Kryokonservierung humaner embryonaler
Stammzellen
SABT1 Masterstudiengang Biotechnologie
Hanna Lorig
Betreuerin: Julia Schulz (Fraunhofer IBMT)
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Überblick
Einführung Embryonale, adulte und induzierte Stammzellen
Grundlagen Kryokonservierung Der Einfriervorgang Kryoprotektiva: „Frostschutzmittel“ Kryobanken: Lagerung der Zellen
Kryokonservierung von hESC Fallbeispiele Probleme
Ausblick
28.01.2011Seminar Masterstudiengang Biotechnologie
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Einführung
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Stammzellen I
Embryonale Stammzellen (ESC) [1]
Besitzen mindestens zwei Eigenschaften:1. self renewal durch asymmetrische Zellteilung2. Pluripotenz
Fähigkeit, sich in alle Zellen der drei Keimblätter zu differenzieren (Ecto-, Endo- und Mesoderm)
Entdeckung murine ESC (1981), humane ESC (1998), Induzierte pluripotente Stammzellen (IPS) (2006/07)[2]
Gewinnung aus der inneren Zellmasse von Blastozysten
Regulierung der Forschung in Deutschland über das Embryonenschutzgesetz
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Stammzellen II
Adulte Stammzellen im Allgemeinen geringeres
Selbsterneuerungsvermögen eingeschränktes Differenzierungspotential
(Multipotenz) Während der gesamten Lebensdauer zu finden, v.a. in
Organen wie Knochenmark, Haut, Leber, Nabelschnur(blut), etc.
IPS – Induzierte pluripotente Stammzellen Adulte Stammzellen, die durch Reprogrammierung in
pluripotente Stammzellen umgewandelt wurden bis dato ist die absolute Übereinstimmung mit ESC nicht
eindeutig bestimmt28.01.2011Seminar Masterstudiengang Biotechnologie
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Stammzellen III
28.01.2011Abb. 1: Überblick IPS/ Differenzierung [15]
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Gewinnung & Kultivierung ESC
Gewinnung aus der inneren Zellmasse der Blastozyste› Zerstörung der Trophoblasten
durch Laserstrahl/Antikörper
Kultivierung [3]:› Feederzellen Monolayer
(inaktivierte murine embryonale Fibroblasten)
› Koloniewachstum -> 3D Struktur
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Forschungsziele
Grundlagenforschung der molekularen Mechanismen (z.B. Differenzierung)
Klinische Forschung› Zell- und Gewebeersatz› Immunsystemaufbau (HIV)
Krankheits- und Patientenspezifische Behandlung
Zellmodell für toxikologische/ pharmakologische Untersuchungen
Lagerung und Bereitstellung von hESC
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Kryokonservierung
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Grundlagen
Verfahren für das Lagern (Einfrieren) von Zellen in lN2
Der Einfrierprozess Langsames vs. schnelles Einfrieren Zellschäden durch extra- und intrazelluläre
Eisbildung
Kryoprotektiva als Frostschutz (im)permeable Substanzen
Lagerung der Zellen in Kryobanken Vorschriften, Handling und Qualitätskontrolle
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[16]
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Der Einfriervorgang
Zwei Einfriergeschwindigkeiten:
1. Langsam (Kristallisation)Wässrige Lösung gefriert unter Phasentrennung, wobei es zur Aufkonzentration der gelösten Stoffe kommt (Gefrierkonzentration) Eutektisches Verhalten
2. Schnell (Vitrifikation)a. Extrem schnelle Abkühlung, die zur sog. Glasbildung führt
z.B. direkter Kontakt mit lN2
Übersättigte Lösung
b. unkontrolliertes Einfrieren
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Abb. 3: kristalline Mannitstruktur (links), amorphe Saccharosestruktur (rechts) [3]
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Kristallisation
Verhalten von Zellsuspensionen bei kristallinem Eis
dendritisches Wachstum der extrazellulärenWasserphase der Lösung Schädigungen der Zellen v.a. durch extrazelluläre Effekte
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Extrazelluläre Schäden
Zelldeformationen aufgrund der Zelldichte in interdentritischen Kanälen
Mechanisch bedingte Schäden aufgrund von Zellschrumpfen
Osmotisch bedingte Schäden (solutions effects)
Membranporenbildung
[14]
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Vitrifikation
Zelleffekte bei Vitrifikation
Schnelles Abkühlen führt zu intrazellulärer Eisbildung (flash out Effekt)® Schädigungen der Zellen durch intrazelluläre Eisbildung
aufgrund von ice seeding durch Membranporen
Zwei-Faktor-Hypothese (Mazur et al.) [6]:
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Abb. 4: Schema der 2-Faktor Hypthese von Mazur
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Kryoprotektiva
Stoffe, die positive Effekte auf die Überlebensrate während des Einfrieren ausüben Verbreiterung des optimalen Kühlratenbereichs
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Permeable Stoffe Impermeable Stoffe
Kolligative Effekte Nicht-kolligative Effekte
Reduktion der Elektrolytkonzen-tration während des Einfrierens
Umstrukturierung der Wassermo-leküle
Verringerung der solution effects
Stabilisierung der Membranen und Proteine -> intrazelluläre Eisvermeidung
Toxisch in hohen Konzentrationen und bei RT
Im Allgemeinen geringere Wirkung
DMSO, Glycerin, Methanol Trehalose, Hydroxyethylstärke
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Kryobanken
Internationaler Forschungsfortschritt bedingt die Registrierung, Lagerung und Verwaltung von biologischem Material (UK Stem Cell Bank, HUES, …)
Ziel: metabolisch inaktiver Zustand, der Langzeitstabilität garantiert
Verschiedene Möglichkeiten der Konservierung [7]:
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Material Lagerung Lagerzeit
versch. Bakterien, Hefen, Pilze
Gefriertrocknung 5 – 35 Jahre
Pflanzensamen lN2 > 10 Jahre
Stammzellen lN2 15 Jahre
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Kryokonservierungvon hESC
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Vorbereitung mechanische Dissoziation in Klumpen von 50-200
Zellen› Enzymatisches Ablösen der Zellen (hESC zusammen mit
Feederzellen)
10 – 20 Zellklumpen pro Kryosubstrat
Auswahl der geeigneten Abkühlrate
Resuspension der Zellen in geeignetem Kryomedium
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Kryoprotokolle
1. Kontrolliertes EinfrierenProbe wird mithilfe eines Einfrierautomaten kontrolliert eingefroren
› Kühlrate variierbar› Schrittweises Abkühlen möglich› Reproduzierbare Protokolle
2. Unkontrolliertes EinfrierenProbe wird direkt in Gefrierschrank/ lN2 überführt
VitrifikationProbe wird direkt in LN2 gefroren
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Controlled-rate freezing of hESC [8]
Kryomedium: 90% Kulturmedium + 10 % DMSOKryosubstrat: 0,25 ml Cassou StrawKontrolle: I) ohne Kryokonservierung (Probe A)
II) unkontrolliertes Einfrieren bei -80 °C (Probe B)
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Schritt
Probe Prozedur Zeit [min]
1 alle Äquilibrierung der Zellen in Kryomedium 15
2 alle Einfrieren bei -10 °C 1
3 D – F Ice seeding 5
4 C + D Abkühlen auf -33 °C 1 °C / min
4 E Abkühlen auf -33 °C 1,8 °C/ min
4 F Abkühlen auf -33 °C 2,7 °C /min
5 C - F Überführung in lN2 > 5 min
6 C - F Auftauen bei Raumtemperatur (RT)
Fall 1: Medium + 10 %DMSO
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Fall 1: Medium + 10 %DMSO
Vitalität
Kontrolliertes Einfrieren mit Ice seeding optimal Höhere Einfrierraten wirken sich negativ auf die Vitalität aus
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Probe Einfrierrate Vitailität
Kontrolle (A) - 100 %
Kontrolle (B) direkt bei -80 °C 1 % ± 0,6
C 1 ° C / min 3,0 % ± 2,0
D (seeding) 1 °C / min 79 % ± 15
E (seeding) 1,8 °C / min 65 % ± 20
F (seeding) 2,7 °C / min 20 % ± 10
Improved cryopreservation of hESC with trehalose [4]
Kryomedium: 90% Knockout serum replacement + 10 % DMSO + 0,2 mol/ l Trehalose
Kryosubstrat: 0,5 ml Kryovial
Kühlrate: 1 °C / min auf – 80 °C, nach 12 h in lN2
Kontrolle: 90% Knockout serum replacement + 10 % DMSO
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Fall 2: Medium + Trehalose
Probe Kryomedium Auftaumedium
Kontrolle (A) - -
B mit Trehalose -
C - mit Trehalose
D mit Trehalose mit Trehalose
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Fall 2: Medium + Trehalose
Differenzierungsstatus:
n = 75 Kolonien Jüngere Passagen erholen sich besser nach der
Kryokonservierung
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Prob
e
Undifferenzierte Kolonien [%]Passage 28
Undifferenzierte Kolonien [%]
Passage 38
A 16 13
B 41 35
C 43 44
D 51 45
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Problematik
3D-Struktur der hESC› Temperatur- & Kryoprotektivumgradienten› Verlust der Pluripotenz nach dem Auftauen› Dissoziation der Zellklumpen kann zu Zelltod führen› Zell-Zellkontakt unterbrochen durch extrazelluläre Eisbildung
Kryoprotektiva› Spezifische Auswahl wichtig› Toxizität bei Raumtemperatur
Proben & Arbeitsweisen› Verschiedene Zelllinien & Passagen› Unterschiedliche Handhabung der Kryokonservierung
die opt imale Kryokonservierung ist von vie len Faktoren abhängig
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Ausblick
hESC besitzen großes Potential als Forschungsobjekt:
› regenerative Medizin› Grundlagenforschung in der Embryonalentwicklung› Individuelles Testsystem für Pharmazeutika
Forschung nach besseren Kryoprotektiva ist weiterhin von großer Bedeutung
Kryokonserv ierung is t e in v ie lversprechender , aber te i lwe ise noch
unausgere i f ter Ansatz für d ie Lagerung b io log ischer Proben
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Dankeschön für die Aufmerksamkeit!
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Quellen[1]: Human embryonic stem cells, Pera M.F., Reubinoff B., Trounson A., J. Cell. Sci., 2007,
113: 5-10[2]: Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors,
Takahashi K. et al., Cell, 2007 Nov 30, 131 (5): 834-5[3]: Embryonic Stem Cell Lines Derives from Human Blastocysts, J.A. Thomson et al.,
Science, 1998, 282: 1145[4]: Improved cryopreservation of human embryonic stem cells with trehalose, Chun F. Wu
et al., Reproductive BioMedicine Online, 2005, 11, 6:733 - 739[5]: The Banking and Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cells, Charles J. Hunt,
Transfusion medicine Hemotherapy, 2007, 34: 293-304,[6]: A two-factor hypthesis of freezing injury: Evidence from Chinese hamster tissue-culture
cells, Mazur et al., Experimental Cell Research,1971, 71:345-355 [7]: Biobanking, John G. Day, Glyn N. Stacey, Mol. Biotechnol., 2008, 40:202 - 213[8]: Controlled-rate freezing of human ES cells, Carol B. Ware, Angelique M. Nelson,
Anthony Blau, BioTechniques, 2005, 38:879 - 883 [13]: Ein Mikro-Waageverfahren zur kontinuierlichen Bestimmung der
Sublimationsgeschwindigkeit während der Gefriertrocknung, Dissertation Claudia Roth, Universität Erlangen-Nürnberg, 2000
http://www2.chemie.uni-erlangen.de/services/dissonline/data/dissertation/ Claudia_Roth/html/ Dissertation-Roth.html
[14]: Cryosurgery, Boris Rubinsky, Annual review of Biomedical Engineering, 2000, Vol. 2:157-187
[15]:http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/life-science/stem-cell-biology/ipsc-pathway.Par.0001.Image.566.gif
[16]: http://www.sciencedaily.com/images/2008/09/080910090825-large.jpg[17]: Kryovial, http://www.fisher.co.uk/offers/fisherbrand/images/FB74401.jpg[18]: Kryo straws,
http://www.cryobiosystem-imv.com/Portals/3/produits/zooms/Z_CBS_straws.jpg
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