-
Modul Kultur Jaringan
Prodi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo Madura
1
Kegiatan 1
PENGENALAN DAN STERILISASI ALAT
Tujuan Instruksional Umum
Setelah melakukan kegiatan ini mahasiswa dapat mengenal dan memahami fungsi alat yang digunakan
untuk kegiatan kultur jaringan
Tujuan Instruksional Khusus
1. Mengetahui nama, fungsi dan prosedur penggunaan alat untuk kegiatan kultur jaringan
2. Memahami prosedur sterilisasi alat
Dasar Teori
Teknik kultur jaringan akan berhasil dengan baik apabila syarat yang diperlukan terpenuhi. Syarat-syarat tersebut meliputi pemilihan eksplan, penggunaan medium yang cocok, keadaan yang aseptik dan pengaturan udara yang baik.(Daisy dan Ari, 1994)
Untuk mendapatkan keadaan yang aseptic, salah satunya adalah alat-alat yang digunakan dalam kegiatan kultur jaringan harus dalam keadaan steril. Alat-alat yang steril akan mampu meminimalkan kontaminan pada media dan plantlet yang dikulturkan.
Sterilisasi Alat
Semua alat yang akan digunakan di ruang penaburan (LAF) termasuk LAF itu sendiri harus dalam keadaan steril. Menurut bentuk dan fungsinya sterilisasi alat yang digunakan dalam kegiatan kultur jaringan ada beberapa macam:
1. Sterilisasi secara fisik yaitu menggunakan panas
a. Sterilisasi menggunakan panas basah dengan autoklaf
Autoklaf adalah alat sterilisasi untuk alat dan medium kultur jaringan. Alat yang berupa glassware
maupun dissecting kit sebelum digunakan harus disterilkan terlebih dahulu, begitupun juga media yang
telah dibuat dan aquadest. Dengan Pemanasan dalam autoklaf maka bakteri dan mikrobia dapat mati
akibat suhu tinggi (120o C) dan tekanan uap air yang besar (1,5 kg/cm2) selama 15 menit.
b. Sterilisasi menggunakan panas kering dengan oven
Pada kegiatan kultur jaringan lebih banyak menggunakan autoklaf daripada oven. Namun pada
hakikatnya oven juga bisa digunakan untuk mensterilkan alat-alat yang digunakan dalam kegiatan kultur
jaringan seperti glassware maupun dissecting kit.
http://eshaflora.com/
-
Modul Kultur Jaringan
Prodi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo Madura
2
Alat tanam seperti pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan
pemanasan dalam bacticinerator.
2. Sterilisasi secara kimia yaitu menggunakan bahan kimia, pada umummnya yang digunakan larutan
alcohol 70 %
Ruang penabur atau Laminar Air Flow juga membutuhkan kondisi steril. Untuk membuat kondisi tersebut
selain menggunakan sinar UV, sebelum dan sesudah penggunaan LAF harus disemprot dan dibersihkan
dengan alcohol 70 %. Khusus untuk scapel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan namun
pisaunya dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperatur tinggi. Oleh karena itu dianjurkan
cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.
Bahan dan Alat
Bahan:
1. Alkohol 70 %
2. Kertas Pembungkus atau aluminium foil
Alat – Alat:
1 Laminar Air Flow(Ruang Penabur)
2 Autoclave : Sterilisasi Basah
3 Glassware (petridish, beckerglass, labu ukur,elemeyer , gelas ukur, pipet ukur, botol media,
pengaduk,)
4 Pinset, scalpel, gunting :alat untu menanam
5 Timbangan analitik: Menimbang Bahan
6 Hot plate dan Stirer : Memanaskan dan mengaduk bahan/media
7 Bunsen: sterilisasi dengan panas
8 sprayer alcohol : sterilisasi secara kimia
-
Modul Kultur Jaringan
Prodi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo Madura
3
Prosedur Kegiatan
A. Pengenalan Alat
Semua alat yang ada digambar/difoto disertai keterangan tentang fungsi dan cara kerja dari masing-
masing alat.
B. Sterilisasi Alat
1. Alat-alat yang akan disterilkan seperti pinset, petridish, skalpel, pinset, gunting terlebih dahulu
dicuci bersih dan dikeringkan kemudian dibungkus kertas aluminium.
2. Hubungkan stop kontak dengan listrik
3. Buka sedikit pengatur udara
4. Buka tutup Autoclave dengan memutar pegangan kebalikan arah jarum jam
5. Angkat keluar kedua keranjang
6. Isi autoclave dengan air aquades sampai batas
7. isi pembuangan udara dengan air aquades 1/3 bagian
8. masukkan alat dan atau bahan yang akan diautoclave kedalam keranjang
9. masukkan keranjang beserta alat dan atau bahan ke dalam autoclave
10. tutup autoclave dengan memutar pegangan searah jarum jam
11. Proses Autoclave dimulai dengan menekan tombol start sampai terdengar bunyi ‘teet’ 2 kali
12. Suhu dan Tekanan akan naik, tunggu sehingga terdengar bunyi mendidih pada pembuangan
udara kemudian tutup rapat pengatur udara
13. Proses Autoclave ini akan berakhir ketika alat berbunyi teet teet teet
14. tunggu sampai jarum tekanan dan suhu turun sampai batas aman
15. buka pengatur udara, kemudian buka tutup autoclave
16. keluarkan alat/bahan yang disterilisasi dan letakkan di tempat yang aman
17. setelah kegiatan selesai lepas stop kontak.
18. Setelah selesai, alat-alat yang disterilisasi diletakkan di tempat yang aman dan terlindung agar
tetap steril seperti di dalam ruang kultur.
C. Sterilisasi Laminar Air Flow
I.SEBELUM DIGUNAKAN
1. Hidupkan LAF dengan menghubungkannya dengan sumber listrik
2. Hidupkan Fan dan Light (khusus untuk LAF ESCO: jika fan hidup maka otomatis UV tidak bisa
dihidupkan begitu juga sebaliknya)
3. Bersihkan semua bagian dalam LAF dengan disemprot alkohol dan kemudian dibersihkan
dengan kertas tissue
4. Alat-alat yang akan digunakan dalam kegiatan kultur disemprot alcohol 70% terlebih dahulu
kemudian masukkan ke dalam LAF
5. Fan dan Light dimatikan
6. Hidupkan lampu UV (selama 30 menit)
7. Setelah lampu UV mati, hidupkan Fan dan Light penanaman di LAF siap dilakukan
-
Modul Kultur Jaringan
Prodi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo Madura
4
II.SETELAH DIGUNAKAN
1. Jika kegiatan penanaman sudah selesai dilakukan keluarkan semua alat yang digunakan
2. Bersihkan semua bagian dalam LAF dengan disemprot alkohol dan kemudian dibersihkan
dengan kertas tissue
3. Fan dan Light dimatikan
4. Hidupkan lampu UV (selama 30 menit)
5. Setelah lampu UV mati, cabut stop kontak
Data Pengamatan
No Naman Alat Fungsi Cara kerja
Laporan Kegiatan
Laporan kegiatan ini berisi uraian tentang : latar belakang dan tujuan melakukan sterilisasi, tinjauan
pustaka tetang sterilisasi, pembahasan tentang kegiatan yang dilakukan, kesimpulan dan daftar pustaka.
-
Modul Kultur Jaringan
Prodi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo Madura
5
Kegiatan 2
PEMBUATAN LARUTAN STOK
Tujuan Instruksional Umum
Setelah melakukan kegiatan ini mahasiswa mampu membuat larutan stok
Tujuan Instruksional khusus
Memahami prosedur pembuatan larutan stok
Dasar Teori
Penimbangan satu per satu komponen media untuk setiap pembuatan media kultur adalah tidak praktis,
dan hanya dapat dilakukan jika jumlah zatnya cukup besar untuk ditimbang. Selain itu akan
menghabiskan banyak waktu dan mengurangi ketepatan. Kadang-kadang pula timbangan yang
dibutuhkan untuk menimbang sejumlah kecil bahan tidak tersedia dalam laboratorium. Kendala ini dapat
diatasi dengan membuat larutan stok terlebih dahulu.
Larutan stok adalah larutan yang berisi satu atau lebih komponen media yang konsentrasinya lebih tinggi
daripada konsentrasi komponen yang diperlukan dalam formulasi media yang akan dibuat. Larutan stok
dalam kegiatan kultur jaringan dikelompokkan dalam: larutan stok unsur makro, larutan stok unsur
mikro, larutan stok Fe, larutan stok vitamin dan larutan stok hormon. Larutan stok bisa dibuat dengan
konsentrasi 10, 100, atau bahkan 1000 kali lebih pekat.
Larutan stok sebaiknya disimpan dalam ruang gelap dan bersuhu rendah, karena ada beberapa bahan
yang tidak tahan cahaya dan suhu tinggi. Larutan stok vitamin tidak dapat disimpan terlalu lama, bisa
dibuat untuk digunakan dalam 1 – 2 minggu, larutan stok hormon dapat disimpan antara 2 – 4 minggu,
sedangkan larutan stok unsur hara dapat disimpan 4 – 3 minggu. Larutan stok yang sudah tersimpan
lama biasanya mengendap dan ditumbuhi mikroorganisme. Larutan yang sudah terkontaminasi
mikroorganisme ini tidak dapat digunakan lagi. Oleh sebab itu kondisi tempat simpan dan wadah larutan
harus diusahakan sesteril mungkin. Dengan adanya larutan stok ini maka pembuatan media kultur
selanjutnya dilakukan hanya dengan teknik pengenceran dan pencampuran saja.
Jika seluruh larutan stok yang dibutuhkan sudah dibuat, gula dan pemadat medianya ditimbang sesuai
kebutuhan, setelah itu kita dapat meramu dan membuat media sesuai dengan yang kita inginkan. Secara
-
Modul Kultur Jaringan
Prodi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo Madura
6
umum media yang cocok untuk semua jenis tanaman terutama herba adalah medi MS (Murashige and
Skoog) sedangkan untuk tanaman anggrek adalah media VW (Vacin and Went)
Tabel 1. Tabel larutan stok untuk Media Murashige and Skoog
No Makronutrient
Konsentrasi larutan
(mg/liter)
1 NH4NO3 1650
2 KNO3 1900
3 CaCL2.2H2O 440
4 MgSO4.7H2O 370
5 KH2PO4 170
Mikronutrient
6 MnSO4.4H2O 22,3
7 ZnSO4.7H2O 8,6
8 H3BO3 6,2
9 KI 0,83
10 CuSO4.5H2SO4 0,025
11 NaMoO4.2H2O 0,25
12 CoCl2.6H2O 0,025
13 FeSO4.7H2O 27,8
14 NaEDTA.2H2O 37,3
Vitamin
15 Mio-Inositol 100
16 Thiamin HCl 0,1
17 Nikotinic Acid 0,5
18 Peridoksin HCl 0,5
19 Glysin 2
Bahan Tambahan
20 IAA 1,0 – 3,0
21 Kinetin 0,04 – 10
22 Sukrosa 30000
23 Agar 7000
-
Modul Kultur Jaringan
Prodi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo Madura
7
T/abel 2. Bahan yang diperlukan untuk media Vacin and Went untuk tanaman anggrek
No Nama bahan
kebutuhan per 6 liter
media
1 Ca3PO4 0,20 g
2 KNO3 0,25 g
3 KH2PO4 0,25 g
4 MgSO4 0,25 g
5 FeSO4 2,8 g
6 MnSO4 0,8 g
7 NH4SO4 0,25 g
8 Na2 EDTA 3,8 g
9 Air kelapa muda 11 ml
10 Pisang 900 g
11 Kentang 5 g
12 Agar-agar 55 g
13 Gula 120 g
14 Bayfolan 5 ml
15 Fish Emulsion 25 ml
16 Vitamin B-1 25 ml
17 Atonik 5 ml
18 Arang Aktif 100 g
-
Modul Kultur Jaringan
Prodi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo Madura
8
Bahan dan Alat
1. Bahan kimia : seperti pada tabel 1 atau tabel 2, aquadest steril
2. Alat : labu ukur, gelas ukur, becker glass, pipet ukur, timbangan analitik, scapel, corong
Prosedur Kerja
Skema Pembuatan Media Kultur
Larutan stok komponen media MS dengan volume 100x
Masing-masing dikali 10 ml
Ditambah 100 mg mio inositol
Ditambah 30 gr sukrosa
Ditambah air suling sampai + ¾ volume akhir
pH diatur 5,6 – 5,7 dengan NaOH 0,1 N atau HCl 0,1 N
ditambah agar 7 g dan ditambah air suling sampai volume akhir
panaskan sampai larut
masukkan botol
-
Modul Kultur Jaringan
Prodi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo Madura
9
autoklaf selama 20 menit, 121 C
simpan di ruang yang bersuhu 25 C
Laporan Kegiatan
-
Modul Kultur Jaringan
Prodi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo Madura
10
Kegiatan 3
PEMBUATAN MEDIA
Tujuan Instruksional Umum
Memahami pentingnya meramu media kultur jaringan
Tujuan Instruksional khusus
Setelah melakukan kegiatan ini mahasiswa mampu membuat media MS (Murashige and Skoog)
Dasar Teori
Media kultur in vitro adalah media buatan yang mengandung senyawa organic, anorganik dan zat
pengatur tumbuh. Media ini mempunyai 2 fungsi yaitu sebagai penyedia nutrisi dan mengarahkan
pertumbuhan melalui zat pengatur tumbuh. Oleh karena itu media yang memenuhi syarat adalah yang
mengandung unsure hara makro dan mikro dengan perbandingan tertentu, sumber energy seperti
sukrosa, vitamin dan zat pengatur tumbuh. Keseimbangan dari komponen tersebut akan tampak pada
pertumbumbuhan yang terjadi.
Berdasarkan fisik dari media dibedakan menjadi media padat dan media cair. Media ini mengandung
semua komponen kimia yang dibutuhkan oleh tanaman hanya saja untuk media padat ditambahkan zat
pemadat berupa agar-agar batangan, agar-agar bubuk, atau agar-agar kemasan kaleng yang yang
memang khusus digunakan untuk media padat kultur jaringan
Bahan dan Alat
1. Bahan yang digunakan adalah
larutan stok yang telah dibuat pada praktikum sebelumnya
sukrosa/ gula
agar-agar
aquadest steril
2. Alat yang digunakan:
timbangan analitik,
tabung erlenmeyer,
gelas ukur besar dan kecil,
pipet ukur dan pipet pump,
-
Modul Kultur Jaringan
Prodi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo Madura
11
pengaduk kaca dan atau stirer,
kompor gas dan atau hot plate,
pH meter atau kertas pH ,
botol media dan plastik tahan panas penutup botol
Prosedur percobaan
1. Menyiapkan alat-alat dan bahan-bahan yang akan digunakan, yaitu :
2. Mencampurkan larutan stok hara makro, mikro, Fe-chelat, vitamin dan hormon sesuai kebutuhan
ke dalam erlenmeyer sambil digoyangkan agar larutan dapat homogen.
3. Menambahkan gula dalam larutan media tersebut kemudian menera larutan tersebut dengan
aquades steril dengan menggunakan gelas ukur sesuai volume media yang dibutuhkan kemudian
mengaduknya dengan stirer hingga semua bahan tercampur dengan sempurna
4. Melakukan pengukuran pH, (pastikan pH meter sudah dikalibrasi terlebih dahulu), kadar pH yang
dibutuhkan adalah 5,8. Apabila pH masih dibawah 5,8 maka perlu ditambahkan beberapa tetes
NaOH atau KOH sampai mencapai kadar pH 5,8. Tetapi jika kadar pH terlalu tinggi atau lebih dari
5,8 maka perlu ditambahkan beberapa tetes HCl sampai kadar pH 5,8.
5. Memasukkan pemadat media (agar-agar 7g/L) ke dalam larutan media. Setelah itu media dapat
langsung dipanaskan dengan menggunakan hotplate atau dipanaskan di atas kompor gas. Selama
pemanasan berlangsung, hendaknya larutan media tersebut diaduk terus-menerus hingga agar-
agar terlarut seluruhnya. Pemanasan dihentikan sampai larutan terlihat bening dan mulai terlihat
gelembung-gelembung udara
6. Setelah larut, menuangkan media tersebut ke dalam botol-botol media yang telah dipersiapkan
sesuai kebutuhan tergantung besar kecilnya botol. Kemudian menutup botol yang sudah terisi
media dengan menggunakan plastik tahan panas atau aluminium foil. Diusahakan supaya botol
benar-benar tertutup rapat.
7. Memasukkan botol-botol tersebut ke dalam autoclaf dan disterilisasi dengan suhu 121°C dengan
tekanan 1,5 kg/cm2 selama 20-30 menit.
8. Menyimpan media yang sudah disterilisasi di dalam ruang penyimpanan media ber-AC (suhu 24 -
26°C) selama 3 hari sebelum digunakan untuk memastikan bahwa media tersebut tidak
terkontaminasi.
-
Modul Kultur Jaringan
Prodi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo Madura
12
Laporan Kegiatan
-
Modul Kultur Jaringan
Prodi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo Madura
13
Kegiatan 4
PENANAMAN I DI LAMINAR AIR FLOW (SUBKULTUR )
Tujuan Instruksional Umum
Mahasiswa dapat memahami manfaat dari tahapan prosedur penanaman eksplant
Tujuan Instruksional khusus
Setelah melakukan kegiatan ini mampu melakukan penanaman di laminar air flow
Bahan dan Alat
1. Bahan : eksplat streril, media tanam, alkohol 70%,
2. Alat : Laminar air flow, Pinset, Spatula, Petridish, Bunsen, gunting
Dasar Teori
Kultur in vitro merupaka teknik budidaya (kultur) sel, jaringan maupun organ di dalam botol gelas (in
vitro) dalam lingkungan terkendali dan aseptic (bebas mikroorganisme). Kondisi yang tidak aseptic akan
mengakibatkan kontaminasi pada bahan tanam/eksplat dan media kultur yang mengakibatkan kematian
jaringan eksplant dan kerusakan komposisi media kultur.
Kultur jaringan akan lebih besar presentase keberhasilannya bila menggunakan jaringan meristem.
Jaringan meristem adalah jaringan muda, yaitu jaringan yang terdiri dari sel-sel yang selalu membelah,
dinding tipis, plasmanya penuh dan vakuolanya kecil-kecil. Teknik kultur jaringan sebenarnya sangat
sederhana, yaitu suatu sel atau irisan jaringan tanaman yang sering disebut eksplan secara aseptik
diletakkan dan dipelihara dalam medium padat atau cair yang cocok dan dalam keadaan steril. dengan
cara demikian sebagian sel pada permukaan irisan tersebut akan mengalami proliferasi dan membentuk
kalus. Apabila kalus yang terbentuk dipindahkan ke dalam medium diferensiasi yang cocok, maka akan
terbentuk tanaman kecil yang lengkap dan disebut planlet. Dengan teknik kultur jaringan ini maka
dengan hanya dari satu irisan kecil suatu jaringan tanaman dapat dihasilkan kalus yang dapat menjadi
planlet dalam jumlah yang besar.
Prosedur kerja
1. Buka pintu Laminair Air Flow .
2. Kemudian semprot semua ruangan dalam Laminair menggunakan alkohol 70 % dan dibersihkan
menggunakan tissue steril.
3. Masukkan semua alat (pinset, pisau skalpel, api bunsen, korek api, karet, petridis, botol kecil,
plastik) dan bahan ( eksplan dan media) ke dalam laminair
4. Tutup kembali pintu laminair dan nyalakan sinar UV selama 1 jam.
-
Modul Kultur Jaringan
Prodi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo Madura
14
5. Setelah 1 jam, matikan sinar UV dan kemudian nyalakan blower dan lampu neon serta buka
kedua pintu laminar
6. Sebelumnya lepas semua asesoris yang dipakai(untuk mengurangi kontaminasi), kemudian
semprot tangan dengan alcohol 70% sebelum bekerja di LAF
7. Setelah itu masukkan eksplan yang akan ditanam/disubkultur kedalam laminair
8. Sebelum dan sesudah menggunakan pinset, gunting atau scalpel harus selalu di bakar diatas
Bunsen dan dicelup alcohol 70%
9. Eksplan selanjutnya diletakkan pada media tanam dengan cara membuka tutup botol media
sambil mendekatkan mulut botol ke api bunsen dan menutupnya kembali.
10. Selanjutnya dilakukan penyimpanan ke dalam rak kultur dengan penerangan lampu neon 20 watt
serta mengatur suhu pada temperature 18-21ºC.
11. Setelah semua kegiatan menanam selesai, keluarkan semua alat dan bahan dari laminair, serta
semprot dengan alkohol 70% bagian dalam laminair untuk menjaga kondisi tetap steril,
kemudian hidupkan UV kembali.
Prosedur penanaman Sub kultur anggrek
Yaitu memindahkan tanaman hasil kultur jaringan yang pada botol sebelumnya sudah terlalu
padat populasinya dan media sudah akan habis ke botol media baru.
1. Semprot alcohol botol anggrek kemudian masukkan ke LAF
2. Kegiatan didalam LAF, buka tutup botol anggrek
3. Ambil beberap tanaman anggrek kecil dengan pinset panjang kemudian letakkan di petri
steril
4. Pindahkan tanaman dari petri steril ke botol media yang sudah disiapkan dengan pinset yang
lebih kecil.
5. Tutup botol dan letakkan hasil subkultur di rak yang tersedia
6. Sebelum dan sesudah menggunakan pinset, gunting atau scalpel harus selalu di bakar diatas
Bunsen dan dicelup alcohol 70%
Laporan Kegiatan
-
Modul Kultur Jaringan
Prodi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo Madura
15
Kegiatan 5
PENANAMAN I I DI LAMINAR AIR FOLOW DAN
STERILISASI BAHAN TANAM/EKSPLANT
Tujuan Instruksional Umum
Mahasiswa dapat memahami manfaat sterilisasi bahan tanam (eksplan)
Tujuan Instruksional khusus
Setelah melakukan kegiatan ini mahasiswa mampu melakukan proses sterilisasi bahan tanam (eksplan)
Bahan dan Alat
1. Bahan :
bahan Eksplant (dapat berupa biji dan atau tanaman),
aquadest steril,
Fungisida dan Bakterisida,
HgCl2,
Sodium hipoklorit atau Klorox/bayclin,
betadine
Alkohol 70 %
2. Alat :
dissecting kit (pinset, scalpel, gunting) steril,
petridish steril,
glassware berupa beckerglass , gelas ukur steril
Dasar Teori
Sterilisasi eksplan dapat dilaksanakan dengan dua acara yaitu secara mekanik dan kimia.
a. Sterilisasi eksplan secara mekanis
Cara ini digunakan untuk eksplan yang keras atau berdaging, yaitu dengan membakar eksplan
diatas lambu spirtus sebanyak 3 kali. Eksplan yang di sterilkan dengan cara ini misalkanya biji
salak, biji kapulaga, buah anggrek, buah anturium dll.
b. Sterilisasi eksplan secara kimiawi
Sterilisasi secarakimiawi digunakan untuk eksplan yang lunak (jaringan muda) seperti daun,
tangkai daun, anther dan sebagainya. Bahan-bahan kimia yang digunakan untuk sterilisasi antara
lain:
-
Modul Kultur Jaringan
Prodi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo Madura
16
1. sodium hipoklorit (nama dagangnya bayclin) konsentrasi yang digunakan antara 5-10 %
tergantung kelunakan eksplan dengan waktu perendaman 5-10 menit. Pembuatan larutan
clorox missal dengan perbandingan 1:4 (25 ml Clorox ditambah aquades steril 100 ml
kemudian ditambah tween -20 1 tetes.
2. Mercuri klorit (nama dagang sublimat 0,05%) penggunaan bahan kimia ini harus hati-hati
karena bersifat racun. Cara perlakuan sterilisasi dengan sublimat sama dengan sterilisasi
dengan Clorox hanya waktunya lebih pendek. Bila sterilisasi terlalu lama dapat menyebabkan
kerusakan pada eksplan (berwarna coklat) sehingga ekplan tersebut tidak mampu tumbuh
menjadi kalus
3. Alkohol 70% penggunaan bahan ini sama dengan cara penggunaan bahan yang lain diatas.
Sterilisasi eksplan merupakan bagian yang paling rumit dalam proses produksi bibit melalui kultur
jaringan. Sterilisasi biasanya dilakukan dalam beberapa tahap yaitu eksplan dicuci dengan deterjen atau
bahan pencuci lain, selanjutnya direndam dalam bahan-bahan sterilan baik yang bersifat sistemik atau
desinfektan. Apabila kontaminan tetap ada maka konsentrasi dan lamanya perendaman dalam sterilan
dapat ditingkatkan. Bahan yang digunakan serta metode sterilisasi biasanya berbeda untuk setiap bahan
tanaman, sehingga bahan dan cara tersebut belum tentu berhasil apabila diaplikasikan pada bahan yang
berbeda serta waktu yang berlainan. Dengan demikian, setiap pekerjaan kultur jaringan, cara sterilisasi
eksplan harus dicoba beberapa kali.
Prosedur Kerja
A. Untuk eksplan dari batang daun, daun
1. Mengambil Eksplan tanaman yang sudah disiapkan
2. bahan eksplant dibersihkan dengan menggunakan air mengalir hingga kotoran yang menempel
hilang
3. Memotong bagian tanaman dan menjadikan eksplan
4. Merendam eksplan kedalam larutan antiseptic sebanyak 3-5 tetes membawa kedalam laminar air
flow cabinet
5. Bilas dengan air steril sebanyak 3 kali
6. Membuat larutan clorox 5% & 10%
7. Merendam eksplan kelarutan clorox 10 % selama 5 menit
8. Bilas dengan air steril sebanyak 3 kali
9. Merendam eksplan kelarutan clorox 5 % selama 10 menit
10. Bilas dengan air steril sebanyak 3 kali
11. Merendam eksplan kedalam larutan antiseptic sebanyak 3-5 tetes
12. Penanaman/ inisiasi eksplant siap dilakuakan
-
Modul Kultur Jaringan
Prodi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo Madura
17
Prosedur 3 sampai 12 dilakukan di dalam Laminar Air Flow
B. Prosedur kerja Untuk bahan tanam dari Buah anggrek
1. Mengambil biji dari tanaman yang sebelumnya sudah disiapkan
2. Biji dicuci bersih dengan sabun dan air mengalir
3. Semprot alcohol 70%
4. Simpan di Petridis steril dan bawa masuk ke LAF
5. Kegiatan didalam LAF ambil buah dan bakar di Bunsen 3 x
6. Letakkan Petridis steril yang lain kemudian buka kulit buah
7. Biji anggrek yang seperti debu ambil menggunakan scalpel steril dan dikulturkan pada botol
media yang sudah disiapkan
8. Setelah selesai proses kultur, tutup botol dan letakkan hasil kultur di rak yang tersedia
Laporan Kegiatan
-
Modul Kultur Jaringan
Prodi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo Madura
18
Kegiatan 6
AKLIMATISASI TANAMAN ANGGREK
Aklimatisasi adalah suatu proses yang terjadi pada suatu tanaman atau organisme hidup lain agar dapat
menyesuaikan diri dengan kondisi atau situasi lingkungan dan iklim yang baru dengan bantuan manusia.
Perbanyakan tanaman anggrek menggunakan teknik kultur jaringan yang hasilnya dikemas dalam botol.
Bibit tanaman anggrek dalam botol ini memiliki kondisi lingkungan yang aseptic dan kebutuhan
nutrisinya tersedia dengan cukup namun selama proses tumbuhnya dari biji menjadi tanaman selalu
dalam kondisi linkungan yang suhu, kelembaban dan sinar/cahayanya diatur didalam laboratorium dan
biasanya lebih rendah dari suhu lingkungan luar. Pemindahan bibit tanaman anggrek keluar dari botol
menuju lingkungan luar inilah yang disebut aklimatisasi. Oleh karena itu perlu dilakukan proses adaptasi
(aklimatisasi) agar tanaman secara perlahan mampu menyesuaikan dengan lingkungan yang baru dan
mampu memenuhi sendiri kebutuhan untuk pertumbuhannya.
TUJUAN :
Untuk mengetahui proses aklimatisasi bibit anggrek dan faktor-faktor yang mempengaruhinya
serta meningkatkan keterampilan mahasiswa dalam melakukan aklimatisasi anggrek.
ALAT :
Alat yang digunakan adalah pinset , penyemprot (hand sprayer) , bak plastic, pot plastic kecil (
fleksibel pot), koran bekas, gabus, potray
BAHAN :
Bahan yang digunakan adalah spagnum, bibit anggrek dalam botol, pupuk anggrek ‘Adaptan7’
(mengandung senyawa organic dan 0,07 % zpt) , fungisida ‘Dithane’.
Prosedur kerja :
A. Persiapan media :
1. Memotong gabus dengan ukuran potongan 1x1 cm (sesuai ukuran pot)
2. Mempersiapkan spagnum sebagai media tumbuh
B. Persiapan bibit :
1. Membuat larutan fungisida (1 g/L air)
2. Keluarkan bibit anggrek dari dalam botol dengan menggunakan pinset secara hati-hati
-
Modul Kultur Jaringan
Prodi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo Madura
19
3. Bersihkan bibit anggrek dari media agar-agar dalam bak plastic yang telah diisi larutan
fungisida
4. Tiriskan bibit tersebut pada alas koran bekas, bibit yang terpilih dihitung jumlah akar dan
daunnya
C. Penanaman
1. Isilah dasar fleksibel pot dengan 2-3 potongan gabus untuk membuat media tumbuh tidak
tergenang air
2. Letakkan 1-2 bibit anggrek di atas potongan gabus kemudian tambahkan spagnum sampai
permukaan fleksibel pot
3. Letakkan fleksibel pot yang telah ditanami bibit anggrek pada tray kemudian simpan di
rumah plastic (usahakan suhu lebih rendah dari lingkungan luar untuk memberi kesempatan
tanaman beradaptasi)
4. Lakukan penyiraman dengan air secukupnya menggunakan penyemprot
D. Pemeliharaan
1. Menjaga kelembaban media dengan cara melakukan penyiraman dengan air setiap hari
2. Setelah bibit berumur 1 minggu setelah tanam (sudah keluar akar baru), lakukan pemupukan
menggunakan “Adaptan7” (1 cc/L air) setiap 4 hari sekali.
-
Modul Kultur Jaringan
Prodi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo Madura
20
PETUNJUK PRAKTIKUM
KULTUR JARINGAN TANAMAN
Oleh:
Ir. Sinar Suryawati,Msi Yusy Purwaningsih, SP Yusy Purwaningsih,SP
Digunakan untuk kalangan sendiri
PRODI AGROTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS TRUNOJOYO MADURA
Nama Praktikan : ……………………………… NRP : ……………………………...