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Mesure des niveaux d'expression des gènes chez les bactéries par la technique des biopuces
Analyse du transcriptome de la bactérie Buchnera aphidicola en condition de stress trophique de son hôte, le puceron Acyrthosiphon pisum
Laboratoire BF2I, UMR INRA/INSA de Lyon 203
Bât. Louis Pasteur, 69 621 Villeurbanne, France.BSMC, Biologie Cellulaire et Modélisation Cellulaire
DTAMB Université Claude Bernard Lyon 1
Hubert Charles & Fédérica Calevro
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22/6/05 2
Inférer (ou valider) un modèle de réseau de régulation… à partir de données d’expressions de puces à ADN
Temps (min)
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22/6/05 3
HYBRIDATION
LECTURE DE L’EMPREINTE
DEPOT DES SONDES
EXTRACTION DES DONNEES ET ANALYSE
0,4413 0,5254 0,1527 0,4413 0,5254 0,15270,7584 0,1477 0,1965 0,7584 0,1477 0,19650,1358 0,1899 0,1236 0,1358 0,1899 0,12360,4413 0,5254 0,1527 0,4413 0,5254 0,15270,7584 0,1477 0,1965 0,7584 0,1477 0,19650,1358 0,1899 0,1236 0,1358 0,1899 0,1236
Extraction des ARNm
Marquage des cibles
A
B
D
C
Robot de dépôt
Matériel biologique
Cy5
Cy3
(1)
(2)
Choix des sondes
Interprétation des résultats
85,6
13,1
1,3
Scanner
Choix du plan de dépôt
Introduction : la technique des puces à ADN
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22/6/05 4
De l’image de la puce… aux résultats interprétés1. Nature des données d’expression
2. Problématique biologique
3. Mesure des données d’expression31. Acquisition de l’image32. Acquisition des données issues de l’image 33. Filtration des données34. Analyse qualité35. Normalisation36. Gestion des données de puces
4. Plans expérimentaux41. Plan de la puce42. Analyses comparatives (statiques)43. Analyses dynamiques
5. Conclusions
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22/6/05 5
1. Nature des données d’expression Grands volumes de données (pb logiciel, pb algorithmique) Dissymétrie du tableau de données (gènes x conditions) Les données sont relatives (pas de niveau 0, pas de mesure
absolue) Distribution non-normale des données
-> Transformation log2
Non-indépendance des données Des connaissances associées très hétérogènes (annotation par
exemple)
121314151617181920212223240100000060000001100000016000000
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22/6/05 6
2. Problématique biologique : la symbiose chez le puceron Acyrthosiphon pisum Buchnera est une bactérie symbiotique intracellulaire associée à la
majorité des pucerons d’importance économique. L’association est très ancienne (250 Ma). Les partenaires sont devenus dépendants.
Buchnera complémente l’alimentation de son hôte (acides aminés et vitamines)
Buchnera possède un génome de taille très réduite (400 à 600 kb), très riche en bases A et T et incluant de nombreuses mutations délétères (adaptatives ?). -> Bon modèle d’étude à un niveau théorique (simple)-> très difficile à manipuler expérimentalement (incultivable)
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Le génome de Buchnera est « dégénéré »
-> Comment Buchnera régule-t-elle l’expression des ces gènes ?-> Comment Buchnera s’adapte-t-elle aux variations des besoins nutritionnels de l’hôte ?
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22/6/05 7
2. Problématique biologique : stress nutritionnel chez le puceron
– Expérience 1 (8 lames) :
Milieu complet Milieu Tyr0/Phe0
A B
4 lames : A-Cy3 / B-Cy54 lames : A-Cy5 / B-Cy3
Expérience en flip-flop
Analyse statistique : test de t-modifié (SAM), approche bayésienne
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22/6/05 8
– Expérience 2 (16 lames) :aa équilibré aa déséquilibré
0.5 M saccharose A B
1 M saccharose C D
2 répétitions indépendantes de 8 lames :
A/B, B/C, C/D, D/A, A/C, B/D, D/B, C/A
A B
CD
2. Problématique biologique : stress nutritionnel chez le puceron
Analyse statistique : modèles d’analyse de la variance
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22/6/05 9
3. Mesure des niveaux d’expression
31. Acquisition de l’image 32. Acquisition des données issues de l’image 33. Filtration des données : analyse qualité 34. Normalisation 35. Analyse statistique et interprétation des résultats
-> Ces différentes phases ne sont pas distinctes
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22/6/05 10
31. L’image brute
bloc (12 x 16)
aiguille1
aiguille2
aiguille3
aiguille4
= =
Contrôles (+ et -)
Doublets de spotsOligo 5’
Oligo 3’
3ème oligo
Superposition des 2 images (R et G)
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22/6/05 11
32. Acquisition des données issues de l’image
Acquisition de l’image : réglage des PMT– limite de la saturation (216) – valeurs de PMT identiques (proches) pour toutes les lames d’un
même jeu de données
Quelle mesure du signal ?– Volume du spot (peu utilisé)– Moyenne (médiane) des pixels du spot
Faut-il retrancher un bruit de fond local ?– Estimation du bruit de fond sur les contours des spots (biais
d’estimation)– Estimation sur la base de témoins négatifs répartis sur toute la
surface de la puce
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22/6/05 12
33. Filtration des données durant l’acquisistion (logiciel GenePix)
Filtration des données (ajout de « flags »)– Flag « absent » des spots vides (- 50)– Flag « not found » des spots non détectés (- 75)– Flag « bad » des mauvais spots (- 100) :
• Spots sous les taches et rayures (manuel), diamètres extrêmes, spots saturés (F635%sat, script Genepix), spots éloignés du nuage (moyenne / médiane), spots à forts CVF et CVB…
– Flag « good » des bons spots (+ 100)• %B635+1SD > 55 et %B532+1SD > 55 (script GenePix)
– Flags (- 40) des valeurs corrigées négatives
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22/6/05 13
34. Analyse qualité
Analyse de la variabilité (critères de qualité)– Variabilité inter sondes identiques
– Variabilité intra-groupe de spottage
– Variabilité intra-gène
– Variabilité géographique
– Variabilité inter lames
-> Utilisation de CV
-> L’analyse de la variabilité permettra de décider de l’arrêt ou de la poursuite de la filtration puis du choix de la technique de normalisation
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22/6/05 14
34. Analyse qualité : représentations graphiques
Graphe RG Bruit de fond
MA plot Distribution de F532
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22/6/05 15
35. Normalisation des données
Il n’existe pas de mesure absolue de fluorescence Les fluorochromes ont des propriétés différentes
(linéarité du signal, quenching, sensibilité, stabilité…) Les PMT fournissent des valeurs relatives Les réactions de marquage ont des rendement
différents ...
-> Il est nécessaire d’effectuer une normalisation des données (la plus simple possible)
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22/6/05 16
35. Normalisation : différents modèles
Soit Ig l’intensité du signal de fluorescence et xg l’abondance de l ’ARNm correspondant :
Effet de bruit de fond :
Effet de saturation (non linéarité de la détection) :
Erreurs additives et multiplicatives :
€
Ig = bxg + ε
€
Ig = a + bxg + ε
€
Ig
=b
1x
g
a + b2x
g
+ ε
€
Ifg
= af
+ bfx
fge
η g +ζ fg + εg
+ δfg
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22/6/05 17Cui et al. 2002
Effet de saturation
Effet des erreurs additives (faibles intensités)
Effet des erreurs multiplicatives (fortes intensités)
Différence de bruit de fond entre vert et rouge
M=
log 2(
R/G
)
A=(RG)1/2
35. Normalisation : différents modèles
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22/6/05 18
35. Normalisation des données : trois cas de figures
(1) Le nombre de gènes est très grand. (H) : La plupart des gènes analysés ne varient pas, ou se répartissent équitablement du coté des sur- et des sous-exprimés.
-> Normalisation sur tous les points
(2) Le nombre de gènes est moyen et H n’est plus applicable. On dispose d ’un échantillons de gènes invariants (contrôles, gènes de ménage) ou on calcule cet échantillon (Tseng et al., 2001).
-> Normalisation sur l’échantillon de gènes invariants
(3) le nombre de gènes est faible. Il faut disposer d’un jeu de contrôles répartis sur toute la gamme des intensités.
-> Normalisation sur les contrôles
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22/6/05 19
35. Normalisation globale Normalisation « par la moyenne ou par la médiane »
– On calcule le rapport des moyennes (ou des médianes) pour les deux couleurs et on le rapporte à 1.
– La transformation :
– Le modèle sous-jacent :
-> Applicable si : (1) pas de bruit de fond, (2) linéarité du graphe MA, (3) pas d’effet aiguille, (4) pas d’effet géographique
€
T = Rg
g=1
N
∑ / Gg
g=1
N
∑
€
′ R g
= Rg
′ G g
= TGg
⎧ ⎨ ⎩
€
Ig = bxg + ε
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22/6/05 20
35. Normalisation globale Normalisation « par régression linéaire »
– Le modèle sous-jacent :
– La transformation est la suivante :
-> Applicable si : (1) pas de bruit de fond, (2) linéarité du graphe MA, (3) pas d’effet aiguille, (4) pas d’effet géographique
€
Rg
= aR
+ bRx
g
Gg
= aG
+ bGx
g
⎧ ⎨ ⎩
⇒ Rg
= aR
−b
R
bG
⎛ ⎝ ⎜ ⎞
⎠a
G+
bR
bG
⎛ ⎝ ⎜ ⎞
⎠G
g
€
⇒′ R =
R
α′ G = G b
⎧ ⎨ ⎩
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22/6/05 21
35. Normalisation globale Normalisation « par régression linéaire locale» (fonction loess)
– Le modèle et la transformation sont les mêmes que précédemment, mais appliqués sur une classe d’intensité.
-> Applicable si : (1) pas de bruit de fond, (2) linéarité du graphe MA, (3) pas d’effet aiguille, (4) pas d’effet géographique
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22/6/05 22
35. Normalisation locale (spatiale) Toutes ces méthodes peuvent s’appliquer de façon à normaliser
par groupe d’aiguille ou par bloc (effet géographique)
-> Applicable si : (1) pas de bruit de fond, (2) linéarité du graphe MA, (3) pas d’effet aiguille, (4) pas d’effet géographique
-> coût sur H ou sur le nombre de témoins très importants
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22/6/05 23
35. Normalisation des données Buchnera
La normalisation est basée sur un jeu de gènes invariants déterminé a posteriori
Normalisation « PrintTip loess »
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22/6/05 24
36. Un système d’informations pour la gestion des données de puces (SI-TRANS)
http://sitrans.insa-lyon.fr
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22/6/05 25
4. Plans expérimentaux
41. Plan de la puce
– Les sondes doivent être spécifiques– Les sondes doivent montrer des rendements homogènes– Les sondes doivent être choisies dans des régions propices– Les sondes devraient être réparties aléatoirement sur la lame– Le nombre de répétitions doit être fixe pour toutes les sondes
(calcul de moyennes)– La puce doit comporter des témoins négatifs répartis sur toute la
surface– La puce doit comporter des témoins positifs répartis sur toute la
gamme d’intensité si l’hypothèse de non variation de la majorité des gènes ne peut pas être faite.
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22/6/05 26
4. Plans expérimentaux
QuickTime™ et undécompresseur TIFF (LZW)
sont requis pour visionner cette image.
http://pbil.univ-lyon1.fr/roso
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22/6/05 27
- Comparaison de 2 conditions :Tests de t modifiés (SAM) ou inférence bayesienne
- Comparaison de différentes conditions dans un plan factoriel :Modèles d’ANOVA
- Comparaison de conditions multiples :Analyse discriminante, interclasse, non-supervisée
A B
CD
A B C D
R
4. Plans expérimentaux : analyse statique
Plan en boucle Plan en référence
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- Analyse à différents tempsProfil d’expression temporel : classification supervisée ou non, corrélation de
profils
Cycle cellulaire, Cycle circadien : classification, transformée de fourrier, PLS…
t1 t2 t3 t4
R = t1 ou asynchrone ou externe
4. Plans expérimentaux : analyse dynamique
Plan en référence
- Peng X et al. (2005) Identification of cell cycle-regulated genes in fission yeast. Mol Biol Cell. ;16(3):1026-42- Remondini et al. (2005) Targeting c-Myc-activated genes with a correlation method: Detection of global changes in large gene expression network dynamics. Proc Natl Acad Sci U S A. 10;102(19):6902-6.- Luan Y & Li H (2004) Model-based methods for identifying periodically expressed genes based on time course microarray gene expression data. Bioinformatics. 12;20(3):332-9.
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22/6/05 29
4. Plans expérimentaux : analyse dynamique
Plan en boucles répétées
- Analyse à différents temps avec une covariable qualitative :Effet d’une drogue au cours du temps : analyse statique à chaque temps, sélection des gènes significatif pour 50% des temps, puis analyse des profils par classification
t2
control
traitement
t3
control
traitement
t4
control
traitement
t5
control
traitement
t1
control
traitement
- Lin et al. (2004) Discovery of estrogen receptor alpha target genes and response elements in breast tumor cells.Genome Biol. 2004;5(9):R6.
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22/6/05 30
5. Conclusion
Le plan d’expérience est primordial pour réaliser les analyses statistiques et ou la modélisation
Toujours utiliser des plans en flip-flop Le modélisateur doit être partie prenante dans la
préparation des données (qualité, filtration, normalisation)
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22/6/05 31
5. Conclusions
inhibited by sucrose stressat 50% aa
inhibited by sucrose stressat 25% aa
Activated by sucrose stressat 50% aa
Activated by sucrose stressat 25% aa
Sucrose effect
yjjTrplSrpsLrpsF
trpBflgBflgCyhbZyleA
atpHftsYrpmGytfNcarByba2
mesJydiCrplFyheMmutLiscU
mopAargHyibNligfabBdcd
fabGfmt
murBdnaG
nthdnaJguaC
lipByciL
rpmB
fldAhscA
ygbByqhA
fliJcvpAaceE
murGgrpE1yfgB
phrBpnpinfB
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22/6/05 32
5. Conclusions
Recherche des gènes impliqués dans la réponse à un stress trophique chez Buchnera
Recherche des voies métaboliques dans lesquelles ils sont impliqués
Analyse des séquences régulatrices des gènes coexprimés
– Détection d’éléments régulateurs
Analyse génomique et analyse de la corrélation entre le niveau d’expression et l’organisation du génome de Buchnera
– Détection de mécanismes de régulation