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Expressão GênicaExpressão Gênica
Marcílio C. P. de SoutoDIMAp/UFRN
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Expressão Gênica
Todas as células em um organismo têm o mesmo DNA genômico
Identidades celulares distintas ocorrem por causa de diferenças na expressão gênica (=transcrição & tradução)
A transcrição ou não de um gene é, em geral, determinada pela presença/ausência de outros produtos dos genes (especialmente proteínas)
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Expressão Gênica
... então os genes interagem em redes complexas:
Gene A ativa gene B, que desliga gene C que aumenta (upregulates) A, ...
Assim, perturbações em um único gene podem levar a mudanças na expressão de vários genes
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Para que estudar Expressão Gênica ?
As células e tecidos tem suas funções normais quando os genes são expressos de forma regulada
A expressão alterada de um gene altera a homeostase do organismo, podendo gerar uma doença
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Genômica Funcional O próximo passo após o sequenciamento:
Entendimento da conexão entre seqüências de DNA e características fenotípicas do organismo
Passo complexo Proteínas e genes interagem em redes
altamente conectadas Tradicionalmente a biologia molecular vem
trabalhando baseada no paradigma Um gene, uma função
No entanto,...
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Microarrays ... microarray podem medir a expressão de vários
genes ao mesmo tempo Microarrays são em geral lâminas de vidro com
uma matriz de pontos (spots) impressa sobre elas Um spot contém milhões de moléculas de DNA
idênticas ou oligonucleotídeos (sondas) As sondas se ligarão a seqüências específicas de DNA, tais
como cDNA de um gene O microarray pode conter milhares de spots
Por exemplo, um spot para cada gene do genoma humano
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Experimentos com Microarrays
Quase todo mRNA mRNA da célula ~ genes expressos
Triture células e extraia o mRNA Faça a transcrição reversa RNA
Utiliza-se cDNA, que é mais estável Rotule cDNA das células de referência de
verde (Cy3) e das células alvo (teste) de vermelho (Cy5) P. Ex.: Cy3=Célula Normal Cy5=Célula Cancerosa
Hibridize ambas as amostras, células referência e alvo, em um único microarray
traduzido proteína
cDNA
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Fabricação do Array (1/4)
Seleção das sondas (cDNA) a serem impressas no array
Três dos milhares de cDNAconhecidos relevantes para a questão biológica investigada
Obtidos de bibliotecas de cDNAOu feitos a partir de amostras de mRNA
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Fabricação do Array (2/4)
Amplificaçãopor PCR
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Fabricação do Array (3/4)
cDNAs são imobilizados em pontos específicos no substrato
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Fabricação do Array (4/4)
Spot contendo várias cópias de cDNA (sondas) de um gene específico
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Amostra de células a ser analisada(RNA experimental)
Preparação da AmostraAmostra de células de referênciaou controle(RNA controle)
Obs: Também pode ser realizadosexperimentos sem a amostra de controle e também para se compararduas amostras de interesseExtrai RNAm
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Síntese e Rotulação de cDNA (1/3)
Fita de cDNA é sintetizadaCada amostra é marcada com um corante diferente
Primer TTTTTTranscriptase reversadNTP
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Síntese e Rotulação de cDNA (2/3)
mRNA é degradado
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DNA polimerase
Síntese e Rotulação de cDNA (2/3)
Segunda fita do cDNA é sintetizada
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Síntese e Rotulação de cDNA (2/3)
cDNA é desnaturado
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Síntese e Rotulação de cDNA (3/3)
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Hibridização (1/3)
Amostra sob investigação
Microarray
Amostra é colocada noarray para hibridização
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Hibridização (2/3)
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Hibridização (3/3)
Lava o excesso de cDNAdas amostras rotuladas
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Scanning (1/3)
Scanner
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Scanning (2/3)
Software do scannersobrepõe imagens
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Scanning (3/3)
Software do scannersobrepõe imagens
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Experimentos com Microarrays - Resultados
O spot para o gene 1 = Vermelho se há mais mRNA 1 nas células de teste Verde se há mais mRNA 1 nas células de referência Amarelo se são iguais Preto se o gene não foi expresso
Dados em geral expressos na forma de uma matriz de níveis de expressão relativa
intensidade vermelhaintensidade verde
indexada pelos genes e as amostras das células de teste
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Esquema de um microarray
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Dados de Microarray
g1 g2 gN-1gN
Padrão 1Padrão 2Padrão 3
Padrão i
Padrão m
Característica
Câncer
Normal
Câncer
Classe
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Como é feita a análise ? Quando é feita a comparação dessas fontes, pode-
se chegar a conclusões sobre a expressão gênica num determinado estado fisiológico
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Algumas Aplicações Descoberta de genes Determinar quais genes estão sendo expressos em um
determinado tipo de célula em um dado momento e sob certas condições
Comparar a expressão dos genes em dois tipos de células diferentes ou duas amostras de tecido diferentes (tecido saudável x tecido doente)
Examinar mudanças na expressão dos genes em diferentes estágios no ciclo da célula ou durante desenvolvimento do embrião
Análise da regulação gênica Identificação de doenças genéticas complexas Descoberta de medicamentos e estudos de toxicologia Detecção de mutação/polimorfismo
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Outras Tecnologias As técnicas de AM a serem descritas
também podem ser aplicadas a dados de expressão gerados com outras tecnologias MPSS (Massively Parallel Signature Sequence
technology) Brenner et al., 2000
SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) Velculescu et al., 1995
Real-time RT-PCR (Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction)
Freeman et al., 1999