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IMUNO ENSAIOS USANDO
CONJUGADOS
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REAÇÕES USANDO REAGENTES MARCADOS
Conjugado: molécula constituída por duas substâncias ligadas covalentemente e que mantêm as propriedades funcionais de ambas
Ex: globulina de carneiro anti IgG humana marcada com
isotiocianato de fluoresceína (FITC)
HRP: enzima peroxidase
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IMUNO ENSAIOS UTILIZANDO
CONJUGADOS
Antígenos usados nos imuno ensaios: patógeno inteiro, moléculas derivadas de patógenos, hormônios
Anticorpos usados: policlonais ou monoclonais
Ensaios manuais e automatizados
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TÉCNICAS
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1 – TÉCNICAS QUE USAM FLUORESCÊNCIA
Fluorescência: emissão de luz de uma cor após
irradiação com luz de cor diferente:
FITC: absorção máxima (490-495 nm), emissão
máxima (517 nm)
Técnicas: imunofluorescência, citometria de fluxo
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Alguns fluorocromos
FITC: isotiocianato de fluoresceína
PE: ficoeritrina
Rodamina
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IMUNOFLUORESCÊNCIA
Lâmina de imunofluorescência
Antígeno usado: pode-se usar Ag comercial ou
pesquisar Ag (micróbio) num material coletado do
paciente (ex: secreção)
Exemplo: IMUNOCRUZI®: Ag de Trypanosoma cruzi
liofilizado obtido por cultivo em meio de LIT
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CONJUGADO E MONTAGEM DA LÂMINA
Antissoro (anti IgG ou anti IgM): gama globulina
obtida em espécie heteróloga (carneiro, cabra)
purificada e conjugada – marcada - com
substância fluorescente (fluorocromo)
Intensidade da luz emitida depende do pH (ao final,
lâmina é coberta com glicerina de alcalina e lamínula
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KIT COMPLETO PARA
IMUNOFLUORESCÊNCIA
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REAÇÃO DE
IMUNOFLUORESCÊNCIA
I - Reação de imunofluorescência direta
(RIFD)
pesquisa do Ag em células ou tecidos
elevada sensibilidade e especificidade
Usa um conjugado para cada sistema
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Reação de imunofluorescência
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II - Reação de imunofluorescência
indireta (RIFI)
amplificação do sinal aumento da
sensibilidade em relação à RIFD
A - pesquisa de antígeno
mais sensível, uso de um único
conjugado para diferentes sistemas
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Reação de imunofluorescência
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Reação de imunofluorescência
indireta (RIFI)
B - pesquisa de anticorpo contra um agente infeccioso
Ag do agente infeccioso (lâmina) + soro do paciente Ag-Ac
LAVAR
Ag-Ac + conjugado anti-IgG ou anti IgM microscópio
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RIFI PARA PESQUISA DE ANTICORPO ANTI
TOXOPLASMA GONDII NO SORO DO PACIENTE
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RIFI PARA ANTICORPO SÉRICO ANTI
LEISHMANIA
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DETERMINAÇÃO DA CLASSE DO AC
Uso de conjugado contra a classe de Ig que se quer determinar:
Ex. de conjugado: globulina de carneiro anti IgG humana marcada pelo FITC
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DETERMINAÇÃO DO TÍTULO DE ANTICORPO
Como o resultado é liberado:
Toxoplasmose IgG (imunofluorescência):
Resultado: reagente (ou positivo até) 1:8.192
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INTERFERENTES NA PESQUISA
DE IgM POR RIFI
Presença de fator reumatóide (FR) falso-
positivo:
o Competição com IgG falso-negativo
Para eliminar falso positivo e falso negativo:
Usar o Removedor IgG/FR: soro do paciente + soro
com anti IgG humano seguido de centrifugação ⇨
usar sobrenadante para dosagem de IgM
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KIT PARA IMUNOFLUORESCÊNCIA PARA AC
ANTI TRYPANOSOMA CRUZI
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Desvantagens da RIFI:
Mais demorada, maior número de reagentes
Limitações da reação de imunofluorescência
Necessidade de microscópio de fluorescência,
subjetividade, não automação
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AUTOMAÇÃO NA IMUNOFLUORESCÊNCIA (E
ELISA)
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![Page 26: IMUNO ENSAIOS USANDO CONJUGADOS - aulasecia.com Aula IMUNOENSAIO USANDO... · KIT COMPLETO PARA IMUNOFLUORESCÊNCIA. REAÇÃO DE ... Imunologia Clínica na Prática Médica – VOLTARELLI,](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022070606/5a88982a7f8b9ad30c8e7c3f/html5/thumbnails/26.jpg)
REAÇÕES DE
ENZIMAIMUNOENSAIO
Reação Ag-Ac monitorada por medida da
atividade enzimática
Alta sensibilidade, reagentes estáveis,
leitura visual ou fotométrica, substratos
coloridos ou luminescentes
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CLASSIFICAÇÃO DOS ENZIMA-
IMUNOENSAIOS
Ensaios homogêneos: atividade da enzima é alterada como parte da atividade imunológica, não precisa de lavagem entre as etapas
Ensaios heterogêneos: atividade da enzima não é alterada, precisa de lavagem entre as etapas
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ENZIMA IMUNOENSAIO HOMOGÊNEO
SLFIA (substrate-labelled fluorescent immunoassay)
A atividade da enzima é alterada pela ligação do Ac ao substrato fluorogênico
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ENSAIOS HETEROGÊNEOS I - ELISA (enzyme linked immunosorbent
assay)
Uso de peptídeos sintéticos ou recombinantes e de anticorpos monoclonais
Fase sólida: placas de poliestireno
Material da placa tem afinidade por proteína
Interação proteína-placa é não covalente
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PLACAS E TIRAS PARA ELISA
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ETAPAS DO ELISA
sensibilização (ou cobertura) da fase sólida: adição de Ag do agente infeccioso (ou de Ac contra o que se quer pesquisar)
Bloqueio: adição de proteína inerte: soro fetal bovino, leite desnatado
lavagens
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ETAPAS DO ELISA
adição da amostra do paciente (soro) na qual se deseja pesquisar Ag ou Ac em diluente *
adição do conjugado: anticorpo marcado com enzima (ex: peroxidase)
lavagens
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ETAPAS DO ELISA
o Adição do substrato cromogênico:
peroxidase: H2O2 (substrato) + OPD
(ortofenilenodiamina) ou ABTS (ácido 5-amino
salicílico) (cromógenos)
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ETAPAS DO ELISA
Interrupção da reação: adição de SDS ou H2SO4
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Leitura do resultado
Leitor de ELISA: Fotômetro multicanal para tiras ou placas
Filtros: 405, 450, 490, 630 nm
Leitura monocromática: uso do comprimento de onda no qual o produto da reação tem maior absorbância
Leitura bicromática ou diferencial: uso de 2 filtros: o primário e o diferencial
Elimina imperfeições do plástico
Leitura é feita usando os 2 filtros, o aparelho libera a diferença das 2 absorbâncias
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EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
limiar de reatividade (cut-off): ponto de corte de
um teste sorológico; pode-se trabalhar com maior
especificidade ou sensibilidade dependendo do
objetivo do teste (ex: seleção de doadores num
banco de sangue)
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Cut-off (limiar de reatividade)
Corrigir: b: máxima sensibilidade e especificidade
g: máxima especificidade
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Leitor de ELISA
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Reação de ELISA
Lavadora de
placas
Pipeta
multicanal
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ELISA: ENSAIOS PARA ANTICORPOS
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ELISA: ENSAIOS PARA ANTÍGENOS
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II - Western Blot
Pesquisa de antígenos e anticorpos
Exemplos:
- Caracterizar reatividade sérica de paciente suspeito de infecção pelo HIV (teste confirmatório para infecção pelo HIV)
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II - WESTERN BLOT
Western blot para pesquisa de Ac anti HIV:
• Fracionamento das proteínas do HIV: separação de acordo
com peso molecular
• Transferência das proteínas para membrana de nitrocelulose
• Em seguida, etapas semelhantes ao ELISA: nesse caso pesquisa-se quais proteínas do HIV o soro reconhece
• Cromógeno usado deve originar produto insolúvel
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Western blot
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Western Blot
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ONDE ESTUDAR
Imunoensaios – Fundamentos e Aplicações. VAZ, TAKEI,
BUENO, 1ª edição, 2007
OU
Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças
Infecciosas e Auto-Imunes – FERREIRA & ÁVILA, 2a
edição, 2001.
OU
Imunologia Médica - PARSLOW, 10a edição, 2004.
OU
Imunologia Clínica na Prática Médica – VOLTARELLI,
DONADI, CARVALHO, ARRUDA, LOUZADA JR, SARTI,
1ª edição, 2008.