IMUNO ENSAIOS USANDO
CONJUGADOS
REAÇÕES USANDO REAGENTES MARCADOS
Conjugado: molécula constituída por duas substâncias ligadas covalentemente e que mantêm as propriedades funcionais de ambas
Ex: globulina de carneiro anti IgG humana marcada com
isotiocianato de fluoresceína (FITC)
HRP: enzima peroxidase
IMUNO ENSAIOS UTILIZANDO
CONJUGADOS
Antígenos usados nos imuno ensaios: patógeno inteiro, moléculas derivadas de patógenos, hormônios
Anticorpos usados: policlonais ou monoclonais
Ensaios manuais e automatizados
TÉCNICAS
1 – TÉCNICAS QUE USAM FLUORESCÊNCIA
Fluorescência: emissão de luz de uma cor após
irradiação com luz de cor diferente:
FITC: absorção máxima (490-495 nm), emissão
máxima (517 nm)
Técnicas: imunofluorescência, citometria de fluxo
Alguns fluorocromos
FITC: isotiocianato de fluoresceína
PE: ficoeritrina
Rodamina
IMUNOFLUORESCÊNCIA
Lâmina de imunofluorescência
Antígeno usado: pode-se usar Ag comercial ou
pesquisar Ag (micróbio) num material coletado do
paciente (ex: secreção)
Exemplo: IMUNOCRUZI®: Ag de Trypanosoma cruzi
liofilizado obtido por cultivo em meio de LIT
CONJUGADO E MONTAGEM DA LÂMINA
Antissoro (anti IgG ou anti IgM): gama globulina
obtida em espécie heteróloga (carneiro, cabra)
purificada e conjugada – marcada - com
substância fluorescente (fluorocromo)
Intensidade da luz emitida depende do pH (ao final,
lâmina é coberta com glicerina de alcalina e lamínula
KIT COMPLETO PARA
IMUNOFLUORESCÊNCIA
REAÇÃO DE
IMUNOFLUORESCÊNCIA
I - Reação de imunofluorescência direta
(RIFD)
pesquisa do Ag em células ou tecidos
elevada sensibilidade e especificidade
Usa um conjugado para cada sistema
Reação de imunofluorescência
II - Reação de imunofluorescência
indireta (RIFI)
amplificação do sinal aumento da
sensibilidade em relação à RIFD
A - pesquisa de antígeno
mais sensível, uso de um único
conjugado para diferentes sistemas
Reação de imunofluorescência
Reação de imunofluorescência
indireta (RIFI)
B - pesquisa de anticorpo contra um agente infeccioso
Ag do agente infeccioso (lâmina) + soro do paciente Ag-Ac
LAVAR
Ag-Ac + conjugado anti-IgG ou anti IgM microscópio
RIFI PARA PESQUISA DE ANTICORPO ANTI
TOXOPLASMA GONDII NO SORO DO PACIENTE
RIFI PARA ANTICORPO SÉRICO ANTI
LEISHMANIA
DETERMINAÇÃO DA CLASSE DO AC
Uso de conjugado contra a classe de Ig que se quer determinar:
Ex. de conjugado: globulina de carneiro anti IgG humana marcada pelo FITC
DETERMINAÇÃO DO TÍTULO DE ANTICORPO
Como o resultado é liberado:
Toxoplasmose IgG (imunofluorescência):
Resultado: reagente (ou positivo até) 1:8.192
INTERFERENTES NA PESQUISA
DE IgM POR RIFI
Presença de fator reumatóide (FR) falso-
positivo:
o Competição com IgG falso-negativo
Para eliminar falso positivo e falso negativo:
Usar o Removedor IgG/FR: soro do paciente + soro
com anti IgG humano seguido de centrifugação ⇨
usar sobrenadante para dosagem de IgM
KIT PARA IMUNOFLUORESCÊNCIA PARA AC
ANTI TRYPANOSOMA CRUZI
Desvantagens da RIFI:
Mais demorada, maior número de reagentes
Limitações da reação de imunofluorescência
Necessidade de microscópio de fluorescência,
subjetividade, não automação
AUTOMAÇÃO NA IMUNOFLUORESCÊNCIA (E
ELISA)
REAÇÕES DE
ENZIMAIMUNOENSAIO
Reação Ag-Ac monitorada por medida da
atividade enzimática
Alta sensibilidade, reagentes estáveis,
leitura visual ou fotométrica, substratos
coloridos ou luminescentes
CLASSIFICAÇÃO DOS ENZIMA-
IMUNOENSAIOS
Ensaios homogêneos: atividade da enzima é alterada como parte da atividade imunológica, não precisa de lavagem entre as etapas
Ensaios heterogêneos: atividade da enzima não é alterada, precisa de lavagem entre as etapas
ENZIMA IMUNOENSAIO HOMOGÊNEO
SLFIA (substrate-labelled fluorescent immunoassay)
A atividade da enzima é alterada pela ligação do Ac ao substrato fluorogênico
ENSAIOS HETEROGÊNEOS I - ELISA (enzyme linked immunosorbent
assay)
Uso de peptídeos sintéticos ou recombinantes e de anticorpos monoclonais
Fase sólida: placas de poliestireno
Material da placa tem afinidade por proteína
Interação proteína-placa é não covalente
PLACAS E TIRAS PARA ELISA
ETAPAS DO ELISA
sensibilização (ou cobertura) da fase sólida: adição de Ag do agente infeccioso (ou de Ac contra o que se quer pesquisar)
Bloqueio: adição de proteína inerte: soro fetal bovino, leite desnatado
lavagens
ETAPAS DO ELISA
adição da amostra do paciente (soro) na qual se deseja pesquisar Ag ou Ac em diluente *
adição do conjugado: anticorpo marcado com enzima (ex: peroxidase)
lavagens
ETAPAS DO ELISA
o Adição do substrato cromogênico:
peroxidase: H2O2 (substrato) + OPD
(ortofenilenodiamina) ou ABTS (ácido 5-amino
salicílico) (cromógenos)
ETAPAS DO ELISA
Interrupção da reação: adição de SDS ou H2SO4
Leitura do resultado
Leitor de ELISA: Fotômetro multicanal para tiras ou placas
Filtros: 405, 450, 490, 630 nm
Leitura monocromática: uso do comprimento de onda no qual o produto da reação tem maior absorbância
Leitura bicromática ou diferencial: uso de 2 filtros: o primário e o diferencial
Elimina imperfeições do plástico
Leitura é feita usando os 2 filtros, o aparelho libera a diferença das 2 absorbâncias
EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
limiar de reatividade (cut-off): ponto de corte de
um teste sorológico; pode-se trabalhar com maior
especificidade ou sensibilidade dependendo do
objetivo do teste (ex: seleção de doadores num
banco de sangue)
Cut-off (limiar de reatividade)
Corrigir: b: máxima sensibilidade e especificidade
g: máxima especificidade
Leitor de ELISA
Reação de ELISA
Lavadora de
placas
Pipeta
multicanal
ELISA: ENSAIOS PARA ANTICORPOS
ELISA: ENSAIOS PARA ANTÍGENOS
II - Western Blot
Pesquisa de antígenos e anticorpos
Exemplos:
- Caracterizar reatividade sérica de paciente suspeito de infecção pelo HIV (teste confirmatório para infecção pelo HIV)
II - WESTERN BLOT
Western blot para pesquisa de Ac anti HIV:
• Fracionamento das proteínas do HIV: separação de acordo
com peso molecular
• Transferência das proteínas para membrana de nitrocelulose
• Em seguida, etapas semelhantes ao ELISA: nesse caso pesquisa-se quais proteínas do HIV o soro reconhece
• Cromógeno usado deve originar produto insolúvel
Western blot
Western Blot
ONDE ESTUDAR
Imunoensaios – Fundamentos e Aplicações. VAZ, TAKEI,
BUENO, 1ª edição, 2007
OU
Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças
Infecciosas e Auto-Imunes – FERREIRA & ÁVILA, 2a
edição, 2001.
OU
Imunologia Médica - PARSLOW, 10a edição, 2004.
OU
Imunologia Clínica na Prática Médica – VOLTARELLI,
DONADI, CARVALHO, ARRUDA, LOUZADA JR, SARTI,
1ª edição, 2008.