niedrigen pH-Wert stattfindenden reversiblen
Prozess darstellt. Die Ergebnisse machen deutlich, dass bei NADH-Messungen mit
diesen Elektroden im saurem Milieu ein Kontaminierung der Probe mit dem in der
Carbonpaste inkorporierten Redoxmediator stattfindet. Das vorgestellte Verfahren
ermöglicht das Kontaminierungsverhalten von Biosensoren mit inkorporierten
Redoxmediatoren bei unterschiedlichen physiologischen Bedingungen zu
untersuchen, was vor allem bei potentiellen in-vivo-Sensoren von Bedeutung ist.
Mittels des Mikrodispensers wurde ein einfache Methode zur Mikrostrukturierung von
beliebigen Oberflächen mit biologischen Erkennungselementen entwickelt (Kapitel
4.7). Die Universalität des Verfahrens konnte durch die erfolgreiche Verwendung von
vier verschiedenen Immobilisierungstechniken gezeigt werden. Die Aktivität
immobilisierter Enzyme konnte mit hoher lokale Auflösung mittels Elektrochemischer
Rastermikroskopie detektiert werden. Weiterhin gelingt die quantitative Bestimmung
von biologischen Substraten mit Enzym-Mikrostrukturen und positionierten
Mikroelektroden (Kapitel 4.7.3), was beispielhaft für immobilisierte Glucoseoxidase
gezeigt wurde. Durch die Immobilisierung verschiedener Enzyme in dicht
nebeneinander angeordneten Strukturen gelangt man zu Multisensor-Strukturen, die
mit dem SECM in nur einem Linienscan ausgelesen werden können und so
interferenzfrei die simultane Bestimmung mehrerer Enzymsubstrate ermöglichen
(Kapitel 4.7.4). Zwei der verwendeten Immobilisierungstechniken gestatten den
Aufbau von Multischicht-Sensorstrukturen. Diese können genutzt werden, um sowohl
die Interaktion verschiedener in mehreren Schichten übereinander immobilisierter
Enzyme zu untersuchen, als auch durch gekoppelte Reaktionen interagierender
Enzyme biologische Substrate zu bestimmen, in deren enzymatischer Reaktion kein
elektrochemisch aktives Produkt gebildet wird (Kapitel 4.7.5). Die Interaktion zweier
Enzyme wurde dabei am Beispiel von Glucoseoxidase und Catalase aufgezeigt,
während die Bestimmung von biologischen Substraten mit Multienzym-
Schichtstrukturen für Maltose über die enzymatische Kopplung von α-Glucosidase,
5 Zusammenfassung und Ausblick 192
Mutarotase und Glucoseoxidase demonstriert wurde.
Durch eine Modifizierung der Platinmikroelektrode mit Redoxmediatoren wie z. B.
Phenothiazin oder Phenoxazin sollte eine Adaption dieses Verfahrens an
NAD+/NADH-abhängige Enzyme möglich sein, wodurch die Zahl der bestimmbaren
Enzymsubstrate beträchtlich erhöht werden kann (vgl. Kapitel 2.2.2).
Durch die neu entwickelte Mikrostrukturierungsmethode wurde die Grundlage für
eine Fülle von weiteren Anwendungsmöglichkeiten gelegt. So ist es denkbar, mit
dem Mikrodispenser, der im Durchflussmodus betrieben wird, einzelne Spots von
biologischen affinanten Erkennungselementen aufzubringen. Durch das geringe
Volumen des Mikrodispensers ist dazu nur eine sehr geringe Menge an Substanz
nötig, so dass sich z. B. die Herstellung von DNA-Strukturen im finanziell
vertretbaren Rahmen bewegt. Limitierungen und Probleme, wie sie sich durch
modifizierte Tintenstrahl-Druckköpfe, die nur eine eng begrenzte Zahl an Reservoirs
besitzen, so dass nur eine limitierte Zahl an verschiedenen Erkennungselementen
auf eine Oberfläche aufgebracht werden können, entfallen.
Durch das definierte Aufbringen von vielen Spots unterschiedlicher
Erkennungselemente auf einem Substrat erhält man einen Multianalyt-Chip, der in
der Lage sein sollte, mehrere Analyte simultan zu bestimmen. Hierbei ist eine
Detektion eines erfolgten Bindungsereignisses z. B. über die Detektion einer
Redoxmarkierung mit mikroelektrochemischen Methoden denkbar.
6 Experimenteller Teil 193
6 Experimenteller Teil
6.1 Methoden
6.1.1 Elektrochemische Messungen
Elektrochemische Messungen werden, soweit nicht anders angegeben, in einer
3-Elektrodenanordnung durchgeführt. Bei der Durchführung des elektrochemischen
Affinitätsassays und der SECM-Messungen an Enzym-Mikrostrukturen diente 0.1 M
Phosphatpuffer (pH 7) als Leitelektrolyt; bei den Experimenten zur Bestimmung von
Diffusionskoeffizienten und des Volumens der vom Mikrodispenser geschossenen
Tropfen wurde 0.1 M KCl als Leitsalz verwendet.
6.1.2 Herstellung von Mikroelektroden
Die im SECM und im Affinitätsassay zur Anwendung kommenden Mikroelektroden
bestehen aus einer Kapillare aus Borosilikatglas (Durchmesser 1.5 mm), in deren
unterem Ende ein Platindraht (Durchmesser 50 µm, 25 µm oder 10 µm
eingeschmolzen ist. Nach dem Einschmelzen des Platindrahtes wird das untere
Ende der Kapillare solange abgeschliffen bis der Platindraht freigelegt ist.
Anschließend wird das untere Ende konisch zugeschliffen, so dass das
Radienverhältnis von Platin zu Glas der entstehenden Kreisfläche bei etwa 1 : 10
liegt. Der Platindraht wird im Inneren der Glaskapillare über einen leitenden Epoxy-
Kleber mit einem Kupferdraht kontaktiert, über den der Anschluss an den
Potentiostaten erfolgt. Detaillierte Angaben zur Herstellung der Mikroelektroden
finden sich in [187,203].
6 Experimenteller Teil 194
6.1.3 Reinigung der Mikroelektroden
Vor Gebrauch werden die Mikroelektroden mit Polierpasten abnehmender
Partikelgröße (3 µm, 1 µm und 0.3 µm) poliert und anschließend mit Wasser intensiv
abgespült. Nachfolgend werden die Mikroelektroden 10 Minuten im Ultraschallbad
gereinigt.
6.1.4 Herstellung von Pseudo-Referenzelektroden
Die Herstellung bzw. Regeneration von Pseudo-Referenzelektroden erfolgt nach
einem Standardverfahren. Der Silberdraht wird in einer 3-Elektrodenanordnung als
Arbeitselektrode geschaltet. In 1 M HCl durchläuft man 3 Potentialzyklen von -0.2 V
bis 1.2 V vs. Ag/AgCl. Auf dem Silberdraht bildet sich dabei eine braun-graue AgCl-
Schicht. Anschließend wird 300 s bei 0.3 V vs. Ag/AgCl elektrolysiert.
6.1.5 Goldbedampfung von Siliziumwafern
Die Bedampfung der Siliziumwafer mit Gold erfolgte am Lehrstuhl für Physikalische
Chemie der Ruhr-Universität Bochum. Eine Hochvakuum-Bedampfungsanlage
wurde benutzt, um die Wafer mit einer Titanschicht (50 Å) als Haftvermittler und
nachfolgend mit einer Goldschicht (1000 Å) zu bedampfen. Mit einem Skalpell
werden die Wafer in Stücke von 0.5 cm x 0.5 cm geschnitten und unter Inertgas-
atmosphäre aufbewahrt.
6.1.6 Modifizierung von Goldoberflächen mit selbstorganisierenden Mono-schichten
Cystamin-modifizierte Goldoberflächen werden durch zweistündiges Eintauchen der
Goldsubstrate bei Raumtemperatur in eine 10 mM wässrige Lösung von Cystamin
erhalten. Anschließend werden die Goldsubstrate intensiv mit Wasser gespült und im
Argonstrom getrocknet.
Zur Modifizierung von Goldoberflächen mit Aktivester-Gruppen werden diese für 1.5
6 Experimenteller Teil 195
Stunden bei Raumtemperatur in eine 10 mM Lösung von 3-3’-Dithiodipropionsäure-
di(N-succinimidylester) in getrocknetem DMSO getaucht. Nach Spülen mit DMSO
und wenig Wasser, um Hydrolyse der Aktivester-Gruppen zu vermeiden, werden die
Goldsubstrate im Argonstrom getrocknet.
6.1.7 Immobilisierung von Enzymen auf Oberflächen
Die Konzentration der wässrigen Enzymlösungen, mit denen der Dispenser befüllt
wird, beträgt im Allgemeinen 1 mg/mL.
Bei mit Aktivester-Gruppen modifizierte Goldoberflächen wird nur die reine
Enzymlösung geschossen.
Für die Aktivierung der Säuregruppen des Enzyms im Falle cystamin-modifizierter
Goldoberflächen wird der Enzymlösung 2 mg/mL EDAC zur Aktivierung der
Säuregruppen des Enzyms zugesetzt.
Für die Herstellung von quervernetzten Enzymstrukturen wird die Enzymlösung mit
2.5 mg/mL PEGDGE versetzt.
Für den Einschluss der Enzyme in eine Polymermatrix wird der Enzymlösung
5 mg/mL Vinnapas EP 16 zugesetzt.
Die Reaktionszeit beträgt bei allen Immobilisierungsmethoden mindestens 2
Stunden, lediglich beim Einschluss der Enzyme in Vinnapas EP 16 sollte die
Trocknungszeit mindestens 12 Stunden lang sein.
Anschließend werden die Oberflächen intensiv mit Pufferlösung hoher Ionenstärke
gespült, um nicht gebundene und adsorbierte Enzyme abzuwaschen.
6 Experimenteller Teil 196
6.2 Synthesen
6.2.1 Synthese des ferrocenmarkierten Biotinderivats (Fc-Biotin)
Ein wasserlösliches ferrocenmarkiertes Biotinderivat (Fc-Biotin, zur Struktur siehe
Abbildung 4.1-1) wurde in einer 2-Schritt-Synthese dargestellt.
Im ersten Schritt wird ein Alkylamin-Ferrocenderivat (Fc-CH2-NH-C2H4-O-C2H4-O-
C2H4-NH2) synthetisiert [305], welches im zweiten Schritt mit N-hydroxysuccinimido-
Biotin (NHS-Biotin) umgesetzt wird (vgl. Reaktionsschema in Abbildung 4.1-4).
Das Alkylamin-Ferrocenderivat wird durch die Umsetzung von 2,2’(-Ethylen-
dioxy)diethlyamin mit Ferrocencarbaldehyd (Fc-CHO) erhalten.
500 mg (2.34 mmol) Fc-CHO werden in 25 mL DMF und 1.36 mL (9.35 mmol)
2,2’(-Ethylendioxy)diethlyamin werden in 50 mL DMF gelöst.
In einer Dreihalskolben-Rührapparatur wird das (Ethylendioxy)diethlyamin vorgelegt
und auf 100 °C erhitzt. Über einen Zeitraum von einer Stunde wird das Fc-CHO
langsam zugetropft, um die Bildung von verbrückten Di-Ferrocenderivaten zu
vermeiden. Die Reaktionslösung wird für weitere 4 Stunden bei 100 °C gehalten und
dann auf Raumtemperatur abgekühlt. 0.2 g NaBH4 werden in 20 mL Wasser
aufgelöst und langsam zur Reaktionslösung zugegeben. Die Lösung wird über Nacht
bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird bis zur Trockene abrotiert und der
Rückstand in CHCl3 aufgenommen und über einen Faltenfilter abfiltriert. Es werden
Dünnschichtchromatogramme in CHCl3 und CHCl3/CH3OH (1:10) gemacht. Das
Filtrat wird am Rotationsverdampfer eingeengt und anschließend über eine
Kieselgelsäule mit CHCl3 als Laufmittel getrennt. Es werden verschiedene
Fraktionen gesammelt, von denen Dünnschichtchromatogramme in CHCl3 und
CHCl3/CH3OH (1:10) gemacht werden. Die zweite orangefarbige Fraktion stellt das
Produkt dar. Die Produktfraktionen werden vereinigt und bis zur Trockene abrotiert.
Der Rückstand wird in Diethylether aufgenommen, zum vollständigen Lösen wird
unter kräftigem Rühren tropfenweise CHCl3 zugegeben. Diese Lösung wird in einem
Rundkolben mit Gaseinleitungsrohr und Magnetrührer vorgelegt. Durch langsames
Zutropfen konzentrierter Schwefelsäure auf festes Natriumchlorid erzeugter
Chlorwasserstoff wird etwa 30 Minuten lang unter langsamen Rühren in die Vorlage
eingeleitet. Es fällt ein gelb-oranger Niederschlag aus. Die Reaktionslösung wird
noch eine Stunde gerührt. Der Diethylether wird abrotiert, der Niederschlag wird in
6 Experimenteller Teil 197
Wasser aufgenommen und abfiltriert. Das Wasser wird ebenfalls abrotiert und die
Substanz wird in einer Vakuumapparatur getrocknet.
Im zweiten Reaktionsschritt werden 0.5 mg (1.5 µmol) NHS-Biotin mit einem
zweifachen Überschuss des Alkylamin-Ferrocen in 0.1 M Phosphatpuffer (pH 7) für 2
Stunden bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Das Endprodukt Fc-Biotin wird
durch eine kommerziell erhältliche monomere Avidin-Säule von nicht-biotiniliertem
Alkylamin-Ferrocen getrennt. Diese Affinitätstrennung erlaubt die Verwendung von
nicht intensiv aufgereinigten intermediären Reagenzien, da nur Fc-Biotin und
eventuell nicht umgesetztes NHS-Biotin an das monomere Avidin der Affinitätssäule
gebunden werden. Das Endprodukt wird mittels cyclischer Voltammetrie
charakterisiert.
6.2.2 Synthese biotinilierter Glucoseoxidase
0.3 mg (0.9 µmol) NHS-Biotin werden mit einem fünffachen Überschuss (berechnet
auf der Basis von 42 Lysinresten pro Enzymmolekül) an Glucoseoxidase (20 mg) in
0.1 M Phosphatpuffer für 2 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Durch eine
monomere Avidinsäule wird die biotinilierte Glucoseoxidase von nicht-biotinilierterter
Glucoseoxidase getrennt.
6 Experimenteller Teil 198
6.3 Chemikalien
Die Reinheit aller verwendeten Substanzen war p.a. oder von höchstem erhältlichem
Standard. Verwendetes Wasser wurde dreifach destilliert.
Alle gängigen Laborchemikalien und Lösungsmittel, wie Chloroform, Methanol,
Diethylether, DMF oder DMSO, sowie Säuren und Basen wurden wahlweise von den
Firmen Merck, Fluka, oder Riedel de Haen bezogen.
6.3.1 Chemikalien
1-Ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimid Sigma, Taufkirchen, D
2,2’(-Ethylendioxy)diethylamin Fluka, Neu-Ulm, D
3-3’-Dithiodipropionsäure-di(N-succinimidylester) Fluka, Buchs, CH
Cystamindihydrochlorid Acros, Geel, B
D-Glucose Merck, Darmstadt, D
D-Maltose Biomol, Hamburg, D
Ferrocencarbaldehyd Sigma, Taufkirchen, D
Ferrocencarbonsäure Strem, Newburyport, USA
Kaliumdihydrogenphosphat Riedel de Haen, Seelze, D
Kaliumhexacyanoferrat(II)-trihydrat Merck, Darmstadt, D
Kaliumhexacyanoferrat(III) Merck, Darmstadt, D
Methylengrün Fluka, Neu-Ulm, D
Natriumborhydrid Mallinckrodt Baker, Deventer, NL
Natrium-L-Lactat Fluka, Neu-Ulm, D
N-hydroxysuccinimido-Biotin Pierce, St. Augustin, D
Paraffinöl Fluka, Neu-Ulm, D
Poly(ethylenglycol)-(400)-diglycidylether Polysciences, Warrington, USA
Polypropylenimin-octaamin-Dendrimer Aldrich, Taufkirchen, D
Riboflavin Sigma, Taufkirchen, D
Ruthenium(III)hexamintrichlorid Strem, Newburyport, USA
Tetrabutylammonium-hexafluorophosphat Fluka, Neu-Ulm, D
Tris-(hydroxymethyl)aminomethan Biomol, Hamburg, D
Vinnapas EP 16 Wacker, Burghausen, D
Zirkonium(IV)hydrogenphosphat Aldrich, Taufkirchen, D
6 Experimenteller Teil 199
6.3.2 Enzyme und Proteine
α-Glucosidase(EC 3.2.1.20 aus Hefen, 67 U mg-1)
Serva, Heidelberg, D
Catalase(EC 1.11.1.6. aus Rinderleber, 2100 U mg-1
fest)
Sigma, Taufkirchen, D
Glucoseoxidase(EC 1.1.3.4. von Aspergillus Niger, Typ X-S,100000-250000 U mg-1)
Sigma, Taufkirchen, D
Lactatoxidase(aus Pediococcus Spezies, 36 U mg-1)
Sigma, Taufkirchen, D
Mutarotase(EC 5.1.3.3. aus Schweineniere, 4400 U mg-1
Protein)
Sigma, Taufkirchen, D
Streptavidin Institut für Bioanalytik, Göttingen, D
6 Experimenteller Teil 200
6.4 Materialien und Geräte
6.4.1 Materialien
Aluminiumoxid-Polierpasten Leco GmbH, Kirchheim, D(Partikeldurchmesser 1 µm und 0.3 µm)
Diamantsuspension-Polierpaste Leco GmbH, Kirchheim, D(Partikeldurchmesser 3 µm)
Polierfilz Leco GmbH, Kirchheim, D
Platindraht Goodfellow, Cambridge, UK(∅ 1 mm, 10 µm, 25 µm, 50 µm)
Silberdraht Goodfellow, Cambridge, UK(∅ 1 mm)
Glasobjektträger (76 x 26 mm) Menzel, Braunschweig, D
Goldelektroden CH-Instruments, Austin, USA(∅ 3 mm)
Borosilikatglaskapillaren Hilgenberg GmbH, Malsfeld, D
Teflonschläuche Kronlab, Mannheim, D(innerer Durchmesser 0.75 mm)
Softlink Avidin Resin (monomere Avidin-Säule) Promega, Mannheim, D
Zweikomponenten-Silberepoxykleber Polytek, Waldbronn, Depo-tek H-20E
einschraubbare Ag/AgCl-Referenzelektrode, Biometra GmbH, Göttingen, Dgefüllt mit 3 M KCl
6 Experimenteller Teil 201
6.4.2 Geräte
Funktionsgenerator Hewlett-Packard 33120 A Agilent, Böblingen, D
Hochvakuum-Bedampfungsanlage Univex 300 Leybold, Köln, D
Spritzenpumpe Microlab OEM 3 Hamilton, Bonaduz, CH
Netzgerät PS2403D Conrad Hirschau, D
Verschiebetische MT 75 25 mm Owis, Staufen, D(für z-Richtung mit 200 µm Piezoverstellung)
Spannungsverstärker PS 500 Owis, Staufen, D
AD/DA-Karte PCI-DAS 1602 Plug-In, Eichenau, D
Videomikroskop SPI GmbH, Oppenheim, D
Potentiostat HEKA PG 310 HEKA GmbH, Lambrecht, D
Potentiostat EG&G PAR 263A EG&G, Bad Wildbad, D
Potentiostat Petit Ampere LC-3C Bioanalytical Systems, WestLafayette, USA
6.4.3 Software
WINDOWS 98 Microsoft, Unterschleißheim, D
Hewlett-Packard HP VEE 5.0 Plug-In, Eichenau, D
Universal Library Plug-In, Eichenau, D
IDL 4.0 Research Systems Inc., Boulder, USA
Die Auswertung und Darstellung der Messdaten erfolgte mit Hilfe von EXCEL
(Microsoft, Unterschleißheim, D) und ORIGIN 4.1 (Microcal Software, Northampton,
USA). Die IDL-Unterprogramme für die dreidimensionale Darstellung der Messdaten
wurden freundlicherweise von Dr. Gunther Wittstock zur Verfügung gestellt.
7 Literatur 202
7 Literatur
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Lebenslauf
Name Marcus MosbachGeburtsdatum 20. Februar 1973Geburtsort HerneFamilienstand ledig
Schule1979 - 1983 Grundschule Pantrings Hof in Herne1983 - 1992 Pestalozzi-Gymnasium in HerneMai 1992 Abitur
ZivildienstJuni 1992 - August 1993 Zivildienst bei der Arbeiterwohlfahrt in Herne
UniversitätOktober 1993 - Mai 1998 Studium der Chemie an der Ruhr-Universität BochumDezember 1997 - Mai 1998 Diplomarbeit am Lehrstuhl für Analytische Chemie in
der Arbeitsgruppe Elektroanalytik und Sensorik(Prof. Dr. W. Schuhmann) mit dem Titel„Untersuchung der Permeabilität von biologischenStrukturen mittels Elektrochemischer Rastersonden-mikroskopie (SECM)“
Juli 1998 - Februar 2001 Promotion am Lehrstuhl für Analytische Chemie in derArbeitsgruppe Elektroanalytik und Sensorik(Prof. Dr. W. Schuhmann) über „Mikro-elektrochemische Methoden in der Biosensorik undElektroanalytik“ gefördert durch ein Stipendium derGraduiertenförderung des Landes Nordrhein-Westfalen
ForschungsaufenthalteSeptember 2000 Forschungsaufenthalt am Institut für Elektrische
Messtechnik, Universität Lund, Schweden (Prof. Dr. T.Laurell): Herstellung von Mikrodispensern inMikrotechnologie
Oktober 1999 Forschungsaufenthalt am Institut für ElektrischeMesstechnik (Prof. Dr. T. Laurell) und Institut fürBiotechnologie (Dr. Elisabeth Csöregi), UniversitätLund, Schweden): Bestimmung der Diffusions-koeffizienten von Redoxmolekülen in „time of flight“-Experimenten
April 1999 Forschungsaufenthalt am Institut für ElektrischeMesstechnik (Prof. Dr. T. Laurell) und Institut fürBiotechnologie (Dr. Elisabeth Csöregi), UniversitätLund, Schweden): Adaption von Mikrodispenser anelektrochemische Anwendungen