Download - KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN
![Page 1: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/1.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 1
KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN
SEKOLAH FARMASI
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
1. Groves MJ, 2006, Pharmaceutical Biotechnology, 2nd ed., CRC, Taylor & Francis, 83-1782. Kayser, O, 2001, Pharmaceutical Biotechnology, Wiley VCH, p 103
![Page 2: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/2.jpg)
Tujuan Topik
• Mahasiswa mampu menjelaskan profil /sifat/karakter protein yang mungkin digunakan untuk mengkarakterisasi protein target
• Mahasiswa mampu menjelaskan metode analisis dan memilih metode yang sesuai untuk mengkarakterisasi protein target
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan2
![Page 3: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/3.jpg)
PRODUKSI PROTEIN REKOMBINAN
untuk TERAPI (PROTEIN TERAPETIK)
Penyiapan host (kloning - TDR)
ProduksiProtein
Isolasi – Purifikasi –Karakterisasi Protein
Formulasi
BIOPROSES
(organisme hidup)
![Page 4: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/4.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 4
PRODUK REKOMBINAN
PROSES HULU(up stream)
PROSES HILIR(down stream)
PRODUKSI(FERMENTASI)
➢ Isolasi gen target
➢ Konstruksi vektorrekombinan
➢ Transformasi kesel inang
➢ Seleksi klon
➢ Pemisahan sel
➢ (lisis sel )
➢ Isolasi protein
➢ Pemekatanprotein
➢ Pemurnian
➢ Karakterisasi
➢ Formulasi
➢ Batch
➢ Fed-batch
➢ Continuous batch
![Page 5: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/5.jpg)
Profil/Karakter Protein
1. Struktur protein
– Struktur primer, sekunder, tersier, kuarterner
– Monomer, homo-mer / hetero-mer
– Modifikasi /konjugasi
(glikoprotein, lipoprotein, ribonukleoprotein,
PEGilasi-polietilen glikol)
– Domain/daerah ikatan spesifik
(Ag – Ab, protein pengikat ke reseptor atau ligantertentu
–Globul / fiber
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 5
![Page 6: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/6.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Produksi Protein Rekombinan 6
![Page 7: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/7.jpg)
Struktur Protein
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 7
![Page 8: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/8.jpg)
Struktur Protein
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 8
![Page 9: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/9.jpg)
Profil/Karakter Protein
2. Urutan protein → sekuensing protein
3. Komposisi asam amino → analisis as. amino
4. Situs pemotongan protease → peptide mapping
5. Ukuran protein
– Panjang/jumlah asam amino
– Bobot molekul (kDa) → http://web.expasy.org/compute_pi/
6. Muatan protein (pI) → http://web.expasy.org/compute_pi/
7. Hidrofilisitas/hidrofobisitas→http://web.expasy.org/protscale
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 9
![Page 10: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/10.jpg)
Sisi pemotongan protein
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Rekombinan 10
![Page 11: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/11.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 11
![Page 12: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/12.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 12
![Page 13: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/13.jpg)
Karakter Protein
8. Stabilitas (pH, T, tekanan, dll)
9. Aktivitas biologis
– enzimatik (substrat → produk)
– proteolysis/protese, hemolysis
– faktor pertumbuhan
– dll
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 13
![Page 14: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/14.jpg)
Aktivitas Biologis (hemolisis)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 14
![Page 15: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/15.jpg)
Tujuan Mengkarakterisasi Protein
• Jika sudah diketahui → uji dilakukan untuk mengkonfirmasi identitas / karakter protein target
• Jika belum diketahui → uji dilakukan untuk mengetahui karakter (karakterisasi) protein target
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 15
![Page 16: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/16.jpg)
Karakterisasi Protein
Untuk mengetahui atau mengkonfirmasi :
• Identitas protein
• Kemurnian
• Cemaran/pengotor
• Jumlah/konsentrasi protein
• Stabilitas→ untuk penyimpanan/formulasi
• Aktivitas/Potensi
• Spesifisitas pengikatan/reaksi silang
• Sterilitas
• Kontaminasi
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 16
![Page 17: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/17.jpg)
JENIS PENGOTOR (CEMARAN)TERKAIT INANG TERKAIT PROSES TERKAIT PRODUK
= VARIAN PRODUK
PROTEIN INANG KOMPONEN MEDIUM
PERTUMBUHAN
(ANTIBIOTIK)
SUBSTITUTSI / DELESI
ASAM AMINO
DNA INANG PEREAKSI PURIFIKASI AKIBAT KETIDAK
STABILAN FISIK
(PRODUK
TERDENATURASI,
AGREGAT)
ENDOTOKSIN MATERIAL KOLOM
PURIFIKASI
AKIBAT KETIDAK
STABILAN KIMIA
(PRODUK
TERDEAMIDASI,
TEROKSIDAS)
KOMPONEN LAIN DARI
SEL INANG
VARIASI GLIKOSILASI
Karakterisasi Protein 17Sekolah Farmasi ITB
![Page 18: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/18.jpg)
Karakterisasi Protein 18
USP
Sekolah Farmasi ITB
![Page 19: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/19.jpg)
Spesifikasi Farmakope (Monografi)
Sekolah Farmasi ITB Karakterisasi Protein 19
KUALITAS
KEAMANAN
EFIKASI
Spesifikasi (farmakope)
1. Identitas: kimia dan
konformasi
2. Kemurnian dan ketidak
kemurnian
3. Aktivitas biologis/potensi
Imunogenitas
Cemaran/Pengotor
Kontaminan
Identitas
Kemurnian
Aktivitas biologis/potensi
![Page 20: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/20.jpg)
KARAKTERISASI PROTEIN
1. Identitas → konfirmasi struktur / komposisi molekular
– Ukuran protein, muatan, struktur, urutan, komposisi as. amino
– Posttranslational modification (profil glikosilasi)
– Amino acid analysis, Peptide mapping, MALDI-MS, ESI – MS (electrospray ionization), koefisien extinsi, pI, struktur kristal, NMR, spektrum CD (circular dichroism), HPLC, CE, PAGE
![Page 21: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/21.jpg)
Karakterisasi Protein
2. Kemurnian dan Ketidak murnian→modifikasi ?
- Glikosilasi (hiper/hipo), ikatan disulfida (alternatif), deamidasi,
oksidasi, fosforilasi, asetilasi, sulfasi, sulfoksidasi, gamma-karboksilasi, pyroglutamat.
–Aktivitas/efikasi , toksisitas
–Peptide mapping, MS, SDS PAGE, RP-HPLC
![Page 22: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/22.jpg)
Deamidasi Amino Acid
School of Pharmacy ITB Pharm. Biotechnology-FA4202 Vaksin Rekombinan 22
![Page 23: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/23.jpg)
KARAKTERISASI PROTEIN
3. Penentuan Jumlah / Kuantifikasi Protein– Spektrometri UV, kolorimatri (Bradford, Lowry, BCA-
Bicinchoninic, biuret), Kjeldahl, Bioassay, Immunoassay
4. Stabilitas, Penyimpanan dan Sterilitas– Mempengaruhi kualitas, keamanan dan efikasi.
– Stabilitas fisik, kimia, biologi, mikrobiologi
5. Spesifisitas pengikatan dan Cross-reactivity– Produk antibodi
– Uji pengikatan, epitope mapping/kabohidrat
– In vitro + → in vivo
![Page 24: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/24.jpg)
Karakterisasi Protein (software)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 24
![Page 25: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/25.jpg)
Karakterisasi Protein (software)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 25
![Page 26: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/26.jpg)
METODE UNTUK KARAKTERISASI PROTEIN
• Metode karakterisasi tergantung pada profil/ karakter protein target
• Karakter protein → sudah diketahui / belum ?
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Vaksin Rekombinan 26
![Page 27: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/27.jpg)
![Page 28: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/28.jpg)
![Page 29: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/29.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 29
![Page 30: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/30.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 30
1. Spektrometri UV → Absorbansi pad 280nm
Absorbance of aromatic amino acid, i.e. tryptophan, tyrosine, phenylalanine
Protein tanpa atau sedikit as. Amino aromatik?
1 Abs of 280 nm = 1 mg/mL protein
2. Kolorimetri→ absorbans pada sinar tampak/→ visible 400 – 700 nm, perlu kurva standar dari protein standar yang diketahui
jumlah/konsentrasinya (mis : BSA-bovine serum albumin)* Lowry Method :Reaksi biuret : Protein (Nitrogen) + copper (II) pada kondisi basa dapat direduksisehingga mengubah Folin Ciocalteu phosphomolybdicphosphotungstic acid →heteropolymolybdenum blue
PENENTUAN KONSENTRASI PROTEIN
![Page 31: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/31.jpg)
Analisis asam amino
• Penentuan komposisi asam amino suatu protein target
• Identitas, kontaminan, modifikasi
![Page 32: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/32.jpg)
ANALISIS ASAM AMINO
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 32
![Page 33: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/33.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 33
BERDASARKAN:
1. UKURAN → SDS-PAGE, Mass Spec
2. MUATAN → ISOELEKTRIC FOCUSING
3. Kombinasi Massa dan muatan → Elektroforesis 2D, CE
4. IMMUNOASSAY → Western blot/ ELISA
KARAKTERISASI PROTEIN
![Page 34: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/34.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 34
SDS - PAGE
➢ Protein didenaturasi – oleh SDS & ß-merkaptoetanol
tujuan : protein memiliki struktur yang seragam
struktur linier
➢ Protein bermuatan negatif
➢ Pada medan listrik: protein bermigrasi ke kutub positif
➢ Jarak migrasi berdasarkan bobot molekul
➢ membutuhkan media berpori → gel poliakrilamid
![Page 35: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/35.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 35
GEL AKRILAMID
![Page 36: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/36.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 36
Sebelum penambahan SDS
Setelah penambahan SDS
Bermuatan -
Daerah hidrofob
KERJA SDS TERHADAP PROTEIN
![Page 37: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/37.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 37
PERSENTASE AKRILAMID
KAPASITAS PEMISAHAN
15% 15 – 45 kDa
12,5% 15 – 50 kDa
10% 18 – 75 kDa
7,5% 30 – 120 kDa
5% 60 – 212 kDa
RESOLUSI GEL AKRILAMID
![Page 38: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/38.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 38
A. separating gel
PERSIAPAN SDS PAGE
B. stacking gel
![Page 39: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/39.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 39
Chemsrv0.pph.univie.ac.at/methods.htm
CHAMBER SDS-PAGE
![Page 40: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/40.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 40
205 kDa
116 kDa
97 kDa
66 kDa
45 kDa
29 kDa
Pewarnaan Coomassie blue Silver (Ag) staining
LoD :
Coomassie : 36 - 47 ng Perak : 0,5 - 1,2 ng
CONTOH HASIL SDS-PAGE
![Page 41: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/41.jpg)
SDS-PAGE NON-REDUCING
• TANPA -MERCAPTOETHANOL
• IKATAN DISULFIDE TIDAK TERPOTONG
• JIKA DILAKUKAN BERSAMA DENGAN SDS PAGE REDUCING DAPAT MEMBERIKAN INFORMASI MENGENAI ADA/TIDAKNYA JEMBATAN DISULFIDA
Karakterisasi Protein 41Sekolah Farmasi ITB
![Page 42: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/42.jpg)
SDS-PAGE REDUCING DAN NON-REDUCING
Karakterisasi Protein 42Sekolah Farmasi ITB
Tereduksi Tidak tereduksi
![Page 43: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/43.jpg)
Native-PAGE
• Tanpa penambahan SDS
• Protein tidak terdenaturasi
• Non-denaturing PAGE
• Migrasi protein pada gel berdasarkan konformasi protein
Karakterisasi Protein 43Sekolah Farmasi ITB
![Page 44: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/44.jpg)
ELEKTROFORESIS
• KEMURNIAN DAN HOMOGENITAS
• DENATURASI, AGREGASI, OKSIDASI, DEAMIDASI
• SDS-PAGE NON-REDUCING : AGREGASI, OLIGOMERISASI
• KONTAMINAN
• STABILITAS PROTEIN: PERUBAHAN ASAM AMINO; HOMOGENITAS; DEAMIDASI GLUTAMIN & ASPARAGIN (LEBIH ASAM)
• GLIKOSILASI (ASAM SIALAT)
![Page 45: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/45.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 45
➢ Karakterisasi protein berdasarkan muatan totalnya
➢ Menggunakan gel akrilamid
➢ Dilakukan dengan gradient pH antara katoda dan anoda dalam larutan amfolit
➢ pI (titik isoelektrik) = pH → muatan total protein 0 →protein akan berhenti bermigrasi
ISOELECTRIC FOCUSING (IEF)
![Page 46: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/46.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 46
![Page 47: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/47.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 PRODUKSI PROTEIN SKALA BESAR 47
![Page 48: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/48.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 48
www.food.rdg.ac.uk/online/fs460/lecture4/lecture4.htm
ISOELECTRIC FOCUSING (IEF)
![Page 49: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/49.jpg)
IEF (Isoelectro Focusing)
N C
Asp (acid)Normal/WT
N C
Arg (basic)Mutan
N C
Mutan Glu (neutral)
![Page 50: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/50.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 50
ALAT ISOELECTRIC FOCUSING
![Page 51: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/51.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 51
➢ Kombinasi IEF & SDS-PAGE
➢ Untuk mengkarakterisasi/membedakan protein dengan BM sama tapi muatan berbeda
➢ Untuk mengkonfirmasi kemurnian protein
Pertama : isoelectric focusing
Kedua : SDS-PAGE
ELEKTROFORESIS 2 DIMENSI
![Page 52: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/52.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 52
ELEKTROFORESIS 2 DIMENSI
![Page 53: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/53.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 53
HASIL ELEKTROFORESIS 2D
![Page 54: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/54.jpg)
ELEKTROFORESIS KAPILER(Capillary Zone Electrophoresis)
Memisahkan protein berdasarkan rasio massa/muatan
Karakterisasi Protein 54Sekolah Farmasi ITB
![Page 55: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/55.jpg)
Maldi-Tof / Mass Spect / LC MS-MShttp://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc471/pages/Lecture23/Lecture23.html
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 55
http://theravalues.com/english/services/pro_ms.html
![Page 56: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/56.jpg)
Spektroskopi Massa(Mass Spectrometry)
❑ Penentuan berat molekul
❑ Lebih akurat dari SDS-PAGE
❑ Jumlah sampel yang dieprlukan lebih sedikit
Sekolah Farmasi ITB 56Karakterisasi Protein
![Page 57: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/57.jpg)
Berbagai metode ionisasi:
❑ Atmospheric Pressure Chemical Ionisation
(APCI)
❑ Chemical Ionisation (CI)
❑ Electron Impact (EI)
❑ Electrospray Ionisation (ESI)
❑ Fast Atom Bombardment (FAB)
❑ Field Desorption / Field Ionisation (FD/FI)
❑ Matrix Assisted Laser Desorption
Ionisation (MALDI)
❑ Thermospray Ionisation (TSP)
Sekolah Farmasi ITB 57Karakterisasi Protein
![Page 58: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/58.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Karakterisasi Protein 58
![Page 59: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/59.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Karakterisasi Protein 59
![Page 60: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/60.jpg)
Monoisotopic mass of neutral peptide Mr(calc):1099.6237
Sekolah Farmasi ITB 60Karakterisasi Protein
![Page 61: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/61.jpg)
Sekolah Farmasi ITB 61Karakterisasi Protein
![Page 62: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/62.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 62
➢ Karakterisasi protein berdasarkan reaksi imun Antigen – Antibodi
➢ Untuk mendeteksi protein spesifik dalam campuran
➢ Bisa diperoleh informasi mengenai ukuran protein menggunakan rainbow protein marker
➢ Menggunakan antibodi spesifik anti-protein target (sebagai antibodi primer)
➢ Antibodi sekunder → terkonjugasi dengan enzim untuk visualisasi
contoh : horse radish peroxidase (HRP)
alkaline phosphatase (AP)
WESTERN BLOT
![Page 63: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/63.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 63
Protein ditransfer ke membrane nitroselusosa SDS-PAGE
Dilabel dengan Ab spesifik
Visualisasi
Ab 2o
Ab 1o
Membran nitroselulosa
Protein target
AP+ Nitro blue tetrazolium (NBT)
+ 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl phosphate
(BCIP)
Ab 2o
ungu
Hasil Western Blotrainbow protein marker
![Page 64: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/64.jpg)
SDS-PAGE VS WESTERN BLOT
Karakterisasi Protein 64Sekolah Farmasi ITB
![Page 65: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/65.jpg)
ELISA = Enzyme linked immunosorbant assay
Karakterisasi Protein 65Sekolah Farmasi ITB
![Page 66: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/66.jpg)
ELISA vs WB?
Karakterisasi Protein 66Sekolah Farmasi ITB
![Page 67: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/67.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 67
• Sekuensing ujung N (10-15 asam amino pertama) – degradasi Edman
•Sekuensing ujung C – karboksi peptidase
•Pemetaan peptida - menggunakan protease
→ LC-MS/MS
KARAKTERISASI STRUKTUR PRIMER / URUTAN PROTEIN
![Page 68: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/68.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 68
N C
Sekuensing ujung amino
Pemetaan peptida
Sekuensing ujung karboksi
![Page 69: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/69.jpg)
SEKUENSING PROTEIN
• IDENTITAS
• HOMOGENITAS (mAb)
• PRODUK PROTEOLITIK
![Page 70: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/70.jpg)
PEMETAAN PEPTIDA (PEPTIDE MAPPING)
• Identitas
• Konfirmasi stabilitas genetik
• Konsistensi lot/batch produksi
• Peptida terglikosilasi (mAb)
• Perbedaan asam amino (1 atau >1)
![Page 71: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/71.jpg)
Struktur 2D/3D Protein
• Difraksi X Ray
– Diperlukan kristal protein murni → Teknik tersendiri
• NMR
– Protein kecil 25kD
• Electron Micrograph
– Resolusi rendah
• Spektra CD
Sekolah Farmasi ITB 71Karakterisasi Protein
![Page 72: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/72.jpg)
Kristalografi Sinar X
Sekolah Farmasi ITB 72Karakterisasi Protein
![Page 73: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/73.jpg)
Spektroskopi NMR (Nuclear Magnetic Resonance)
•Sampel dipaparkan pada medan magnet yang kuat
•Spin inti atom
•Penyerapan gelombang oleh inti-inti atom tertentu →
melepaskan radiasi
•H-NMR, C-NMR
Sekolah Farmasi ITB 73Karakterisasi Protein
![Page 74: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/74.jpg)
Mikroskop Elektron
Mikroskop yang menggunakan
elektron untuk memperoleh
gambaran suatu sampel →
perbesaran
Dengan perbesaran mendekati 1
juta kali (106).
Sekolah Farmasi ITB 74Karakterisasi Protein
![Page 75: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/75.jpg)
CIRCULAR DICHROISM (CD)
Spektroskopi Circular Dichroism (CD) merupakan metode optik yang dapat digunakan untuk mendeteksi dan mengkuantifikasi kiralitas dalam suatu molekul.
Dasar tersebut dapat digunakan untuk memperoleh informasi mengenai struktur sekunder dan tersier dari suatu protein.
Circular dichroism mengukur perbedaan absorpsi cahaya terpolarisasi ke kanan dan kiri.
Sekolah Farmasi ITB 75Karakterisasi Protein
![Page 76: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/76.jpg)
Sekolah Farmasi ITB 76Karakterisasi Protein
![Page 77: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/77.jpg)
Sekolah Farmasi ITB 77Karakterisasi Protein
![Page 78: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/78.jpg)
KOMBINASI KARAKTER
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan78
![Page 79: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/79.jpg)
Isolat Produsen CGTaseLab Bioteknologi Farmasi - SF ITB (2010)
E. coli LT1B
Agar Horikoshi
![Page 80: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/80.jpg)
Hidrolisis pati & Aktivitas siklisasi-β
Hidrolisis pati Siklisasi-β
I2/KI
phenolphtalin
coomassie blue
Native-PAGE
Coomassie biru
![Page 81: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/81.jpg)
Penetapan Bobot Molekul
I2/KIcoomassie blue
SDS-PAGE
97 kDa
66 kDa
45 kDa
M 1 2
![Page 82: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/82.jpg)
Spesifisitas Produk
Inte
nsi
ty (
mV
)
Retention time (min)
Standard α:β:γ-CD = 1:5:5 (μg/μL)
α-CD β-CD γ-CD
Pregelatinated1% Soluble starch
Non-pregelatinated10% Soluble starch
Non-pregelatinated1% Soluble starch
Ratio = 0 : 81 : 18Amount = 0 : 4.48 : 1.02 (μg/μL)
Ratio = 0 : 1 : 0Amount = 0 : 0.33 : 0 (μg/μL)
Ratio of α : β : γ -CyclodextrinRatio = 0 : 83 : 18Amount = 0 : 2.85 : 0.6 (μg/μL)
HPLC-Refraction Index detectorColumn : Waters Spherisorb® 5,0 µm NH2 4,6 mm x 250 mmH20 : Acetonitrile (70:30), 1.0 ml/min
![Page 83: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/83.jpg)
KuisReteplase akan diproduksi sebagai protein rekombinan. Reteplase (r-PA) adalah domain aktif human tissue plasminogen activator yang terdiri atas 357 asam amino, dengan 9 jembatan disulfida, dan pI 6.9. Agar protein dapat dimurnikan dengan kolom chitin, dipilihplasmid pYXC, dan gen disisipkan dengan enzim restriksi BamHI dan XbaI menggunakaninang S. cerevisiae. Reteplase dapat mengalami deamidasi pada asam amino Gln-21 dan Asn-267.
1. Setelah purifikasi dengan kolom chitin, protein dipotong dengan factor Xa dan fragmen dipisahkan. (a) Metode apa yang sesuai untuk memastikan kemurnianreteplase yang dihasilkan? (b) Ilustrasikan hasilnya. (c) Apa saja pengotor yang potensial ada, dan merupakan pengotor terkait apa?
Untuk reteplase sebagai API, (a) pilih metode karakterisasi yang sesuai untukmasingmasing aspek berikut, dan (b) ilustrasikan hasilnya.
1. Identitas (4 metode)
2. Kemurnian (2 metode)
3. Pengotor dengan bobot molekul lebih tinggi
4. Protein inang
5. Protein mutan
6. Protein terdeamidasi
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Vaksin Rekombinan 83
![Page 84: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/84.jpg)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Vaksin Rekombinan 84
![Page 85: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/85.jpg)
• Apa yang dimaksud dengan splicing dan di mana proses tersebut terjadi? Apakah proses splicing terjadi di semua sel ? Apa implikasi proses tersebut dalam kloning gen
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Vaksin Rekombinan 85
![Page 86: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/86.jpg)
• Pada sistem operon Lac dimana laktosa berlaku sebagai induser, apa yang terjadi jika sel yang memiliki sistem tersebut ditumbuhkan pada kondisi (A) media tanpa laktosa dan (B) media dengan laktosa? Apa yang terjadi pada sel untuk kondisi A dan B jika urutan operator dimutasi?
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Vaksin Rekombinan 86
![Page 87: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/87.jpg)
• Bila kita akan menghasilkan protein rekombinan yang gen pengkodenya terdiri atas tiga ekson dan dua intron, bagaimana cara kita membuat DNA sisipannya? Jelaskan!
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Vaksin Rekombinan 87
![Page 88: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/88.jpg)
• Bila kita akan menghasilkan protein rekombinan di ragi, vektor apa yang digunakan? Jelaskan mengapa demikian?
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Vaksin Rekombinan 88
![Page 89: KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022020910/620080d93ead5a2a2e5f25c9/html5/thumbnails/89.jpg)
• Bila protein yang akan dipurifikasi mempunyai muatan total negatif, bersifat hidrofil dan berukuran 54 kDa, sistem purifikasi apa yang saudara akan gunakan untuk memperoleh protein murni?
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Vaksin Rekombinan 89