Download - Informe 2 Fcgs Reconocimiento de Metabolitos
Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímica
Curso:
FARMACOGNOSIA
Profesor:
HERRERA HERNANDEZ, NORA
Tema:
Horario:
G1 -- Martes de 11:20am a 1:00pm
Integrantes:
- MALPARTIDA ORÉ, KELLY
- PIZARRO VENTOCILLA, DAMARIS
- AROSTEGUI BACA, MARINA
-2011-
INTRODUCCIÓN
Este trabajo se realizó esencialmente para reconocer los diferentes
metabolitos secundarios, de diversas plantas mediante pruebas químicas. En
cada una de las muestras se realizaron diferentes pruebas de acuerdo al
metabolito que contenían.
Para saber que reactivo específico se debe usar en cada tipo de metabolito
para su reconocimiento, se tuvo un conocimiento previo de la estructura
molecular de cada metabolito diferente que contenía la muestra, y también de
la planta que lo contiene. Teniendo en cuenta todos estos datos se concluyó
satisfactoriamente la práctica.
Para esta prueba también se tuvo métodos de extracción, para cada muestra
diferente, ya que sin este procedimiento necesario no se podría identificar
ningún metabolito.
OBJETIVO
Identificar y clasificar los diferentes metabolitos secundarios presentes en el
tejido vegetal de diferentes especies vegetales, por medio de pruebas
químicas de coloración y precipitación.
MARCO TEORICO
Desde la antigüedad se usan a las plantas por la actividad terapéutica que
poseen, sin embargo no se sabia las causas de ese efecto. Ahora en la
actualidad con el avance científico, estos se conocen tanto por su actividad y
estructura. En Estados Unidos por ejemplo el 25% de las recetas medicas,
contienen medicamentos cuyos principios activos son derivados de plantas.1
Un gran porcentaje de principios activos están comprendidos dentro de los
llamados metabolitos secundarios, estos son sintetizados en la planta, y tienen
una estructura molecular compleja.1Estos metabolitos secundarios cumplen
una función específica en la planta así como: la función de la clorofila sirve para
la captación de luz y los aceites esenciales para la polinización y control de
plagas.2
Los metabolitos secundarios se originan luego de las rutas metabólicas
básicas, Las propiedades químicas de los diferentes compuestos de los
metabolitos secundarios se basan esencialmente en su estructura química y
grupo funcional que poseen dichos compuestos. Así los terpenos pueden
presentarse como alcoholes (mentol), éteres (cineol), cetona (carvona), etc., y
estos a su vez tienen propiedades químicas similares a los terpenoides.5
Alcaloides:
Son sustancias orgánicas, que proceden principalmente del metabolismo
secundario. Se forman a partir de los aminoácidos. Los principales productores
de alcaloides son las plantas, las principales familias que lo contienen son:
Solanáceas, Papaveráceas, Rubiáceas, Apocináceas. También se pueden
encontrar en bacterias e insectos.5
La detección de alcaloides se clasifica en 3:4
1. Reacciones de precipitación: Combinación de alcaloides con metales
pesados en medio acido.
Ácidos de elevado peso molecular: Ac. Fosfowolfrámico, ac.
Silicowolfrámico, ac. Fosfomolibdénico.
Reactivos yodados: reactivo de Valser y Meyers, reactivo de Wagner,
reactivo de Dragendorff y otros.
2. Reacciones de cristalización: acido pícrico, cloruro y bromuro úrico y
cloruro de mercurio.
3. Reacciones coloreadas: reacciones de deshidratación con H2SO4,
oxidación con HNO3, KMnO4.
Reactivo de Vitali – Morín: Detecta alcaloides tropánicos y produce
una coloración violeta.
Reactivo de Van Urk: p-dimetilaminobenzaldehido. Detecta alcaloides
con el núcleo de ergolina. Produce coloración azul.
Raactivo de Oberlin – Zeisel: Detecta protolonas.
Flavonoides:
Los Flavonoides son grupos relacionados a los antocianos, catequinas y
leucontocianidinas.4Se conocen diez clases de Flavonoides y todos tienen un
núcleo básico formado por quince carbonos, son estructuras del tipo C6-C3-C6
con dos anillos aromáticos.1
Este compuesto se identifica generalmente por cromatografía de capa fina
(CCF) y revelado UV.4
Saponinas:
Son compuestos tensoactivos naturales. Para identificarlas solo se agita la
solución acuosa y se observa la formación de espuma. Las saponinas se
clasifican de acuerdo a la naturaleza del aglicón:
Las que tienen aglicón triterpenico se denominan saponinas triterpénicas y
las que lo tienen con estructura esteroídica se denominan saponinas
esteroídica.4
Cumarinas:
Son metabolitos secundarios ampliamente difundido en el reino vegetal. Las
familias que poseen gran cantidad de Cumarinas son las Fabáceas,
Rubiáceas, Rutáceas, Asteráceas, umbelíferas, Apocináceas y compuestos.
También se encuentran en ciertos hongos del genero Aspergillus.4
Para su identificación; Estas producen fluorescencia bajo la luz UV. Sin
embargo hay falsos positivos como son los compuestos lactónicos
(cardiotónicos, terpenlactonas).2
Taninos:
Los taninos están constituidos por un amplio grupo de compuestos
hidrosolubles con estructura polifenólica, capaces de precipitar ciertas
macromoléculas (proteínas, alcaloides, celulosa, gelatina).4
Su identificación consiste, en una solución acuo-alcohólica al añadir cloruro
férrico producen diferentes coloraciones y precipitan las proteínas.
Antocianina:
Las antocianinas son compuestos fenólicos que se encuentran principalmente
en frutos, flores y hojas de las plantas, y son las responsables de conferir los
colores rojos, azul, violeta. Se sintetizan a partir de la conversión de los
precursores fenilalanina y acetato, vía el metabolismo del fenil propanoide , y
se acumulan en las vacuolas de las células hipodermales. Su estructura
corresponde a heterociclos formados por la combinación de una aglicona o un
azúcar.6
MÉTODO EXPERIMENTAL
Equipos:
Centrífuga
Balanza digital
Materiales:
Papel de filtro
Matraz erlenmeyer
Cuchillo
Probeta x 100 mL
Pipeta x 5 mL
Mortero
Tubos de ensayos
Reactivos:
HCl al 5%
Urea 10 M
FeCl3 al 10%
Ácido sulfúrico al 50%
Solución de NaOH al 5% con
amoníaco al 2%
Reactivo de Dragendorff,
Mayer y Wagner
Reactivo gelatina – sal
Reactivo Kedde, soluciones
A y B
ETOH
Diclorometano
Benceno
Anhidrido acético
Ácido sulfúrico concentrado
Äcido clorhídrico concentrado
Muestras biológicas:
Llanten --Plantago major
Uvas --Vitis vinifera
Hojas de tabaco --Nicotiana
tabacum
Soja-- Glycine max
Petalos de rosas --Rosa
gallica
Sabila --Aloe vera
Manzanilla – Matricaria
recutita
PROCEDIMIENTO:
EXPERIENCIA 1: IDENTIFICACIÓN DE ALCALOIDES
Muestra: Nicotiana tabacum
Desmenuzar en un mortero x gr de la muestra fresca y colocarlos en un matraz
erlenmeyer. Lo mismo realizar con la muestra seca.
- Adicionar un volumen suficiente de HCL al 5%, para que toda la
muestra este en contacto con la solución ácida. (Ambas muestras).
Calentar con agitación en baño maría por 5 minutos, enfriar y filtrar. (Ambas
muestras).
- Colocar 1ml de la solución en 3 tubos de ensayo y añadir 2 gotas de reactivo:
Dragendorff Mayer Wagner
EXPERIENCIA2: IDENTIFICACIÓN DE FLAVONOIDES Y ANTOCIANIDINAS
Muestra: Vitis vinifera
- Colocar x gr de la muestra desmenuzada en un matraz erlenmeyer.
- Añadir un volumen suficiente de etanol que cubra toda la muestre y le de fluidez.
- Calentar en baño maría durante 5 minutos luego enfriar y filtrar.
ENSAYO FLAVONOIDES
- Colocar 1 limadura de magnesio en un tubo de ensayo y 2 ml del filtrado, dejar caer varias gotas de HCL concentrado en zona.
ENSAYO PARA LEUCOANTOCIANIDINAS
-Colocar en un tubo de ensayos 2 mL del filtrado más 1 mL de HCl
concentrado, calentar en baño de agua hirviendo durante 15 minutos. La
aparición de coloraciones rojas es prueba positiva de la existencia de
leucoantocianidinas en la muestra.
EXPERIENCIA3: IDENTIFICACIÓN DE SAPONINAS
Muestra: Aloe vera
- En un mortero desmenuzamos 10g de muestra fresca con unos ml de agua.
Filtramos,
MUESTRA (ALOE VERA)
MOLER LA MUESTRA
FILTRAR
En un tubo de ensayo tapado, agitamos 4 ml del filtrado acuoso durante 1min.
EXPERIENCIA 4: IDENTIFICACIÓN DE TANINOS
Muestra: Plantago major
- E n un mortero desmenuzarmos 10g de la muestra fresca con unos ml de
agua.
Filtramos y colocamos en un tubo de ensayo 1ml del filtrado y un 1 ml de
reactivo gelatina- salluego añadimos 2 a 3 gotas de solución de FeCl3 al10 %.
EXPERIENCIA 5: IDENTIFICACIÓN DE ESTEROIDES Y/O
TRITERPENOSIDES
Muestra: Glycine max
- En un mortero trituamos la muestra vegetal seca.
Agregamos volumen suficiente de diclorometano y extrajimos por agitación.
Filtramos, luego se seca por un minuto con sulfato de sodio.
En un tubo de ensayo limpio y seco colocamos 1 ml del filtrado orgánico y 1 ml
de anhídrido acético. Por la pared del tubo dejamos resbalar cuidadosamente 1
a 2 gotas de acido sulfúrico concentrado, tal como vemos en la imagen
EXPERIENCIA 6: IDENTIFICACIÓN DE QUINONAS
Muestra: Aloe vera
- En el reflujo colocamos 5 g de muestra fresca (o un g de muestra seca) con
unos 25ml de HCl al 5% reflujamos por 5 minutos, filtramos cuando se enfrió.
Colocamos en un tubo de ensayo 5 ml del filtrado acuoso mas 1 ml peróxido de
hidrogeno al 20% y 1 ml de acido sulfúrico al 50%. Calentamos la mezcla en
baño de agua hirviendo durante 15 minutos. Enfriar, agregar 5 ml de tolueno,
agitamos sin emulsionar. Recuperamos la fase toluenica y trasvasamos 2 ml a
un tubo de ensayo, agregamos 1 ml de solución de NaOH al 5% con amoniaco
al 2%, agitamos sin emulsionar.
EXPERIENCIA 7: IDENTIFICACIÓN DE ANTOCIANOS
Muestra: Vitis vinifera
- En un matraz erlenmeyer colocamos la muestra fresca finalmente
desmenuzada y 200 ml de agua, calentamos a ebullición durante 5 minutos y
filtrar. En un tubo de ensayo colocamos 2 ml del filtrado y 1 ml de NaOH
diluido, en otro tubo de ensayo colocamos 2 ml de filtrado y 6 gotas de un acido
mineral diluido.
EXPERIENCIA 8: IDENTIFICACIÓN DE CUMARINAS
Muestra: Matricaria recutita
En un tubo de ensayo agregamos un 1 g de la planta fresca con la cantidad
suficiente de etanol comercial cubrimos la boca del tubo con un papel de filtro
blanco humedecido en NaOH y sujetado con una pita.
Calentamos el tubo hasta ebullición durante 5 minutos, enfriamos y retiramos el
papel de filtro.
RESULTADOS
Experiencia 1: Los resultados se muestran en el siguiente cuadro:
Reactivo
Nº de tubo Resultado
de prueba
Imagen del resulado
Dragendorff Presenta un
precipitado de
color anaranjado.
positiva
Meyers Solución de color
blanco-crema
turbio
positiva
Wagner precipitado color
marrón
positiva
Experiencia 2: Los resultados se observan en el siguiente cuadro:
FLAVONOIDES LEUCOANTOCIANIDINAS
FormaciónAnillo de color rosado en
la superficie
Coloración rojo de la
solución
Resultado del ensayoPositivo Positivo
Imagen del resultado
Experiencia 3: Identificación de saponinas:
Luego de la agitación por un minuto, se observó la formación de espuma
persistente.
Experiencia 4: Identificación de taninos
Al agregar gelatina se observó la presencia de un
pequeño precipitado, y luego al final del procedimiento al agregar FeCl3 se
observó la formación de un color verde
amarronado.
Presencia de espuma, la prueba es positiva.
Experiencia 5: Identificación triterpenoides y/o esteroides
Al agregar el acido sulfúrico a la solución preparada se observo la formación de
un color rojo anaranjado que se a medida pasaba el tiempo se fue haciendo
más intenso.
Experiencia 6: Identificación de quinonas
Luego de realizar el procedimiento previamente, se agregó al final una solución
de NaOH al 5% con amoníaco al 2% y el extracto se coloreo de color rosado.
Experiencia 7: Identificación de antocianinas.
Los resultados se observan en el siguiente cuadro:
Experiencia 8: Identificación de cumarinas
En el papel filtro se observó traslucidez,se observa en la imagen, sin embargo no se llegó a concluir esta prueba por la falta de equipo.
MEDIO ÁCIDO MEDIO BÁSICO
PRUEBA Positiva Positiva
COLOR Rosado Incoloro
IMAGEN
DISCUSIÓN
Experiencia 1: Identificación de alcaloides
Las técnicas de reconocimiento de alcaloides estan basadas en la capacidad
que tienen los alcaloides en estado de sal (extractos ácidos), de combinarse
con el yodo y metales pesados como bismuto, mercurio, tungsteno formando
precipitados coloreados. Por ejemplo nosotros, al agregar a la solución que
contenía alcaloides, previa extracción, el reactivo de Dragendorff formó junto
con la solución un precipitado de color naranja, este precipitado es el -tetra
yodo bismutato de potasio- , mientras que en la molécula de alcaloide el
hidrogeno es reemplazado por I- . Esta reacción se encuentra en el anexo1.
Experiencia 2: Identificación de Flavonoides y leucoantocianidinas
El procedimiento realizado también es llamado el ensayo de shinoda. La
muestra con la que trabajamos contiene flavonoides, el color rojo de los
petalos se debe a los Flavonoides. Los flavonoides con el núcleo
benzopirona (p. ej. flavonas, flavonoles, flavanonas, etc.) producen
coloraciones de rosado a rojizo. Se desconoce el mecanismo de reacción.
La identificación de leucoantocianidinas se concluyó satisfactoriamente, sin
embargo la solución se coloreo de rojo sin necesidad de calentarlo. El
ensayo de Rosenheim (para leucoantocianidinas) es igual hasta la mitad al
procedimiento que se llevo a cabo, el ensayo de Rosenheim consiste en
agregar HCl() al filtrado y luego agregar alcohol amílico, agitar y observar
las fases, y por ultimo llevar a calentamiento hasta que el alcohol amilico se
coloree a color carmesí.
Experiencia 3: Identificación de saponinas:
Las saponinas son un conjunto de glucósidos que se disuelven en agua y
disminuyen la tensión superficial de esta, por lo tanto, al sacudir una solución
que contiene saponinas y agua, se forma espuma abundante y relativamente
estable. Por hidrólisis de las saponinas se obtienen carbohidratos y esteroide,
es decir tiene un elemento soluble en lípidos (esteroide), y soluble en agua
(azúcar), es por esa razón que observamos en nuestro tubo de ensayo
presencia de espuma.
Experiencia 4: Identificación de taninos
La determinación de taninos con gelatina, fue propuesto por Lowental, este
método sirve para la eliminación de taninos por precipitación de una muestra.
La formación de precipitado con gelatina es una importante reacción de
reconocimiento del carácter curtiente de una combinación de los polifenoles
implicados.
El color verde- marrón que nos dio como resultado la solución que contenía
taninos, se debe a que el grupo R-OH del compuesto, tiende a colorearse con
soluciones férricas, en este caso se usó el FeCl3.
Experiencia 5: Identificación triterpenoides y/o esteroides
El procedimiento realizado es llamado “La reacción de Liebermen Burchard”.
Para esta reacción nosotros previamente extrajimos el lipido con
diclorometano. Esta reacción se lleva a cabo en una medio acido fuerte, en
nuestro caso lo constituyo el anhídrido acético y el acido sulfúrico concentrado.
En la reacción el esteroide sufre oxidación, formándose un compuesto con
doble enlace adicional del cual deriva. La coloración se debe al que el grupo -
OH del compuesto se protona y este luego de protonarse forma agua, y por ello
da un color anaranjado rojizo.
Experiencia 6: Identificación de quinonas
La identificación de quinonas se llevó a cabo satisfactriamente, el reflujo de la
muestra por 5 minutos junto con el FeCl3 en medio ácido, tiene como fin romper
las uniones C-glicósido y ayudar a la oxidación de las formas reducidas hasta
quinonas. En otras palabras al usar nosotros el acido clorhídrico hidrolizamos
todos los glicosidos de la muestra para asi dejar libres la moleculas de
quinonas. Luego de este procedimiento se hace la partición con un solvente
orgánico. La fase orgánica (en nuestro caso el tolueno) se pone en contacto
con una solución de NaOH al 5% con amoníaco al 2% y este nos da como
resultado una coloración roja.
Experiencia 7: Identificación de antocianinas
Esta prueba esencialmente esta basada en el efecto de pH. Las antocianinas
son más estables en un medio ácido que en un medio neutro o alcalino.
Nosotros tuvimos dos tubos de prueba el cual contenía el filtrado de la misma
muestra (extracto de uvas sin ollejo), sin embargo a uno se le aciduló con
H2SO4() y al otro se le agrego NaOH.
En medio ácido la forma predominante es la del ión flavilio, el cual nos dio el
color rosado, cuanto la muestra fue sometida a pH básico o alcalino, el ión
flavilio es susceptible al ataque nucleofílico por parte del agua, produciéndose
la pseudobase carbinol y/o chalcona, estas dos formas son incoloras, por ello al
agregar el NaOH la solución no cambió de color. Las dos reaccione acido /
base se observan en el anexo 3.
Experiencia 8: Identificación de cumarinas
Esta practica no se concluyó, ya que a universidad no cuenta con el equipo
para determinar la coloración.
CONCLUSIONES
La identificación de metabolitos es muy importante, ya que así
podemos reconocer los diferentes metabolitos que tiene una
planta de composición química desconocida.
El reconocimiento de los metabolitos también sirve para verificar
lo extraído, ya que muchas veces se realizan extracciones de
metabolitos secundarios de una especie, y se desconoce si la
extracción fue buena, así que se pueden verificar por medio de
reacciones químicas, la presencia de estos, con reactivos
específicos para cada metabolito.
Los metabolitos secundarios son muchos y diferentes, e cuanto a
su estructura, propiedades, grupo funcional, etc. Por lo tanto es
necesario usar diferentes ensayos de reconocimiento, en otras
palabras usando reactivos y técnicas especialmente diseñadas
para cada metabolito.
BIBLIOGRAFIA
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16 de setiembre del 2011]; [24 páginas].Disponible en:
http://www.bvsde.paho.org/texcom/manualesMEC/fitoterapia/cap4.pdf
2. Martínez M. Ensayos de Reconocimiento de Metabolitos Secundarios de
Interés Farmacéutico. [citada el 16 de setiembre del 2011]; [14 páginas].
Disponible en:
http://farmacia.udea.edu.co/~ff/ensayos2os.pdf
3. Claus E., Varru E. Farmacognosia. El Ateneo. Argentina. 1965. (533
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4. Kuklinski, C. Farmacognosia- Estudio de las drogas y sustancias
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5. Trease y Evans. Farmacognosia. Nueva editorial
interamericano.Mexico.1991. (1054 páginas)
6. Del Valle Leguizamón, et, Antocianinas en la uvay su relación con el
color [citada el 02de octubre del 2011]; [11 páginas].Disponible en:
http://redalyc.uaemex.mx/pdf/610/61028408.pdf
ANEXO