Méthode d ’étude de la cellule normale et pathologique : Mise en culture des cellules et tissus
Master M1: cellule normale à cellule cancéreuse
Dr Mossuz P
27/01/06
I : les tissus
Ensemble de cellules de types et d ’origine embryonnaire différente
Associés en général à une matrice extra cellulaire (glycoprotéine, protéoglycane, fibronectine..)
Origine
prélèvements biopsiques, fragment de tissus
Contraintes
Les tissus pure sont rares; nombreux tissus accessoires (tissus conjonctifs, vaisseaux sanguins, tissu nerveux..)
2 types de cultures possibles
- culture direct du fragment= culture primaire
-fragmentation de la pièce biopsique = dissociation des tissus pour récupérer la fraction cellulaire d ’intérêt
1) mécanique
scalpel, broyeur , filtration , sonication
2) chimique
solution sans calcium, chelateurs de calcium, de Mg… (cations divalents)
3) enzymatique
digestion par la trypsine, la collagénase, hyaluronidase
Rmq :
* Très grande diversité des tissus = très grande diversité des protocoles
le plus souvent mélange de 2 ou 3 étapes
* Le mieux est l ’ennemi du bien : les cellules sont fragiles!!
Dissociation des tissus
Culture de kératinocytes
Prélèvement cutanée
Fragmentation au scalpel
Dissociation cellulaire (x4/5)
mécanique
trypsine
EDTA
Surnageant + cellules en suspension
Culture sur sous couche après numération
Application : recherche,
thérapeutique
II : les cellules
1) Les cellules circulantes / en suspension
Origine
le sang périphérique,
la moelle osseuse ,
les liquides physiologiques (liquides pleuraux,... )
le sang de cordon
Intérêts
source relativement pure (peu de types cellulaires mélangés)
facilité d ’accès
matériel riche
mise en culture directe
Purification cellulaire
Pour obtenir une culture pure (un seul type cellulaire) nécessité de séparer les différents types cellulaires
* Cellules en suspensions
Sang périphérique : cellules granuleuses, lymphocytes , monocytes
Moelle osseuse : progéniteurs érythroïdes, mégacaryocytaire, granuleux
Liquide biologique : cellules épithéliale, cellules différenciées , cellules tumorales
* Tissus
en culture primaire à partir de la suspension cellulaire obtenue par dissociation du tissus
formation d ’une couche adhérente contenant les différents type cellulaire présents dans le
tissus
1) méthode physique :
séparation basée sur les différences de densité des cellules
centrifugation différentielle en gradient de densité
ultracentrifugation
electrophorèse
cytométrie de flux
2) avantage prolifératif, métabolique
croissance en milieu sans facteur de croissance
milieu sans sérum
3) tri par adhérence
ex monocyte/macrophage
Méthode de purification
4) Tri immunologique
séparation à l ’aide de marqueurs protéiques (antigènes) de surface spécifique
d ’un type cellulaire
ex : glycoprotéine érythrocytaire
marqueurs tumoraux
marqueurs de lignée
marqueur épithélial : kératine
marqueur leucocytaire : CD45
cytométrie de flux
FACS sorter
billes immuno-
magnétiques
Tri sur boite
« imuno capping »
Tri par cytométrie de flux
Principe :
Séparation des cellules à l ’aide d’un cytomètre de flux
-analyse des cellules en suspension
-caractérisation par la taille (FSC) et le contenu (SSC)
-analyse de l ’expression d ’antigène de surface
Séparation des cellules en les isolant dans une goutte, par
fractionnement du flux d'eau physiologique qui les contient au travers d'une
buse(0.05mm).
Analyse des caractéristiques de chaque cellule sur différents critères
(taille, diffraction, la densité de granulation évaluée par absorbance, la
présence ou non d'antigènes sur la surface cellulaire).
Tri des cellules dans des gouttes plus ou moins chargées, selon que la
cellule corresponde aux critères fixés par l'opérateur. Leur trajectoire sera
plus ou moins déviée en passant entre 2 électrodes qui ménagent un
champs électrique.
Récupération de la fraction d ’intérêt
laserélectrodes
Cellules chargéesCellules non chargées
Suspension cellulaire
Tri par billes immuno-magnétiques
Purification de cellules souches hématopoïétiques CD34+/HLA DR-
CD34 = glycoprotéine membranaire spécifique des cellules souches hématopoïétiques, absentes des cellules du sang périphérique
HLA DR = antigène d ’histocompatibilité de classe II absent des CSH
Principe : tri en 2 étapes, purification des cellules CD34+ puis
déplétion des cellules DR+
Moelle humaine normale
Fraction CD34+/DR-
Ac AntiCD34
Fraction CD34+/ DR+
Ac Anti DR
1)
2)
2) Les Lignées cellulaires immortalisées
Rmq : les cellules normales en culture primaire ont un potentiel limité de prolifération in vitro, même en présence de facteur de croissance (50 à 60 temps de doublement maxi)
mortalité par senéscence, raccourcissement des télomères
le potentiel prolifératif est inversement proportionnel au degré de différenciation
Une lignée cellulaire immortalisée peut être définie par la capacité de plus de 150-200 tps de doublement, ou la possibilité de cultiver les cellules plus d ’un an, sans interruption
Principe : expression par transfection cellulaire d ’une protéine virale
Immortalisation de cellules normales (non cancéreuses) par infection virale
* Expression d ’un oncogène
- Expression stable d ’un oncogène virale responsable de la transformation des cellules
Ex C-Myc oncogène codant pour un facteur de transcription régulant la prolifération et la mort cellulaire / rôle ++ dans la lymphomagénèse
* Sur-expression d ’un récepteur de facteur de croissance
Ex : Rcp GM-CSF
* Sur-expression d ’une protéine kinase régulant la prolifération cellulaire
Ex : p210 protéine dérégulée dans la LMC
Immortalisation de cellules normales (non cancéreuses) par transfection
Sélection antibiotique
Principe : expression d ’un gène de résistance à un ATB (ex néomycine) permettant de sélectionner les cellules transfectées (obtention de lignée clonale stable)
A) Sans sélection
B )Avec sélection, population non transfectée
C-D) Avec sélection, population transfectée
Ex : lignées cellulaires dérivées de patients présentant une hémopathie/tumeurs solides...
Lignée Hela : carcinome cervical
Raji = lymphome de Burkitt
HL60 = LAM3
Lignée établie spontanément en culture par sélection de clone prolifératif
Possibilité de sélection par passage sur la souris
A partir de cellules tumorales
Un cas particulier : les cellules souches
*Les cellules souches embryonnaires de souris
obtenue à partie de blastocytes de souris
établissement de lignées cultivées en présence de facteur de croissance (LIF)
différenciation orientée par des facteurs de croissance
intérêt : étude des mécanismes moléculaires de la différenciation cellulaire (oncogénèse et ontogénèse)
souris KO
*Les cellules souches humaines
-les cellules souches dérivés d ’embryon au stade très précoce (ES)
*les cellules germinatives dérivées de fœtus avortés
cellules de la lignée germinales (ovule et spermatozoide) = embryonnic germ cells (EG)
*Les cellules souches adultes
III Méthodes de culture
1) Les milieux de cultureDoivent répondre aux exigences minimum des cellules animales
H2o
ions minéraux( nacl, Kcl, mgcl2….)
osmolarité = 9g/1000
source de carbone et d ’énergie (glucose)
source d ’azote (acides aminées)
facteurs de croissance : acides aminées éssentiels, vitamines, acide gras, cytokines
Gaz O2 et CO2
système tampon , Ph stable 7.4 (indicateur de pH)
RPMi, HBS DMEM, MEM…….+ sérum (SVF) + ATB
La température (37°c)
l ’hygrométrie (contrôle de l ’évaporation) 90% d ’humidité
le pH
CO2…
la densité cellulaire
le pourcentage de sérum
la dépendance en facteur de croissance (ex lignée IL3 dépendante)
2) Paramètres régulant la prolifération cellulaire
1 contrainte majeure : la stérilité microbienne
protection des cellules et des manipulateurs
Cinétique de la croissance cellulaire
1er phase = phase de latence
pas de division cellulaire
dépend du type cellulaire, du milieu de culture, de la densité cellulaire
2eme phase = phase exponentielle
Phase de division cellulaire
temps de doublement selon le type cellulaire (4h à 48h)
3eme phase = phase stationnaire
épuisement du milieu = arrêt de la prolifération
4ém phase = poursuite de la croissance cellulaire (repiquage)
ou mort cellulaire
Cinétique de la croissance cellulaireN
om
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cell
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Temps (jours)
Pha
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tes)
Phase exponentielle Phase stationnaire
Mort cellulaire
Temps de doublement
Pendant la phase exponentielle les cellules sont distribuées de façon hétérogène dans les différentes parties du cycle cellulaire.
La culture cellulaire est donc un ensemble hétérogène de cellules
caractérisées par des propriétés métaboliques différentes
Il est possible de synchroniser les cellules
privation en facteur de croissance = mise en G0
séparation cellulaire par gradient de Ficoll
ultra centrifugation
méthode chimique
drogue bloquant la phase S (hydrea)
déplétion calcique
Croissance cellulaire
les cellules adhérentes : la confluence
Confluence = occupation de toute la surface de la boite de culture par les cellules
s ’accompagne en général d ’un arrêt de la prolifération par inhibition de contact
Cas particulier des cellules transformées (virus, oncogènes..)
perte de l ’inhibition de contact
culture non régulée
témoin de transformation
* en suspension (cellules non adhérentes)
* en couche mono cellulaire (cellules adhérentes)
* sur sous couche nutritive (feeder)
culture sur un support cellulaire (fibroblaste ++, cellule endothéliale , adipocytes )
Ex lignée stromale murine produisant de l ’IL3
* cultures en milieu semi solide / cultures clonogéniques
utilisation de collagène, méthyl cellulose, agar dans lesquels sont implantées les cellules
permet la formation de colonies clonale (dérivée d ’une seule cellule)
III Différents types de culture
Cultures clonogéniques de progéniteurs hématopoïétiques
Principe :
Identification rétrospective des progéniteurs différenciés par leur capacité à produire des colonies (CFU) dans un milieu
de culture semi-solide.
Les colonies résultent de la prolifération clonale d’un
progéniteur en présence de facteurs de croissances hématopoïétiques
Systèmes de culture permettant d’identifier et de quantifier les progéniteurs hématopoïétiques différenciés (différenciation myéloïdes)
Lignée érythroïdes BFU-ELignée érythroïdes BFU-E
Lignée granulo-macrophagique CFU-GMLignée granulo-macrophagique CFU-GM
Lignée mégacaryocytaire CFU-MKLignée mégacaryocytaire CFU-MK
Microscope-inversé MGGMGG APAAP-CD41APAAP-CD41
Une suspension cellulaire (même purifiée) est le plus souvent oligoclonale
plusieurs types cellulaires possibles
hétérogénéité d ’une population tumorale
intérêt du clonage
Principe : isoler par dilution limite des populations monoclonale
les cellules sont cultivées dans des petits volume en dilution au 1/10, 1/100, 1/1000; jusqu ’à obtenir une implantation théorique de une cellule par puit qui donnera une population monoclonale vraie ( cellules totalement identique, phénotypiquement, cytogénétiquement, morphologiquement..)
Clonage cellulaire
Population oligoclonale A+ B
oligoclonale Clone A - Clone A Clone B -