Download - EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS EM BACTÉRIAS João Fernando Bortoleto Jeanne Blanco De Molfetta Machado
EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS EM
BACTÉRIAS
João Fernando Bortoleto
Jeanne Blanco De Molfetta Machado
Uso de uma célula ou um organismo para expressar uma proteína produzida em outra célula ou outro organismo.
Ex.: TAQ DNA Polimerase, enzimas de restrição
produção de proteínas heterólogas
Para que produzir proteínas recombinantes?
Pesquisa em estrutura e função de proteínas
Imunização
Fármacos: anticorpos terapêuticos, vacinas, hormônios, fatores de coagulação
Fator VIII da imunoglobulina recombinante
Interferon α
Insulina
Por que expressar proteínas recombinantes?
Dificuldade de se purificar do tecido original
Proteínas do tecido podem estar contaminadas
Proteínas recombinantes podem ser engenheiradas
Processo completamente controlado
Especificidade
Quantidade
Como preparar um sistema recombinante.
Isolar e preparar o DNA ou cDNA
Escolher o sistema apropriado
Transformar hospedeiro
Selecionar hospedeiro transformado
Checar se a proteína foi expressa
Checar se está solúvel
Purificar
Checar se está ativa
Caracterizar a proteína
CLONAGEM E TRANSFORMAÇÃO EM PLASMÍDEOS
CLIVAGEM
ou
PCR
TRANSFORMAÇÃO
LIGAÇÃO
Como preparar um sistema recombinante
Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar
Escolher o sistema apropriado
Transformar hospedeiro
Selecionar hospedeiro transformado
Checar se a proteína foi expressa
Checar se está solúvel
Purificar
Checar se está ativa
Caracterizar a proteína
Vetores de expressão- componentes básicos
malE
M13 ORI-
Marcadores seletivos
Origem de replicação
Promotor
Sítio de poliadenilaç
ãoTerminador
Sítio de ligação do ribossomo
Características que devem ser avaliadas em cada sistema de expressão
Taxa de crescimento celular
Complexidade do meio de cultura
Custo do meio de cultura
Nível de expressão
Capacidade de expressar extracelularmente
Capacidade de produzir as modificações pós-traducionais tais como: dobramento correto, formação das pontes dissulfeto, glicosilação, fosforilação, acetilação
Vantagens dos sistemas de expressão
eucarióticos - Dobramento das proteínas eucarióticas mais semelhante.
- Modificações pós-traducionais.
- Pode produzir grandes quantidades de proteínas com o uso de equipamentos próprios (fermentadores).
Desvantagens dos sistemas de expressão
eucarióticos
- Sistemas caros
- Necessitam equipamentos adequados
- Poucos vetores disponíveis- Adequado para proteínas ricas em cisteínas- pontes dissulfeto.
- Níveis de expressão mais baixos.
Escolha do sistema - hospedeiros
Bactérias Gram-negativas – E. coli e Caulobacter
Bactérias Gram-positivas – Bacillus subtilis
Leveduras – Saccharomyces pichiapastoris
Fungos filamentosos – Aspergillus e Trichoderma
Células de inseto
Células de mamífero
Células vegetais em cultura
Oócito de Xenopus
Plantas transgênicas e Animais transgênicos
Replicação a cada 20 minutos em condições ideais de crescimento
Disponibilidades de vários vetores de clonagem
Disponibilidade de várias cepas mutantes, deficientes em proteases
Linhagens de E. coli modificadas - Gram negativa
EXPRESSÃO PROTEÍNA HETERÓLOGA
Como preparar um sistema recombinante
Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar
Escolher o sistema apropriado
Transformar hospedeiro
Selecionar hospedeiro transformado
Checar se a proteína foi expressa
Checar se está solúvel
Purificar
Checar se está ativa
Caracterizar a proteína
Eletroporação, biobalistica, vírus, ... X sistema
Como preparar um sistema recombinante
Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar
Escolher o sistema apropriado
Transformar hospedeiro
Selecionar hospedeiro transformado
Checar se a proteína foi expressa
Checar se está solúvel
Purificar
Checar se está ativa
Caracterizar a proteína
Seleção Cepa Transformada
Vetores carregam gene resistência a antibióticos ManutençãoPressão Seletiva
Meio + antibiótico
Seleção
Antibióticos: ampicilina, canamicina, cloranfenicol, tetraciclina.
Gentamicina
Higromicina, canamicina
Herbicidas: BASTA
Como preparar um sistema recombinante
Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar
Escolher o sistema apropriado
Transformar hospedeiro
Selecionar hospedeiro transformado
Checar se a proteína foi expressa
Checar se está solúvel
Purificar
Checar se está ativa
Caracterizar a proteína
Tempo/ solubilidade Controle da indução
PM S0 S1 S2 S3 S4 P0 P1 P2 P3 P4 S0 S3 C3 PM
Desvantagens
Sistema procariótico
Não realiza modificações pós-traducionais
- Não realiza secreção de proteínas.
Algumas proteínas são tóxicas para as bactérias.
Dobramento incorreto de proteínas (proteínas ricas em cys)
Codon usage (uso de tRNAs)
-Tendência a formar corpúsculos de inclusão.
Degradação proteolítica
PROBLEMAS COMUNS da EXPRESSÃO em E. coli
PROTEÍNA NÃO EXPRESSA
Alternativa sequenciar, uso do código
AGA, AGG, CGA, CGG,,,,,,,,,,,,,,,,,,,ArgUGU, UGC..........................................CysGGA, GGG...........................................GlyAUA.....................................................IleCUA, CUC............................................LeuCCC, CCU, CCA...................................ProUCA, AGU, UCG, UCC......................Ser
ACA......................................................Thr
Presença de codons raros na proteína de interesse
Codons raros em E.coli
CÓDON PLUS, ROSETA
Como preparar um sistema recombinante
Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar
Escolher o sistema apropriado
Transformar hospedeiro
Selecionar hospedeiro transformado
Checar se a proteína foi expressa
Checar se está solúvel
Purificar
Checar se está ativa
Caracterizar a proteína
PURIFICAÇÃO PROTEÍNA RECOMBINANTE
pGEX – Glutationa S-Transferase agarose-glutationa
pQE, pET – tag de Histidinas coluna de níquel
Clivagem química ou enzimática
Proteína de interesseGST
Clivagem com fator Xa
Sistemas de Purificação
clonagem
Cromatografia
lavagens eluição