Institut für Lebensmittel- und
Bioverfahrenstechnik
Untersuchung von Nährmedien zur Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des biotechnologischen Herstellung des kommensalen kommensalen Escherichia coli Escherichia coli L2000L2000
Diplomarbeit
Sören Werner
Betreuer: Prof. Dr. rer. nat. habil. Th. BleyProf. Dr.-Ing. D. EiblDr. rer. nat. D. Grimmecke
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04/11/23
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EinleitungEinleitung
TheorieTheorie
Material und Material und MethodenMethoden
ErgebnisseErgebnisse
FazitFazit
• Escherichia coli Wildstamm mit weitestgehend unbekannter Physiologie
• Bisher identifizierte Eigenschaften liefern Anhaltspunkte für eine mögliche probiotische Nutzung zur Prävention und Akutbehandlung entzündlicher Darmerkrankungen
• Gestiegene Anzahl antibiotikaresistenter Krankheitserreger stärkt das Marktpotential probiotischer Pharmakons in Human- und Veterinärmedizin
• Zusätzlich sind Nebenwirkungen von Antibiotika unerwünscht
Ziel → Kultivierung des Stammes mit einer hohen Zelldichte und einer Anpassung an das Milieu „Verdauungstrakt“
1 Einleitung
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FazitFazit
Escherischia coli
• Fakultativ anaerobes, gramnegatives, stäbchenförmiges, nichtsporenbildendes und peritrisch begeißeltes Bakterium aus der Familie der Enterobacteriaceae
• Medizinische Mikrobiologie unterscheidet kommensale, nichtpathogene und pathogene Stämme
• Diagnostische Differenzierung beruht auf der serologischen Einteilung von Kauffmann nach O-, H- und K-Antigen
2 Theoretischer Überblick
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FazitFazit
Wachstum von E. coli
• Heterotrophe Mikroorganismen → Energie aus Oxidation energiereicher
organischer Verbindungen
• Bei E. coli Kohlenhydrate, organische Säuren oder Aminosäuren als Energie- und Kohlenstoffquelle
• Ammoniumverbindungen oder Aminosäuren als Stickstoffquelle
• Makroelemente wie Magnesium, Kalium, Eisen und Phosphor essentiell
• Mikroelemente wie Bor, Mangan, Kupfer, Cobalt, Molybdän in spezifischen Funktionen
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FazitFazit
Stressantwort von E. coli
• Allgemeine Stressantwort geregelt durch alternativen -Faktor S→ veränderte RNA-Synthese
• Säurestressantwort durch Bildung biogener Amine aus korrespondierenden Aminosäuren →dadurch Verbrauch eines Wasserstoffions
• Aminosäure/Amin-Paare: Glutaminsäure/-Aminobuttersäure (GABA), Arginin/Agmatin/Putrescin, Ornithin/Putrescin und Lysin/Cadaverin
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Kultivierungen
• Komplexes Nährmedium (Pepton) anaerob in Schüttelkultur (37 °C, 150 rpm, pH-ungeregelt)
• Komplexes Nährmedium (Pepton, LB) aerob im 15L Bioreaktor von Braun (37 °C, 400-800 rpm, 1-2 vvm, pH 6,8)
• Wachstum, Substratverbrauch und Produktbildung aufgezeichnet
• Bildung biogener Amine als Zeichen der Stressadaption durch HPLC-Analyse ermittelt
→ Physiologie in Bezug auf Stressantwort und Wachstum
• Nach Medienoptimierung Validierung des Mineralmediums durch Versuche in Analogie zu Komplexmedium
3 Material und Methoden
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Medienoptimierung
• Ableitung chemisch definiertes Mineralmedium aus Erkenntnissen von Wachstumsversuchen und Literaturangaben
• Optimierung in einem Mikrotiterplattenphotometer (Thermo Electron)
• Mineralmedium aus Glucose, Ammoniumchlorid, Phosphatpuffer, Magnesiumsulfat und Spurenelementen
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Analysen
• Zellzahl und Biotrockenmassekonzentration über Korrelation zur optischen Dichte ermittelt
• Medienbestandteile mit Bioprofile 300 (Nova Biomedical) untersucht
• Konzentration biogener Amine und korrespondierender Aminosäuren mittels HPLC (Dionex) bestimmt
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FazitFazit
Komplexmedium anaerob
• Wachstum bis zu einer Zelldichte von 0,35 g·L-1
• pH-Wert sinkt auf 4,0
• Glucoseverbrauch von insgesamt 2,5 g·L-1 (teils auch nach Wachstumsstop)
→ Metabolismusaktivität
• Acetat- und Ethanolausschüttung (1,3 g·L-1 bzw. 0,35 g·L-1) auch nach Wachstumsstop
• Aminausschüttung equimolar und zeitgleich zu Aufnahme von Aminosäuren als Zeichen der Säurestressantwort
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Komplexmedium aerob
• Wachstum bis zu einer Zelldichte von 2,5 g·L-1
• pH-Wert geregelt (pH 6,8)
• Hohe Acetatausschüttung (1,3 g·L-1) trotz ausreichender Sauerstoffsättigung aufgrund hoher Glucosekonzentration (36 g·L-1)
• Ausschüttung von Cadaverin und Putrescin trotz physiologischem pH-Wert
• Keine Bildung von -Aminobuttersäure und Agmatin
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Medienentwicklung und -optimierung
• pH-Wert ungeregelt
• optimales Wachstum bei Glucosekonzentration von 7,2 g·L-1
• Ammoniumchlorid als bevorzugte Stickstoffquelle
• Aminosäuren mit teils negativen Auswirkungen
• Zugabe von Vitaminen nahezu ohne Einfluss auf Wachstum
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FazitFazit
Mineralmedium anaerob
• Wachstum bis zu einer Zelldichte von ca. 0,15 g·L-1
• pH-Wert sinkt auf 4,0
• Keine Stressantwort in Form von biogenen Aminen nachweisbar
→ unbekannte Cofaktoren müssen analysiert werden
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4 Ergebnisse
Mineralmedium aerob
• Wachstum bis zu einer Zelldichte von 5 g·L-1
• pH-Wert geregelt (pH 6,8)
• Kaum Acetatausschüttung
• Vollständiger Verbrauch von Glucose (7,2 g·L-1)
• Parameter: µmax=0,79 h-1 , YX/Gluc=0,76 g·g-1, KGluc=0,003 g·L-1, YX/NH4+=0,13
g·mmol-1
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Aerobe fed-batch-Strategie
• Wachstum bis zu einer Zelldichte von 60 g·L-1
• pH-Wert geregelt (pH 6,8)
• Acetatausschüttung bei Limitierung durch Sulfatmangel (Stunde 18)
• Ausschüttung von Cadaverin, Putrescin und -Aminobuttersäure trotz physiologischem pH-Wert
→ teilweise konstitutive Bildung
• Weitere Parameter: YX/PO43+=3,55 g·mmol-1, YX/SO4
2+=14 g·mmol-1
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FazitFazit
5 Fazit
Zusammenfassung
• Ausgeprägte Stressantwort durch Biosynthese biogener Amine im Komplexmedium unter anaeroben, nicht pH-geregelten Bedingungen
• Aufnahme von Aminosäure und Export der korrespondierenden Amine nahezu equimolar und zeitgleich
• Unter aeroben, pH-konstanten Bedingungen keine Beziehung
• Medienoptimierung im Mikrotiterplattenphotometer ist ressourcenschonend
• Optimale Glucosekonzentration 7,2 g·L-1
• Mineralmedium mit gutem aerobem Wachstum
• Säurestressantwort auch bei Zugabe der benötigten Precursoren kaum vorhanden
• Bei höheren Zelldichten (fed-batch bis 60 g·L-1) unter pH-konstanten Bedingungen Bildung von Aminen
→ teils konstitutiver Charakter
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Material und Material und MethodenMethoden
ErgebnisseErgebnisse
FazitFazit
Ausblick
• Säurestressantwort im Mineralmedium
• Assay zur Bestimmung der allgemeinen Stressantwort (s)
• Vitalitätsbestimmung
• Verbesserte Prozessführung mit online-Messung
5 Fazit
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