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LA RICERCA DELLE SOSTANZE INIBENTI NEL LATTE OVINO
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GLI ANTIBIOTICI SONO COMPOSTI CAPACI DI UCCIDERE O INIBIRE LA CRESCITA DI
AGENTI PATOGENI
SONO PRODOTTI DA BATTERI E FUNGHI PER LIMITARE O IMPEDIRE LA CRESCITA DI ALTRI MICRORGANISMI
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LA CLASSIFICAZIONE SI BASA PRINCIPALMENTE SUL
MECCANISMO D’AZIONE CONTRO L’AGENTE PATOGENO
• ALCUNI ANTIBIOTICI ATTACCANO LA PARETE CELLULARE BATTERICA,
• ALTRI ROMPONO LA MEMBRANA CELLULARE • LA MAGGIOR PARTE DI ESSI INIBISCE LA
SINTESI DEGLI ACIDI NUCLEICI E DELLE PROTEINE, MOLECOLE ESSENZIALI PER LA VITA DEGLI ORGANISMI.
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GLI ANTIBIOTICI POSSONO ESSERE ANCHE CLASSIFICATI IN BASE ALLA
STRUTTURA CHIMICA
SI POSSONO ALLORA DISTINGUERE:• RIFAMICINE• CLORAMFENICOLO• AMMINOGLICOSIDI• TETRACICLINE• MACROLIDI• BETA-LATTAMICI• SULFAMIDICI
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TETRACICLINE
ANTIBIOTICI BATTERIOSTATICI CHE INIBISCONO LA SINTESI PROTEICA DELLE CELLULE BATTERICHE
BETA LATTAMICI
AZIONE BATTERICIDA, DOVUTA ALLA CAPACITA’ DI INIBIRE LA FORMAZIONE DELLA PARETE CELLULARE BATTERICA
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L’IMPIEGO DI FARMACI AD ATTIVITA’ ANTIMICROBICA SU LARGA SCALA HA
DETERMINATO E DETERMINA LA PRESENZA DI RESIDUI DI FARMACI NEGLI
ALIMENTI.
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DIVERSE SONO LE CAUSE DELLA PRESENZA DEI RESIDUI NEGLI ALIMENTI E TRA LE PIU’
FREQUENTI SI POSSONO CITARE:
• MANCATO RISPETTO DEI TEMPI DI SOSPENSIONE PREVISTI PER IL FARMACO
• MANCATA O ERRONEA INDIVIDUAZIONE DEGLI ANIMALI TRATTATI
• USI IMPROPRI DEL FARMACO ( ES.DOSAGGI TROPPO ELEVATI )
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GLI ANTIBIOTICI RAPPRESENTANO
• RISCHIO PER LA SALUTE PUBBLICA
• PROBLEMA TECNOLOGICO: INIBISCONO LE COLTURE DI STARTER IMPIEGATI NELLA PRODUZIONE DI LATTI FERMENTATI
• PRESSIONE SELETTIVA IN GRADO DI SELEZIONARE CEPPI DI BATTERI ANTIBIOTICO - RESISTENTI NON PATOGENI PER GLI ANIMALI, MA POTENZIALI AGENTI TOSSINFETTIVI PER L’UOMO. ( DEPAUPERAMENTO DELLA FLORA MICROBICA INTESTINALE CHE FAVORISCE L’EVENTUALE ADESIONE DI BATTERI PATOGENI )
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LA CONSAPEVOLEZZA DEI POTENZIALI RISCHI PER LA SALUTE DEL CONSUMATORE HA INDOTTO I GOVERNI DEI VARI PAESI A
INTRODURRE NELLE PROPRIE LEGISLAZIONI CONCENTRAZIONI MASSIME DI RESIDUI
( Reg. 2377/90/CE )
( LMR= LIMITI MASSIMI DI RESIDUI )
TOLLERATE NEGLI ALIMENTI
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IL TERMINE LMR SI PUO’ DEFINIRE COME LA
MASSIMA CONCENTRAZIONE DEL RESIDUO
INDICE DERIVANTE DALL’USO DI MEDICINALI VETERINARI, ESPRESSO IN
ppm (mg/Kg) O ppb (μg/kg)
LEGALMENTE TOLLERATO.
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IN PARTICOLARE LE TOLLERANZE AMMESSE PER LE SOSTANZE PIÙ LARGAMENTE
IMPIEGATE IN MEDICINA VETERINARIA PER IL TRATTAMENTO DEGLI OVINI SONO :
TETRACICLINE 100 ppb (μg/kg)PENICILLINA G 4 ppb (μg/kg)
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OCCORRE SAPERE CHE I LIMITI MASSIMI RESIDUI SONO STABILITI E FISSATI PER
ALIMENTI NON TRATTATI.
SAREBBE PERCIO’ IMPORTANTE AVERE INFORMAZIONI SULL’INFLUENZA DI ALCUNI
TRATTAMENTI( ES. CALORE ) CHE SUBISCE L’ALIMENTO
PRIMA DI ESSERE CONSUMATO E CHE POSSONO DETERMINARE UN CAMBIAMENTO
NELLA STRUTTURA DELLE MOLECOLE AD ATTIVITA’ FARMACOLOGICA
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QUESTI TRATTAMENTI POSSONO RIDURRE, LASCIARE INVARIATA O PEGGIORARE LA
PERICOLOSITA’ DELLE MOLECOLE ( ATTIVITA’ ALLERGENICA, TERATOGENA,
MUTAGENA ).
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IN GENERALE SI PUÒ AFFERMARE CHE L’ATTIVITÀ ANTIMICROBICA TENDE AD
DIMINUIRE DURANTE I PROCESSI DI PREPARAZIONE DEGLI ALIMENTI ANCHE SE
ANCORA NON SI È IN GRADO DI ESCLUDERE LA POSSIBILE FORMAZIONE DI
METABOLICI TOSSICI IN SEGUITO AI DIVERSI PROCESSI.
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AL GIORNO D’OGGI SI CONOSCONO E VENGONO NORMALMENTE IMPIEGATE
DIVERSE METODICHE PER LA RICERCA DEI RESIDUI DI FARMACI AD AZIONE ANTIMICROBICA NEGLI ALIMENTI:
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METODI BASATI SU:
•INIBIZIONE DELLA CRESCITA MICROBICA •TEST DEL RECETTORE MICROBICO •TEST ENZIMATICO-COLORIMETRICI•METODICHE CROMATOGRAFICHE
•TEST IMMUNOCHIMICI
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ALCUNI TEST DANNO RISPOSTE DI TIPO QUALITATIVO, ALTRE QUANTITATIVO,
ALTRE SEMIQUANTITATIVO.
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TEST QUALITATIVI: RICHIEDONO CHE SIA STABILITO UN VALORE
SOGLIA PER CLASSIFICARE I CAMPIONI IN POSITIVI E NEGATIVI
( QUESTO VALORE DOVRÀ ESSERE DEFINITOTENENDO CONTO DEI LMR ).
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TEST QUANTITATIVI: È NECESSARIO TESTARE UN CAMPIONE E PARAGONARLO A VALORI DI RIFERIMENTO
CERTIFICATI CON CUI COSTRUIRE UNA CURVA DI CALIBRAZIONE.
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TEST SEMIQUANTITATIVI:SONO SIMILI A QUELLI QUANTITATIVI MA LE
RISPOSTE NON SONO ESPRESSE COME PRECISI VALORI DI CONCENTRAZIONE MA COME RANGE DI CONCENTRAZIONE ( AD ES.
CAMPIONI NEGATIVI, DEBOLMENTE POSITIVI, POSITIVI , MOLTO POSITIVI )
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LA DIVERSITA’ DELLE METODICHE PUO’ ESSERE SFRUTTATA IMPIEGANDO I
DIVERSI TEST IN RAPPORTO ALLE DIVERSE ESIGENZE
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UNA METODICA CHE PERMETTE DI SAGGIARE UN GRANDE NUMERO DI CAMPIONI, DANDO UN BASSO
NUMERO DI FALSI NEGATIVI E UN ACCETTABILE NUMERO DI FALSI POSITIVI POTREBBE ESSERE
IL TEST DI INIBIZIONE DELLA CRESCITA MICROBICA.
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UNA METODICA IN GRADO DI SVELARE IL TIPO DI RESIDUO POTREBBE ESSERE IL
TEST IMMUNOENZIMATICO O RECETTORIALE
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PER LA CONFERMA DELLA POSITIVITA’ E LA QUANTIFICAZIONE DEL RESIDUO
OCCORREREBBE UTILIZZARE METODI QUANTITATIVI
TECNICHE CROMATOGRAFICHE ASSOCIATE ALLA SPETTROMETRIA DI
MASSA PER UNA CONFERMA DI CERTEZZA
(EU 93/256 “Methods based only on chromatographic analysis without the
use of molecular spectometric detection are not suitable for use as
confirmatory methods”)
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CONCENTREREMO LA NOSTRA ATTENZIONE SU QUELLI PIU’ FREQUENTEMENTE
UTILIZZATI IN AMBITO VETERINARIO E IN PARTICOLAR MODO NEGLI OVINI
![Page 26: LA RICERCA DELLE SOSTANZE INIBENTI NEL LATTE OVINO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081507/5542eb5b497959361e8c872b/html5/thumbnails/26.jpg)
ALLO SCOPO DI COMPARARE LA PERFORMANCE DI DUE DIVERSI TEST PRESENTI SUL MERCATO
E DI DETERMINARE LA SENSIBILITÀ DEI DUE TEST
( TEST 1 E TEST 2 ) AI PRINCIPALI PRINCIPI ATTIVI
( PENICILLINA E TETRACICLINA ), IL LABORATORIO ANALISI LATTE
DELL’ASSOCIAZIONE REGIONALE ALLEVATORI DELLA SARDEGNA HA CONDOTTO NEL 2003
UNO STUDIO DI VALIDAZIONE IN LATTE DI PECORA .
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LO STUDIO ERA RIFERITO A 1165 CAMPIONI DI LATTE OVINO DELLA RACCOLTA DI ROUTINE
NEL PERIODO LUGLIO- AGOSTO 2003.
LA TOTALITÀ DEI CAMPIONI È STATA ANALIZZATA CON DUE DIVERSI TEST
ENTRAMBI BASATI SULL’INIBIZIONE DELLA CRESCITA MICROBICA, ED È STATA ESEGUITA
SIA UNA LETTURA VISIVA CHE UNA SPETTROFOTOMETRICA
![Page 28: LA RICERCA DELLE SOSTANZE INIBENTI NEL LATTE OVINO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081507/5542eb5b497959361e8c872b/html5/thumbnails/28.jpg)
SONO STATI PRESI IN CONSIDERAZIONE SIA I RISULTATI POSITIVI E NEGATIVI
CHE QUELLI DUBBI O INTERMEDI
![Page 29: LA RICERCA DELLE SOSTANZE INIBENTI NEL LATTE OVINO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081507/5542eb5b497959361e8c872b/html5/thumbnails/29.jpg)
COMPARAZIONE DELLE PERFORMANCE IN ROUTINE:
SI È REGISTRATO UN 100% DI COINCIDENZA TRA I DUE TEST SUI CAMPIONI POSITIVI,
CI SONO STATI 5 CASI CON RISULTATI DISCORDANTI (+- vs. -) lo 0,4%
![Page 30: LA RICERCA DELLE SOSTANZE INIBENTI NEL LATTE OVINO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081507/5542eb5b497959361e8c872b/html5/thumbnails/30.jpg)
ALLO SCOPO DI DETERMINARE LA SENSIBILITÀ AI DIVERSI ANTIBIOTICI SONO STATI ADULTERATI
DEI CAMPIONI DI LATTE CON 7 CONCENTRAZIONI DI PRINCIPI ATTIVI E
SONO STATI ANALIZZATI IN DOPPIO CON I DUE TEST
I CAMPIONI DI LATTE PROVENIVANO DA PECORE DI RAZZA SARDA DELL'AZIENDA SPERIMENTALE
DELL'IZCS DI BONASSAICOMPLESSIVAMENTE 20 CAMPIONI 10 DELLA
MUNGITURA DELLA MATTINA E 10 DELLA SERA
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AGENTE ANTIMICROBICO
• PENICILLINA G
• DIIDROSSISTREPTOMICINA
• SULFADIAZINA
• TETRACICLINA
CONCENTRAZIONE (ppb)
0,1,2,3,4,5,6,7
1000,2000,2500,3000,3500,4000,4500
0,20,40,60,80,100,120,140
0, 200, 250, 350, 450, 550, 650, 800
CONCENTRAZIONE DI ANTIBIOTICO NEI CAMPIONI CONTAMINATI
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IL TEST 1 È RISULTATO PIÙ SENSIBILE DEL TEST 2 NELLA RILEVAZIONE DELLA
TETRACICLINA SIA SUI CAMPIONI POSITIVI CHE SU QUELLI “ NON NEGATIVI”.
![Page 33: LA RICERCA DELLE SOSTANZE INIBENTI NEL LATTE OVINO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081507/5542eb5b497959361e8c872b/html5/thumbnails/33.jpg)
725> 800483650TETRACICLINA
2,502,972,482,97PENICILLINA
TEST 2NON
NEGATIVI
TEST 2POSITIVI
TEST 1NON
NEGATIVI
TEST 1POSITIVI
SENSIBILITÀ
IN PPB SU LATTE OVINO
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DETECTION LIMITS OF ANTIMICROBIALS IN EWE MILK BY DELVOTEST
PHOTOMETRIC MEASUREMENTS( J. DAIRY SC. 2003 )
SENSIBILITÀIN PPB SU LATTE OVINO
AGENTE ANTIMICROBICO
DETECTION LIMIT
LMR
PENICILLINA G 1 4,00
TETRACICLINA 590 100
![Page 35: LA RICERCA DELLE SOSTANZE INIBENTI NEL LATTE OVINO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081507/5542eb5b497959361e8c872b/html5/thumbnails/35.jpg)
DAGLI STUDI DI SENSIBILITÀ È EMERSO UN DATO IMPORTANTE PER ALTRO GIÀ NOTO DA STUDI EFFETTUATI PRECEDENTEMENTE
SUL LATTE BOVINO
(M.BENEDETTI, G.VARISCO, G.BOLZONI: VALUTAZIONE DEI LIMITI DI SENSIBILITÀ METODO MICROBIOLOGICO PER LA
DETERMINAZIONE DELLE SOSTANZE INIBENTI NEL LATTE )
OGGI CON L’INTRODUZIONE DI SISTEMI AUTOMATICI DI INCUBAZIONE E LETTURA E’ POSSIBILE MIGLIORARE LA SENSIBILITA’ DEL
METODO SENZA MODIFICHE DEL KIT DI PARTENZA. (DI PROSSIMA PUBBLICAZIONE LAVORO SU LATTE DI PECORA
E CAPRA –AGRIS SARDEGNA)
![Page 36: LA RICERCA DELLE SOSTANZE INIBENTI NEL LATTE OVINO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081507/5542eb5b497959361e8c872b/html5/thumbnails/36.jpg)
MENTRE LA SENSIBILITÀ ALLA PENICILLINA DEI TEST DI SCREENING E DEI TEST BASATI SU
SAGGIO ENZIMATICO RECETTORE SPECIFICO ( ES. SNAP ) È AL DI SOTTO DEI LMR, LA
SENSIBILITÀ DEI TEST DI SCREENING BASATI SULL’INIBIZIONE DELLA CRESCITA MICROBICA ( ES DELVOTEST ) SI RIVELA INADEGUATA ALLA
RILEVAZIONE DELLE TETRACICLINE.( LMR 100 PPB TEST DI SCREENING LETTURA
> 650 PPB, BEN AL DI SOPRA DEI LIMITI MASSIMI CONSENTITI. )
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QUESTO SOPRATTUTTO IN CONSIDERAZIONE DEL FATTO ESTREMAMENTE IMPORTANTE CHE NELLA REALTÀ DELLA SARDEGNA PER IL LATTE
OVINO L’ANTIBIOTICO PIÙ LARGAMENTE UTILIZZATO
(ANZI QUASI ESCLUSIVAMENTE ) È L’OSSITETRACICLINA
( DATI ESTRATTI DA INDAGINI SVOLTE DAI VETERINARI ARAS PRESENTI SU TUTTO IL TERRITORIO REGIONALE)
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SNAP TEST
SAGGIO ENZIMATICO RECETTORE SPECIFICO CHE DETERMINA LA PRESENZA DI RESIDUI DI
PENICILLINA G O TETRACICLINA A CONCENTRAZIONI UGUALI O INFERIORI AI
VALORI DI TOLLERANZA E /O DI SICUREZZA IN LATTE DI MASSA NON TRATTATO
SENSIBILITA’ PENICILLINA G: 4 ppbSENSIBILITA’ OSSITETRACICLINA 50 ppb
![Page 39: LA RICERCA DELLE SOSTANZE INIBENTI NEL LATTE OVINO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081507/5542eb5b497959361e8c872b/html5/thumbnails/39.jpg)
DALL’ANALISI DEI DATI RELATIVI AL LAVORO DI CONFERMA CON LO SNAP TEST, DEI RISULTATI POSITIVI O DUBBI AL DELVOTEST EFFETTUATO DAL LABORATORIO ARAS NEL PERIODO 2008-
2009 SUL LATTE OVINO EMERGONO I SEGUENTI DATI :
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Latte Ovino
AnnataNumero campioni
N° campioni
++
%++
Numero campioni
+-
% +-
2008/2009 45635 210 0,46 139 0,30
2007/2008 46535 144 0,30 94 0,20
2006/2007 47987 120 0,25 38 0,07
2005/2006 41333 90 0,21 44 0,10
2004/2005 40239 129 0,32 70 0,17
![Page 41: LA RICERCA DELLE SOSTANZE INIBENTI NEL LATTE OVINO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081507/5542eb5b497959361e8c872b/html5/thumbnails/41.jpg)
N° CAMPIONI OVINI ANALIZZATI CON IL DELVOTEST
100.289
N° CAMPIONI POSITIVI400 ( 0,40% )
N° CAMPIONI DUBBI 248 ( 0,25% )
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N° CAMPIONI OVINI POSITIVI AL DELVOTEST E
ANALIZZATI CON LO SNAP TEST: 400
N° CAMPIONI POSITIVI AI BETA LATTAMICI :
211 ( 52,75 % )
N° CAMPIONI POSITIVI ALLE TETRACICLINE: 32 ( 8 % )
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N° CAMPIONI OVINI INTERMEDI AL DELVOTEST E
ANALIZZATI CON LO SNAP TEST: 248
N° CAMPIONI POSITIVI AI BETA
LATTAMICI :50 ( 20,16% )
N° CAMPIONI POSITIVI ALLE TETRACICLINE:
25 ( 11% )
![Page 44: LA RICERCA DELLE SOSTANZE INIBENTI NEL LATTE OVINO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081507/5542eb5b497959361e8c872b/html5/thumbnails/44.jpg)
TRA I CAMPIONI POSITIVI AL DELVOTEST SI SONO VERIFICATI 4 CASI NEI QUALI SONO RISULTATI POSITIVI SIA AI BETA LATTAMICI
CHE ALLE TETRACICLINE CON LO SNAP TEST
![Page 45: LA RICERCA DELLE SOSTANZE INIBENTI NEL LATTE OVINO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081507/5542eb5b497959361e8c872b/html5/thumbnails/45.jpg)
DALL’ANALISI DEI DATI EMERGONO I SEGUENTI DUBBI :
QUALI SONO LE RAGIONI CHE GIUSTIFICANO UNA COSÌ BASSA PERCENTUALE DI CAMPIONI POSITIVI ALLE TETRACICLINE DAL MOMENTO CHE L’OSSITETRACICLINA È L’ANTIBIOTICO PIÙ UTILIZZATO?
E’ UN PROBLEMA DI SENSIBILITÀ DEL METODO DI SCREENING O PIUTTOSTO DIPENDE DALLE MODALITÀ DI UTILIZZO DEL FARMACO ( SI FA PRESENTE CHE NEL CASO DEL LATTE OVINO LA SOMMINISTRAZIONE È QUASI ESCLUSIVAMENTE PARENTERALE ) E DELLA SUA FARMACOCINETICA?
SE PROVASSIMO A ESEGUIRE IL TEST SNAP SULLA TOTALITÀ DEI CAMPIONI
( ANCHE SU QUELLI NEGATIVI ) CI DOVREMMO ATTENDERE UN INCREMENTO DELLA PERCENTUALE DI POSITIVITÀ ALLE TETRACICLINE ?
![Page 46: LA RICERCA DELLE SOSTANZE INIBENTI NEL LATTE OVINO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081507/5542eb5b497959361e8c872b/html5/thumbnails/46.jpg)
E LE SEGUENTI NECESSITA’:
SAREBBERO NECESSARI STUDI SU CARRYOVER E UTILIZZO DELLE TETRACICLINE NEI PICCOLI RUMINANTI IN MODO DA DEFINIRE LA REALE CONSISTENZA DEL PROBLEMA
LA DISPONIBILITA’ DI UN BUON METODO DI CONFERMA POTREBBE AIUTARE A RISOLVERE MOLTI DUBBI.