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Étudier le métabolisme a l'état stationnaire
une approche par contraintes
Julien Gagneurdoctorant
Grenoble, 6 Mai 2004
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Motivation
On cherche à « explorer différentes approches pour l'étude intégrée des réseaux géniques et métaboliques »
On se restreint à une cellule.
Régulation
MétabolismeBriques
élémentaires
Cofacteurs
Substrats du milieu
Molécules propres
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Motivation
=
Roche Applied Science « Metabolic Pathways » map
E. coli:
750 réactions
500 métabolites
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Motivation
Le « plan » est complet pour certains micro-organismes (H. influenzae, E. coli)
Par séquençage et annotation de génome, en cours pour d’autres micro-organismes (KEGG)
Il existe des modèles des réactions enzymatiques (MCA)
MAIS: Il est difficile d’estimer in vivo:
Les lois cinétiques
leurs paramètres
les concentrations des métabolites
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Motivation
Des données structurelles, certes, mais (presque) complètes à l’échelle cellulaire
Que peut-on dire sur le métabolisme à partir du réseau seulement ou à partir du réseau et de quelques mesures?
Approche par contraintes
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Plan
Analyses du métabolisme par contraintes
État quasi-stationnaire
Metabolic Flux Analysis
Irréversibilité
Flux Balance Analysis
Metabolic Pathway Analysis
Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques?
Vue d’ensemble
Regulatory Flux Blance Analysis
propositions
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Plan
Analyses du métabolisme par contraintes
État quasi-stationnaire
Metabolic Flux Analysis
Irréversibilité
Flux Balance Analysis
Metabolic Pathway Analysis
Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques?
Vue d’ensemble
Regulatory Flux Blance Analysis
propositions
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Construction du modèle
P
E
D
C
B
A
1100000100
1000001000
1001000000
1010100000
0110010010
0001110001
R10R9R8R7R6R5R4R3R2R1
N
Système
Métabolites
• Internes m=6
• Externes
Flux (réactions +transports): q=10
Stœchiométrie :
(Klamt et al, 03)
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La matrice de stœchiométrie N• N est un composant essentiel du système dynamique • La dynamique du système est décrite par (MCA):
),),(()( ttft Pcr contient les paramètres cinétiques
)()(
tdt
tdrN
c
N invariant du système contient sa structure
c(t) : concentrations
r(t) : flux des réactions (reaction rates)
N matrice creuse
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Hypothèse d’état quasi-stationnaire Les métabolites ont un temps de turn-over typique rapide par rapport à la régulation
Metabolite
r1
r2
r3
r4
r5 54sortantsflux rr
cc MetaboliteMetabolite
sec601.0
Le métabolisme est à l’état quasi-stationnaire (quasi steady-state)
)()(
tdt
tdrN
c
c(t) const.
Pour les métabolites internes:
Production =
Consommation
0rN }
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Plan
Analyses du métabolisme par contraintes
État quasi-stationnaire
Metabolic Flux Analysis
Irréversibilité
Flux Balance Analysis
Metabolic Pathway Analysis
Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques?
Vue d’ensemble
Regulatory Flux Blance Analysis
propositions
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Metabolic Flux AnalysisDétermination d’une distribution de flux lors d’une expérience à l’état stationnaire
L’ équation Nr = 0 est souvent indéterminée(q>m : plus de réactions que de métabolites)
certains flux doivent être connuspar mesurespar hypothèses
Soit:- k (known) les indices des flux connus- u (unknown) les indices des flux inconnus
kkuu
kkuu
rNrN
0rNrNNr
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Metabolic Flux Analysis
La solution utilisée est basée sur la matrice pseudo-inverse de Moore-Penrose qui résout le problème des moindres carrés:
-pour les cas sur-déterminé (moindres erreurs)-pour les cas sous-déterminé (solution parcimonieuse)
kkuu rNrN
kkuu rNNr #
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Metabolic Flux Analysis
r1
r2
r3
r4A B
Sous- déterminéles flux manquants peuvent être estimés par:
- pseudo-inverse (longueur minimale)- optimisation d’autres objectifs
(croissance maximale…)
2A B 2
Déterminé2
A
0
B22
02
A B3
2.5 Sur-déterminé
Connuinconnu
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MFA: Utilisation
Avec les flux externes: souvent insuffisant Combines avec des mesures (partielles) des flux internes
Isotopic Tracer Experiment
(Wiechert et al.)
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Plan
Analyses du métabolisme par contraintes
État quasi-stationnaire
Metabolic Flux Analysis
Irréversibilité
Flux Balance Analysis
Metabolic Pathway Analysis
Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques?
Premiers pas
Ce que l’on pourrait faire (propositions)
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Irréversibilité de certaines réactions
Certaines réactions, dans les conditions de fonctionnement de la cellule, sont unidirectionnelles.
Les flux associés sont positifs ou nuls.
010 R
![Page 18: Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062408/56813876550346895da02449/html5/thumbnails/18.jpg)
Construction du modèle (suite)
Flux (réactions +transports): q=10
• Rev={R2,R8}
• Irrev={R1,R3,R4,R5, R6,R7,R9,R10}
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Le cône des états possibles
Les états possibles obéissent à un ensemble de contraintes linéaires:
m égalités :
|Irr| inégalités :
Cela restreint toute solution dans un cône polyédrique convexe
0rN
Irrii 0r
qr
![Page 20: Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062408/56813876550346895da02449/html5/thumbnails/20.jpg)
Plan
Analyses du métabolisme par contraintes
État quasi-stationnaire
Metabolic Flux Analysis
Irréversibilité
Flux Balance Analysis
Metabolic Pathway Analysis
Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques?
Vue d’ensemble
Regulatory Flux Blance Analysis
propositions
![Page 21: Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062408/56813876550346895da02449/html5/thumbnails/21.jpg)
Flux Balance AnalysisDétermination d’une distribution de flux optimale à l’état stationnaire pour une fonction objectif donnée
On considère un problème d’optimisation linéaire:
Problème standard et rapidement résolubleLe argmax n’est pas unique !
rcTmax
Sous contrainte:
iii r
0Nr État stationnaire
réversibilité et capacité
Exemples: • réaction irréversible : i=0• flux maximal connu (capacité) : i=Vmax
• conditions du milieu : i= i=0
![Page 22: Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062408/56813876550346895da02449/html5/thumbnails/22.jpg)
FBA: fonction objectif
1. Suivant l’idée que l’évolution a conduit à des « organismes optimaux »:
• croissance maximale (maximal growth)• rendement d’ATP
2. « metabolic engineering »: optimisation d’organisme• rendement maximal pour un certain produit• Minimisation de produits secondaires
![Page 23: Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062408/56813876550346895da02449/html5/thumbnails/23.jpg)
Max cTr = (0,0,1,0,0,0,0,0,0,0) r
Sous:Nr = 0i = (0,-,0,0,0,0,0,-,0,0)i = (1,0,+,+,+,+,+,+,+,+)
“manière optimale de produire P en présence de A seulement dans le milieu ?”
Rendement optimal = R3/R1= 1
FBA: exemple
![Page 24: Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062408/56813876550346895da02449/html5/thumbnails/24.jpg)
Prédiction du taux de croissance optimal (et observation !)(Edwards et al., Ibarra et al. )
Identification de rendement optimaux (Nielsen et al., Stephanopoulos et al. )
Prédiction de viabilité de mutants (Edwards et al.)
Invalidation de réseaux
Une variante pour les mutants: MoMA Minimization of Metabolic AdjustmentLe mutant serait à un état sous optimal mais voisin de l’état optimal de la souche sauvage(Segre et al.)
Simulation dynamique
FBA: application et variante
![Page 25: Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062408/56813876550346895da02449/html5/thumbnails/25.jpg)
« fonction objectif naturelle » les organismes sont-ils optimaux? Pour quel objectif?
la solution optimale n’est pas unique!
Solution (1): P/A=1 Solution (3) Solution (2)
FBA: Limitations
Pas de prédiction certaine de la distribution des flux
![Page 26: Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062408/56813876550346895da02449/html5/thumbnails/26.jpg)
Plan
Analyses du métabolisme par contraintes
État quasi-stationnaire
Metabolic Flux Analysis
Irréversibilité
Flux Balance Analysis
Metabolic Pathway Analysis
Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques?
Vue d’ensemble
Regulatory Flux Blance Analysis
propositions
![Page 27: Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062408/56813876550346895da02449/html5/thumbnails/27.jpg)
Metabolic Pathway AnalysisDéfinition de la notion de « voie métabolique » comme route fondamentale fonctionnelle a l’équilibre.
L’idée part du cône (espace des réactions):
Problème : le cône n’est pas toujours pointé(réactions réversibles)
Tout r admissible est combinaison à coefficients positifs des rayons extrêmes
rayons extrêmes = base convexe
espace linéaire
Pour avoir une définition canonique : 2 voies…
![Page 28: Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062408/56813876550346895da02449/html5/thumbnails/28.jpg)
MPA: Extreme Pathways
Par reconfiguration du réseau
L’idée classique: pour toute variable libre x, on pose:x = x+ - x-
x+ >=0 ; x- >=0Toute réaction réversible est partagée en 2: forward et backward
=A AB BR Rf
Rb
0rN 0r et : cône pointé
Extreme pathways = extreme rays
![Page 29: Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062408/56813876550346895da02449/html5/thumbnails/29.jpg)
MPA: Elementary Flux Modes
En se basant sur une propriété des rayons extrêmes
Tout rayon extrême satisfait un maximum de contraintes avec égalité (maximum au sens de l’inclusion)
Dans le cas irréversible:
0rN
0r
Elementary Flux Mode = une distribution de flux minimal (pour l’inclusion) en terme de réactions utilisées
Toujours satisfaites avec égalité
Un maximum avec égalité un minimum de réactions utilisées
Cas général:
![Page 30: Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062408/56813876550346895da02449/html5/thumbnails/30.jpg)
MPA: 2 voies = 1 voie
En fait, extreme pathways = elementary flux modes
Sauf:
bi-cycle futile (futile 2-cycle)
utiliser les Elementary Flux Mode
(extreme pathway)A B
Rf
Rb
A B
problèmes de convention a l’interface (flux entrants et sortants) pour les extremes pathways: certains pathways optimaux peuvent être omis
![Page 31: Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062408/56813876550346895da02449/html5/thumbnails/31.jpg)
MPA: exemple
(Klamt, 03)
ensemble des solutions optimales
pour P/A
R6 et R9 sont parfaitement corrélées
![Page 32: Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062408/56813876550346895da02449/html5/thumbnails/32.jpg)
MPA: applications et limitations
Identification de « voie métabolique »: Base qui engendre toute solution admissible
Contient une base pour les solutions optimales aux problèmes linéaires
Corrélations de réactions
Définition des délétions létales minimales (minimal cut set)
Flexibilité du réseau (par le nombre d’EFMs)
Limitation: explosion combinatoireMétabolisme central d’E.coli (109 réactions, 500 000 EM)
![Page 33: Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062408/56813876550346895da02449/html5/thumbnails/33.jpg)
Plan
Analyses du métabolisme par contraintes
État quasi-stationnaire
Metabolic Flux Analysis
Irréversibilité
Flux Balance Analysis
Metabolic Pathway Analysis
Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques?
Vue d’ensemble
Regulatory Flux Blance Analysis
propositions
![Page 34: Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062408/56813876550346895da02449/html5/thumbnails/34.jpg)
Modèles intégrés? vue d’ensemble
réseauQuantités / temps
?
MPA
FBA
MFA
J.P.
rFBA
![Page 35: Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062408/56813876550346895da02449/html5/thumbnails/35.jpg)
Plan
Analyses du métabolisme par contraintes
État quasi-stationnaire
Metabolic Flux Analysis
Irréversibilité
Flux Balance Analysis
Metabolic Pathway Analysis
Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques?
Vue d’ensemble
Regulatory Flux Balance Analysis
proposition
![Page 36: Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062408/56813876550346895da02449/html5/thumbnails/36.jpg)
Regulatory Flux Balance Analysis
Covert, Palsson « transcriptional regulation in constraints-based metabolic models » J. Bio. Chem. 2002
Réseau génique modélise comme un réseau booléen, qui réagit a la présence ou absence de métabolites internes ou externes.
A une condition fixee par le reseau genique, FBA est appliquee
Amélioration de la prédiction de viabilité de simples mutants (de 97 a 106 sur 116 )
Amélioration des modèles dynamiques
La régulation contraint le métabolisme
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Plan
Analyses du métabolisme par contraintes
État quasi-stationnaire
Metabolic Flux Analysis
Irréversibilité
Flux Balance Analysis
Metabolic Pathway Analysis
Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques?
Vue d’ensemble
Regulatory Flux Blance Analysis
proposition
![Page 38: Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062408/56813876550346895da02449/html5/thumbnails/38.jpg)
Proposition
Quels degrés de liberté reste-t-il au réseau génique étant donné le réseau métabolique?
gène constitutivement exprime?
logique du réseau?
un exemple : enzyme subset
Le métabolisme contraint la régulation
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Enzyme subset
Pour l’instant détecté au sein du noyau de N comme lignes colinéaires utilise pour réduire les modèles « vraisemblablement coregules »
Ensemble de réactions qui opèrent a ratio de flux fixe 2 a 2 a l’état stationnaire.
A BOu correlation plus “distante”
Exemple: cascadeA B C
01
11
10
01
K
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Menaquinone synthesis operon
Enterochelin synthesis operon
A quel point peut-on prédire des opérons par contraintes structurelles issues du métabolisme?
Des structures logiques plus complexes (OU) comme un iso-enzyme ?
Proposition
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Références (points d’entrée)
Metabolic Flux Analysis:
Klamt et al. 2002« Calculability analysis in underdetermined metabolic networks illustrated by a model of the central metabolism in purple nonsulfur bacteria. » Biotechnol Bioeng. Mar 30;77(7):734-51
Flux Balance Analysis:
Edwards et al 2001 « In silico predictions of E. coli metabolic capabilities are consistent with experimental data » Nature Biotech. 19:125-130
Metabolic Pathway Analysis:
Klamt, Stelling 2003 « Two approaches for metabolic pathway analysis? » Trends in Biotech. 21 (2):64-69