Interpretácia výsledkov analýzy krvných buniek rutinnou prietokovou cytometriou
Marián Bobovčák ([email protected])Klinické laboratórium VÚPCH-VVZ a.s., Nová Polianka - Vysoké Tatry
Seminár Poprad – jún 2013
Aplikačné oblasti Prietokovej cytometrie (FC) v klinickej diagnostike
ČO JE MOŽNÉ MERAŤ – FC:Bunky, častice (1-100 um)fluorescsenčné značenie (fluorochróm)meranie jednotlivej častice- protilátky (značenie)- farbiváMolekuly -povrchové-intracelulárne-subcelulárne štruktúry-solubilnéAnalýza časticových populácií-povrchová a IC expresia-kvantifikáciafunkčné prejavy-metabolizmus, chemizmus-aktivácia, proliferácia, apoptóza-vitalita-kolokalizácia molekúl-prenos signálov... -humorálne faktory....kombinácia parametrov !Vzorky-periférna krv , izolované bunky,-tkanivové kultúry, BAL, punktáty, -kostná dreň, CSF, moč, -L. uzliny, solídne tkanivá.... -atď
- Hematológia (onkológia, anémie, -pénie ...)
- Imunológia a alergológia (fenotypizácia a funkcia imunocytov)
- Transplantológia, bunková terapia - Infektológia a interná medicína - DNA analýza – solídne nádory- Genetika a reprodukčná medicína- Mikrobiológia- klinický výskum
Interpretácia:- analýza dát cytometrickým softwarom- interpretácia klinicko diagnostická
Základné časti prietokového cytometra
1-3 SS – bočný rozptyl
FW – priamy rozptyl
Fluorescencie5-8 (36)
Základné parametre merané v klinickej prietokovej cytometrii.
Bunka FW – priamy rozptyl svetla= cca VEĽKOSŤ bunky Ly<Mo<Gra
SS – bočný rozptyl svetla= GRANULARITA bunky Ly<Mo<Gra
FL1 FL2 FL3 ... atď
Povrchové molekuly
Monochromatické svetlo, laser
FL1
FL2
Cytogramy
+ +
+ -- -
- +
CD3
HLA DR
1 10 100 1000
1000
100
10
LymfoFL2
FL3Aj negatívna expresia = významný znak ! Intenzita expresie= počet molekúl
Intenzita
Monoklonálne protilátky značené fluorescenčne
Monocyty
Granulocyty
RT-SSC RT-SSC
CD3+ T-Lymfocyty
CD3+ 8+ 4- CD3+ 8+ 4+
CD3+ 8- 4+CD3+ 8- 4-
CD3+ 4+Lymfo-Helpery
FW
SS
Ly
Mo Gra
Multiparametrová analýza periférnej krvi – cytometrická analýza tzv. „gating“trojfarebná kombinácia protilátok antiCD4-FITC, antiCD8-PE, antiCD3-PE-Cyanin5.
Lymfocyty
Granularita
Veľ
kosť
Aby sme mohli výsledky analýzy krvi interpretovať -základné imunocyty - bunky imunitného systému – funkcia - vzťahy
Vrodená imunita
Monocyty -Makrofágy
Dendritické b.
NK bunky
Most Vrodené - Získané
Získaná imunita
Neutrofily, Eo
Fagocytóza, Komplementzabíjanie mikróbov
chemokíny, lyzozým,metabolické vzplanutie
Defragmentácia rozloženie
makromolekúl: tvorba antigénov
Cytokíny
Protilátky, opsonizácia
Prezentácia antigénu
NKT bunky
Blymfocyty
Tlymfocyty
Plazmocyty
Th, Tc, Treg...etclymfocyty
Imunitná odpoveď v periférnej krvi neprebieha !V periférnej krvi - odraz niekde prebiehajúcej lokálnej odpovede (krivé zrkadlo)
Normálna IO prebieha lokálne:-v sekundárnych lymfatických orgánoch – slezina, LU
(miesto kooperácie imunocytov)- v slizniciach - GALT, BALT, - v tkanivách
Vzorky na analýzu:BALVýpotkysynoviálna tekutina CSFPunktáty LU
GALTPayerove plakyApendixsubmukóza
Slezina
LU
Waldeyer kruh• tonsily• adenoidné tk.
BALT
Primárne lymfoidné orgány
Sekundárne:• Lymfatické uzliny• slezina
Lymfatické tkanivá v slizniciach (MALT)
Genitálny trakt
Týmus
Kostná dreň
CD systém Cluster of DifferentiationHLDA - leukocyty 8. workshop zaradené do
HCDM - Human Cell Differentiation Molecules – HDCM 9 Barcelona cez 360 molekúl www.hcdm.org
Prítomnosť leukocytov v periférnej krvi zdravých – líniové markery
Myelomonocytárny rad Lymfoidný rad - lymfocyty
Pluripotentná kmeňová bunkaKostná dreň
Lymf. uzlina
Tkanivo
Progenitory
Periférnakrv
NeuCD16+
BazoCD203c+
EoCD16-
MonocytyCD14+
ErytrocytyTrombocyty
Dendritické bunky
Makrofág-Akt. MF
AktiváciaCD16+
HLA DR+
granulocyty
Tr.B
zrelá BCD19+
Plazmocyt
T CD3+ =
T helper CD3+4+
subpopulácie, naivné, efektory, pamäťové, aktivované
CTL CD3+8+
T Reg...
NK CD3- CD16+-56+-
NKT CD3+
CD34+
Pan Leu CD45+
Čo hľadáme vo výsledku FC pri fenotypizácii leukocytov.
Deficit určitej subpopulácie leukocytov, ktorá je normálne prítomná(vyšetrujeme pokiaľ možno mimo akútneho ochorenia a opakovane – aj pol roka)1. primárny (najčastejšie kombinovaný, CVID) 2. sekundárny získaný a/alebo spojený s akútnym či chronickým ochorením.- deficit početný - chýbanie, redukcia počtu subpopulácie- deficit molekuly, receptora, funkčný deficit....
Prebytok určitej subpopulácie (relatívny, absolútny)- významný - klonalita, nezvyčajné znaky- prítomnosť aktivovaných buniek - zvýšenie expresie molekuly (akt. znaku CD16, CD25, HLADR)
(mono-makrofágy, aktivované T)
V periférnej krvi - odraz (krivé zrkadlo) prebiehajúcej lokálnej odpovede- veľmi zriedka proliferujúce bunky (mimo onkologických ochorení)
- možno nájsť aktivované bunky - žiadne, málo, buniek typu CD34+, dendritické bunky, plazmocyty
Nezvyčajný obraz analýzy (vzhľad populácie, nezvyčajné znaky napr. leukémie, proliferujúce bunky, apoptóza...)
Čo hľadáme vo výsledku FC pri fenotypizácii leukocytov.
Početné zastúpenie populácií: lymfocyty Th,Tc, B, NK, NKT (cca100%)- relatívne zastúpenie % populácie v rámci lymfocytov, - regulačné pomery,ak nejde o primárny deficit populácie, alterácie sa objavujú pri perzistujúcich infekciách, ochoreniach s imunopatogenetickým pozadím. IRI= T-CD4/T-CD8 (1-2,5)IRI: zníženie HIV (abs), Herpes vírusy, CMV, EBV,VZV (rel, nárast CD8)
Zníženie T a B, nie NK – Influenza (abs) Bakteriálne infekcie vnútorné (SPA, klebsiela, ) nárast CD4(rel)TBC, intracelulárne infekcie,granulomatózy, zníženie T CD4 (rel), zvýšenie NKTBakteriálne superficiálne infekcie len malé zmeny v T populáciách
- absolútne počty (aj keď je populácie relatívne málo (deficit) – abs. počet postačuje)
V každej krvi - zdravého jedinca sa nachádzajú subpopulácie subpopulácií !(napr. CD3 - naivné, pamäťové bunky, špecifické a nešpecifické efektory T, NK, funkčne odlišné populácie) špecifický klon predstavuje 1-10-tky buniek / ul krvi
Špecifické celulárne deficiencie je často ťažké odlíšiť od efektu infekčných agensna IS , zmeny v populáciách môžu pretrvávať mesiace (herpetické vírusy)
Zmeny v subpopuláciách sprevádzajú infekcie, vakcináciu, terapiu – nie sú diagnostické!Nie je vždy možné určiť či zmeny v populáciách = imunodeficiencia / imunitná odpoveď
Aké protilátky (základné líniové znaky) vybrať pre rutinný protokol FC
CD45: pan Leu marker – na rozlíšenie non Leu buniek a debris
Anti: CD45, CD3, CD4, CD8, CD19, CD 16 (56), HLA-DRNajlepšie v rámci 1skúmavky – teoreticky 2n populácií (n=počet znakov)
CD3+(CD19-CD16-) : všetky populácie T lymfocytov a NKT bunky (16+56)CD3+4+8-(16-) : T helperické ly. (bunka reguluje IO, HIV) , NKT (16+56)CD3+4-8+(16-) : T cytotoxické ly. (nádory, autotolerancia), NKT (16+56) CD3+4+8+(16-): T nezrelé ly. (malé deti, posun z LO)CD3+ 4-8-(16-) : T d. neg ly. (TCR gama/delta a iné, napr intracel. parazity, TBC)CD3+DR+ : Aktivované T lymfocyty (efektorové bunky)
CD19+ DR+ (CD3-4-8-16- ) : všetky populácie B lymfocytov (tvorba protilátok)
CD16+56+(CD3- 8+dim 80% ) : NK bunky (vírusy, nádory, im. dohľad)
CD3+ CD16+-56+- CD8+ - CD4+-) : NKT bunky funkcia NK, funkcia T - IFNg
Lymfocyty
Aké protilátky (základné líniové znaky) vybrať pre rutinný protokol FC Anti: CD45, CD3, CD4, CD8, CD19, CD 16 (56), HLA-DR
Monocyty CD14+ a Granulocyty CD16+-nie len lymfocytom je potrebné venovať pozornosť pri rutinnej analýze !
Monocyty 45+14+ >SS ako Ly, CD4 dimm, HLADR, CD16+ aktivované makrofágy
Granulocyty >SS ako Mono, > FS, 45+14± , CD16+ Neutrofily CD16- Eozinofily
Granulo
Aké protilátky (základné líniové znaky) vybrať pre rutinný protokol FC
Monocyty a Granulocyty potrebné venovať pozornosť pri rutinnej analýze !
CD16 CD16
SSSS
Aktivované Mono CD16+
Monocyty
Lymfocyty
Neutrofily CD16+
Eozinofily CD16-
Rutinný protokol fenotypizácie periférnej krvi (CD4, 19/CD8,16/CD3/CD45)
Leukocyty
Debris
LyMo Gra Neutrofily
Eozinofily
Th, NKT
Tc, NKT
B
Th, NKT
Tc, NKT
NK
NK
BCD3+4+8+
CD3+4-8-
CD3+4-8+
CD3+4+8-
Gate z CD3 buniek
CD4
SS
CD16
SS
CD4CD19
CD3
CD8CD16
CD4
CD8CD3
CD45
Rutinný protokol fenotypizácie periférnej krvi -pokračovanie
Aktivovanémonocyty CD16+
Všetky T bunkyvčítane NKT
CD16
CD3 FS
SS
Koľko je NKT buniek v zdravej periférnej krvi (CD16+56 /CD45/ CD3/CD4)
Th,NKT
Tc,NKT
NK NKT
TB
NK, B
Populácia NKT buniek v zdravej periférnej krvi - subpopulácie
NKT (subtypy) : cca 5% z Lymfo, zvýšené napr. TBC, ADCC cytotoxická odpoveď podobne ako NK, Ne, Mf, Eo (CD16)TCR -aktivácia na glyko/lipidy- prezentoavné cez CD1d (baktérie TBC, kvasinky), silná produkcia IFN gama, IL4 ....
CD16
CD3
CD8
CD4 CD4
CD8
Kazuistika
Pacientka 33 r. v poslednom roku opakovane liečená pre obojstranné otitídy,Prijatá do VUPCH pod obrazom atypickej pneumónie s interlobárnou reakciou a subfebrilitami, Gastritída.Laboratórne. : mierna anémia HG, Ery, Tr-pénia Fe norm. CRP 300 postupne klesá , FW1- 60, mierna leukopénia (3,7), Leu diff posun ku GRA 70% ( mierna lymfopénia 22%). Anti TB ,T-SPOTTB negat, diméry negat. Odobraná mikrobiológia a inf. serológia. Prietoková cytometriaIg(G/A/M) opakovane na hranici detekcie
= indikované vyšetrenie subpopulácií B lymfocytov
Kazuistika - rutinná fenotypizácia leukocytov
BAktivované
MonoNKTh Tc
Kazuistika – subpopulácie B lymfocytov
Kazuistika – subpopulácie B lymfocytov
CD 27
Naivné B lymf: 60,5%
B lymf. marginal zóny: 15,3%
Zdravý dárca
Izotypovo prepnuté pamäťové B lymf.: 21,3%
IgDZáver: pravdepodobný CVID
porucha expresie CD40L?prípadne iný genetický defekt
Odoslanie na imunologické konzíliumna navrhutie iv IgG suplementácie
Pacient:
Príklad HIV + pacientPacient – HIV+ hepatopatia, oportúnne infekcie TBC, kandidóza, anémia
Th 4,2% (19) Tc 51,1% (231)
452 517 6876
Príklad - Deficit CD16 na neutrofiloch (výskum Eo symbicort AB)
CD16 (NK, Mf, Ne) la FcRIII pre IgG – efektorové funkcie, fagocytóza opsoniz.častíc a IK, ADCC. Deficiencia je pravdepodobne kompenzovaná CD34, CD64 – bez dopadu na IO.Alely NA1, NA2, NA null – v kavkazkej populácii gén frekvencia 0,0274 (NAIN neonatal alloimunne neutropenia)
Pri absencii molekuly nutné použiť rôzne klony protilátok – genetické testy, RT PCR atď.
Ly akt.MoNeu CD16+
Eo CD16-
Normálny nález
Ly akt.Mo
Gra CD16-
Príklad akútne vírusové ochorenie (influenza)
Príklad Bronchiálna Astma exacerbácia - Eozinofily
Eozinofily
Neočakávané nálezy - príklad B-CLL
B
CD19
CD5
CD34
1000
100
10
1 10 100 10001 10 100 1000
CD19
CD5 CD14
HLA DRLymfo Ly-Mo
LEU
CD34 hematopoeticképrekurzory 0.1-0.5 %
Leukémie CD5, CD19, HLA DR,CD 13,14 screening (CD19+5+ Autoimunita)
1.5%
Neočakávané nálezy – onko hematológia - klonalita
1000
100
10
CD56+ 43%
CD38+ 95 %
CD19 vs CD20
FS vs SS
Lymfocyty
Plazmocyty
Plazmatické bunky fenotyp: CD45dim(100% ),CD38+(95% ), CD56+(43%), CD16-, CD19-,CD20-,HLADR-,CD3-,CD14-,kappa+, paraproteín, proliferácia
Neočakávané nálezy – pleurálny punktát aj periférna krv
Hematológia - počítanie RTC, eozinofilov a bazofilov
ErytrocytyRetikulocyty
Leukocyty
TrombocytyCD203c PE
SS
FL1
FL2
RNA+ThiazolOr- FL1
AutofluorescenciaEozinofily
Retikulárne Trombocyty
RTC + maturačný index
CD3
HLA DR MoCD4
CD25 CD45RA
CD4
CD69
Lymfo Lymfo
CD16
Leu CD45RA
Lymfo
CD45RO
CD4+LymfoCD14 Mono
CD3+DR+ Aktivov.T lymfo 8-15% 85-255b/ul
CD25+ Ly,Mo ( IL2R,)Včasná aktivácia
CD45RA+4+ naive,virgin32-49% 173-620 b/ul
CD69 Ly,Mo - de novoVčasná aktivácia (AIM)
CD14+16+ Aktiv.Mono -MF>15% v subklinickom štádiu
CD45RO+RA- memoryprimované Ag
BAL – flow cytometry
FW
SS
FW
SSLy
Mo Gra
Perif.Krv
BAL
CD45
CD3 CD4
CD3
Celulárny profil v BAL - a diagnóza
LymfocytózaLymfocytárna alveolitis
Sarkoidóza EAA
BeryliózaTBC , HIV , Virová BP
Polieková AlveolitisAlveolárna proteinóza
KolagenózyPneumokoniózy
Bronchiolitis obliteransLymfangiosis Ca
Neutrofília
Idiopat.pľ.fibrózaPneumónie-infekt
ARDSKolagenózy
Wegener.GranulomatózaPneumokonióza
Eozinofília
Eozinifilná pneumóniaChurg-Strauss-Syn.
Hyper Eoz.Syn.Alerg. BP aspergilóza
Idiopat.pľ.fibrózaLieky
Asthma bronchiale
Normálny nález / 80-90%AM /fajčiari/vylučuje:
Aktívnu Sarkoidózu Aktívnu EAA
BeryliózuEozinifilná pneumóniaAlveolárna proteinózaAlveolárna hemorágia
CD4/CD8zvýšenýzníženýnormálny (2,4 ±1,4)
Azbest
Ďakujem za pozornosť a trpezlivosť
Krajšie ako hory,sú hory, v ktorých som ešte nebol.